HU217208B - Eljárás foszfinotricinnel szemben rezisztens gén előállítása - Google Patents

Eljárás foszfinotricinnel szemben rezisztens gén előállítása Download PDF

Info

Publication number
HU217208B
HU217208B HU727/87A HU372787A HU217208B HU 217208 B HU217208 B HU 217208B HU 727/87 A HU727/87 A HU 727/87A HU 372787 A HU372787 A HU 372787A HU 217208 B HU217208 B HU 217208B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
ptc
gene
ptt
resistance
marker
Prior art date
Application number
HU727/87A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT44621A (en
Inventor
Renate Alijah
Walter Arnold
Klaus Bartsch
Dieter Brauer
Susanne Grabley
Rüdiger Marquardt
Alfred Pühler
Eckhard Strauch
Wolfgang Wohleben
Gerhard Wöhner
Original Assignee
Hoechst Ag.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19863628747 external-priority patent/DE3628747A1/de
Priority claimed from DE19863642829 external-priority patent/DE3642829A1/de
Priority claimed from DE19873700313 external-priority patent/DE3700313A1/de
Application filed by Hoechst Ag. filed Critical Hoechst Ag.
Publication of HUT44621A publication Critical patent/HUT44621A/hu
Publication of HU217208B publication Critical patent/HU217208B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
    • C12P41/007—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures by reactions involving acyl derivatives of racemic amines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8277—Phosphinotricin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
  • Catalysts (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
  • Compounds Of Alkaline-Earth Elements, Aluminum Or Rare-Earth Metals (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás főszfinőtricinnel szemben rezisztenciátközvetítő gén előállítására. Az eljárás szerint a Streptőmycesviridőchrőmőgenes DSM 4112 mikrőőrganizműst főszfinőtricil-alanil-alanin jelenlétében tenyésztik, a rezisztenssé vált telepeketszelektálják, a rezisztens egyedek össz-DNS-ét BamHI restrikciósenzimmel vágják, egy 0,4 kb méretű fragmenst klónőznak, majd agazdasejtek PTT- rezisztenciája alapján újabb szelektálást végeznek.Az így előállítőtt gént növényekbe építve főszfinőtricinnel szembenrezisztens növényeket lehet előállítani. Tekintve, hőgy a génexpressziójából származó PTC-acetil- transzferáz a főszfinőtricinnekcsak az L-főrmáját szelektíve N-acetilezi, a gén a racém PTC őptikaiizőmerekre történő szétválasztásáhőz is alkalmazható. ŕ

Description

A találmány foszfinotricinnel szemben rezisztens gén előállítására vonatkozik.
Foszfinotricin (PTC, 2-amino-4-metilfoszfino-vajsav) glutamin-szintetáz inhibitor, továbbá a foszfinotricil-alanil-alanin antibiotikum egyik „építőkockája”. Az említett tripeptid Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok, valamint a Botrytis cinerea gomba ellen [Bayer et al., Helv. Chim. Acta 55 (1972) 224] aktív. A Streptomyces viridochromogenes Tü 494 (DSM 40736, DSM 4112) törzs termel PTT-t.
A 2 717440 számú NSZK-beli szabadalmi leírásból ismert, hogy a PTC totál herbicidként hat. A WO 86/02097 számú PCT bejelentésben olyan növényeket írnak le, amelyek PTC elleni rezisztenciája arra vezethető vissza, hogy feleslegben termelnek glutaminszintetázt. Az ilyen túltermelés (amelyet például génamplifikálással lehet indukálni) azonban nem szükségképpen stabil; instabilitás esetén a glutamin-szintetáz túltermelése lecsökken, és a PTC kompetitív inhibitorhatása újból érvényesülne.
A jelen találmány tárgya eljárás PTC ellen rezisztens gén előállítására; e gén segítségével PTC-vel szemben rezisztens növényeket lehet előállítani. Emellett a gén rezisztenciajelzőként is alkalmazható. Végül a találmány szerint előállított gén a racém PTC L-formájának szelektív N-acetilezésére alkalmazható.
A PTC-vel szemben rezisztens gént úgy állítjuk elő, hogy a PTT-rezisztenciára szelektált Streptomyces viridochromogenes DSM 4112 törzs össz-DNS-ét BamHI restrikciós enzimmel vágjuk, egy 4,0 kb (kilobázis) méretű fragmenst klónozunk, majd PTT-rezisztenciára szelektáljuk. Az 1. ábrán látható restrikciós térkép az említett 4,0 kilobázis méretű fragmenst közelebbről jellemzi.
A 4 kb fragmens egyes résztartományait klónozva behatároltuk a kódolótartomány pontosabb helyét. Megállapítást nyert, hogy a rezisztenciagén az 1,6 kb-nyi SstlI-Sstl-fragmensen (az 1. ábrán a 0,55-től 2,15-ig terjedő pozíciókon) helyezkedik el. BglII enzimmel vágva 0,8 kb méretű fragmenst kapunk, amely - plazmidba beépítve és S. lividansban transzformálva - PTT elleni rezisztenciát közvetít. Ez a rezisztencia a PCT N-acetilezésén alapul.
A 0,8 kb méretű fragmens Maxem és Gilbert szerint végzett szekvenciaelemzése a függelékben ábrázolt I. DNS-szekvenciát eredményezte. A szekvencia nyitott olvasókerete lehetővé teszi a rezisztenciagén helyzetének megállapítását. A gén a 258. pozíciónál kezdődik, végét az ábrázolt nukleotidok utolsó előtti tagja képezi (806. pozíció), az utolsó nukleotid (a 807.) tehát a stopkodon elejét jelenti.
Az I. DNS-szekvenciában a „Shine-Dalgamo-szekvenciá”-t, valamint a startkodonként működő GTG triplettet aláhúzással kiemeltük. A mérvadó olvasókeret tehát a felső sorban található.
A II. DNS-szekvencia a szekvenciaelemzett génen belül azt mutatja, melyik helyeken vágják a restrikciós enzimek. A szekvenciát hatnál több helyen vágó enzimek nincsenek feltüntetve.
A PTT antibiotikumot a baktériumok felveszik, majd PTC-vé lebontják. Ez a PTC baktériumban szintén a glutamin-szintetáz enzimet gátolja, így a baktérium glutaminhiány miatt pusztul el. A PTT-t termelő baktériumban kellene tehát olyan mechanizmus legyen, amely a baktériumot a PTT hatásától védi, például a termelt PTT újbóli felszívódását gátolja vagy a bomlástermékként keletkező PTC módosítását teszi lehetővé. Meglepő módon azonban a PTT-termelő S. viridochromogenes DSM 4112 törzs érzékeny a saját antibiotikumára. Nem várt módon viszont sikerült PTT jelenlétében végzett szelektálás útján meglepően magas részarányban (105) olyan szelektálókat találni, amelyek PTT-vei szemben rezisztensek, és a szomszédos telepek talaj alatti növekedését is elnyomják.
