PL178993B1 - plazmid, gen kompleksu dehydrogenazy a-ketokwasu o rozgalezionym lancuchu ze Streptomyces avermitilis oczyszczony polipeptyd oraz polipeptyd i sposób wytwarzania awermektyn PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. W ydzielony segment DNA, znam ienny tym , ze koduje kompleks dehydrogenazy a-ketokwasu o rozgalezionym lancuchu organi- zmu nalezacego do gatunku Streptomyces i jako sekwencje DNA zawiera sekwencje Id nr 1, sekw encje Id nr 2, sekwencje Id nr 3 lub sek- wencje Id nr 4 albo w ariant tych sekwencji kodujacy zasadniczo taki sam polipeptyd. 5. Fragm ent DNA, znam ienny tym , ze stanowi fragment funkcyjnie równowazny segmentowi DNA o sekwencjach Id nr 1, Id nr 2, Id nr 3 lub Id nr 4 albo wariant tych sekwencji kodujacy zasadniczo taki sam polipeptyd. 6. Zrekom binowany DNA, znam ienny tym , ze zawiera segm ent DNA o sekwencjach Id nr 1, Id nr 2, Id nr 3 lub Id nr 4 albo wariant tych sekwencji kodujacy zasadniczo t a ki sam polipeptyd. 7. Kom órka gospodarza, zn am ien n a tym , ze zaw iera w prow adzony zrekom binowany DNA o sekw encjach Id nr 1, nr 2, Id nr 3 lub Id nr 4 albo w ariant tych sekwencji kodujacy zasadniczo taki sam polipeptyd. 9. Plazmid, znam ienny tym , ze zawiera zrekom binowany DNA o sekwencjach Id nr 1, Id nr 2, Id nr 3 lub Id nr 4 albo w ariant tych se- kwencji kodujacy zasadniczo taki sam polipeptyd. 12. Gen kompleksu dehydrogenazy a -ketokwasu o rozgalezionym lancuchu, ze Streptomyces avermitilis, znam ienny tym, ze zawiera segment DNA wybrany z grupy obejmujacej pCD713, pCD740, pCD747 i pCD854. 14. Oczyszczony polipeptyd, znam ienny tym , ze zawiera sekwencje aminokwasów w postaci sekwencji Id nr 5, w postaci sekwencji Id nr 6, w postaci sekwencji Id nr 7 lub w postaci sekwencji Id nr 8. 15. Polipeptyd, znam ienny tym, ze zostal wytworzony w wyniku ekspresji w komórce gospodarza, która zawiera wprowadzony zre- kombinowany DNA o sekwencjach Id nr 1, Id nr 2, Id nr 3 lub Id n r 4 albo wariant tych sekwencji kodujacy zasadniczo taki sam polipeptyd. 16. Sposób wytwarzania naturalnej awermektyny, znam ienny tym, ze prowadzi sie fermentacje S. avermitilis, w którym zostala zwie- kszona liczba kopii fragmentu genomowego zawierajacego jeden lub wiecej sposród genów bkdF, bkdG, bkdH lub w którym ekspresja geno- mowego fragmentu zawierajacego jeden sposród tych genów zostala wzmocniona na drodze manipulacji lub podstawienia genów bkdF, bkdG, bkdH odpowiedzialnych za regulacje takiej ekspresji. 17. Sposób wytwarzania nowej awermektyny, znam ienny tym, ze prowadzi sie fermentacje S. avermitilis, w którym ekspresja frag- mentu genomowego zawierajacego jeden lub wiecej sposród genomów bkdA, bkdB, bkdC, bkdF, bkdG i bkdH zostala oslabiona lub wyeli- minowana poprzez delecje, dezaktywacje, podstawienie lub inna manipulacje genami odpowiedzialnymi za taka ekspresje lub w którym fragment genomowy zawierajacy jeden lub wiecej sposród tych genów bkdA, bkdB, bkdC, bkdF, bkdG i bkdH zostal wyciety lub zdczakty- wowany. PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są: wydzielony segment DNA, segment DNA, zrekombinowany DNA, komórka gospodarza, plazmid, gen kompleksu dehydrogenazy α-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu ze Streptomyces avermitilis oraz polipeptyd i sposób wytwarzania awermektyn (naturalnej i nowej). Nowa sekwencja DNA koduje kompleks dehydrogenazy α-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu (BCKDH) z organizmów należących do gatunku Streptomyces a zwłaszcza Streptomyces avermitilis. Mutant Streptomyces avermitilis zubożony w bkd nie wykazuje aktywności dehydrogenazy α-ketokwasu o rozgałęzionm łańcuchu i jest przydatny do wytwarzania na drodze fermentacji nowych (nienaturalnych) awermektyn.

S. avermitilis wytwarza 8 naturalnych, różniących się, ale bardzo zbliżonych przeciwpasożytniczych związków polipeptydowych określonych jako awermektyny. Kompleks awermektyn wytwarzany przez S. avermitilis obejmuje 4 główne składniki, Ala, A2a, Bla i B2a oraz 4 składniki uboczne, A1 b, A2b, B Ib i B2b. Budowę różnych składników przedstawiono poniżej.

och₃

178 993

Awermektyna	R1	R2	Χ-Υ
Ala	sec-butyl	Me	CH=CH
Alb	izopropyl	Me	CH=CH
A2a	sec-butyl	Me	CH2-CH(OH)
A2b	izopropyl	Me	CH2-CH(OH)
Bla	sec-butyl	H	CH=CH
Bib	izopropyl	H	CH=CH
B2a	sec-butyl	H	CH2-CH(OH)
B2b	izopropyl	H	CH2-CH(OH)

Struktura poliketydu awermektynowego pochodzi od 7 cząsteczek octanu i 5 cząsteczek propionianu oraz jednej cząsteczki α-rozgałęzionego kwasu tłuszczowego, którym jest kwas S-(+)-2-metylomasłowy lub kwas izomasłowy. Oznaczenia „A” i „B” odnoszą się do awermektyn, w której podstawnik 5 stanowi odpowiednio grupa metoksylowa lub hydroksylowa. Liczba „1” dotyczy awermektyn, w których w pozycji 22-23 znajduje się wiązanie podwójne, a liczba „2” dotyczy awermektyn, w których w pozycji 22 znajduje się atom wodoru, a w pozycji 23 grupa hydroksylowa. Ponadto przy C25 mogą znajdować się dwa podstawniki: podstawnik sec-butylowy (pochodzący od kwasu S-(+)-2-metylomasłowego) występuje w awermektynach serii „a”, a podstawnik izopropylowy (pochodzący od kwasu izomasłowego) występuje w awermektynach serii „b” (przegląd - patrz M.H. Fisher i H. Mrozik, 1984, „Macrolide Antibiotics”, Academic Press, rozdział 14).

Określenie „naturalne” awermektyny odnosi się do tych awermektyn wytwarzanych przez S. avennitilis, w których podstawnikiem w pozycji 25 jest, jak to wspomniano wyżej, grupa izopropylowa lub sec-butylowa. Awermektyny, w których grupę w pozycji 25 stanowi grupa inna niż izopropyl lub sec-butyl, określane są w opisie jako nowe lub nienaturalne awermektyny

Jedna z dróg metabolicznych prowadzących do naturalnych kwasów tłuszczowych o a-rozgałęzionych łańcuchach w formie CoA rozpoczyna się od aminokwasów o a-rozgałęzionych łańcuchach, izoleucyny i waliny, poprzez reakcję z udziałem transaminazy aminokwasów o a-rozgałęzionych łańcuchach, a następnie reakcję z udziałem dehydrogenazy α-ketokwasów o a-rozgałęzionych łańcuchach. (Pochodne acylo-CoA kwasów tłuszczowych o rozgałęzionych łańcuchach mogą także pochodzić od α-ketokwasów o rozgałęzionych łańcuchach wytworzonych w syntezie de novo). Takie drogi metaboliczne przedstawiono poniżej.

178 993

C^CHCH (NHJ COOH

CH

Walin^.

