DD249038A1 - Verfahren zur herstellung rekombinanter plasmide mit breitem wirtsbereich sowie portabler expressions-/sekretionseinheit - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen rekombinanten Vektorplasmiden mit breitem Wirtsbereich, die ueber eine spezifische portable Expressions-/Sekretionseinheit verfuegen. Sie verfolgt das Ziel, derartige neue Vektorplasmide zu konstruieren und in prokaryotischen Wirtssystemen, sowohl gramnegativen als auch -positiven, zu erproben. Die aus diesem Ziel abgeleitete Aufgabe wird in der Weise geloest, dass, gestuetzt auf die kuerzlich gelungene Isolierung und Klonierung eines Fragments mit funktionsfaehigem Gen fuer eine neue Staphylokinase (SAK-Gen) aus der DNS eines temperenten Staphylococcus aureus-Phagen,- aus einem SAK -rekombinanten Plasmid, vorzugsweise aus dem Plasmid pDB17, die native Expressions-/Sekretionseinheit dieses Gens als etwa 420 bp langes HinfI-TaqI-Teilfragment entnommen und-diese Einheit mit Polylinker-tragenden Vektoren wie pUC19 bzw. pGB363 und pBB100 neu kombiniertwird.Die Funktions- und Leistungsfaehigkeit der auf diese Weise entstandenen neuen Vektorplasmide, die die portable Expressions-/Sekretionseinheit in verschiedenen Modifikationen enthalten, wird in mehreren Beispielen, so unter Einbezug des Chloramphenicolacetyltransferase- und des Human-Interferon-Alpha1-Gens, in den Wirtssystemen E. coli sowie Bacillus und Streptococcus demonstriert.
Description
Hierzu 9 Seiten Zeichnungen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung und Erprobung von Vektorplasmiden, die jeweils eine neue portable Expressions-/Sekretionseinheit enthalten.
• Diese Vektorplasmide können vorteilhaft für die Klonierung von prokaryotischen oder eukaryotischen Genen sowie für die Expression und Sekretion der Genprodukte, sowohl den nativen Proteinen als auch von neuen Fusionsproteinen, durch grampositive und -negative prokaryotische Wirtsorganis.men eingesetzt werden.
Die Erfindung bietet Nutzungsmöglichkeiten in der Gentechnologie sowie auf anderen Gebieten der Molekularbiologie und nachgelagert damit in der pharmazeutisch-chemischen Industrie, deren Produkte ihrerseits in der Human- und Veterinärmedizin sowie in der Pflanzen- und Tierproduktion verwendet werden, und in der Nahrungsmittelerzeugung.
Die industrielle Gewinnung von Wirkstoffen mit Hilfe gentechnisch veränderter Mikroorganismen hat eine ständig zunehmende Bedeutung, da sie die Möglichkeit bietet, sowohl eine Massenproduktion von bisher schwer zugänglichen Proteinen durchzuführen als auch neuen, bisher nicht bekannte Wirkstoffe biotechnologisch herzustellen bzw. bekannte zu modifizieren.
Seit den 70er Jahren werden in ständig wachsender Zahl Gene aus Prokaryoten und Eukaryoten isoliert und in mikrobiellen Wirten, insbesondere in E. coli, kloniert und exprimiert. (siehe etwa E.-L. Winnacker, Gene und Klone, Verlag Chemie, Wein heim,
Die Ausprägung dieser oft heterologen Gene in den mikrobiellen Wirten erfordert in der Regel deren Kopplung an Expressionssignale, die vom Transkriptions- und Translationsapparat des jeweiligen Produzenten erkannt werden.
Soll das Genprodukt aus der Zelle ausgeschleust werden, was für seine Isolierung von Vorteil sein kann, so muß die Sequenz für das gewünschte Protein einer Signalpeptidsequenz folgen, die während derTranslokation durch die Zellmembran abgespalten wird (processing).
Zu diesem Zweck wurden und werden sog. Sekretionsvektoren entwickelt. Diese enthalten auf einem Trägerplasmid eine Expressions-/Sekretionseinheit (ESE), die zumindest aus einer Promotorregion, einem Ribosomenbindungsort (SD-Sequenz) und einer funktionsfähigen Signalpeptidsequenz besteht, und sie bieten durch wenigstens einen unikalen Restriktionsort die Möglichkeit, das zu exprimierende Gen in Transkriptionsrichtung unmittelbar im Anschluß an die ESE zu inserieren.
Soll eine hohe Produktbildungs- und Sekretionsrate erzielt werden, müssen die Signale der ESE für die Transkription, die Translation und aus Ausschleusung des Genproduktes so beschaffen und angeordnet sein, daß sie vom wirtsspezifischen Expressions- und Sekretionsapparat des Produzentenstammes mit hoher Effizient erkannt und realisiert werden.
Für das gut charakterisierte E. coli-System (gramnegativ) sind bislang mehrere ESEen entwickelt und für die Expression von prokaryotischen und eukaryotischen Genen herangezogen werden.
Beispiele sind die ESEen, die jeweils von der Regulationsregion und Signalpeptidsequenz des Genes für die pBR322-kodierte /3-Lactamase bla (Talmadge et al., PNAS 77,1980,3369 und 3988; Talmädge et al., Nature 294,1981,176; Chan et al., PNAS, 78, 1981,5401; Cornells et al., MGG 186,1982, 507), für die alkalische Phosphatase phoA (Miyake et al., J. Biochem.97,1985,1429), fü r das äußere Membranprotein ompF (Hall, et al., J. Mol. Biol. 146,1981,23 und J. Mol. Biol. 151,1981,1) oder für das Lipoprotein Ipp (Masui et al., in: Exptl. Manip. Gene Express., Academic Press, 1983) abgeleitet sind bzw. aus einem Hybrid der beiden letztgenannten ESEen bestehen (Ghrayeb et al., EMBO Journal 3, 1984, 2437; Takahara et al., J. Biol. Chem. 260,1985, 2670).
Der hauptsächliche Nachteil der im E. coli-System eingesetzten ESEen besteht darin, daß die Genprodukte nicht ins Medium ausgeschieden, sondern in den periplasmatischen Raum sekretiert, hier akkumuliert und dann infolge dort vorhandender proteolytischer Enzyme rasch abgebaut werden. Da die Genprodukte die Wirtszellen nicht verlassen, führen hohe Produktbildungsraten darüber hinaus oft zu erheblichen Wachstumsstörungen der Kultur.
Es werden darum in letzter Zeit verstärkt alternative bakterielle Wirts-Vektorsystem entwickelt, dieneben einer hohen Expression und einer guten fermentativen Handhabbarkeit vor allem eine Sekretion der Produkte in das Kulturmedium ermöglichen sollen.
Diese Voraussetzungen erfüllen die grampositiven Mikroorganismen vor allem vom Genus Bacillus, aber auch vom Genus Streptococcus, von denen Vertreter bereits zur kommerziellen Gewinnung nativerExoenzyme herangezogen werden (siehe zum Beispiel die Wirtschaftspatente DD 144173, DD 156604, DD 157265, DD 158647).
Im Bereich der grampositiven Mikroorganismen sind die Expressions- und Sekretionssignale tragenden DNS-Sequenzen einiger Gene identifiziert, isoliert und kloniert worden. Es gibt jedoch nur wenige Beispiele einer effektiven heterologen Expression/ Sekretion mit Hilfe von ESEen, die von Genen für sekretorische Enzyme aus Bacillus oder aus anderen grampositiven Mikroorganismen abgeleitet sind.
Die vom Penicillinase-penP-Gen aus Bacillus licheniformis abgeleitete ESE führte in B. subtilis zu einer nur geringen Expressionshöhe und zu lediglich 10% Sekretion (Chang et al., GIM-Proceedings 1982, 227).
Als bisher effektivstes Bacillus-System erwies sich die vom a-Amylase-Gen aus Bacillus amyloliquefaciens abgeleitete ESE, die erfolgreich zur Expression und Sekretion (bis zu 95% des gebildeten Produkts) von heterologen pro- und eukaryotischen Genen in B. subtilis eingesetzt wurde (Palva et al., PNAS 79,1982,5582; Palva et al., Gene 22,1983, 229; Lundström, FEMS Microbiol.
Lett. 23,1984,65; Meyer et al., Appl. Envirum. Microbiol. 50,1985,503). Diese ESE hat jedoch den Nachteil, daß die volle Expressionshöhe erst zu Beginn der stationären Wachstumsphase des Produzentenstammes erreicht wird, so daß die ausgeschiedenen Genprodukte durch die in dieser Phase verstärkt einsetzende Bildung von Exoproteasen des Wirtes rasch degradiert werden. Selbst Exoprotease-reduzierte Mutanten führten bisher zu keiner befriedigenden Lösung (Ulmanen et al., Bacteriol. 162,1985,176).
Die aus dem a-Amylase-Gen von B. subtilis konstruierte ESE gestattet zwar eine konstruktive Expression sowie eine effektive Sekretion, erreicht jedoch ein wesentlich geringeres Expressionsniveau (lediglich etwa 10%) im Vergleich zu Expressionsniveau der aus B. amyloliquefaciens gewonnenen ESE (Ohmura et al., J. Biochem.95,1984,87; Shiroza et al., Gene 34,1985,1).
Die aus dem Protein-A-Gen von Staphyloccus au-reus für das Staphylokokken-System entwickelte ESE für ein Fusionsprotein erfordert jeweils die Einführung einer processing site zur Abspaltung des zu gewinnenden Proteins sowie dessen Abtrennung von der toxischen Protein-A-Komponente und ist nicht generell nutzbar (Nilsson et al., NAR 13,1985,1151).