E szelektánsok DNS-éből génbankot létesítettünk oly módon, hogy a DNS-t izoláltuk, BamHI enzimmel vágtuk és Streptomyces-vektorba ligáltuk. A ligálás során kapott elegyet a kereskedelmi forgalomban lévő S. lividans TK 23 törzsbe transzformáltuk, amelynek során 1 pg ligációs elegyből mintegy 5000-10000 transzformáit egyedet nyertük, darabonként 1-5 kb-nyi beépített anyaggal. A transzformánsok között PTT-rezisztens S. lividans törzsek is vannak. A plazmid elkülönítése, majd S. lividans-ba történő újbóli transzformálása révén meggyőződhetünk arról, hogy a rezisztencia: a plazmidban kódolt tulajdonság. A rezisztenciáért felelős gén egy 4 kb méretű BamHI-ffagmensen (1. ábra) helyezkedik el. A kódoló szakasz a 0,8 kb méretű BglII-fragmensen található. A BamHI-fragmens az alábbi enzimek számára nem tartalmaz vágóhelyeket: Clal, EcoRI, EcoRV, HindlII, Hpal, KpnI, Pvul, PvuII és Xhol.
Ha a gént az S. hygroscopicus FERM BP-130/ATCC 21705 mikroorganizmusból izolált, közelebbről nem jellemzett rezisztenciagén restrikciós térképével összehasonlítjuk, akkor látjuk, hogy a találmány szerint előállított gén különbözik az ismert géntől (0 173 327 számú alatt publikált európai szabadalmi bejelentés 7. ábrája); az utóbbit egyébként a PTT-bioszintézisért felelős gének kutatása közben találták meg.
S. viridochromogenes DSM 4112, S. lividans TK 23, továbbá a PTT-rezisztens S. viridochromogenes szelektáns, és végül a plazmidot tartalmazó S. lividans transzformáit törzs sejtextraktumait PTC és acetil-koenzim-A jelenlétében inkubálva azt tapasztaljuk, hogy a rezisztens szelektánsnak, valamint a plazmidot tartalmazó transzformált törzsnek acetilező aktivitása van. Kromatográfiás módszerrel kimutatható, hogy az acetilezés az aminocsoporton történik.
Tekintettel arra, hogy E. coli-ban szintén lehetett PTT-rezisztenciát kimutatni, és ezek szerint a rezisztencia mechanizmusa Gram-negatív baktériumokban is működik, kizárhatjuk azt, hogy a rezisztencia oka valamilyen transzportjelenség volna. A találmány szerint előállított gént tehát növényi promotorhoz lehet kapcsolni, majd megfelelő vektorral növényekbe transzformálni, így PTC ellen rezisztens növények állíthatók elő.
Az N-acetilezés szintetikusan előállított D,L-PTC racemát szétválasztására is használható, mert szelektíve csak az L-forma acetileződik.
HU 217 208 Β
A találmány szerint előállított rezisztenciagénben kódolt PTC-acetil-transzferáz tehát arra is alkalmazható, hogy például a 2717440 számú NSZK-beli szabadalmi leírás szerint előállított racém PTC-t az optikai antipodokra szétválasztjuk oly módon, hogy a racemátot kitesszük az enzim acetilező hatásának. Az N-acetilezés szelektíve csak az L-forma esetén történik, a Dforma változatlan marad. Az így kapott elegyből a különböző tulajdonságok alapján a komponenseket ismert módon elkülöníthetjük.
Az N-acil-D,L-aminosavak szétválasztására ismert módszer az aminosavelegy adott esetben hordozóra rögzített aciláz enzimmel való érintkeztetése, aminek során szelektíve az L-aminosav szabadul fel, amely az N-acil-D-aminosav mellől savanyítás után vízzel nem elegyedő oldószerrel extrahálható (1 369462 számú brit szabadalmi leírás). Az N-acil-D,L-PTC fenti elven alapuló szétválasztását például a 2 939269 számú NSZKbeli közrebocsátási irat és a 4226 941 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti.
A találmány szerint végzett szelektív N-acetilezés során visszamaradó D-PTC ismert módon racemizálható (a 0 137 371 szám alatt publikált európai szabadalmi bejelentés 8. példája szerint), majd a folyamatba visszavezethető.
Az enzim (itt és a továbbiakban ezen mindig az enzimként hatásos részt értjük) elkülönítése lehetséges, de nem szükséges. Amennyiben az enzimet izoláljuk, később szabad formában vagy hordozóhoz rögzítve alkalmazhatjuk. Alkalmas hordozókat például a 141 223 szám alatt publikált európai szabadalmi bejelentés ismertet. Célszerűen azonban az enzimet nem izoláljuk, hanem a PTC-rezisztens sejteket használjuk, amelyek az enzimet exprimálják. így például a S. viridochromogenes DSM 4112 törzs PTC-rezisztens szelektánsát alkalmazhatjuk, de alkalmazhatunk tetszés szerinti sejteket is, feltéve, hogy a találmány szerint előállított gén beléjük van transzformálva, és a sejt képes a PTC-acetil-transzferáz exprimálására. A találmány szerint előállított gént, illetve aktív részeit plazmidban integrált formában vagy egyéb géntechnológiai módon, például transzfekció útján juttatjuk a sejtbe. Célszerűen például úgy járunk el, hogy a gént egy E. coli expressziós plazmidba építjük és E. colit ezzel a plazmiddal transzformálunk, például a 0163 249 és 0 171 024 szám alatt publikált európai szabadalmi bejelentésekben leírtak szerint.
A PTC-racemát L-komponensének találmány szerinti N-acetilezése során a PTC-acetil-transzferázt exprimáló sejteket szabad vagy rögzített formában alkalmazhatjuk. A rögzítés módszerei ismertek (3237341 számú NSZKbeli közrebocsátási irat és az ebben említett irodalom).
Az L-PTC enzimes acetilezését az enzimes reakció esetén szokásos módon végezzük, és az eljárási körülményeket az alkalmazott szervezet adottságai alapján választjuk. A módszerek alapvetően azonosak a fent említett szelektív dezacetilezési módszerekkel.
Az alábbi példákkal a találmányt közelebbről ismertetjük. A példákban szereplő részek és százalékok tömegrészek és -százalékok, ha nincs más kikötés.
