KR100209842B1 - 스트렙토마이세스 아베르미틸리스에서 단리된, 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈 복합체를 암호화하는 유전자 - Google Patents

스트렙토마이세스 아베르미틸리스에서 단리된, 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈 복합체를 암호화하는 유전자 Download PDF

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클라우디오 다니엘 데노야
김 죠넬 스튜츠만-엥갈
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디. 제이. 우드, 스피겔 알렌 제이
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Abstract

본 발명은 스트렙토마이세스 속에 속하는 미생물의 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈 복합체를 암호화하는 신규한 DNA 서열, 및 상기 서열을 발현시켜 생산되는 신규한 폴리펩타이드에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 천연 아베르멕틴의 생산 증가 방법, 스트렙토마이세스 아베르 미틸리스 bkd 돌연변이체 생산 방법, 및 발효를 통한 신규 아베르멕틴의 제조방법에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]
스트렙토마이세스 아베르미틸리스에서 단리된, 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈 복합체를 암호화하는 유전자
[발명의 상세한 설명]
[발명의 배경]
본 발명은 스트렙토마이세스(Streptomyces)속에 속하는 미생물의 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈(Branched-Chainalpha-Ketoacid DeHydrogenase; BCKDH) 복합체를 암호화하는 신규한 DNA 서열에 관한 것이다. 또한, 유전 공학 기술에 의해 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈(bkd)가 결핍된 돌연변이체인 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis; 이하, 에스. 아베르미틸리스로 약칭하기도 함)의 생산에 관한 것이다. bkd가 결핍된 돌연변이체는 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈 활성이 없고 신규한 (천연이 아닌) 아베르멕틴(avermectin)의 발효 생산에 유용하다.
에스. 아베르미틸리스는 아베르멕틴이라 명명된 여덟개의 분별가능하지만 밀접하게 연관된 구충제인 풀리케티드 화합물을 천연적으로 생산한다. 에스. 아베르미틸리스에 의해 생성되는 아베르멕틴 복합체는 4개의 주요 성분, Ala, A2a, Bla 및 B2a를 갖고, 4개의 부수 성분, A1b, A2b, B1b 및 B2b 를 갖는다. 다양한 이들 성분의 구조를 하기에 도시한다.
아베르멕틴 폴리케티드 구조는 7개의 아세테이트, 5개의 프로피오네이트 분자, 및 1개의 알파-분지쇄 지방산 분자로부터 유도되고, 이는 S(+)-2-메틸부티르산 또는 이소부티르산이다. 아베르멕틴에 대한 A 또는 B의 명명은 5-치환체(OR2)가 각각 메톡시 또는 하이드록시 임을 의미한다. 1은 22 내지 23의 위치에 이중 결합이 있는 아베르멕틴을 의미하고, 2는 22 위치에 수소를 갖고 23 위치에 하이드록시를 갖는 아베르멕틴을 의미한다. 마지막으로, C-25(R1)는 2개의 가능한 치환체를 갖는데, 2차-부틸 치환체(S(+)-2-메틸부티르산을 혼입시켜 유도된다)는 아베르멕틴 a 시리즈에 존재하고, 이소프로필 치환체(이소부티르산을 혼입시켜 유도된다)는 아베르멕틴 b 시리즈에 존재한다(피셔(Fisher, M. H.) 및 모지크(Mrozik, H.)의 문헌[1984, Macrolide Antibiotics, Academic Press, 14장]참조).
천연 아베르멕틴은 25-위치의 치환체가 상기 언급한 바와 같이 이소프로필 또는 2차-부틸인 에스. 아베르미틸리스에서 생성되는 아베르멕틴을 의미한다. 25-위치의 기가 이소프로필 또는 2차-부틸이 아닌 아베르멕틴은 본원에서는 신규 또는 천연이 아닌 아베르멕틴으로 명명된다.
CoA 형태인 천연 알파-분지쇄 지방산으로의 한가지 대사 경로는 알파-분지쇄 아미노산인 이소루신 및 발린으로부터의 분지쇄 아미노산 트랜스아미네이즈 반응 및 이어서 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈 반응이다. (다르게는, 신규 합성에 의해 생성되는 분지쇄 알파-케토산으로부터 분지쇄 지방 아실-CoA 유도체가 유도될 수 있다). 이들 대사 경로는 다음에 도시한 바와 같다.
마지막으로 언급된 효소인 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈(BCKDH) 활성이 없는 에스. 아베르미틸리스의 돌연변이체는 이미 단리되어 있었다(1988년, 하프너(Hafner)등, 유럽특허 제 284,176 호, 1993년 10월 20일자로 허여됨). 상기 돌연변이체는14C-1 표지된 2-옥소이소카프르산 기질(루신 유사체)로부터14CO2를 생성시키지 않는 스크린 탐색으로 에스. 아베르미틸리스 균주 ATCC 31272의 표준 화학적 돌연변이에 따라 단리되었다. 상기 돌연변이체는, 이 돌연변이체가 배양되는 배지에 S(+)-2-메틸부티르산 또는 이소부티르산, 또는 이소프로필 또는 2차-부틸(S-형) 기를 갖는 전구체가 첨가되었을때를 제외하고는, 천연 아베르멕틴을 합성할 수 없다. 또한, 상기 돌연변이체는 상기 도시된 바와 같이 외부에서 첨가된 다른 카복실산, 예컨대 사이클로헥산 카복실산(CHC) 또는 그의 전구체를 함유한 영양 배지에서 수성 호기성 조건하에 배양되는 경우에는 신규한 (천연이 아닌) 아베르멕틴을 생성할 수 있다.
에스. 아베르미틸리스의 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈 복합체를 암호화하는 유전자를 클로닝하는 것은 매우 바람직하다. 재조합 DNA 기술에 의해 상기 유전자를 조작함으로써 천연 및 신규 아베르멕틴을 용이하게 생산할 수 있다. 특정 균주에서는, bkd 유전자의 복제(copy) 수를 증가시킴으로써 천연 아베르멕틴의 역가가 증가할 것이 예상된다. 또한, 유전자 치환에 의해 BCKDH 활성을 영구적으로 파괴 또는 변형시킨 비가역적으로 차단된 bkd 균주의 생성은 화학적 돌연변이에 의해 상기 언급된 바와 같이 수득된 bkd 돌연변이체의 개선된 대안이 될 것이다.
알파-케토산 데하이드로지네이즈 다중효소 복합체, 즉 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈(BCKDH) 복합체, 피루베이트 데하이드로지네이즈(PDH) 복합체 및 알파-케토글루타레이트 데하이드로지네이즈(KGDH) 복합체는 각각 분지쇄 알파-케토산, 피루베이트 및 알파-케토글루타레이트의 산화적 탈카복실화를 촉매하여 CO2를 유리시키고 상응하는 아실-CoA 및 NADH를 생성시킨다(퍼함(Perham, R. N.)의 문헌[1991, Biochemistry, 30:8501-8512]). 각각의 복합체는 세개의 상이한 촉매 효소로 구성된다: 데카복실레이즈(E1), 디하이드로리포아미드 아실 트랜스퍼레이즈 트랜스아실레이즈(E2) 및 디하이드로리포아미드 데하이드로지네이즈(E3).
분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈(BCKDH)는 3개의 작용 성분, 즉 E1, 데카복실레이즈, E2, 트랜스아실레이즈 및 E3, 리포아미드 데하이드로지네이즈로 구성된 다중효소 복합체이다. 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas Putida), 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtlis; 이하, 비. 섭틸리스라고 약칭하기도 함)로부터 정제된 복합체는 4개의 폴리펩티드로 구성된다. 정제된 포유동물의 복합체는 또한 E1 알파, E1베타, E2 및 E3의 4개의 폴리펩티드로 구성된다. 알파-케토산 데하이드로지네이즈 복합체는 피루베이트 및 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈 활성 둘 모두를 갖는 바실러스 섭틸리스로부터 단리되었다. 상기 이중 작용을 하는 복합체는 막의 인지질에 대해 피루베이트 및 분지쇄 알파-케토산 둘 모두를 산화시킨다.
원핵성 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈 유전자의 클로닝은 슈도모나스 및 바실러스에 대해 보고되었다. 이들 시스템에서, BCKDH를 암호화하는 유전자는 하나의 오페론에 군집되어 있었다. 슈도모나스 푸티다의 BCKDH 복합체의 유전자는 클로닝되었고 이 영역의 뉴클레오티드 서열이 결정되었다(시케스(Sykes) 등의 문헌[1987, J. Bacterio1., 169:1619-1625] 및 번스(Burns) 등의 문헌[1988, Eur J. Biochem., 176:165-169 및 176:311-317]). E1알파의 분자량은 45289이고, E1베타는 37138, E2는 45134이고 E3는 48164이다. 4개의 유전자는 E1 알파, E1베타, E2 및 E3의 순서로 군집되어 있다. 노던 블럿 분석에 의하면, 이들 4개의 유전자의 발현은 단일 mRNA에서 일어나고 이들 유전자들은 하나의 오페론을 구성한다. 전형적인 원핵성 컨센서스(consensus) 프로모터는 슈도모나스 bkd 유전자가 항상 발현되게 하는 E1알파 암호화 영역의 출발점의 바로 앞부분에 있다. E1베타 암호화 영역에 대한 개시 코돈은 E1알파의 개방 판독 프레임(open reading frame)(ORF)의 말단으로부터 단지 40개의 뉴클레오티드 하향에 위치한다. 반대로 E1 베타 ORF에 대한 정지 코돈은 E2 ORF의 개시 코돈의 바로 앞쪽에 있으므로, E1베타와 E2 ORF 사이에는 유전자간의 공간이 없다. E2 및 E3 ORF 간의 유전자간의 공간은 단지 2개의 뉴클레오티드로 감소된다. 따라서, 슈도모나스의 bkd 유전자는 밀접하게 연결되어 있다.
유사하게, 바실러스 섭틸리스 BCKDH/PDH 이중 복합체를 암호화하는 오페론이 클로닝되었다(허밀라(Hermila) 등의 문헌[1990, J. Bacteriol.,172:5052-5063]). 상기 오페론은 크기가 42,36,48 및 50 킬로달톤(kDa)인 4개의 단백질을 암호화하는 4개의 ORF를 함유하고, 슈도모나스 bkd 군집의 E1 알파, E1베타, E2 및 E3 서브유니트(subunit)와 매우 유사함을 나타내었다. 바실러스 스테아로써모필루스(Bacillus Stearothermophilus)로부터 이중 BCKDH/PDH 다중 효소 복합체의 E1 성분의 알파 및 베타 서브유니트를 암호화하는 유전자를 또한 클로닝하고 서열을 밝혔다(알파 및 베타 서브유니트의 추정되는 분자량은 각각 약 41,000 및 35,000이다)(호킨스(Hawkins)등의 문헌[1990, Eur. J. Biochem.,191:337-346]).
또한, 다수의 진핵성 E1 알파 및 베타 BCKDH 서브유니트(인간, 소 및 래트)의 서열을 개시하였다. 최근에 여러 종류에서의 PDH 및 BCKDH 복합체의 E1 알파 E1 베타 성분 둘 모두에 대해 공지된 모든 발표된 서열의 아미노산 서열을 컴퓨터 분석에 의해 비교하였다(웨슬러(Wexler 등의 문헌[1991, FEBS Letters, 282:209-213]). 흥미롭게도, 알파 및 베타 서브유니트의 여러 영역이 이제까지 개시된 모든 PDH에서뿐만 아니라 원핵 및 진핵성 BCKDH 복합체 둘다에서 매우 보존되어 있음이 밝혀졌다.
또한, 최근에는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스로부터 E1 성분의 알파(bkdA) 및 베타(bkdB) 서브유니트, 및 BCKDH 복합체의 E2(bkdC) 성분을 각각 암호화하는 3개의 유전자를 클로닝하고 서열을 밝히고 이종의 유전자 발현 시스템을 이용하여 분석하였다(데노야(Denoya, C.D.) 의 문헌[1993, Cloned genes encoding branched-chain alpha-ketoacid dehydrogenase complex from Streptomyces avermitilis, 1993년 7월 30일자로 출원된 미합중국 특허원 제 08/100,518 호). DNA 서열 분석에 의하면, 모의의 전사 프로모터 서열이 존재하고 bkd의 구조 유전자가 다음과 같이 조직된 군집으로 정렬되어 있다. 프로모터 서열, E1-알파(bkdA), E1-베타(bkdB) 및 E2(bkdC) 개방 판독 프레임. 또한, 완전한 에스. 아베르미틸리스 bkdABC 유전자 군집을 강한 에스케리치아 콜리(Escherichia coli; 이하 이. 콜라이로 약칭하기도 함) T7 프로모터의 하류에서 클로닝하여 이. 콜라이 숙주에서 발현시켰다. 유사하게, E1알파 및 E1베타 개방 판독 프레임(ORF)도 T7 프로모터의 하류에서 개별적으로 또는 함께 클로닝하여 각각의 구축물이 발현되는지 시험하였다. 이러한 연구는 에스. 아베르미틸리스 bkd 유전자 군집(E1-알파[bkdA] 및 E1-베타[bkdB])의 2개이상의 개방 판독 프레임이 이. 콜라이에서 발현시켰을때 완전히 해독됨을 나타내었다. 또한, BCKDH 복합체의 E1 성분을 구체적으로 분석하기 위해 효소적으로 분석한 결과, 2개의 제조합 이. 콜라이 클론이 하나는 전체 bkd 유전자 군집을 갖고 다른 하나는 E1-알파 및 E1-베타 ORF를 함께 가지고, E1 BCKDH-특이적 효소활성을 함유함을 결론적으로 확인하였다.
본 발명은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈(BCKDH)를 암호화하는 신규한 유전자의 제2군집의 분자 클로닝 및 분석에 관한 것이다. 이 군집은 각각 에스. 아베르미틸리스 BCKDH 복합체의 E1-알파, E1-베타 및 E2 서브유니트를 암호화하는 적어도 3개의 유전자(bkdF, bkdG, bkdH) 를 함유한다.
본원에서 개시된 bkd 유전자 군집은 최근에 보고된(데노야의 문헌[1993, 1993년 7월 30일자로 출원된 미합중국 특허원 제 08/100,518 호]) 첫번째 bkd 군집(bkdA, bkdB 및 bkdC 유전자)의 약 12 킬로베이스 하부에 위치한다. 두 군집 모두 유사한 유전자 구성을 공유하고 이들은 에스. 아베르미틸리스 염색체상에서 동일한 방향으로 배향한다. 두가지 군집에서 상응하는 구조 유전자는 매우 동일하지만 상이하다.
또한, 본 발명은 유전자 공학 기술에 의한 bkd 돌연변이체의 구축에 관한 것이다. bkdF 유전자에 영향을 미치는 염색체 결실을 갖고 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈 활성이 없는 bkd 돌연변이체는 유일한 탄소원으로서 이소루신, 루신 및 발린상에서 성장할 수 없고, 또한 S-2-메틸부티르산 및 이소부티르산 둘 모두가 없는 배지에서 천연 아베르멕틴을 생성할 수 없다. 본원에 개시된 돌연변이체는 사이클로헥산 카복실산(CHC)과 같은 적절한 다른 카복실산을 함유하는 배지에서의 발효를 통해 신규한 (천연이 아닌) 아베르멕틴을 생산하는데 이용된다. 또한, 본 발명은 bkdF 유전자 및 bkdABC 유전자 군집 둘 모두에 영향을 미치는 염색제 결실을 갖는 돌연변이체의 구축에 관한 것이다.
스트렙토마이세스는 균사 구획에는 다중 복제형으로 존재하지만 포자에서는 단일 복제형으로 존재하는 1개의 주요 유전자 연결기인 1개의 염색체를 갖는다. 스트렙토마이세스 게놈은 이. 콜라이의 약 2배의 크기를 갖는 원핵세포(5x103내지 7x 103킬로베이스[kb])중 가장 큰 것이 특징이다(글라덱(Gladek, A) 및 자크르제스카(Zakrzewska, J)의 문헌[1984, FEMS Microbiol. Lett.,24:73-76]).
스트렙토마이세스의 유전학의 한가지 특히 흥미로운 측면은 강한 DNA 증폭에 의해 종종 수반되는 광범위한 결실을 포함하는 잦은 염색체 재배열이다(비치(Birch, A.) 등의 문헌[1990, Bacteriol., 172:4138-4142]). 스트렙토마이세스에서의 증폭 및 결실은 이. 콜라이 및 비. 섭틸리스에서의 유사한 경우보다 10 내지 100배 빈번하다. 염색체의 18%를 구성하는 결실 및 게놈의 45%를 나타내는 증폭이 보고되었다. 이들의 본질적인 장기간의 불안정성에도 불구하고, 특정 유전자의 증복은 104세포중의 하나와 같은 높은 확률로서 발생한다. 상기 중복은 분열하는 딸 염색체에서의 짧고, 부분적으로 상동한 부분의 DNA 를 포함하는 불법적인 교차 사건에 의해 일반적으로 발생된다. 상기 중복은 동일한 염색체상에 새로운 DNA 를 생성시켜, 자동적으로 유전자가 더욱 증폭되거나 제거되게 하는 경향이 있다. 동일한 유전자 뿐만 아니라 매우 유사한 구조를 갖는 2개의 상이한 유전자의 다중 복제는 제조합하여 결실되는 경향이 있다. 따라서, 유전자의 본질적인 안정성은 임의의 다른 유전자와 너무 유사하지 않을 것을 요구한다.