Für das Streptokokken-System wurden bisher keine ESE beschrieben.-
Die Erfindung verfolgt das Ziel, eine neue portable Expressions-/Sekretionseinheit bereitzustellen und zu erproben, die in Verbindung mitTrägerplasmiden in verschiedenen prokaryotischen Wirtssystemen funktionsfähig ist.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein mehrstufiges gentechnologisches Verfahren zu beschreiben, mit dessen Hilfe eine neue konstitutive, portable Expressions- und Sekretionseinheit bereitgestellt und erprobt wird, die bei ihrem über Trägerplasmide vermittelten Einsatz in prokaryotischen, insbesondere grampositiven Wirtssystemen die Nachteile der bisher bekannten technischen Lösungen vermeidet.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe in ihrem Grundzug wie folgt gelöst:
Unter Nutzung von Abschnitten gentechnischer Standardoperationen der DNS-Rekombination wird das Verfahren durch 2 Parallelschritte eingeleitet. Auf der einen Seite wird einem rekombinanten Plasmid, welches ein dem Staphylococcus aureus-Phagen 042D entnommenes DNS-Fragment mit einem Gen für eine neue Staphylokinase aufweist (im weiteren abgekürzt als „042D-SAK+-rekombinantes Plasmid" bezeichnet), als ca. 420bp langes Hinfl-Taql-Teilfragment die native Expressions-/ Sekretionseinheit dieses Staphylokinase-Gens entnommen. Solche 042D-SAK+-rekombinanten Ausgangsplasmide sind im Ergebnis eines Herstellungsverfahrens, welches Gegenstand einer anderen Patentanmedlung ist, kürzlich in verschiedenartiger Modifikation, so als E. coli-Plasmide oder als shuttle-Plasmide für einen ausgewählten Bereich grampositiver Bakteriengattungen, verfügbar geworden (Plasmide der pDB-Familie). Das entnommene Hinfl-Taql-Fragment wird mittels Ausführung einer Klenow-Reaktion für eine nachfolgende blunt end-Ligation (siehe auch Abb. 1) vorbereitet. Auf der anderen Seite wird im Einleitungsschritt des Verfahrens aus einem MLS-Resistenz ausprägenden, Polylinker-tragenden shuttle-Vektor der pGB-Plasmidfamilie (vgl. Wirtschaftspatent DD 234441; die shuttle-Vektoren der pGB-Familie sind shuttles im Bereich der gebräuchlichen grampositiven Bakteriengattungen) durch Insertion des 1 808bp-Sau3A-Fragmentes aus dem literaturbekannten E. coli-Plasmid pTG278 in seinen Polylinkerbereich in Zwischenplasmid, nämlich ein neuer, gleichfalls Polylinker-tragender shuttle-Vektor der pBB-Plasmidfamilie konstruiert. Das genannte spezifische Sau3A-Fragment trägt eine cat-Genbox, d.h. das Strukturgen für eine konstruktive Chloramphenicolacetyltransferase (E.C.2.3.1.28), nebst ihrer nativen SD-Region sowie weiterhin einen Replikationsorigin für E. coli und einige weitere gramnegative Bakterienarten. Durch die gewählte Art der Insertion dieses Sau3A-Fragmentes in den Polylinker des jeweils gewählten pGB-shuttle-Vektors wird gleichzeitig gewährleistet, daß jedes erhaltene Zwischenplasmid der pBB-Familie in einem breiten Wirtsbereich nicht nur als primärer Klonierungsvektor, sondern auch als sog. Promotorsuchplasmid (mit cat als Indikatorgen) verwendet werden kann. Unter dem Aspekt der Einsatzbarkeit in einem breiten Wirtsbereich können mit jeder pBB-Vektorkonstruktion, die in dieser Stufe der vorliegenden erfinderischen Lösung erhalten wird, beispielsweise sowohl Primärklonierungen und funktionell Untersuchungen im gut charakterisierten E. coli-System als auch Vergleichsuntersuchungen in verschieden anderen Wirtssystemen, darunter in den gebräuchlichsten grampositiven Systemen, durchgeführt werden. Ein in diesem Verfahrensschritt als Zwischenplasmid erhaltener pBB-shuttle-Vektor wird bei der Fortführung des Gesamtverfahrens zunächst als Promotorsuchplasmid, d.h. als Vehikel zur Isolation einer Expressionssignale tragenden DNS-Sequenz — hier naturgemäß der eingangs parallel bereitgestellten nativen ESE des 042D-Staphylokinase-Gens (weiterhin verwendete Kurzbezeichnung: native SAK-ESE) —, verwendet. Dazu wird dieser pBB-Vektor in einem unikalen Restriktionsort
seines Polyklinker-Bereiches linearisiert und gegebenenfalls mittels Ausführung der adäquaten Klenow-Reaktion gleichfalls für eine anschließende blunt end-Ligation vorbereitet.
Im nächsten Schritt des Verfahrens werden die so für eine blunt end-Ligation vorbereiteten Komponenten, die ca. 420 bp lange native SAK-ESE, deren DNA-Sequenz aufgeklärt wurde (vgl. Abb. 2), einer— und das jeweils gewählte pBB-Zwischenplasmid andererseits, zu einem neuen, rekombinanten Polylinker-tragenden pBB-shuttle-Vektor mit portabler Expressions-/ Sekretionseinheit (Modifikation I) zusammengefügt. Für den hier erhaltenen Typ von Polylinker-tragenden pBB-Plasmiden mit portabler ESE ist charakteristisch, daß jedes Plasmid dieses Typs einem grampositiven oder -negativen Rezipientenstamm aus dem zugeordneten Wirtsbereich — neben der MLS-Resistenz — die Chloramphenicolresistenz vermittelt, womit die Funktionsfähigkeit der verfahrensgemäß einbezogenen SAK-ESE im gewählten Wirtssystem belegt wird. In diesem Zusammenhang ist auf der Grundlage des vorliegenden Verfahrens der Nachweis für die Funktionsfähigkeit der SAK-ESE in einigen heterologen Wirtssystemen, so in E. coli. Bacillus subtilis, demonstriert worden (s.a. anliegende Tabelle). Damit ist gleichzeitig auch gezeigt, daß sich bereits die pBB-Plasmide des o.g. Typs, d. h. die rekombinanten Polylinker-tragenden pBB-shuttles mit portabler ESE (Modifikation I), für einen Einsatz zumindest als Expressionsvektoren — und das in einem weiten Wirtsbereich — eignen.
Um für die in den pBB-Vektoren des voranstehenden Typs verfügbare portable ESE weiter verbesserte Einsatzmögüchkeiten zu erschließen, wird das Verfahren in seinem Grundzug noch in der Weise fortgesetzt, daß aus einem beliebigen dieser pBS-Vektoren nach Restriktion die portabele ESE (Modifikation I) wiederum isoliert wird und diese mit einem zur Ligation vorbereiteten, an sich bekannten Polylinker-tragenden E. coli-Vektor zu einem neuen, gleichfalls Polylinker-tragenden E. colipBB-Vektor mit portabler Expressions-/Sekretionseinheit (Modifikation II) zusammengefügt wird. Für diesen Verfahrensschritt vorteilhaft heranziehbare Polylinker-tragende E. coli-Vektoren sind unter anderem die Plasmide der pUC-Serie, so pUC8, pUC9, pUC18oder pUC19. Die Ligation wird hier — das ist ein spezifisches Merkmal dieser Umklonierung — so durchgeführt, daß die ESE nunmehr vor allem stromabwärts mit einem Polylinker versehen ist, wodurch insbesondere die Flexiblität beim Anschluß jeweils zu exprimierender Gensequenzen an die hergestellte portable ESE erhöht wird.
Abschließend wird im Verfahren sowohl jeder erhaltene E. coli-pBB-Vektor mit portabler ESE (Modifikation II) wie auch jeder erhaltene pBB-shuttle-Vektor mit portabler ESE (Modifikation I) unter Einbezug eines Strukturgens für ein Protein, etwa für ein Enzym oder für ein Polypeptid, auf seine Leistungsfähigkeit geprüft. Dazu werden Stämme aus dem benannten breiten Wirtsbereich der grampositiven und -negativen Mikroorganismen mit dem jeweiligen pBB-Plasmidvektor, in den korrekt in den Leserahmen der portablen ESE ein Strukturgen, welches für ein quantifizierbares Protein kodiert, inseriert worden ist, transformiert. Die transformierten Produzentenstämme werden jeweils sodann in an sich bekannter Weise submers kultiviert; das jeweils gebildete Genprodukt wird in an sich bekannter Weise gesammelt und auf seine Aktivität geprüft. In weiterer Ausgestaltung ihres Grundzuges ist die Erfindung nun darüber hinaus durch nachstehende Teilschritte charakterisiert:
— Bereitstellung der nativen SAK-ESE
Für die Bereitstellung der nativen ESE wird auf ein SAK+-rekombinantes E. coli-pDB-Plasmid, vorzugsweise auf das E. coli-Plasmid pDB17 (4,1 kb), das verfügbare SAK+-rekombinante Plasmid mit dem kleinsten 042D-DNS-lnsert, zurückgegriffen. Dieses ca. 1,0kb große 042D-lnsert von pDB17 lag in der erwähnten anderen Patentanmeldung übrigens der DNS-Sequenzanalyse des Staphylokinase-Gens zugrunde. Ein mit diesem Trägerplasmid transformierter Stamm, bezeichnet als E. coli294(pDB17), ist in diesem Zusammenhang in der ZIMET-Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen, Zentralinstituts für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften, DDR - 6900 Jena, Beutenbergstr. 11, unter der Registriernummer ZIMET 11136 hinterlegt worden. Benötigte Mengen an Plasmid pDB17-DNS werden aus einer E. coli294(pDB17)-Kultur in an sich bekannter Weise isoliert, gereinigt und in TrisHCI-Puffer gelöst.
Nach Restriktion mit Hinfl und anschließender Auftrennung der Fragmente im Agarosegel wird zunächst ein ca. 0,8 kb-DNS-Fragment, das die gesamte native ESE und den größten Teil des Strukturgens kodiert, isoliert, welches dann einer weiteren enzymatischen Spaltung mit Taql unterzogen wird, wodurch (neben 3 kleineren Fragmenten) das ca. 420 bp-Hinfl-Taql-Fragment erhalten wird, welches die SAK-Regulationsregion und die -Signalpeptidsequenz trägt. Für den essentiellen Bereich dieses Fragmentes ist die DNS-Sequenz bestimmt worden (Subklonierung in M13mp18; Sequenzierungsreaktion nach dem Kettenterminationsverfahren von Sanger). Diese ist in Abb. 2 dargestellt. (Die Hinfl-Spaltstelle ist stromaufwärts die dem Accl-Ort nächstgelegene Spaltstelle). *
Gemäß dem Grundzug des Verfahrens wird das ca. 420bp-Fragment mit der nativen SAK-ESE am Abschluß dieses Verfahrensschrittes durch die Ausführung einer an sich bekannten Klenow-Reaktion für eine anschließende blunt end-Ligation (vgl. Schritt 3 des Gesamtverfahrens) vorbereitet.