CHjCIĘCHCH (NH,) COOH

CH |lzoleucyr.a

Transaminaza aminokwasów o rozgałęzionych łańcuchach ▼ V

Kwas 2-oksoizowalerianowy Kwas 2-okso-3-metyloizowaleri

Kompleks dehydrogenazy α-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu

CĄCHCO. SCoA

CH

V

CĄCĄCHCO.SCoA

CH

Izobutyrylo CoA 2-metylobutyrylo-CoA

Droga degradacji (Propionylo-CoA

Metylomalonylo-CoA)

Droga degradacji (Acetylo-CoA,

Propionylo-CoA, Metylomalonylo-CoA)

Biosynteza awermektyny

CHCO.SCoA ^CHCOOH

Egzogenny kwas tłuszczowy o rozgałęzionym łańcuch = synteza de novo

178 993

Mutant S. avermitilis o niewykrywalnej aktywności dehydrogenazy α-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu (BCKDH) w ostatnim wspomnianym enzymie został już wydzielony (Hafner i inni, 1988, patent europejski EP 284 186 z 20 października 1993). Mutant wydzielono w wyniku standardowej chemicznej mutagenezy S. avermitilis szczep ATCC 31272 w selekcjonującym poszukiwaniu braku powstawania ¹⁴CO₂ z ¹⁴C-1-znaczonego kwasu 2-oksoizokapronowego (analogu leucyny). Mutant ten nie jest zdolny do syntetyzowania naturalnych awermektyn z wyjątkiem przypadku gdy do ośrodka fermentacji mutantu doda się kwas S-(+)-2-metylomasłowy lub kwas izomasłowy, albo prekursor zawierający grupę izopropylową lub sec-butylową (forma S). Mutant może również wytwarzać nowe (nienaturalne) awermektyny, gdy fermentację prowadzi się w środowisku wodnym w warunkach aerobowych, na pożywce zawierającej egzogenicznie dodany alternatywny kwas karboksylowy taki jak kwas cykloheksanokarboksylowy (CHC) lub jego prekursor, jak to zaznaczono powyżej.

Geny, które kodują kompleks dehydrogenazy α-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu z S. avermitilis jest wysoce pożądany. Manipulacja takimi genami z wykorzystaniem technik zrekombinowanego DNA powinna ułatwić wytwarzanie naturalnych i nowych awermektyn. W przypadku pewnych szczepów zwiększonego miana naturalnych awermektyn możnaby oczekiwać w wyniku zwiększenia liczby kopii genów bkd. Na dodatek stworzenie szczepu z nieodwracalnie blokowanym bkd, o aktywności BCKDH na stałe wyciętej lub zmodyfikowanej przez zastąpienie genu, mogłoby stanowić korzystną alternatywą dla mutantu bkd, który otrzymano, jak to zaznaczono powyżej, na drodze chemicznej mutagenezy.

Wieloenzymatyczne kompleksy dehydrogenazy α-ketokwasu - kompleks dehydrogenazy α-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu (BCKDH), kompleks dehydrogenazy pirogronianowej (PDH) i kompleks dehydrogenazy α-ketoglutaranowej (KGDH) katalizują utleniające dekarboksylacje odpowiednio α-ketokwasów o rozgałęzionych łańcuchach, pirogronianu i a-ketoglutaranu, z uwolnieniem CO₂ i wytworzeniem odpowiedniego Acylo-CoA i NADH (R.N. Perham, 1991, Biochemistry, 30: 8501-8512). Każdy z kompleksów składa się z 3 różnych enzymów katalitycznych: dekarboksylazy (El), transacylazy acylotransferazy dihydrolipoamidowej (E2) i dehydrogenazy dihydrolipoamidowej (E3).

Hydrogenaza α-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu (BCKDH) jest wieloenzymatycznym kompleksem składającym się z 3 funkcyjnych składników, El - dekarboksylazy, E2 - transacylazy i E3 - dehydrogenazy lipoamidowej. Oczyszczone kompleksy z Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa i Bacillus subtilis składają się z 4 polipeptydów. Oczyszczone kompleksy ssaków również zawierają4 polipeptydy, Ela, El β, E2 i E3. Kompleks dehydrogenazy a-ketokwasu, który wydzielono z Bacillus subtilis, wykazuje aktywność dehydrogenazy zarówno pirogronianowej jak i α-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu. Taki kompleks o podwójnym działaniu utlenia zarówno pirogronian jak i α-ketokwasy o rozgałęzionych łańcuchach dla fosfolipidów w błonie komórkowej.

Klonowanie prokariotycznych genów dehydrogenazy α-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu opisano dla Pseudomonas i Bacillus. Stwierdzono, że w układach tych geny kodujące BCKDH skupiają się w operonie. Geny kompleksu BCKDH z Pseudomonas putida zostały sklonowane, a sekwencja nukleotydów tego obszaru została ustalona (Sykes i inni, 1987, J. Bacteriol., 169:1619-1625; Burns i inni, 1988, Eur. J. Biochem., 176:165-169 i 176: 311-317). Ciężar cząsteczkowy Ela wynosi 45289, Elβ - 37138, E2 - 45134, a E3 - 48164. Cztery geny skupione są w następującej kolejności: Ela, El β, E2 i E3. Analiza metodą blottingu Northema wykazała, że ekspresja tych 4 genów zachodzi od pojedynczego mRNA, oraz że geny te tworząoperon. Występuje typowy prokatiotyczny promotor konsensusu bezpośrednio poprzedzający start obszaru kodującego El, co umożliwia konstytutywną ekspresję genów Pseudomonas bkd. Kodon inicjacyjny obszaru kodującego El β znajduje się zaledwie 40 nukleotydów w dół od końca otwartej ramki odczytu (ORF) Ela. Natomiast brak jest odstępu międzygenowego pomiędzy ORF El β i E2, gdyż kodon terminacyjny dla ORF El β stanowi triplet bezpośrednio poprzedzający kodon inicjacyjny ORF F2. Odstęp między genowy pomiędzy ORF E2 i E3 jest zredukowany do zaledwie 2 nukleotydów. W związku z tym geny Pseudomonas BKG są ściśle połączone.

178 993

Przeprowadzono także klonowanie operonu kodującego podwójny kompleks BCKDH/PDH z Bacillus subtilis (Hemila i inni, 1990, J. Bacteriol., 172: 5052-5063). Operon ten zawiera 4 ORF kodujące białka o 42,36,48 i 50 kilodaltonach (kDa), które, jak to wykazano, są wysoce homologiczne z podjednostkami Ela, Εΐβ, E2 i E3 w skupieniu Pseudomona bkg. Przeprowadzono także klonowanie i sekwencjonowanie genów kodujących podjednostki a i β składnika El podwójnego kompleksu wiełoenzymowego BCKDH/PDH z Bacillus stearothermophilus (oszacowane ciężary cząsteczkowe podj ednostek a i β wynoszą odpowiednio około 41000135000) (Hawkins i inni, Eur. J. Błochem., 191: 337-346).

Ujawniono także sekwencje szeregu eukariotycznych podjednostek Ε1 a i β BCKDH (ludzkich, bydlęcych i szczura). Ostatnio przeprowadzono z wykorzystaniem analizy komputerowej porównanie sekwencji aminokwasów wszystkich opublikowanych sekwencji, odnośnie których wiadomo, że zawierają składniki Ε la i Ε1 β kompleksów PDH i BCKDH dla różnych gatunków (Wexler i inni, FEBS Letters, 282:209-213). Należy podkreślić, że zidentyfikowano szereg obszarów podjednostek a i β zachowanych w wysokim stopniu nie tylko we wszystkich opisanych dotychczas PDH, ale również zarówno w prokariotycznych jak i eukariotycznych kompleksach BCKDH.