스트렙토마이세스내에서의 유전자 또는 유전자군의 다중 복제의 존재는 일반적이지 않다. 사카로폴리스포라 에리트라에아(Saccharopolyspora erythraea)에서의 마크롤라이드 항생제 에리트로마이신의 폴리케티드 부분의 합성에 필요한 유전자의 변형 구축이 보고되었다(도나디오(Donadio)등의 문헌[1991, Science, 252:675-679]).
스트렙토마이세스 아베르미틸리스는 2개이상의 bkd 유전자의 군집을 갖는 것이 발견되었다: 하나의 군집은 bkdA, bkdB 및 bkdC 유전자를 포함하고, 다른 군집은 bkdF, bkdG 및 bkdH 유전자를 포함한다.
본원에 개시된 bkdABC(1993년 7월 30일자로 출원된 미합중국 특허원 제 8/100,518 호에서 개시되고 언급되었음) 및 bkdFGH 유전자 군집은 에스. 아베르미틸리스에서의 유전자 중복에 의해 발생하였고, 돌연변이를 통해 생존을 보증할 만큼 충분히 다른(재조합/결실을 피하는) 2개의 복제형이 축적되었을 것으로 예상된다.
BCKDH를 암호화하는 제2의 신규한 유전자 군집의 개시에 첨가하여, 또한 유전 공학 기술에 의한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 bkdF 돌연변이체의 구축을 개시한다. bkdF 돌연변이체는 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈 활성이 없으므로 유일한 탄소원으로 이소루신, 루신 및 발린을 이용하여 성장할 수 없고, S-2-메틸부티르산 및 이소부티르산 둘 모두가 없는 배지에서 천연 아베르멕틴을 생성시킬수 없다. bkdF 돌연변이체는 사이클로헥산 카복실산(CHC)과 같은 적절한 다른 카복실산을 함유한 배지에서의 발효를 통해 신규한 아베르멕틴을 생성시키는데 유용하다. bkdF 유전자 및 bkdABC 유전자 군집 둘 모두에 영향을 미치는 염색체 결실을 갖는 돌연변이체의 구축을 또한 개시한다.
화학적 및 물리적 돌연변이 유발물질을 이용한 스트렙토마이세티스 돌연변이체의 생성은 유전자의 작용 및 조절을 분석하고, 개선된 산업적인 균주를 개발하기 위한 중요한 기술이다. 스트렙토마이세스 유전자 클로닝에서의 최근 발전으로 내성, 생합성 및 조절 유전자와 같은 무수한 클로닝된 유전자를 제조합 DNA 기술로 조작하는 것이 가능해졌고 유전자의 구성 및 조절을 밝히는 것이 가능해졌다. 다른 돌연변이적 접근인 유전자 치환은 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 에스케리치아 콜리 및 바실러스 섭틸리스(쉐러(Scherer, S) 및 다비스(R. W. Davis) 의 문헌[1979, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 76:4951-4955]; 쇼틀(Shortle, D) 등의 문헌[1982, Science, 217:371-373]; 스탈(Stahl, M. L.) 및 페라리(Ferrari, E)의 문헌[1984, J. Bacteriol., 158:411-418]) 및 사카로폴리스포라 에리트라에아(웨버(Weber, J.M.) 및 로식(Losick, R.)의 문헌[1988, Gene, 68:173-180]) 및 여러 스트렙토마이세티스 종에서 성공적으로 응용된다. 상기 기술에 의해 플라스미드상에서의 생체외에서 생성된 돌연변이가 숙주 균주의 염색체로 도입될 수 있다. 이러한 접근은 제조합이 숙주 염색체와 상동 부분을 함유하는 플라스미드 사이에서 일어난다는 발견을 토대로 한 것이다.
에스. 아베르미틸리스에서의 유전자 치환은 벡터가 갖고 있는 클로닝된 서열과 이들의 염색체 대응부분 사이의 상동 재조합에 의해 발생한다. 아마도, 2개의 교차가 동시에 일어나거나, 단일 교차후 통합(integration)되고 통합된 플라스미드가 절단되는 후속적인 분리(resolution) 단계에 의해 클로닝된 서열과 본래의(resident)서열 사이의 상호 교환이 유도될 것이다. 에스. 아베르미틸리스에서는 이중 또는 단일 교차 둘 모두가 발견된다. 이중 교차 및 단일 교차는 절단후에는 두가지 기작 모두 동일한 생성물을 생성시킨다. 이러한 접근법을 사용하여 에스. 아베르미틸리스의 bkdF 유전자의 E1-알파 개방 판독 프레임을 파괴할 수 있었다. 이러한 파괴는 BCKDH 복합체의 E1-알파 서브유니트를 암호화하는 유전자의 5'-절반에 영향을 미치는 약 1.4kb의 염색체의 결실을 포함한다. 결과로 생성된 돌연변이 균주는 bkd 돌연변이체의 모든 특징적인 표현형의 특징을 나타내는 것으로서, 안정하고, 발효에 의해 가치가 있는 신규한 아베르멕틴을 생성시키는데 이용될 수 있다.
본원에 언급된 모든 출판물은 전체가 참고로 본원에 혼입되어 있다.
[어휘]
본원에서 사용된 기술적인 용어는 분자 유전학 분야에 숙련된 이들에게는 공지되어 있다. 본원에서 자주 사용되는 용어는 다음과 같이 정의된다;
증폭 : 염색체내 또는 염색체외 DNA에서 발견되는 염색체 서열의 추가 복제의 생성을 의미한다.
항생제 내성 유전자 : 특정한 항생제에 천연적으로는 민감한 숙주 세포에 도입시켰을때 항생제에 대해 내성을 갖게하는 DNA 서열. 항생제 표지(marker)로도 공지되어 있다.
클론 : 1개의 조상을 갖는 동일한 다수의 세포 또는 분자.
클로닝 백터 : 외부의 DNA가 삽입되어 클로닝될 수 있는 임의의 플라스미드. 형질전환시 숙주 박테리아 세포로 외부의 DNA를 전달시킨다.
CoA : 조효소 A.
점착성 말단 서열(Cos) : 생체외 포장하는데 사용되는 박테이오파지 람다에서 유래된 DNA 서열.
코즈미드 : 박테리오파지 람다 cos 부위가 삽입된 플라스미드; 결과적으로, 플라스미드 DNA(외부 DNA 삽입체를 보유)를 파지의 외피로 생체외에서 포장할 수 있다.
cDNA : 생체외 전사에 의해 DNA로부터 합성되는, DNA에 상보적인 단일 가닥 RNA.
교차 : 클로닝된 서열과 그의 염색체의 대응부분 사이에서 상호적인 물질 교환이 일어나는 지점을 의미한다.
달톤 : 수소원자 1개에 상응하는 분자 크기와 연관되어 일반적으로 사용되는 질량의 단위.
DNA 라이게이션 : 2개의 DNA 단편의 화학 결합 연결 형성.
중복 교차 : 동시에 또는 순차적으로 발생하는 2개의 교차. 결과적으로 클로닝된 서열과 본래의 서열 사이의 상호 교환이 일어난다.
유전자 군집 : 염색체상에서 물리적으로 가까운 일군의 유전자.
유전자 치환 : 플라스미드에 있는 생체외의 돌연변이를 염색체로 도입하는 기술. 치환은 숙주 염색체 및 염색체에 상동한 부위를 함유하는 플라스미드가 재조합될 때 발생한다.
게놈 : 전체 염색체 세트. 개개의 유전자의 총합.
하이브리드형성, 콜로니 하이브리드형성 : 삽입된 DNA가 일부 특정 서열과 유사한 키메라성 벡터를 갖는 박테리아의 콜로니를 확인하기 위해 사용되는 기술.
균사 : 곰팡이의 성장 또는 생장의 주요 요소. 균사는 관형의 구조이고, 직경이 약 2 내지 10 마이크론이며, 균사체로 불리는 서로 감기는 가닥(strand)의 덩어리를 형성한다.
kb : DNA 또는 RNA의 1,000개의 염기쌍의 약자.
링커(linker) : 하나이상의 제한효소의 표적 부위를 함유하는 짧은 합성 이중 올리고데옥시뉴클리오티드. 벡터에 첨가되어 신규한 폴리 링커 또는 다중 클로닝 부위(MCS)를 생성시킨다.
NADH : 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드.
뉴클레오티드 : 핵산의 구성 볼록 또는 단량체 단위.
올리고뉴클레오티드 : 뉴클레오티드의 짧은 쇄.
오페론 : 구조 유전자, 조절 유전자 및 조절 유전자 생성물(들)에 의해 인식되는 DNA의 제어 요소를 포함하는, 박테리아 유전자의 발현 및 조절의 완전한 단위.
플라스미드 : 자율적으로, 자가-복제하는 염색체외의 환형 DNA.
플라스미드 복제 수 : 각각의 숙주 염색체에서 박테리아에서 유지되는 플라스미드 분자의 수.
프라이머 : DNA 또는 DNA의 한 가닥과 쌍을 이루는 RNA 의 짧은 서열로서 DNA 폴리머레이즈가 데옥시리보뉴클레오티드쇄의 합성을 시작하는 유리 3'-하이드록시 말단을 제공한다.
원핵 세포 : 대부분의 미생물을 포함하는 작고 비교적 간단한 세포.
프로모터 : 전사를 개시하는 DNA 영역.
제한 효소 : DNA의 특정한 짧은 서열을 인식하고 그곳을 절단하는 효소.
제한 인식 서열 : 특정한 제한 효소에 의해 특정하게 인식되는 DNA 서열. 표적 부위로도 공지되어 있다.
셔틀 벡터 : 하나이상의 다른 숙주(예, 이. 콜라이 및 스트렙토마이세스)에서 복제할 수 있는 이작용성 클로닝 벡터.
단일 교차 : 단일 지점에서 발생되는 단일 상호 유전자 재조합. 들어온 환형 플라스미드 또는 파지 벡터를 상동한 염색체 서열에서 통합 및 중복시킨다.
서던 블럿팅 : 변성된 DNA를 아가로즈 겔로부터 상보적인 헥산 프로브와 하이브리드를 형성할 수 있는 니트로셀롤로즈 필터로 이동시키는 공정.
서브클로닝 : 한가지 유형의 벡터로부터 다른 유형의 벡터로, 예를 들면 재조합 코즈미드에서 플라스미드로, DNA의 클로닝된 단편을 이동시키는 것. 그런 다음, 새로운 재조합 플라스미드는 적절한 숙주 세로로 형질전환되어 서브클론 균주를 생성한다.
박테리아 세포의 형질전환 : 첨가된 DNA를 혼입하여 새로운 유전자 표지를 획득하는 것을 의미한다.
[발명의 요약]
본 발명은 스트렙토마이세스 속에 속한 미생물의 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈 복합체를 암호화하는 단리된 DNA 분절에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈 복합체의 발현을 조절하는 DNA 영역을 더욱 포함하는, 상기 언급된 바와 같은 단리된 DNA 분절에 관한 것이다.
본 발명은 또한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈 복합체를 암호화하는 단리된 DNA 분절에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하기 개시된 바와 같은 서열 식별번호 1, 서열 식별번호 2, 서열 식별번호 3 또는 서열 식별번호 4의 DNA 서열 또는 이들 서열의 대립인자 변형물(allelic variation)을 포함하는 DNA 분절에 관한 것이다. 또한 전술한 DNA 분절의 일부분이며 기능적으로 등가체인 DNA 분절에 관한 것이다.
본 발명은 또한: (a)서열 식별번호 1, 서열 식별번호 2, 서열 식별번호 3 또는 서열 식별번호 4의 DNA 서열, 또는 이들 서열의 대립인자 변형물을 포함하는 재조합 DNA; (b)이러한 재조합 DNA 를 포함하는 플라스미드; 및 (c)이러한 재조합 DNA가 혼입된 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하기 정의된 바와 같은 pCD713, pCD740, pCD747 및 pCD854로 구성되는 군에서 선택되는 DNA 분절에 함유되어 있는 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈 복합체에 대한 유전자에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열 식별번호 1, 서열 식별번호 2, 서열 식별번호 3 또는 서열 식별번호 4의 DNA 서열, 또는 이들 서열의 대립인자 변형물을 포함하는 DNA 분절에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열 식별번호 1, 서열 식별번호 2, 서열 식별번호 3 또는 서열 식별번호 4의 DNA 서열 또는 그의 대립인자 변형물의 일부이고, 프로브로 사용시 서열 식별번호 1, 서열 식별번호 2, 서열 식별번호 3 또는 서열 식별번호 4 또는 그의 대립인자 변형물에 각각 하이브리드를 형성하거나 폴리머레이즈 쇄 반응 프라이머로서 사용시 상기 서열의 전부 또는 일부를 증폭시킬 수 있는 DNA 서열에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열 식별번호 5, 서열 식별번호 6, 서열 식별번호 7 또는 서열 식별번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 정제된 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 천연 아베르멕틴을 생산하기에 적합한 발효 배지 및 조건하에서, 하나이상의 bkdF, bkdG 및 bkdH 유전자를 포함하는 게놈 단편의 복제 수가 증가된 에스. 아베르미틸리스를 발효시킴을 포함하는, 상기 천연 아베르멕틴의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 천연 아베르멕틴을 생산하기에 적합한 발효 배지 및 조건하에서, 하나이상의 bkdF, bkdG 및 bkdH 유전자를 포함하는 게놈 단편의 발현이 이러한 발현을 조절하는 유전자의 조작 또는 치환에 의해 증가된 에스. 아베르미틸리스를 발효시킴을 포함하는, 상기 천연 아베르멕틴의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 신규 아베르멕틴을 생산하기에 적합한 발효 배지 및 조건하에서, 하나이상의 bkdF, bkdG 및 bkdH 유전자를 포함하는 게놈 단편의 발현이 이러한 발현을 조절하는 유전자의 결실, 불활성화, 치환 또는 다른 조작에 의해 감소되거나 완전히 제거된 에스. 아베르미틸리스를 발효시킴을 포함하는, 상기 신규 아베르멕틴의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 양태는, 신규 아베르멕틴을 생산하기에 적합한 발효 배지 및 조건하에서, 하나이상의 bkdF, bkdG 및 bkdH 유전자를 포함하는 게놈 단편이 결실 또는 불활성화된 에스. 아베르미틸리스를 발효시킴을 포함하는, 상기 신규 아베르멕틴의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 신규 아베르멕틴을 생산하기에 적합한 발효 배지 및 조건하에서, 하나이상의 bkdA, bkdB 및 bkdC 유전자 및 하나이상의 bkdF, bkdG 및 bkdH 유전자를 포함하는 게놈 단편의 발현이 이러한 발현을 조절하는 유전자의 결실, 불활성화, 치환 또는 다른 조작에 의해 감소되거나 완전히 제거된 에스. 아베르미틸리스를 발효시킴을 포함하는, 상기 신규 아베르멕틴의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 양태는, 신규 아베르멕틴을 생산하기에 적합한 발효 배지 및 조건하에서, 하나이상의 bkdA, bkdB 및 bkdC 유전자 및 하나이상의 bkdF, bkdG 및 bkdH 유전자를 포함하는 게놈 단편이 결실 또는 불활성화된 에스. 아베르미틸리스를 발효시킴을 포함하는, 상기 신규 아베르멕틴의 생산하는 전술한 방법에 관한 것이다.
[도면의 간단한 설명]
제1도 : 폴리머레이즈 쇄 반응(PCR) 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 에스. 아베르미틸리스 bkdF 유전자(E1-알파 BCKDH)의 단편을 클로닝하기 위해 사용되었다. 각각의 프라이머는 9개의 아미노산 길이를 갖는 보존된 영역으로 디자인되었다. 각각의 보존된 아미노산에 상응하는 코돈은 상응하는 DNA 서열의 상부에 도시된다. 오른쪽의 프라이머는 인간의 E1-알파 BCKDH 서브유니트의 192 내지 200의 아미노산을 포함하는 영역에 대해 디자인되었고, 이는 E1-알파 BCKDH 서브유니트의 대표적인 모델로 사용되었다. 왼쪽의 프라이머는 E1-알파 BCKDH 서브유니트의 286 내지 293의 아미노산을 포함하는 영역에 대해 디자인되었다. 오른쪽 프라이머의 5'말단에는 2개의 추가 아데닌을 함유하는 뉴클레오티드, 및 PCR 생성물의 클로닝을 용이하게 하기 위해 첨가된 2개의 제한 효소(EcoRI 및 SacI) 인식 서열이 있다. 유사하게는, 왼쪽 프라이머의 5'말단에는 2개의 추가 아데닌을 함유하는 뉴클레오티드, 및 2개의 제한 효소(BamHI 및 XbaI) 인식 서열이 있다.