— Konstruktion eines pBB-Zwischenplasmids
Da die nach obigem Teilschritt als Hinfl-Taql-Fragment bereitgestellte native SAK-ESE in einem Gemisch mit weiteren ligierbären Restriktionsfragmenten vorliegt, ist es zweckmäßig, das jeweilige pBB-Zwischenplasmid von vornherein in Form eines Promotorsuchplasmides zu konstruieren. Gleichzeitig kam es in diesem Schritt des Gesamtverfahrens auch darauf an, für die isolierte native ESE bereits ein Trägerplasmid mit breitem Wirtsbereich verfügbar zu machen. Innerhalb der Familie der MLS-Resistenz vermittelnden pGB-shuttle-Vektoren bietet das Plasmid pGB363 (8,3kb) die beste Basis für die Konstruktion eines Zwichenplasmids mit diesen Parametern
Dieses Plasmid pGB363
— wird in den grampositiven Wirtsorganismen Bacillus und Streptococcus stabil repliziert,
— trägt einen Polylinker mit unikalen Restriktionsorten für die Enzyme EcoRI, BamHI, Pstl, Smal, Xmal, Hpall, der vielfältige Klonierungsmöglichkeiten bietet und
— weist weitere zur Klonierung geeignete unikale Restriktionsorte außerhalb des Polylinkers auf (u.a. Aval, Bell, BstEII, Sphl). Benötigte Mengen an Plasmid pGB363-DNS werden vorzugsweise in der Weise gewonnen, daß aus einer Kultur von Streptococcus sanguis Challis 57(pGB363) das Plasmid in bekannter Weise isoliert, gereinigt und in TrisHCI-Puffer gelöst wird. Eine biologisch reine Kultur des plasmidtragenden Stammes ist im Zusammenhang mit einer früheren Patentanmeldung in der ZIMET-Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW, DDR-6900 Jena, Beutenbergstraße 11, unter der Registriernummer ZIMET 11192 hinterlegt worden.
In den Polylinker von Plasmid pGB363 wird gemäß dem Grundzug des Verfahrens in Form eines speziellen Fragmentes von Plasmid pTG278 eine cat-Genbox (nutzbar als Indikatorgen) sowie ein Replikationsorigin für E. coli eingefügt. Plasmid pTG278
weist mehrere Spaltorte für das Enzym Sau3A sowie einen unikalen Spaltort für das Enzym BamHI (Enzym Sau3Aistzu diesem Enzym kompatibel), letzteren gerade zwischen dem Promotor und der SD-Sequenz des cat-Gens, auf.
Das Plasmid pTG278 wird in diesem Teilschritt folglich mit dem Enzym Sau3A geschnitten, und die entstandenen Fragmente werden gelelektrophoretisch voneinander getrennt. Das 1 808 bp-Fragment wird in an sich bekannter Weise aus dem Agarosegel isoliert und in TrisHCI-Puffer aufgenommen.
Parallel wird der Vektor pGB363 im Polylinker durch Spaltung mit BamHI geöffnet und mit dem 1 808 bp Sau3A-Fragment in an sich bekannter Wetee ligiert. Aus dem bei obiger Ligation anfallenden Reaktionsgemisch werden die Chimären Plasmide, die nachfolgend als pB B100 bezeichnet werden, in der Weise abgetrennt, daß mit Proben dieses Gemisches kompetente Zellen eines Rezipientenstammes, vorzugsweise S. sanguis Challis 57, subtilis GB500 bzw. E. coli DB11 transformiert, Erythromycinresistente Klone selektiert und einem Screening nach DNS-Molekülen im Größenbereich von 10,1 kb unterzogen werden.
Durch Restriktionsanalyse von DNS-Proben, die aus den einzelnen Transformatenklonen gewonnen werden (vorzugsweise mit EcoRI, Pvull, BamHI), können solche, die die gewünschte Insertorientierung aufweisen und vom Typ pBB100 (Molekülgröße 10,1 kb) sind, identifiziert und von jenen, die vom Typ pGB363 (Molekülgröße 8,3kb) sind, unterschieden werden.
Die nach Standardverfahren ermittelten MIC-Werte für die bevorzugt eingesetzten Wirtssysteme zeigen keine wesentlich erhöhten Resistenzwerte für mit pBB100 transformierte Stämme (vgl. Tabelle), so daß damit der biologische Nachweis für dessen Nutzbarkeit als Promotorsuchplasmid vorliegt.
Das so erhaltene Zwischenplasmid pBB100 (siehe Abb.3) weist folgende vorteilhafte Eigenschaften auf:
— Es kann in grampositiven und gramnegativeo Wirtssystemen replizieren und vermittelt MLS-Resistenz.
— Es trägt eine promotorlose cat-Genbox mit ihrer nativen SD-Region (die 2 mögliche SD-Sequenzen in unterschiedlichem Abstand vom ATG-Startcodon sowie 2 Translationsstop-Signale außerhalb des Leserahmens des cat-Gens enthält) und gestattet, zumindest in E. coli, die Promotorerkennung unabhängig vom Leseraster.
— In ihm stehen unmittelbar vor der SD-Region des cat-Gens zur Promotorklonierung folgende Restriktionsorte des pGB363-Polylinkers zur Verfugung, die die Insertion von Fragmenten mit 3'- und/oder 5'-sticky ends und/oder blunt ends in unterschiedlichen Abständen vom ATG-Startcodon und in allen 3 Leserahmen ermöglichen: BamHI (gestattet außerdem die Klonierung von Sau3A-, BdII- und Bglll-Fragmenten), Xmal/Smal und Pstl.
— Seine weiter stromaufwärts vom cat-Gen gelegenen Restriktionsorte für die Enzyme BstEII, Bell und Sphl sind in Kombinationen mit den o.g. Restriktionsorten des Polylinkers ebenfalls für Promotorklonierungen über den Weg der Fragment-Substitution nutzbar.
Darüber hinaus ist Plasmid pBB100 durch Nutzung der Restriktionsorte für die Enzyme Aval, Ball, BamHI, Bell, BstEII, EcoRI, Pstl, Sphl und Smal/Xmal (einschließlich ihrer Kombination miteinander) für Genklonierungen einsetzbar, und es bietet die Möglichkeit, hierfür bereitgestellte Gene mit der gleichen Vektor-Konstruktion sowohl in grampositiven als auch in gramnegativen Wirtsorganismen zu exprimieren.
— Einfügung der nativen SAK-ESE in Plasmid pBBIOO; Herstellung der Modifikation I der portablen ESE
Benötigte Mengen an DNS von Plasmid pBBIOO werden vorzugsweise aus Kulturen von E. coli DB11(pBB100) in an sich bekannterWeise gewonnen. Nach Linerarisieren des Plasmids mit BamHI —pBBIOO trägt für diese Enzym einen unikalen Spaltort in seinem Polylinker, d. h. unmittelbar vor der Region mit der SD-Sequenz und dem cat-Strukturgen —, werden die entstehenden einzelsträng igen Enden mittels Ausführung einer Klenow-Reaktion für eine blunt end-Ligation vorbereitet, so daß das eingangs bereitgestellte ca. 420bp-Fragment, welches die native ESE des SAK-Genes trägt, durch Ligation nunmehr mit pBBIOO verknüpft werden kann.
Das entstehende rekombinante Plasmid, welches die SAK-ESE auf pBBIOO trägt (im weiteren als Polylinker-tragendershuttle-VektorpBBI OT bezeichnet), wird von allen anderen Ligationsprodukten, die in diesem Verfahrensschritt auftreten können, in der Weise abgetrennt, daß mit Proben des Ligationsgemisches kompetente Zellen der gewählten Rezipientenstämme (vorzugsweise E. coli 294 oder B. subtilis GB500, aber auch Str. sanguis Challis 57) transformiert, anschließend Chloramphicol-resistente Klone selektiert und diese einem Screening nach Plasmiden in der Größenordnung von 10,5kb unterzogen werden. Danach kann dasjenige Ligationsprodukt, das nach Restriktion mit dem Enzym EcoRI ein charakteristisches ca. 0,7 kb-Fragment sowie nach simultaner Spaltung mit den Enzymen EcoRI und BamHI an dessen Stelle zwei charakteristische Fragmente von ca. 0,42kb und ca. 0,25kb Länge aufweist, als Plasmid pBB101 identifiziert werden (Abb. 4).
Die in diesem Prüfprozeß registrierte, vom Plasmid pBB101 vermittelte Chloramphenicol-Resistenz stellt dabei gleichzeitig den Nachweis für die Funktionsfähigkeit der SAK-Regulationsregion in heterologen Wirtssystemen dar (vgl. Tabelle). Auf dem shuttle-Vektor pBB101 liegt im Ergebnis der gewählten Klonierungsstrategie die portable ESE in der Modifikation I vor. Diese ist einerseits dadurch gekennzeichnet, daß der unikale BamHI-Ort von pBBIOO, jetzt gelegen 12 Nukleotide stromabwärts vom Signalpeptid-processing site der SAK-ESE, rekonstituiert worden ist; andererseits ist die Modifikation dadurch charakterisiert, daß der Polylinker mit seinen unikalen Restriktionsorten und weitere unikale Restriktionsorte stromaufwärts von der SAK-ESE angeordnet sind. Die Excision der ESE wird somit vorzugsweise durch Schneiden mit dem Enzym BamHI in Kombination mit einem der Enzyme EcoRI, Smal/Xmal, Pstl, BstEII, Bell oder Sphl realisiert. Dieser Umstand ist für den vielseitigen Einsatz der SAK-ESE in Form eines portablen DNS-Fragments von prinzipieller Bedeutung. Eine biologisch reine Kultur des Stammes E. coli294(pB101) ist in der ZIMET-Hinterlegungsstellefür Mikroorganismen, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften, DDR - 6900 Jena, Beutenbergstraße 11 unter der Registriernummer ZIMET 11134 hinterlegt worden.