Również ostatnio 3 geny kodujące odpowiednio podjednostki a (bkdA) i β (bkdB) składnika El oraz składnika E2 (bkdC) kompleksu (BCKDH.) z Streptomyces avermitilis sklonowane, poddano sekwencjonowaniu i zanalizowano z wykorzystaniem układu ekspresji heterologicznego genu (C.D. Denoya, 1993, „Cloned genes encoding branched-chain alpha-ketoacid dehydrogenase complex from Streptomyces avermitilis”, zgłoszenie patentowe USA nr 08/100 518, z 30 lipca 1993). Analiza sekwencji DNA wykazała obecność przypuszczalnych transkrypcyjnych sekwencji promotora oraz genów strukturalnych bkd uszeregowanych jako następujące skupienie: sekwencja promotora oraz otwarte ramki odczytu Ela(bkdA), El β (bkdB) i E2 (bkdC). Dodatkowo pełny gen S. avermitilis bkdABC sklonowane w dół silnego promotora Escherichia coli T7 w celu wykonania ekspresji w E. coli jako gospodarzu. Sklonowano także otwarte ramki odczytu (OFR) El-ai El-β, oddzielnie lub razem, w dół promotora T7 i każdą z konstrukcji zbadano na okoliczność ekspresji. Badania .te wykazały, że co najmniej 2 otwarte ramki odczytu skupienia genu S. avermitilis bkd(El-a[bkadA] iEl-β[bkadB] ulegająw pełni translacji po ekspresji w E. coli. Na dodatek testy enzymatyczne wykonane w celu specyficznego zanalizowania składnika El kompleksu BCKDH potwierdziły, że dwa spośród zrekombinowanych klonów E. coli, jeden z E. coli, jeden zawierający pełne skupienie genu bkd, a drugi przenoszący obydwie ORF, El-ai El-β, wykazują El BCKDH-specyficzną aktywność enzymatyczną.

Wynalazek dotyczy molekularnego klonowania i analizy drugiego skupienia nowych genów kodujących dehydrogenazę α-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu (BCKDH) z Streptomyces avermitilis. Skupienie zawiera co najmniej 3 geny (bkdF, bkdG i bkdH) kodujące odpowiednio podjednostki El-α, Ε2-β i E2 kompleksu BCKDH S. avermitilis. Ujawnione skupienie genu jest zlokalizowane około 12 kilozasad (kb) w dół od pierwszego skupienia (geny bkdA, bkdB i bkdC), ujawnionego ostatnio (C.D. Denoya, zgłoszenie patentowe USA nr 08/100 518, z 30 lipca 1993). Obydwa skupienia wykazują podobną organizację genowąi zorientowane są w tym samym kierunku w chromosomie S. avermitilis. Mimo iż odpowiednie geny strukturalne w obydwu skupieniach są heterologiczne, to różnią się.

Przedmiotem wynalazku jest również konstrukcja mutanta bkd z wykorzystaniem techniki inżynierii genetycznej. Mutant bkd, który przenosi chromosomową delecję wpływającą na gen bkd, nie wykazuje aktywności dehydrogenazy α-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu, nie może rosnąć na izoleucynie, leucynie i wahnie jako jedynych źródłach węgla, a także nie może wytwarzać naturalnych awermektyn w ośrodku, który nie zawiera kwasu S-2-metylomasłowego i izomasłowego. Ujawniony mutant znajduje zastosowanie do wytwarzania nowych (nienaturalnych) awermektyn w wyniku fermentacji w ośrodku zawierającym odpowiedni alternatywny kwas karboksylowy taki jak kwas cykloheksanokarboksylowy (CHC). Przedmiotem wynalazku jest

178 993 ponadto mutant, który przenosi chromosomową delecję wpływającą zarówno na gen bkdF jak i na skupienie genowe bkdABC.

Streptomyces zawieraj ąjedną główną genetyczną grupę łączącą, jeden chromosom, często występujący w szeregu kopiach w przedziale strzępkowym, ale występujący jedynie jako pojedyncza kopia w sporach. Genom Streptomyces odznacza się tym spośród eukariotów, że jest bardzo duży (5 χ 10³ do 7 χ 10³ kilozasad ]kb]) (A. Gladek, J. Zakrzewska, 1984, FEMS Microbiol. Lett., 24: 73-76), około 2 razy większy niż w przypadku E. coli.

Jednym ze szczególnie interesujących aspektów genetyki Streptomyces jest to, że zachodząw nim często przegrupowania chromosomowe obejmujące obszerne delecje, którym często towarzyszą intensywne amplifikacje DNA (A. Brich i inni, 1990, J. Bacteriol., 172: 4138-4142). Zjawiska amplifikacji i delecji w Streptomyces są2-3 rzędy wielkości silniejsze niż podobne zjawiska w E. coli i B. subtilis. Doniesiono o delecjach stanowiących 18% chromosomu i amplifikacji reprezentującej 45% genomu. Pomimo wrodzonej niestabilności w dłuższych przedziałach czasowych duplikacje pewnych genów występują z wysokimi częstotliwościami, nawet 1/10⁴ komórek. Takie duplikacje zazwyczaj powstająw wyniku zjawisk nierówno crossing-over, które obejmują krótkie, częściowo homologiczne sekcje DNA w dzielących się chromosomach potomnych. W przypadku takich zjawisk duplikacji tworzących nowe napięcia w DNA na tym samym chromosomie występuje automatycznie tendencja do zachodzenia w konsekwencji zjawisk dalszej amplifikacji genu lub eliminacji w konsekwencji zjawisk dalszej amplifikacji genu lub eliminacji. Wielokrotne kopie nie tylko tego samego genu, ale również dwóch różnych genów o bardzo podobnej budowie wykazują skłonność do rekombinacji i tworzenia delecji. Wrodzona stabilność genów wymaga, aby nie był on podobny do jakiegokolwiek innego genu.

Obecność szeregu kopii genu lub grupy genów w Streptomyces nie jest rzeczą niezwykłą. W literaturze doniesiono o modułowej organizacji genów niezbędnych w syntezie poliketydowej części makrolidowego antybiotyku erytromycyny w Saccharopolyspora erythraea (Donadio i inni, 1991, Science, 252: 675-679).

Stwierdzono, że Streptomyces avermitilis zawiera co najmniej dwa skupienia genów bkd: jedno skupienie zawierające geny bkdA, bkdB i bkdC, oraz drugie skupienie zawierające geny bkdF, bkdG i bkdH. Uważa się, że zarówno skupienie genowe bkdABC (ujawnione w zgłoszeniu patentowym USA nr 08/100 518, z 30 lipca 1993, który wprowadza się jako źródło literaturowe) oraz bkdFGH (ujawnione w niniejszym opisie) wynikają z duplikacji genów w S. avermitilis, oraz że dwie kopie nagromadzają na skutek mutacji wystarczająco wiele różnic, aby zapewniło to przetrwanie (poprzez wyeliminowanie przypadków rekombinacji/delecji).

Oprócz ujawnienia drugiego nowego skupienia genów kodujących BCKDH ujawniono także konstrukcję mutanta Streptomyces avermitilis bkdF z wykorzystaniem technik inżynierii genetycznej . Mutant bkdF nie wykazuj e aktywności dehydrogenazy α-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu, nie może rosnąć na izoleucynie, leucynie i walinie jako jedynych źródłach węgla, a także nie może wytwarzać naturalnych awermektyn w ośrodku, który nie zawiera kwasu S-2-metylomasłowego i izomasłowego. Mutant bkdF znajduje zastosowanie do wytwarzania nowych awermektyn w wyniku fermentacji w ośrodku zawierającym odpowiedni alternatywny kwas karboksylowy taki jak kwas cykloheksanokarboksylowy (CHC). Ujawniono ponadto konstrukcję mutanta, który przenosi chromosomową delecję wpływającą zarówno na gen bkdF jak i na skupienie genowe bkdABC.

Tworzenie mutantów Streptomyces z wykorzystywaniem mutagenów chemicznych i fizycznych stanowi ważną technikę analizy działania i regulacji genów oraz uzyskiwania ulepszonych szczepów o znaczeniu przemysłowym. Ostatnie osiągnięcia w klonowaniu genu Streptomyces stworzyły możliwość manipulowania z wykorzystaniem techniki zrekombinowanego DNA wielką liczbą klonowanych genów takich jak geny odporności, biosyntezy i regulujące, oraz wyjaśnienia organizacji i regulacji genu. Inne rozwiązanie mutageniczne, podstawianie genu, zostało z powodzeniem wykorzystane w przypadku Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli i Bacillus subtilis (S. Scherer i R. W. Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4951-4955; D. Shortle i inni, 1982, Science, 217: 371-373; M.L. StahliE. Ferrari, 1984, J. Bacteriol., 158:411-418) orazw Saccharopolyspo

178 993 ra erythraea (J.M.Weber i R. Losick, 1988, Gene, 68:173-180), atakże w szeregu gatunkach streptomycetes. Technika ta umożliwia wprowadzenie wytworzonej in vitro mutacji przeprowadzonej na plazmidzie do chromosomu szczepu gospodarza. Podejście to oparte jest na stwierdzeniu, że zachodzi rekombinacja między chromosomem gospodarza i plazmidem zawierającym homologiczny obszar.