제2도 : 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 bkdFGH 유전자 군집에 대한 게놈 제한 지도, 위치 및 서브클론. 또한 이전에 개시된 bkdABC 유전자 군집의 위치가 되시되어 있다(상기 언급된 데노야의 미합중국 특허원 제 08/100,518 호 참고). 지도 하단의 흑색 박스는 PCR을 사용하여 클로닝된 초기의 E1-알파 특이성 에스. 아베르미틸리스 게놈 단편의 위치 및 배향을 나타낸다. E1-알파, E1-베타 및 E2 BCKDH 서브유니트 각각을 암호화하는 bkdF, bkdG 및 bkdH 구조 유전자의 위치 및 배향이 또한 도시되어 있다. 검증된 개방 판독 프레임(박스로 도시됨)의 극성은 왼쪽에서 오른쪽이다. 약자: B, BamHI: Bg, Bg1II; P, PstI; 및 S, SphI. X는 하기 개시된 바와 같은 bkdF 개방 판독 프레임의 하부에 위치된 DNA 영역을 서열화시키는데 이용되는 트랜스포손 미니-감마-델타-1 삽입체의 위치를 나타낸다.
제3도 : 제1도에서 도시된 프라이머를 이용한 PCR에 의해 클로닝된 에스. 아베르미틸리스 게놈 DNA의 501 bp 단편(CD 613)의 뉴클레오티드 서열 및 추론된 해독 생성물. 상기 게놈 단편은 bkdF 유전자(E1-알파 BCKDH)의 부분을 함유한다. 뉴클레오티드는 서열 선의 상부에서 번호매겨진다. 추론된 아미노산 서열은 상응하는 코돈 서열 밑에 도시된다.
제4도 : SP6 벡터 프라이머를 이용한 pCD746 서브클론의 PstI 말단으로부터 서열화한 201 bp의 에스. 아베르미틸리스 게놈 DNA영역의 뉴클레오티드 서열 및 추론된 해독 생성물. 추론된 해독 생성물은 bkdG 유전자에 상응하는 BCKDH 복합체의 E1-베타 성분의 부분을 나타낸다. 뉴클레오티드는 서열 선의 상부에서 번호매겨진다. 추론된 아미노산 서열은 상응하는 코돈 서열의 밑에 도시된다.
제5도 : 4.1kb BamHI 게놈 단편에서 bkdF 유전자를 함유하는 BamHI 말단으로부터 약 1.7kb 에 위치한 미니-감마-델타-1 삽입체 A3의 양쪽 말단으로부터 서열화한 194bp의 에스. 아베르미틸리스 게놈 DNA영역의 뉴클레오티드 서열(서열 CD785) 및 추론된 해독 생성물. 추론된 해독 생성물은 bkdG 유전자에 상응하는 BCKDH 복합체의 E1-베타 성분의 C-말단의 끝부분을 나타낸다. 뉴클레오티드는 서열 선의 상부에서 번호매겨진다. 추론된 아미노산 서열은 상응하는 코돈 서열의 밑에 도시된다.
제6도 : 4.1kb BamHI 게놈 단편에서 bkdF 유전자를 함유하는 BamHI 말단으로부터 약 3kb 에 위치한 미니-감마-델타-1-삽입체 A5의 양쪽 말단으로부터 서열화한 455bp의 에스. 아베르미틸리스 게놈 DNA영역의 뉴클레오티드 서열(서열 CD786) 및 추론된 해독 생성물. 추론된 해독 생성물은 bkdG 유전자에 상응하는 BCKDH 복합체의 E2성분의 C-말단의 끝부분을 나타낸다. 뉴클레오티드는 서열 선의 상부에서 번호매겨진다. 추론된 아미노산 서열은 상응하는 코돈 서열의 밑에 도시된다.
제7도 : 유전자 치환 벡터 pCD768의 구축 및 에스. 아베르미틸리스 bkdF 돌연변이주 CD794의 게놈 제한 지도. 플라스미드 pCD768은 ermE 표지(흑색 화살표)가 매달린 2.3 및 4.1kb의 BamHI 에스. 아베르미틸리스 게놈 단편을 갖는 셔틀 벡터 pCD262의 유도체이다. 플라스미드 pCD761은 하기에 개시된 바와 같은 중간 구축물이다. bkdF 유전자를 함유한 에스. 아베르미틸리스 염색체 영역의 게놈 제한 지도(야생형 및 치환주)가 또한 도시되어 있다. 이들 지도는 프로브로서 5.0kb PstI 게놈 단편을 이용한 서던 하이드리드형성 분석법에 의해서 추론된다. 약자: B, BamHI: P, PstI. 각 DNA 단편상부의 숫자는 킬로베이스(kb)로 나타낸 길이이다.
제8도 : 유전자 치환 벡터 pCD768의 제한 지도. 빗금친 박스는 tsr-티오스트렙톤 내성 표지; amp-암피실린 내성 표지; 2.3-2.3kb BamHI 에스. 아베르미틸리스 게놈 단편; erm-에리트로마이신 내성 표지; 4.1-4.1kb BamHI 에스. 아베르미틸리스 게놈 단편을 나타낸다.
스트렙토마이세스 및 이. 콜라이의 복제 기원 영역이 또한 도시된다.
횐색 박스는 이. 콜라이 벡터 영역을 나타낸다. 화살표는 전사 및 해독 방향을 나타낸다.
제9도 : bkdABCF 돌연변이체의 구축, 벡터 구축물 및 표적 게놈 영역의 게놈 제한 지도 및 단순화된 도면을 나타낸다. bkd 유전자 군집의 위치, 개방 판독 프레임의 배향 및 약자는 제3도의 해설에서 개시된 바와 같이 사용된다. 결실된 분절은 회색 빗금친 영역으로 도시되어 있다. 연속 및 빗금친 선은 염색체 및 벡터 DNA 각각을 나타낸다. 두꺼운 흑색선은 유전자 치환을 이용하여 클로닝된 게놈 단편을 나타낸다. 수직의 화살표는 항생제 내성 표지가 삽입된 위치를 나타낸다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명의 신규한 DNA 서열은 DNA 폴리머레이즈 쇄 반응(PCR) 및 상동 프로브화의 두가지 분자 유전학 기술을 함께 사용하여 클로닝되었다.
본 발명의 신규한 DNA 서열을 검증하고 클로닝하는 과정 및 유전자 치환에 의한 bkd 돌연변이체의 구축은 하기에 개시된다.
먼저, 오른쪽 및 왼쪽으로 명명된 2개의 PCR 프라이머(제1도)를 다양한 종 및 문헌에서 이용가능한 추론된 E1-알파 BCKDH 펩티드 서열의 다중 정렬에서 확인된 보존된 영역에 대해 디자인하였다. 약 0.55kb의 길이를 갖는 PCR 생성물은 오른쪽 및 왼쪽 프라이머 둘 모두를 사용하여 에스. 아베르미틸리스 게놈 DNA 를 PCR 증폭시켜 탐지되었다. 상기 PCR 증폭된 DNA 단편을 이어서 이. 콜라이의 벡터인 pGEM-3Z로 클로닝하여 재조합 플라스미드 pCD613을 생성시켰다. 이어서, 플라스미드 pCD613을 이. 콜라이 DH5-알파 컴피튼트(competent) 세포로 형질전환시켰다. 하나의 형질전환체를 선택하고 균주 CD613으로 명명하였다. 클로닝된 DNA 단편인 CD613의 DNA 서열은 E1-알파 BCKDH 서브유니트와 매우 상동한 추론된 펩티드를 갖는 개방 판독 프레임의 존재를 나타낸다(제3도). 그런 다음, 클로닝된 CD613 게놈 DNA 단편을 콜로니 하이브리드형성에 의한 에스. 아베르미틸리스 염색체 라이브러리를 스크린하는 프로브로 사용하였다. 여러 코즈미드 클론을 검증하였다. 제한 및 서던 블럿 분석 결과, 모든 선택된 코즈미드 클론이 겹치는 게놈 단편을 갖고 있음을 나타내었다. 서브클로닝된 게놈 DNA 단편(실시예 6에 완전히 개시되는 바와 같음)으로부터 수득된 염색체 영역의 DNA 서열을 분석한 결과 CD613의 서열은 완전한 bkd 유전자 군집의 일부이었다. 클로닝된 에스. 아베르미틸리스 bkd 유전자는 길이가 약 4 킬로베이스인 염색체의 영역을 포함한다(제2도). DNA 서열 분석은 하기와 같이 구성된 군집으로서 배열된 bkd 구조 유전자의 존재를 나타낸다: E1-알파(bkdF), E1-베타(bkdG) 및 E2(bkdH)개방 판독 프레임(제2도 내지 제6도).
다음으로, 불활성화된 bkdF 유전자를 갖는 플라스미드를 구축하였다. 제2도에 도시된 바와 같이 에스. 아베르미틸리스 염색체내의 3개의 인접한 BamHI 제한 단편을 지도화하였다(왼쪽에서 오른쪽으로): 2.3kb, 1.4kb 및 4.1kb. 1.4kb BamHI 게놈 단편은 E1-알파 개방 판독 프레임(ORF-1)의 시작 부분(유전자 bkdF)을 갖는다. 4.1kb BamHI은 bkd 유전자 군집의 나머지를 갖는다(bkdF 의 말단, bkdG 및bkdH).
플라스미드 pCD768은 염색체의 1.4kb BamHI 단편의 양 말단에 인접한 2개의 에스. 아베르미틸리스 게놈 단편(2.3 및 4.1kb BamHI)을 갖는 셔틀 벡터 pCD262의 유도체이다. 또한, pCD768은 2.3 및 4.1kb BamHI 단편 사이에 위치한 ermE 표지를 갖는다. ermE 표지(에리트로마이신에 대한 내성을 제공)는 하부 유전자의 과다발현에 의한 가능한 어려움을 피하기 위해 ORF-1(bkdF)의 배향과 반대로 놓여있다. 상기 구축물은 하기 개시된 바와 같이, 재조합시 숙주 게놈에서 1.4kb의 결실(ORF1이 영향을 받는다)을 가져온다.
플라스미드 pCD768을 에스. 아베르미틸리스 31272 SC2 숙주 원형질체로 형질전환시켰다. 에리트로마이신(erm-R) 및 티오스트렙톤(tsr-R) 항생제 둘 모두에 대해 내성을 나타내는 2개의 형질전환체를 선택하였다. 형질전환체1(CD783)을 액상 배지에서 성장시켰고 원형질체를 제조하여 에리트로마이신을 함유한 한천 배지에서 플레이팅하였다. 50개의 클론을 선택하여 더욱 분석하였다: 46개는 erm-R,tsr-R 이고; 4개는 erm-R,tsr-S이다. 후자의 4개의 클론은 하기와 같이 bkd-결핍 표현형을 보였다: ILV 최소 배지 플레이트에서 성장하지 못하였다; E1(분지쇄 데카복실레이즈) 활성이 탐지되지 않았다; 그리고, 발효시,S(+)-2-메틸부티르산 또는 이소부티르산을 보충하지 않으면 천연 아베르멕틴을 합성하지 못했다(실시예 9참조). 또한, CHC를 발효 배지에 첨가하면, 신규 아베르멕틴(CHC-아베르멕틴)이 합성되었고, bkd 차단이 아베르멕틴 생합성 세포 기작에는 영향을 미치지않음을 나타내었다. 상기 4개의 군중에서 하나의 클론(클론 pp15)은 공식적으로 에스. 아베르미틸리스 균주 CD794로 명명되어 본 발명의 예시로서 어메이칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; ATCC)에 기탁된 것이다. 마지막으로, 서던 하이브리드형성 분석으로 bkdF 유전자에 상응하는 ORF-1이 에스. 아베르미틸리스 ATCC 31272 SC2에서의 유전자 치환에 대해 예상되는 바와 같이 파괴되었음을 확인하였다.
실험단계의 완전한 개시는 에스. 아베르미틸리스 bkd 유전자의 클리닝 및 그에 의해 수득된 결과를 포함하고, 이를 하기에 나타낸다:
(a)PCR 프라이머가 결합하는 후보 위치로서 작용할 수 있는 E1-알파 BCKDH 펩티드 서브유니트에서의 보존된 영역의 확인
인간(피셔(Fisher)등의 문헌[1989, J. Biol. Chem., 264:3448-3453]), 래트(장(Zhang)등의 문헌[1987, J. Biol. Chem., 262:15220-15224]), 슈도모나스 푸티다(쇼카치(Sokatch)등의 문헌[1988, Eur. J. Biochem., 176:311-317]) 및 바실러스 스테아로써모필루스(퍼함(Perham)등의 문헌[1990, Eur. J. Biochem., 191:337-346])에서의 4가지 E1-알파 BCKDH 펩티드 서열을 정렬하여 상응하는 PCR 프라이머를 디자인하기 위한 서열로서 작용할 수 있는 보존된 영역을 확인하였다. 원핵 및 진핵 BCKDH 복합체 둘모두에서 매우 보존된 E1-알파 서브유니트의 영역을 확인하기 위해 GCG 서열 분석 소프트웨어 패키지(GCG, 위스콘신 메디슨 소재)의 라인업(LineUp) 및 프리티(Pretty) 프로그램을 사용하여 컴퓨터 분석을 하였다. 4개의 E1-알파 BCKDH 펩타드를 다중 정력하여 여러 확장된 상동 영역을 나타내었다(웨슬러(Wexler, I.D)등의 문헌[1991, FEBS Letters.282:209-213]). 인간의 E1-알파 아미노산 182-229 사이에 위치한 티아민 피로포스페이트 결합 모티프(퍼함 등의 문헌[1989, FEBS Letters. 255:77-82]), 및 아미노산 291-307 부분을 가로지르는 인산화 부위 1 및 2의 영역은 분석된 4개의 E1-알파 BCKDH 펩티드 모두에서 매우 보존되어 있다. 또한, 아미노산 245-289 사이에 위치한 예전에 개시된 매우 상동한 영역이 존재하였다. 이 영역은 알파 및 베타 서브유니트 둘 모두를 갖는 알파-케토산 데하이드로지네이즈에 독특하고, 이. 콜라이 PDH E1 또는 단일 E1 플리펩티드만으로 구성된 이량체인 이.콜라이 및 효모 알파-케토글루타레이트 데하이드로지네이즈 복합체의 E1 성분의 임의의 서열과는 상동하지 않은 것으로 보인다. 상기 언급된 이유로인해, 후자의 상동 영역은 서브유니트 상호작용에 작용하는 것으로 제안되었다(파텔(Patel) 등의 문헌[1991, FEBS Letters. 282:209-213]). PCR 프라이머 디자인으로 선택된 보존된 영역은 인간의 E1-알파 BCKDH 단백질의 아미노산 잔기 192 내지 200, 및 286 내지 293을 암호화하였다.
(b)PCR 프라이머로 사용되는 상기 E1-알파 BCKDH 보존 영역에서 유도된 신규한 올리고뉴클레오티드의 디자인
이전에 언급된 바와 같이, E1-알파 BCKDH 서브유니트의 2개의 보존된 영역이 다중 정렬 연구로부터 선택되었다. 오른쪽 PCR 프라이머(제1도)는 인간 E1-알파 BCKDH 서브유니트의 아미노산 192-200을 포함하는 영역으로 디자인되었고, 이는 E1-알파 BCKDH 서브유니트의 대표적인 모델로서 이용되었다. 상기 아미노산은 티아민 피로포스페이트 결합 모티프내에 위치한다. 왼쪽 PCR 프라이머(제1도)는 인간 E1-알파 BCKDH 서브유니트의 아미노산 286-293을 포함하는 영역으로 디자인되었다. 후자의 아미노산 서열은 서브유니트 상호 작용 부위의 말단 및 인산화 부위 보존 영역의 시작 부분을 포함한다.
스트렙토마이세스 유전자 코돈의 정렬을 이용하였다(라이트(F.Wright)및 빕(M.J. Bibb)의 문헌[1992, Gene, 113:55-65]). 오른쪽 프라이머의 5' 말단에는 2개의 추가 아데닌-함유 뉴클레오티드, 및 PCR 생성물의 클로닝을 용이하게 하기 위해 첨가된 2개의 제한 효소(EcoRI 및 SacI)인식 서열이 있다. 유사하게는, 왼쪽 프라이머의 5' 말단에는 2개의 추가 아데닌을 함유하는 뉴클레오티드, 및 2개의 제한 효소(BamHI 및 XbaI)인식 서열이 있다.
오른쪽 프라이머의 완전한 서열은 다음과 같다:
왼쪽 PCR 프라이머의 완전한 서열은 다음과 같다:
뉴클레오티드를 명명하는 인터내셔날 유니온 오브 바이오케미스트리(IUB) 규칙을 DNA 서열을 개시하는데 사용하였다. 중복을 K=G+T, S=G+C 및 W=A+T인 IUB 그룹 코드에 따라 확인하였다. E-1 알파 bkd 유전자와 상동하지 않고 클로닝 목적으로 프라이머에 혼입시킨 제한 인식 서열은 밑줄쳤다(제1도 참조).
(c)에스. 아베르미틸리스 게놈 DNA 단편의 PCR 증폭.
에스. 아베르미틸리스 게놈 DNA를, 효과적이고 특정한 스트렙토마이세티스 DNA의 증폭을 허용하는 GC 함량이 높은 DNA 에 적합한 반응 조건을 이용하여 효소적으로 증폭시켰다(실시예 2 참조). 상기 개시된 프라이머의 조합을 이용하여 PCR을 수행하였다.