1. példa
PTT-rezisztens szelektáns
A S. viridochromogenes DSM 4112 törzset minimális tápközegen tartjuk [Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, England (1985), 233. oldal], amelyhez növekvő koncentrációban PTT-t adunk. A 110 pg/ml koncentráció elérése után mintegy 105 telep között egy rezisztens telep is akad.
2. példa
A vektor készítése
A 0 070 522 számú európai szabadalmi leírásban ismertetett pSVHl plazmidot BglII enzimmel vágjuk, a mintegy 7,1 kb méretű ffagmenst izoláljuk, és a tiostrepton-rezisztenciát hordozó, 1,1 kb méretű BclIfragmenssel (0 158201 szám alatt publikált európai szabadalmi bejelentés) ligáljuk. így a 8,15 kb méretű pEB2 plazmidot kapjuk (2. ábra).
3. példa
A rezisztenciagén izolálása
Az 1. példa szerinti szelektánsokból az össz-DNS-t izoláljuk és BamHI enzimmai vágjuk. A pEB2 plazmidot szintén BamHI enzimmel nyitjuk, majd a két oldatot egyesítjük és ligáljuk. A ligációs eleggyel az S. lividans TK 23 törzset (kapható a John Innes Foundationnél) transzformáljuk. 1 pg ligációs elegyből 5-10xl03 transzformált egyedet kapunk, mindegyik mintegy 1-5 kb méretű beépített szakaszt tartalmaz. PTT jelenlétében végzett szelektálással két rezisztens S. lividans telepet nyerünk. Ezekből a felvett plazmidot izoláljuk és BamHI enzimmel vágjuk. 4 kb méretű BamHI-fragmenst találunk, amely a rezisztenciáért felelős gént hordozza. Ezt a plazmidot pPR.1 plazmidnak nevezzük (3. ábra).
A pPRl plazmidot újból S. lividans TK 23 egyedekbe visszajuttatjuk. Abból, hogy az így transzformált egyedek 100 pg/ml PTT-t tartalmazó minimális közegen növekednek, látható, hogy a PTT-rezisztencia plazmidban kódolt tulajdonság.
4. példa
A PTC N-acetilezés folytán bekövetkező inaktiválásának kimutatása
A klónozott fragmens acetilezési aktivitásának kimutatása céljából az alábbi törzseket vizsgáltuk:
- S. viridochromogenes DSM 40736
- S. viridochromogenes PTT-rezisztens mutánsa
- S. lividans TK 23
- S. lividans TK 23 (pPRl plazmiddal transzformált).
A törzsekkel lízisközeget (0158 872 szám alatt publikált európai szabadalmi bejelentés, 6. oldal) oltunk, 2 napon keresztül 30 °C körrázógépen inkubáljuk. Utána 1 mg micéliumot alkalmas pufferben [például RSbuffer: C. J. Thompson et al., J. Bacteriol. 151 (1982), 678-658] ultrahanggal feltárunk. Az így kapott extraktumban a PTC-bontást az alábbiak szerint méljük:
250 μΐ nyers extraktumhoz 100 μΐ PTC-oldatot (250 pg/ml) és 50 μΐ acetil-koenzim-A-t (4 mg/ml)
HU 217 208 Β adunk, és az elegyet 30 °C-on 2 órán át inkubáljuk. Az utána még meglévő PTC mennyiségét nagynyomású folyadékkromatográfiásán határozzuk meg.
Az alábbi eredményt kapjuk:
Törzs el nem reagált PTC x j θθ bevitt PTC
S. lividans TK 23 100%
S. Viridochromogenes (DSM 40736) 72%
S. viridochromogenes szelektánsa 7%
S. lividans TK 23 (pPRl) 31 %
Az, hogy a PTC N-acetilezéséről van szó, referenciaanyagokkal végzett vékonyréteg-kromatográfiasan kimutatható (ninhidrinnel nincs elszíneződés).
5. példa
Radioaktívan jelzett D,L-PTC (10 mM), radioaktívan jelzett L-PTC (10 mM), illetve radiaktívan jelzett D-PTC (10 mM) 3-3 μΐ-jéhez 10 μg elkülönített PAT-enzimet (foszfínotrícin-acetil-transzferáz) és 3 μΐ acetil-CoA-t
Függelék (100 mM) adunk, és az elegyeket 30 μΐ össztérfogatban 37 °C-on 3 órán át inkubáljuk. Az inkubációs közeg összetétele: 50 mM trisz/HCl (pH 7,5), 2 mM EDTA.
Utána a proteint 30 μΐ 12%-os triklór-ecetsawal ki5 csapjuk. Mindegyik felülúszóból 6 μΐ-t HPTLC-lemezre (Merck, F 254 cellulóz) viszünk, majd n-propanol és 25%-os NH3 3:2 térfogatarányú elegyével eluáljuk. Ezzel sikerült a PTC és az acetil-PTC szétválasztása. A radioaktívan jelzett PTC és a keletkezett acetil-PTC auto10 radiográfiásán került kimutatásra.
A D-PTC PAT-enzimmel végzett inkubálása nem vezetett a szubsztrátum átalakulásához, míg az L-PTC teljesen átalakult acetil-PTC-vé. A racém D,L-PTC-ből mintegy 50 alakult át acetil-PTC-vé; ez az L-PTC rész15 arányának felel meg, mivel a D,L-PTC azonos mennyiségben tartalmazza a D- és az L-PTC-t.
A kísérlet azt mutatja, hogy a PAT-enzim szelektíve csak az L-PTC-t átalakítja, és hogy a racém D,L-PTCből a PAT-enzimmel végzett inkubálás útján tiszta L20 PTC állítható elő.