Podstawienie genu w S. avermitilis występuje poprzez homologiczną rekombinację między klonowanymi sekwencjami przenoszonymi przez wektor i ich chromosomowymi odpowiednikami. Prawdopodobnie zachodzą równocześnie 2 crossing-over, albo pojedynczy crossing-over prowadzący do integracji, a następnie etap rozdziału, w którym zintegrowany plazmid zostaje -wycięty, co powoduje wzajemną wymianę między sekwencjami klonowanymi i rezydentnymi. W S. avermitilis zaobserwowano przypadku zarówno podwójnego jak i pojedynczego crossing-over. Obydwa mechanizmy, podwójny crossing-over i pojedynczy crossing-over, po którym następuje wycięcie, dają ten sam produkt. Wykorzystując takie rozwiązanie można było rozbić otwartą ramkę odczytu El-a genu bkdF S. avermitilis. Niszczenie obejmowało chromosomową delecję około 1,4 kb obejmującą 5'-połowę genu kodującego podjednostkę El-α kompleksu BCKDH. Uzyskany szczep mutantowy wykazujący wszystkie cechy fenotypowe mutanta bkd jest stabilny i może być wykorzystywany do wytwarzania cennych nowych awermektyn na drodze fermentacji.

Wszystkie publikacje cytowane w opisie wprowadza się w całości jako źródła literaturowe.

Słownik

Techniczne terminy użyte w zgłoszeniu sąznane specjalistom w dziedzinie genetyki molekularnej. Terminy często wykorzystywane w opisie określono poniżej

Amplifikacja: Dotyczy wytwarzania dodatkowych kopii sekwencji chromosomowych, które występująjako wewnątrzchromosomowe lub pozachromosomowe DNA.

Gen odporności na antybiotyk: sekwencja DNA nadająca odporność na antybiotyk po wprowadzeniu do komórki gospodarza z natury wrażliwej na ten konkretny antybiotyk.

Klon: Wielka liczba komórek lub cząsteczek identycznych z pojedynczym przodkiem.

Wektor klonowania: Dowolny plazmid, do którego wstawić można obcy DNA w celu przeprowadzenia klonowania. Przenosi on obcy DNA do komórek bakterii gospodarza w wyniku transformacji.

Co A: Koenzym A.

Sekwencja lepkiego końca (Sos): Sekwencja DNA pochodząca z bakteriofaga lambda, umożliwiająca pakowanie in vitro.

Kosmid: plazmid, do którego wstawiono miejsca cos bekteriofaga lambda; w efekcie plazmidowy DNA (przenoszący inserty obcego DNA) może być opakowany in vitro w powłoce faga.

cRNA: Jednoniciowy RNA komplementarny z DNA, syntetyzowany z niego w wyniku transkrypcji in vitro.

Crossing-over: Dotyczy punktu, w którym zachodzi wzajemna wymiana materiału między klonowaną sekwencją i jej chromosomowym odpowiednikiem.

Dalton: Jednostka masy powszechnie wykorzystywana do określania wielkości cząsteczek, odpowiada jednemu atomowi wodoru.

Ligowanie DNA: Tworzenie wiązania chemicznego łączącego dwa fragmenty DNA.

Zjawisko podwójnego crossing-over: Dwa crossing-over występujące równocześnie lub kolejno po sobie. W jego wyniku następuje wzajemna wymiana między sekwencją klonowaną i rezydentną.

Skupienie genów: Grupa genów położonych blisko siebie na chromosomie.

Podstawienie genu: Technika umożliwiająca wprowadzenie uzyskanej in vitro mutacji, przenoszonej przez plazmid, do chromosomu. Podstawienie występuje, gdy chromosom gospodarza i plazmid zawierający obszar homologiczny względem niego ulegają rekombinacji.

Genom: Pełny zestaw chromosomów. Całkowita suma wszystkich genów.

178 993

Hybrydyzacja, hybrydyzacja kolonii: Technika wykorzystywana do identyfikacji kolonii bakterii przenoszących chimeryczne wektory, w których wstawiony DNA jest podobny do pełnej określonej sekwencji.

Strzępek: Podstawowy element rosnącej lub wegetatywnej formy pleśni. Strzępki stanowią rurkowate struktury o średnicy około 2-10 μ, tworzące masę przenikających się pasm określaną jako grzybnia.

kb: Skrót oznaczający 1 000 par zasad DNA lub RNA.

Linker: krótki syntetyczny oligonukleotyd dwuniciowy zawierający miejsce docelowe dla jednego lub więcej enzymów restrykcyjnych. Dodawany jest do wektora w celu stworzenia nowego polilinkera lub miejsca wielokrotnego klonowania (MCS).

NADH: Zredukowany dinukleotyd nikotynoamido-adeninowy.

Nukleotyd: blok lub monomeryczna jednostka kwasów nukleoinowych.

Oligonukleotyd: Krótki łańcuch nukleotydów.

Operon: Pełna jednostka ekspresji i regulacji genu bakteryjnego, obejmująca geny strukturalne, geny regulatory i elementy kontrolne DNA rozpoznawane przez produkt(y) genu regulatora.

Plazmid: Pozachromosomowy kołowy DNA zdolny do autonomicznej samoreplikacji.

Starter: Krótka sekwencja DNA lub RNA, która jest sparowana z jedną niciąDNA dostarczając wolnego końca 3'-hydroksylowego, od którego polimeraza DNA rozpoczyna syntezę łańcucha dezoksyrybonukleotydowego.

Komórki prokariotyczne: Małe, stosunkowo proste komórki, obejmujące większość drobnoustrojów.

Promotor: Obszar DNA odpowiedzialny za zainicjowanie transkrypcji.

Enzym restrykcyjny: Enzym, który rozpoznaje określoną krótką sekwencję DNA i rozszczepiają.

Sekwencja rozpoznawania restrykcyjnego: Sekwencja DNA specyficznie rozpoznawana przez określony enzym restrykcyjny. Określana również jako miejsce docelowe.

Wektor bifunkcjonalny: Dwufunkcjonalny wektor klonowania zdolny do replikacji w jednym lub więcej różnych gospodarzach (np. w E. coli i Streptomyces).

Zjawisko pojedynczego crossing-over: Pojedyncza wzajemna rekombinacja genetyczna występująca w jednym punkcie. Powoduje ona integrację zewnętrznego plazmidu kołowego lub wektora fagowego i duplikację w homologicznej sekwencji chromosomu.

Blotting Southema: Procedura przenoszenia zdenaturowanego DNA z żelu agarozowego na filtr z nitrocelulozy, na którym można przeprowadzić jego hybrydyzację z komplementarną sondą kwasu nukleinowego.

Subklonowanie: Przenoszenie klonowanych fragmentów DNA z jednego typu wektora na inny, np. ze zrekombinowanego kosmidu na plazmid. Nowy zrekombinowany plazmid transformuje się następnie do odpowiedniej komórki gospodarza w celu uzyskania subklonowego szczepu.

Transformacja komórek bakteryjnych: Oznacza przyjmowanie nowych markerów genetycznych poprzez wbudowanie dodanego DNA.

Streszczenie wynalazku

Przedmiotem wynalazku są wyizolowane fragmenty DNA kodujące kompleks dehydrogenazy α-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu organizmu należącego do gatunku Streptomyces.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto segment DNA opisany powyżej, który zawiera ponadto obszar DNA regulujący ekspresję takiego kompleksu dehydrogenazy α-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu.

Przedmiotem wynalazku jest także wydzielony segment DNA, który koduje kompleks dehydrogenazy α-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu Streptomyces avermitilis.

Przedmiotem wynalazku jest także segment DNA obejmujący sekwencję DNA przedstawionąponiżej jako sekwencja ID nr 1, sekwencja ID nr 2, sekwencja ID nr 3 lub sekwencja ID nr 4, albo alleliczny wariant takiej sekwencji. Dotyczy on także segmentu DNA stanowiącego podzbiór powyższego segmentu DNA, równoważnego pod względem funkcjonalnym.