(오른쪽 프라이머:
[서열 1]
및 왼쪽 프라이머:
[서열 2]
증폭 생성물을 아가로즈 겔 전기영동시켜 크기에 따라 분획시켰다. 상기 개시된 PCR 조건하에서, 상기 프라이머의 조합을 사용하였을때, 단일 DNA 밴드(약, 550 염기쌍 길이)를 탐지하였다.
(d)이. 콜리 클로닝 벡터로 증폭된 게놈 DNA 단편을 클로닝한 후 이. 콜라이 숙주로 형질전환시킴.
상기 언급한 바와 같이, EcoRI 제한 부위는 클로닝의 편의를 위해 오른쪽 PCR 프라이머에 혼입되었고, XbaI 제한 부위는 왼쪽 프라이머의 5'말단에 존재한다. 0.55kb PCR 단편을 전기용출시켜서 아가로즈 겔로부터 회수하여 이를 EcoRI 및 XbaI 제한 효소 둘 모두로 절단하였다. 많은 재조합 클론을 특정한 단편을 선형화된 이. 콜라이 벡터(pGEM-3Z)로 라이게이션하여 회수하여 재조합 플라스미드 pCD613를 생성시키고 이를 이. 콜라이 컴피튼트 세포로 형질전환시켰다. 하나의 형질전환체를 더욱 특징을 규명하기 위해 선택하였고 이를 균주 CD613으로 명명하였다. 제한 분석하여 이. 콜라이 균주 CD613에서 단리된 플라스미드 pCD613이 정말 0.55kb의 에스. 아베르미틸리스 삽입체를 함유함을 확인하였다.
(e)클로닝된 단편의 DNA 서열화 및 bkd-특이 서열의 검증
플라스미드 pCD613 내에 존재하는 0.55kb 삽입체를 한쌍의 벡터 프라이머를 사용한 이중가닥 서열화 과정에 의해 서열화시켰다(실시예 6A 참조). 또한 0.55kb PCR 삽입체내에 내부적으로 위치하는 0.35kb Sa1I 단편을 박테리오파지 M13으로 서브클로닝하고 단일가닥 서열화 방법에 의해 서열화하였다(실시예 6B 참조). DNA 서열화는 단일가닥 DNA 주형 및 택트랙(TaqTrack) 키트(프로메가(Promega)제품)를 이용하여 디데옥시뉴클레오티드-쇄 종결 방법에 의해 수행되었다. DNA 서열화 자료의 코돈의 선호도 분석(GCG 서열 분석 소프트웨어 패키지, 위스콘신 메디슨 소재)은 스트렙토마이세티스 유전자에 대한 예상되는 코돈 용도를 갖는 개방 판독 프레임의 존재를 나타내었다.
그런 다음, 가짜의 개방 판독 프레임을 인텔리제네틱스 슈트(IntelliGenetics Suite) 소프트웨어(인텔리제네틱스 인코포레이티드, 캘리포니아 마운틴 뷰 소재)의 시크 앤드 트랜스레이트(Seq and Translate)프로그램을 이용하여 아미노산 서열로 해독하였다. 마지막으로 쿼리(query)펩티드 서열을 이용한 자료 은행 유사성 조사를 인텔리제네틱스 소프트웨어의 FASTDB 프로그램을 이용하여 수행하였다. 모든 자료 은행 즉, DNA 자료 은행(진뱅크(GenBank), 국립보건원, 및 유럽 분자 생물학 실험실(EMBL), 독일 하이델베르그 소재) 또는 단백질 자료 은행 (PIR 및 스위스-프로트(Swiss-Prot)를 조사하여 일치되게 클론 CD613에서 유래된 서열이 매우 상동이지만, 원핵 및 진핵세포의 기원 둘모두의 자료 은행에 열거된 모든 다른 E1-알파 BCKDH 펩티드와 구별되는 신규한 것임을 나타내었다. 또한 유전자 bkdA에 의해 암호화되는 신규한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 E1-알파 BCKDH 펩티드 서열 또한 비교하였다(데노야의 문헌[1993, Cloned genes encoding branched-chain alpha-ketoacid dehydrogenase complex from Streptomyces avermitilis, 1993년 7월 30일자로 출원된 미합중국 특허원 제 08/100,518 호] 참조). 상기 분석으로부터 이. 콜라이 균주 CD613에서 클로닝된 550bp의 에스. 아베르미틸리스 게놈 PCR 생성물이 정말 신규한 E1-알파 bkd 유전자 단편을 나타냄을 결론지었다.
(f)전체 에스. 아베르미틸리스 bkd 유전자 군집의 클로닝, 제한 및 서던 블럿 분석 및 염색체 지도의 구축.
상기 개시된 바와 같이, 원래의 0.55kb PCR 단편은 내부적인 0.35kb의 Sa1I 단편을 함유한다. 이러한 작은 단편은 콜로니 하이브리드 형성에 의해 에스. 아베르미틸리스 게놈 DNA 코즈미드 라이브러리를 스크린하기 위한 방사성활성이 있는 표지된 프로브로서 사용되었다. 10개의 클론이 확인되었고 회수되었다. 제한 및 서던 블럿 하이브리드 형성 분석은 10개의 클론이 동일한 염색체 영역으로부터 기원된 겹치는 서열을 함유함을 나타낸다. 동일한 프로브를 에스. 아베르미틸리스 ATCC 31272 SC2로부터의 절단된 염색체 DNA의 서던 블럿에 대해 매우 엄격함을 갖도록 사용하였다. 후자의 분석은 게놈 라이브러리로부터 회수된 클론의 검증을 확인하였다. 놀랍게도, 코즈미드 클론중의 2개가 또한 kbdA 특이성 프로브에 하이브리드를 형성함은(데노야의 문헌[1993, Cloned genes encoding branched-chain alpha-ketoacid dehydrogenase complex from Streptomyces avermitilis, 1993년 7월 30일자로 출원된 미합중국 특허원 제 08/100,518 호] 참조) 본원에 개시된 bkd 유전자(bkdF로 명명)가 bkdA, bkdB 및 bkdC를 포함하는 유전자 군집에 가까이 위치할 수 있음을 제안하였다. 에스. 아베르미틸리스 CD613의 서열을 함유한 게놈 영역의 제한 효소 지도를 구축하였다(제2도). 상기 개시한 하이브리드 형성 자료로부터 예상되는 바와 같이, bkd 유전자는 bkdABC 유전자 군집과 단지 12 킬로베이스 떨어져있다.
(g)코즈미드 클론으로부터 유래된 게놈 DNA 단편의 서브클로닝, 및 bkd 유전자 군집의 에스. 아베르미틸리스 염색체 영역의 DNA 서열화.
에스. 아베르미틸리스 염색체의 전체 CD613 bkd 영역을 포함하는 BamHI 및 PstI 게놈 단편을 DNA 라이브러리 코즈미드 클론으로부터 이. 콜라이 벡터 pGEM-3Z로 서브클로닝하였다. 각 플라스미드의 간략한 개시를 포함하는 상기 작업중에 구축된 서브클론의 리스트는 다음과 같다:
1. 2.3kb BamHI 단편을 함유하는 플라스미드 pCD740.
2. 1.4kb BamHI 단편을 함유하는 플라스미드 pCD854.
3. 4.1kb BamHI 단편을 함유하는 플라스미드 pCD713.
4. 약 5kb의 PstI 삽입체를 함유하는 플라스미드 pCD747.
(각각 상기 4개의 플라스미드에 상응하는 에스케리치아 콜리 균주 CD740, CD854,CD713 및 CD747은 어메이칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되었다. 상기 기탁에 관한 정보는 PCT 양식 RO/134에서 발견할 수 있고, 이는 본원의 특허청구범위 앞에 기재되어 있다). 또한, 약 3.1kb PstI/BamHI 단편을 함유하는 서브클론은 플라스미드 pCD713에 있는 4.1kb BamHI 단편에서 유도되었다. 새로운 구축물은 플라스미드 pCD746으로 기록되었고, 하기와 같이 DNA 서열화에 이용되었다. 플라스미드 제한 효소 지도, 서던 하이브리드형성, 및 PCR 분석에 의해 각 서브클론을 확인하였다.
(h)클로닝된 DNA 단편에서 수득된 DNA 서열화 자료의 컴퓨터 분석 및 에스. 아베르미틸리스 E1-알파, E1-베타 및 E2 bkd 개방 판독 프레임의 검증.
DNA 서열화 자료를 상이한 여러개의 서브클론 및 구축물로부터 수득하였고 하기와 같다:
1. CD613: 상기 c 및 d 부분, 및 실시예 2 및 3에서 개시된 원래의 PCR 클론을 나타낸다. BCKDH 복합체의 E1-알파 성분을 암호화하는 bkdF 유전자에 상응하는 개방 판독 프레임 1(ORF-1)의 부분을 함유한다(제3도).
2. CD746: pCD713으로부터 유래된 3.1kb PstI/BamHI 단편을 나타낸다(상기 g 부분 참조). SP6 벡터 프라이머(프로메가 캄파니에서 구입)를 사용하여 pCD746 삽입체의 PstI 말단을 서열화하여 수득된 DNA 서열화 자료는 BCKDH 복합체의 E1-베타 성분을 암호화하는 bkdG 유전자에 상응하는 ORF-2의 부분임을 밝혀냈다(제4도).
3. CD785: 클로닝된 4.1kb BamHI 게놈 단편에서 bkdF 개방 판독 프레임의 하부에 위치된 DNA 영역을 서열화하는데 사용되는 트랜스포손 미니-감마-델타-1 삽입체. A3로 명명된 상기 미니-감마-델타-1 삽입체는 bkdF 유전자를 함유하는 BamHI 말단으로부터 약 1.7kb 떨어져 위치한다. 삽입체 A3의 양쪽 말단에서의 DNA 서열화는(실시예 6C 참조) E1-베타 ORF(ORF-2)(bkdG)의 말단에 상응하는 ORF의 존재를 나타낸다(제5도).
4. CD786: 클로닝된 4.1kb BamHI 게놈 단편에서 bkdF 개방 판독 프레임의 하부에 위치된 DNA 영역을 서열화하는데 사용되는 트랜스포손 미니-감마-델타-1 삽입체. A5로 명명된 상기 미니-감마-델타-1 삽입체는 bkdF 유전자를 함유하는 BamHI 말단으로부터 약 3kb 떨어져 위치한다. 삽입체 A5의 양쪽 말단에서의 DNA 서열화는(실시예 6C 참조) E2 ORF(ORF-3)(bkdH)의 말단에 상응하는 ORF의 존재를 나타낸다(제6도).
에스. 아베르미틸리스 E1-알파, E1-베타 및 E2(부분) bkd 개방 판독 프레임(ORF)을 함유한 서열화된 게놈 영역을 DNA 인스펙터(Inspector) 소프트웨어(Textco, N.H.)를 이용하여 미끄럼(sliding) 염기 조성 분석하였다. 이 분석은 스트래치 길이 30 염기 및 오프세트값 20을 이용하여 G+C 함량의 평균의 프로파일을 제공하였다. 에스. 아베르미틸리스 염색체의 상기 영역에 상응하는 전체 G+C 함량은 69%이었다. 코돈 위치에 대한 G+C 함량의 함수관계를 또한 분석하였다. 프로그램 코돈 선호도(Codon Preference)(위스콘신 메디슨 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)를 이용하여 64개의 유전자에 대한 스트렙토마이세스 코돈 이용 표로 개방 판독 프레임을 탐지하였다(라이트 및 빕의 문헌[1992, Gene, 113:55-65]). 코돈 선호도 프로그램은 코돈 빈도 표와의 유사성 또는 각 코돈의 세번째 위치에서의 조성(대부분 GC)의 선호도에 의해 단백질 암호화 서열을 인식하기 위한 프레임-특이성 유전자 발견자이다. ORF는 각각의 판독 프레임에 대해 플롯의 아래에 박스로 표시되었다. 모든 시작(ATG) 및 중단 코돈을 또한 탐지하였다(수직선). 각각의 판독 프레임에서 발견된 희귀한 코돈을 각 ORF 플롯의 아래에 표지하였다. G+C 함량은 25개의 코돈의 미끄럼 윈도우를 이용하여 계산하여, 단백질 암호화 영역의 전부를 관찰하기 전에 악 25개의 코돈의 래그(lag)를 예상하였다. 3개의 프로파일을 다음과 같이 수득하였다: 1.3개중 첫번째 위치; 2,3개중 두번째 위치; 3,3개중 세번째 위치. 상기 분석의 결과로서, E1-알파, E1-베타 및 E2의 BCKDH 서브유니트에 상응하는 3개의 bkd ORF의 위치를 결정하였다.
(i)에스. 아베르미틸리스 bkd 돌연변이체의 구축
결실을 도입하는데 사용되는 기술은 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 에스케리치아 콜리 및 바실러스 섭틸리스(세레(Scherer, S.) 및 데이비스(R. W. Davis)의 문헌[1979, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 76:4951-4955]; 쇼틀(Shortle, D)등의 문헌[1982, Science, 217:371-373]; 스탈(Stahl, M.L) 및 페라리(Ferrari, E.)등의 문헌[1984, J. Bacteriol., 158:411-418]에서 사용된 유전자 치환 방법의 변형이다. 상기 기술의 일반적인 설명, 특히 스트렙토마이세스에서 사용된 기술은 키에저(Kieser, T.) 의 개관 논문[Genetic Manipulation of Streptomyces: Integrating Vectors and Gene Replacement] 및 흡우드(Hopwood, D.A)의 문헌[1991, Methods in Enzymology, vol. 204,430-458]에서 발견할 수 있다. 또한, 단일 콜로니를 단리시키고 플라스미드 제거의 빈도를 증가시키는데에 필요한 추가의 원형질체화 단계를 포함하는 상기 기술의 상세한 설명은 안자이(Anzai)등의 문헌[Replacement of Streptomyces hygroscopicus genomic segments with in vitro altered DNA sequences, Journal of Antibiotics, 1988, vol. XLI, No. 2, pp. 226-233]에서 발견될 수 있다.
유전자 치환에 의해 돌연변이된 산업적인 균주의 개발에 필수적인 단계는 특정한 균주에서 효과적으로 작용할 통합 벡터의 구축이다. 또한, 스트렙토마이세스 염색체에서 유전자를 치환할때, 주요한 문제점중의 하나는 벡터의 제거이다. 스트렙토마이세스에 대한 선택적인 표지가 있는 에스케리치아 콜리 플라스미드는 스트렙토마이세스에서 복제할 수 없으므로 이상적인 것으로 간주된다. 이. 콜라이 플라스미드는 에스. 암보파시엔스(S. Amvofaciens) 및 에스. 리비단스(S. lividans)에서 성공적으로 사용되어왔다(키에저(Kieser, T) 및 흡우드(Hopwood, D.A.)의 문헌[1991, Genetic Manipulation of Streptomyces: Integrating Vectors and Gene Replacement, Methods in Enzymology, vol. 204, 430-458]). 그러나, 우리의 실험에서, 상기 전략은 에스. 아베르미틸리스에 낮은 효율로 통합되어 대부분 단일 교차가 발생하였다.
최근에, 스트렙토마이세스 및 이, 콜라이 둘 모두의 클로닝에서 유용하고; 스트렙토마이세스에서의 분자 유전학 기술에서 다양하게 응용할 수 있는 다수의 만능 셔틀 벡터를 개발하였다(데노야의 문헌[Novel Bacterial Plasmid Shuttle Vectors for Streptomyces sp. and Eschetichia coli, 1993년 3월 18일자로 출원된 미합중국 특허원 제 032,925 호]). 이들 셔틀은 이. 콜라이 및 많은 스트렙토마이세스 종에서 구조적으로 안정하고 효율적으로 복제되어, 넓은 크기 범위의 클로닝된 DNA 단편이 하나의 숙주에서 다른 숙주로 자유롭게 이동될 수 있게 한다. 셔틀 벡터중 3개(pCD262, pCD385 및 pCD500)는 스트렙토마이세스 중간 내지 높은 복제 수를 제어하는 스트렙토마이세스의 온도에 민감한 복제원을 갖고 있다. 이러한 리플리콘(replicon)의 온도 민감성은 스트렙토마이세스 유전자 치환 및 돌연변이 디자인 실험에서 그의 응용을 허용한다.
셔틀 벡터인 pCD262 및 pCD500 은 본원에 개시된 bkd-결핍균주의 구축에 성공적으로 사용되었다. 상기 벡터는 에스. 아베르미틸리스에서 자가 복제하는 높은 복제 수의 플라스미드로 안정적으로 유지된다. 그러나, 상기 벡터중의 임의의 것으로 형질전환된 에스. 아베르미틸리스 균주가 고온, 포자화, 또는 원형질체화 및 재생과 같은 스트레스 환경에 처했을 때, 플라스미드가 없는 다수의 콜로니를 회수할 수 있다. 에스. 아베르미틸리스의 유전자 파괴 실험에서 통합 벡터로서 pCD262 또는 pCD500중의 하나를 이용하는 것이 유리하다.