Plasmid pBB101 kann bereits als Expressionsvektor eingesetzt werden. Die Insertion eines Strukturgens, d.h. eines Gensohne eigene Expressionssignale, in den unikalen BamHI-Ort dieses Plasmids hat bei korrektem Leseraster Expression sowie gegebenenfalls Sekretion des betreffenden Genprodukts in dem jeweils eingesetzten Wirtssystem zur Folge (vgl. den o. g. Fall der Verknüpfung der SAK-ESE mit der cat-Genbox).
— Herstellung der Modifikation Il der portablen ESE
Wie im Grundzug des Verfahrens ausgeführt, ist es im Sinne einer Erweiterung der Einsatzmöglichkeiten der vorliegenden ESE vorteilhaft, diese auch stromabwärts mit einem Polylinker zu versehen, um die Flexibilität für den Anschluß zu exprimierender Gensequenzen an die ESE zu erhöhen.
Mit Rückgriff auf Plasmid pBB101 wird dieser Verfahrensschritt nun in der weiteren Ausgestaltung des Verfahrens durch Umklonierung der SAK-ESE in das an sich bekannte Polylinker-tragende E. coli-Plasmid pUC19 ausgeführt (vgl. Abb. 1).
Die benötigten Mengen an pBB101-DNS werden hierzu aus einer E. coIi294(pBB101 (-Kultur in an sich bekannter Weise isoliert, gereinigt und in TrisHCI-Puffer gelöst. Die portable ESE wird durch simultanes Spalten des Plasmids pBB101 mit den Enzymen EcoRI und BamHI als EcoRI-BamHI-Fragment (wiederum von ca. 420 bp Länge) gewonnen, gelelektrophoretisch von den anderen Spaltprodukten des Plasmids getrennt, isoliert und für die Ligation vorbereitet.
Benötige Mengen an pUC19-DNS werden in an sich bekannter Weise aus einer Kultur von E. coli JM83(pUC19) isoliert, gereinigt und in Tris-HCI-Puffer gelöst.
Durch gleichzeitige Spaltung mit den Enzymen EcoRI und BamHI wird pUC19 linearisiert und durch nachfolgende Ligation mit dem bereitgestellten pBB101-Fragment, das die SAK-ESE trägt, verknüpft. Anschließend wird ein E. coli-Stamm, vorzugsweise Stamm TG1 oder Stamm 294, mit den in vitro hergestellten Rekombinationsprodukten transformiert.
Bei der Selektion der Transformaten wird der Umstand ausgenutzt, daß das angestrebte rekombinante pUC19-Derivat auf Grund der lnsertionsinaktivierungder/3-Galaktosidase-Bildung und-Komplementation leicht anhand einer ausbleibenden Farbreaktion erkannt werden kann. Es wer den unter den Transformanten, die die Ampicillinresistenz von pUC19, daher solche ausgewählt, die nicht mehr in der Lage sind, /3-Galaktosidase zu bilden (weiße Kolonien). Die Plasmid-DNS solcher Transformanten wird in an sich bekannter Weise in einem Schnellverfahren isoliert und einer vorläufigen Restriktionsanalyse unterzogen. Insbesondere durch Spaltung mit dem Enzympaar EcoRI/BamHI kann das angestrebte ca. 3,2 kb große rekombinante pUC19-Derivat, welches die SAK-ESE in sich aufgenommen hat, identifiziert werden. Dieses Derivat wird im weiteren mit dem Namen Plasmid pBB201 belegt.
Durch die gewählte Klonierungsstrategie kann die Insertion des Fragments mit der ESE in das E. coli-Plasmid pUC19 nur in einer Orientierung erfolgen, nämlich so, daß der Polylinker-Teil dieses Trägerplasmids stromabwärts direkten der SAK-ESE anliegt.
Diese Konstruktion wird, wie im Grundzug des Verfahrens vorgeprägt, als „portable SAK-ESE in der Modifiktation II" bezeichnet
Mit der beschriebenen Konstruktion des E. coli-Vektors pBB201 sind folgende Vorteile verbunden:
a) Die SAK-ESE ist in dieser Modifikation in einer Vielzahl von Varianten als portables DNS-Fragment gewinnbar, da durch die angefügten Polylinker sowohl stromauf- als auch stromabwärts der ESE jeweils eine ganze Gruppe von unikalen Restriktionsorten verfügbar ist, aus der das jeweils günstigste Schema zur Heraustrennung der ESE gewählt werden kann (stromaufwärts: EcoRI, Smal/Xmal, Accl; stromabwärts: Hindlll, Sphl, Pstl, Hincll, Accl, Sail, Xbal, BamHI).
b) Der Vektor pBB201 kann unmittelbar zur Klonierung und Expression von Fremdgenen eingesetzt werden. Da im stromabwärts angeordneten Polylinker eine Vielzahl von unikalen Restriktionsorten vorhanden ist, resultiert eine hohe Variabilität in der Wahl der Klonierungsstrategie, d.h. bei der Verknüpfung der SAK-ESE mit einem zu exprimierenden Strukturgen, in allen 3 Leserahmen.
— Anwendung der ESE zur Expression eines modifizierten humanen Interferons in E. coli
Anschließend werden 2 Verfahrensschritte beschrieben, die die Gesamtdarlegung des Wesens der Erfindung komplettieren. In ihnen wird das Ziel verfolgt, einige der verfahrensgemäß, d. h. unter Rückgriff auf die SAK-ESE, hergestellten Expressionsplasmide auf ihre Leistungsfähigkeit bei der Expression eines eukaryotischen Strukturgas in bakteriellen Wirten zu prüfen. Für diesen Zweck wird ein Strukturgen herangezogen, das für humanes Interferon-Alphai (hlFN-Alpha1) kodiert. Als Quelle für das hlFN-Alpha1-Gen dient das IFN+-rekombinante E. coli-Plasmid pHRW500, welches kürzlich nach dem Verfahren einer anderen Patentanmeldung des Zentralinstituts hergestellt werden konnte. In ihm liegt das hlFN-Alphai-Gen ohneeigene Expressionssignale vor und kann komplett auf einem ca. 0,6 kb großen, von Schnittpunkten für das Restriktionsenzym Sail flankierten DNS-Fragment gewonnen werden (vgl. Abb.1).
Aus der verfahrensgemäß bereitgestellten Kollektion neuer pBB-Plasmide soll im E. coli-System der Vektor pBB201 in bezug auf seine vom SAK-Promotor vermittelte Expression dieses heterologen Gens geprüft werden. Benötigte Mengen an DNS der Plasmide pBB201 und pHRW500 werden vorzugsweise aus Kulturen von E. coli TG 1 (pBB201) bzw. E. coli JM101 (pHRW500) in an sich bekannter Weise isoliert, gereinigt und in TrisHCI-Puffer gelöst.
Nach Restrikation des Plasmides pHRW500 (3,3kb) mit Sail wird das ca. O,6kb-DNS-Fragment mit dem hlFN-Alphal-Strukturgen in an sich bekannter Weise gelelektrophoretisch abgetrennt, isoliert und für die Ligation vorbereitet.
Simultan dazu wird der Vektor pBB201 durch Spaltung gleichfalls mit Sail in seinem Polylinker unmittelbar stromabwärts der SAK-ESE linearisiert und nachfolgend durch Ligation mit dem bereitgestellten Sall-Fragment aus pHRW500 verknüpft. Mit dem bei dieser Ligation anfallenden Gemisch rekombinater Plasmide werden kompetente Zellen eines E. coli-Rezipientenstammes, vorzugsweise des Stammes E. coliTGI oder E. coli 294, transformiert und einer Selektion auf Ampicillinresistente Klone unterworfen. In einem anschließenden Screening werden in an sich bekannter Weise diejenigen Klone identifiziert, die rekombinante Plasmide in der Größe von 3,8kb beherbergen. Unter diesen wird schließlich durch Restriktionsanalyse vorzugsweise mit den Enzymen EcoRI, Sail und BamHI das Plasmid pBB202 identifiziert. Dieses trägt das ca. 0,6kb hlFN-Alpha1-Fragment in korrekter Orientierung zur SAK-ESE (vgl. Abb. 6). E. coli-Wirtsstämme, die Plasmid pBB202 tragen, sind zur Expression von modifiziertem hlFN-Alpha1 befähigt. In Ausführungsbeispiel 2 ist dieser Sachverhalt für den Fall des Stammes E. coliTGI (pBB202) verifiziert worden; die Abb. 8 zeigt den Verlauf der Bildung des biologisch aktiven modifizierten hlFN-Alpha1 während einer submersen Kultivierung dieses Wirtsstammes (nach 8 Stunden Kultivierung liegt die IFN-Produktion unter den gewählten Bedingungen von 3 χ 108IE/l).
Eine biologisch reine Kultur des Stammes E. coli TG1 (pBB202) ist in der ZIMET-Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften, Beutenbergstr. 11, Jena, DDR-6900 unter der Registriernummer ZIMET 11134 hinterlegt worden.
Durch die gewählte Strategie für die Konstruktion der vorliegenden portablen ESE resultiert als Genprodukt ein hlFN-Alpha1-Fusionsprotein, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß am N-terminalen Ende des reifen Interferons eine zusätzliche Aminosäuresequenz angefügt ist. Diese wird aus der DNS-Sequenz im Abschnitt vom Signalpeptid-processing site bis hin zum Fusionsort der ESE mit dem IFN-Strukturgen generiert (vgl. Abb.7). Biologisch aktives hlFN-Produkt wurde sowohl in der periplasmatischen als auch in der intrazellulären Fraktion bestimmt.
— Anwendung der ESE zur Expression eines modifizierten humanen Interferons in grampositiven Mikroorganismen Um die Expression des hlFN-Alpha1-Gens unter Kontrolle der SAK-ESE auch in grampositiven Wirten wie B. subtilis oder
S. sanguiszu ermöglichen, ist die Übertragung dieses Gens auf ein Trägerplasmid erforderlich, das in diesen Wirtsorganismen replikationsfähig ist. Diese Aufgabe wird in der Weise gelöst, daß entweder der shuttle Vektor pGB363 oder das verfahrensgemäß gewonnene Zwischenplasmid pBB100 sowohl mit der SAK-ESE als auch mit dem hlFN-Alphal-Strukturgen
gekoppelt und das jeweils resultierende rekombinante Plasmid in grampositive Wirte eingebracht wird (vgl. Abb. 1).