178 993

Wynalazek dotyczy także (a) zrekombinowanego DNA obejmującego sekwencję DNA przedstawioną]ako sekwencja ID nr 1, sekwencja ID nr 2, sekwencja ID nr 3 lub sekwencja ID nr 4, albo alleliczny wariant takiej sekwencji; (b) plazmidu zawierającego taki zrekombinowany DNA; oraz (c) komórki gospodarza, do której wprowadzono taki zrekombinowany DNA.

Wynalazek dotyczy również genów dla kompleksu dehydrogenazy α-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu, zawartych w segmencie DNA wybranym z grupy obejmującej pCD713, pCD740, pCD747 i pCD854, określone poniżej.

Wynalazek dotyczy ponadto segmentu DNA obejmującego sekwencję DNA przedstawionąjako sekwencja ID nr 1, sekwencja ID nr 2, sekwencja ID nr 3 lub sekwencja ID nr 4, albo alleliczny wariant takiej sekwencji.

Wynalazek dotyczy także segmentu DNA obejmującego sekwencję DNA stanowiącą podzbiór sekwencji DNA przedstawionej jako sekwencja ID nr 1, sekwencja ID nr 2, sekwencja ID nr 3 lub sekwencja ID nr 4, albo allelicznego wariantu takiej sekwencji, zdolnądo hybrydyzacji odpowiednio z sekwencjąDNA przedstawioną jako sekwencja ID nr 1, sekwencja ID nr 2, sekwencja ID nr 3 lub sekwencja ID nr 4, albo z allelicznym wariantem takiej sekwencji, po zastosowaniu jako sonda, albo do amplifikacji całości lub części takiej sekwencji po zastosowaniu jako strater polimerazowej reakcji łańcuchowej.

Wynalazek dotyczy również oczyszczonego polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasów przedstawionąjako sekwencja ID nr 5, sekwencja ID nr 6, sekwencja ID nr 7 lub sekwencja ID nr 8.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania naturalnej awermektyny, polegający na tym, że przeprowadza się fermentację, w warunkach oraz w ośrodki fermentacji odpowiednich do wytwarzania takiej naturalnej awermektyny, S. avermitilis, w którym zwiększona została liczba kopii fragmentu genomowego zawierającego jeden lub więcej spośród genów bkdF, bkdG i bkdH.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania naturalnej awermektyny, polegający na tym, że przeprowadza się fermentację, w warunkach oraz w ośrodki fermentacji odpowiednich do wytwarzania takiej naturalnej awermektyny, S. avermitilis, w którym ekspresja fragmentu genomowego zawierającego jeden lub więcej spośród genów bkdF, bkdG i bkdH, została wzmocniona na drodze manipulacji lub podstawienia genów odpowiedzialnych za regulację takiej ekspresji.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania nowej awermektyny, polegający na tym, że przeprowadza się fermentację, w warunkach oraz w ośrodki fermentacji odpowiednich do wytwarzania takiej nowej awermektyny, S. avermitilis, w którym ekspresja fragmentu genomowego zawierającego jeden lub więcej spośród genów bkdF, bkdG i bkdH, została osłabiona lub wyeliminowana poprzez delecję, dezaktywację, podstawienie lub inną manipulację genami odpowiedzialnymi za taką ekspresję.

W korzystnym wykonaniu przedmiotem wynalazku jest powyższy sposób wytwarzania nowej awermektyny, polegający na tym, że przeprowadza się fermentację, w warunkach oraz w ośrodki fermentacji odpowiednich do wytwarzania takiej nowej awermektyny, S. avermitilis, w którym fragment genomowy zawierający jeden lub więcej spośród genów bkdF, bkdG i bkdH, został wycięty lub zdezaktywowany.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania nowej awermektyny, polegający na tym, że przeprowadza się fermentację, w warunkach oraz w ośrodki fermentacji odpowiednich do wytwarzania takiej nowej awermektyny, S. avermitilis, w którym ekspresja fragmentu genomowego zawierającego jeden lub więcej spośród genów bkdB, bkdB i bkdC oraz jeden lub więcej spośród genów bkdF, bkdG i bkdH, została osłabiona lub wyeliminowana poprzez delecję, dezaktywację, podstawienie lub inną manipulację genami odpowiedzialnymi za taką ekspresję.

W korzystnym wykonaniu przedmiotem wynalazku jest powyższy sposób wytwarzania nowej awermektyny, polegający na tym, że przeprowadza się fermentację, w warunkach oraz w ośrodki fermentacji odpowiednich do wytwarzania takiej nowej awermektyny, S. avermitilis, w którym fragment genomowy zawierający jeden lub więcej spośród genów bkdB, bkdB i

178 993 bkdC oraz jeden lub w ięcej spośród genów bkdF, bkdG i bkdH, został wycięty lub zdezaktywowany.

Krótki opis rysunków

Figura 1: Sekwencja nukleotydowa starterów polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR) wykorzystywanych do klonowania fragmentu genu S. avermitilis bkdF (El-aBCKDH). Każdy starter skonstruowano na obszarze odpowiadającym 9 zachowanym aminokwasom. Kodony odpowiadające każdemu z zachowanych aminokwasów zaznaczono kreskami nad odpowiednią sekwencją DNA. Starter prawostronny skonstruowano na obszarze obejmującym aminokwasy 192-200 ludzkiej podjednostki El-aBCKDH, którą zastosowano jako reprezentatywny model podjednostki Ε1 -aBCKDH. Starter lewostronny skonstruowano na obszarze obejmującym aminokwasy 286-293 podjednostki El-aBCKDH. Na końcu 5' prawostronnego startera znajdują się dwa dodatkowe nukleotydy obejmujące adeninę, a ponadto dodano dwie sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne (EcoRI i SacI). Również na końcu 5' lewostronnego startera znajdują się dwa dodatkowe nukleotydy obejmujące adeninę oraz dwie sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne (BamHI i Xbal).

Figura 2: Genomowa mapa restrykcyjna, lokalizacja i subklony dla skupienia genowego Streptomyces avermitilis bkdFGH. Zaznaczono również lokalizację skupienia genowego bkdABC, ujawnionego uprzednio (patrz Denoya, zgłoszenie patentowe USA nr 08/100 518, wspomniane powyżej). Puste ramki pod mapą oznaczają lokalizację i orientację wyjściowych El -a-specyficznych genomowych fragmentów z S. avermitilis, klonowanych z wykorzystaniem PCR. Zaznaczono genomowe subklony (pochodzące od pGEM-3Z). Zaznaczono także lokalizację i organizację genów strukturalnych bkdF, bkdG i bkdH, kodujących odpowiednio podjednostki BCKDH, El-o, El-β i E2. Polamość zidentyfikowanych otwartych ramek odczytu (zaznaczonych ramkami) jest od lewej do prawej. Skróty: B - BamHI; Bg - BgUI; P - Pstl; S - SphI. „X” oznacza lokalizację insercji transpozonu mini-γ-δ, zastosowanej do obszarów sekwencji DNA w dół od otwartej ramki odczytu bkdF, jak to opisano poniżej.

Figura 3: Sekwencja nukleotydowa i wydedukowane produkty translacji fragmentu genomowego DNA S. avermitilis o 501 bp (CD613) klonowanego metodą PCR z wykorzystaniem starterów pokazanych na fig. 1. Ten genomowy fragment zawiera część genu bkdF (El-a BCKDH). Nukleotydy ponumerowano nad liniami sekwencji. Wydedukowaną sekwencję aminokwasów podano pod odpowiednią sekwencją kodonu.

Figura 4: Sekwencja nukleotydowa i wydedukowane produkty translacji fragmentu genomowego DNA S. avermitilis o 201 bp sekwencjonowanego od końca Pstl subklonu pCD746 z wykorzystaniem startera wektorowego SP6. Wydedukowany produkt translacji reprezentuje część składnika Ε1 -β kompleksu BCKDH odpowiadającą genowi bkdG. Nukleotydy ponumerowano nad liniami sekwencji. Wydedukowaną sekwencję aminokwasów podano pod odpowiednią sekwencją kodonu.