에스. 아베르미틸리스에서의 유전자 치환의 기작은 아마도 통합되게 하는 중복 또는 단일 교차 및 후속적으로 통합된 플라스미드가 절단되는 곳에서의 분리 단계이다. 중복 또는 단일 교차 둘 모두가 에스. 아베르미틸리스에서 관찰되었다. 중복 교차 및 단일 교차 두 기작 모두는 절단된 후에 동일한 생성물을 생성시켰다. 상기 접근법을 이용하여 본원에 개시된 에스. 아베르미틸리스 bkd 유전자 군집의 bkdF 유전자에 상응하는 E1-알파 개방 판독 프레임을 파괴할 수 있었다. 이러한 파괴는 BCKDH 복합체의 E1-알파 서브유니트를 암호화하는 유전자의 5' 절반에 영향을 미치는 약 1.4kb의 염색체 결실을 포함하였다. bkd 돌연변이체의 특징적인 표현형의 특징을 보이는, 생성된 돌연변이체 균주는 안정하고 발효에 의해 가치있는 신규한 아베르멕틴 생성물을 생성시키는데 사용될 수 있다.
보다 구체적으로, 사카로폴리스포라 에리트라에아에서 유래한 ermE 유전자(에리트로마이신 내성)을 갖는 에스. 아베르미틸리스 ATCC 31272 SC2 염색체에서 E1-알파 BCKDH 유전자(bkdF)의 분절을 치환시켜 bkdF 돌연변이체를 구축하였다. 상기 언급된 바와 같이, 이는 에스. 아베르미틸리스에서의 클로닝 및 유전자 치환 실험 둘 모두에서 효과적으로 작용하는 것으로 입증된 신규한 이작용성(이.콜라이/스트렙토마이세스) 벡터(pCD262)를 사용하여 수행되었다. 제7도에 도시된 바와 같이 에스. 아베르미틸리스 염색체에서 3개의 인접한 BamHI 제한 단편을 (왼쪽에서 오른쪽으로) 지도화하였다: 2.3kb, 1.4kb 및 4.1kb. 1.4kb의 BamHI 게놈 단편은 E1-알파 개방 판독 프레임(ORF-1)(유전자 bkdF)의 시작 부분을 갖고 있다. 4.1kb의 BamHI은 bkd 유전자 군집의 나머지(bkdF의 말단, bkdG 및 bkdH)를 갖고 있다.
플라스미드 pCD768은 1.4kb의 BamHI 단편의 양쪽의 2개의 에스. 아베르미틸리스 게놈 단편(2.3 및 4.1kb의 BamHI)을 갖는 셔틀 벡터 pCD262의 유도체이다(제8도). 또한 pCD768은 2.3 및 4.1kb의 BamHI 단편 사이에 위치한 ermE 표지를 갖고 있다. ermE 표지는 하향 유전자의 과다발현에 의해 가능한 어려움을 피하기위해 ORF-1(bkdF)의 배향과 반대로 위치한다. 상기 구축물은 재조합시 숙주 게놈에서 1.4kb의 결실(ORF-1)이 영향을 받는다)을 생성할 것으로 예상된다.
플라스미드 pCD768을 에스. 아베르미틸리스 ATCC 31272 SC2 숙주 원형질체로 형질전환시켰다. 에리트로마이신(erm-R)및 티오스트렙톤(tsr-R) 둘 모두에 대해 내성을 나타내는 2개의 형질전환체를 선택하였다(실시예 9 참조). 형질전환체 1(CD783)은 액상 배지에서 성장하였고 원형질체를 제조하여 에리트로마이신을 함유한 한평 배지에서 플레이팅하였다. 50개의 클론을 선택하여 더욱 분석하였다: 46개는 erm-R,tsr-R이고; 4개는 erm-R,tsr-S(pp15, pp17, pp22 및 pp40)이었다. 전자의 군에서의 2개의 클론(pp14 및 pp21, 실시예 9의 표 1 참조) 뿐만 아니라, 후자의 4개의 클론을 더욱 분석하였다. 이들 모두는 하기와 같이 bkd-결핍 표현형을 보였다: 모든 4개의 erm-R,tsr-S 클론은 ILV 최소 배지 플레이트에서 성장하지 못하였다; BCKDH 복합체의 E1 성분에 대해 분석시 활성이 탐지되지 않았다; 그리고, 발효시, S(+)-2-메탈부티르산 또는 이소부티르산중의 하나를 보충하지 않으면 천연 아베르멕틴을 합성하지 못했다(실시예 9 참조). 또한, CHC를 발효 배지에 첨가하면, 신규 아베르멕틴(CHC 아베르멕틴)이 합성되었고, bkd 차단이 아베르멕틴 생합성 세포 기작에는 영향을 미치지않음을 나타내었다(실시예 9), 상기 4개의 군중에서 하나의 클론(클론 pp15)을 공식적으로 에스. 아베르미틸리스 균주 CD794로 명명하고 본 발명의 예시로서 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁하였다. 마지막으로, 서던 하이브리드형성 분석으로 bkdF 유전자에 상응하는 ORF-1 이 에스. 아베르미틸리스 ATCC 31272 SC2에서의 유전자 치환에 대해 예상되는 바와 같이 파괴 되었음을 확인하였다(실시예 5 참조).
[실시예]
이하에서 첨부된 도면에 의해 또한 예시된 에스. 아베르미틸리스로부터 bkdFGH 유전자를 검증, 클로닝 및 분석하기 위해 사용되는 실험 공정의 예를 설명한다. 또한, 유전자 치환에 의한 2개의 bkd-결핍 돌연변이체의 구축을 개시한다. 분자 생물학에 숙련된 이에게 잘 공지된 표준 기술의 추가적인 설명, 및 사용된 특정한 효소의 명명은 예를 들면 실험실 안내서인 삼부록 등의 문헌[Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory, 1989]에 개시되어 있다.
[실시예 1]
[에스. 아베르미틸리스 게놈 DNA 의 제조]
에스. 아베르미틸리스 ATCC 31272 SC2(단일 콜로니 단리체 #2) 균사체를 29에서 7일동안 YPD-2 한천 배지상에서 배지를 갈아주면서 한층으로 배양하였다. 배지는 하기를 포함한다;
pH를 7.0으로 조절하고, 최종 부피를 1로 만들고, 121에서 25분동안 고압멸균하였다.
그런다음 균사체를 300들이 배플(baffle) 플라스크내의 30의 AS-7 배지를 접종시키기 위해 사용하고, 이를 29에서 24시간동안 진탕(230rpm)시키면서 유지시켰다(하프너(Hafner) 등의 1988년 유럽 특허원 제 88300353.5 호, 공개공보 제 0 284176 호 참조). 배지는 하기를 포함한다:
NaOH로 pH를 7.2로 조절하고, 최종 부피를 1로 만들고, 121에서 25분동안 고압멸균하였다.
1전분을 터마밀(termamyl), 코넥티컷 윌톤 소재의 노보 엔자임스(Novo Enzymes)에서 시판하는 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)에서의 알파-아밀레이즈로 처리하여 가수분해하여 제조한다.
2뉴저지 07012 클리프톤 소재의 이스트 프로덕츠, 인코포레이티드(Yeast Products, Inc.)제품.
3테네시 38108 멤피스 소재의 트레이더스 프로테인(Tradets Protein)제품.
상기 배양액의 약 0.3를 30의 개질된 액상 효모 추출물 맥아 추출물(YEME) 배지를 함유한 300들이 배플 플라스크에서 접종하는데 사용하였다(빕(Bibb, M.J.), 프리맨(Freeman, R.F.) 및 흡우드(Hopwood, D.A)의 문헌[1977, Mol. Gen. Genetics, 154:155-166]). 개질된 YEME 배지는 1당 하기 성분을 포함한다:
121에서 40분동안 고압멸균하고, 고압멸균한 후에 2의 2.5M MgCl. 6H2O를 첨가하였다.
최종 부피를 1로 맞추었다.
배양물을 29에서 48 내지 72시간동안 성장시켰다. 균사체를 원심분리하여 회수하고 게놈 DNA를 흡우드 등의 문헌[Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, U.K., 1985, Isolation of Streptomyces Total DNA by Cesium Chloride Gradient Centrifugation: Procedure 2]의 방법에 따라 준비하였다. DNA 침전물을 3의 TE 완충용액(10mM Tris-HCl, pH8.0,1mM EDTA)에 재현탁시켰다.
[실시예 2]
[에스. 아베르미틸리스 게놈 DNA 증폭의 폴리머레이즈 쇄 반응]
에스. 아베르미틸리스 게놈 DNA를 퍼킨-엘머 세투스 열 순환기를 이용하여 효소적으로 증폭시켰다. 택(Taq) 폴리머레이즈(퍼킨-엘머 세투스), 및 200μM의 dNTP, 0.5μM의 각각의 프라이머, 50ng의 주형 DNA 및 2.5 유니트의 효소가 있는 제조사에서 제공되는 완충용액을 최종 부피 100㎕에서 30회 순환시켜 PCR 반응을 수행하였다. 제1회의 열 프로파일은 95에서 3분(변성 단계), 55에서 2분(어닐링(annealing)단계) 및 72에서 2분(연장 단계)이었다. 후속적인 29회는 변성 단계가 1.5분으로 단축된 점을 제외하면 유사한 열 프로파일을 가졌다. DNA프라이머는 지노시스 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드(Genosys Biotechnologies, Inc.)(텍사스 소재)에서 제공하였다. 오른쪽 프라이머(제1도)는
이고, 왼쪽 프라이머(제1도)는
이다.
뉴클레오티드에 대한 인터내셔날 유니온 오브 바이오케미스트리(IUB)의 규칙을 DNA 서열을 개시하는데 이용하였다. 중복은 K=G+T, S=G+C 및 W=A+T와 같은 IUB 그룹 코드를 따라서 확인된다. E1-알파 bkd 유전자와 상동하지 않고 클로닝 목적으로 프라이머에 혼입된 제한 인식 서열은 밑줄쳤다(제1도 참조). 증폭된 생성물을 아가로즈 겔 전기영동하여 크기별로 분획하였다. PCR 시료를 1X TBE 완충용액(90mM Tris-HCl, pH 8.5, 90mM 붕산, 2.5mM EDTA)에 용해시킨 수평 1% 아가로즈 겔에서 삼브록 등의 문헌[1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, Cold Spring Harbor Lab, N.Y.]에서 개시된 바와 같이 100V에서 1.5시간동안 전기영동하였다. 분리된 PCR DNA 생성물을 겔에 위치시키고 에티듐 브로마이드로 염색하고 365 nm의 자외선광으로 형광 밴드를 가시화시켰다. 상기 개시한 PCR 조건하에서, 상기 프라이머 혼합물을 사용하여 단일 DNA 밴드(약 550 염기쌍 길이)를 탐지하였다.
[실시예 3]
0.55kb의 PCR 증폭된 에스. 아베르미틸리스 게놈 DNA 단편을 이. 콜라이 벡터에 클로닝시키고, 후속적으로 이. 콜라이 숙주에 형질전환시킴
A. 0.55kb PCR 생성물의 회수
상기 언급한 바와 같이, 에스. 아베르미틸리스 게놈 DNA를 주형으로 이용하고, 오른쪽 및 왼쪽 프라이머의 혼합물 이용하여 0.55kb DNA 단편을 증폭시켰다. 제1도에 도시된 바와 같이 오른쪽 프라이머는 5' 말단에 EcoRI 인식 부위를 갖고, 왼쪽 프라이머는 5' 말단에 XbaI 인식 부위를 갖는다. 0.55kb PCR 단편은 삽입체 및 클로닝 벡터 둘 모두가 EcoRI 및 XbaI으로 절단되는 라이게이션 과정을 이용하여 클로닝되었다. 증폭(실시예 2에서 개시된 바와 같이) 후에, 약 80㎕의 PCR 반응 혼합물을 1% 아가로즈 겔에 부하하고 전기영동시켰다. 0.55kb DNA 단편을 전에 개시한 바와 같이 가시화시키고 하기와 같이 전기 용출에 의해 회수하였다: 0.55kb DNA 밴드를 레이저 칼로 제거하고 DNA를 아가로즈 겔로부터 단일방향 전기용출기(인터내셔날 바이오 테크놀리지, 인코포레이티드(International Biotechnology, Inc.), 코넥티컷 뉴 해븐 소재)를 이용하여 7.5M 암모늄 아세테이트로 충진시킨 V 형 웰에서 80V, 35분간 전기용출시켜 회수하였다. 그런 다음, DNA를 에탄올로 침전시키고, 펠렛팅시키고 마지막으로 20㎕의 DNA 완충용액(10mM Tris-HCl, 4mM NaCl, 0.1mM EDTA; pH 7.5)에 재용해시켰다.
B. EcoRI 및 XbaI 제한 효소 절단
상기 회수한 PCR 물질의 총량을 공급자(베링거 만하임 바이오케미칼스(Boehringer Mannheim Biochemicals)에서 추천한 바와 같이 제한 효소 EcoRI 및 XbaI 각각 1 유니트로 동시에 절단하였다. 유사하게, 약 1㎍의 플라스미드 pGEM-3Z(위스콘신 메디슨 소재, 프로메가 코포레이션) 및 2 유니트의 제한 효소 EcoRI 및 XbaI(모든 제한 효소는 베링거 만하임 바이오케미칼스에서 구입하였다)를 공급자에 의해 특정화된 분석 완충용액에서 총 반응 부피 60㎕로 37에서 4시간동안 향온처리시켜서 선형 분자를 생성시켰다. 그런 다음, PCR 단편 및 선형화된 벡터 둘 모두를 각각 동량의 페놀- 클러러포름으로 2회, 동량의 에테르로 2회 세척하고, 마지막으로 DNA 를 2배의 무수 에탄올을 첨가하여 침전시켰다. 침전된 DNA를 10분간 10,000x g에서 원심분리하여 회수하고 진공에서 건조시켰다. 최종 PCR 단편 펠렛(pellet)을 DNA 완충용액 20㎕에 재용해 시킨 후, 최종으로 선형화된 벡터 펠렛을 DNA 완충용액 12㎕에 재용해시켰다.
C. 라이게이션하여 pCD613을 생성
약 11㎕의 EcoRI/XbaI-처리된 0.55kb PCR DNA 생성물 및 약 1㎕의 EcoRI/XbaI-선형화된 pGEM-3Z를 공급자가 제시한 조건하에서 15, 20㎕의 총 반응 부피에서 1 유니트의 라이게이즈(매사츄세츠 비버리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스, 인코포레이티드(New England Biolabs, Inc.))로 하룻밤 항온처리하였다. 분석 마이크로튜브를 얼음에 두어서 반응을 종결시키고 그런다음 반응 혼합물(20㎕)을 삼브룩 등의 문헌[1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판 Cold Spring Harbor Lab N.Y]에서 개시된 바와 같은 표준 공정에 따라 컴피튼트 이. 콜라이 DH5-알파 세포를 형질전환시키는데 이용하였다. 많은 암피실린 내성 형질전환체를 회수하였다. 플라스미드 벡터 pGEM-3Z는 베타-갈락토시데이즈의 아미노-말단 단편을 암호화하는 에스케리치아 콜리의 락(lac) 오페론에서 유래된 DNA 분절을 함유한다(야니쉬-페론(Yanisch-Perron. C), 비에이라(Vieira, J) 및 메싱(J. Messing)의 문헌[Gene, 33,103, 1985]). 이소프로필티오-베타-D-갈락토시드(IPTG)에 의해 합성이 유도될 수 있는 상기 단편은 숙주에 의해 암호화되는 베타-갈락토시데이즈의 결핍 형태와 내부-대립인자(알파) 상보적일 수 있다.
유도자인 IPTG에 노출된 이. 콜라이 세포는 효소의 단편들 둘 모두를 합성하고 발색 기질인 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-베타-D-갈락토시드(X-gal)를 함유하는 배지에 플레이팅하면 청색 콜로니를 형성한다. 외부 DNA를 플라스미드의 폴리클로닝 부위에 삽입시키면 베타-갈락토시데이즈의 아미노-말단 부분이 불활성화되고 알파-상보성이 파괴된다.
따라서, 재조합 플라스미드를 갖는 박테리아는 백색 콜로니를 생성한다. 많은 백색 콜로니를 상기 형질전환 실험에서 회수하였다. 상기 콜로니는 플라스미드 pCD613을 함유하여야만 한다. 이는 균주 CD613으로 명명된 하나의 콜로니를 선택하여 더욱 분석하여 확인하였다. 이. 콜라이 균주 CD613의 단일 박테리아 콜로니를 표준 미생물 방법에 따라 50㎍/의 암피실린을 함유한 루리아-베르타니(LB) 액상 배지에 접종시켰다. LB 배지는 하기를 포함한다:
5N NaOH로 pH를 7.0으로 조절하고, 용액의 최종 부피를 1로 조절하고, 121에서 20분간 고압멸균하여 살균하였다.
