SK149598A3 - Promoters of the genes glutamate deshydrogenase, 'beta'-n- -acetylhexosaminidase and gamma-actine, and their use in systems of expression, secretion and anti-sens in filamentary fungi - Google Patents

Promoters of the genes glutamate deshydrogenase, 'beta'-n- -acetylhexosaminidase and gamma-actine, and their use in systems of expression, secretion and anti-sens in filamentary fungi Download PDF

Info

Publication number
SK149598A3
SK149598A3 SK1495-98A SK149598A SK149598A3 SK 149598 A3 SK149598 A3 SK 149598A3 SK 149598 A SK149598 A SK 149598A SK 149598 A3 SK149598 A3 SK 149598A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
gene
ala
gly
ser
leu
Prior art date
Application number
SK1495-98A
Other languages
English (en)
Inventor
Fuente J L Barredo
Saiz M Rodriguez
Valle M A Moreno
De La Vieja Alfonso J Collados
Maldonano F Salto
Garcia B Diez
Original Assignee
Antibioticos Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Antibioticos Sa filed Critical Antibioticos Sa
Publication of SK149598A3 publication Critical patent/SK149598A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y104/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12Y104/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.4.1)
    • C12Y104/01002—Glutamate dehydrogenase (1.4.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01052—Beta-N-acetylhexosaminidase (3.2.1.52)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Oblasť techniky
Tento vynález sa týka odbornej oblasti expresie gdh a hex génov Penicillium chrysogenum a act génu taktiež Penicillium chrysogenum a Acremonium chrysogenum. Z analýzy nukleotidovej sekvencie uvedených génov je odvodená existencia oblasti promótora, ktorá zahrňuje translačné iniciačné miesto a ktorá môže byt použitá na zostavenie silných nosičov expresie a sekrécie, čo je užitočné u Penicillium chrysogenum aj Acremonium chrysogenum a blízkych druhov. Ďalej, tieto promótory môžu byt použité na blokovanie expresie génu prostredníctvom protipôsobiacich konštrukcií. Expresia iných génov vo vláknitých hubách môže byt regulovaná pri kontrole zmienenými promótormi so zvýšením produkcie antibiotík a/alebo proteínov v tom inherentných.
Doterajší stav techniky
Penicillium chrysogenum a Acremonium chrysogenum sú vláknité huby, ktoré sú predmetom priemyselného záujmu, nakoľko majú schopnosť produkovať penicilín resp. cefalosporín. V poslednom desaťročí bol zaznamenaný značný rozvoj techník genetickej manipulácie aplikovateľných na oba mikroorganizmy. Techniky genetickej manipulácie u Penicillium chrysogenum a Acremonium chrysogenum zahrňujú tranformáciu protoplastov nosičmi, ktoré používajú fleomycín-rezistantný gén a ďalej nazvaný bleR gén) (Kolár, M. et al. (1988), Gene 62, 127-134) ako selekčný celulárny označovač, ako aj expresiu ďalších intaktných vzoriek predmetných génov a nahradenie promótora daného génu iným promótorom, ktorý je schopný zlepšit jeho expresiu. Expresia homologických génov v hubách, ako je Penicillium chrysogenum alebo Acremonium chrysogenum, môže byt negatívne regulovaná, kým v prípade heterologických génov je možné, že ich promótor nemôže byt účinne rozpoznaný uvedenou hubou. S cielom vyhnutia sa týmto problémom boli identifikované a klonované gény, ktoré sú vytlačené zásadne a v ktorých uvedená expresia prednostne neukazuje negatívnu katabolickú reguláciu, dalej nazvané silné promótory. Vo všeobecnosti sa uvažuje, že gény s vysokou expresiou majú informácie v oblasti promótora, ktoré ulahčujú vysoké transkripčné úrovne a ktoré zohrávajú základnú úlohu u funkcií obsiahnutých v primárnom bunkovom metabolizme. Tieto gény zahrňujú: gény, ktoré kódujú NADP-závislá glutamát dehydrogenázu (dalej nazvaný gdh gén), β-Ν-acetylhexozoaminidázu (E.C.3.2.1.52) (dalej nazvaný hex gén) a 7-aktin (dalej nazvaný a expresiu hexl génu (1994), J. Bacteriol.
act gén).
Skoršie referencie na gdh, hex a act gény mikroorganizmov sú odlišné od tých, ktoré sa používajú v tomto vynáleze. Najviac relevantná literatúra zahrňuje: (I) nukleotidové sekvencie gdh génu huby Neurospora crassa (Kinnaird, J.H. and Fincham, J.R.S. (1983), Gene 26, 253-260) ako aj reguláciu expresie gdhA génu Aspergillus nidulans (Hawkins, A.R. et al. (1989), Kol. Gen. Genet. 418, 105-111), (II) klonovanie
Candida albicans (Cannon, R.D. et al
2640-2647) a (III) charakterizáciu act génu Aspergillus nidulans (Fidel, S. et al. (1988), Gene 70, 283-293). Expresia heterologických génov v Penicillium chrysogenum pri použití promótorov pcbC alebo penDE génov bola popísaná Cantwellom, C.A. et al. v roku 1992 (Proc. R. Soc. London Ser. B 248, 283-289). Taktiež bola dalej popísaná expresia heterologických génov v Acremonium chrysogenum pri použití promótorov β-izopropylmalát dehydrogenáza génu (Japanese· Patent Laid Open Publication No. 80295/1989) a glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza génu (European Patent Application 0376226A1/1989).
Inaktivácia génovej expresie v priemyselných kmeňoch je niekedy nevyhnutná pre elimináciu nežiadúcej enzýmovej aktivity. Vzhladom k skutočnosti, že úroveň ploidy množstva priemyselných kmeňov sťažuje v mnohých prípadoch blokovanie expresie priamym rozkladom génov, je nevyhnutné použiť systémy na inaktiváciu expresie, ktoré sú nezávislé na úrovni ploidy. Rozvoj protipôsobiacich konštrukcií vytlačených pri kontrole silnými promótormi umožní prerušenie génovej expresie. Sústavy tohto typu sú mimoriadne užitočné u priemyselných kmeňov vzhladom k skutočnosti, že ich úrovne ploidy (Kunkel et al. (1992) Appl. Microbiol. Biotech. 36, 499-502) sťažujú získanie úplnej génovej inaktivácie. Použitie protipôsobiacich konštrukcií na blokovanie enzýmových aktivít bolo popísané v kvasniciach (Atkins, D. et al. (1994), Biol. Chem. H-S 375, 721-729) a rastlinách (Hamada, T. (1996), Transgenic Research 5, 115-121; John, M.E. (1996) Plánt Mol. Biol. 30, 297-306). Hex promótor má osobitný znak kódovania pre extracelulárne enzýmy, ktorý mu umožňuje, aby bol použitý pre expresiu extracelulárnych proteinov.
V doterajšom stave techniky žial nie sú citácie, ktoré popisujú génové sekvencie vláknitých húb použité v tomto vynáleze alebo enzýmov syntetizovaných ich expresiou. V doterajšom stave techniky nie je ani žiaden · popis použitia génov húb popisovaných v tomto vynáleze na alebo inaktiváciu génovej expresie.
silných promótorov expresiu, sekréciu
Podstata vynálezu
Použitie silného promótora na preexpresiu určitých génov môže viesť k zvýšeniu produkcie penicilínu alebo cefalosporínu a taktiež k syntéze nových antibiotík odvodených z posledne uvedených.
Tento vynález popisuje nové postupy na získanie kmeňov Penicillium chrysogenum a Acremonium chrysogenum so schopnosťou expresie homologických alebo heterologických génov pri kontrole silnými promótormi. Popísaná je charakterizácia a následné použitie promótorov zodpovedajúcich génom, ktoré kódujú NADP-závislá glutamát dehydrogenázu (EC.1.4.1.4) - gdh gén Penicillium chrysogenum, β-Ν-acetylhexózoaminidázu (EC.3.2.1.52) - hex gén Penicillium chrysogenum a ^č-aktin - act gén Penicillium chrysogenum a Acremonium chrysogenum. Použitie uvedených promótorov na preexpresiu génov vzhladom na biosyntézu penicilínu a/alebo cefalosporínu vo vyššie uvedených kmeňoch je jedným z cieiov tohto vynálezu. Tieto promótory môžu byt takisto použité • 3 oligonukleotidov sekvencií enzýmu gén Penicillium na blokovanie génovej expresie prostredníctvom protipôsobiacich konštrukcií.
Tento vynález ja založený na Penicillium chrysogenum a Acremonium chrysogenum ako na donoroch nukleových kyselín. Keďže genómová DNA bola purifikovaná, rady DNA oboch mikroorganizmov boli zostavené ako je popísané v Príkladoch 1 a 4, a boli screenované: (I) syntetickými oligonukleotidmi zodpovedajúcimi gdh génu Neúrospora crassa, aby klonovali homologický gén Penicillium chrysogenum, (II) kombináciami syntetizovaných na báze aminotermináIných β-Ν-acetylhexozoaminidázy, aby klonovali hex chrysogenum a (III) fragmentom act génu
Aspergillus nidulans, aby klonovali homologický gén Penicillium chrysogenum a Aspergillus nidulans. Klony purifikované na základe ich schopnosti generovať pozitívnu hybridizáciu so zodpovedajúcou sondou boli následne analyzované a bola determinovaná prítomnosť hladaných génov.
gdh gén Penicillium chrysogenum bol identifikovaný v 7,2 kb EcoRI fragmente a v dvoch BamHI fragmentoch s 2,9 kb resp. 1,5 kb. Reštrikčné vyznačenie oblasti DNA, ktoré to zahrňuje, je ukázané na Obr. 1. Potom bola determinovaná 2 816 nukleotidová sekvencia (SEQ ID NO:1), ktorá zahrňuje νοϊηύ variantu usporiadania (ORF) s presne vyznačeným preferenčným obvyklým kódovaním. ATG translačné iniciačné kódovanie, ktoré bolo zistené v polohe 922 a TAA translačné terminačné kódovanie v polohe 2 522. Prítomnosť 2 intrónov so 159 bázami a 56 bázami bola determinované taktiež medzi polohami 971-1130 resp. 1262-1318. Uvedené ORF kóduje protein s molekulovou hmotnosťou 49 837 a izoelektrickým bodom 6,18, 461 sekvenciu aminokyseliny (SEQ ID N0:5), ktorá má identitu 72,4% so sekvenciou aminokyseliny NADP-závislá glutamát dehydrogenázy enzýmu Neúrospora crassa.
V oblasti promótora bolo zistené zóny bohaté na pyrimidín, podobné tým, ktoré sa objavujú u génov s vysokou expresiou, ako aj dva predpokladané TATA oddiely (tento oddiel je zistený v určitých promótoroch húb s 30 až 50 bázami ležiacimi vyššie od miesta iniciácie transkripcie) (Davis, M.A. a Hynes, M.J. (1991), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, San Diego, Califormia) a CCAAT oddiel (ktorý bol zistený u približne
30% promótorov eukaryotických génov s 50 až 200 bázami ležiacimi vyššie od miesta iniciácie transkripcie) (Bucher, P. (1990) J. Mol. Biol. 212:563-578). Tento promótor bol potom použitý na expresiu v Penicillium chrysogenum a Acremonium chrysogenum Escherichia coli génu, ktorý kóduje galaktozidázu (ďalej nazvaný lacZ gén) a bleR gén S. hindustarius. Plazmidy pSKGSu a pALfleo7 (Obr. 5) boli zostavené pre tento účel, ako je popísané v Príklade 1. Zo získaných výsledkov je dedukované, že gdh promótor (ďalej nazvaný Pgdh) je schopný kontrolovať expresiu heterologických lacZ a bleR génov u Penicillium chrysogenum a Acremonium chrysogenum, ako aj u Escherichia coli. Rozvoj protipôsobiacich konštrukcií podliehajúcich expresii pri kontrole silnými promótormi umožňuje prerušenie expresie génov. Plazmid pALP888 (Obr. 5) bol zostavený pre tento účel, ako je popísané v časti 1.3 Príkladu 1. Získané výsledky potvrdzujú možnosť celkového alebo čiastočného blokovania nežiadúcej enzýmovej aktivity u Penicillium chrysogenum pri použití protipôsobiacich konštrukcií použijúc Pgdh.
Hex gén Penicillium chrysogenum bol identifikovaný v 3,2 kb Sací fragmente a v 2,1 kb fragmente. Reštrikčné vyznačenie oblasti DNA, ktorá zahrňuje hex gén, je ukázané na Obr. 2. Potom bola determinovaná 5 240 nukleotidová sekvencia (SEQ ID NO:2), potvrdzujúca existenciu dvoch volných variantov usporiadania (ORF) s presne vyznačeným preferenčným obvyklým kódovaním, z ktorých jeden bol porovnaný s hex génom. ATG translačné iniciačné kódovanie hex génu bolo zistené v polohe 1 324 a TGA translačné terminačné kódovanie v polohe 3 112. Uvedená ORF nemá intróny a kóduje protein s molekulovou hmotnosťou 66 545 a s izoelektrickým bodom 5,34, 596 sekvenciu aminokyseliny (SEQ ID N0:6), ktorá má identitu 49,0% so sekvenciou aminokyseliny β-acetylhexozoaminidázy enzýmu Candida albicans. Ďalej, dedukovaná sekvencia aminokyseliny zahrňuje polypeptidy determinované chemicky z purifikovaného enzýmu v polohe 19-40 a 99-120. V oblasti promótora boli zistené dve zóny bohaté na pyrimidín, predpokladaný TATA oddiel a CAAT oddiel. Tento promótor bol potom použitý na expresiu bleR génu S. hindustanus u Penicillium chrysogenum. Plazmid pALP480 (Obr. 6) bol zostavený pre tento účel, ako je popísané v Príklade 2. Zo získaných výsledkov je dedukované, že hex promótor (ďalej nazvaný Phex) je schopný kontrolovať expresiu heterologického bleR génu v Penicillium chrysogenum. Ďalej, skutočnosť, že enzým β-Ν-acetylhexozoaminidáza je protein vo velkej miere sekretovaný prostredníctvom Penicillium chrysogenum do kultúry, umožňuje použitie hex génu na expresiu a sekréciu homologických alebo heterologických proteinov v Penicillium chrysogenum alebo blízkych vláknitých hubách. Pre expresiu môžu byt gény spojené do varianty usporiadania s oblasťou promótora, zahrňujúcou sekrečnú informáciu sekvencie hex génu alebo ešte môžu byť spojené do varianty usporiadania s úplným hex génom.
act gén Penicillium chrysogenum (ďalej nazvaný actPc) bol identifikovaný v 5,2 kb BamHI fragmente, 4,9 kb ECoRI fragmente a 5,9 kb HindlII fragmente. Reštrikčné vyznačenie DNA oblasti, ktorá zahrňuje actPc gén je ukázané na Obr. 3. Keďže 2 994 nukleotidová sekvencia (SEQ ID NO:3) bola determinovaná, existencia ORF s presne vyznačeným preferenčným obvyklým kódovaním bola potvrdená. ATG translačné iniciačné kódovanie hex génu bolo zistené v polohe 494 a TAA translačné terminačné kódovanie v polohe 2 250. Uvedená ORF má 5 intrónov a kóduje protein s molekulovou hmotnosťou 66 545, s izoelektrickým bodom 5,51, 375 sekvencie aminokyseliny (SEQ ID N0:7), ktorá má identitu 98,1% so sekvenciou· aminokyseliny ?t-aktin proteinu Aspergillus nidulans. Tento promótor bol potom použitý na expresiu bleR génu S. hindustanus v Penicillium chrysogenum. Plazmid pALPfleol (Obr. 6) bol zostavený pre tento účel, ako je popísané v Príklade 3. Zo získaných výsledkov je dedukované, že act promótor Penicillium chrysogenum (ďalej nazvaný PactPc) je schopný kontrolovať expresiu heterologického bleR génu v Penicillium chrysogenum.
act gén Acremonium chrysogenum (ďalej nazvaný actAc) bol identifikovaný v 2,4 kb a 1,1 kb Sali fragmentoch, 3,9 kb Smal fragmente a 8,7 kb HindlII fragmente. Reštrikčné vyznačenie DNA oblasti, ktorá zahrňuje actAc gén, je ukázané na Obr. 4. Determinovaná 3 240 nukleotidová sekvencia (SEQ ID NO:4) potvrdila existenciu ORF s presne vyznačeným preferenčným obvyklým kódovaním. ATG translačné iniciačné kódovanie bolo zistené v polohe 787 a TAA translačné terminačné kódovanie v polohe 2 478. Uvedené ORF má 5 intrónov a kóduje proteín s molekulovou hmotnosúou 41 612, s izoelektrickým bodom 5,51, 375 sekvenciu aminokyseliny (SEQ ID NO:8), ktorá má identitu 98,4% a 98,1% so sekvenciou· aminokyseliny ý^-aktin proteinov Aspergillus nidulans resp. Penicillium chrysogenum. V oblasti promótora boli potom zistené zóny bohaté na pyrimidín a CAAT oddiel, existencia TATA oddielu nebola pozorovaná. Tento promótor bol potom použitý na expresiu bleR génu S. hindustanus u Acremonium chrysogenum. Plazmid pALPfleol (Obr. 6) bol zostavený pre tento účel, ako je popísané v Príklade 4. Zo získaných výsledkov je dedukované, že act promótor Acremonium chrysogenum (dalej nazvaný PactAc) je schopný kontrolovať expresiu heterologického bleR génu v Acremonium chrysogenum.
Vo všetkých prípadoch bola dosiahnutá expresia heterologického génu Penicillium chrysogenum a Acremonium chrysogenum pri kontrole hubovým promótorom prostredníctvom spojenia uvedeného génu v správnej variante usporiadania. Hoci u lacZ a ble génov sa uskutočnila expresia spôsobom podlá príkladu, rovnakým spôsobom by sa mohla uskutočniť expresia génov, ktoré kódujú enzýmy, týkajúce sa biosyntézy penicilínu: pcbAB (α-aminoadipyl-cysteinyl-valín syntetáza), pcbC (izopenicilín-N syntáza), penDE’(acyl-CoA:6-APA acyltransferáza) , pcl (fenylacetyl-CoA ligáza), atd.; alebo cefalosporínu: pcbAB (α-aminoadipyl-cysteinyl-valín syntetáza), pcbC (izopenicilín N syntáza), cefD (izopenicilín N izomeráza) cefEF (deacetoxycefalosporín C syntáza/hydroxyláza), cefG (deacetylcefalosporín C acetyltransferáza), atd. Gén, ktorý má podliehať expresii, môže byt získaný rôznymi spôsobmi: izolovaním z chromozómu DNA, cDNA syntetizovaním z mRNA, syntetizovaním chemicky atd. Základné postupy pre správne spojenie promótor-gén sú popísané Sambrockom, J. et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA, a Ausubel et al. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USA.
Penicillium chrysogenum a Acremonium chrysogenum boli použité ako hosťovské kmene, ale môžu byt použité všetky blízke kmene alebo mutantné kmene z nich odvodené. . Postup vytvárajúci produkciu protoplastov a tranformácia Penicillium chrysogenum je na princípe, ako bola popísaná Cantoral et al. v roku 1987 (Biotechnology 5: 494-497) a Diez et al. v roku 1987 (Curr. Genet. 12: 277-282) a je popísaná v Príklade 1. Produkcia protoplastov a transformácia Acremonium chrysogenum sú popísané v Príklade 4. V oboch prípadoch sa použil antibiotický fleomycín ako selekčný označovač a plazmidy pALfleo7, pALP480, pALPfleol alebo pALCffleol, ktoré sú nosičmi bleR génu, u ktorého sa uskutočnila expresia pri kontrole Pgdh, Phex, PactPc resp. PactAc Bolo by však možné použiť akýkolvek iný označovač, ktorý môže selektívne separovať tranformantové kmene od iných, ktoré nie sú tranformantové.