Figura 5: Sekwencja nukleotydowa (sekwencja CD785) i wydedukowane produkty translacji fragmentu genomowego DNA S. avermitilis o 194 bp sekwencjonowanego z obydwu końców insercji mini-γ-δ-Ι „A3” zlokalizowanej około 1,7 kb od końca BamHI, zawierającej gen bkdF we fragmencie genomowym BamHI o 4,1 kb. Wydedukowany produkt translacji reprezentuje C-końcową część składnika El -β kompleksu BCKDH odpowiadającą genowi bkdG. Nukleotydy ponumerowano nad liniami sekwencji. Wydedukowaną sekwencję aminokwasów podano pod odpowiednią sekwencją kodonu.

Figura 6: Sekwencja nukleotydowa (sekwencja CD786) i wydedukowane produkty translacji fragmentu genomowego DNA S. avermitilis o 455 bp sekwencjonowanego z obydwu końców insercji mini-γ-δ-1- „A5” zlokalizowanej około 3 kb od końca BamHI, zawierającej gen bkdF we fragmencie genomowym BamHI o 4,1 kb. Wydedukowany produkt translacji reprezentuje C-końcową część składnika E2 kompleksu BCKDH odpowiadającą genowi bkdH. Nukleotydy ponumerowano nad liniami sekwencji. Wydedukowaną sekwencję aminokwasów podano pod odpowiednią sekwencją kodonu.

178 993

Figura 7: Konstrukcj a podstawiaj ącego gen wektora pCD768 i genomowa mapa restrykcyjna szczepu mutantowego S. avermitilis bkdF, CD794. Plazmid pCD768 pochodzi od wektora bifunkcjonalnego pCD262 przenoszącego fragmenty genomowe BamHI S. avermitilis o 2,3 i 4,1 kb, flankujące marker ermE (czarna strzałka). Plazmid pCD761 stanowi konstrukt pośredni, opisany poniżej. Pokazano także genomowe mapy restrykcyjne (dla szczepu dzikiego i podstawionego) obszaru chromosomu S. avermitilis zawierającego gen bkdF. Mapy te wydedukowano z analizy hybrydyzacji Southema z wykorzystaniem fragmentu genomowego Pstl o 5,0 kb jako sondy. Skróty: B - BamHI; P - PstO. Liczby powyżej każdego fragmentu DNA oznaczają długość w kilozasadach (kb).

Figura 8: Mapa restrykcyjna podstawiającego gen wektora pCD768. Zacieniowane ramki oznaczają: tsr - marker odporności na tiostrepton; amp - marker odporności na ampicylinę; „2.3” - fragment genomowy BamHI S. avermitilis o 2,3 kb; ermE - marker odporności ma erytromycynę; „4.1” - fragment genomowy BamHI S. avermitilis o 4,1 kb; Zaznaczono również obszary replikacji pochodzące ze Streptomyces i E. coli. Białe ramki oznaczają obszar wektora E. coli. Strzałki oznaczają kierunek transkrypcji i translacji.

Figura 9: Konstrukcja mutanta bkdABCF. Pokazano genomowąmapę restrykcyjną oraz uproszczone rysunki konstruktów wektorowych i docelowych obszarów genomowych. Lokalizacja skupisk genów bkd, orientacja otwartych ramek odczytu oraz skróty - patrz opis fig. 3. Wycięte segmenty zaznaczono obszarem zacieniowanym na szaro. Linie ciągłe i przerywane oznaczają odpowiednio chromosomowy i wektorowy DNA. Grube czarne linie oznaczająklonowane fragmenty genomowe wykorzystywane w podstawieniu genu. Strzałki pionowe wskazują miejsce insercji markera odporności na antybiotyk.

Szczegółowy opis wynalazku

Nowe sekwencje DNA według wynalazku sklonowano z wykorzystaniem dwóch technik inżynierii genetycznej, polimerazowej reakcji łańcuchowej DNA (PCR) i sondowania homologii.

Procedury identyfikacji i klonowania nowych sekwencji DNA według wynalazku oraz konstrukcji mutanta bkd przez podstawienie genowe opisano poniżej.

Najpierw skonstruowano dwa startery, określone jako „prawostronny” i „lewostronny” (fig. 1), zachowanych obszarach zidentyfikowanych na podstawie wielokrotnego zestrajania wydedukowanych sekwencji peptydowych El a BCKDH dla różnych gatunków oraz dostępnych z literatury. Produkt PCR, w przybliżeniu o długości 0,55 kb, wykryto na drodze amplifikacji PCR genomowego DNA S. avermitilis stosując startery lewo- i prawostronny. Uzyskany w wyniku amplifikacji PCR fragment DNA sklonowano następnie do wektora E. coli pGEM-3Z uzyskując zrekombinowany plazmid pCD613. Następnie, plazmid pCD613 przeniesiono do kompetentnych komórek E. coli DH5-a. Wybrano jeden transformant oznaczając go jako szczep CD613. Sekwencjonowanie DNA sklonowanego fragmentu DNA CD613 wykazało obecność z wydedukowanym peptydem wysoce homologicznym z podjednostką El-a BCKDH (fig. 3). Sklonowany fragment CD613 genomowego fragment DNA zastosowano następnie jako sondę do selekcjonowania biblioteki chromosomów S. avermitilis metodą hybrydyzacji kolonii. Zidentyfikowano szereg klonów kosmidowych. Analiza restrykcyjna i blotting Southerna wykazały, że wszystkie wyselekcjonowane klony kosmidowe przenoszą zachodzące na siebie fragmenty genomowe. Sekwencjonowanie DNA obszaru chromosomowego uzyskanego z fragmentów subklonowanego genomowego DNA (w sposób opisany w przykładzie 6) wykazało, że sekwencja CD613 stanowi część skupienia pełnego genu bkd. Sklonowane geny bkd S. avermitilis bkd genes obejmują obszar chromosomu o długości około 4 kilozasad (fig. 2). Analiza sekwencji DNA wykazała obecność genów strukturalnych ułożonych jako skupienie genów w następującym porządku: otwarte ramki odczytu Ε1 -a(bkdF), Ε1 -β (bkdG), and E2 (bkdH) (fig. 2-6).

Następnie skonstruowano plazmid przenoszący zdezaktywowaną wersję genu bkdF. Jak to pokazano na fig. 2, trzy sąsiadujące fragmenty restrykcyjne BamHI w chromosomie S. avermitiliszmapowano (od lewej do prawej): 2,3 kb, 1,4 kb i 4,1 kb. Fragment genomowy BamHI o l,4kb przenosi początek otwartej ramki odczytu (ORF-1) (gen bkdf). Fragment BamHI o 4,1 kb przenosi resztę skupienia genu bkd (koniec bkdf, bkdg i bkdh). Plazmid pCD768 jest pochodną we

178 993 która dwufunkcjonalnego pCD262 przenoszącego dwa fragmenty genomowe S. avermitilis (2,3 and 4,1 kb BamHI) sąsiadujące po każdej stronie z fragmentem 1.4 kb BamHI chromosomu. pCD768 przenosi ponadto marker ermE zlokalizowany między fragmentami BamHI o 2,3 i 4,1 kb. Marker ermE (nadający odporność na erytromycynę) jest zorientowany odwrotnie do ORF-1 (bkdF), aby uniknąć ewentualnych problemów związanych z nadekspresją dalszych genów. Konstrukt ten w wyniku rekombinacji wprowadza delecję 1,4 kb (ORF1 zostanie naruszona) w genomie gospodarza, jak to zostanie opisane poniżej.