I. DNS-szekvencia
I1eTrpSerAspVa1LeuGlyAlaG1yPr oVaILeuPr oGlyAspAs pPhePheSe rLeuGlyGlyThr Se rIIe AspLeuGluArgArgProGlyGlyArgSerGlyAlaAlaArgGlyArgLeuLeuLeuProArgArgHisLeuHis
Ar gSe rGlyAlaThrSerTrpGlyPr oVa1ArgCy sCy sProGlyThrThrSerSerProSerAlaAlaProPro AGATCTGGAGCGACGTCCTGGGGGCCGGTCCGGTGCTGCCCGGGGACGACTTCTTCTCCCTCGGCGGCACCTCCA 75 TCTAGACCTCGCTGCAGGACCCCCGGCCAGGCCACGACGGGCCCCTGCTGAAGAAGAGGGAGCCGCCGTGGAGGT SerArgSerArgArgGlyProProArgAspProAlaAlaAr gPr oAr gSe rArgArgGlyArgArgCysArgTrp
As pPr oAlaVa1As pGlnPr oGlyTh rAr gHi sGlnG1yPr oVa1Va1G1uGluG1yG1uAlaAIaGlyGlyAs p IleGlnLeuSerThrArgPr oAlaPr oGlyTh rSerGlyProSerSerLysLysGluArgProPr oVa1G1 uMe t
Se rAlaLeuAr gVaIValSerArgIleArgLysGluLeuGlyVa1Pr oLeuAr gLeuAlaValIlePheGluThr LeuGlyVa1AlaGlyGlyLeuAlaHi sPr oGlnGlyThrAr gAr gAlaThr Pr oAlaArgAr gAs pLeuArgAs p
Se rArgArgCysGlyTrpSerArgAlaSerAlaArgAsnSerAlaCysHisSerGlySe rPr oOP SerSerArg TCTCGGCGTTGCGGGTGGTCTCGCGCATCCGCAAGGAACTCGGCGTGCCACTCCGGCTCGCCGTGATCTTCGAGA 15 0 AGAGCCGCAACGCCCACCAGAGCGCGTAGGCGT TCCTTGAGCCGCACGGTGAGGCCGAGCGGCAC TAGAAGCTC T ArgProThrAlaProPr oArgAlaCysGlyCysProValArgArgAlaValGlyAlaArgArgSerArgArgSer
Ar gAr gGlnProHi sAs pArgAlaAs pAlaLeuPheG1uAlaHi sTrpGluPr oGluGlyHi sAs pGluLeuArg G1uAlaAsnArgTh rTh rGluArgMe tArgLeuSerSerProThrGlySerArgSerAlaThrlleLysSerVal
Pr oSe rLeuG1uAlaValAlaGluSe rVa1LeuArgG1uLeuLysGlyTh rAM OC ArgG1yAlaArgHi sPr o AlaVa1ProGlySerGlyGlyArgIIeArgThrProArgThrGluGlyAs pVaIVaILysArgCysProProPro
ArgAr gPr oT r pLy sArgTrpProAsnProTyrSerAlaAsnOP Ar gGlyAr gS e rLy sGluVaIPr oAlaTh r CGCCGTCCCTGGAAGCGGTGGCCGAATCCGTACTCCGCGAACTGAAGGGGACGTAGTAAAGAGGTGCCCGCCACC 225 GCGGCAGGGACCTTCGCCACCGGCTTAGGCATGAGGCGCTTGACTTCCCCTGCATCATTTCTCCACGGGCGGTGG AlaThrGlyProLeuProProArgl1eAr gVa1G1yAr gValSerProSerThrThr PheLeuHi sGlyGl yGly
ArgGlyGlnPheArgHisGlyPheGlyTyrGluAlaPheGlnLeuProArgLeuLeuSerThrGlyAlaValArg G1yAs pAr gSerAlaThrAIaSerAspThrSerArgSerSer Phe ProVaITyrTyrLeuProAlaArgTrpGly
LeuSe rG1nAsnTh rGluGlyAr gPr oHi sValSerProGluArgArgProVa1G1uI1eArgPr oAlaTh rAla AIaPheAlaG1uHi sAr gArgLysTh rTh rAr gGluProArgThrThrProGlyArgAs pPr oSe rArgH i sAr g
Ar gPheArgAr gThrProLysGluAs pHi sThrOP AlaGlnAsnAs pAlaAr gSe rArgSe rVa1ProProPro CGCTTTCGCAGAACACCGAGGAAGACCACACGTGAGCCCAGAACGACGCCCGGTCGAGATCCGTCCCGCCACCG 300 GCGAAAGCGTCTTGTGGCTTCCTTCTGGTGTGCACTCGGGTCTTGCTGCGGGCCAGCTCTAGGCAGGGCGGTGGC AlaLysAlaSerCysArgLeuPheValValArgSerGlyLeuVaIVa1G1yPr oAr gSe rGlyAs pArgT r pAr g
Ly sAr gLeuVaIGlyPheSerSerTr pValHí sAlaTrpPheSerAlaAr gAs pLeuAs pTh rGlyGlyG1yGly Se rG1uCy sPheValSerPr oLeuGlyCy sTh rLeuG1ySe rAr gArgGlyThrSerIleArgGIyAlaVa1Ala
HU 217 208 Β
I. DNS-szekvencia folytatása
A1aAs pMe tAlaAlaValCysAspIleVa1AsnHi sTyrlleGluThrSerThrValAsnPheArgThrGluPro Ar gAr gHi sG1yG1yG1yLeuArgHi sAr gGlnSe rLeuHi sArgAs pGluHi sGlyGlnLeuProTyrGlyAla
ProProThrTr pAr gAr gSe rA1aThrSerSerlleThrThrSerArgArgAlaArgSerThrSerValArgSer CCGCCGACATGGCGGCGGTCTGCGACATCGTCAATCACTACATCGAGACGAGCACGGTCAACTTCCGTACGGAGC 375 GGCGGCTGTACCGCCGCCAGACGCTGTAGCAGTTAGTGATGTAGCTCTGCTCGTGCCAGTTGAAGGCATGCCTCG ArgArgCysProProProArgArgCysAr gOP AspSerCysArgSerSerCy s Pr oOP SerGlyTyrProAla
GlyValHisArgArgAspAlaValAspAspIleValValAspLeuArgAlaAr gAspValGluThrArgLeuArg A1aSe rMe tAlaAlaThrGlnSe rMe tTh rLeuOP AM Me t Se rVa1LeuVa1Th rLeuLy sAr gVa1 Se rGly
GlnThrProGInGluTrpIleAspAspLeuGluArgLeuGInAspArgTyrProTrpLeuValAlaGluVaIG1u AlaAspSerAlaGlyValAspArgArgProGIyAlaProProGlyProLeuProLeuAlaAr gArgAr gGlyGIy