Transformant môže rásť v kultúre, obsahujúcej uhlíkové a dusíkové zdroje, ktoré môžu byť asimilované. Príkladmi uhlíkových zdrojov je glukóza, sukróza, laktóza, škrob, glycerín, organické kyseliny, alkoholy,' mastné kyseliny at<ľ., použité samostatne alebo v kombinácii. Príkladmi dusíkových zdrojov môžu byt peptón, sladový extrakt, kvasnicový extrakt, roztok z namočenej pšenice, lepok, kyselina močová, amóniove soli, dusičnany, ŇZ-amín, síran amónny atd., použití samostatne.alebo v kombinácii. Anorganické soli, ktoré môžu byt použité ako zložky kultúry zahrňujú fosfáty (napríklad fosfát draselný), sulfáty (napríklad sulfát draselný), chloridy (napríklad chlorid horečnatý) atď. a železo, horčík, vápnik, mangán, kobalt atď., môžu byt použité ako ióny. Podmienky kultúry, ako je inkubačná teplota, pH kultúry, nasýtenie plynom, inkubačný čas, atd. musia byt selektované a prispôsobené v súlade s použitým kmeňom. Vo všeobecných podmienkach však fermentácia je vykonávaná po dobu 4 až 14 dní, pri aeróbnych podmienkach pri teplote medzi 20°C a 30°C a pH je medzi 5 a 9.
V súhrne tento vynález zahrňuje: (I) DNA fregmenty, ktoré obsahujú promótory gdh, hex a act génov Penicillium chrysogenum a act gén Acremonium chrysogenum, (II) plazmidy, ktoré zahrňujú vyššieuvedené promótory spolu s ich translačným iniciačným miestom, (III) plazmidy, v ktorých je umiestnený homologický alebo heterologický štruktúrny gén alebo protipôsobiaci DNA fragment, s kontrolou uvedeným promótorom, (IV) kmene Penicillium chrysogenum alebo Acremonium chrysogenum tranformované uvedenými plazmidmi, (V) kmene transformantov schopné expresie štruktúrneho génu alebo DNA s protipôsobením umiestnenej v plazmide, pri kontrole promótorom a (VI) kmene transformantov schopné sekrécie homologických alebo heterologických extracelulárnych proteinov pri kontrole Phex.
Nasledujúce príklady popisujú tento vynález v detailoch bez obmedzenia jeho rozsahu.
Prehíad obrázkov na výkresoch
Obr. 1: Reštrikčné vyznačenie gdh génu Penicillium chrysogenum, ktorý kóduje aktivitu NADP-závislá glutamát dehydrogenáza enzýmu.
Obr. 2: Reštričné vyznačenie hex génu Penicillium chrysogenum, ktorý kóduje aktivitu β-Ν-acetylhexozoaminidáza enzýmu.
Obr. 3: Reštrikčné vyznačenie act génu Penicillium chrysogenum, ktorý kóduje -aktin.
Obr. 4: Reštrikčné vyznačenie act génu Acremonium chrysogenum, ktorý kóduje ^-aktin.
Obr. 5: Nosiče pre expresiu lacZ génu Escherichia coli, ble gen S. hindustanus a protipôsobiaci fragment pahA génu Penicillium chrysogenum a/alebo Acremonium chrysogenum pri promótore Pgdh.
Obr. 6: Nosiče pre expresiu ble^ génu S. hindustanus v
Penicillium chrysogenum a/alebo Acremonium chrysogenum pri promótore Phex, PactPa, PactAc.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
1.1 Klonovanie a charakterizácia gdh génu Penicillium chrysogenum
S cielom klonovania gdh génu Penicillium chrysogenum bol zostavený rad DNA v nosiči fágu ÁGEM12 pri použití zavedených postupov (Sambrook, J. et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). Nakoniec bola celá DNA huby (purifikovaná spôsobom popísaným Barredom et al. (1994) Spanish Patent P9400931) usporiadaná s Sau3AI a fragmenty s približne 20 kb boli purifikované v sacharózovom grädiente (10-40%). Tieto fragmenty boli naviazané s ramenami nosiča, ktorý bol predtým usporiadaný s BamHI a purifikovaný a naviazaná zmes bola potom uložená in vitro pri použití Gigapack II Gold (Stratagene) systému v súlade s inštrukciami výrobcu. Ukladacia reakcia resuspendovaná v 500 μΐ SM bola použitá na vytvorenie infekcie Escherichia coli LE392, pre titrovanie počtu prítomných fágov, a Escherichia coli, s cielom určenia percentuálneho obsahu rekombinantných fágov. Escherichia coli NM539 je lyzigénny kmeň fágu P2 a produkuje lyzisový povlak iba vtedy, keď fág, ktorý ho infikuje nemá νοϊηύ centrálnu oblasť. Bolo zistené, že titer fágu je 132 pfu/μΐ (celkovo 66 000 pfu) v Escherichia coli LE392 a 113 pfu/μΐ (celkovo 56 500 pfu) v Escherichia coli NM539. To znamená, že približne 85% fágov prenieslo exogénne vloženie DNA. Počet rekombinantných fágov potrebných na vytvorenie úplného radu DNA bolo vypočítané podlá rovnice: N=ln(l-p)/ln(1—f), kde p je zvolená pravdepodobnosť, f je rozmer genómu selektovaného organizmu, ktorý je obsiahnutý v rekombinante a N je počet potrebných rekombinantov. Pri predpoklade, že genóm Penicillium chrysogenum je obsiahnutý v približne 30 000 kb (Fierro et al. (1993), Mol. Gen. Genet. 241: 573-578) a že priemer uloženého vloženia bol 18 kb (v zmysle skutočnosti, že boli selektované velkosti okolo 20 kb) bol získaný rad DNA Penicillium chrysogenum s 99,999% pravdepodobnosťou získania rekombinantných fágov. Po vykonaní týchto radov teoretických verifikácií bola Escherichia coli NM539 infikovaná a úplný rad DNA bol rozotrený na Pétriho miskách s priemerom 150 mm (okolo 11 300 pfu/Pétriho miska), sústredený v 50 ml SM plus 2,5 ml chloroformu a udržovaný pri teplote 4°C. Týmto spôsobom bol k dispozícii dostatočný a reprezentatívny objem rekombinantných fágov (5 300 pfu/μΐ) kedykoívek pripravený na odobratie.
Okolo 60 000 pfu bolo rozotrených na Pétriho miske s priemerom 150 mm a potom prenesených do nitrocelulózových filtrov (ΒΑ85, 0,45 um, Schleicher & Schuell). Uvedené filtre boli hybridizované použitím štandardných postupov (Sambrook, J. et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA) so syntetickými oligonukleotidmi zodpovedajúcimi gdh génu Neurospora crassa. Celkom 10 pozitívnych klonov bolo purifikovaných cez druhý a tretí hybridizačný cyklus a ich DNA bola potom usporiadaná so sériami reštrikčných endonukleáz a analyzovaná prostredníctvom Southern blot techniky. Týmto spôsobom bol gdh gén identifikovaný v 7,2 kb EcoRI fragmente resp. v dvoch 2,9 kb a 1,5 kb BamHI fragmentoch. Potom bolo vykonané zodpovedajúce subklonovanie v plazmidoch pBluescript I KS (+) (Stratagene) a pUC13 a boli zostavené plazmidy pALP784 a pALP785, ktoré oba zodpovedajú 2,9 kb Sau3AI fragmentu zahrňujúcemu gdh gén. Reštrikčné obmedzenie oblasti DNA, ktorá zahrňuje uvedený gén je ukázané na Obr. 1.
S cielom determinovania nukleotidovej sekvencie gdh génu boli zostavené z plazmidov pALP784 a pALP785 série klonov spôsobom Erase a base (Proméga), a potom boli zoradené podlá dideoxynukleotidového spôsobu použijúc testovaciu sadu Sequenase (USB), v oboch prípadoch v súlade s inštrukciami výrobcu. Získaná 2 816 nukleotidová sekvencia (SEQ ID N0:l) bola analyzovaná Geneplot programom (DNASTAR), potvrdzujúcim existenciu ORF s presne vyznačeným preferenčným obvyklým kódovaním. ATG translačné iniciačné kódovanie bolo zistené v polohe 922 a TAA translačné terminačné kódovanie v polohe 2 522. Prítomnosť 2 intrónov so 159 bázami a 56 bázami bola determinovaná medzi polohami 971-1130, resp. 1262-1318. Uvedené ORF kóduje protein s molekulovou hmotnosťou 49 837 a izoelektrickým bodom 6,18, 461 sekvenciu aminokyseliny (SEQ ID NO:5), ktorá má identitu 72,4% so sekvenciou aminokyseliny NADP-závislá glutamát dehydrogenáza enzýmu Neurospora crassa.
V oblasti promótora boli zistené rôzne zóny bohaté na pyrimidín, hoci umiestnenie medzi polohou 766-796 je najrozšírenejšie. Tieto zóny boli zistené u génov s vysokou expresiou a sú umiestnené hneď vyššie za miestom transkripčnej iniciácie. Ďalej sú tu dva predpokladané TATA oddiely (ktorých koordinovaná sekvencia v hubách je TATAA) v polohe 752 (TATATAATT) a 852 (ΤΑΤΑΑΤΤΤ). Tieto TATA oddiely sú zistené v hubách od 30 do 50 báz ležiacimi vyššie od miesta transkripčnej iniciácie, takže je najpravdepodobnejšie, že identický TATA oddiel je ten, ktorý sa nachádza v polohe 752, napr. 42 báza ležiaca vyššie od od miesta transkripčnej iniciácie. Sekvencia CCAAT je zistená v oblasti promótora s približne 30% známych eukaryotických génov, nachádzajúcou sa medzi 50 a 200 bázami ležiacimi vyššie od miesta transkripčnej iniciácie. CCAAT oddiel je v polohe 691 v oblasti promótora gdh génu, napr. okolo 105 bázy od predpokladaného miesta transkripčnej iniciácie.
I. 2 Expresia génov v Penicillium chrysogenum a Acremonium chrysogenum pri kontrole gdh promótorom
Spôsob tranformácie a selekcie Penicillium chrysogenum a Acremonium chrysogenum tranformantov bolo vykonané ako bude popísané ďalej, v závislosti na rezistancii k antibiotickému fleomycínu. Na tento účel bolo nevyhnutné zostaviť plazmid pALFfleo7, ktorý má velkost· 5,4 kb a nesie bleR gén S. hindustanus, u ktorého sa uskutočnila expresia pri kontrole Pgdh ako označovača v hubách, chloramfenikol-rezistantný gén ako označovač Escherichia coli a polyretazovač plazmidu pBC (+) (Stratagene).
Postup použitý na produkciu protoplastov a tranformáciu Penicillium chrysogenum bol taký, ako bol popísaný Cantoralom et al. v roku 1987 (Biotechnology 5: 494-497) a Dierom et al. v roku 1987 (Curr. Genet. 12: 277-282) s jemnými modifikáciami. Najprv rástlo Penicillium chrysogenum v PM definovanom prostredí (Anné,
J. , (1997) Agriculture 25) s pridaním 10% obilného extraktu po dobu 18-21 hodín pri 25°C a mycélium bolo zachytené filtráciou cez nylonový filter a premyté 3 až 5 objemami 0,9% NaCl. Po vysušení medzi papierovým filtrom bolo resuspendované (lOOmg/ml) v pufri protoplastov. Po zhomogenizovaní micelárnej suspenzie bol do nej pridaný objem 4 mg/ml Caylasovho roztoku (Cayla) v pufri protoplastov a bola udržovaná pri konštantnej teplote 25°C po dobu 3 hodín s pretrepávaním pri 100 r.p.m. Vzhlad protoplastov bol pozorovaný mikroskopicky. Po uvolnení väčšiny z nich boli separované z mycélia filtráciou cez 30μπι póry nylonového filtra. Protoplastová suspenzia bola premytá 3-krát 0,7 M KCl, centrifugovaná pri 400xg po dobu 3 minút medzi premytiami. Vyzrážané protoplasty boli resuspendované v 10 ml roztoku KCM a po odhadnutí ich koncentrácie spočítaním v Tomášovej komore boli upravené s KCM na 1-5 x· 10® protoplastov/ml. Potom bolo ΙΟΟμΙ tohto roztoku starostlivo miešané s 1-10 gg DNA plus 10mi PCM a zmes bola udržovaná pri konštantnej teplote v chladenom vodnom kúpeli po dobu 20 minút. Potom bolo pridané 500 ml PCM a zmes bola udržovaná pri teplote miestnosti po dobu 20 minút a potom bolo pridané 600μ1 KCM. Tranformanty boli selektované na základe schopnosti danej fleomycíno-rezistantným génom prítomným v plazmide pALfleo7, pALP480 a pALPfleol rásť v 30 μg/ml fleomycínu. Na tento účel bolo 200μ1 tranformačnej reakcie zmiešané s 5 ml Czapekovho roztoku s pridaním sorbitolu (1 M) a fleomycínu (30μ9/ιη1) a bolo rozotrené na Pétriho miske s 5 ml rovnakého roztoku. Misky boli udržované pri konštantnej teplote 25°C, až kým bolo vidieť vzhlad transformantov (4 až 8 dní).
Postup použitý na produkciu protoplastov a tranformácia Acremonium chrysogenum bola popísaná Gutiérrezom et al. (1991), Mol. Gen. Genet. 225: 56-64. Najprv· rástol kmeň Acremonium chrysogenum v MMC definovanom prostredí po dobu 20-24 hodín pri 28°C a mycélium bolo zachytené filtráciou cez nylonový filter a premyté 3 až 5 objemami 0,9% NaCl. Po vysušení medzi papierovým filtrom bolo resuspendované (50 mg/ml) v pufri protoplastov. Po zhomogenizovaní micelárnej suspenzie bol do nej pridaný DDM v konečnej koncentrácii 10 mM a bola udržovaná pri teplote 28°C a 150 r.p.m. po dobu 1 hodiny, centrifugovaná pri 12000xg po dobu 15 minút a zrazenina bola resuspendované v 20 ml pufra protoplastov. Potom bol pridaný Caylasovho roztoku (Cayla) v pufri protoplastov konštantnej potom bola obj em 4 mg/ml a bol udržovaný pri konštatnej teplote 25°C po dobu 3 hodín s pretrepávaním pri 100 r.p.m. Vzhlad protoplastov bol pozorovaný mikroskopicky. Po uvolnení väčšiny z nich boli separované z mycélia filtráciou cez 25μπι póry nylonového filtra. Protoplastová suspenzia bola premytá 3-krát 0,7 M KC1 centrifugovaná pri lOOOxg po dobu 3 minút medzi premytiami. Vyzrážané protoplasty boli resuspendované v 10 ml pufru NCM a po odhadnutí ich koncentrácie spočítaním v Tomášovej komore boli upravené s KCM na 1-5 x 108 protoplastov/ml. Potom bolo ΙΟΟμΙ tohto roztoku starostlivo miešané s 1-10 gg DNA a zmes bola udržovaná pri konštantnej teplote v chladenom vodnom kúpeli po dobu 20 minút, po ktorých bol pridaný 1 ml CCM a zmes bola udržovaná pri teplote miestnosti po dobu ďalších 20 minút. Zmes bola centrifugovaná pri 1 OOOxg po dobu 5 minút a sediment bol resuspendovaný v 800μ1 pufra NCM. Tranformanty boli selektované na základe schopnosti danej fleomycíno-rezistantným génom prítomným v plazmide pALfleoľ a pALPfleol rásť v 10 μ9/ιη1 fleomycínu. Na tento účel bolo 200μ1 tranformačnej reakcie zmiešané s 5 ml roztoku TSA s pridaním sacharózy (0,3 M) a fleomycínu (10μg(ml) a bolo rozotrené na Pétriho miske s 5 ml rovnakého roztoku. Misky boli udržované pri konštantnej teplote 28°C, až kým bolo vidieť vzhíad transformantov (5 až 8 dní).
V získaných tranformantoch bola urobená analýza (I) prítomnosti DNA zodpovedajúcej plazmidu použitému v tranformácii, (II) existencie transkriptu zodpovedajúcej kontrole génu a (III) enzýmovej aktivity zodpovedajúcej génu, u ktorého sa uskutočnila expresia. Celková DNA bola získaná v súlade s podmienkami popísanými Barredom et al. v roku 1994 (Spanish Patent P94400931) a potom bola analyzovaná Southern blot technikou pri použití postupu popísaného Sambrookom et al. v roku 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA), purifikovaná spôsobom popísaným Ausubelom et al, v roku 1987 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, New York, USA). Získaná RNA bola udržovaná v zrazenine v etanole pri -20°C. Pre jej použitie bola zachytená centrifugovaním pri 4°C a 10 OOOxg po dobu 20 minút. Separácia RNA molekúl na základe ich molekulovej velkosti bola vykonaná agarózo-formaldehydovou elektroforézou. RNA bola potom tranferovaná do nitrocelulózového filtra a hybridizovaná so zvolenou sondou, všetko toto bolo urobené spôsobom popísaným Sambrookom et al. v roku 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). Vzhlad hybridizačných pásov odhalil existenciu transkriptov a teda schopnosť uskutočniť expresiu bakteriálneho génu v hosťujúcej hube: Penicillium chrysogenum. alebo Acremonium chrysogenum. Enzýmová aktivita β-galaktozidázy bola v tranformantoch stanovená
Spring Harbor Celá RNA bola spôsobom popísaným Sambrookom’ et al. v roku 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). Expresia fleomycínovo rezistantného génu stanovená na základe úrovne rezistancie danej Penicillium chrysogenum alebo Acremonium chrysogenum v Czapekovom prostredí pevnej látky po inkubácii po dobu 7 dní pri 25°C.
1.2.1 Expresia lacZ génu Escherichia coli v Penicillium chrysogenum a Escherichia coli pri Pdgh lacZ gén Escherichia coli bol postupne spojený s Pgdh génom s cielom jeho expresie v Penicillium chrysogenum. Nakoniec bol lacZ gén subklonovaný medzi miesta EcoRI a Sali plazmidu pMLl (Carramolino et al. 1989, Gene 77:31-38), vytvárajúc plazmid pMLac. Pgdh bol potom zavedený medzi miesta EcoRI a Smal v pMLac pri vzniku plazmidu pSKG (Obr. 5). Nakoniec bol sulfónamido-rezistantný gén (Carramolino et al. 1989, Gene 77: 31-38) zavedený v mieste EcoRI v pSKG pri vzniku plazmidu pSKGSu (Obr. 5). V Penicillium chrysogenum tranformantoch s plazmidom pSKGSu selektovanými na základe ich sulfónamidovej rezistancie boli urobené analýzy na prítomnosť plazmidu pomocou Southern blot techniky a existenciu transkriptu zodpovedajúcu lacZ génu pomocou Nothern blot techniky. Aktivita β-galaktozidáza enzýmu bola potom meraná v tranformantoch, ktoré boli pozitívne v dvoch predchádzjúcich analýzach. Tranformanty účinne uskutočnili expresiu lacZ génu Escherichia coli a bolo pozorované, že úrovne aktivity β-galaktozidázy boli vyššie u tých, ktoré obsahovali pôvodný plazmid integrovaný v svojom genóme než u jednotlivých tranformantov, ktoré uskutočnili expresiu lacZ génu pri kontrole promótorom tryptofán C génu (trpC).
Plazmid pSKG bol zavedený do Escherichia coli DH5a (Alacz) s cielom zistenia, či Pgdh Penicillium chrysogenum bol tiež schopný kontrolovať expresiu lacZ génu v Escherichia coli. Získané tranformanty mali schopnosť vytvárať modro-zafarbené kolónie po 10 dňoch udržovania pri konštantnej teplote 25°C v prostredí LB, do ktorého boli pridané izopropyl-p-D-galaktozidáza (IPTG) a 5-brómo-4-chlóro-3-indolyl^-D-galaktozidáza (X-gal). Tento výsledok potvrdil, že zloženie Pgdh-lacZ uskutočňuje expresiu enzýmovej aktivity β-galaktozidázy v Escherichia coli, hoci menej účinne než endogénny lacZ gén Escherichia coli.