PlamizdpCD768 przeniesiono do protoplastów gospodarza S. avermitilis 31272 SC2. Wyselekcjonowano dwa transformanty wykazujące odporność zarówno na antybiotyki, erytromecynę (erm-R) jak i tiostrepton (tsr-R). Transformant nr 1(CD783) hodowano w ciekłym ośrodku, po czym protoplasty wypreparowano i posiano na ośrodku agarowym zawierającym erytromycynę. Wybrano 50 klonów, które zanalizowano dokładniej: 46 było erm-R, tsr-R; 4 były erm-R, tsr-S. O statnie 4 klony wykazywały fenotyp zubożony w bkd, na co wskazywało: nie mogły rosnąć na płytkach z minimalnym ośrodkiem ILV; nie wykazywały wykrywalnej aktywności El (dekarboksylazy rozgałęzionych łańcuchów); oraz w czasie fermentacji nie były one zdolne do wytwarzania naturalnych awermektyn, o ile ośrodek nie został uzupełniony kwasem (S)-(+)-2-metylomasłowym lub kwasem izomasłowym (patrz przykład 9). Na dodatek po dodaniu CHC do ośrodka fermentacji, nastąpiła synteza nowych awermektyn (CHC-awermektyn), co wykazuje, że blok bkd nie wpływa na układ biosyntezy awermektyny w komórce. Jeden klon z tej grupy 4 klonów (klon pp 15) nazwano jako szczep S. avermitilis CD794 i zdeponowano w American Type Culture Collection jako przykładowy szczep według wynalazku. Ponadto analiza hybrydyzacyjna Southern potwierdziła, że ORF-1 odpowiadająca genowi bkdF zgodnie z oczekiwaniem uległa rozbiciu w wyniku podstawienia genowego w S. avermitilis ATCC 31272 SC2.

Poniżej podano pełny opis etapów doświadczalnych przeprowadzanych przy klonowaniu genów S. avermitilis bkd genes, oraz uzyskane wyniki:

(a) Identyfikacja zachowanych obszarów w podjednostce peptydu El-a BCKDH, które mogą służyć jako potencjalne miejsca wiązania starterów PCR sekwencje peptydowe ΕΙ-α-BCDKH, ludzką (Fischer i inni, 1989, J. Biol. Chem., 264: 3448-3453), szczura (Zhang i inni, 1987, J. Biol. Chem., 262: 15220-15224), Pseudomonas putida (Sokatch i inni, 1988, Eur. J. Biochem., 176: 311-317)orazBacillus stearothermophilus (Perham i inni, 1990, Eur. J. Biochem., 191: 337-346) zestrojono, aby zidentyfikować zachowane obszary, które mogą służyć jako sekwencje do konstrukcji odpowiednich starterów PCR. Analizę komputerową w celu zidentyfikowania obszarów podjednostki El-o, które są w wysokim stopniu zachowane zarówno w prokariotycznych jak i eukariotycznych kompleksach BCKDH przeprowadzono wykorzystując programy LineUp i Pretty z zestawu oprogramowania GCG do analizy sekwencji (GCG, Madison, WI). Wielokrotne zestrajanie 4 peptydów El a BCKDH wykazało szereg obszarów o wydłużonej homologii (patrz Wexler I.D. i inni, 1991, FEBS Letters, 282: 209-213). Motyw wiązania pirofosforanu tiaminowego (Perham i inni, 1989, FEBS Letters, 255: 77-82) zlokalizowano między ludzkimi aminokwasami 182-299 El -o, a obszar z miejscami fosforylowania 1 i 2, obejmujący aminokwasy 291 -307, był wyraźnie zachowany we wszystkich 4 analizowanych peptydach El-a BCKDH. Stwierdzono także występowanie uprzednio opisanego obszaru o wysokiej homologii, zlokalizowanego między aminokwasami 245-289. Okazuje się, że jest to obszar unikatowy dla dehydrogenaz β-ketokwasów zawierających podjednostki a i b, przy czym nie jest on homologiczny z żądanąz sekwencji w E. coli PDH El lub ze składnikami El E. coli i drożdżowymi kompleksami dehydrogenazy α-ketoglutaranowej, będącymi dimerami złożonymi jedynie z pojedynczego polipeptydu El. Z powyższych względów sugerowano, że ten ostatni obszar homologii odgrwa rolę w oddziaływaniu podjednostek (Patel i inni, 1991, FEBS Letters,. 28-2: 209-213). Zachowane obszary wybrano do konstrukcji startera PCR kodującego reszty aminokwasów 192-200 i 286-293 ludzkiego białka El-α BCKDH.

(b) Konstrukcja nowych oligonukleotydów pochodzących z tych zachowanych obszarów El-a BCKDH do stosowania jako startery PCR

178 993

Jak to zaznaczono uprzednio, na podstawie wielokrotnego zestrajania wyselekcjonowano dwa zachowane obszary podjednostki E1 -a BCKDH. Prawostronny starter PCR (fig. 1) skonstruowano na obszarze obejmującym aminokwasy 192-200 ludzkiej podjednostki El-a BCKDH, zastosowanej jako reprezentatywny model podjednostki El-a BCKDH. Aminokwasy te są zlokalizowane w motywie wiązania pirofosforanu tiaminy. Lewostronny starter (fig. 1) skonstruowano na obszarze obejmującym aminokwasy 286-293 ludzkiej podjednostki El-aBCKDH. Ta ostatnia sekwencja aminokwasów obejmuje końcową część miejsca oddziaływania podjednostki oraz początek zachowanych obszarów miejsca fosforylowania. Zastosowano podziały kodonu genu Streptomyces (F. Wright i M. J. Bibb, 1992, Gene, 113: 55-65). Na końcu 5' prawostronnego startera znajdująsię dwa dodatkowe nukleotydy zawierające adeninę, oraz dwie sekwencje rozpoznawane przez enzymu restrykcyjne (EcoRI and SacI), aby ułatwić klonowanie produktów PCT. Także na końcu 5' prawostronnego startera znajdująsię dwa dodatkowe nukleotydy zawierające adeninę, oraz dwie sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne (BamHI i Xbal).

Pełna sekwencja prawostronnego startera PCR jest następująca:

5'-AAGAATTCGAGCTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3'.

Pełna sekwencja lewostronnego startera PCR jest następująca: 5'-AAGGATCCTCTAGAGGTSSWGTGGKGGCCGATSCGGWA-3'.

Do opisu sekwencji DNA wykorzystano zasady International Union Biochemistry (IUB) dotyczące nomenklatury nukleotydów. Powtórzenia zaznaczono zgodnie z kodami IUB Group w sposób następujący: K=G+T, S=G+C oraz W=A+T. Sekwencje rozpoznawania restrykcyjnego nie homologiczne z genami El-abkd, wprowadzone do starterów w celu ułatwienia klonowania, zostały podkreślone (patrz fig. 1).

(c) Amplifikacja PCR fragmentów genomowego DNA S. avermitilis

Genomowy DNA S. avermitilis enzymatycznie zamplifikowano w warunkach reakcji odpowiednich dla DNA o wysokiej zawartości GC, umożliwiających wydajnąi specyficznąamplifikację DNA streptomyces (patrz przykład 2). PCR przeprowadzono stosując wyżej opisaną kombinację starterów (starter prawostronny, 5'-AAGAATTCGAGCTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3' oraz starter lewostronny, 5'-AAGGATCCTCTAGAGGTSSWGTGGKGGCCGATSCGGWA-3'). Produkty amplifikacji rozfrakcjonowano pod względem wielkości metodą elektroforezy na żelu agarozowym. W opisanych wyżej warunkach PCR przy stosowaniu podanej kombinacji starterów wykryto pojedyncze pasmo DNA (o długości około 550 par zasad).

(d) Klonowanie zamplifikowanego fragmentu genomowego DNA w wektorze klonowania Escherichia coli, a następnie transformacja do gospodarza, E. coli

Jak to zaznaczono powyżej, miejsce restrykcyjne EcoRI wprowadzono do prawostronnego startera PCR, aby ułatwić klonowanie, a a miejsce restrykcyjne Xbal znajdowało się na końcu 5' startera lewostronnego. Fragment PCR o 0,55 kb odzyskano z żelu agarozowego na drodze elektroeluowania, po czym strawiono go enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Xbal. Odzyskano wiele zrekombinowanych klonów po zligowaniu określonego fragmentu z linearyzowanym wektorem E. coli (pGEM-3Z) uzyskując zrekombinowany plazmid pCD613, który przeniesiono do kompetencyjnych komórek E. coli. Jeden transformant wybrano do dalszych badań, określając go jako szczep CD613. Potwierdzająca analiza restrykcyjna wykazała, że plazmid pCD613, wydzielony ze szczepu E. coli CD613 rzeczywiście zawiera insert 0,55 kb z S. avermitilis.