Ar gArgLeuAr gArgSerGlySerThrThrTrpSerAlaSerArgThrAlaThrProGlySerSerProArgTrp CGCAGACTCCGCAGGAGTGGATCGACGACCTGGAGCGCCTCCAGGACCGCTACCCCTGGCTCGTCGCCGAGGTGG 450 GCGTCTGAGGCGTCCTCACCTAGCTGCTGGACCTCGCGGAGGTCCTGGCGATGGGGACCGAGCAGCGGCTCCACC AlaSerGluAlaProThrSerArgArgGlyProAlaGlyGlyProGlySerGIyArgAlaAr gAr gArgProPro
LeuSerArgLeuLeuPr oAspVa1Va1G1nLeuAIaG1uLeuVa1A1aVa1G1yPr oGluAs pGlyLeuHi sLeu Cy sVa1GIyCysSerHi sI1eSerSerArgSe rArgAr gTr pSe rArgAM G1yGInSerThrAlaSerThrSer
G1yVaIValAlaGlylleAlaTyrAlaGlyProTr pLy sAlaArgAs nAlaTyrAspTr pTh rValGluSerThr G1yAr gAr gArgAr gHi sAr gLeuArgAr gPr oLeuGluGlyPr oGlnAr gLeuArgLeuAs pAr gAr gVa1As p
ArgAlaSerSerPr oAlaSerProThrPr oAla Pr oG1yAr gPr oAlaThrProThrThrGlyProSerSerArg AGGGCGTCGTCGCCGGCATCGCCTACGCCGGCCCCTGGAAGGCCCGCAACGCCTACGACTGGACCGTCGAGTCGA 525 TCCCGCAGCAGCGGCCGTAGCGGATGCGGCCGGGGACCTTCCGGGCGTTGCGGATGCTGACCTGGCAGCTCAGCT Pr oAr gArgAr gAr gCy sArgAr gAr gAr gGlyAr gSer Pr oG1yCy sArgAr gArgSerSerArgArgThrSer
AlaAs pAspG1yAlaAs pGlyVa1GIyAlaG1yPr oLeuGlyAlaVa1G1yVa1Va1Pr oG1yAs pLeuArgAr g ProThrThrAlaPr oMe tAIaAM A1aPr oG1yG1n Ph eAlaArgLeuAlaAM SerGlnVaIThrSe rAs pVa1
ValTyrVaI Se rHi sArgHi sGInArgLeuGlyLeuGlySerThrLeuTyrThrHi sLeuLeuLysSe rMe tGlu G1yValArgLeuProProAlaProAlaAlaAr gThrGlyLeuHi s Pr oLeuH i s Pr oPr oAlaGluValHi sGIy
ArgCysThrSerProThrGlyThrSerGlySerAspTrpAlaProProSerThrProThrCysOP SerProTrp CGGTGTACGTCTCCCACCGGCACCAGCGGCTCGGACTGGGCTCCACCCTCTACACCCACCTGCTGAAGTCCATGG 600 GCCACATGCAGAGGGTGGCCGTGGTCGCCGAGCCTGACCCGAGGTGGGAGATGTGGGTGGACGACTTCAGGTACC Pr oTh rArgAr gG1yGIyAlaGlyAlaAlaArgValProSerTrpGlyArgCysGlyGIyAlaSerThrTrpPro
HisValAspGlyValProValLeuProGluSerGlnAlaGlyGlyGluValGlyValGlnGlnLeuG1yHi sLeu ThrTyrThrGluTr pArgCy sTr pArgSerProSerProGluVa1ArgAM Va1Tr pArgSe r PheAspMe t Se r
AlaGlnGlyPheLysSerValValAlaValIleGlyLeuProAsnAspProSerValArgLeuHisGluAlaLeu G1yPr oGlyLeuGlnGluAr gG1yAr gArgHi sArgTh rAlaGlnArgPr oGluArgAla Pr oAlaAr gGlyAla
ArgPr oArgAlaSerArgAlaTrpSerProSerSerAs pCy sProThrThrAr gAlaCy sAlaCysThrArgArg AGGCCCAGGGCTTCAAGAGCGTGGTCGCCGTCATCGGACTGCCCAACGACCCGAGCGTGCGCCTGCACGAGGCGC 675 TCCGGGTCCCGAAGTTCTCGCACCAGCGGCAGTAGCCTGACGGGTTGCTGGGCTCGCACGCGGACGTGCTCCGCG ProGlyProSe rOP SerArgProArgAr gOP ArgValAlaTrpArgGlySerArgAlaGlyAlaArgProAla
G1yLeuAlaGluLeuAlaHi sAspGlyAspAspSerGlnGlyVaIValArgAlaHi sAlaGlnVa1LeuArgGlu AlaTrpProLysLeuLeuThrThrAIaTh rMe tProSerGlyLeuSerGlyLeuTh rArgAr gCysSerAlaSer
GlyTyrThrAlaArgGlyThrLeuAr gAlaAlaGlyTyrLysHisGlyGlyTrpHisAspValGlyPheTrpGln Ar gIIeHi sArgAlaAr gAs pAlaAlaGlySerArgLeuGlnAlaArgGIyLeuAlaArgAr gG1yVa1LeuAla
SerAspThrProArgAlaGlyArgCysGlyGlnProAlaThrSerThrGlyAlaGlyThrThrTrpGlySerGly TCGGATACACCGCGCGCGGGACGCTGCGGGCAGCCGGCTACAAGCACGGGGGCTGGCACGACGTGGGGTTCTGGC 750 AGCCTATGTGGCGCGCGCCCTGCGACGCCCGTCGGCCGATGTTCGTGCCCCCGACCGTGCTGCACCCCAAGACCG ArglleCysArgAlaArgSerAlaAlaPr oLeuAr gSe rCy sAlaArgPr oSe rAlaArgAr gPr oTh rArgAla
Se rVa1G1yAr gAlaPr oArgGlnPr oCy sG1yAlaVa1LeuVa1Pr oAla Pr oVa1ValHi s Pr oGluPr oLeu ProTyrValAlaArgProVa1SerArgAlaAlaPr oAM LeuCy sProProGlnCysSerThrPr oAsnGInCy s
ArgAs pPheGluLeuProAlaPr oPr oAr gPr oValArgProValThrGlnlle AlaAr gLeuArgAlaAlaGlyProAlaProProArgProAlaAr gH i sTh rAs p
SerAlaThrSerSerCysArgProArgProAlaProSerGlyProSerHisArgSer
AGCGCGACTTCGAGCTGCCGGCCCCGCCCCGCCCCGTCCGGCCCGTCACACAGATCT 807
HU 217 208 Β
I. DNS-szekvencia folytatása
TCGCGCTGAAGCTCGACGGCCGGGGCGGGGCGGGGCAGGCCGGGCAGTGTGTCTAGA AlaAr gSe rAr gAlaAlaPr oGlyAlaGlyGlyAr gGlyAlaArgOP ValSerArg
AlaVa1G1uLeuG1nAr gGlyArgG1yAlaGlyAs pPr oG1yAspCy sLeuAsp ArgSerLysSerSerGlyAlaGlyGlyArgGlyTh rAr gGlyTh rValCysIle
II. DNS-szekvencia
AGATCTGGAGCGACGTCCTGGGGGCCGGTCCGGTGCTGCCCGGGGACGACTTCTTCTCCC TCTAGACCTCGCTGCAGGACCCCCGGCCAGGCCACGACGGGCCCCTGCTGAAGAAGAGGG