1.2.2 Expresia bleR génu S. hindustanus v penicillium chrysogenum a Acremonium chrysogenum pri Pgdh bleR gén bez svojej oblasti promótora bol získaný z plazmidu pUT737 (Mullaney et al. (1985), Mol. Gen. Genet. 199: 37-45) ako 1 100 báza Ncol-Apal fragmentu. Tento fragment bol potom subklonovaný v plazmide pUT713, ktorý bol predtým usporiadaný s Ncol-Apal poskytujúc plazmid pALfleoS. Pgdh bol zachytený z pALP25 ako 726 báza EcoRI-BamHI fragmentu, ktorý bol potom subklonovaný v pALfleoS (predtým usporiadaným s EcoRI-BamHI), aby vytvoril pALfleo6. Tento posledný plazmid má velkosť 4,2 kb, u bleR génu sa uskutočnila expresia pri kontrole Pgdh a ampicilíno-rezistantného génu bol ako označovač v Escherichia coli. S cieíom nahradenia posledného označovača chloramfenikol-rezistantným génom bola 1 900 báza EcoRI-NotI fragmentu, ktorý zahrňuje Pgdh, bleR a terminátor trpC génu (TtrpC) purifikovaná z pALfleoô a naviazaná na plazmid pBC KS (+) (Stratagene) usporidaný s EcoRI-NotI. Toto vyúsťuje do plazmidu pALfleo7 (Obr. 5), ktorý má velkosť 5,4 kb a nesie bleR gén S. hindustanus pri Pgdh ako selekčnom označovači v hubách, chloramfenikol-rezistantný gén .ako označovač v Escherichia coli a polyreťazovač plazmidu pBC KS (+). Zoradenie spojovacej oblasti medzi Pgdh a bleR potvrdzuje usporiadanie posledne uvedeného génu v správnej variante usporiadania.
Tranformácie Penicillium chrysogenum a Acremonium chrysogenum boli uskutočnené s plazmidom pALfleo7, tranformanty boli selektované na základe ich rezistancie k 30 μg/ml resp. 10 ug/ml fleomycínu. Maximálna úroveň pleomycínovej rezistancie transformantov bola potom stanovená v pevnej látke, niektoré boli získané tak, že boli schopné rásť v prítomnosti fleomycínu vyššej než 100 μg/ml. U tranformantov selektovaných na ich fleomycínovú rezistanciu boli vykonané analýzy na prítomnosť plazmidu pomocou Southern blot techniky a na existenciu transkriptu zodpovedajúcu bleR génu pomocou Nothern blot techniky, pozitívne výsledky sa získali v oboch prípadoch. Tieto výsledky potvrdili možnosť expresie heterologických génov v Penicillium chrysogenum a Acremonium chrysogenum pri kontrole Pdgh.
Plazmid pALfleo7 bol zavedený do Escherichia coli s cielom zistenia, či aj Pgdh Penicillium chrysogenum bol schopný bontrolovať expresiu bleR génu v Escherichia coli. Získané tranformanty mali schopnosť rásť v LB s 0,2 μg/ml fleomycínu, minimálna inhibítorová koncentrácia fleomycínu pre Escherichia coli bola nižšia než 0,025 μg/ml. Tento výsledok potvrdil, že sa uskutočnila expresia Pgdh v Escherichia coli, hoci menej účinná než u Penicillium chrysogenum. Tranformant Escherichia coli DH55 s plazmidom pALfleo7 bol uložený v Spanish Collection of Type Cultures (CECT) s prístupovým číslom CECT4849. Ostatné plazmidy, ako napríklad pALP784 a pALP785 boli získané z uložených plazmidov jednoducho selektovaním 2,9 kb Sau3AI-XbaI fragmentu prostredníctvom hybridizácie s promótorom gdh génu vrátane pALfleo7 a jeho subklonovaním v Bluescript I KS (+) alebo pUC13.
1.3 Protipôsobenie expresie · v Penicillium chrysogenum a Acremonium chrysogenum pri gdh promótori
Inaktivácia expresie génov v priemyselných kmeňoch je niekedy potrebná pre eliminovanie nežiadúcich aktivít enzýmov. Vzhíadom na skutočnosť, že úroveň ploidy mnohých priemyselných kmeňov vo väčšine prípadov sťažuje blokovanie expresie priamym rozložením génov, je nevyhnutné použit systémy na inaktiváciu expresie, ktoré sú nezávislé na úrovni ploidy. Rozvoj protipôsobiacich konštrukcií pre expresie pri kontrole silnými promótormi umožňuje prerušenie expresie génov.
Príkladom popísaným ďalej je použitie Pgdh na inaktiváciu expresie génu, ktorý kóduje fenylacetát 2-hydroxydázu (pahA) v Penicillium chrysogenum. Najprv bol zostavený plazmid pALP873, ktorý nesie Pgdh a TtrpC spojený cez jedno miesto BamHI. Plazmid pALP873 bol usporiadaný s BamHI, jeho konce boli doplnené Klenowým fragmentom DNA polymeräzy I a boli naviazané so 1 053 bázou cDNA fragmentu vo vnútri pahA génu získaného z plazmidu pALP555 pomocou EcoRV usporiadania. Výsledný plazmid, nazvaný pALP874, bol selektovaný nakolko niesol protipôsobiaci pahA fragment súvisiaci s Pgdh. Z tohto plazmidu bol purifikovaný 2,5 kb EcoRI-Xbal fragment nesúci protipôsobiacu kazetu, ktorá bola doplnená Klenovom a subklonovaná pri mieste EcoRI-Xbal plazmidu pALfleo7 pri vzniku plazmidu pALP888. tento posledný plazmid je charakterizovaný veľkosťou 7,9 kb a nesením (I) protipôsobiacej kazety pahA génu pri kontrole Pgdh, (II) bleR génu ako selekčného označovača v hubách, (III) chloramfenikol-rezistantného génu ako označovača v Escherichia coli ä (IV) polyreťazovača plazmidu pBC KS (+).
Tranformácie Penicillium chrysogenum boli uskutočnené s plazmidom pALP888, transformanty boli selektované na základe ich rezistancie k 30 gg/ml fleomycínu. Zo selektovaných tranformantov okolo 20% ukazovalo redukovanú schopnosť oxidácie kyseliny fenylacetátovej a niektoré z nich postrádali zistiteľnú úroveň uvedenej aktivity. V týchto tranformantoch boli vykonané analýzy na prítomnosť plazmidu Southern blot technikou a na existenciu protipôsobiaceho transkriptu zodpovedajúceho pahA génu Nothern pri použití oligonukleotidu zodpovedajúceho sonde. V oboch prípadoch boli získané potvrdzujúce možnosť celkového alebo čiastočného blokovania nežiadúcich enzýmových aktivít v Penicillium chrysogenum pri použití protipôsobiacich konštrukcií. Tieto výsledky môžu byt extrapolované na vláknité huby a na všetky aktivity enzýmov pri použití promótorov popísaných v tomto patente (Pgdh, Phex, PactPc a PactAc) alebo ktorýchkoľvek prípustných promótorov.
blot technikou kódovacej vetve ako pozitívne výsledky
Príklad 2
2.1 Klonovanie a charakterizácia hex génu Penicillium chrysogenum Prítomnosť dôležitého proteínu, u ktorého po purifikovaní a charakterizácii bolo zistené, že je β-Ν-acetylhexozoaminidáza, bol determinovaný v mycéliu Penicillium chrysogenum získanom z priemyselnej fermentácie pri podmienkach produkcie penicilínu aminokyseliny z terminálneho konca amino proteínu bola determinovaná spôsobom Edmanovej degradácie a boli získané dve rozdielne sekvencie:
(A) Ala-Pro-Ser-Gly-Ile-His-Asn-Val-Asp-Val-(His)-ValVal-(Asp)-Asn-(Asp)-Ala-(Asp)-Leu-Gln-Tyr-(Gly)
G. Sekvencia purif ikovaného (B) Val-Gln-Val-Asn-Pro-Leu-Pro-Ala-Pro-(Arg)-(Arg)Ile-(Thr)—???—(Gly)-(Ser)-(Ser)-(Gly)-(Pro)(Ile/Thr)-???-(Val)
Na základe týchto sekvencii a pri predpoklade obvyklej kódovacej tendencie, ktorá existuje u sérií génov Penicillium chrysogenum boli označené nasledujúce kombinácie syntetických oligonukleotidov:
(I) 5' TCGACGACGTGSACGTCSACGTTGTGGATGCC 3' (II) 5' CCGTAYTGSAGGTCRGCGTCGTTGTCGACGAC 3' (III) 5' GGGGCVGGSAGVGGGTTGACYTG 3' hex gén Penicillium chrysogenum bol klonovaný pri použití radu DNA a postupy boli popísané v Príklade 1. Celkovo 11 pozitívnych klonov bolo purifikovaných a ich DNA bola potom usporiadaná so sériami reštrikčných endonukleáz a analyzovaná Southern blot technikou. Týmto spôsobom bol hex gén identifikovaný v 3,2 kb Sací fragmente a v 2,1 kb Salľ fragmente. Subklonovaním Sali fragmentu v plazmide pBC KS (+) (Stratagene) v oboch orientáciách boli vytvorenú plazmidy pALP295 a pALP303. Reštrikčné vyznačenie oblasti DNA, ktorá zahrňuje hex gén je ukázané na Obr. 2.
Na determinovanie nukleotidovej sekvencie hex génu boli použité plazmidy pALP295 a pALP303, ako aj pALP319 a pALP461 (obe orientácie s 2,4 kb Sali fragmentom) a pALP377 a pALP378 (obe orientácie s 1,2 kb PstI fragmentom) (Obr. 2). Série klonov boli uvedených plazmidov pomocou spôsobu Erase a base potom boli zoradené pomocou dideoxynukleotidového použití testovacej.sady Sequenase (USB), v oboch súlade s inštrukciami výrobcu. Získaná 5 240 (SEQ ID NO:2) bola analyzovaná (DNASTAR) potvrdujúcim existenciu ORF s presne vyznačeným preferenčným obvyklým kódovaním. ATG translačné iniciačné kódovanie hex génu bolo zistené v polohe 1 324 a TGA translačné terminačné kódovanie v polohe 3 112. Uvedené ORF nemá intróny a kóduje protein s molekulovou hmotnosťou 49 837 a izoelektrickým bodom 5,34, 596 sekvenciu zostavené z (Promega) a spôsobu pri prípadoch v nukleotidová Geneplotovým sekvencia programom aminokyseliny (SEQ ID NO:6), ktorá má identitu 49,0% so sekvenciou aminokyseliny β-Ν-acetylhexózoaminidázy enzýmu Candida albicans. Ďalej v polohách 19-40 a 99-120 dedukovaná sekvencia aminokyseliny zahrňuje sekvencie aminokyselín determinované chemicky z purifikovaného enzýmu. Zistené miesto proteázy (Lys-Arg) sa vyskytuje v polohách ihneď priíahlých k sekvencií aminokyseliny (A) popísanej vyššie (aminokyseliny 97-98).
V oblasti promótora boli zistené dve zóny bohaté na pyrimidín medzi polohami 1 106-1 128 a 1 182-1 200 a predpokladaný oddiel TATA v polohel 258 (ATAAATA) a oddiel CAAT v polohe 1 163.
2.2 Expresia bleR génu S. hindustanus v Penicillium chrysogenum pri Phex tranformácie a selekcie Penicillium chrysogenum (II) analýza DNA, (III) analýza RNA a (IV) boli uskutočnené ako bolo popísané v časti 1.2
Spôsoby (I) transformantov, merania enzýmov
Príkladu 1.
Na expresiu bleR génu pri Phex bolo najprv zostavené miesto Ncol nad ATG kódovaním, ktoré kóduje iniciátor metionín hex génu. Toto bolo uskutočnené pomocou PCR pri použití nasledujúcich oligonukleotidov ako základov:
· CTCCATGGTGATAAGGTGAGTGACGATG 3 '
5' GTAAAACGACGGCCAGTG 3' (základ -20)
DNA fragment získaný pomocou PCR bol subklonovaný v oboch orientáciách v mieste Smal plazmidu pBC KS (+) (Stratagene) pri vzniku pALP427 a pALP428. Vloženia oboch plazmidov boli zoradené pri použití testovacej sady Erase a base (Promega) a Sequenase (USB), v oboch prípadoch v súlade s inštrukciami výrobcu. Týmto spôsobom bolo ukázané, že získaný Phex postrádal mutácie a zahrňoval miesto Ncol nad ATG, ktoré kóduje iniciátor metionín proteinu.
PÄLP427 bol plazmid vybraný na uskutočnenie subklonovania bleR génu. bleR gén bez svojej oblasti promótora bol získaný z plazmidu pUT737 (Mullaney et al. (1985), Mol. Gen. Genet. 199: 37-45) ako 1 100 báza Ncol-Apal fragmentu. Tento fragment bol potom subklonovaný v plazmide pALP427 (nesúcom Phex) predtým usporiadanom s Ncol-Apal poskytujúc plazmid pALP480 (Obr. 6). Tento posledný plazmid má velkost 5,4 kb, expresia bleR génu sa uskutočnila pri kontrole Phex, terminátor trpC génu podlá bleR génu, chloramfenikol-rezistantný gén ako označovač v Escherichia coli a polyreťazovač plazmidu pBC KS (+). Zoradenie spojovacej oblasti medzi Phex a bleR potvrdilo usporiadanie posledne uvedeného génu v správnej variante usporiadania.
Tranformácie Penicillium chrysogenum boli uskutočnené s plazmidom pALP480, tranformanty boli selektované na základe ich rezistancie k 30 μg/ml fleomycínu. Maximálna úroveň fleomycínovej rezistancie tranformantov bola potom stanovená v pevnej látke, niektoré boli získané tak, že boli schopné rásť v prítomnosti fleomycínu vyššej než 100 μg/ml. U tranformantov selektovaných na ich fleomycínovú rezistanciu boli vykonané analýzy na prítomnosť plazmidu pomocou techniky Southern blot a na existenciu transkriptu zodpovedajúcu bleR génu pomocou techniky Nothern blot, pozitívne výsledky sa získali výsledky potvrdili možnosť expresie penicillium chrysogenum pri kontrole Phex. Tranformant Escherichia coli DH5a s plazmidom pALP480 bol uložený v Spanish Collection of Type Culture (CECT) s prístupovým číslom CECT4852. Plazmidy pALP295, pALP319, pALP377 a pALP388 môžu byt získané z uloženého plazmidu jednoducho selekciou DNA fragmentov 2,1 kb Sali, 2,8 kb MamHI, 1,2 kb PstI a 2,4 kb Sali hybridizáciou s promótorom hex génu zahrňutým v pALP480 a potom ich subklonovaným v Bluescript I KS (+).
v oboch prípadoch. Tieto heterológických génov v
2.3 Extracelulárna produkcia proteinov v Penicillium chrysogenum pri použití hex génu
Enzým β-Ν-acetylhexozoaminitfáza je protein, ktorý je značne sekretovaný Penicillium chrysogenum do kultúry v priemyselných fermentov pri podmienkach produkcie penicilínu G. Schopnosť sekrécie tohto enzýmu umožňuje použiť hex gén na expresiu a sekréciu homologických alebo heterologických proteinov v Penicillium chrysogenum alebo blízkych vláknitých húb.
Enzým má sekrečný informačnú sekvenciu vytvorenú z nasledujúcich aminokyselín: Met-Lys-Phe-Ala-Ser-Val-Leu-Asn21
Val-Leu-Giy-Ala-Leu-Tlir-Ala-Ala-Ser-Ala (aminokyseliny 1 až 18 SEQ ID NO: 6). Vo všeobecnosti informačné peptidy majú tri udržované štruktúrne oblasti (Takizawa, N. et al. (1994) Rekombinantné mikróby pre priemyselné a poľnohospodárske aplikácie, Murooka, Y. a Imanaka, T. (eds), Marcel ekker, Inc. New York): (I) pozitívne nabitú terminálnu oblasť nazvanú n, ktorá zvyčajne má 1 až 5 rezíduí a je potrebná pre účinnú translokáciu proteínov cez membránu (Met-Lys), (II) hydrofóbnu oblasť nazvanú vytvorenú (phe-Ala-Ser-Val-Leu-Asn-Val-Leu) a z 7 až 15 rezíduí (III) polárnu oblasť pri karboxylovom zakončení nazvanú c vytvorenú z 3 až 7 rezíduí (Gly-Ala-Leu-Thr-Ala-Ala-Ser-Ala). Intracelulárne syntetizovaný preprotein postupuje cez miešto štiepenia vytvorené z dvoch základných rezíduí (Lys-Arg, aminokyselín 97 a 98 (SEQ ID NO: 6) produkujúcich zrelý protein.
Sú dve možnosti, kedy možno dospieť k expresii a sekrécii proteínov použitím hex génu: (I) spojením oblasti promótora, zahrňujúcou sekrečnú informačnú sekvenciu s kódovacou oblasťou génu, u ktorého má byt expresia', vo variante usporiadania, a (II) spojením úplného hex génu s kódovacou oblasťou génu, u ktorého má byť expresia, vo variante usporiadania. Použitím štandardných techník molekulovej biológie (Sambrook,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA; Ausubel et al. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, New York, USA), by bola akákoľvek osoba vzdelaná v odbore schopná použiť promótor, vrátane sekrécie sekvencie hex génu alebo ešte úplný gén, na expresiu a sekréciu predmetných proteínov v Penicillium chrysogenum alebo blízkych vláknitých hubách.
J. et al. (1989), Cold Spring Harbor
Príklad 3
3.1 Klonovanie a charakterizácia act génu Penicillium chrysogenum act gén Penicillium chrysogenum bol klonovaný pri použití radu DNA a postupy boli popísané v Príklade 1. V tomto prípade bola uskutočnená hybridizácia s 888 bázou Ncol-Clal fregmentom pochádzajúcim z act génu Aspergillus nidulans (Fidel et al.
(1988), Gene 70: 283-293). Celkom 10 pozitívnych klonov bolo purifikovaných a ich DNA bola potom usporiadaná so sériami reštrikčných endonukleáz a analyzovaná Southern blot technikou. Týmto spôsobom bol act gén identifikovaný v 5,2 kb BamHI fragmente, 4,9 kb EcoRI fragmente a 5,9 kb HindlII fragmente. HindlII fragment bol subklonovaný v oboch orientáciách v plazmide Bluescript I KS (+) (Stratagene), vytvárajúc plazmid pALP298 a pALP299. Subklonovanie EcoRI fragmentu v plazmide Bluescript I KS (+) (Stratagene) v oboch orientáciách vytvorilo plazmidy pALP315 a pALP316. Reštrikčné vyznačenie oblasti DNA, ktorá zahrňuje act gén je ukázané na Obr. 3.