배양물을 35에서 하룻밤 배양하였다. 다음날 아침, 박테리아 세포를 4, 10,000 rpm에서 5분동안 원심분리하여 수확하였다. 플라스미드 벡터를 새로 수확한 에스케리치아 콜리 CD613 세포로부터 데노야 등의 문헌[Microbios Lett., 1985, 29:87-93]에서 개시된 바와 같이 빈보임(Birnboim) 및 돌리(Doly)의 방법[Nucleic Acids Res., 1979, 7:1513-1523]을 개질하여 단리하였다. 단리된 플라스미드 DNA를 최종적으로 DNA 완충용액(10mM Tris-HCl, 4mM NaCl, 0.1mM EDTA; pH 7.5)에 용해시켜서 완충 용액 10㎕당 1㎍의 pCD613으로 농축시켰다. EcoRI 및 XbaI을 사용한 제한 분석법은 예상한 바와 같이 pCD613이 0.55kb의 DNA 삽입체를 갖고있음을 나타낸다.
[실시예 4]
[균일하게 방사능표지된 이중가닥 DNA 프로브의 제조]
이중가닥 DNA 프로브를 닉(nick) 해독(이 기술의 일반적인 설명을 위해서는 삼브록 등의 문헌[1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2판, Cold Spring Harbor Lab, N.Y]참조)에 의해 제조되었다. 먼저, 표적 서열을 갖는 특정한 DNA 단편을 적절한 제한 효소 절단에 의해 제조하고 실시예 1에서 개시된 바와 같은 전기 용출을 이용하여 정제하였다. 각 경우에 엔이엔-듀풍(NEN-Dupont)에서 구입한 [알파-32P]-dCTP(데옥시사이티딘 5'-트리포스페이트, 테트라(트리에틸암모늄)염, [알파-32P]-), 및 비알엘 라이프 테크놀로지스, 인코포레이티드(BRL Life Technologies, Inc.)에서 구입한 비알엘 닉 해독 시스템을 이용하여 공급사의 지시에 따라 약 1㎍의 DNA를 표지화하였다. 전형적인 반응은 50㎕의 부피에서 수행되었다. 5㎕의 스톱(Stop) 완층용액을 첨가한 후에(비알엘의 추천 방법에서 개시된 바와 같이), 공급사의 지시에 따라 스트라타진(Stratagene)의 푸쉬 컬럼을 이용하여 혼입되지 않은 뉴클레오티드로부터 표지된 DNA를 분리시켰다. 비활성도가 108cpm/㎍을 초과하는32P-표지된 DNA를 상기 방법에 따라 통상적으로 수득하였다.
[실시예 5]
[서던 하이브리드형성에 의한 에스. 아베르미틸리스 게놈 DNA의 분석]
약 10의 정제된 에스. 아베르미틸리스 게놈 DNA를 37에서 2 유니트의 제한 효소 BamHI 으로 최소 2시간동안 절단시켰다. 절단 말기에, DNA 단편을 1% 아가로즈 겔을 통해 전기영동시켜 분리시키고(실시예 1A 참조), 모세관 이동 방법(서던(Southern, E.M.)의 문헌[J. Mol. Biol., 98:503])을 사용하여 하룻밤동안 나일론 막(공극 크기 0.45㎛)(슬레이러 앤드 슈엘 니트란(Schleicher and Schuell Nytran)막)으로 이동시켰다. 다음날, 나일론 막을 플라스택 랩으로 싸고, 각 막의 DNA가 있는 면을 자외선 조사원(302nm)에 노출시켜 DNA를 막에 고정시켰다. 방사능표지된 RNA 또는 DNA 프로브의 나일론 막에 고정된 DNA에 대한 하이브리드형성은 삼브룩 등이 개시한 방법(1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2판, Cold Spring Harbor Lab, N.Y.)(본원에서는 삼브룩 등의 매뉴얼로 언급됨)에 따라 수행된다. 예비하이브리드 형성 및 하이브리드형성은 실온에서 15분간 2회 세척, 0.1x SSC, 0.1SDS로 42에서 수행되었다. 하이브리드형성 용액은 6X SSC(1x; 0.15M NaCl, 15mM 시트르산 나트륨, pH 7.0), 10X 덴나트(Denhardt)의 시약[1x:0.02% 피콜, 0.02% 폴리비닐 피롤리돈, 0.02% 소의 혈청 알부민], 1% SDS(나트륨 도데실 설페이트), 100/의 변성된 단편인 연어 정자 DNA, 100/의 이. 콜라이 tRNA, 및 50%의 포름아미드(플루카(Fluka))를 함유한다. 하룻밤 하이브리드형성후, 막을 하기와 같이 세척한다: 1x SSC, 0.1% SDS로 42에서 15분간 2회 세척. 일부 실험에서 하이브리드 형성은 포름아미드없이 65에서, 및 SSC 대신 SSPE(1x:0.18 M NaCl, 10mM NaPo4, pH 7.7, 1mM EDTA)를 사용하여 수행되었다. 마지막으로 막을 X-선 필름에 노출시켜서 방사선 사진 영상을 수득하였다.
[실시예 6]
[DNA 서열화]
A. 플라스미드 pCD613이 갖고 있는 이중가닥 DNA PCR 생성물의 서열화
슈퍼코일링(supercoiling)된 플라스미드 pCD613을 실시예 2에서 개시된 바와 같이 제조하였다. 약 4의 이중가닥 pCD613을 서열화시키기 전에 단일가닥 형태로 전환시켰다. 이는 택 트랙 서열화 시스템스 테크니칼 매뉴알(Taq Track Sequencing Systems Technical Manual, 위스콘신 매디슨 소재의 프로메가 코포레이션 제품)에 개시된 바와 같은 알칼리 변성에 의해 수행하였다. 올리고뉴클레오티드 서열화 프라이머를 지노시스 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드(텍사스 소재)에서 합성하였다. 벡터 프라이머1(5'-AAGGATCCTGCAGCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGA-3')는 pGEM-3Z 다중 클로닝 부위(MCS)의 EcoRI 부위의 상부(위치 2689-2712)를 지도화하였고, 프라이머
2(5'-AAGGATCCTGCAGACAGCTATGACCATGATTACGCCA-3')는 MCS의 HindIII 부위의 하부(위치 91-114)를 지도화하였다.
B. pCD613-유래된 0.35kb Sall에스. 아베르미틸리스 게놈 단편을 박테리오파지 M13에 클로닝시키고 DNA 서열화함
상기 개시된 바와 같이, 제한 분석은 PCR-유래된 게놈 단편 CD613이 내부에 0.35kb Sall 단편을 함유함을 나타내었다. 상기 0.35kb Sall에스. 아베르미틸리스 DNA 단편을 상거(Sanger)의 디데옥시 서열화 방법(상거 등의 문헌[1977, Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 74:5463-5467])에서 주형으로 사용될 수 있는 단일가닥 재조합 DNA를 제조하기 위해 박테리오파지 M13mp18에 클로닝하였다. 상기 개시한 바와 같은 미니프렙 방법에 따라 제조된 약 2의 플라스미드 pCD613을 제한 효소 Sall으로 37에서 2시간동안 절단시켜 0.35kb 에스. 아베르미틸리스 게놈 단편을 방출하게 하였다. 절단된 혼합물을 1.2% 아가로즈겔에서 전기영동시키고 0.35kb 단편을 전기용출시키고 상기 개시한 바와 같이 침전시켰다. 또한, 약 1의 정제된 이중가닥 복제형(RF)M13mp18 DNA 를 Sall으로 절단시키고, 송아지의 장 알칼리성 포스파테이즈(CIAP)(위스콘신 매디슨 소재의 프로메가 코포레이션 제품)로 탈인 산화시키고, 마지막으로 상기 개시된 바와 같이 0.35kb DNA 에 라이게이션시켰다. 정제된 RF M13 클로닝 벡터를 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)에서 구입하였다. 라이게이션 혼합물을 컴피튼트 이. 콜라이 JM 109 세포를 형질감염시키기 위해 사용하였다. 여러 백색 플라크를 회수하였다. 반대로 배향된 삽입체를 갖는 mp18 형질 감염체로부터 2개의 단일 백색 플라크를 선별하고, 파지를 성장시키고, 단일가닥 DNA를 삼브룩 등의 매뉴얼에서 개시된 바와 같이 제조하였다. M13-특이형-40 서열 프라이머(뉴 잉글랜드 바이오랩스, 카탈로그 번호 1212), 데옥시아데노신 5'[-알파-티오]트리포스페이트[35S](엔이엔-듀풍) 및 탁트랙 서열화 키트(프로메가)를 이용하여 공급자(프로메가)가 제공한 지시를 따라 각각의 단일가닥 DNA 주형의 DNA를 서열화하였다.
C. bkdF 유전자의 부분을 갖는 클로닝된 4.1kb BamHI 단편에 위치하는 일부 게놈 영역의 트란스포손(transposon)에 의해 용이해진 서열화
미니-감마-델타-1 트란스포손 삽입체를 에스. 아베르미틸리스로부터 클로닝된 4.1kb BamHI 게놈 단편에서 bkdF 개방 판독 프레임의 하부에 위치한 DNA 영역을 서열화시키는데 이용하였다. 미니-감마-델타-1 요소는 Tn5의 kan 유전자, 및 감마-델타 말단중의 하나의 2회 40bp 역상 반복체 사이에 클로닝된 감마-델타에서의 분리(res) 부위를 함유하는 작은(1.8bk) 감마-델타(Tn1000) 유도체이다(베르그(Berg. C.M.)등의 문헌[1992, Gene, 113:9-16]). 미니-감마-델타-1은 트란스포세이즈(transposase) 및 리졸베이스(resolvase)가 결핍되어 있으므로 전위 및 분리 기능을 숙주에 의존한다. 따라서, 보조 트란스포손이 결핍된 균주에서는 미니-감마-델타-1은 전위할 수 없으므로, 삽입체가 안정하다. 역상 반복 말단의 내부는 DNA 서열화를 위한 프라이머-결합 부위로서 사용될 수 있는 독특한 서열이다. 트란스포손 삽입체를 베르그 등의 문헌[1993, Methods in Enzymology, Academic Press, vol. 218, p279-306]에서 개시한 바와 같이 준비하였다. 삽입된 트란스포손은 각각 삽입된 양 부위에 위치한 스트렙토마이세스 DNA 를 서열화시키기 위한 초기 주형으로서 사용하였다. 2개의 공통 프라이머를 사용하였다: res 프라이머(5'-GTAGGGAGCCTGATATG-3') 및 kan프라이머 (5'-GCTATCCGCGCATCCAT-3'). A3(클론 CD785) 및 A5(클론 CD786)으로 명명된 2개의 미니-감마-델타-1 삽입체를 bkdF ORF를 함유한 BamHI 말단에서 각각 약 1.7kb 및 3kb에 위치시켰다. 각각의 삽입체의 양쪽 말단에서 수행된 DNA 서열화는 A3 삽입체(서열 CD785)가 E1-베타 ORF(bkdG)의 말단에 가까이 위치하고(제5도), A5 삽입체(서열 CD786)가 E2 ORF(bkdH)의 말단에 위치함을 나타낸다(제6도).
[실시예 7]
[전체 bkd 에스. 아베르미틸리스 유전자 군집의 클로닝 및 염색체 지도의 구축]
약 4의 정제된 pCD613을 SalI 제한 효소를 이용하여 절단시키고 DNA 단편을 1.2% 아가로즈 겔에서 전기영동시켜 분리하였다. 에스. 아베르미틸리스 bkdF E1-알파 유전자에 특이적인 서열을 갖고 있는 약 0.35kb SalI DNA 단편을 전기용출하여 회수하고 상기 개시한 바와 같이 닉 해독시켜 표지화시켰다. 그런 다음, [32P]-표지된 DNA 단편을 에스. 아베르미틸리스 게놈 코즈미드 라이브러리를 스크린하기 위한 프로브로 이용하였다. 일반적으로 게놈 라이브러리를 제조하기 위한 상세한 설명은 삼브룩 등의 메뉴얼에서 발견된다. 스트렙토마이세티스 염색체 라이브러리 제조의 완전한 설명은 흡우드 등의 문헌[1985, Genetic Manipulation of Streptomyces A Laboratory Manual]에 제시된다. 코즈미드 벡터의 설정은 데노야 등의 1993년 4월 16일자로 출원한 미합중국 특허원 제 048,719 호의 Cosmid Vectors for Streptomyces Genomic DNA cloning에서 발견된다.
2200개 이상의 재조합 라이브러리 클론을 스크린한 후에, 10개의 클론을 확인하였다. 10개의 하이브리드 클론(이. 콜라이 클론CD519, CD521, CD691, CD692, CD694, CD695, CD696, CD697, CD698 및 CD699로서 기록됨)을 LB 액상 배지에서 배양하고 플라스미드를 상기 개시한 바와 같이 각 배양엑에서 준비하였다. 제한 및 서던 블럿 하이브리드형성 분석은 10개의 클론이 겹쳐진 염색체 영역을 갖고 연관되어있음을 밝혔다. 흥미롭게도, 상기 열거된 코즈미드 쿨론중의 2개, 즉 CD519 및 CD521은 또한 bkdA 프로브를 사용하여 검증된 코즈미드 클론의 목록에도 포함되어 있다(상기 언급된 데노야의 미합중국 특허원 제 08/100,518 호 참조). CD613의 서열을 포함하는 전체 염색체 영역을 포함하는 에스. 아베르미틸리스 게놈 제한 지도는 하기 표준 방법에 따라 수득되었고, 제2도에 제시되어 있다. 제2도는 또한 본원에서 개시된 신규 bkd 유전자와 이전에 개시된 유전자(데노야의 1993년 7월 30일자로 출원된 미합중국 특허원 제 08/100,518 호) 사이에 연관이 있음을 나타낸다. 2개의 bkd 유전자 군집은 약 12kb 떨어져서 위치된다.
[실시예 8]
[셔틀 벡터를 이용한 스터렙토마이세스 리비단스(이하, 에스. 리비단스로 약칭하기도 함)의 형질전환 및 에스. 리비단스 형질전환체로부터 플라스미드 벡터의 대규모 제조]
에스. 리비단스 균주 TK64를 이 실험에서 이용하였다. 에스. 리비단스의 성장 및 원형질체화용 배지 및 원형질체의 제조 및 형질전환은 흡우드 등의 문헌[Genetic Manipulation of Streptomyces-a laboratory manual, 1985, The John Innes Foundation, Norwich, U.K]에서 개시한 바와 같이 수행하였다. 또한, 이 문헌은 에스. 리비단스 균주 TK64의 완전한 설명을 제공한다. 셔틀 벡터 pCD262 또는 다수의 유도체로 직접적으로 형질전환된 에스. 리비단스 원형질체는 티오스트렙톤 내성에 대해 선택되었다. 플라스미드 DNA를 하기와 같이 선택된 형질전환체로부터 제조하였다: 배양물을 액상 YEME 배지에서 성장시켰다(빕(Bibb, M.J.), 프리맨(Freeman, R.F.) 및 흡우드(D.A.Hopwood)의 문헌[1977, Mol. Gen. Genetics. 154:155-166]). YEME 배지는 1리터당 3g의 효모 추출물, 5g의 박토-펩톤, 3g 의 맥아 추출물, 340g의 슈크로즈를 함유한다. 고압멸균시킨후에, 2의 2.5M MgCl2. 6H2O를 첨가하였다. 배양물을 30에서 40 내지 48시간동안 성장시켰다. 스트렙토마이세티스 세포 500배양물로부터 균사체를 원심분리하여 회수하고 최종 50부피의 라이소자임 용액(0.3M 슈크로즈, 0.025M 트리스-HCl(pH8.0) 및 0.025M EDTA 중의 2㎎/라이소자임)에 재현탁시켰다. 이 단계후에, 플라스미드를 매뉴얼[Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, 1985, The John Innes Foundation, Norwich, 1985]에 개시된 알칼리성 세포 용해 방법에 따라 제조하였다. DNA 펠렛을 500의 10mM 트리스-HCl, pH 8.0 1mM EDTA에 재용해시키고 삼부룩 등의 매뉴얼에 개시된 바와 같이 세슘 클로라이드-에티듐 브로마이드 구배 초원심분리에 의해 더욱 정제하였다. 단리된 플라스미드 DNA를 최종적으로 DNA 완충용액 (10mM 트리스-HCl, 4mM NaCl, 0.1mM EDTA; pH 7.5)에 용해시켜서 완충용액 10㎕당 약 1의 플라스미드의 농도가 되게 한다.
[실시예 9]
[에스. 아베르미틸리스 bkdF 돌연변이체의 구축]
염색체 결실을 도입시키는 데 사용되는 기술은 사카로마이세스 세레비시아에, 에스케리치아 콜리 및 바실러스 섭틸리스에서 사용되는 유전자 치환 방법의 변형이다.(쉐레(Scherer, S) 및 데이비스(R.W.Davis)의 문헌[1979, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 76:4951-4955; 쇼틀(Shortle, D)의 문헌[1982, Science, 217:371-373; 스탈(Stahl, M.L.) 및 페라리(Ferrari, E.)등의 문헌[1984, J. Bacteriol., 158:411-418]). 특히 스트렙토마이세스에 이용되는 상기 기술의 일반적인 설명은 키에저 및 흡우드의 리뷰 문헌[Genetic Manipulation of Streptomyces: Integrating Vectors and Gene Replacement, 1991, Methods in Ezymology, vol. 204, 430-458]에서 발견된다. 또한, 단일 콜로니를 단리시키고 플라스미드 제거의 빈도를 증가시키는데 필요한 추가의 원형질체화 단계를 포함하는 상기 기술의 상세한 설명은 안자이(Anzai)등의 문헌[Replacement of Streptomyces hygroscopicus genomic segments with in vitro altered DNA Sequences, The Journal of Antibiotics, 1988, vol. XLI, No2, pp. 226-233]에서 발견할 수 있다. 원형질체화 및 재생 단계는 종종 플라스미드의 손실을 촉진시킨다. 그러나, 대부분의 이작용성(이콜라이/스트렙토마이세스) 벡터(예를들면 상기 작업에서 사용되는 pCD 262)는 1 또는 2회의 비선택적 성장후에 종종 플라스미드가 없는 세포를 생성시킨다(키에저 및 흡우드의 문헌[1991, Methods in Enzymology. vol. 204, 430-458]).