ΛΑ Λ ΛΛ A AA A AA A A
BGLII XHOII, 2 DPNI SAU3A, 5 GSUI, 12 AATII ACYI, 13 MAEII 17 APYI ECORII, 26 RSRII, 27 AVAII, 35 BBVI, 39 AVAI NCII SMAI, 40 NCII, 52MBDII, 59 MNLI,
TCGGCGGCACCTCCATCTCGGCGTTGCGGGTGGTCTCGCGCATCCGCAAGGAACTCGGCG AGCCGCCGTGGAGGTAGAGCCGCAACGCCCACCAGAGCGCGTAGGCGTTCCTTGAGCCGC
A A A A A
HGICI, 70 MNLI, 97 FNUDII, 100 SFANI, 101 FOKI,
2 1 TGCCACTCCGGCTCGCCGTGATCTTCGAGACGCCGTCCCTGGAAGCGGTGGCCGAATCCG
ACGGTGAGGCCGAGCGGCACTAGAAGCTCTGCGGCAGGGACCTTCGCCACCGGCTTAGGC
A ΛΛΛ Λ Λ Λ Λ
122 BGLI, 140 DPNI SAU3A, 142 ΜΒΟΙI, 149 ACYI HGAI ΤΤΗ111I, 158 APYI ECORII, 169 CFRI GDIII, 174 HINFI, 180 RSAI,
8 1 TACTCCGCGAACTGAAGGGGACGTAGTAAAGAGGTGCCCGCCACCCGCTTTCGCAGAACA ATGAGGCGCTTGACTTCCCCTGCATCATTTCTCCACGGGCGGTGGGCGAAAGCGTCTTGT
Λ A Λ Α Λ
186 FNUDII, 201 ΜΑΕΙΙ, 211 MNLI , 213 HGICI, 214 SDUI,
241 CCGAAGGAAGACCACACGTGAGCCCAGAACGACGCCCGGTCGAGATCCGTCCCGCCACCG
GGCTTCCTTCTGGTGTGCACTCGGGTCTTGCTGCGGGCCAGCTCTAGGCAGGGCGGTGGC
247ΜΒΟΙΙ, 254 AFLIII, 255 PMACI, 256 ΜΑΕΙΙ, 260HGIJII SDUI , 271 ACYI HGAI, 275 NCII, 283 ΧΗΟΙI, 284 ΒΙΝΙ DPNI SAU3A,
0 1 CCGCCGACATGGCGGCGGTCTGCGACATCGTCAATCACTACATCGAGACGAGCACGGTCA GGCGGCTGTACCGCCGCCAGACGCTGTAGCAGTTAGTGATGTAGCTCTGCTCGTGCCAGT
Λ Λ Λ Λ Λ
303 BGLI, 308 NLAIII, 3Ζ4 ΤΤΗ111I, 350 HGIAI SDUI, 357 HINCII
61 ACTTCCGTACGGAGCCGCAGACTCCGCAGGAGTGGATCGACGACCTGGAGCGCCTCCAGG
TGAAGGCATGCCTCGGCGTCTGAGGCGTCCTCACCTAGCTGCTGGACCTCGCGGAGGTCC
A A ΑΑ ΛΑΛΑΑΛΑ
367 RSAI, 380 HINFI, 394 ΒΙΝΙ, 395 DPNI SAU3A, 404 APYI ECOR II, 405 GSUI, 409 ΗΑΕΙΙ, 413 MNLI, 414 GSUI, 416 APYI ECORII 419 AVAII,
421 ACCGCTACCCCTGGCTCGTCGCCGAGGTGGAGGGCGTCGTCGCCGGCATCGCCTACGCCG TGGCGATGGGGACCGAGCAGCGGCTCCACCTCCCGCAGCAGCGGCCGTAGCGGATGCGGC
A A A A A AA A
430 APYI ECORII, 444 MNLI, 450 MNLI, 453 ACYI, 454 HGAI, 462 NAEI, 466 SFANI, 477 NAEI,
8 1 GCCCCTGGAAGGCCCGCAACGCCTACGACTGGACCGTCGAGTCGACGGTGTACGTCTCCC
CGGGGACCTTCCGGGCGTTGCGGATGCTGACCTGGCAGCTCAGCTGCCACATGCAGAGGG
A A A A A A
484 APYI ECORII, 511 AVAII, 519 HINFI, 521 ACCI HINCII SÁLI, 530 RSAI, 532 MAEII,
4 1 ACCGGCACCAGCGGCTCGGACTGGGCTCCACCCTCTACACCCACCTGCTGAAGTCC
TGGCCGTGGTCGCCGAGCCTGACCCGAGGTGGGAGATGTGGGTGGACGACTTCAGGT
AA A A A A AA
544 HGICI, 549 NSPBII, 563 HGIJII SDUI, 572 MNLI, 578 TAQII, 583 BSPMI , 595 NCOI STYI, 596 NLAIII, 600 MNLI,
HU 217 208 Β
601 AGGCCCAGGGCTTCAAGAGCGTGGTCGCCGTCATCGGACTGCCCAACGACCCGAGCGTGC TCCGGGTCCCGAAGTTCTCGCACCAGCGGCAGTAGCCTGACGGGTTGCTGGGCTCGCACG
A Λ
605 APYI ECORII, 650 AVAI,
661 GCCTGCACGAGGCGCTCGGATACACCGCGCGCGGGACGCTGCGGGCAGCCGGCTACAAGC CGGACGTGCTCCGCGAGCCTATGTGGCGCGCGCCCTGCGACGCCCGTCGGCCGATGTTCG
Λ A ΛΑΑ ΑΛΑ Λ Λ A
669MNLI, 671 HAEII, 686 FNUDII, 687BSSHII, 688 FNUDII, 690 FNUDII, 695 HGAI, 698 BBVI, 705 BBVI, 708 NAEI, 716 TTH111I I,
721 ACGGGGGCTGGCACGACGTGGGGTTCTGGCAGCGCGACTTCGAGCTGCCGGCCCCGCCCC TGCCCCCGACCGTGCTGCACCCCAAGACCGTCGCGCTGAAGCTCGACGGCCGGGGCGGGG
Λ Λ Λ Λ Α Λ Λ
732 DRAIII, 736 MAE 1 1, 749 BBVI, 753 FNUDII, 763 ALUI, 764 Β BVI, 767 NAEI,
781 GCCCCGTCCGGCCCGTCACACAGATCT CGGGGCAGGCCGGGCAGTGTGTCTAGA
Λ Λ Λ
795 ΜΑΕΙΙΙ, 802 BGLII ΧΗΟΙΙ, 803 DPNI SAU3A

Claims (9)

1. Eljárás foszfinotricin (PTC) rezisztenciagén előállítására, azzal jellemezve, hogy a DSM 4112 jelű Streptomyces viridochromogenes törzset foszfinotricilalanil-alanin jelenlétében tenyésztjük, a foszfinotricilalanil-alaninnal (PTT-vel) szemben rezisztens telepeket szelektáljuk, a rezisztens baktériumok össz-DNS-ét BamHI restrikciós enzimmel elhasítjuk, egy 4,0 kb méretű fragmenst klónozunk, majd a gazdasejt PTT-rezisztenciája alapján szelektálunk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1. ábra szerinti restrikciós térképű DNS-fragmenst klónozzuk.