Na determinovanie nukleotidovej sekvencie act génu boli použité vyššieuvedené plazmidy pALP315 a pALP316. Série klonov boli zostavené z uvedených plazmidov spôsobom Erase a base (Promega) a potom boli zoradené dideoxynukleotidovým spôsobom pri použití testovacej sady Sequenase (USB), v oboch prípadoch výrobcu. Získaná 2 994 nukleotidová bola analyzovaná Geneplot programom existenciu ORF s presne vyznačeným preferenčným obvyklým kódovaním. ATG translačné iniciačné kódovanie translácie act génu bolo zistené v polohe 494 a TAA translačné terminačné kódovanie v polohe 2 250. Uvedené ORF má 5 intrónov V polohách 501-616, 649-845, 905-1046, 1078-1180 a 1953-2021 a kóduje protein s molekulovou hmotnosťou 41 760 a izoelektrickým bodom 5,51, 375 sekvenciu aminokyseliny (SEQ ID NO: 7), ktorá má identitu 98,1% so sekvenciou aminokyseliny ^-aktinu proteínu Aspergillus nidulans. V oblasti promótora boli zistené dve rozšírené zóny bohaté na pyrimidín medzi polohami 356-404 a 418-469, predpokladaný TATA oddiel v polohe 259 (TATAAAAAT) a štyri CAAT oddiely v polohách 174, 217, 230 a 337.
v súlade s inštrukciami sekvencia (SEQ ID NO: 3) (DNASTAR), potvrdzujúcim
3.2 Expresia bleR génu v Penicillium chrysogenum pri PactPc
Na expresiu bleR génu pri PactPc bolo najprv zostavené miesto
Ncol nad ATG kódovaním, ktoré kóduje iniciátor metionín hex génu. Toto bolo uskutočnené pomocou PCR pri použití nasledujúcich oligonukleotidov ako základov:
5’ CTCCATGGTGACTGATTAAACAAGGGAC 5' GTAAAACGACGGCCAGTG
3'
3' (základ -20)
DNA fragment získaný pomocou PCR bol subklonovaný v oboch orientáciách v mieste Smal plazmidu pBC KS (+) (Stratagene) pri vzniku pALPactl a pALPact2. Vloženia oboch plazmidov boli zoradené pri použití testovacej sady Erase a base (Promega) a Sequenase (USB), v oboch prípadoch v súlade s inštrukciami výrobcu. Týmto spôsobom bolo ukázané, že získaný PactPc postrádal mutácie a zahrňoval miesto Ncol nad ATG, ktoré kóduje iniciátor metionín proteinu.
pALPactl bol plazmid vybraný na uskutočnenie subklonovania bleR génu. bleR gén bez svojej oblasti promótora bol získaný z plazmidu pUT737 (Mullaney et al. (1985), Mol. Gen. Genet. 199: 37-45) ako 1 100 báza Ncol-Apal fragmentu. Tento fragment bol potom subklonovaný v plazmide pALPactl (nesúcom PactPc) predtým usporiadanom s Ncol-Apal poskytujúc plazmid pALPfleol (Obr. 6). Tento posledný plazmid má bleR gén, ktorého expresia sa uskutočnila pri kontrole PactPc, terminátor trpC génu podía bleR génu, chloramfenikol-rezistantný gén ako označovač v Escherichia coli a polyreíazovač plazmidu pBC KS (+). Zoradenie spojovacej oblasti medzi PactPc a bleR potvrdilo usporiadanie posledne uvedeného génu v správnej variante usporiadania.
Tranformácie Penicillium chrysogenum boli uskutočnené s plazmidom pALPfleol, tranformanty boli selektované na základe ich rezistencie k 30 gg/ml fleomycínu. Maximálna úroveň fleomycínovej rezistancie tranformantov bola potom stanovená v pevnej látke, niektoré boli získané tak, že boli schopné rásť v prítomnosti fleomycínu vyššej než 100 gg/ml. U tranformantov selektovaných na ich fleomycínovú rezistanciu boli vykonané analýzy na prítomnosť plazmidu pomocou Southern blot techniky a na existenciu transkriptu zodpovedajúcu bleR génu pomocou Nothern blot techniky, pozitívne výsledky sa získali v oboch prípadoch. Tieto výsledky potvrdili možnosť expresie heterologických génov v Penicillium chrysogenum pri kontrole PactPc. Tranformant Escherichia coli DH5a s plazmidom pALP315 bol uložený v Spanish Collection of Type Culture (CECT) s prístupovým číslom CECT4851. Plazmid pALP316 môže byt získaný z uloženého plazmidu pALP315 jednoducho subklonovaním vloženia pALP315 v mieste EcoRI Bluescript I KS (+) v opačnej orientácii.
Príklad 4
4.1 Klonovanie a charakterizácia act génu Acremonium chrysogenum S cielom klonovania gdh génu Acremonium chrysogenum bol zostavený rad DNA v nosiči fágu ^GEM12, ako bolo popísané v časti
1.1 Príkladu 1. Titer fágu získaného bol 50 pfu/μΙ (celkovo 25 000 pfu) v Escherichia coli LE392 a 41 pfu/μΐ (celkovo 20 500 pfu) v Escherichia coli NM539. To znamená, že približne 82% fágov prenieslo exogénne vloženie DNA fragmentu a že rad DNA bol získaný s 99,999% pravdepodobnosťou. Po uskutočnení týchto sérií teoretických verifikácií bol Escherichia coli infikovaný a úplný rad DNA bol rozotrený na Pétriho miskách s priemerom 150 mm (okolo 7 000 pfu/Pétriho miska), sústredený v 50 ml SM plus 2,5 ml chloroformu a udržovaný pri teplote 4°C. Týmto spôsobom bol k dispozícii dostatočný a reprezentatívny objem rekombinantných fágov (2 100 pfu/μΙ) kedykolvek pripravený na odobratie.
Okolo 20 000 pfu bolo rozotrených na dvoch Pétriho miskách s priemerom 150 mm a potom prenesených do nitrocelulózových filtrov (BA85, 0,45 μη, Schleicher & Schuell). Uvedené filtre boli hybridizované použitím štandardných postupov (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA) s 888 bázou Ncol-Clal fragmentu zodpovedajúcou act génu Aspergillus nidulans. Celkom 5 pozitívnych klonov bolo a ich DNA bola potom usporiadaná so sériami reštrikčných endonukleáz a analyzovaná prostredníctvom Southern blot techniky. Týmto spôsobom bol act gén identifikovaný v 8,7 kb EcoRI fragmente. Tento fragment bol subklonovaný v oboch orientáciách v plazmide pBluescript I KS (+) (Stratagene) pri vytvorení plazmidov pALC52 a pALC53. Reštrikčné vyznačenie oblasti DNA, ktorá zahrňuje act gén je ukázané na Obr. 4.
Vyššie uvedené plazmidy pALC52 a pALC 53 boli použité na determinovanie nukleotidovej sekvencie act génu. Z uvedených plazmidov boli zostavené série klonov spôsobom Erase a base (Promega) a potom boli zoradené podlá dideoxynukleotidového spôsobu použijúc testovaciu sadu Sequenase (USB), v oboch prípadoch v súlade s inštrukciami výrobcu. Získaná 3 240 nukleotidová sekvencia (SEQ ID NO: 4) bola analyzovaná Geneplot programom (DNASTAR), potvrdzujúcim existenciu ORF s presne vyznačeným preferenčným obvyklým kódovaním. ATG translačné iniciačné kódovanie act génu bolo zistené v polohe 787 a TAA translačné terminačné kódovanie v polohe 2 478. Uvedené ORF má 5 intrónov v polohách 794-920, 952-1 123, 1 180-1 289, 1 3211 410 a 2 183-2 249 a kóduje protein s molekulovou hmotnosťou 41 612 a izoelektrickým bodom 5,51, 375 sekvenciu aminokyseliny (SEQ ID NO: 8), ktorá má identitu 98,4% a 98,1% so sekvenciou aminokyseliny -aktinu proteinov Aspergillus nidulans resp. Penicillium chrysogenum. V oblasti promótora bolo zistené zóny bohaté na pyrimidín medzi polohami 607-654, predpokladaný TATA oddiel v polohe 747 (TTATAAAA) a CAAT oddiel v polohe 338.
4.2 Expresia bleR génu v Acremonium chrysogenum pri PactAc
Plazmid pALCfleol (Obr. 6), ktorý zahrňuje bleR gén, ktorého expresia sa uskutočnila pri kontrole PactAc, terminátor trpC génu podlá bleR génu, chloramfenikol-rezistantný gén ako označovač v Escherichia coli a polyretazovač plazmidu pBC KS ( + ) bol zostavený na účely expresie bleR génu pri kontrole PactAc.
bleR gén bez svojej oblasti promótora bol získaný z plazmidu pUT737 (Mullaney et al. (1985), Mol. Gen. Genet. 199: 37-45) ako 1 100 báza Ncol-Apal fragmentu. Tento fragment bol potom spojený vo variante usporiadania s PactAc pri skutočnosti, že act gén má miesto Ncol nad ATG, ktoré kóduje iniciátor metionín proteinu. Nakoniec bol bleR gén subklonovaný v plazmide pALPactl (nesúcom PactAc) predtým usporiadanom s Ncol-Apal poskytujúc plazmid pALPfleol (Obr. 6). Zoradenie spojenia medzi PactAc a bleR potvrdilo usporiadanie posledne uvedeného génu v správnej variante usporiadania.
Tranformácie Acremonium chrysogenum boli uskutočnené s plazmidom pALPfleol, tranformanty boli selektované na základe ich rezistancie k 10 gg/ml fleomycínu. Maximálna úroveň fleomycínovej rezistancie tranformantov bola potom stanovená v pevnej látke, niektoré boli získané tak, že boli schopné rásť v prítomnosti fleomycínu vyššej než 30 μ9/ιη1. U tranformantov selektovaných na ich fleomycínovú rezistanciu boli vykonané analýzy na prítomnosť plazmidu pomocou techniky Southern blot a na existenciu transkriptu zodpovedajúcu bleR génu pomocou techniky Nothern blot, pozitívne výsledky sa získali v oboch prípadoch. Tieto výsledky potvrdili možnosť expresie heterologických génov v Acremonium chrysogenum pri kontrole PactAc. Tranformant Escherichia coli DH5a, ktorý nesie act gén, bol uložený v Spanish Collection of Type Culture (CECT) s prístupovým číslom CECT4850. Plazmid pALC53 môže byť získaný z uloženého plazmidu pALC52 jednoducho subklonovaním vloženia pALC52 v mieste HindlII Bluescript I KS (+) v opačnej orientácii.
Zavedenie vloženia Penicillium, Aspergillus, Acremonium alebo Scacharomyces, prítomného v uloženom plazmide do aktinomycét použitím Escherichia coli ako hosťa je iba otázkou technickej rutiny a vybratia najvhodnejšieho nosiča pre tranformáciu uvedených druhov alebo rodov.
Zoznam sekvencií
Všeobecné informácie:
Prihlasovatel:
Meno: ANTIBIOTICOS, S.A.U.
Ulica: Avda. de Burgos, 8-A Mesto: Madrid
Štát alebo provincia: Madrid Krajina: Španielsko Poštový kód: 28036 Telefón: 91-3841200 fax: 91-3841220
Názov: Promótory génov glutamát β-Ν-acetylhexozoaminidáza a -aktin v systémoch expresie, sekrécie a systémoch vo vláknitých hubách
Počet sekvencií: 8
Adresa pre korešpodenciu:
Adresa: ANTIBIOTICOS, S.A.U.
Ulica: Avda. de Burgos, 8-A Mesto: Madrid
Štát alebo provincia: Madrid Krajina: Španielsko Poštový kód: 28036
Strojovo-čitatelná forma:
Typ média: 3,5 disketa Počítač: PC
Operačný systém: Windows Software: Word
Informácie na právnika/zástupcu:
Meno: Alberto de Elzaburu Registračné číslo: 232/1 dehydrogenáza, a ich využívanie protipôsobiacich
Adresa: Miquel Angel, 21 28010 - Madrid
Telekomunikačné informácie:
Telefón: 3085900 Fax: 3193810
Telex alebo elektronická pošta: elzaburu@elzaburu.es
INFORMÁCIE o SEQ ID N0:l
Charakteristiky sekvencie:
Dĺžka: 2816 báz Typ: nukelot idy Rozvetvenost: 2 Konfigurácia: lineárna Typ molekuly : genómová DNA Hypotetická: nie Protipôsobenie: nie
Pôvodný zdroj: Penicillium chrysogenum Priamy zdroj: plazmidy pALP784 a pALP785 Poloha v genóme: nie je známa
Charakteristika:
Názov/kíúč: kódovacia sekvencia
Umiestnenie: spojenie (922...970, 1131...1261, 1319...2521 Charakteristika:
Názov/kíúč: intrón Umiestnenie: 971...1130 Charakteristika:
Názov/kíúč: intrón Umiestnenie: 1262...1318 Charakteristika:
Iné informácie: gdh gén popis sekvencie: SEQ ID NO:1
GATCGCCGTT XATGGQAXAG TGGGCACGTO ACAGAGCCTC CAOCCGAGTC AAATTCCCGA 60 AGTTGGCAGT TGGTGGCGGA GAACTCGAGA W1A1IXCC GTITAITTCG XUAIWUIA 120 τττααπττ cctatxtttc ctaxttigcx tgattccatc axcrmxx cgaiaczact ιβο TCAXAAXAGG TCGATCATAG TACAAOCACC AACTCCTCGC ATCATGCATT TTCTGGGCTT 240 CCAATTCTTT ACXTAGAGZA AGGTTTCTCT CACCCTCCTA AXAAACXACC TAGGTAGCTT 300 AAA'H'IACťZ TTXAACA2ŤT TATMAIZCA GAAGATTGTC GGAGAGGACC GATCCGAAGG 360 ACACGAATTO AACACGGAAG GGATAXTAGG GACAACCAAfl ATTTAGCCAT AAAAAAACGA 420 GCTCTCA3TQ AZGGGAAGGT ΤΟΜΟΤσΟα TAAXGAAGGT GXIGOOXCCX AAAGGAGTGG 460 GAGAGAIAAC CCAAATTCTO TGCAAATTCT CTGACCTTAA ACCAIAACAT AACATTGTTC 540 CGGCCCCCAA CTTCCGACGT TCITCCCACO QAAAGGCAAA TCATTCGGTT TCATCGAITC 600 TCTTCGATCT TZAICCTAAT TCCCCGTÚCA ÄCCTGGTCTT UUUUAIIATT GTCQACTTGT. 660 AGGCCCATTA ACCCATCTCC CCTCTTCCCT CCAATCAATC CCGGATTCTC TCGTCOGACT 720 CCGGCZTCGA CICTCTCTCT CTCCACATCT CZAXAXAAXT GTACACTCCC CCAICCCATT 760 CTTTTCTTCT CTTCTCAICT ACTCBCTTGA ATCTCAATTG TCTTAATACT CTCTCTGCTC 840 TTGTCTTTAT TTATAATTTA TTAGATCACT GCTZAGCAZT GATCTACTTA CCTAAAAOCA 900 GAGTTAACAfl TACCGGCCGA A ATC ATC CAA AAC CTI CCC TTC CM CCT CM 951
Mae Mae Cla Asn Leu Pro Phe Glu Pro Glu 1 S _ _ 10
TTC CAG CAC CCC TAC AAG a GTATGTCTCT TTTAATTTTT CCCTTTCTTA TTTCAA 10 OS Phe Glu Gin Ala Tyr Lys _ _
TTCCATATCO TCCAXATCAC ACACTAXTTC CCGACTCAAT TCCTTZACCC ATCGGCATCT 1066 TCCCGGCCIT TGGCTCCACC GGCGGCAXAA TTTCGGOOTG ACTCAGCTAA CAATCCCGAA U26 ACAG AG CTC OCC TCC ACT CIC GAG AAC TCC ACT CTT TTC CÄG AAG AAG 1174
Glu Leu Ala Ser Thr Leu Glu Asn Ser Thr Lau Pha Gla Lye Lye 20 25 30
CCC GAG TAC CGC AAG GCT CTT. CAG CTC CTC TCT CTC CCC GAG CCT CTT 1222
Pro Glu Tyr Arg Lys Ala Leu Gla Val Val Ser Val Pre Glu Arg Val
40 <5 _
ATT CAG TTC CCT GIT CTC- TGG GAA GAT GAC AAA GGC CAG GZAAGACCTT 1271
Zle Gin Phe Arg Val Val Trp Glu Asp Asp Lys Gly Gin
55 «0
TCTTTTTGAA AATGTCTAAT TAATTGCCAC ATGCIAATTC CGTTCAG GTC CAA ATC 1327
Val Gin Zle
AAC CGT GGA TAC CGT GTC CAG TTC AAC TCC CCT CTT GCC CCC TAC AAG 1375
Aan Arg Gly Tyr Arg 65 Val Gla Phe Asn 70 Ser Ala Leu Gly Pro 75 Tyr Lys
GGT GGC CTC CGG TTC CAC CCC ACG GTG AAC CIT TCC ATC CTC AAG TTC 1423
Gly Gly Leu Arg Phe 80 Hla Pro Thr Val 85 Asn Leu Ser Zle Leu 90 Lys Phe 95
CTC GGT TTC GAG CAG XZC TTC AAG AAT GCC CTC ACC GCC CTC AAC ATS 1471
Leu Gly Phe Glu Gla 100 Zle Phe Lys Asn Ala 105 Leu Thr Gly Leu Asa Hee 110
GGC GGT CCT AAG CGT GGA TCC GAC TTC CAC CCC AAG CGC AAG ACC GAT 1519
Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe 115 120 Aep pro Lys Gly Lya 125 Thr Aep
AAC GAG ATC CCC CGC TTC TGT GTC TCC TTC AIG ACC GAG CTG TCC AAG 1567
Asn Glu Zle Arg Arg 130 Phe*Cys Val Ser 135 Pha Met Thr Glu Leu 140 Cys Lya
CAC ATC GGT CCC GAC ACC GAT CTT CCC CCC CGT GAT ATC CCT GTC ACC 1615
His Zle Gly Ala Asp 145 Thr Aep Val Pro .150 Ala Gly Aep Zle Gly 155 Val Thr
4 GGC CGC GAG CXT GGT TTC ATG TTC GGC CAG TAC AAG AAG ATC CCC AAC 1663
Gly Arg Clu Val Gly Pbe Met Pbe Gly Gin Tyr Lya Lya Zle Arg Aan
160 165 170 175
CAG TGG GAG GGT GTC CTC ACC GGT AAG GGT GGC AGC TGG GGT GGT TCC 1711
Gin Trp Glu Gly Val Leu Thr Gly Lya Cly Gly Sar Trp Gly Gly Ser
180 IBS 190
CTC ATC CGC CCC CAO CCC ACC CGC TAC GGT GTC CTC TAC TAC GTC GAG 1759
Leu Tie Arg Pro Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Val Val Tyr Tyr Val Glu
195 200 205
CAC ATC ATC CAG CAC GCC TCC GGC GGC AAG GAA TCC TTC GCT GGT AAG 1807
Hla Met Zle Gin Hla Ala Ser Gly Gly Lya Glu Ser Pbe Ala Gly Lya .