Für die Konstruktion dieser rekombinanten Plasmide wird im Verfahren vorteilhaft der Umstand ausgenutzt, daß auf dem Vektor pBB202 die hlFN-Alphai-Genbox bereits verknüpft mit der SAK-ESE vorliegt und in Form eines ca. 1,0kb-EcoRI-Fragments gewinnbar ist.
Benötigte Mengen an DNS der Plasmide pBB202 und beispielsweise pBBIOO werden vorzugsweise aus Kulturen von E. coliTGI (pBB202) und von E. coli DB 11 (pB100) in an sich bekannter Weise isoliert, gereinigt und in TrisHCI-Puffer gelöst. Plasmid pBB202 wird mit dem Enzym EcoRI geschnitten, und das dabei anfallende ca. 1,0 kb große Fragment wird in an sich bekannter Weise gelelektrophoretisch abgetrennt, isoliert und gereinigt. Nach Mischen diese Fragmentes mit dem ebenfalls mit EsoRI linearisierten Trägerplasmid pBBIOO erfolgt deren Verknüpfung mittels einer DNS-Ligase.
Mit dem entstandenen Ligationsgemisch, welches auch Plasmide enthält, in denen das genannte ca. 1,0kb große,'das hl FN-Alpha1-gen tragende Fragment inseriert in pBBIOO vorliegt — Chimären dieses Typs werden nachfolgend als pBB203 bezeichnet —, werden zunächst kompetente Zellen eines E. coli-Stammes, vorzugsweise des Rezipienten E. coli DB/11, transformiert. Erythromycin-resistente Klone werden einem Screening auf Plasm ide der Größenordnung 10,8kb unterzogen, und innerhalb der in der Reaktion erhaltenen Plasmidgruppe dieser Größenordnung führt eine Restriktionsanalyse vorzugsweise mit den Enzymen EcoRI, BamHl, Sail, BgII! und Pst! zur eindeutigen Identifizierung des Plasmides pBB203 im Sinne von Abb. 7. In entsprechender Weise wird bei der Konstruktion und Identifizierung des neuen hlFN-AIpha1 ^-rekombinanten PlasmidspBB2031, welches durch Verknüpfung des ca. 1,0kb großen EcoRI-Fragments von pBB202 mit dem im unikalen EcoRI-Ort linearisierten Vektor pGB363 hergestellt worden ist, vorgegangen.
E. coli-Klone, die Plasmid pBB203 oder Plasmid pBB21031 enthalten, werden nun zunächst auf ihre Fähigkeit, h!FN-A!pha1 zu produzieren, untersucht. Der positive Befund liefert den schlüssig en N ach weisfür die strukturelle Intaktheit der (S AK-ESE-h IFN-Aiphai (-Region auf pBB203 bzw. auf pBB2031.
In nachfolgenden Transformationen wird Plasmid pBB203oderpBB2031 dann in grampositive Wirte, vorzugsweise in solche aus den Arten B. subtilis, beispielsweise in B. subtilis GB500, und Streptococcus sanguis, beispielsweise in S. sanguis Challis 57, überführt.
Die erhaltenen Transformantenklone werden, wie im voranstehenden Anwendungsfall beschrieben, nach Vorselektion auf Erythromycin-Resistenz durch Restriktionsanalyse der aus ihnen isolierten DNS identifiziert sowie auf ihr hlFN-Bildungsvermögen hin untersucht.
Es konnte gezeigt werden, daß grampositive Wirtsstämme, die Plasmid pBB203 oder pBB2031 tragen, nach Kultivierung zur .
Expression und Sekretion von biologisch aktivem, modifiziertem hl FN-Al ρ hai befähigt sind. (Darüber hinaus sind auch pBB203-tragende E. coli-Wirte, z.B. DB11, zur hlFN-Alphai-Expression fähig.)
In Ausführungsbeispiel 3 ist dieser Sachverhalt unter Rückgriff auf den Produzenten B. subtilis GB500 (pBB203) verifiziert worden. Die Abb. 9 zeigt den Verlauf der hl FN-Al ph a 1-BiI du ng (modifiziertes Protein) während einer 8stündigen submersen Kultivierung dieses Stammes. Nach ca. 7stündiger Kultivierung liegt die IFN-Produktion im Bereich von 1,5 χ 109IE/I (Beispiel für einen durchschnittlichen Lauf), wobei das Genprodukt zu 99% im Kulturmedium aufzufinden ist. Wie die Produktbildungskinetik erkennen läßt, erfolgt die IFN-Bildung konstitutiv bereits in der exponentiellen Wachstumsphase des Wirtes.
Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens bestehen darin, daß Plasmidvektoren, u.a. solche mit breitem Wirtsbereich, herstellbar sind, die eine effektive heterologe Ausprägung von Fremdgenen unter der Kontrolle der Expressions-/ Sekretionssignale des SAK-Genes des Staphylococcus aureus-Phagen 042D ermöglichen, welche vor allem dadurch gekennzeichnet ist, daß
— die Genprodukte konstitutiv in der exponentiellen Wachsumsphase des Wirtsorganismus gebildet und
— bei Verwendung von grampositiven Wirten mit hoher Effizienz ins Medium ausgeschieden werden.
Der Einsatz von derartigen Plasmiden wurde am Beispiel der Expression/Selektion eines modifizierten humanen Interferon-Alphai-Genes besonders vorteilhaft im Bacillus subtilis- sowie im E. coli-System demonstriert. Ausführungsbeispiele
Die folgenden Ausführungen sollen an einigen Beispielen die einzelnen Schritte des Verfahrens zur Herstellung rekombinanter Plasmide mit breitem Wirtsbereich sowie portabler Expressions-/Sekretionseinheit (ESE) näher veranschaulichen. Sie enthalten dabei jedoch keine detaillierten Angaben zu den herangezogenen Standard verfahren der Gentechnologie und der Mikrobiologie (wie Gewinnung von Piasmid-DNS, Spaltung von DNS mit Restriktionsenzymen, Darstellung und Charakterisierung von Plasmid-DNS mittels Agarose-Gelelektrophorese, Gewinnung von DNS-Fragmenten aus Agarosegelen, Umwandlung von sticky ends in blunt ends, Einfügen von Gensequenzen in Vektorpl asm ide, Transformati on von bakteriellen Rezipientenstämmen mit Plasmid-DNS, Kultivierung von Mikroorganismen, DNS-Sequenzanalyse und Ermittlung von MIC-Werten). Solche Verfahren sind dem Fachmann bekannt und in einer Reihe von Veröffentlichungen ausführlich beschrieben, beispielsweise in:
— "Advanced Bacterial Genetics, a Manual for Genetic Engineering" (R.W. Davis, D. Botstein, J. R. Roth), Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980;
— "MolecularCloning,a Laboratory Manual" (T. Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sam brock), Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982;
— Monographien der Serie „Methods in Enzymology", Acad. Press, Bände 65 (1980), 68 (1980), 100(1983), 101 (1983);
— Monographien der Serie „Methods in Microbiology", Acad. Press, Bände 1 (1969), 2(1970), 3A (1970), 5B (1971), 6A(1971) sowie 17 (1984).
Beispiel 1: Herstellung der pBB-Plasmide
1.1. Bereitstellung der nativen ESE als ca. 420bp-Hinfl-Taql-Fragment
Die native ESE, d.h. die Region zur Regulation von Transskription sowie Translation und die Si g na I peptidsequenz, des gewählten SAK-Genes wird dem Trägerplasmid pDB17 unter Nutzung der spezifischen Anordnung der Restriktionsorte des Genes entnommen.
Zu nächst wird die benötig te Menge an Plasmid pDB17-DNS (ca. 10 μg) a us einer Kultur von E. coli 294 (ρ DB17) isoliert, gereinigt und in TrisHCI-Puffer gelöst. In der Folge wird unter Nutzung bekannter Methoden nach Restriktion der Plasmid-DNS mit dem Enzym Hinfl und anschließender Auftrennung der Fragmente im Agarosegel zunächst ein ca. O,8kb-DNS-Fragment, das die gesamte ESE und den größten Teil des SAK-Strukturgenes kodiert, isoliert. Dieses wird dann einer weiteren enzymatischen
Spaltung mit der Restriktase Taql unterzogen, wodurch neben drei kleineren Fragmenten das ca. 420bp Hinfl-Taql-Fragment entsteht. Nach Auffüllen der sticky ends der Fragmente mittels Klenow-Fragment der DNS-Polymerase wird das Reaktionsgemisch, welches auch das Hinfl-Taql-Fragment der nativen SAK-ESE enthält, für die blunt-end-Ligation in Punkt 1.3 bereitgestellt.
1.2. Konstruktion des Zwischenplasmids pBB100
Nachfolgend wird die Konstruktion des Zwischenplasmids pBB100 beschrieben, welches wahlweise entweder als Promotorsuchplasmid oder als Klonierungsvektor eingesetzt werden kann und sowohl in den grampositiven Wirten B. subtilis und S. sanguis als auch im gramnegativen Wirt E. coli repliziert wird.
Als Ausgangsplasmid wird der MLS-Resistenz vermittelnde Bacillus-Streptococcus-shuttle-Vektor pGB363 eingesetzt. Eine ausreichende Menge an pGB363-DNS (ca. 5,u,g) wird aus einer Kultur von S. sanguis Challis 57(pGB363) in bekannter Weise isoliert, gereinigt und in TrisHCI-Puffer gelöst. Die so vorbehandelte pGB363-DNS wird durch Spaltung mit dem Enzym BamHI linearisiert und dzur Ligation vorbereitet.
Als Quelle des Indikatorgenes (der cat-Genbox) und des Replikationsorigins für E. coli dient das Chloramphenicol- und Ampicillin-Resistenz vermittelnde Plasmid pTG278. Die benötigte Menge an Plasmid pTG278-DNS (ca. 5/xg) wird aus einer Kultur von E. coli294 (pTG278) in bekannter Weise isoliert, gereinigt und in TrisHCI-Puffer gelöst.
Das Plasmid pTG278 wird nun mit dem Enzym Sau3A geschnitten, und die entstandenen Fragmente werden gel elektrophoretisch voneinander getrennt. Das 1 808 bp-Frag ment wird in an sich bekannter Weise aus dem Agarosegel isoliert und ebenfalls zur Ligationsreaktion vorbereitet. Anschließend wird der mit BamHI geöffnete Vektor pGB363 mit dem gewonnenen 1 808bp-Sau3A-Fragment aus pTG278 unter Zuhilfenahme von T4-Ligase verknüpft.