3. Eljárás PTC-rezisztens növények előállítására, azzal jellemezve, hogy a növényben 1. vagy 2. igénypont szerint előállított gént expresszáltatunk.
4. Eljárás PTT-rezisztencia markerként történő alkalmazására baktériumokban, azzal jellemezve, hogy markergénként 1. vagy 2. igénypont szerint előállított gént alkalmazunk.
5. Eljárás PTC-rezisztencia markerként történő alkalmazására növényi sejtekben, azzal jellemezve, hogy markergénként 1. vagy 2. igénypont szerint előállított gént alkalmazunk.
6. Eljárás az I. DNS-szekvenciát - a 258. pozíciótól
25 kezdve - tartalmazó foszfinotricin (PTC) rezisztenciagén előállítására, azzal jellemezve, hogy a gént az 1. igénypont szerinti eljárással megklónozzuk, enzimatikus és/vagy szintetikus úton előállítjuk.
7. Eljárás PTC-rezisztens növények előállítására,
30 azzal jellemezve, hogy a növényben a 6. igénypont szerint előállított gént expresszáltatunk.
8. Eljárás PTT-rezisztencia markerként történő alkalmazására baktériumokban, azzal jellemezve, hogy markergénként a 6. igénypont szerint előállított gént
35 alkalmazunk.
9. Eljárás PTC-rezisztencia markerként történő alkalmazására növényi sejtekben, azzal jellemezve, hogy markergénként a 6. igénypont szerint előállított gént alkalmazunk.
40 10. Eljárás racém PTC L-formájának szelektív Nacetilezésére, azzal jellemezve, hogy a PTC racemátját az 1., 2. vagy 6. igénypontok bármelyike szerint előállított gén expresszálásával előállított PTC-acetil-transzferáz enzim hatásának tesszük ki.
HU727/87A 1986-08-23 1987-08-23 Eljárás foszfinotricinnel szemben rezisztens gén előállítása HU217208B (hu)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19863628747 DE3628747A1 (de) 1986-08-23 1986-08-23 Resistenzgen gegen phosphinothricin und seine verwendung
DE3637307 1986-11-03
DE19863642829 DE3642829A1 (de) 1986-08-23 1986-12-16 Resistenzgen gegen phosphinothricin
DE19873700313 DE3700313A1 (de) 1986-08-23 1987-01-08 Verwendung eines resistenzgens gegen phosphinothricin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT44621A HUT44621A (en) 1988-03-28
HU217208B true HU217208B (hu) 1999-12-28

Family

ID=27433686

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU727/87A HU217208B (hu) 1986-08-23 1987-08-23 Eljárás foszfinotricinnel szemben rezisztens gén előállítása

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP0257542B1 (hu)
JP (4) JPH0797994B2 (hu)
CN (2) CN1040772C (hu)
AT (1) ATE75776T1 (hu)
AU (1) AU604743B2 (hu)
CA (1) CA1337597C (hu)
DK (1) DK175254B1 (hu)
ES (1) ES2038631T3 (hu)
FI (1) FI100251B (hu)
GR (1) GR3005200T3 (hu)
HU (1) HU217208B (hu)
IL (1) IL83604A (hu)
NZ (1) NZ221526A (hu)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3765449D1 (de) * 1986-03-11 1990-11-15 Plant Genetic Systems Nv Durch gentechnologie erhaltene und gegen glutaminsynthetase-inhibitoren resistente pflanzenzellen.
CN87100603A (zh) * 1987-01-21 1988-08-10 昂科公司 抗黑素瘤疫苗
DE3716309A1 (de) * 1987-05-15 1988-11-24 Hoechst Ag Resistenzgen gegen phosphinothricin
DE3732972A1 (de) * 1987-07-02 1989-01-12 Hoechst Ag Resistenzgen gegen phosphinothricin und seine verwendung
DE4126414A1 (de) * 1991-08-09 1993-02-11 Hoechst Ag Deacetylasegene zur erzeugung von phosphinothricin oder phosphinothricyl-alanyl-alanin, verfahren zu ihrer isolierung und ihre verwendung
DE4222407C1 (de) * 1992-07-08 1993-10-07 Max Planck Gesellschaft Modulartiges Promotor-Konstrukt
US6586367B2 (en) 1996-09-05 2003-07-01 Syngenta Crop Protection, Inc. Process for the control of weeds
AR008158A1 (es) * 1996-09-05 1999-12-09 Syngenta Participations Ag Proceso para el control de malas hierbas en cultivos de plantas utiles que son resistentes a un fosfo-herbicida y una composicion herbicida para dicho uso.
DE19836684A1 (de) 1998-08-13 2000-02-17 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Herbizide Mittel für tolerante oder resistente Reiskulturen
DE19836700A1 (de) 1998-08-13 2000-02-17 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Herbizide Mittel für tolerante oder resistente Getreidekulturen
DE19836659A1 (de) 1998-08-13 2000-02-17 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Herbizide Mittel für tolerante oder resistente Baumwollkulturen
DE19836660A1 (de) 1998-08-13 2000-02-17 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Herbizide Mittel für tolerante oder resistente Sojakulturen
PL218413B1 (pl) 1998-08-13 2014-12-31 Bayer Cropscience Ag Zastosowanie kompozycji zawierającej glifosat oraz chlopyralid do zwalczania szkodliwych roślin w uprawach kukurydzy oraz sposób zwalczania szkodliwych roślin w tolerujących uprawach kukurydzy
CA2475485C (en) 2002-02-26 2012-08-28 Syngenta Limited A method of selectively producing male or female sterile plants
CA2586241C (en) 2004-11-17 2013-07-30 Hokko Chemical Industry Co., Ltd. Herbicide-resistance gene and utilization thereof
KR100743611B1 (ko) * 2006-03-28 2007-08-01 최광술 산업용 로봇의 케이블 조절장치
AR074941A1 (es) 2009-01-07 2011-02-23 Bayer Cropscience Sa Plantas transplastomicas exentas de marcador de seleccion
CN102869769A (zh) 2009-12-23 2013-01-09 拜尔知识产权有限公司 耐受hppd抑制剂型除草剂的植物
EP2516630B1 (en) 2009-12-23 2017-11-15 Bayer Intellectual Property GmbH Plants tolerant to hppd inhibitor herbicides
EP2516631B1 (en) 2009-12-23 2018-02-14 Bayer Intellectual Property GmbH Plants tolerant to hppd inhibitor herbicides
BR112012015697A2 (pt) 2009-12-23 2015-08-25 Bayer Intelectual Property Gmbh Plantas tolerantes a herbicidas inibidores de hppd.