210 215 220
CGC GTC GCC AK TCC GGT TCC GOA AAC GTC GCC CM TAC GCC GCT CTC 1855
Arg Val Ala Zlé Ser Gly Ser Gly Aen Val Ala Gin Tyr Ala Ala Leu
225 230 235
AAG GTC ATC GAG CTC GGT GGC TCC GK ATC TCC CTC TCC GAC TCC CAG 1903
Lya Val Zle Glu Leu Gly Gly Ser Val Zle Ser Leu Ser Asp Ser Gin
240 245 250 255
GGT GCT CTC GTC CTC AAC CGC GAG GAG GGC TCC TTC ACC GCT GAG GAG 1951
Gly Ala Leu Val Leu Aaa Gly Glu Glu Gly Ser Pbe Thr Ala Glu Glu
260 265 270
ATC AAC ACC ATC GCT GAG AK AAG GK CAG CGC AAG CAG ATC GCC GAG 1999
Zle Asn Ths Zle Ala Glu Zle Lya Val Gin Arg Lya Gin Zle Ala Glu
275 280 285
CTC GCT ACC CAG GAC GCC TTC AGC TCC AAC TTC AAG TAC ATC CCC GGT 2047
Leu Ala Thr Gin Aap Ala Pbe Ser Ser Lya Pbe Lya Tyr Zle Pro Gly
290 295 300
GCC CGC CCC TGG ACC AAC ATC GCC GGC CGC ATC GAT GTC GCT CTC CCC 2095
Ala Arg Pro Trp Thr Aan Zle Ala Gly Arg Zle Aap Val Ala Leu Pro
305 310 315
TCC GCC ACC CAG AAC GAG GTC TCC GGC GAT GAG GCC AAG GCT CTC ATC 2143
Ser Ala Thr Gin Aan Glu Val Ser Gly Aap Glu Ala Lya Ala Leu Zle
320 325 330 335
GCC GCT GGC TGC AAG TTC ATC GCT GAG GGC TCC AAC ATG GGT TCC ACC 2191
Ala Ala Gly Cya Lya Phe Zle Ala Glu Gly Ser Aaa Mee Gly Ser Thr
340 345 350
CAG GAG GCT ATC GAT CTC TTC GAG GCC CAC CGT GAT GCC AAC CCT GGT 2239
Gin Glu Ala Zle Aap Val Pbe Glu Ala 81a Arg Aap Ala Aan Pro Gly
355 350 365
GCC GCT GCC ATC TGG TAC GCC CCT CGT AAG CCC GCC AAC GCT GGT GGT 2287
Ala Ala Ala Zle Trp Tyr Ala Pro Gly Lya Ala Ala Aan Ala Gly Gly
370 375 3B0
GTT GCC GTC TCT GGT CTC GAG ATG GCC CAG AAC TCT GCC CGT GTC AAC 2335
Val Ala Val Ser Gly Leu Glu Het Ala Gin Aan Ser Ala Arg Val Aan
3B5 390 395
TGG TCC CGT GAG GAG GTT GAC TCC CGT CTT AAG AAG ATT ATC GAG GAC 2383
Trp Ser Arg Clu Glu Val Aap Ser Arg Leu Lya Lya Zle Mee Glu Aap
400 405 410 415
TGC TTC AAC AAC GGT CTC. TCT ACT GCT AAG GAG TAT GTC ACC CCT GCT 2431
Cya Pbe Aan Aan Gly Leu Ser Thr Ala Lya Glu Tyr Val Thr Pro Ala
420 425 430
GAG GGT GTT CTT CCT TCC CTC GTG GCT ' GGC TCC AAC ATT GCT GGT TTC 2479
Glu Gly Val Leu Pro Ser Leu Val Ala , Gly Ser Aan Zle Ala Gly Phe
435 440, 445
AOC AAfl CTC GCT GAO CCC ΑΤΟ ΑΑΟ'ίβλΟ CAC GCT GAC TOO TOO TAAAXTAGTC 2531 Thr Lya Val Ala Glu Ala Mac LýšIGltt Hia Gly Arp Trp Trp <50 '. 49S'A*'ľ:'-„·' . «0
CCAXCCCCAT TTA2TCTGGG AGCTGTTCTB .TGACGAXXTC TOTCCTCTCT TAAGGAGAGO 2581 CAGCZTTGAT GCATITTCZT TTCXRTAAA TAOCRTTTA CCCTTTXTGT CAAGCCGGTT 2651 AOGGATAGAfl GOCCITCGIT TTCTCCACTO ;TTQCATTOGA TTGXTXTCCC CACTTGXOCA 2711 ccocioniu ttrogrct gcacrooga ctgtcxtgat gaiaatgaga tacaaigaat 2771 AACTTÄAAAA TWOTCTGTB GTCTOGTAAA GIZGZAAACT CTXGA 2816
INFORMÁCIE O SEQ ID NO:2
Charakteristiky sekvencie:
Dĺžka: 5240 báz Typ: nukelotidy Rozvetvenosť: 2
Konfigurácia: lineárna . .
Typ molekuly : genómová DNA Hypotetická: nie
Protipôsobenie: nie
Pôvodný zdroj: Penicillium chrysogenum Priamy zdroj: plazmidy pALP295 a pALP388 Poloha v genóme: nie je známa
Charakteristika:
Názov/kíúč: kódovacia sekvencia Umiestnenie: 1324...3111 Iné informácie: hex gén
Popis sekvencie: SEQ ID NO:2
CTCGACCTCO CAACXOTCOA GXAQCACeCC OCCXATCTCO OCOOCAGCCG G8ZAACCGGC 60 CTXGTAACCC AGGOTAGCAA TGGCGAAOCC GICCACCZAG ACCGOeAAeVAOSCAAeCCC 120 axcacmcco ccacacocco coccctcgac ocacccgoct acaccaacät qcccctoaxt ιοο CCCGOCTGTC GCOCCOCCTC AACCCGTGAO'ACCXXCCAXT TCTBCCXOQA CTCCGGTOCA 240 GCAGOCGCCG ACCCTCTCCT CGTOCTCCCA CCCRGCTACT ACAAflZCCR CGTGAGCACC 300 GAGTCCATGC ACGCCCACTT CCGGGCTGZG GCCGAIGCCT COCCCGTCCC TGTCCTCAXC 360 TACAACTTCC CCGGCCTGCA CTCCGGCCTC GATCZCAOCT CA3AIGAIAX CTTAACTCIC 420 GCAOAACACC CCAAXATCAT COOCTGZAAG CTCACGIGCG OCAACACGGO TAAGTTGGCT 410 CGZGTTGCGG CGGCCAAGCC 0GATT7RZG ACTTTTGGIG CCTCGOCCOA TTTCACGCTG 640 cagacgctgg ttgxtcotoo cgcogogar atcggtgoco tggczaacat axrrccrcoc 100 TCGTGTGTGC GTCTGAXOQA GRPZXXCGT OCTOOOAAOO TTCAflGXGGC OCAGAAGGTO 660 CAGGCTATTG TTCCGCCCCC TGACTGGGCT GCTATCCAIG GTQGCZTTAT CORGRAAG 720 ACGGOCCTCC AAGCCSACCA COOTOCOCT COTCTTCCTC GCCOGCCTTG TOTCGTUCCT 780 TCTGCTAAGG AIGCGGCAGC CAITCAOGA0 GAOXTCCOGG ΑΟΟβΑΑΤΟΟΑ CCTCGACAAG 840 tcgttggagt cctaatcgät χησααχπ jwaaaGia taccagagat cccatgtgga 900 gatttctatt cctitccagg cGfzrzccAG ogcttitcca gatgttttcc aggtgttttc j«o atMivmc aggttgcttc aiagatcgac aoaccggtgt gactgtctca titcccacta 1020 GATCCOGAGA TCCCCTAGCT TTCCCCCTCT TTATCTTTTA ATATTTGTZG TTAXATGGGA 1080 GTTCAAGTTG CATGTAGAGG TTGCACTCTC TCTCTCTCTC T3TCCCTTGA AITATTTGAG 1140 TCCAAGGTCT CTTACTTCTA TCCAATGTÄA CTAGGGAGCT GiUbiliíI CCCCTTCCCC 1200 AGGGTTGCAT CCTGGGCCAT TCCCCATTCC GATGAAAGAT CGACAATCCA GCTAAACATA 1260 AATACrrCTG CTTATCTCCT GGCCACAflTT TCTCTÄCTTT TCATCGTCAC TCACCTTATC 1320
AAC ATG AAG TTC Met Lys Phe 1 GCC TCG GTG Ala Ser Val 5 TTG AAT GTG CTC GCG GCC CTG ACG GCT 1368 1416
Leu CCA Asa Val CIT CCC Leu Gly Ala Leu Thr Ala
10 GCC ČCC CGT AAC ATC 15 ACC
GCG TCC GCC GTC CAA GTG AAT
Ala Ser Ala Val Gin Val Asn Pro Leu Pro Ala Pro Arg Asn Zle Thr
TGG GGA TCC TCC 20 GGT CCA ATC CAA 25 GTC AAC AAC TTG AAT CTC 30 AAC GGT 1464
Txp Gly Ser Ser Gly Pro XX·, Gin Val Asn Asn Leu Asn Leu Asa Gly
CCT 35 CAC TCC CCT TTG CTC ACT CAA 40 GCT TGG GAG CGA GCA 45 TGG GAA ACC 1512
Pro Hla Ser Pro Leu Leu Thr Gla Ala Trp Glu Arg Ala Trp Glu Thr
ATC 50 ACC ACC CTG CAA TGG GTT 55 CCT GCT GCT GTT GAA 60 TCC CCA ATC GCC 1560
Zle Thr Thr Leu Gin Trp Val Pro Ala Ala Val Glu Ser Pro íle Ala
TCC 65 TAT CCO GCC TTC CCC 70 ACC TCG ACC CCT GTC 75 TCC TCT GCC CCC AAG 1608
Ser Tyr Pro Ala Phe Pro Thr Ser Thr Pro Val Ser Ser Ala Pro Lys
BO GCC AAA CGC GCG CCC 85 TCC GGA ATC CAT AAC 90 GTC GAT GTT CAT GTG 95 GTG 1656
Ala Lya Arg Ala Pro Ser Gly Zle Hli Asn Val Asp Val His Val Val
GAC AAC GAT GCC 100 GAT CTC CAA / 105 TAC.GGT GTG GAT GAA TCC TAT 110 ACA CTC 1704
Aap Asn Aap Ala Aap Leu Gin Tyr Gly Val Asp Glu Ser Tyr Thr Leu
GTA 115 GTG ACC GAT GGT CGC ATC AGG 120 ATC AAT TCT CAG ACG 125 GTC TGG GGT 1752
val Val Ser Asp Gly Gly Zle Arg Zle Asa Ser Gin Thr Val Trp Gly
GTG 130 TTG CAG GCA TTC ACC ACC 135 CTG CAG ’CAG ATT ATC 140 ATC TCG GAT GGG 1800
Val Leu Gin Ala Phe Thr Thr Leu Gin Gin Zle Zle Zle Ser Asp Gly
145 ISO 155
AAG GGC GGT TTG ATC ATT GAA CAS CCC GTC AAG ATC AAG GAT GCC CCG 1848
Lya 160 Gly Gly Leu íle Zle 165 Glu Gin Pro Val Lys 170 Zle Lya Asp Ala Pro 17S
CTG TAC CCC CAT CGT GGT ATC ATG ATA GAC ACC GGG CGC AAC TTC ATT 1896
Leu Tyr Pro His Arg 180 Cly Zle Met Zle Asp 185 Thr Gly Arg Asn Phe 190 Zle
ACC GTT CGC AAG CTC CIT GAG CAG ATC GAC GCT ATG CCC CTG TCC AAG 1944
Thr Val Arg Lys 195 Leu Leu Glu Gin Zle 200 Asp Gly Met Ala Leu 205 Ser Lys
CTC AAT GTT CTC CAC TGG CAC TTG GAC GAT TCT CAG TCG TGG CCC ATG 1992
Leu Asn Val 210 Leu His Trp His Leu 215 Asp Asp Sar Gin Ser 220 Trp Pro Met
CAG ATG ACC TCC TAC CCC CAG ATG ACC AAA GAT GCT TAC TCG CCT CGC 2040
Gin Met 225 Ser Ser Tyr Pro Glu 230 Met Thr Lya Aap Ala 235 Tyr Ser Pro Arg
GAA ATC TAC ACC GAG CAC GAC ATG CCC CCC GTG ATT GCC TAC GCA CGC 2088
Glu 240 Íle Tyr Thr Glu His 245 Asp Met Arg Arg Val 250 Zle Ala •‘Tyr Ala Arg 255
GCG CGA GCT CTC CGC CTC ATC CCC GAG CTC GAC ATG CCC GCC CAC TCA 2136
Ala Arg Gly Val Arg Val Xle Pro Glu Val Asp Met Pro Ala Kla Ser
260 265 270
GCC TCC GGC TGG CAG CAD GTC GAC CCG GAG ATC GTG CCA TCT GCC GAA 2164
Ala Ser Oly Trp ala ain Val Asp Pro Glu Xle Val Ala Cys Ala Glu
275 280 285
TCC TCG TGG TCO AAC GAC GTT TGG GCG GAG CAC ACC GCC CTC CAG CCG 2232
Ser Trp Trp Ser Aaa*Aap Val Trp Ala Glu Kla Thr Ala Val Gla Pro
290 295 300
AAC CCT GGC CAG CTC GAC ATT ATC TAC CCC AAG ACC TAC GAA CTT CTC 2280
Aaa Pro Gly Gla Leu Aap Xle Xle Tyr Pro Lys Thr Tyr Glu Val Val
305 310 315
AAC AAT GTC TAC CAG GAA TTG TCT CGC ATC TTC . ABC GAC AAC TTG TTC 2328
Aan Aaa Val Tyr Gla Glu Leu Ser Arg Xle Phe Ser Asp Aaa Leu Phe
320 325 330 335
CAC GIT GCT GCA GAC GAG ATC CAG CCC AAC TCC TAC AAC TAC AGC ACC 2376
Hi· Val Gly Ala Aap Glu Xle Gla Pro Aan Cys Tyr Asn Tyr ser Thr
340 345 350
CÄT ATC ACT AAG TCC TTT GCC GAG GAT CCC TCG CGC ACC TAC AAC GAC 2424
Hla Xle Thr Lya Trp Phe Ala Glu Aap Pro Ser Arg Thr Tyr Aaa Aap
355 350 365
CTI GCG CAG TAC TGG GTT GAC CAT TCC ATG CCC ATC TTC CCT ACT GTC 2472
Leu Ala Gin Tyr Trp Val Aap Kla Ser Met Pro Tie Phe Arg Ser Val
370 375 380
GGC GAC CAC CGC CGT CTT ATG ATG TGG GAG GAC AXA GCT ATC CCC ACT 2520
Gly Aap Hla Arg Arg Leu Mae Met Trp Glu Aap Xle Ala Zle Ala Thr,
385 390 395 \
GAA AGC CCC CAC CAC GTB CCC AAA GAC GTC ATC ATG CAG ACC TOS AAC \ 2568
Glu Ser Ala Hla Aap Val Pro Lys Aap Val Xle Met Gin zhr Trp Aan 1
400 405 410 415
AGC GGC GAG GCT GAG GGT AAC ATC AAG AAA CTC ACC TCC GCC GGC TAC· 2616
Ser Gly Glu Gly Glu Gly Aaa Xle Lya Lya Leu Thr Ser Ala Gly>Zýr
420 425 430
GAC GTT GTC GTT TCG ACC TCC GAT TTC CTC TAC CTC GAC TBC GGG CCC 2664
Aap val Val Val Ser Thr Ser Asp Phe Leu Tyr Leu Aap Cys Gly Arg
435 440 445
GGC GGC TAT GTC ACC AAC GAC GCC CGC TAC AAC GTG CAG AGC AAC ACC 2712
Gly Gly Tyr Val Thr Aaa Aap Ala Arg Tyr Aaa Val Gla Ser Aaa Thr
450 455 460
GAC GGC GGA GTG AAC.TTC AAC TAC CGC CGC CAC CCT CGC TCC TCC TBC 2760
Aap Gly Oly Val Aaa Phe Aaa Tyr Gly Gly Aap Gly Gly Ser Trp cya
455 <70 475
GCC CCC TAC AAG ACC TGG CAG CGC ATC TAC GAC TAC GAC TTC CTC ACG 2808
Ala Pro Tyr Lya Thr Trp Gla Arg Tie Tyr Aap Tyr Asp Phe Leu Thr
480 485 490 495
AAT CTC ACT TCC TCC GAA GCG AAG CAC ATT ATC GGC GCC GAG GCT CCT 2656
Aaa Leu Thr Ser Ser Glu Ala Lýa Kla Xle Zle Gly Ala Glu Ala Pro
500 505 510
TTG TGG TCO GAO CAG GTC GAC GAT GTG ACC CTC TCC AGC GTG TTC TGG 2904
Leu Trp Ser Glu Gla Val Aap Aap Val Thr Val Ser Ser Val Phe Trp
515 520 525
CCT CGC GCT GCT GCT CTC GCT GAG CIT CTC TGG TCT GCT AAC CCT GAC 2952
Pro Arg Ala Ala Ala Leu Gly Glu L«u Val Trp Ser Gly Aaa Arg Aap
530 • 535 1 540
GCT GCG GGT AGA AAG CCT ACC ACC ABC TTT ACT CAG CCT ATT CTC AAC 3000
Ala Ala Gly Arg Lya Arg Thr Thr Ser Phe Thr Gla Arg Zle Leu Aaa
545 550 555
TTC CGT QM TAC CTC GTT GCC MI GGT CIO ATS GCT ACT GCT CTT STS
Phe Ara Clu Tyr Leu Val Ala Am Gly Val Met Ala Thr Ala Leu Val
580 S55 ' 570 575
CCG AAG TAT TGT CTO CAG CAC CCT CAT GCT TBC GAC CTC TAT AAA AAC
Pro Lya Tyr Cya Leu Gla Bla Pro Kle Ala Cya Aap Leu Tyr Lya Aaa
580 585 590
CAG ACT GTA ATC TCT TGATTCTGGT .TAAGCTGGAC TCCIAGTCAG CÚTTACAACT Gin Thr Val Met Ser
595
3048
3096
3151
CCCTGTTCCT CTCTATATAC CAGGATACAT GTCCCIGATC CAATTTATCC AAACCAATCA ACTTGATACC CAATCCCAXT CAGCCCCCCG AGCCCAACCC AAACAAATCC ATCACGCCCX CCTCCACAAA CCAAACCCCA CTTCGGTCCC CTCCCGAACT GTAGTACGGA GTACGCCGTA GTTCGAGIAC GCAGTACGTA CGGCATAACC TACGCTATGC GATGCAATAC ATGTACATCT ATGTCTAGTC GTGTATAAGT GCAAACCAGC CCATTCAOAC GAGCTGGGCT TTCGGTGTTQ CAGGAXGCAG GGAATGACAA TCTCGTTCGG GATGTTTATG GGAATTTGTG GCAATCTGTC GATGGTCAAT GGGTATTCCA GATrTGGATT GAATTCTTCT ACAACCCTGO CTTCCAXAXA GCTGCGAGTA GATCGGGAAC CGGTCGTTCT GCGZAACCGG GATTTGGGAT AAGCTTCTÄT GTCTTCTATG TCAIATTTCC TXTGGTTTGT GGTrZACGTC CGTCGTGTTT CAACGTGGAT TGCCGTAGTG CGGGTTCGXA ACGTTQAGGT CCAGCIľUUT TATCAACATT CCCAAAACAG CTTGATCTTA CTCTGACTCC CCCAAGAACC AGGTAXAGTC GTTTAGGGCG ACGAATCTGO TTATATCTAC ATGGTTGTTC TCTGACGTGC GTATGIATCG
TTATTCTATC TTCCATACCC AGIAXACCAT TTCACGTCCA CCACCCTAGA TCIACCACAA CCAACCAGGC GCAAAAGGCG TCTCCACAXA TCCAXACCCT ACGACCCČAC AGACCTCCCC AATtíAfiAACT GCCGTGCAAC TAGAXGGGCT TCGOGACCGC CACATGTAGT AGGGGAXAXA GTCTCGCATO CACCTCACCT ATCTAA1ATT CTTCGGXAXA ACAIGTGCAT ACCTAGGIAC GTAGTCCCXT GICXXATAXA ATCCCTGCTC GAAACCCAGT CTGCATGCGT ACOCCTACAT ATTGACGAAT TBAGAAAXAC TTTXCCTAGG TATACTGCCT AGTOGCCAGG TCCTTGTTTG AGGAGGATGT ATCATCTGCT TTCCACGTCO ATOTAGATTC TCATGTGTCC ATACXAAGXA TGATCTOGCA TGTCTGTACA TTORTATGT TATTGOAXTT CCTK3GAATS GGIGCTTGGT AAAATACTAG TTTTCGGTAA CTACĽIOGCO TTZAGAGGGA CCGCGTCCTT TCCCTGAXAT TAATGCATST CTGGTAXATC TTGÄGGTTAC ATATATTGAG AACTTCATTC GTTGGATGCC TATCTCATCT CACCTTGGTT TGATCGTGGA TGTOGGCCAC GACTOCATTC CAGACGGGCC CCTGGTGTGT GIGGGTGTTT CTGGAAAGGC TCCtAGCGCC
AATTCCA3TG GAATTTCTTC CATTCAATCT TCAGCAACAC CACTACCTTT AXACAIATCT TSCCCAGTCC AAATCAAAAT AATCAAAATC ACCTTAAICT TTCCCAACCC ACCCAGTCCA TCTCCGTCTT AGAACTCGCC TTGCTGTÄTC CACTATCCAT TGTATGTACT AXGZACGCAT ACCATTGGCA CTAGCAXAXA TACCACAIGG TACGGAAIZA AAAGTSAATC TCCTTATTGT CAAGCCCAXA CCGCXZCGGA CTACGGAXIG AGACOGGGCT ACGZASGGAG AXATGCTGCA GCGAGiaSTT AGAIGZTAAT GGGGGGTCGT CAXACACGTG AXTXAXAXCT TTCCSAIGCG TIACACCGTC CCTTGCCTGG TTCCCCOGAC CTATTOGGCT CAOACGCTTC GAITTCCCGT CGAAGGGTTG TACAAGCACG GGXARCGTC XAAXATGGAX AXACTTCAOC CIAGIAĽ11Ľ GTAXATCTCC TACCTTTGAC GGGAZAGGTT TCTG3ATCAC AIÄXCTTGGC TTATUTITCG AXACGGCATT AGTGACTGGG CCAAAAXGGT CGAAAAXAXA ATGCCAAATT GCTAAXAGGT AXTCGTTACA CAGCARAAC GACAAAAXAG AAGGTCTCGT TGCGGAGAAI TTGCAGCAR CATGAXAXAT CCTGGICGAX TGCCTCGAC