A. bkdF 유전자의 불활성화된 복제를 갖는 셔틀 벡터의 구축
제7도에서 도시된 바와 같이, bkd 유전자 군집을 포함하는 에스. 아베르미틸리스 염색체에서 3개의 인접한 BamHI 제한 단편을 2.3kb, 1.4kb 및 4.1kb(왼쪽에서 오른쪽으로)로 지도화하였다. 1.4kb BamHI 게놈 단편은 E1-알파 개방 판독 프레임(ORF-1)(bkdF)의 시작 부분을 갖는다. 4.1kb BamHI은 bkd 유전자 군집의 나머지(bkdF 의 말단, bkdG 및 bkdH)를 갖는다. 3개의 제한 단편 각각을 이. 콜라이 벡터 pGEM-3Z에 서브클로닝하였다. 결과로서 2.3kb BamHI 단편을 갖는 플라스미드 pCD740; 1.4kb BamHI 단편을 갖는 플라스미드 pCD854; 4.1kb BamHI 단편을 갖는 플라스미드 pCD713을 구축하였다(제2도 참조). bkdF 유전자의 불활성화된 복제를 갖는 벡터의 구축은 2단계로 수행되었다. 먼저, 4.1kb BamHI 에스. 아베르미틸리스 단편, 및 항생제 에리트로마이신에 대한 내성을 주는 ermE 표지를 갖는 1.6kb BglII 단편 둘 모두를 셔틀 벡터 pCD262에 하기와 같이 클로닝하였다(데노야의 1993년 3월 18일자로 출원한 미합중국 특허원 제 032,925 호, Novel Bacterial Plasmid Shuttle Vectors for Streptomyces sp. and Escherichia coli]; 약 1.5의 플라스미드 pCD713을 제한 효소인 BamHI으로 절단하여 0.8% 아가로즈 겔에서 전기영동하였다. 전기영동후에, 4.1kb BamHI 단편을 진클린II(GeneCleanII)키트를 이용하여 겔에서 제조자(바이오 101 인코포레이티드(Bio 101 Inc.), 켈리포니아 라졸라 소재)가 추천한 방법으로 회수하였다. 유사하게, 약 2의 pIJ4026을 제한 효소인 BglII으로 절단하여 0.8% 아가로즈 겔에서 전기영동한다. 플라스미드 pIJ4026은 사카로폴리스포라 에리트라에아(이전에는 스트렙토마이세스 에리트라에오스(Streptomyces erythraeus))의 ermE 유전자를 갖는 이. 콜라이 클로닝 벡터 pUC18의 유도체이다(빕등의 문헌[1985, Gene, 41:357-368] 및 흡우드 등의 문헌[Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, 1985, The John Innes Foundation, Norwich, U,K.]참조). 전기영동후에, 1.6kb BglII 단편을 진클린II 키트를 이용하여 겔에서 제조자(바이오 101 인코포레이티드, 캘리포니아 라 졸라 소재)가 추천한 방법으로 회수하였다. 또한, 정제된 플라스미드 pCD262의 분취액을 제한 효소 BglII으로 선형화시키고, 송아지의 장 알칼리성 포스파테이즈(CIAP)(위스콘신 매디슨 소재의 프로메가 코포레이션에서 구입)로 탈인산화시키고, 마지막으로 상기 개시된 4.1kb BamHI 및 1.6kb BglII의 정제된 단편에 라이게이션하였다. 라이게이션 반응은 분석용 마이크로튜브를 얼음에 둠으로써 종결되고, 그런다음 반응 혼합물(20㎕)을 실시예 1에서 개시된 바와 같은 표준 공정을 따라 컴피튼트 이. 콜라이 DH5-알파 세포를 형질전환시키는데 이용하였다. 많은 암피실린-내성 형질전환체를 회수하였다. 이들 콜로니는 플라스미드 pCD761을 함유하여야만 한다. 이는 균주 CD761로 명명된 하나의 콜로니를 선택하고 상기 균주로부터 회수된 재조합 플라스미드를 여러 제한 효소로 더욱 분석하여 확인되었다. 플라스미드 pCD761은, 둘 모두 제7도에 도시된 바와 같이 배향된 4.1kb 에스.아베르미틸리스 BamHI 게놈 단편, 및 ermE 표지를 갖는 1.6kb BglII DNA 단편 둘 모두를 갖고 있는, 셔틀 벡터 pCD262의 유도체이다.
두번째로, 플라스미드 pCD740을 BglII으로 선형화하고, CLAP로 탈인산화시키고, 플라스미드 pCD740으로부터 단리한 2.3kb BamHI 에스.아베르미틸리스 단편에 라이게이션하였다. 라이게이션 반응은 분석용 마이크로튜브를 얼음에 둠으로써 종결되고, 그런 다음 반응 혼합물(20㎕)을 실시예 1에서 개시된 바와 같은 표준 공정을 따라 컴피튼트 이. 콜라이 DH5-알파 세포를 형질전환시키는데 이용하였다. 많은 암피실린-내성 형질전환체를 수득하였다. 이들 콜로니들은 플라스미드 pCD768을 함유하여야만 한다. 이는 균주 CD768로 명명된 하나의 콜로니를 선택하고 상기 균주로부터 회수된 재조합 플라스미드를 여러 제한 효소로 더욱 분석하여 확인되었다. 플라스미드 pCD768은 야생형 염색체에서는 1.4kb BamHI 단편의 각각의 측면에 인접한 2개의 에스.아베르미틸리스 게놈 단편(2.3 및 4.1kb의 BamHI)을 갖고 있는 셔틀 벡터 pCD262의 유도체이다. 또한, pCD768은 2.3과 4.1kb BamHI 단편 사이에 위치한 ermE 표지를 갖는다. ermE 표지는 하향 유전자의 과발현에 의해 일어날 수 있는 곤란함을 피하기 위해 ORF-1(bkdF)와 반대로 배향되어 놓여있다. 상기 구축물은 재조합시 숙주 게놈에서 bkdF 유전자의 5'말단에 영향을 미치는 1.4kb를 결실시킨다.
B. 셔틀 벡터를 이용한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 형질전환
에스. 아베르미틸리스 원형질체를 형질전환시키는데 이용되는 셔틀 벡터(pCD262, pCD768)를, 형질전환된 이.콜라이 DH5-알파 또는 이. 콜라이 CD167세포(균주 CD167은 이. 콜라이 GM2163으로부터 유도된 단일 콜로니 단리물-이는 예일 대학의 이. 콜라이 유전자 저장 센터의 큐레이터인 닥터 바크만으로부터 수득하였다)(실시예 1 참조)또는 형질전환된 에스. 리비단스 TK64 세포(실시예 8 참조)로부터 제조하였다.
에스. 아베르미틸리스 균주 ATCC 31272 단일 콜로니 단리물 #2(SC2)를 이용하였다. 에스. 아베르미틸리스 원형질체의 제조에 3개의 다른 접종원을 이용하였다: 1. 포자(흡우드 등의 문헌[1985, Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, U,K.]에서 개시된 바와 같이 제조), 2. 냉동 음파 분쇄시킨 균사체(하기 제조 참조) 및 3. YPD-2 한천상의 콜로니(실시예 1 참조). 냉동 음파분쇄된 균사체를 하기와 같이 제조하였다: 균사체 배양물을 트립티케이즈 콩 브로쓰(TSB)에서 600nm에서의 혼탁도가 2 내지 9가 될 때까지 성장시킨후 유리 조직 분쇄기를 이용하여 10회 균질화시켰다. 균질화된 균사체를 TSB 에 2배로 희석시키고 20를 멸균한 폴리프로필렌 원심분리 튜브에 첨가하였다. 초음파 프로브(브론윌 바이오소닉(Bronwill Biosonik) III)를 액체속에 1 내지 2㎝ 깊이로 담그고, 시료를 50% 강도(최대 와트의 절반)에서 10초간 음파분쇄하였다. 음파분쇄하여 균사체 덩어리를 서브배양시 기하급수적으로 빨리 성장하는 단일 또는 이중 세포 단위로 분산시켰다. 음파분쇄된 균사체 제조물을 최종 농도 40% 글리세롤로 희석시키고, 바이알로 피펫팅하고, -85에서 냉동시켰다. 포자, 균사체 또는 균질화된 콜로니를 0.5% 글라이신을 함유한 YEME 배지에 접종시켰다(실시예 1 참조). 에스. 아베르미틸리스 원형질체의 제조 및 형질전환 방법은 맥네일(MacNeil, D.J.) 및 클랍코(Klapko, L.M)의 문헌[J. Industrial Microbiol., 1987, 2,209-218]에서 개시된 바와 같이 수행한 후 흡우드 등의 문헌[Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, 1985, The John Innes Foundation, Norwich, U,K.]에서 개시된 바와 같이 변형하였다. 셔틀 벡터인 pCD262 또는 pCD768과 같은 유도체로 형질전환된 에스. 아베르미틸리스 원형질체는 각각 티오스트렙톤 또는 에리트로마이신 내성에 대해 선택되었다.
C. pCD768을 이용한 에스. 아베르미틸리스의 에리트로마이신-내성, 티오스트렙톤-민감성 돌연변이체의 단리
플라스미드 pCD768을 상기 개시한 바와 같이 에스. 아베르미틸리스 ATCC 31272 SC2의 원형질체로 형질전환시켰다. 에스. 아베르미틸리스의 1차 형질전환체를 재생 배치(RM14) 플레이트상에서당 4의 에리트로마이신으로 선택하였다(배지 조성에 관하여는 상기한 바를 참조). 2개의 에리트로마이신-내성(erm-R) 형질전환체(1 및 2)를 4/의 에리트로마이신 또는 4/의 티오스트렙톤 둘중 하나를 함유한 YPD-2 한천 플레이트에 찍었다(실시예 1 참조). 두 형질전환체는 모두 항생제둘 모두에 대해 내성이 있었다(erm-R, tsr-R). 형질전환체 1(에스. 아베르미틸리스 균주 CD783으로 명명)를 더욱 작업하기 위해 선택하였다. 상기 균주를 YEME 액상 배지에서 성장시키고 원형질체를 제조하여 에리트로마이신(4/)을 함유한 재생 배지 플레이트상에 플레이팅하였다. 단일 콜로니를 확실히 단리시키고 플라스미드 손실을 증가시키기 위해 상기 원형질체 재생 단계를 포함하였다(안자이 등의 문헌[1988, Replacement of Streptomyces hygroscopicus genomic segments with in vitro altered DNA Sequences, The Journal of Antibiotics, vol. XLI, No2, pp. 226-233]). 다수의 콜로니를 재생시켰고 50개의 클론을 에리트로마이신 또는 티오스트렙톤을 함유한 플레이트에 찍었다. 50개의 콜로니중에서 46개가 티오스트렙톤상에서 성장할 수 있었다. 요약하자면, 46개의 콜로니가 erm-R, tsr-R이고 오직 4개의 콜로니가 erm-R, tsr-S이었다. erm-R, tsr-S 콜로니는 통합형성(중복 교차) 및 유리 리플리콘 손실 후에 예상되는 표현형을 나타내었다. 따라서, erm-R 및 tsr-R(대조군으로 사용)(pp14 및 pp21)인 2개의 클론과 함께, erm-R 및 tsr-S 표현형을 나타내는 4개의 클론(pp15, pp17, pp22 및 pp40)을 더욱 분석하였다.
D. 에스. 아베르미틸리스 bkdF 돌연변이체: bkdF 유전자의 5' 말단에 영향을 미치는 염색체 결실을 갖는 에스. 아베르미틸리스의 표현형
하기 분석을 수행하였다: 1. 유일한 탄소(C)원으로서 이소루신, 루신 및 발린(ILV)을 함유란 최소 배지 한천 플레이트상에서 성장할 수 있는 능력; 2. 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈(BCKDH) E1 활성의 분석; 및 3. 발효동안 천연 및 신규 아베르멕틴을 생성할 수 있는 능력. 이들 방법의 설명은 다음과 같다:
1. ILV 플레이트: 전통적인 M9 최소 배지의 변형(안데르슨(Anderson, E.H)의 문헌[1946, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 32:120-128]을 사용하였다. 변형된 M9 배지는 1리터당 아가로즈(시켐엠이, 에프엠씨 바이오프로덕츠(SeaKem ME, FMC BioProducts),메인록랜드 소재) 7.5g 및 증류수 650을 함유한다. 121에서 15분간 고압멸균하였다. 냉각시킨후, 하기 멸균 용액을 첨가하였다:
pH를 7.0으로 조절하였다.
최종 부피는 1이다.
플레이트당 약 25를 부었다.
하기 염을 탈이온수에 최종 부피가 1.2가 되게 녹여 25xM9 염 용액을 제조하였다:
pH를 7.0으로 조절하였다.
염 용액을 160의 분취액으로 분할하고 121에서 15분간 고압멸균하여 살균하였다.
미네랄 저장 용액은 하기를 포함한다:
121에서 15분간 고압멸균하였다.
ILV 혼합물을 각각 10g의 L-이소루신, L-루신 및 L-발린을 1의 탈이온수에 용해시켜 제조하였다. 혼합물을 여과하여 살균하였다.
상기 플레이트 상에서는 bkd-결핍 돌연변이체가 성장할 수 없었다. ILV 비이용자를 29에서 14일동안 배양한 후에 세었다.
2. BCKDH E1 분석법: BCKDH E1 활성을 상기 개시한 방사능화학적 분석법의 변형판에 의해 결정하였다(하프너(Hafner, E.W)등의 문헌[1991, J. Antibiotics, 44:349-356]). 선택된 단리물을 YPD-2 한천 플레이트에서 29에서 6 내지 7일 동안 성장시켰다. 성장후에, 멸균된 이쑤시개를 이용하여 YPD-2 한천 플레이트상에서 성장하는 콜로니 각각으로부터 핀머리 크기의 세포 덩어리를 찍어서 15의 유리 신틸레이션 바이알의 바닥으로 이동시켰다. 세포를 재현탁시키고 100㎕의 톨루엔/알파-[1-14C]케토이소카프로에이트 혼합물(하기 개시한 바와 같이 제조)을 첨가하여 침투가능하게 하였다. 바이알의 입구를 즉시 솔베이블(Solvable)(엔이엔-듀퐁에서 구입한 조직 및 겔 안정화제)이 스며든 와트만 4CHR 종이(와트만 카탈로그 번호 3004614)로 덮었다. 그런다음 플라스틱 뚜껑을 바이알에 단단하게 위치시키고, 뚜껑 및 바이알의 위쪽 절반을 파라필름으로 감싸고 부드럽게 진탕시키면서 29에서 3.5시간동안 항온처리하였다. 항온처리가 종결될때, 방사능활성을 결정하기 위해 여과지를 4의 레디 세이프(Ready safe)(베크만) 액상 신틸레이션 칵테일을 함유한 7의 유리 신틸레이션 바이알로 이동시켰다. 용매에서 4시간 이상 평형화시킨후, 방사능활성을 측정하였다. 톨루엔/알파-[1-14C]케토이소카프로에이트 혼합물을 22㎕의 알파-[1-14C]케토이소카프로에이트 저장 용액을 5% 톨루엔을 함유한 1의 M9 염 배지에 첨가하여 음파분쇄하여 톨루엔을 유백색 분산액으로 생성시켰다(데이비드(David R.W.)의 문헌[1980, 부록 1: Media, drug concentrations, and nutritional supplements in A Manual for genetic Engineering - Advanced Bacterial Genetics, p. 203, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y]). 알파-[1-14C]케토이소카프로에이트 저장 용액을 2.8㎕의 20mM 알파-케토이소카프로에이트(나트륨 염, 시그마 K-0629), 50㎕의 알파-[1-14C]케토이소카프로에이트(55mCi/mmol, 50마이크로큐리/, 애머샴) 및 충분한 H2O를 최종 부피가 1가 되게 혼합하여 제조하였다. 단백질 농도를 바이오-래드 단백질 분석법(바이오-래드 레보라토리즈, 캘리포니아 리치몬드 소재)을 사용하여 결정하였고, 이는 브레드포드 염료-결합 방법을 기준으로 한다(브레드포드(Bradford, M.)의 문헌[Anal. biochem., 72:248, 1976]). 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈의 E1성분의 비활성도를 단백질 ㎎당 분당 발생하는CO2피코몰로서 표현한다(표 1).