Aus dem bei dieser Ligation anfallenden Reaktionsgemisch wird das chimäre Plasmid pBBIOO in der Weise abgetrennt, daß mit Proben des Gemisches kompetente Zellen des Rezipientenstammes S. sanguis Challis 57 tranformiert, Erythromycin-resistente Klone selektiert und im ersten Teilschritt einem Screening nach DNS-Molekülen im Größenbereich von 10,1 kb unterzogen werden.
Durch Restriktionsanalyse von Plasmid-DNS-Proben, die aus den einzelnen Transformantenklonen gewonen werden, mit EcoRI, SauSA, Pvull und BamHI werden dann solche Plasmid-DNS-Proben identifiziert, die vom pBB100-Typ sind (Molekülgroße 10,1 kb; Insertorientierung gemäß Abb.3).
Abschließend werden mit aus S. sanguis Challis 57 (pBBIOO) gewonnener pBB100-DNS kompetente Zellen der alternativen Wirtsorganismen E. coli DB11 sowie B. Subtilis GB500 transformiert und in o.a. Weise die Klone vom Typ pBBIOO selektiert und identifiziert.
Durch Größenvergleich und Restriktionsanalyse wird im nächsten Schritt die Identität der aus den alternativen Wirtssystemen gewonnenen Plasmid-DNS vom Typ pBBIOO gezeigt, und gemäß Standardverfahren werden die MIC-Werte gegenüber dem Antibiotikum Chloramphenicol für die eingesetzten Wirtsorganismen ermittelt. Sie sind aus der beigefügten Tabelle ersichtlich und erbringen den Nachweis für die Einsetzbarkeit des Vektors pBBIOO als Promotorsuchplasmid.
1.3. Klonierung der nativen ESE des SAK-Genes
Zur Klonierung der nach dem Teilverfahren gemäß Punkt 1.1 bereitgestellten nativen SAK-ESE wird das in Punkt 1.2 konstruierte Zwischenplasmid pBBIOO herangezogen.
Die benötigte Menge an pBB100-Plasmid-DNS (ca. 5μg) wird aus Kulturen von E. coli DB11 (pBBIOO) gewonnen, durch Restrikation mit BamHI geöffnet, nach Auffüllen der sticky ends mittels Klenow-Fragment der DNS-Polymerase zur blunt-end-Ligation vorbereitet und mit dem gemäß Punkt 1.1 gewonnenen ca. 420bp-Fragment, welches u.a. die Promoterregion des SAK-Genes trägt, unter Zuhilfenahme von T4-Ligase verknüpft.
Das hierbei entstehende rekombinate Plasmid pBB 101, welches die SAK-ESE auf pBBIOO trägt, wird von allen anderen Ligationsprodukten, die auftreten können, in der Weise abgetrennt, daß mit Proben des Ligationsgemisches kompetente Zellen des Rezipientenstammes E. coli294 transformiert, Chloramphenicol-resistente Klone selektiert und einem Screening nach Plasmiden in der Größenordnung von 10,5kb unterzogen werden, wonach diejenigen von ihnen, die nach Restriktion mit EsoRI ein charakteristisches ca. O,7kb-Fragment sowie nach simultaner Spaltung mit EcoRI und BamHI an dessen Stelle zwei charakteristische Fragmente von ca. 0,42 kb und 0,25kb aufweisen, als Plasmide vom Typ pBB101 identifiziert werden (Abb.4). Auf pBB101 liegt die SAK-ESE als portable ESE in der Modifikation Ivor.
Eine zusätzliche Bestätigung dafür, daß aus dem im Ergebnis des Teilverfahrens von Punkt 1.1 vorliegenden Fragmentgemisch tatsächlich das SAK-Promotorfragmentkloniert wurde (und auf Plasm id pBB101 vorliegt), erfolgte durch Umklonieren dieses ca. 420bp-EcoRI-BamHI-Fragments aus pBB101 in die simultan ebenfalls mit EcoRI und BamHI geschnittene replikative Form der Bakteriophagen-M13mp18-DNS nebst anschließender Sequenzanalyse nach dem bekannten Kettenterminationsverfahren (Sanger-Technik).
Durch Vergleich der ermittelten DNS-Sequenz des oben genannten ca. 420bp-Fragments aus pBB101 mit der aus einer parallelen Patentanmeldung bekannten DNS-Sequenz der nativen ESE der 042D-SAK-Genes (vgl. Abb. 2) konnte Identität festgestellt werden.
1.4. Herstellung von Modifikation Il der portablen ESE
Diese Aufgabenstellung wird durch Umklonierung der nach Punkt 1.3 hergestellten, auf pBB101 vorliegenden portablen ESE in das Polylinker-tragende E. coli-Plasmid pUC19 gelöst.
Eine ausreichende Menge an pBB 101 -Plasmid-DNS (ca. 10μg) wird aus Kulturen von E. coli294 (pBB101) isoliert, gereinigt und in TrisHCI-Puffer gelöst. Die portable ESE wird nach simultaner Restrikation mit den Enzymen EcoRI und BamHI alsca.420bp-EcoRI-BamHl-Fragment aus dem Plasmid pBB101 gewonnen und gelelektrophoretisch vom gleichzeitig anfallenden ca. 250bp-Fragment (N-terminalerTeil des cat-Genes) sowie dem Rest des Trägerplasmides abgetrennt, isoliert und für die Ligation vorbereitet.
Die benötigte Menge an pUC19-Plasmid-DNS (ca. 5/xg) ihrerseits wird aus Kulturen von E. coliJM83 (pUC19) isoliert, gereinigt und in TrisHCI-Puffer gelöst. Durch simultane Spaltung mit den Restriktasen EsoRI und BamHI wird pUC19 zur Insertion der wie oben beschrieben als ca. 420bp-EcoRI-BamHI-Fragment bereitgestellten portablen ESE vorbereitet. Die Ligationsreaktion wird in an sich bekannter Weise unter Zuhilfenahme von T4-Ligase ausgeführt. Anschließend werden die SAK-ESE-tragenden Chimären von pUC19, die als pBB201 bezeichnet werden, in der Weise selektiert, daß mit Proben des Ligationsgemisches kompetente
Zellen von E. coli TG1 transformiert, sowohl Ampicillin-resistente als auch /3-Galaktosidase negative (weiße) Klone ausgewählt und einem Screening nach Plasmiden in der Größenordnung von 3,2kb unterzogen werden. Hierbei wird der Umstand ausgenutzt, daß auf o.g. Art erzeugte rekombinante pl)C19-Chimären aufgrund des Ausfalls der/3-Galaktosidase-Bildung durch Insertation im lacZ-Strukturgen (Polylinker von pUCI 9) leicht anhand des Ausbleibens der bekannten Farbreaktion von 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-/3-D-galactopyranosid (BCIG) nach Induktion mit lsopropyl-/3-D-thiogalactopyranosid (IPTG) erkannt werden können.
Anhand des spezifischen Restriktionsmusters der rekombinanten Plasmide nach Behandlung mit BamHI oder/und EcoRI lassen sich jene Klone, die das Plasmid pBB201 (s.a. Abb.5) tragen, eindeutig identifizieren (Auftreten eines charakteristischen ca. 420bp-Fragments nach simultaner Restrikation mit diesen Enzymen). .
Beispiel 2: Anwendung der ESE zur Expression eines modifizierten humanan Interferons-Alphai in E. coli
2.1. Herstellung des Expressionsvektors pBB202
Eine Genbox für reifes hlFN-Alpha1 ohne eigene Expressionssignale wird aus dem Plasmid pHRW500 in Form eines ca. 0,6-kb-Sall-Fragments bereitgestellt; die Konstruktion des Expressionsvektors wird in einem Ein-Schritt-Verfahren durch Insertion des genannten^ca. O,6kb-Sall-Fragments in den unikalen Sall-Ort von pBB201 durchgeführt (vgl.Abbn.1 und 5).
Die benötigten Mengen an DNS der Plasmide pBB201 (ca. 5/xg) und pHRW500 (ca. 10/zg) werden aus Kulturen von E. coli TG KpBB201) bzw. E. coli JM101 (pHRW500) isoliert, gereinigt und in TrisHCI-Puffer gelöst.
Nach Restriktion des Plasm ides pH RW500 mit SaI! wird das ca. 0,6-kb-Frag ment gel elektrophoretisch abgetrennt, isoliert und für die Ligation vorbereitet.
Der Vektor pBB201 wird durch Spaltung mit Sail im Polylinker unmittelbar stromabwärts der ESE geöffnet undmitdem bereitgestellten Fragment, welches die hlFN-Alpha1-Genbox trägt, unter Zuhilfenahme von T4-Ligase verknüpft.
Aus dem dabei anfallenden Reaktionsgemisch werden rekombinante Plasmide pBB202, welche das ca. 0,6-kb-Sall-Fragment in der richtigen Orientierung, d.h. in der Transkriptionsrichtung der ESE, auf pBB201 tragen (s.a. Abb. 6), in der Weise abgetrennt, daß kompetente Zellen des Rezipientenstammes E. coli TG1 mit Proben dieses Gemisches transformiert, Ampicillin-resistente Klone selektiert und einem Screening nach Plasmiden der Größenordnung von ca. 3,8kb unterzogen werden, wonach durch Restriktionsanalyse mit EcoRI, Sail und BamHI die Plasmide vom Typ pBB202 eindeutig identifizierbar sind (Plasmid pBGB202 zeigt nach Restriktion mit EcoRI ein charakteristisches ca. 1,0-kb-Fragment sowie nach Sail-oder BamHI-Behandlung ein ebenso charakteristisches ca. O,6kb-Fragment).
E. coli-Wirtsstämme, die Plasmid p3B202 tragen, sind fähig zur Expression von biologisch aktivem, modifiziertem hlFN-Alpha1.