3211
3271
3331
3391
3451
3511
3571
3631
3691
3751
3811
3871
3931
3991
4051
4111
4171
4231
4291
4351
4411
4471
4531
4591
4651
4711
4771
4B31
4891
4951
5011
5071
5131
5191
5240
INFORMÁCIE o SEQ ID NO: 3
Charakteristiky sekvencie:
Dĺžka: 2994 báz Typ: nukelotidy Rozvetvenosť: 2 Konfigurácia: lineárna Typ molekuly : genómová DNA Hypotetická: nie Protipôsobenie: nie
Pôvodný zdroj: Penicillium chrysogenum Priamy zdroj: plazmidy pALP315 a pALP316 Poloha v genóme: nie je známa
Charakteristika:
Názov/kíúč: kódovacia sekvencia
Umiestnenie: spojenie (494...500, 617...647, 846___901,
1047...1077, 1181...1952, 2022...2249)
Charakteristika:
Názov/kíúč: intrón Umiestnenie: 501...616 Charakteristika:
Názov/kíúč: intrón Umiestnenie: 648...845 Charakteristika:
Názov/kíúč: intrón Umiestnenie: 902...1046 Charakteristika:
Názov/kíúč: intrón Umiestnenie: 1078...1180 Charakteristika:
Názov/kíúč: intrón Umiestnenie: 1953...2021 Iné informácie: act gén
Popis sekvencie: SEQ ID HO:3
GAATTCAGCA GCCTACGGAfl TCCATAAGAC ACCAAGACAC AOCCAITGTA ΤΟβΑΧΙΜΑΧ ATGCCATGTA TCCCTCAČAA TCCTCTXSAA CTACTCTXAT ACAAOGTAÄA CCCCCAACCC GGTCAAGGTA CCIGTXCCCQ CCOTACCCAA MGQQTCCCC AAOAATCTCC ACOCMXACT TTTAGGTAGA CATTGAAGGA ATCCÄXGTGA, GXAATTCAAT GAACATGAAC MXHBTTCXO ccttaxaktc tttaiwmôta tmjaktcm αχαοχοΧαττ aiaiacaaaa gggtagatct GGAGGGGG7? CAGAGTTAAO GCCICAGGCA GGČGCÄCAAT CCOCCCAIC ACAAACCCCT CTCCACTCTT CCCTCTCTCT CTCTTCCTTC nCCXZTCTC CCCTAAICCC AACTAIAICC
CO
120
ISO
240
300
3C0
420
CCTCIAACCT CTTTCCATCT TTCTTTTCTT 7TXTCCCCTC TTCTCCCCTA ACTCCCI1UT 410 TIAATCAGTC ACA ATG GAC G GZATG1TATT CCAGTTGTGG CCACATCAGC AGCTTCCC 538
Mac Glu 1
CGGAAGCTCC CCCCCCTGTT GGCCACAGCT TCGATTCCAT ATTTGCGAAT GACAACTAAC 598 CCGTATATCT CAXTATAG AA GAA GTT GCT GCT CTC GTC ATC GAC AAT GG 647
Glu Glu Val Ala Ala Leu Val Xle Aap Aan Gly 5 10
GTATCTCCTA TACTTTTCCC CGGAGCTTCT OGCTTGTGTT GGGGTCGCCA ACTCAGCCCC 707 GGTCGCAGTC GTTGCCACCC CTAATCCGCC CGCGACGGCA GATGGAATCC ATCCCAATGG 767 CTTTCCATCT CGCTCCACAA CTACCAGACG GTOATCCAAA GACTACAAGA ACTAIGATAC 827 TGATTATTTG CGATAIAG T TCG GGT ATG TGT AAG GCC GGT TTC GCC GCT GAC 879
Ser Gly Met Cya Lya Ala Gly Phe Ala Gly Aap 15 20
GAC GCA CCA CGA GCT GTT TTC C GTAAGTCCA ACCCCACAGA ATATGACACC 930
Aap Ala Pro Arg Ala Val Phe 1 25 30
CCTCCTGTGC GAAGGCCGCC ATCCCACCAA CCCTTGCGTC GGATGGCTTC CCCTCTTTTG 990 CTTGGCTAGG AGGAACCTGG AACCTAGGAA ATCAAAXAAC TGACAAAATT CAACAG 1046
CT TCC ATT GTC GGT CGT CCC CGC CAC CAT GS GTAAATGATC CCCCCTTTTT 1097 Pro Ser Zla Val Gly Arg Pro Arg Hia Hia Gly
40
TTTCCGGCTC GTTTCGGCTG TATACGCTAT ACCCACCCAA TTTGATCCCT AATCAACCAA 1157
AAAGAATACT AACATGGGCG CAG T ATT ATG ATT GGT ATG GGT CAG AAG GAC 1208
íle Mae Zla 45 Gly Mac Gly Gin Lya 50 Aap
TCG TAC GTT GGT GAT GAG GCA CAG TCG AAG CGT GGT ATC CTC ACG CTC 1256
Ser Tyr Val Gly Aap Glu Ala Cla Sex Lya Arg Gly Zle Leu Thr Leu
55 «0 65
CGT TAC CCT ATT GAG CAC GGT GTT GTC ACC AAC TGG GAC GAC ATG GAG 1304
Arg Tyr Pro Zle Glu Hia Gly Val val Thr Aan Trp Aap Aap Mee Glu
70 75 80
AAG ATC TCG CAC CAC ACC TTC TAC AAC GAG CTC CCT GTT GCC CCC GAA 1352
Lya Zle Trp Hia Hia Thr Phe Tyr Aan Glu Leu Arg Val Ala .Pro Glu
85 90 95
GAG CAC CCC ATT CTC TTG ACC GAA GCT CCC ATC AAC CCC AAG TTC AAC 1400
Glu Hia Pro Zle Leu Leu Thr Glu Ala Pro Zle Aan Pro Lya Phe Aan
100 105 110 115
CGT GAG AAG ATS ACC CAG ATC OTO TTC GAG ACC TTC AAC GCC CCC GCC 1448
Arg Glu Lya Mec Thr Gla Zle Val Phe Glu Thr Phe Aan Ala Pro Ala
120 125 130
TTC TAC GTC TCC ATC CAG GCC GTT CTG TCC CTG TAC GCC TCC GGT CGT 1496
Phe Tyr Val Ser Zle Gin Ala Val Leu Ser Leu Tyr Ala Ser Gly Arg
135 140 145
ACC ACT GGT ATC GTT CTC GAC TCC GCT GAC GGT GTC ACC CAC GTC GTC 1544
Thr Thr Gly Zle Val Leu Aap Ser Gly Aap Gly Val Thr Hia Val Val
150 155 160
CCC ATC TAC GAG GGT TTC TCT CTG CCC CAC GCT ATC TCG CGT GTC GAC 1592
Pro Zla Tyr Glu Gly Phe Sex Leu Pro Hia Ala Zle Sex Arg Val Aap
165 170 175
ATG GCT CGC CGT GAT CTC ACC GAC TAC CTG ATG AAG ATC CTC GCT GAC 1640
Mec Ala Gly Arg Aap Leu Thr Aap Tyr Leu Mec Lya Zle Leu Ala Glu
íao 185 190 195
CGT GGT TAC ACT TTC TCC ACC ACC GCC GAG CGT GAA ATC GTC CGT GAC 1688
Arg Gly Tyr Thr Phe Ser Thr Thr Ala Glu Arg Glu Xle Val Arg Aap
200 205 210
1736
ATC AÁG CAC AAO CIT TCC TAC CICGCCCICGACTTCCAOCAOCMATC II· Lya clu Lya Leu Cya TyrValAla Leu Aap Phe Clu Ola Clu XI·
215 . , . 2X0 225
CM ACC CCT TCC CM ACC TCC MC CTC.CM AM TCC TAC GAG CIT CCC
Cla Thr Ala Ser Cla Sex Ser Ser Leu Clu Lya 8er Tyr Clu Leu Pro
220 235.; 240
CAT CCA CAC CTC ATC ACT ATT CCC AAC CAC CCC TTC CCT CCT CCT CAC
Aap oly Cla Val Xle Thr XI· Gly.Aea Clu Arg Phe Arg Ala Pro Clu
245 .250 - ' 255
CCT CTC TTC CM CCT AAC CIT CIT MC CTC CAC TCT QSC CCT ATC CAC
Ala Leu Phe Cla Pro Ara Val Leu Oly Leu Clu Ser Cly Gly Xle Hia
250 2CS ' 270 375
CTC ACC ACC TTC AAC TCC ATC ATC AAC TCT GAT CIT CAT CTC CCT AM
Val Thr Thr Phe Aaa Ser Xle Mae Lya Cya .Aap Val Aap Val Arg Lya
210 255 290
CAT CTC TAC COC AAC ATT' CTC'ATC OXAAOAAAAA AGCCTCCAGX GCZGAIGXTC Aap Leu ťyr Oly Aaa Xle Val- Met ' 255· -i/r//.
CGCAAAGATC CCCACZAACA TACAACTCCT TTTTTTTA0 TCT CCT CCT ACC ACC Ser Oly Cly Thr Thr 300
ATC TAC CCC GGT ATC TCC CAC CCT ATC CAC AAO CAC ATC ACT CCT CIT
Met Tyr Prú Cly Xle Ser Aep Arg Met Cla Lya Clu Xle Thr Ala Leu
305 310 315 320
CCT CCT TCT TCC ATQ AAC GTC AAO ATC ATC CCT CCC CCC CAC CCC AAC
Ala Pro Ser Ser Met Lya Val Lya Xle Xle Ala Pro Pro Clu Arg Lya
325 · /.λ 330 335
TAC TCC CTC TO0 ATC OCT CSX TCC ATT CIC CCC TCC CIC TCC ACC TTC
Tyr Ser Val Tip Xle'Cly Cly Ser Xle Leu Ala Ser Leu Ser Thr Phe
340 .345 350
CAC CAC ATC TCC ATC TCC AAC CAC OAO TAC CAC CAC ACC CCT CCT TCC
Cla Cla Met Trp Xle Ser Lya Ola Clu Tyr Aap Clu Ser Cly Pro Ser
355 :350 -. 355
ATC CIT CAC CCC AAC TCC TTC. TAAOCTICTT GCACCACZTT ACXACTCCTA
Xle Val Bla Arg Lya Cya Pha '370 375.
TTCCCTCCXA CTTTCCTCCT GXATCAAAAA CCAOGMGGA CGCACTCCTO GATTGCAAGC GITCTIOSAC TCQCAXSATC AAGOSSATM CCTCAAAAIG GAATCTCGAT TXTAUľUUAK TACAGTOOCT GGTTTTCTTT TTCTTACICT TTACCZTACT CTTTACTCCA TCTCXAXCCA TCCATTTCTO CRTQAACCA TXTCACCXZT ACTCCATCTT TTTCCCTXTC CTCATTCCAA TCCGCTCTCC CCTCCACCTC TCICATTCTT:TTQCCTOCAC GGCTCTCTCO CCATCCCGCA TCAACACTCT ACCTCTACCO CAAOQAIGTA .TATOCAOITO GTTCCCXATA CCCATZAGCT TCCCTTCTCC TTZTCCACOT CTTCIACCTC.TTTCITCIAO CCCCITCCCT TCTCT'ľCAAC TAAACTCCCC TTCTCCCXAC CITTTAACCT CACITTCACT TCAAATATTC CACTCCTTCC TTGZATTCIG CTAGAAACCC TCCTTCAACQ CTTGTTGAAT GTCTTCIATC TCCAACAICT ACAACACCTA TCCCACXACA CAACAAAAA0 OCTCZBACQA AACTCZACXA AAAACZTCCC CAGGCCGOAT TACOCCrTTC TCAIGCltAT TCXACXGTCA TTCQATCAGT CCAZAXTGAT ATTCTGCCAA TATCTASOCT QACQAOATAA ATGOCACQCA TTCGGTCTCT ATCTT
1714
1132
18B0
1928
1982
203C
2084
2132
21B0
2228
2279
2339
2399
2459
2519
2579
2639
269»
2759
2819
2·7»
2939
2994
INFORMÁCIE O SEQ ID NO:4
Charakteristiky sekvencie:
Dĺžka: 3240 báz Typ: nukelotidy Rozvetvenosť: 2 Konfigurácia: lineárna Typ molekuly : genómová DNA Hypotetická: nie
Protipôsobenie: nie
Pôvodný zdroj: Penicillium chrysogenum
Priamy zdroj: plazmidy pALC52 a pALC53
Poloha v genóme: nie je známa
Charakteristika:
Názov/klúč: kódovacia sekvencia
Umiestnenie: spojenie (787...793, 921...951, 1124...1179, 1290...1320, 1411...2182, 2250...2477)
Charakteristika:
Názov/klúč: intrón
Umiestnenie: 794...920
Charakteristika:
Názov/klúč: intrón
Umiestnenie: 952...1123
Charakteristika:
Názov/klúč: intrón
Umiestnenie: 1180...1410
Charakteristika:
Názov/klúč: intrón
Umiestnenie: 2183...2249
Iné informácie: act gén
Popis sekvencie: SEQ ID NO:4
GCCAGGCTGG CACCOCCCTO CCTTOXTCCO ABÄICCCIAC TCGTACTMO CCIACAGGTA SO
TGGGCRTCC COOTGTCGTC AOCWaCOXC OSCSOCOCZa CTOACOXCCC AAQOCAACCT 120
GGTAACATGQ CGQCACGAAX TrTCTCTCTO CCXCCTCCTC CTCITGGTGT GGÄCCGGTÄC 180
GAGTCCAGGT XtOXGQnfl 0000*1X00 TaMSOMKC 'lUlUOXZZO OOQQJUBZAC 240 tozacomia crcarAcrar MxnoatoarAexszGSXGa Txcrociraa tgomxtoss soo TCCASCACGC ATCCXCCTCC CTCCCÄCCGT CQTTAXCCÄX TdCTZÄAAO C1CCAACGCA 360 acccgccccc QTrrrTcxGC οαλΜζπα aocacncToa tocccccjust cccssnaec 420
CSCCCTTGTC TOZTCGCCXA CAGCCTCCAC CAOUSGTAAG MCAGGCCGC CCCAOGTCCT 480 e
TCTAGGTGCC CAGTGAGTGC CCGCTGCCCA CAAGľlICIC GTGGCAICCA CTGGCGGACT 540
TGGAACCCCA TCACTGATGC TTCCCTCCZT TCCCCCTCCA CATCTCACTC ACCTCACGCA «00 agccaaccct ctctcccccc gzctccaitc cazcttcztc tctccacoac cctzaagagt «60
CCCTCCTGCT CACCTCGACC ATCCITCCCT CCCAGCCCCA CGACAICTGC AICGTCTGGG 730
CrTCTTGACA CTCTCTCATT TCZTCCTTAT AAAACCTCTT TACCGCTC1T CCCCTAATCC 780
GACGCC ATG GAG G GTACGTGTCC CCCCAACCCA CTCCCCCTTC CCCXACTACC CCTA 837
M<e Glu 1
TCGCCC ATCCACACGG CCCCGCGATG CCTAGOCATC GCGAGGGIGC ATCGCAACGA CTI 894 GGCTAAC TGTTCTTCGC TTCACAG AG GAG GTC GCC GCC CTC GIT ATC GAC 946
Glu Glu Val Ala Ala Leu Val Zla Aap S 10
AAT GG GIAAGCTCGC CCGCTGTCTC ACCGACATCC ATCGTCCCCC TGGCCTCTGT 1001
Aan Gly
CGAGATGGGA GCCTCCAGGG GTCCCTTCGA CGAGCCCGIC GATTGCCAAA ATCCAACGAG 1081
ATCGGGCCAT ACTGAGCCGA CACTCGTGIG TTTTCIGGAC ATSAGGACIG ACTTGATTCT 1131
AG T TCG GGT ATG TGC AAQ GCC GGT TTC GCC GGT GAT GAT GCT CCC CGA 1169
Ser Gly Met Cya Lya Ala Gly Pbe Ala Gly Aap Aap Ala Pro Arg 15 20 25 _
GCT GTT TTC C GTAAGTACCC CACTTCCACC CGTCGAGCTC CCCAATTGIC CACCGCCAGG 1229 Ala Val Pbe
GCGAGAAGGG GGCAGAACGG GGCAAACTCC ATOGCAAACA TGGCXAATTC GATGCCACAG 1289 CG TCC ATT GTC GGT CGT CCC CCC CAC CAT GO GTAAGZTTCC GGCCCCAGCC 1340 Pro Ser Zle Val Gly Arg Pro Arg Kla Bis Gly
40
GACACCTCTC ACCCCCCCCC GGGGGGCTCC TAAGCGAGTC AGCGCZGGTT CTGACCGCTG 1400 GATACTATAG C ATC ATG ATC GGC ATG GGC CAG AAG GAC TCG TAC GTC GGT 1450
Zle Met íle Gly Met Gly Gla Lya Aap Ser Tyr Val Gly 43 50 55
CAC CAC GCT CAC TCC AAG CGT GGT ATC CTC ACC CTG CCC TAC CCC ATT 1498
Asp Glu Ala Gla Ser Lya Arg Gly Zle Leu Tbr Leu Arg Tyr Pro Zle
60 65 70
GAG CAC GGT GTT GTC ACC AAC TCG GAC GAC ATG GAG AAG ATC 7GG CAC 1546
Glu KÁS Gly Val Val Tbr Aan Trp Aap Aap Met Glu Lya Zle Trp Hla
75 80 B5
CAC ACC TTC TAC AAC GAG CTG CGT GTT GCC CCC GAG GAG CAC CCG GTC 1594
Hla Tbr Pbe Tyr Asa Glu Leu Arg Val Ala Pro Glu Glu Bis Pro Val
90 95 100
CTG CTC ACC GAG OCO CCC ATC AAC CCC AAG TCC AAC CGT GAG AAG ATG 1642
Leu Leu Tbr Glu Ala Pro Zle Aaa Pro Lya Ser Asa Arg Glu Lya Met
105 110 115
ACC CAG ATC GTC TTC GAG ACC TTC AAC CCC CCT GCC TTC TAC CTC TCC 1690
Tbr Cla Zle Val Pbe Glu Tbr Pbe Aaa Ala Pro Ala Pbe Tyr Val Ser
120 125 130 135
ATC CAG CCC GTC CTG TCA CTG TAC GCC TCC GGC CGT ACG ACC GGT ATC 1738
íle Gla Ala Val Leu Ser Leu Tyr Ala Ser Gly Arg Tbr Tbr Gly Zle
140 145 150
GTC CTG GAC TCT GGT GAT GGT GTC ACC CAC CTT GTC CCC ATC TAC GAG 1786
Val Leu Asp Ser Gly Aap Gly Val Tbr Bla Val Val Pro Zle Tyr Glu
155 160 165
GGT TTC GCC CTG CCC CAC GCC ATT GCC CGT GTC GAC ATG GCT. GGT CGT 1834
Gly Pbe Ala Leu Pro His Ala Zle Ala Arg Val Aap Met Ala Gly Arg
170 • 175 180
GAT CTC ACC GAC TAC CTC ATG AAG ATC CTG GCC GAG CCC GGC TAC ACC 1B82
Aap Leu Tbr Aap Tyr Leu Mac Lya Zle Leu Al* Clu Arg Gly Tyr Tbr
185 X90 195
TTC TCC ACC XCS CCC OAO COT 0X0 ATT OTC OBI CXC XTC AM CM XXO 1930
Phe Ser Thr Xhr Ala Olu Arg Olu Zle Val Arg Asp Zle lys Olu Lys
200 20S 210 215
Cic TCC XXC OTC OCC CXC «C TTC OM CM. 0X0 XTC CM ACT GCC GCC 197*
Leu cys Tyr Val Ala Len Asp Phe Olu 01a Glu-lle Ola Ihr Ala Ala
230 225 230
CXO ABC TCC AOC CTC 0X0 AM TCC TAC 0X0 CXT CCC OXC OQC CXO OTC 202C
Gla Ser Ser Sex Leu Gin Lya Sex Tyr Olu Leu Pro xsp Oly Gla Val
335 . 340 245
XTC ACC ATT OQC ΑΛΤ 0X0 COC.TTC COT OCT CCC 0X0 OCX CIC TTC CXO 2074
Zle Thx Zle 01y Xan Olu Arg The Arg Xla Pro Olu Ala Leu Phe Gla
250 4« 255 240
CCC TCC OTC CTO OCT CIC CM ACC OCC CCC XTC CXC CIC ACC ACC TTC 2122
Pso Ser. Val Leu Oly Letf Olu Sex Oly 01y Zle Bi· Val Xhx Thr Phe
245 * Ϊ70 275
XXC TC(* XTC XTQ XXO XOC OM,OTC OXT OXC COT XXO CXT CTO TXC CCC 2170
Xen Sex Zle Mee Lya Cya Asp Val Asp Val Arg Lys Asp Leu Tyx Oly
280 255 290 295
XXC ATT OTC XTC GXAXCTCASX TQCCOSQCCT CQXXGXCXCC TCATTTXGCX TCT 2225
Asn zle Val Mec
TCCTXXC ACCXXTXTTT TTXTTXO TCT COT OCT ACC ACC XTC TXC CCT OCC 2274
Sex Oly Oly Xhr Xhr Met Tyr Pro Oly 300 305
CTC TCT CXC CCT XTO CM AM OM ATC ACT OCX CIT OCT CCT TCT TCC 2324