3. 아베르멕틴 생성: 신선한 변형(변형은 일상적인 YPD-2 배지에서 아세테이트를 생략한 것으로 구성된다. 실시예 1 참조)된 YPD-2 한천 플레이트상에서 5 내지 7일 동안 성장시킨 에스. 아베르미틸리스 ATCC 31272 SC2 또는 에스. 아베르미틸리스 균주 CD794(bkdF) 중의 하나의 균사체를 8의 최소 정의된 배지를 함유하는 50(1x6인치) 배양 튜브에 접종시켰다. 그런 다음, 튜브를 29에서 72시간동안 200rpm으로 45°각을 주어 진탕시켰다. 성장시킨 후에, 종자 배양물의 2분취액을 다양한 지방산이 추가될 수 있는 최소 정의된 배지 25를 함유하는 새로운 300플라스크를 접종시키는데 이용하였다. 발효 배지는 묽은 감자 수용성 전분 대신에 가수분해된 전분(114g/)을 사용하고, 루신 및 NaCl을 생략시키고, 글라이신(2g/)을 첨가한 점을 제외하고는 상기 개시된 바와 같이 구성되었다. 일부 발효에서는, S(+)-2-메틸부티르산 또는 사이클로헥산 카복실산(CHC)를 배지에 첨가하였다(최종 농도 0.04%). 29에서 12일동안 진탕(200rpm)한 후에, 플라스크의 내용물을 4배 부피의 아세토니트릴-메탄올(7:118) 용매 혼합물로 추출하고, 상층액을 고성능 액상 크로마토그래피(HPLC)로 아베르멕틴에 대해 분석하였다. HPLC 분석을 0.75/분의 유속 및 240nm에서의 흡광 측정으로 탐지하여 베크만 5울트라스피어 ODS C-18 컬럼(4.6mm x 25㎝)을 이용하여 수행하였다. 이동상은 물(178), 아세토니트릴(102) 및 최종 2을 채우는 메탄올이었다.
하기 표 1은 상기 결과들을 요약한다. 유리 리플리콘을 결실한 4개의 티오스테렙톤-민감성 클론은 하기와 같은 전형적인 bkd-결핍 표현형을 보였다: 모든 4개의 클론은 ILV 최소 배지 플레이트상에서 성장할 수 없고 BCKDH 복합체의 E1 성분에 대해 분석시 활성이 없었다. 발효 연구결과, 차단된 배양물은 천연 아베르멕틴을 합성할 수 없었다. 또한, S(+)-2-메틸부티르산을 발효 배지에 첨가하였을때(최종 농도, 0.04%) 사이클로헥산 카복실산(CHC)을 첨가하면 신규한 CHC-아베르멕틴이 형성되었다. 상기 발효 결과는 bkd 차단이 아베르멕틴 생합성의 세포 기작에 영향을 미치지않음을 나타낸다. 상기 4군중의 하나의 클론(클론 pp15, 표 1 참조)은 공식적으로 에스. 아베르미틸리스 균주 CD794로 명명되고 본 발명의 예로서 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되었다. 기탁에 관한 관련정보는 PCT 양식 RO/134에서 발견될 수 있고, 이는 본원의 특허청구범위 앞에 기재되어 있다.
E. bkd-마이너스 유전형을 확인하기 위한 서던 하이브리드형성 분석
서던 하이브리드형성 분석을 erm-R, tsr-S 클론중 2개, pp15(이전에는 균주 CD794) 및 pp22(이전에는 균주 CD798)에 수행하였다. 상기 분석은 ermE 표지의 역색체 통합, 및 중복 교차에 의해 발생하는 bkdF 개방 판독 프레임(ORF-1)의 5'말단을 갖는 1.4kb BamHI 게놈 단편의 동시 결실을 나타내었다. 염색체 DNA의 제한 단편은 1% 아가로즈 겔을 통해 전기영동되어 분리되고 실시예 5에 개시된 바와 같은 서던(1975)의 방법에 의해 나일론으로 이동되었다.
[실시예 10]
[에스. 아베르미틸리스 bkdABCF 돌연변이체의 구축]
이 실시예는 bkdA, bkdB, bkdC 및 bkdF의 bkd 유전자에 영향을 미치는 안정한 에스. 아베르미틸리스 다중 돌연변이체의 구축을 개시한다. 상기 유전자중 처음 세개, 즉 bkdA, bkdB 및 bkdC는 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈 복합체 각각의 E1-알파, E1-베타 및 E2-서브유니트를 암호화한다. 이들 유전자는 데노야의 1993년 7월 30일로 출원된 미합중국 특허원 제 08/100,518 호에서 개시된 바와 같은 bkdABC 유전자 군집의 일부이다. bkdF 유전자는 상기 개시된 bkdFGH 유전자 군집에 위치하고, 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈 복합체의 E1-알파 서브유니트를 암호화한다.
A. 선택가능하고 항생제 내성이 있는 표지(ermE)로 표지된 표적 염색체 영역(bkdC)을 갖는 운반(delivery) 벡터의 디자인 및 구축
먼저, 6.5kb의 SphI 에스. 아베르미틸리스 31272 게놈 단편(bkdABC 유전자 군집을 갖고있음)을 셔틀/운반 벡터 pCD500의 SphI 클로닝 부위에 서브클로닝하여(데노야의 1993년 3월 18일자로 출원된 미합중국 특허원 제 08/032,925 호, Novel Bacterial Plasmid Shuttle Vactors for Streptomycetes and Escherichia coli참조) 결과적으로 플라스미드 pCD544를 수득하였다(제9도 참조). 이어서, ermE 표지를 갖는 1.7kb BalII pIJ4026 단편을, pCD544 삽입체에 존재하는 독특한 BalII 부위에 삽입하였다. 플라스미드 pIJ4026은 사카로폴리스포라 에리트라에아(이전에는 스트렙토마이세스 에리트라에우스(Streptomyces erythraeus))의 ermE 유전자를 갖는 이.콜라이 클로닝 벡터인 pUC18의 유도체이다(빕 등의 문헌[1985, Gene, 41:357-368]및 흡우드 등의 문헌[Genetic Manipulation of Streptomyces-A Laboratory Manual, 1985, The John Innes Foundation, Norwich, U,K.]참조). 결과로 생성된 구축물(pCD547)은 삽입에 의해 불활성화된 bkdC 유전자의 복제를 갖는다.
B. 유전적으로 표지된 bkdC 돌연변이 균주의 구축
운반 벡터로서 플라스미드 pCD547(상기 A 참조), 숙주로서 에스. 아베르미틸리스 야생형 균주 ATCC 31272 SC2를 사용하고, 표준 유전자 치환 방법을 따라(실시예 9 참조), 에리트로마이신-내성, 티오스트렙톤-민감성 표현형을 나타내는 원형질체화 후 재생된 12개의 단일 콜로니를 선택하였다. 상기 12개의 군중 하나의 콜로니를 공식적으로 에스. 아베르미틸리스 균주 CD570으로 명명하고(제9도 참조), 이를 하기 유전자 치환 단계에서 숙주로서 사용하였다(하기 참조).
C. 돌연변이된(결실된) bkdABC 표적 영역을 갖는 운반 벡터의 디자인 및 구축
플라스미드 pCD728은 2개의 에스. 아베르미틸리스 염색체 단편(pCD528 서브클론에서 제조된 7kb BamHI, 및 pCD559의 서브클론에서 제조된 6.5kb BglII/BamHI)을 갖는 셔틀 벡터인 pCD262의 유도체(데노야의 문헌[Novel Bacterial Plasmid Shuttle Vactors for Streptomyces sp. and Escherichia coli,1993년 3월 18일자로 출원된 미합중국 특허원 제 08/032,925 호])이다(제9도 참조). 본원에서 이용한 서브클론을 전부 개시하기 위해서는 또한 데노야의 1993년 7월 30일자로 출원된 미합중국 특허원 제 08/100,518 호를 참조할 수 있다.
D. 표지되지않은 bkdABC 결실된 균주의 구축
플라스미드 pCD728을 에스. 아베르미틸리스 균주 CD570의 원형질체로 형질전환시켜 가짜 형질전환체를 회수하였다. 게놈 단편중의 하나가 틀린 배향으로 삽입된 대조용 플라스미드, pCD739를 형질전환에 의해 균주 CD570에 또한 도입하였다. ermE 표지가 bkdABC 결실된 구축물에 의해 치환되고 운반 플라스미드(pCD262)가 세포에서 손실된 많은 재조합체를 수득하였다. 요약하자면, 형질전환 및 중복 교차 재조합시에, pCD728은 bkdA(E1-알파), bkdB(E1-베타) 및 bkdC(E2) 유전자에 영향을 미치는 에스. 아베르미틸리스 염색체의 약 2kb를 결실하였다. 회수된 통합물은 에리트로마이신-민감성, 티오스트렙톤-민감성 표현형을 갖는다. 서던 불럿 분석결과, ermE 표지가 결실된 서열로 치환되었다. 상기 군의 대표인 하나의 단독 콜로니를 더욱 작업하기 위해 선택하고 균주 CD757로 기록하였다(제9도 참조).
E. bkdF 유전자 치환 벡터의 디자인 및 구축
상기 벡터의 구축은 실시예 9, A 부분에 개시되어 있었다. 간략하게는, 플라스미드 pCD768은 야생형 염색체의 1.4kb BamHI 단편의 양 측면에 인접한 2개의 에스. 아베르미틸리스 게놈 단편(2.3 및 4.1kb BamHI)을 갖는 셔틀 벡터 pCD262의 유도체이다. 또한 pCD768은 2.3과 4.1kb BamHI 단편 사이에 위치한 ermE 표지를 갖는다. ermE 표지는 하향 유전자의 과다발현에 의해 일어날 수 있는 치사율을 피하기 위해 ORF-1(bkdF)와 반대로 배향되어 있다. 상기 구축물은 재조합시 숙주 게놈에서 1.4kb을 결실(bkdF 유전자의 5'말단에 영향을 미친다)시켰다.
F. 에스. 아베르미틸리스 다중 bkd 돌연변이체(bkdABCF)의 구축
플라스미드 pCD768을 실시예 9에서 개시된 바와 같이 에스. 아베르미틸리스 균주 CD757(bkdABC)의 원형질체로 형질전환시켰다(상기 단계 D 참조). 많은 형질전환체를 회수하고 가짜 통합물을 표준 방법에 따라 선별하였다. 상기 군의 대표이고, 에리트로마이신-내성, 티오스트렙톤-민감성 표현형을 보이는 하나의 통합물을 균주 CD797로 명명하고 더욱 분석하였다(제9도 참조). 배양물 CD797은 하기와 같은 전형적인 bkd-결핍 표현형을 나타낸다: ILV 최소 배지 플레이트에서 성장할 수 없고(실시예 9 참조), BCKDH 복합체의 E1 성분에 대해 분석시 활성이 없었다. 발효 연구결과, 차단 배양은 S(+)-2-메틸부티르산 또는 이소부티르산을 보충해 주지않으면 천연 아베르멕틴을 합성할 수 없음을 나타내었다. 또한, 사이클로헥산 카복실산(CHC)을 첨가하면 신규한 CHC-아베르멕틴을 형성시켰다. 상기 발효는 4개의 유전자(bkdA, bkdB, bkdC 및 bkdF)의 파괴 또는 결실을 포함하는 다중 bkd차단이 아베르멕틴 생합성 세포 기작에 영향을 미치지않음을 나타내었다.

Claims (25)

  1. 스트렙토마이세스(Streptomyces)속에 속하는 미생물의 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈 복합체를 암호화하는, 서열 식별번호 1번, 서열 식별번호 2번, 서열 식별번호 3번 또는 서열 식별번호 4번의 DNA 서열을 포함하는 단리된 DNA 분절.
  2. 제1항에 있어서, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈 복합체를 암호화하는 단리된 DNA 분절.
  3. 제1항에 있어서, 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈 복합체의 발현을 조절하는 DNA 영역을 또한 포함하는 단리된 DNA 분절.
  4. 제2항에 있어서, 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈 복합체의 발현을 조절하는 DNA 영역을 또한 포함하는 단리된 DNA 분절.
  5. 제1항에 따른 DNA 분절을 포함하는 재조합 DNA.
  6. 제5항에 따른 재조합 DNA가 혼입된 숙주 세포.
  7. 제5항에 따른 재조합 DNA를 포함하는 플라스미드.
  8. pCD713, pCD740, pCD747 및 pCD854으로 구성된 군에서 선택되는 제2도에 도시된 게놈 제한 지도를 갖는 DNA 분절.
  9. 제8항에 따른 DNA 분절이 혼입된 숙주 세포.
  10. 제1항에 있어서, 서열 식별번호 1번, 서열 식별번호 2번, 서열 식별번호 3번 또는 서열 식별번호 4번인 DNA 서열의 전사 또는 해독을 조절하는 DNA 영역을 함유하는 DNA 분절.
  11. 제8항에 따른 DNA 분절에 함유된 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지네이즈 복합체에 대한 유전자.
  12. 서열 식별번호 1번, 서열 식별번호 2번, 서열 식별번호 3번 또는 서열 식별번호 4번인 DNA 서열의 일부를 포함하고, 프로브로 사용시 서열 식별번호 1번, 서열 식별번호 2번, 서열 식별번호 3번 또는 서열 식별번호 4번 각각에 하이브리드를 형성하거나 폴리머레이즈 쇄 반응 프라이머로서 사용시 상기 서열의 전부 또는 일부를 증폭시킬 수 있는 DNA 서열을 포함하는 DNA 분절.
  13. 서열 식별번호 5번, 서열 식별번호 6번, 서열 식별번호 7번 또는 서열 식별번호 8번의 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 정제된 폴리펩티드.
  14. 제6항에 따른 숙주 세포에서 발현되어 생산되는 폴리펩티드.
  15. 하나이상의 bkdF, bkdG 및 bkdH 유전자를 포함하는 게놈 단편의 복제수가 증가된 에스. 아베르미틸리스를, 천연 아베르멕틴을 생산하는데 적합한 발효 배지 및 조건에서 발효시킴을 포함하는, 상기 천연 아베르멕틴의 제조방법.
  16. 제15항에 있어서, bkdF, bkdG 및 bkdH 유전자를 포함하는 게놈 단편의 복제수가 증가된 에스. 아베르미틸리스를 발효시키는 방법.
  17. 하나이상의 bkdF, bkdG 및 bkdH 유전자를 포함하는 게놈 단편의 발현이 이러한 발현을 조절하는 유전자의 조작 또는 치환에 의해 증가된 에스. 아베르미틸리스를 천연 아베르멕틴을 생산하는데 적합한 발효 배지 및 조건에서 발효시킴을 포함하는, 상기 천연 아베르멕틴의 제조방법.
  18. 제17항에 있어서, bkdF, bkdG 및 bkdH 유전자를 포함하는 게놈 단편의 발현이 증가된 에스. 아베르미틸리스를 발효시키는 방법.
  19. 하나이상의 bkdF, bkdG 및 bkdH 유전자를 포함하는 게놈 단편의 발현이 이러한 발현을 담당하는 유전자의 결실, 불활성화, 치환 또는 다른 조작에 의해 감소되거나 완전히 제거된 에스. 아베르미틸리스를, 신규 아베르멕틴을 생산하는데 적합한 발효 배지 및 조건에서 발효시킴을 포함하는, 상기 신규 아베르멕틴의 제조방법.
  20. 제19항에 있어서, bkdF, bkdG 및 bkdH 유전자를 포함하는 게놈 단편의 발현이 이러한 발현을 담당하는 유전자의 결실, 불활성화, 치환 또는 다른 조작에 의해 감소되거나 완전히 제거된 에스. 아베르미틸리스를 발효시키는 방법.
  21. 제19항에 있어서, 결실, 불활성화, 치환되거나 또는 달리 조작되는 유전자가 인핸서(enhancer), 저해제(inhibitor), 활성화제(activator) 또는 억제제(repressor) 유전자인 방법.
  22. 제19항에 있어서, 하나이상의 bkdF, bkdG 및 bkdH 유전자를 포함하는 게놈 단편이 결실, 불활성화된 에스. 아베르미틸리스를, 신규 아베르멕틴을 생산하는데 적합한 발효 배지 및 조건에서 발효시킴을 포함하는 신규 아베르멕틴의 제조방법.
  23. 제22항에 있어서, bkdF, bkdG 및 bkdH 유전자를 포함하는 게놈 단편이 결실 또는 불활성화된 에스. 아베르미틸리스를 발효시키는 방법.
  24. 하나이상의 bkdA, bkdB 및 bkdC 유전자 및 하나이상의 bkdF, bkdG 및 bkdH 유전자를 포함하는 게놈 단편의 발현이 이러한 발현을 담당하는 유전자의 결실, 불활성화, 치환 또는 다른 조작에 의해 감소되거나 완전히 제거된 에스. 아베르미틸리스를, 신규 아베르멕틴을 생산하는데 적합한 발효 배지 및 조건에서 발효시킴을 포함하는, 상기 신규 아베르멕틴의 제조방법.
  25. 제24항에 있어서, bkdA, bkdB bkdC 및 bkdF 유전자를 포함하는 게놈 단편이 결실 또는 불활성화된 에스. 아베르미틸리스를 발효시키는 방법.
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