2.2. Expression von biologisch aktivem, modifiziertem hlFN-Alpha1 in E. coli
Zur Gewinnung von hlFN-Alpha1 obiger Kennzeichnung wird der Produzentenstamm E. coliTG1(pBB202) eingesetzt. Als Kulturmedium wird Nährbouillon II, bestehend aus
Pankreatisches Pepton (Fleisch, Gelatine, Kasein) 6,75 g/l
Eiweißhydrolysat 1,75 g/l
Hefeextrakt 1,50 g/l
NaCI 5,00 g/l
nach 12minütiger Sterilisation bei ca. 120°C (pH 7,2 ± 0,3) mit einem Zusatz von 80μg Ampicillin/ml Medium verwendet. Die Kultur wird submers bei 37°C auf einem Rotationsschüttler (220 U/min) geführt.
Die Kultivierung erfolgt in den Stufen Vor- und Hauptkultur. Zunächsst wird eine Vorkultur (ca. 10ml) von einer Einzelkolonie abgeimpft und über Nacht angezogen. Für die Hauptkultur werden mehrere Kölbchen mit je 10ml Medium parallel beimpft (1 % v/v) und stufenweise (nach je 4 Stunden bis 10 Stunden Fermentationszeit) abgebaut. Der Wachstumszustand der Kultur wird anhand der optischen Dichte (550 nm) überprüft.
Nach Beendigung der Kultivierung werden die E. coli-Zellen sedimentiert (5 Minuten bei 5000U/min). Eine Probe des Überstandes wird bis zur biologischen Testung bei -2O0C aufbewahrt. Nach Resuspension werden die Zellen einem Lysozym-Ultraschallaufschluß unterzogen. Nach Separation der Zeilreste (Membranfiltration bzw. Zentrifugation) wird die so gewonnene Fraktion bis zur Bestimmung der biologischen Aktivität ebenfalls bei -20°C aufbewahrt.
Die Bestimmung der biologischen Aktivität, d.h. des hlFN-Gehaltes, erfolgt in Anlehnung an Rubinstein et al., J. Virol. 37,1981, 755-758 in Mikrotestplatten. Zur Bewertung wurde die 50%ige Hemmung des zytopathischen Effektes von VSV auf der bovinen Zellinie MDBK herangezogen (mikroskopische Ablesung). Die Titer-Ermittlung wurde anhand eines mitgeführten, nach internationalen Einheiten geeichten Laborstandards hlFN-Alpha leu vorgenommen (vgl. M.Tonew et al., J.'Basic Microbiol., 26,
Die Bildung ski netikderin der Zellfraktion bestimmten biologischen h IFN-AI ph a 1-Aktivität ei η er repräsentativen Fermentation ist in Abb. 8 dargestellt. Charakteristisch ist der parallele Verlauf von Biomasse- und Produktbildung.
Die hlFN-Alpha1-Aktivität im Kulturüberstand lag bei Werten um ca. 10% der Gesamtaktivität.
Beispiel 3: Anwendung der ESE zur Expression eines modifizierten humanen Interferons-Alphai in grampositiven Mikroorganismen
3.1. Herstellung des Expressionsvektors pBB203
Diese Aufgabe wird in diesem Beispiel durch Übertragung des ca. 1,0-kb-EcoRI-Fragmentes von Plasmid pBB202, welches die mit der SAK-ESE verknüpfte hlFN-Alpha1-Genbox aus pHRW500 enthält, auf das auch in grampositiven Wirten replizierbare Trägerplasmid pBB100 gelöst.
Die benötigten Mengen an DNS der Plasmide pBB100 und pBB202 (ca. je 5/xg) werden aus Kulturen von E. coli DB11(pBB100) bzw. E. coliTG1(pBB202) isoliert, gereinigt und in TrisHCI-Puffer gelöst.
Nach Restrikation von pBB202 mit EcoRI wird das dabei anfallende ca. 1,0-kb-Fragment gelelektrophoretisch abgetrennt, isoliert und mit dem mit EcoRI geöffneten Vektor pBB100 unter Verwendung von T-4-Ligasee verknüpft.
Aus dem Ligationsgemisch werden chimäre Plasmide, auf welchen das besagte ca. 1,0-kb-EcoRI-Fragmentauf pBB100 integriert vorliegt (nachfolgend als pBB203 bezeichnet), in der Weise abgetrennt, daß kompetente Zellen des Rezipientenstammes
B.subtiiisGB500 mit Proben des Ligationsgemisches transformiert, Erythromycin-resistente Klone selektriert, einem Screening nach Plasmiden der Größenordnung 10,8kb unterzogen und durch Restriktionsanalyse mit den Enzymen EcoRI, BamHI, Sail, BgIII und Pstl eindeutig identifiziert werden. Die unikalen Restrikationsortefür Sail und BgII können hier nur gefunden werden, wenn das o.g. Insert vorliegt. Die Insertorientierung wird beispielsweise durch simultane Restriktion der DNS der erhaltenen chimären Plasmide mit Pstl und BgII {oder mit Pstl und Sail) ermittelt, da nur beim Plasmid pBB203 gemäß Abb.7 ein charakteristisches ca. 300bp-Pstl-Bglll-Fragment (bzw. ein ca. 600bp-Pstl-Sall-Fragment) anfällt.
Wirtsstämme von B. subtilis, die das Plasmid pBB203 enthalten, sind zur Expression und Sekretion von biologisch aktiven,
modifiziertem hlFN-Alpha1 befähigt (s.a. Punkt 3.2). —
3.2. Sekretion von biologisch aktivem, modifiziertem hlFN-Alpha1 durch B. subtilis Zur Herstellung des genannten Produkts wird hier der in Punkt 3.1 dieses Ausführungsbeispiels hergestellte gentechnisch manipulierte Produzentenstamm B. subtilisGB500 (pBB203) eingesetzt.
Eine Nährlösung der Zusammensetzung
Rinderherzinfusion | 500 g/l |
Neopepton | 20 g/l |
Bacto-Dextrose | 2g/l |
NaCI | 2 g/l |
Na2HPO4 | 0,4 g/l |
Na2CO3 | 2,5g/l |
wird nach 15minütiger Sterilisation bei ca. 1200C (pH 7,8 ± 0,3) mit einem Zusatz von 0,1% bis 1,0%, vorzugsweise 0,5%, Glucose sowie von 5^g Erythromycin/ml als Kulturmedium verwendet. Die Kultivierung wird submers bei 37°C auf einem Rotationsschüttler (220U/min) durchgeführt; sie erfolgt in den Stufen Vor- und Hauptkultur.
In einem ersten Schritt wird eine Vorkultur (ca. 10 ml) von einer Einzelkolonie beimpft und über Nacht angezogen. Mit 1 % dieser Vorkultur werden in 500-ml-Rundkolben je 100 bis 200 ml Hauptkulturmedium beimpft. Anhand der optischen DiGhte (bei 550 nm) wird während der Fermentation der Wachstumszustand der Kultur überprüft. Der Kultur werden stündlich steril 1-ml-Proben entnommen, die bei 12000 U/min zentrifugiert werden. Der Überstand wird bis zur Bestimmung der biologischen Aktivität bei -2O0C aufbewahrt.
Die sedimentierten Zellen werden jeweils in 0,1 ml Lysozym-Puffer-Lösung (10mg Lysozym/ml 1OmM Tris; pH 8,0; +1 mM EDTA) resuspendiert und 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Durch Zugabe von 0,9 ml 0,1 %igem Na-Dodecy!sulfat werden die Zellen anschließend lysiert, die Zeilreste werden durch 5minütige Zentrifugation bei 12000U/min sedimentiert und der hierbei erhaltene Überstand gleichfalls bis zur Bestimmung der biologischen Aktivität bei —200C gelagert.
Die biologische Aktivität wird nach dem in Beispiel 2 beschriebenen biologischen Test ermittelt.
Die Bildungskinetik der im Kulturüberstand bestimmten hlFN-Alpha1 -Aktivität einer repräsentativen B. subtilis GB500(pBB203)-Fermentation ist in Abb. 9 dargestellt. Charakeristisch ist wiederum (vgl. Abbl.8sowie Punkt 2.2 von Beispiel 2) die Parallelität im Verlauf von Biomasse- und Produktbildung.
Die in der Zellfraktion bestimmte biologische Aktivität von hlFN-Alpha1 überstieg nicht 1% der im Kulturmedium vorgefundenen Aktivität.
Das vom Produzentenstamm B.subtilis GB500(pBB203) sekretierte modifizierte hlFN-Alpha1 ist dadurch gekennzeichnet, daß am N-terminalen Ende des reifen hlFN-Proteins folgende 11 zusätzliche Aminosäuren
N'Ser-Ser-Ser-Phe-Gly-Ser-Ser-Arg-Val-Asp-Met
angefügt sind. Diese werden durch die DNS-Sequenz im Bereich vom Signalpeptid-Spaltort der SAK-ESE mit zum Fusionspunkt der IFN-Genbox mit dem Polylinker-Teil von pUC19 (vgl. Abb.7) generiert, die im Ergebnis der.gewählten Klonierungsstrategie entstanden ist.
Der vorliegende Befund wurde durch Bestimmung der N-terminalen Aminosäuren (manuelle Edmann-Degradation) des in das Kulturmedium sekretierten modifizierten hlFN-Alpha1 erhalten.