Leu Sex Aip Axg Met 01a Lya Olu Zle Tte Ala Leu Xla Pxo Sex Sex
310 SIS 230
ATC AM OTC AM ATC ATT .OCT CCC CCO OM CSC AM TXC TCC CXC T00 2372
Mae Lya Val Lya Zle Zle Ala Pro.Pro Olu Axg Lya Tyx Sex Val Trp
325 . 330./-:. Λ ... . 335 340
ATC COT GCT TCC ATT CTC OCQ.TCT CXO TCC ACC TTC OQ CM ATC TCQ 2420
Zle Oly Oly Ser Zle Leu*. Ala Ser Leu Sex Xhr Phe Gin 01a Met TXp
345 350 355
ATC TCO XM CM OM XACCXC OM AOCCGC CCC TCC ATC CTC CXC CCC .2448
Zle Ser Lya Ola Olu Tyx'.Asp Olu ’Sex'Oly Pro Sex Zle Val Bi· Arg
340 345 370
AM TSC TTC XXXGCXXTCT TCZCBTCCCO AAQCCQQAXA CCCOXXTCXX XCCTTCXCM 2527 Lys Cya Phe
375
CXTCGXXAM XCXXOOCXXC COSCCXOXXC CAAATCCXTC CXCCCXCCQC XXXXSXXCCC 2517
CAAGATGTCG CXCTCCOTOQ CSACCSATCC XXCCXCXXCT CACQTGCOCO CCTATCCCAC 2447
TCXXfiTCTCX TATXTXeOXX AAfiTZXXTTC ΧελΤΟβΤΟΜ .CCUUXUCTCO CCCTTCCCTT 2707
TTCTCcoxAc xexcxxoxca ocqgccactt TTQTMTcoa xtqcqttxm oaxxocaxac 2747
CTACCGGTQT AGOXXOCTBX CSROXZXZX CXXZXXCTTT TTTTCCXTTC CCTTCZXGXC 2827
TCOTTCXXTC OQXXfiXCOTC ACOOXXXCOC TXOQCTCTCT AATAOCCAQC TTBXTCXOGC 2887
GAGTCOOGTT OTTQTOZTTC QATGTXGAGA OQTQCXCCM CCTXTXTCTA TOGCCGXGGT 2947
ACGTATTXTO OTCTCGTXTT TQCXXCXCXA OXCCTCCCTT OCTCOXTTTT XCCXGCXCXO . 3007 tcctctqccx TBccacoacT ccsxczcrca tctoocxtct cxoxccotoc ctcgtcaaxa 3os7
GTATTXTCCC CCGTXOTAXC CTCCOCXCXA OCCOOTTCIT TOTCQTCTTC CXCCTCCCCO 3127
ATCAOCTTCC TSTXCTTOCO CCTCXTCTTC TTOXCOQCOC TCOCXOCCCT CXTCTCCXTO 3187
ATCCCCCCBX CCXTBBCOSX CCGCCTCTBC TCCCCCTXSA CCAGCTCGTC OXC 3240
INFORMÁCIE o SEQ ID NOí5
Charakteristiky sekvencie:
Dĺžka: 461 aminokyselín Typ: aminokyseliny Rozvetvenosi: 1 Konfigurácia: lineárna Typ molekuly : peptid
Pôvodný zdroj: Penicillium chrysogenum 43 a
Charakteristika:
Iné informácie: sekvencia aminokyseliny enzýmu glutamát dehydrogenáza (EC.1.4.1.4) s molekulovou hmotnosťou 49 837 Da
Popis sekvencie: SEQ ID NO:5
Met Met Gin Asn Leu Pro Phe Glu Pro Glu Phe Glu Gin Ala Tyr
15 10 15
Lys Glu Leu Ala Ser Thr ‘Leu Glu Asn Ser Thr Leu Phe Gin Lys
20 25 30
Lys Pro Glu Tyr Arg Lys Ala Leu Gin Val Val Ser Val Pro Glu
35 40 45
Arg Val Zle Gin Phe Arg Val Val Trp Glu Asp Asp Lys Gly Gin
50 55 60
Val Gin Zle Asn Arg Gly Tyr Arg Val Gin Phe Asn Ser Ala Leu
65 70 75
Gly Pro Tyr Lya Gly Gly Leu Arg Phe His Pro Thr Val Asn Leu
80 85 90
Ser Zle Leu Lys Phe Leu Gly Phe Glu Gin íle Phe Lya Asn Ala
95 100 105
Leu Thr Gly Leu Asn Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe
110 115 120
Asp Pro Lys Gly Lys Thr Asp Asn Glu íle Arg Arg Phe Cys val
125 130 135
Ser Phe Met Thr Glu Leu Cys Lys His Zle Gly Ala Asp Thr Asp
140 145 150
Val Pro Ala Gly Asp Zle Gly Val Th*· Gly Arg Glu Val Gly Phe
155 160 165
Met Phe Gly Gin Tyr Lya Lya íle Arg Asn Gin Trp Glu Gly Val
170 175 180
Leu Thr Gly Lys Gly Gly Ser Trp Gly Gly Ser Leu íle Arg Pro
185 190 195
Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Val Val Tyr Tyr Val Glu His Met Zle
200 205 210
Gin His Ala Ser Gly Gly Lys Glu Ser Phe Ala Gly Lys Arg Val
215 220 225
Ala íle Ser Gly Ser Gly. Asa Val Ala Glň Tyr Ala Ala Leu Lys
230 - --/::,..238 240
Val íle Glu Leu Gly Gly Sér Val- íle Ser Leu Ser Asp Ser Gin'
245 ?.· 2S0 255
Gly Ala Leu Val Leu Asn Gly Glu Glu Gly Ser Phe Thr Ala Glu
260 265 270
Glu íle Asa Thr Xle Ala Glu íle Lys Val Gla Arg Lys' Gin Íle
275 280 285
Ala Glu Leu Ala Thr Gla Asp Ala Phe Ser Ser Lys Phe Lys Tyr
290 295 300 íle Pro Gly Ala Arg Pro Trp Thr Asa íle Ala Gly Arg Xle Asp
305 310 315
Val Ala Leu Pro Ser Ala Thr Gla Asn Glu Val Ser Gly Asp Glu
320 . * 325 330
Ala Lys Ala Leu íle Ala Ala Gly Cys Lys Phe íle Ala Glu Gly
335 340 345
Ser Asn Mec Gly Ser Thr Gin Glu Ala íle Asp Val Phe Glu Ala . 350 . .-„}·?·.· 355 360
Kis Arg Asp Ala Asa Pro Gly- Ala Ala Ala íle Trp Tyr Ala Pro
355 370 375
Gly Lys Ala Ala Asa Ala Gly Gly Val Ala Val Ser Gly Leu Glu
380 385 390
Met Ala Gin Asa Ser Ala Arg .Val . Asa Txp Ser Arg Glu Glu Val
395 7;'.:·Λ·...·. , 400 405
Asp Ser Arg Leu Lys Lys?Hej Met Glu Asp Cys Phe Asn Asn Gly
410 ‘ · '·.· . . 415 420
Leu Ser Thr Ala Lys Glu Tyr -Val Thr Pro Ala Glu Gly Val Leu 425 430 435
Pro Ser Leu Val Ala Gly Ser Ásh íle Ala Gly Phe Thr Lys Val
440 445 450
Ala Glu Ala Mee Lys Qlu Kis Gly Asp Txp Trp
455 460
INFORMÁCIE o SEQ ID NO:6
Charakteristiky sekvencie:
Dĺžka: 596 aminokyselín Typ: aminokyseliny Rozvetvenosť: 1 Konfigurác ia: 1ineárna Typ molekuly : peptid
Pôvodný zdroj: Penicillium chrysogenum Charakteristika:
Iné informácie: sekvencia aminokyseliny enzýmu β-Ν-acetylhexozoaminidáza (EC.3.2.1.52) s molekulovou hmotnosťou 66 545 Da
Popis sekvencie: SEQ ID NO:6
Mee Lys Phe Ala Ser Val Leu Asn Val Leu Gly Ala Leu Thr Ala.
1 5 10 15
Ala Ser Ala Val Gin Val Asn Pro Leu Pro Ala Pro Arg Aen Zle
20 25 30
Thr Trp Gly Ser Ser Gly' Pro Zle Gin Val Asn Asn Leu Asn Leu
35 40 45
Asn Gly Pro His Ser Pro Leu Leu * Thr Gin Ala Trp Glu Arg Ala
50 55 60
Trp Glu Thr íle Thr Thr Leu Gin Trp Val Pro Ala Ala Val Glu
65 < • 70 • 75
Ser Pro· Zle Ala Ser Tyr Pro Ala Phe Pro Thr Ser Thr Pro Val
80 1 85 90.
Ser Ser Ala Pro Lys Ala Lys.Arg.Ala Pro Ser Gly Zle Bis Asn
95 4, * 100 105
Val Asp Val Bis Val Val AŠp’-Asn Asp Ala Asp Leu Gin Tyr Gly
110 ' ·· .* .· *. ·**’ 115 120
Val Asp Glu Ser Tyr Thr Leu Val Val Ser Asp Gly Gly Zle Arg
125 130 135
íle Asn Ser Gin Thr Val Trp Gly Val Leu Gin Ala Phe Thr ®ir
140 , 1 145 ISO
Leu Gin Glh Zle íle íle Ser Asp Gly Lys Gly Gly Leu Zle Zle
155 160 16S
Glu Gin Pro Val Lys Zle Lys Asp Ala Pro Leu Tyr Pro Bis Arg
170 175 180
Gly Zle Met Zle Asp Thr Gly Arg Asn Phe Zle Thr Val Arg Lys
185 190 195
Leu Leu Glu Gin Zle Asp Gly Met Ala Leu Ser Lys Leu Asn Val
200 205 210
Leu His Trp His Leu Asp Asp Ser Gin Ser Trp Pro Met Gin Met
215 l- 1 220 225
Ser Ser Tyr Pro GlU Meť Thr Lys Asp Ala Tyr Ser Pro Arg GlU
230 • 235 240
íle Tyr Thr Glu His Asp. Steč Arg Arg Val Zle Ala iyr Ala Arg
24S 250 255
Ala Arg Gly Val Arg Val Zle Pro Glu Val Asp Met Pro Ala Bis
260 265 270
Ser Ala Ser Gly Trp Gin Gin'Val Asp Pro Glu Zle val Ala cye
275 » » 280 285
Ala Glu Ser Trp Trp Ser Asn Asp Val Trp Ala Glu Bie Ώιτ Ala
290 295 300
Val Gin Pro Asn Pro Gly Gin Leu Asp Zle Zle Pro Lys Thr
308 310 315
Tyr Glu val Val Asn Asn Val Tyr Gin Glu Leu 'Ser Arg Zle Phe
320 325 330
Ser Asp Asn Leu Phe Bis Val . Gly Ala Asp Glu Zle Gin Pro Asn
335 . * · -·><· 340 345
Cye Tyr Asn Tyr Ser Thr Bis Zle Thr Lys Trp Phe Ala Glu Asp
350 355 360
Pro Ser Arg Thr Tyr Asn Asp Leu Ala Gin Tyr Trp Val Asp Bis
365 '.••••.‘.r· ' ’’ 370 375
Ser Met Pro íle Phe Arg Ser Val Gly Asp Bis Arg Arg Leu , Met
380 • ’ 4». -1 385 390
Met Trp Glu Asp Zle Ala Zle Ala Thr Glu Ser Ala Bis Asp Val
395 400 405
Pro Lys Asp Val Zle Met Gin Thr Trp Asn Ser Gly Glu Gly Glu
410 415 420
Gly Aan Zle Lya Lya Leu Thr Ser Ala Gly Tyr Asp Val Val Val
425 430 435
Sex Thr Ser Aap Phe Leu Tyr Leu Asp Cys Gly Arg Gly Gly Tyr
440 445 450
Val Thr Asn Asp Ala Arg Tyr Aan Val Gin Ser Asn Thr Asp Gly
9 455 460 465
Gly Val Asn Phe Asn Tyr .Gly Gly Asp Gly Gly Ser. Trp Cys Ala
470 475 480
Pro Tyr Lya Thr Trp Gin Arg Zle Tyr Asp Tyr Asp Phe Leu Thr
485 490 495
Asn Leu Thr Ser Ser Glu Ala Lys Bis Zle Zle Gly Ala Glu Ala
500 505 510
Pro Leu Trp Ser Glu Gin Val Asp Asp Val Thr Val Ser Ser Val
515 520 525
Phe Trp Pro Arg Ala Ala Ala Leu Gly Glu Leu Val Trp Ser Gly
530 535 540
Asn Arg Asp Ala Ala Gly Arg Lys Arg Thr Thr Ser Phe Thr Gin
545 550 55S
Arg Zle Leu Asn Phe Arg Glu Tyr Leu Val Ala Asn Gly Val Met
550 565 570
Ala Thr Ala Leu Val Pro Lys Tyr cys Leu Gin Bis Pro Bis Ala
575 580 585
Cya Aap Leu Tyr Lya Aan Gin Thr Val Met Ser
590 595
INFORMÁCIE O SEQ ID NO:7
Charakteristiky sekvencie:
Dĺžka: 375 aminokyselín
Typ: aminokyseliny
Rozvetvenosť: 1
Konfigurácia: lineárna
Typ molekuly : peptid
Pôvodný zdroj: Penicillium chrysogenum
Charakteristika:
Iné informácie: sekvencia aminokyseliny proteinu
-aktin s’molekulovou hmotnosťou 41 760 Da
Popis sekvencie: SEQ ID NO:7
Met Glu Glu Glu Val Ala Ala Leu Val Zle Asp Asn Gly Ser Gly
1 S 10 15
Met Cys Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala Val
20. 25 30
Phe Pro Ser Zle Val Gly Arg Pro Arg His His Gly Zle Met íle
35 40 45
Gly Met Gly Gin Lys Asp Ser Tyr Val Gly Asp Glu Ala Gin Ser
50 55 60
Lys Arg Gly Zle Leu Thr Leu Arg Tyr Pro Zle Glu His Gly Val
65 70 75
Val Thr Asn Trp Asp Asp Met Glu Lys Zle Trp His His Thr Phe
80 85 90
Tyr Asn Glu Leu Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Zle Leu Leu
95 100 105
Thr Glu Ala Pro íle Asn Pro Lye Phe Asn Arg Glu Lys Met Thr
110 115 120
Gin íle Val Phe Glu Thr Phe Asn Ala Pro Ala Phe Tyr Val Ser
125 130 135
Zle Gin Ala Val Leu Ser Leu Tyr Ala Ser Gly Arg Thr Thr Gly
140 145 150
Zle Val Leu Asp Ser Gly Asp Gly Val Thr His Val Val Pro Zle
155 160 165
Tyr Glu Gly Phe Ser Leu Pro His Ala Zle Ser Azg Val Asp Met
170 175 180
Ala Gly Arg Asp Leu Thr Asp Tyr Leu Met Lys Zle Leu Ala Glu
IBS 190 195
Arg Gly Tyr Thr Phe Ser Thr Thr Ala Glu Arg Glu íle Val Arg
200 205 210
Asp Zle Lys Glu Lys Leu Cys Tyr Val Ala Leu Asp Phe Glu Gin'
215 220 225
Glu íle Gin Thr Ala Ser Gin Ser Ser Ser Leu Glu Lys Ser. Tyr
230 235 240
Glu Leu Pro Asp Gly Gin Val íle Thr Zle Gly Asn Glu Arg Phe
245 250 255
Arg Ala Pro Glu Ala Leu Phe Gin Pro Asn Val Leu Gly Leu. Glu
260 265 270
Ser Gly Gly íle His Val Thr Thr Phe Aen Ser Zle Met Lye Cye
275 280 285
Asp Val Asp Val Arg Lya Asp Leu Tyr Oly Asn Xle Val Met Ser
290 295 . 300
Gly Gly Thr Thr Met Tyr Pro Gly Zle Ser Asp Arg Met Gin Lys
305 310 315
Glu Zle Thr Ala Leu Ala Pro Ser Ser Met Lys Val Lys Zle Zle
320 325 330
Ala Pro Pro Glu Arg Lys Tyr Ser Val Trp Zle Gly Gly Ser Zle
335 340 345
Leu Ala Ser Leu Ser Thr Phe Gin Gin Met Tzp íle Ser Lys Gin
350 355 360
Glu Tyr Asp Glu Ser Gly Pro Ser Zle Val His Arg Lys Cys Phe
365 .370 375
INFORMÁCIE O SEQ ID NO:8
Charakteristiky sekvencie:
Dĺžka: 375 aminokyselín
Typ: aminokyseliny
Rozvetvenosť: 1
Konfigurácia: 1ineárna
Typ molekuly : peptid
Pôvodný zdroj: Acremonium chrysogenum
Charakteristika:
Iné informácie: sekvencia aminokyseliny proteinu
-aktin s molekulovou hmotnosťou 41 612 Da
Popis sekvencie: SEQ ID NO:8
Met Glu Glu Glu Val Ala Ala Leu Val íle Asp Asn Gly Ser Gly
1 5 10 15
Met Cys Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala Val
20 25 30
Phe Pro Ser íle Val Gly Arg Pro Arg Bis His Gly Zle Met Zle
35 40 45
Gly Met Gly Gin Lys Asp Ser Tyr Val Gly Asp Glu Ala Gin Ser
50 55 60
Lys Arg Gly íle Leu Thr Leu Arg Tyr Pro íle Glu His Gly Val
65 70 75
Val Thr Asn Trp Asp Asp Met Glu Lys Zle Trp His His Thr Phe
80 85 90
Tyr Asn Glu Leu Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro _Val Leu Leu
95 100 105
Thr Glu Ala Pro Zle Asn Pro Lys Ser Asn Arg Glu Lys Met Thr
. 110 115 120
Gin Zle Val Phe Glu Thr Phe Asn Ala Pro Ala Phe Tyr Val Ser
125 130 e 135
íle Gin Ala Val Leu Ser Leu Tyr Ala Ser Gly Arg Thr Thr Gly
140 145 150
íle Val Leu Asp Ser Gly Asp Gly Val Thr His Val Val Pro Zle
155 160 165
Tyr Glu Gly Phe Ala Leu Pro His Ala íle Ala Arg Val Asp Met
170 175 180
Ala Gly Arg Asp Leu Thr Asp Tyr Leu Met Lys Zle Leu Ala Glu
185 190 195
Arg Gly Tyr Thr Phe 200 Ser Thr Thr Ala Glii Arg Glu íle Val Arg
205 210
Asp Zle Lys Glu Lys Leu Cys Tyr Val Ala Leu Asp Phe Glu Gin
215 220 225
Glu Zle Gin Thr Ala Ala Gin Ser Ser Ser Leu Glu Lys Ser Tyr
230 235 240
Glu Leu Pro Asp Gly Gin Val Zle Thr íle Gly Asn Glu Arg Phe
245 250 255
Arg Ala Pro Glu Ala Leu Phe Gin Pro Ser Val Leu Gly Leu Glu
260 265 270
Ser Gly Gly Zle Bis Val Thr Thr Phe Asn Ser íle Met Lys Cys
275 280 285
Asp Val Asp Val Arg Lys Asp Leu Tyr Gly Asn íle Val Met Ser
290 295 300
Gly Gly Thr Thr Met Tyr Pro Gly Leu Ser Asp Arg Met Gin Lys
305 310 315
Glu Zle Thr Ala Leu Ala Pro Ser Ser Met Lys Val Lys Zle Zle
320 325 330
Ala Pro Pro Asp Gly Lys Tyr Ser Val Trp Zle Gly Gly Ser íle
335 340 345
Leu Ala Ser Leu Ser Thr Phe Gin Gin Met Trp íle Ser Lys Thr
350 355 360
Glu Tyr Asp Glu Glu Arg Pro Ser íle Val His Arg Lys Cys Phe
365 370 375
7/

Claims (42)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Spôsob zvyšovania alebo blokovania génovej expresie v mikroorganizmoch, vyznačujúci sa tým,že expresia génov, čiastočných génových sekvencii alebo DNA fragmentov v uvedených mikroorganizmoch je.kontrolovaná promótorom gdh génu Penicillium chrysogenum.