WO2011076889A1 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Bayer Cropscience Ag Plants tolerant to hppd inhibitor herbicides
WO2011144684A1 (de) 2010-05-21 2011-11-24 Bayer Cropscience Ag Herbizide mittel für tolerante oder resistente reiskulturen
WO2011144683A1 (de) 2010-05-21 2011-11-24 Bayer Cropscience Ag Herbizide mittel für tolerante oder resistente rapskulturen
BR112012029616A2 (pt) 2010-05-21 2015-10-20 Bayer Ip Gmbh agentes herbicidas para as culturas de cereais tolerantes ou resistentes
BR112012029621A2 (pt) 2010-05-21 2015-09-22 Bayer Ip Gmbh agentes herbicidas para as culturas de milho tolerantes ou resistentes
WO2012004013A2 (en) 2010-07-08 2012-01-12 Bayer Bioscience N.V. Glucosinolate transporter protein and uses thereof
US20140090102A1 (en) 2011-01-24 2014-03-27 Stéphane Pien Use of the rd29 promoter or fragments thereof for stress-inducible expression of transgenes in cotton
EP2524602A1 (de) 2011-05-20 2012-11-21 Bayer CropScience AG Herbizide Mittel für tolerante oder resistente Sojakulturen
UA117816C2 (uk) 2012-11-06 2018-10-10 Байєр Кропсайєнс Акцієнгезелльшафт Гербіцидна комбінація для толерантних соєвих культур
DE202014101590U1 (de) 2014-04-03 2014-04-29 Igus Gmbh Führungssystem für Versorgungsleitungen und Roboter mit Führungssystem

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3765449D1 (de) * 1986-03-11 1990-11-15 Plant Genetic Systems Nv Durch gentechnologie erhaltene und gegen glutaminsynthetase-inhibitoren resistente pflanzenzellen.

Also Published As

Publication number Publication date
DK437887A (da) 1988-02-24
JPS6371183A (ja) 1988-03-31
CN1225393A (zh) 1999-08-11
FI873610A0 (fi) 1987-08-20
EP0257542A2 (de) 1988-03-02
JPH03103193A (ja) 1991-04-30
IL83604A (en) 2004-02-19
CN1040772C (zh) 1998-11-18
CA1337597C (en) 1995-11-21
JP2749424B2 (ja) 1998-05-13
CN1124347C (zh) 2003-10-15
JPH0797994B2 (ja) 1995-10-25
FI100251B (fi) 1997-10-31
AU604743B2 (en) 1991-01-03
NZ221526A (en) 1989-03-29
AU7731887A (en) 1988-05-19
IL83604A0 (en) 1988-01-31
HUT44621A (en) 1988-03-28
FI873610A (fi) 1988-02-24
JPH07147985A (ja) 1995-06-13
EP0257542B1 (de) 1992-05-06
DK175254B1 (da) 2004-07-26
CN87105764A (zh) 1988-11-30
JP2815847B2 (ja) 1998-10-27
GR3005200T3 (hu) 1993-05-24
JPH09107981A (ja) 1997-04-28
ATE75776T1 (de) 1992-05-15
ES2038631T3 (es) 1993-08-01
EP0257542A3 (en) 1990-03-07
DK437887D0 (da) 1987-08-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU217208B (hu) Eljárás foszfinotricinnel szemben rezisztens gén előállítása
US5273894A (en) Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US5637489A (en) Phosphinothricin-resistance gene, and its use
CA2679532C (en) Transformed strains originated from multidrug efflux protein defective strains and a method for microbial conversion using them
JPH10229885A (ja) 新規アルコールアルデヒド脱水素酵素
ITMI951764A1 (it) Peptide sintetasi ingegnerizzate e loro impiego per la produzione via non-ribosomale di peptidi
US5352599A (en) Co-enzyme-independent L-sorbosone dehydrogenase of gluconobacter oxydans: isolation, characterization, and cloning and autologus expression of the gene
JP4251554B2 (ja) 大腸菌における放線菌由来チトクロームｐ−４５０遺伝子の発現系
FI117674B (fi) Polypeptidit, jotka liittyvät streptogramiinien biosynteesiin, näitä polypeptidejä koodittavat nukleotidisekvenssit, ja niiden käyttö
CA2183632A1 (en) Process for producing 2-keto-l-gulonic acid
Arisawa et al. Direct fermentative production of acyltylosins by genetically-engineered strains of Streptomyces fradiae
US5068189A (en) Recombinant dna vectors encoding a 4"-o-isovaleryl acylase derived from a carbomycin biosynthetic gene, designated care, for use in streptomyces and other organisms
AU636500B2 (en) Cloning and overexpression of glucose-6-phosphate dehydrogenase from leuconostoc dextranicus
HU216653B (hu) Eljárás kobalaminok és/vagy kobamidok bioszintézisében részt vevő polipeptidek rekombináns úton történő előállítására
AU783603B2 (en) Transformant producing secondary metabolite modified with functional group and novel biosynthesis genes
CN116670295A (zh) 用于在抑制香草酸形成的情况下产生香草醛的拟无枝酸菌属菌株
KR100209842B1 (ko) 스트렙토마이세스 아베르미틸리스에서 단리된, 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈 복합체를 암호화하는 유전자
KR20020022045A (ko) 유게놀 및 페룰라산 분해대사의 유전자를 특이적으로불활성화함으로써 치환된 페놀을 생성하기 위한 생산균주의 구축
HU215231B (hu) Géntechnológiai eljárás S-(+)-2,2-dimetil-ciklopropán-karboxamid előállítására mikroorganizmusok segítségével
US6361987B1 (en) Gene encoding a protein having asymmetric hydrolase activity for 4-substituted 1,4-dihydropyridine derivatives and its expression product
US5202427A (en) DNA segment containing streptomycin resistance gene and being capable of controlling expression of said gene
JPH099982A (ja) Ｌ−含硫アミノ酸の製造法
Pageni et al. Characterization of a chalcosyltransferase (gerGTII) in dihydrochalcomycin biosynthesis
JP2004089156A (ja) ビセニスタチン合成酵素遺伝子クラスター、ビセニサミン糖転移酵素ポリペプチドおよび当該ポリペプチドをコードする遺伝子
JPH0523187A (ja) カスガマイシンアセチル化酵素遺伝子とそれを含有するｄｎａ断片