Strain
Plasmid
CmR(/xg/ml)
Streptococcus sanguis Challis 57 Streptococcus sanguis Challis 57 Streptococcus sangius Challis 57 Escherichia coli DB11 Escherichiacoli DB11 Escherichia coli 294 BacillussubtilisGB500 Bacillussubtilis GB500 BacillussubtilisGB500 Escherichia coli 294 Bacillussubtilis GB500 Streptococcus sangius Challis 57
— | 1 |
pGB363 | 2 |
pBB100 | 2 |
- | 0,5 |
pBB100 | 4 |
- | 4 |
- | 2 |
pGB363 | 4 |
pBB100 | 4 |
pBB101 | 250 |
pBB101 | 60 |
pBB101 | 4 |
Claims (29)
1. Verfahren zur Herstellung rekombinanter Plasmide mit breitem Wirtsbereich sowie portabler Expressions-/Sekretionseinheit (s'nuttle-Vektoren) und Anwendung von Abschnitten gentechnischer Standardoperationen der DNS-Rekombination, gekennzeichnet dadurch, daß man
— parallel zunächst
a) einem rekombinanten Plasrnid, welches ein dem Staphylococus aureus-Phagen 042D entnommenes DNS-Fragmant mit einem Gen für eine neue Staphylokinase aufweist (Kurzformulierung: 042D-SAK+-rekombinantes Plasmid), als ca. 420bp langes Hinfl-Taql-Teilfragment die native Expressions7Sekretionseinheit diese Staphylokinase-Gens entnimmt und mittels Ausführung einer Klenow-Reaktion für eine nachfolgende blunt end-Ligation vorbereitet sowie
b) aus einem MLS-Resistenz ausprägenden, Polylinker-tragenden shuttle-Vektor der pGB-Plasmidfamilie durch Insertion des 1808bp langen Sau3A-Fragments von Plasmid pTG278, welches neben einer SD-Sequenz und neben dem Gen für eine konstitutive Chloramphenicolacetyltransferase (cat-Gen) weiterhin einen Replikationsorigin für gramnegative Bakterien trägt, in seinen Polylinker-Bereich einen auch als Promotorsuchplasmid verwendbaren neuen, Polylinker-tragenden shuttle-Vektor der pBB-Plasmidfamilie konstruiert, anschließend
— den erhaltenen pBB-shuttle-Vektor erneut in einem unikalen Restriktionsort seines Polylinkerbereiches linearisiert und gegebenenfalls mittels Ausführung der Klenow-Reaktion ebenfalls noch für eine blunt end-Ligatiön vorbereitet,
— die nunmehr mit blunt ends ausgestattete native Expressions-/Sekretionseinheit mit diesem linearisierten, inzwischen gleichfalls mit blunt ends ausgestatteten, zur Promotor-Suche einsetzbaren pBB-shuttle-Vektor zu einem neuen, rekombinanten Polylinker-tragenden pBB-shuttle-Vektor mit protabler Expressions7Sekretionseinheit (Modifikation I) zusammenfügt,
— aus dem voranstehend erhaltenen pBB-shuttle-Vektor nunmehr die portable Expressions-/ Sekretionseinheit (Modifikation I) nach Restriktion isoliert und diese mit einem zur Ligation vorbereiteten Polylinker-tragenden E. coli-Vektor zu eine'm neuen, gleichfalls Polylinkertragenden E. coli-pBB-Vektor mit portabler Expressions-/Sekretionseinheit (Modifikation II) zusammenfügt und
— abschließend sowohl jeden erhaltenen E. coli-pBB-Vektor mit portabler Expressions-/ Sekretionseinheit (Modifikation II) wie auch jeden erhaltenen pBB-shuttle-Vektor mit portabler Expressions-/Sekretionseinheit (Modifikation I) unter Einbezug eines Strukturgens für ein Enzym bzw. für ein Protein in an sich bekannter Weise auf seine Leistungsfähigkeit prüft.
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man die native Expressions-/ Sekretionseinheit des 042D-Staphylokinase-Gens einem SAK+-rekombinanten E. coli-Plasmid entnimmt.
3. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß man die native Expressions-/ Sekretionseinheit des 042D-Staphylokinase-Gens mit SAK+-rekombinanten E. coli-Plasmid pDB17 entnimmt.
4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß man als MLS-Resistenz ausprägenden, Polylinker-tragenden shuttle-Vektor Plasmid pGB3631 einsetzt.
5. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß man als MLS-Resistenz ausprägenden, Polylinker-tragenden shuttle-Vektor Plasmid pGB363 einsetzt.
6. Verfahren nach Punkt 1,3 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß man durch Insertion des 1808bp langen Sau3Ä-Fragmentes von pTG278in den unikalen BamHI-Ortim Polylinker von Plasmid pGB363 den auch als Promotorsuchplasmid verwendbaren neuen Polylinker-tragenden shuttle-Vektor pBB100 konstruiert und mit pBB100-Proben Reziptentenstämme aus den Bakterienarten Streptococcus sanguis. Bacillus subtilis bzw. E. coli transformiert.
7. Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß man mit pBB100-Proben den Stamm S. sanguis Challis 57 transformiert.
8. Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß man mit pBB1 OO-Proben den Stamm B. subtilis GB500 transformiert.
9. Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß man mit pBB1 OO-Proben den Stamm E. coli DB11 transformiert.
10. Verfahren nach Punkt 1 und 6, gekennzeichnet dadurch, daß man den shuttle-Vektor pBBIOO in seinem Polylinkerbereich unmittelbar vor der Region mit SD-Sequenz und cat-Gen wiederum mit BamHI linearisiert und mittels Ausführung einer Klenow-Reaktion für eine blunt end-Ligation vorbereitet.
11. Verfahren nach Punkt 1 und 10, gekennzeichnet dadurch, daß man durch blunt end-Ligation die native Expressions-/Sekretionseipheit mit dem BamHI-linearisierten Vektor pBB100 zu dem neuen, rekombinanten Polylinker-tragenden shuttle-Vektor pBB101 mit portabler Expressions-/ Sekretionseinheit (Modifikation I) zusammenfügt und mitpBB101-Proben Rezipientenstämmeaus den Bakterienarten Streptococcus sanguis, Bacillus subtilis bzw. E. coli transformiert.
12. Verfahren nach Punkt 11, gekennzeichnet dadurch, daß man mit pBB101 -Proben den Stamm S. sanguis Challis 57 transformiert.
13. Verfahren nach Punkt 11, gekennzeichnet dadurch, daß man mit pBB 101-Proben den Stamm B. subtilis GB500 transformiert.
14. Verfahren nach Punkt 11, gekennzeichnet dadurch, daß man mit pBB101-Proben den Stamm E. coli 294 transformiert.
15. Verfahren nach Punkt 1 und 11, gekennzeichnet dadurch, daß man dem Polylinker-tragenden shuttle-Vektor pBB101 durch Restriktion mit EcoRI und BamHI die portable Expressions-/ Sekretionseinheit (Modifikation I) entnimmt und diese mit dem nach EcoRI- sowie BamHI-Behandlung zur Ligation vorbereiteten Polylinker-tragenden E. coli-Vektor pUC19 zu dem neuen, Polylinker-tragenden E. coli-Vektor pBB201 mit portabler Expressions-/Sekretionseinheit (Modifikation II) zusammenfügt.
16. Verfahren nach Punkt 15, gekennzeichnet dadurch, daß man mit pBB201-Proben den Stamm E. coli 294 transformiert.
17. Verfahren nach Punkt 15, gekennzeichnet dadurch, daß man mit pBB201-Proben den Stamm E. coli TG1 transformiert.
18. Verfahren nach Punkt 1 und 15, gekennzeichnet dadurch, daß man dem E. coli-Expressionsplasmid pHRW500 nach Restriktion mit Sail die Human-Interferon-Alphai-Genbox (Kurzbezeichnung: IFN-Alpha1-Genbox) in Form eines ca. 0,6kb großen Fragmentes entnimmt und diese mit dem durch Sall-Behandlung im Polylinker der Expressions-/Sekretionseinheit (Modifikation II) linearisierten Vektor pBB201 zu dem neuen E. coli-Expressionsplasmid pBB202 zusammenfügt.
19. Verfahren nach Punkt 1 und 18, gekennzeichnet dadurch, daß man mitpBB202-Proben den Stamm E. coli 294 transformiert, den transformierten Stamm in an sich bekannter Weise submers kultiviert, das gebildete IFN-Alpha1-Fusionsprotein in an sich bekannter Weise sammelt und in an sich bekannter Weise die Interferon-Aktivität prüft.
20. Verfahren nach Punkt 1,18 und 19, gekennzeichnet dadurch, daß man mit pBB202-Proben den Stamm E. coli TG1 transformiert.
21. Verfahren nach Punkt 1 und 18, gekennzeichnet dadurch, daß man dem E. coli-Expressionsplasmid pBB202 durch Restriktion mit EcoRI ein ca. 1,0 kb großes Fragment, enthaltend die Expressions-/ Sekretionseinheit (Modifikation II) mit der IFN-Alpha1-Genbox, entnimmt und dieses Fragment mit dem durch EcoRI-Behandlung im Polylinker linearisierten shuttle-Vektor pBB100 zu dem neuen shuttle-Expressionsplasmid pBB203 zusammenfügt.
22. Verfahren nach Punkt 1 und 21, gekennzeichnet dadurch, daß man mit pBB203-Proben Rezipientenstämme aus den Bakterienarten Streptococcus sanguis. Bacillus subtilis bzw. E. coli transformiert, den jeweils transformierten Stamm in an sich bekannter Weise submers kultiviert, das jeweils gebildete IFN-Alpha1-Fusionsprotein in an sich bekannter Weise sammelt und in an sich bekannter Weise jeweils in Interferon-Aktivität prüft.
23. Verfahren nach Punkt 22, gekennzeichnet dadurch, daß man mit pBB203-Proben den Stamm S. sanguis Challis 57 transformiert.
24. Verfahren nach Punkt 22, gekennzeichnet dadurch, daß man mit pBB203-Proben den Stamm B. subtilis GB500 transformiert.
25. Verfahren nach Punkt 22, gekennzeichnet dadurch, daß man mit pBB203-Proben den Stamm E. coli DB11 transformiert.
26. Verfahren nach Punkt 1 und 21, gekennzeichnet dadurch, daß man das ca. 1,0kb große EcoRI-Fragment mit dem durch EcoRI-Behandlung im Polylinker linearisierten shuttle-Vektor pGB363 zu dem neuen shuttle-Expressionsplasmid pBB2031 zusammenfügt.
27. Verfahren nach Punkt 1 und 26, gekennzeichnet dadurch, daß man mit pBB2031 -Proben Rezipientenstämme aus den Bakterienarten Streptococcus sanguis und Bacillus subtilis transformiert, den jeweils transformierten Stamm in an sich bekannter Weise submers kultiviert, das jeweils gebildete IFN-Alpha1-Fusionsprotein in an sich bekannter Weise sammelt und in an sich bekannter Weise jeweils'die Interferon-Aktivität prüft.
28. Verfahren nach Punkt 27, gekennzeichnet dadurch, daß man mit pBB2031-Proben den Stamm S. sanguis Challis 57 transformiert.
29. Verfahren nach Punkt 27, gekennzeichnet dadurch, daß man mit pBB2031-Proben den Stamm B. subtilis GB500 transformiert.
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---|---|---|---|
DD28666886A DD249038A1 (de) | 1986-01-31 | 1986-01-31 | Verfahren zur herstellung rekombinanter plasmide mit breitem wirtsbereich sowie portabler expressions-/sekretionseinheit |
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