  2. 2. Spôsob zvyšovania alebo blokovania génovej expresie v mikroorganizmoch, vyznačujúci sa tým,že expresia génov, čiastočných génových sekvencii alebo DNA fragmentov v uvedených mikroorganizmoch je kontrolovaná promótorom hex génu Penicillium chrysogenum.
  3. 3. Spôsob extracelulárnej expresie proteinov v mikroorganizmoch, vyznačujúci sa tým,že v uvedených mikroorganizmoch sa uskutočňuje expresia génových spojení s hex génom Penicillium chrysogenum.
  4. 4. Spôsob zvyšovania alebo blokovania génovej expresie v mikroorganizmoch, vyznačujúci sa tým, že expresia génov, čiastočných génových sekvencii alebo DNA fragmentov v uvedených mikroorganizmoch je kontrolovaná act génom Penicillium chrysogenum.
  5. 5. Spôsob zvyšovania alebo blokovania génovej expresie v mikroorganizmoch, vyznačujúci sa tým, že expresia génov, čiastočných génových sekvencii alebo DNA fragmentov v uvedených mikroorganizmoch je kontrolovaná act génom Acremonium chrysogenum.
  6. 6. Spôsob podlá nároku 1 až 5,vyznačujúci sa tým, že transformované mikroorganizmy sú nehumánne eukaryoty, prednostne Penicillium, Aspergillus alebo Acremonium.
  7. 7. Spôsob podlá nároku 6,vyznačujúci sa tým, že používané mikroorganizmy sú prednostne Penicillium chrysogenum, Aspergillus nidulans alebo Acremonium chrysogenum.
  8. 8. DNA izolovaná z Penicillium chrysogenum so 2811 bázami, viazanými pomocou reštrikčných miest Sau3AI a Xbal, ktorá zahrňuje promótor gdh génu.
  9. 9. DNA izolovaná z Penicillium chrysogenum so 7737 bázami, viazanými pomocou reštrikčných miest BamHI a Sací, ktorá zahrňuje promótor hex génu.
  10. 10. DNA izolovaná z Penicillium chrysogenum so 4947 bázami, viazanými pomocou reštrikčných miest BglII a EcoRI, ktorá zahrňuje promótor act génu.
  11. 11. DNA izolovaná z Acremonium chrysogenum so 8650 bázami, viazanými pomocou reštrikčných miest HindlII, ktorá zahrňuje promótor act génu.
  12. 12. Sekvencia DNA identifikovaná ako gdh gén Penicillium chrysogenum.
  13. 13. Sekvencia DNA identifikovaná ako hex gén Penicillium chrysogenum.
  14. 14. Sekvencia DNA identifikovaná ako act gén Penicillium chrysogenum.
  15. 15. Sekvencia DNA identifikovaná ako act gén Acremonium chrysogenum.
    SEQ ID NO:l, ktorá zahrňuje
    SEQ ID NO:2, ktorá zahrňuje
    SEQ ID NO:3, ktorá zahrňuje
    SEQ ID NO:4, ktorá z ahrňuj e
  16. 16.Nukleotidová sekvencia, ktorá je hybridizovatelná pri reštriktívnych podmienkach s DNA podlá nároku 8 až 15.
  17. 17. Sekvencia aminokyseliny identifikovaná ako SEQ ID NO:5, ktorá zodpovedá glutamát dehydrogenáze enzýmu Penicillium chrysogenum.
  18. 18. Sekvencia aminokyseliny identifikovaná ako SEQ ID NO:6, ktorá zodpovedá β-Ν-acetylhexozoaminidáze enzýmu Penicillium chrysogenum.
  19. 19. Sekvencia aminokyseliny identifikovaná ako SEQ ID NO:7, ktorá zodpovedá ^/-aktinu proteinu Penicillium chrysogenum.
  20. 20. Sekvencia aminokyseliny identifikovaná ako SEQ ID NO:8, ktorá zodpovedá -aktinu proteinu Acremonium chrysogenum.
  21. 21. Nosiče, ktoré nesú DNA popísané v nárokoch 8 až 16, alebo ich fragmenty.
  22. 22. Nosiče podía nároku 21, vyznačujúce sa tým, že obsahujú plazmid.
  23. 23. Plazmidy podía nároku 22,vyznačujúci sa tým, že zahrňujú pALP784, pALP785 a pALfleo7.
  24. 24. Plazmidy podía nároku 22, vyznačujúci sa tým, Že zahrňujú PALP295, pALP319, pALP377, pALP388 a pALP480.
  25. 25. Plazmidy podía nároku 22, vyznačujúci sa tým, že obsahujú pALP315 a pALP316.
  26. 26. Plazmidy podía nároku 22, vyznačujúci sa tým, že zahrňujú pALC52 a pALC53.
  27. 27. Spôsob získavania tranformovaných nehumánnych organizmov so zvýšenou expresiou homologických alebo heterologických génov, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje nasledujúce operácie:
    a) Zostavenie nosičov, ktoré nesú, úplne alebo čiastočne, SEQ ID NO:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID NO:3 alebo SEQ ID NO:4, alebo ich rekombinantné DNA.
    b) Zavedenie nosičov do nehumánnych hosťovských organizmov pri získaní tranformovaných organizmov, ktoré uskutočňujú expresiu homologických alebo heterologických génov.
    c) Selektovanie transformovaných organizmov, ktoré vykazujú zvýšenú expresiu homologických alebo heterologických génov v porovnaní s netransformovanými kontrolovanými organizmami.
  28. 28. Spôsob získavania tranformovaných nehumánnych organizmov schopných produkovať extracelulárne proteiny, vyznačuj ú ci sa tým, že zahrňuje nasledujúce operácie:
    a) Zostavenie nosičov, ktoré nesú úplne alebo čiastočne SEQ ID NO:2 alebo jej rekombinantnú DNA.
    b) Zavedenie nosičov do nehumánnych hosťovských organizmov pri získaní transformovaných organizmov, ktoré uskutočňujú expresiu alebo sekréciu aspoň jedného proteinu.
    c) Selektovanie transformovaných organizmov, ktoré sú schopné sekrécie aspoň jedného proteinu na vyššej úrovni než netransformované kontrolované organizmy.
  29. 29. Spôsob získavania transformovaných nehumánnych organizmov s protipôsobiacou génovou expresiou, úplným alebo čiastočným blokovaním ich aktivity, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje nasledujúce operácie:
    a) Zostavenie nosičov, ktoré nesú, úplne alebo čiastočne, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 alebo SEQ ID NO:4, alebo ich rekombinantné DNA.
    b) Zavedenie nosičov do nehumánnych hosťovských organizmov pri získaní transformovaných organizmov s protipôsobiacou génovou expresiou.
    c) Selektovanie transformovaných organizmov, ktoré vykazujú úplne alebo čiastočne blokovanú expresiu génu v porovnaní s netransformovanými kontrolovanými organizmami.
  30. 30. Spôsob získavania transformovaných mikroorganizmov podlá nároku 27 a 29, vyznačujúci sa tým, že použité nosiče sú tie, ktoré boli definované v nároku 21 až 26, alebo boli z nich získané.
  31. 31. Spôsob získavania tranformovaných organizmov podlá nároku 28, vyznačujúci sa tým, že použité nosiče sú tie, ktoré boli definované v nároku 24, alebo boli z nich získané.
  32. 32. Spôsob získavania tranformovaných organizmov podlá nároku 27 až 31, vyznačujúci sa tým, že použitý hosťovský organizmus je nehumánny eukaryot, prednostne Penicillium, Aspergillus alebo Acremonium.
  33. 33. Spôsob podlá nároku 32,vyznačujúci sa tým, že použitý miktrorganizmus je prednostne Penicillium chrysogenum, Aspergillus nidulans alebo Acremonium chrysogenum.
  34. 34. Spôsob získavania tranformovaných organizmov podlá nároku 27 až 31, vyznačujúci sa tým, že použitý hosťovský organizmus je prokaryot, prednostne Escherichia coli alebo aktinomyceta.
  35. 35. Transformované nehumánne organizmy, vyznačujúce sa t ý m, že sekvencie DNA podlá nárokov 8 až 16, úplne alebo čiatočne zahrnuté v nosiči podlá nárokov 21 až 26, ktoré je možné získať spôsobom popísaným v nárokoch 27 až 34, boli do nich zavedené.
  36. 36. Transformované mikroorganizmy podlá nároku 35, vyznačujúce sa tým, že sú zložené z prokaryotu, prednostne Escherichia coli alebo aktinomycety.
  37. 37. Transformované mikroorganizmy podlá nároku 35, vyznačujúce sa tým, že sú zložené z eukaryotu, prednostne z génu Penicillium, Aspergillus, Acremonium alebo Saccharomyces.
  38. 38. Transformované mikroorganizmy podlá náoku 36, vyznačujúce sa tým, že sú zložené prednostne z Penicillium chrysogenum, Aspergillus nidulans, Acremonium chrysogenum alebo Saccharomyces cerevisiae.
  39. 39. Organizmus podlá nároku 36, vyznačujúci sa tým, že je zložený z čistého kmeňa reprezentovaného CECT4849, CECT4852, CECT4851 a CECT4850, alebo mutantov a ich trans formovaných derivátov.
  40. 40. Použitie transformovaných organizmov podlá nárokov 35 až 39 v produkcii antobiotík.
  41. 41. Použitie tranformovaných organizmov podlá nárokov 35 až 39 v produkcii penicilínu.
  42. 42. Použitie tranformovaných organizmov podlá nárokov 35 až 39 v produkcii cefalosporínov.
SK1495-98A 1997-03-05 1998-03-05 Promoters of the genes glutamate deshydrogenase, 'beta'-n- -acetylhexosaminidase and gamma-actine, and their use in systems of expression, secretion and anti-sens in filamentary fungi SK149598A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES009700482A ES2127697B1 (es) 1997-03-05 1997-03-05 Promotores de los genes glutamato deshidrogenasa, beta-n-acetilhexosaminidasa y gamma-actina y su utilizacion en sistemas de expresion, secrecion y antisentido de hongos filamentosos.
PCT/ES1998/000056 WO1998039459A1 (es) 1997-03-05 1998-03-05 PROMOTORES DE LOS GENES GLUTAMATO DESHIDROGENASA, β-N-ACETILHEXOSAMINIDASA η-ACTINA Y SU UTILIZACION EN SISTEMAS DE EXPRESION, SECRECION Y ANTISENTIDO DE HONGOS FILAMENTOSOS

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK149598A3 true SK149598A3 (en) 2000-03-13

Family

ID=8298517

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1495-98A SK149598A3 (en) 1997-03-05 1998-03-05 Promoters of the genes glutamate deshydrogenase, 'beta'-n- -acetylhexosaminidase and gamma-actine, and their use in systems of expression, secretion and anti-sens in filamentary fungi

Country Status (17)

Country Link
US (2) US6300095B1 (sk)
JP (1) JP2000509613A (sk)
KR (1) KR20000065202A (sk)
CN (1) CN1219200A (sk)
AU (1) AU6101198A (sk)
CA (1) CA2253250A1 (sk)
CZ (1) CZ353598A3 (sk)
EE (1) EE9800381A (sk)
ES (3) ES2127697B1 (sk)
HU (1) HUP0000870A3 (sk)
IL (1) IL126647A0 (sk)
LT (1) LT4557B (sk)
LV (1) LV12264B (sk)
PL (1) PL329722A1 (sk)
SK (1) SK149598A3 (sk)
WO (1) WO1998039459A1 (sk)
ZA (1) ZA981896B (sk)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6610839B1 (en) 1997-08-14 2003-08-26 Geron Corporation Promoter for telomerase reverse transcriptase
US6777203B1 (en) 1997-11-19 2004-08-17 Geron Corporation Telomerase promoter driving expression of therapeutic gene sequences
ES2127697B1 (es) * 1997-03-05 2000-03-16 Antibioticos Sau Promotores de los genes glutamato deshidrogenasa, beta-n-acetilhexosaminidasa y gamma-actina y su utilizacion en sistemas de expresion, secrecion y antisentido de hongos filamentosos.
US7378244B2 (en) * 1997-10-01 2008-05-27 Geron Corporation Telomerase promoters sequences for screening telomerase modulators
ES2143408B1 (es) * 1998-04-02 2000-12-01 Urquima Sa Promotor y construcciones para expresion de proteinas recombinantes en hongos filamentosos.
EP1175494A1 (de) * 1999-03-03 2002-01-30 Marcus Hartmann Beta-hexosaminidase sowie diese kodierende dna-sequenz aus ciliaten und deren verwendung
EP2009093A3 (en) * 2004-09-22 2009-04-08 Bioworks, Inc. Transgenic strains of trichoderma and their use in biocontrol
EP1801221A1 (en) * 2005-12-22 2007-06-27 Sandoz AG Promoter sequences
CN102127546B (zh) * 2010-11-24 2012-10-24 山东农业大学 一种骨骼肌特异性actin启动子及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8508800D0 (en) * 1985-04-04 1985-05-09 Glaxo Group Ltd Microbiological process
FI864473A (fi) * 1985-11-20 1987-05-21 Panlabs Inc Sammansatta yttryckskassetter foer fungaltransformering.
ES2127697B1 (es) * 1997-03-05 2000-03-16 Antibioticos Sau Promotores de los genes glutamato deshidrogenasa, beta-n-acetilhexosaminidasa y gamma-actina y su utilizacion en sistemas de expresion, secrecion y antisentido de hongos filamentosos.

Also Published As

Publication number Publication date
LT4557B (lt) 1999-10-25
HUP0000870A2 (en) 2000-07-28
HUP0000870A3 (en) 2001-09-28
ZA981896B (en) 1998-09-14
WO1998039459A1 (es) 1998-09-11
LV12264A (lv) 1999-04-20
ES2127697B1 (es) 2000-03-16
PL329722A1 (en) 1999-04-12
CZ353598A3 (cs) 1999-02-17
ES2149706B1 (es) 2001-05-16
KR20000065202A (ko) 2000-11-06
ES2149706A1 (es) 2000-11-01
CN1219200A (zh) 1999-06-09
JP2000509613A (ja) 2000-08-02
ES2149707A1 (es) 2000-11-01
ES2149707B1 (es) 2001-05-16
LT98152A (en) 1999-06-25
LV12264B (en) 1999-10-20
AU6101198A (en) 1998-09-22
US6300095B1 (en) 2001-10-09
US6558921B1 (en) 2003-05-06
CA2253250A1 (en) 1998-09-11
ES2127697A1 (es) 1999-04-16
EE9800381A (et) 1999-04-15
IL126647A0 (en) 1999-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hatfield et al. The ubiquitin‐activating enzyme (E1) gene family in Arabidopsis thaliana
Inokoshi et al. Cerulenin-resistant mutants of Saccharomyces cerevisiae with an altered fatty acid synthase gene
AU715382B2 (en) Process and DNA molecules for increasing the photosynthesis rate in plants
SK149598A3 (en) Promoters of the genes glutamate deshydrogenase, &#39;beta&#39;-n- -acetylhexosaminidase and gamma-actine, and their use in systems of expression, secretion and anti-sens in filamentary fungi
JP2002515253A (ja) トリコテセン−欠失糸状菌変異体細胞において異種ポリベプチドを生成するための方法
JP2000501620A (ja) ａｒｅＡ，ｐｅｐＣ及び／又はｐｅｐＥ遺伝子が不活性化されている菌類
JP2003532379A (ja) 共通翻訳開始配列を用いるポリペプチドの産生方法
JP2001509376A (ja) フィードバック不感性トレオニンデヒドラターゼ／デアミナーゼを発現する植物および微生物を製造するための方法および組成物
JP2898499B2 (ja) エンド型キシログルカン転移酵素遺伝子
AU772284B2 (en) Polynucleotide sequences
HU212767B (en) One-step process for producing 7-aminocephem compound or salts thereof, expression vector and microorganism for this purpose
Bröker et al. New expression vectors for the fission yeast Schizosaccharomyces pombe
US6093810A (en) Nematode-induced genes in tomato
ES2307746T3 (es) D-hidantoinasa de ochrobactrum anthropi&#39;.
US5474929A (en) Selectable/reporter gene for use during genetic engineering of plants and plant cells
US5466598A (en) Deacetylcephalosporin C acetyltransferase from Acremonium chrysogenum
EP0475584A2 (en) Inactivation of gene transcription in plants using altered transcriptional activators
JPH0884540A (ja) 植物における病害虫抵抗性増強方法
US6913905B1 (en) Regulatory sequences functioning in filamentous fungi
JP3512217B2 (ja) エンド型キシログルカン転移酵素遺伝子
JP2002505587A (ja) Ｔ．バリアビリス由来のｄ−アミノ酸オキシダーゼプロモーター
JP2001501466A (ja) ロドスポリジウム・トルロイド由来のセファロスポリンエステラーゼ遺伝子
Hynes et al. Regulation of acetamide catabolism
MXPA98009198A (en) PROMOTERS OF THE GENES GLUTAMATE DESHYDROGENASE,&amp;bgr;-N-ACETYLHEXOSAMINIDASE AND$b(g)-ACTINE, AND THEIR USE IN SYSTEMS OF EXPRESSION, SECRETION AND ANTI-SENS IN FILAMENTARY FUNGI
JP3349440B2 (ja) 植物の制御方法