(e) Sekwencjonowanie DNA klonowanego fragmentu i identyfikacja sekwencji specyficznych względem bkd

Przeprowadzono sekwencjonowanie insertu o 0,55 kb znajdującego się w plazmidzie pCD613 metodą dwuniciowego sekwencjonowania z wykorzystaniem pary starterów wektorowych (patrz przykład 6A). Dodatkowo przeprowadzono również subklonowanie fragmentu Sali o 0,35 kb zlokalizowanego wewnątrz insertu PCR o 0,55 kb w bakteriofagu Ml 3, a następnie sekwencjonowanie metodąjednoniciowego sekwencjonowania (patrz przykład 6B). Sekwencjonowanie DNA wykonano techniką terminacji łańcucha didezoksynukleotydowego stosując matrycowy jednoniciowy DNA i zestaw TaqTrack (Promega). Analiza preferencji kodonów (zestaw oprogramowania GCG do analizy sekwencji, Madison, WI) danych z sekwencjonowaniaDNA wykazała

178 993 obecność otwartej ramki odczytu z oczekiwaną przydatnością kodonu względem genu streptomyces.

Następnie wykonano translację przypuszczalnej otwartej ramki odczytu na sekwencję aminokwasów z wykorzystaniem programów Seq i Translate oprogramowania IntelliGenetocs Suitę (IntelliGenetics Inc., Mountain View, California). Na koniec wykonano przeszukiwanie podobieństwa w banku danych z zapytaniem o sekwencję peptydu, wykorzystując program FASTDB program z pakietu IntelliGenetics. Wszystkie przeszukiwania banków danych, obejmujące zarówno przeszukiwanie banków danych DNA (GenBank®, National Institute Health i European Molecular Biology Laboratory (EMBL), Heidelberg, Niemcy) jak i banków danych dla białek (PIR i Swiss-Prot), jednoznacznie wykazały, że sekwencja pochodząca z klonu CD613 jest w wysokim stopniu homologiczna, ale nowa i różni się od wszystkich innych peptydów E1 -a BCKDH wymienionych w bankach danych, pochodzenia zarówno prokariotycznego jak i eukariotycznego. Porównano także nową sekwencję peptydową Sterptomyces avermitilis El-a BCKDH kodowaną przez gen bkdA (patrz Denoya, C.D., 1993, „Cloned genes encoding branched-chain alpha-ketoacid dehydrogenase complex from Streptomyces avermitilis”, zgłoszenie patentowe USA nr 08/100, 518 z 30 lipca 1993). Z analizy tej wywnioskowano, że genomowy produkt PCR S. avermitilis o 550 bp klonowany w E. coli, szczep CD613 stanowi rzeczywiście fragment nowego genu El-a bkd.

(f) klonowanie pełnego skupienia genu S. avermitilis bkd, restrykcja i blotting Southema oraz konstrukcja mapy chromosomowej

Jak to zaznaczono powyżej, wyjściowy fragment PCR o 0,55 kb zawiera wewnętrzny fragment Sali o 0,35 kb. Ten mały fragment zastosowano jako radioaktywnie znaczoną sondę do selekcjonowania biblioteki kosmidów genomowego DNA S. avermitilis na drodze hybrydyzacji kolonii. Zidentyfikowano i oddzielono 10 klonów. Analiza restrykcyjna i hybrydyzacja metodą blottingu Southema wykazały, że 10 klonów zawiera nakładające się sekwencje pochodzące z tego samego obszaru chromosomowego. Tą samą sondę zastosowano z dużą ostrością w stosunku do biotów Southema strawionego chromosomowego DNA z S. avermitilis ATCC 31272 SC2. Ta ostatnia analiza potwierdziła identyczność klonów odzyskanych z biblioteki genomowej. Nieoczekiwanie dwa spośród klonów kosmidowych hybrydyzowały również z sondą specyficzną względem bkdA (patrz Denoya, C.D., 1993, „Cloned genes encoding branched-chain alpha-ketoacid dehydrogenase complex from Streptomyces avermitilis”, zgłoszenie patentowe USA nr 08/100,518, z 30 lipca 1993), co sugeruje, że gen bkdprzedstawiony w opisie (oznaczony jako bkdF) może być zlokalizowany w pobliżu skupienia genowego obejmującego bkdA, bkdB i bkdC. Skonstruowano mapę restrykcyjną obszaru genomowego obejmującego sekwencję S. avermitilis CD613 (fig. 2). Zgodnie z przewidywanymi na podstawie wyników hybrydyzacji opisanej poniżej gen kbd oddzielony jest od skupienia genowego bkdABC jedynie o 12 kilozasad.

(g) Subklonowanie fragmentów genomowego DNA pochodzących z klonów kosmidowych oraz sekwencjonowanie DNA obszaru chromosomowego S. avermitilis przenoszącego skupienie genów bkd.

Fragmenty genomowe BamHI i Pstl obejmujące cały obszar CD613 bkd biblioteki DNA do wektora E. coli pGEM-3Z. Poniżej podano listę subklonów skonstruowanych w tym eksperymencie wraz z krótkim opisem każdego plazmidu.

1. Plazmid pCD740 zawiera BamHI fragment o 2,3 kb;

2. Plazmid pCD854 zawiera BamHI fragment o 1,4 kb;

3. Plazmid pCD713 zawiera BamHI fragment o 1,4 kb; oraz

4. Plazmid pCD747 zawiera insert Pstl o około 5 kb.

(Szczepy Escherichia coli CD740, CD854, CD713 i CD747, odpowiadające kolejno 4 powyższym plazmidom zdeponowano w American Type Culture Collection. Odpowiednią informację dotyczącą tych depozytów znaleźć można w formularzu PCT RO/134, stanowiącym 55 stronę niniejszego zgłoszenia). Dodatkowo uzyskano subklon zawierający fragment Pstl/BamHI o około 3,1 kb pochodzący z fragmentu BamHI o 4,1 kb, przenoszony w plazmidzie pCD713.

178 993

Nowy konstrukt odzyskano jako plazmid pCD746 i zastosowano go do sekwencjonowania DNA w sposób opisany poniżej. Mapowanie restrykcyjne plazmidu, hybrydyzacja Southema i analiza PCR potwierdziły identyczność wszystkich subklonów.

(h) Analiza komputerowa danych z sekwencjonowania DNA uzyskanego z klonowanych fragmentów DNA i identyfikacja otwartych ramek odczytu S. avermitilis El-a, El-β i E2 bkd

Dane z sekwencjonowania DNA uzyskano dla szeregu różnych subklonów i konstruktów w sposób następujący:

1. CD613 reprezentuje wyjściowy klon PCR opisany powyżej w częściach „a” i „c” oraz w przykładach 2 i 3. Zawiera część otwartej ramki odczytu 1 (ORF-1), która odpowiada genowi bkdF składnika El-akompleksu BCKDH (fig. 3).

2. CD746 reprezentuje fragment PstLBamHI pochodzący z pCD713 (patrz część „g” powyżej). Dane z sekwencjonowania DNA uzyskane w wyniku sekwencjonowania końca Pstl insertu pCD746 z wykorzystaniem startera wektorowego (uzyskanego z Promega Co.) potwierdziły, że część ORF-2 odpowiadającą genowi bkdG kodującemu składnik E1 -β kompleksu BCKDH (fig. 4).

3. CD785 Transpozon insercji mini-γ-δ zastosowanej do obszarów sekwencji DNA zlokalizowanych w dół od otwartej ramki odczytu bkdF w klonowanym fragmencie genomowym BamHI o 4,1 kb. Ta insercja miniy-6, oznacza jako „A3” została zlokalizowana o około 1,7 kb od końca BamHI zawierającego gen bkdF. Sekwencjonowanie DNA przeprowadzone od obydwu końców insercji A3 (patrz przykład 6C) wykazało obecność ORF odpowiadającej końcowi El-β ORF (ORF-2) (bkdG) (fig. 5).

4. CD786: Transpozon insercji mini-γ-β-Ι zastosowanej do obszarów sekwencji DNA zlokalizowanych w dół od otwartej ramki odczytu bkdF w klonowanym fragmencie genomowym BamHI o 4,1 kb. Ta insercja mini-γ-β, oznaczonajako „A5” została zlokalizowana o około 1,7 kb od końca BamHI zawierającego gen bkdF. Sekwencjonowanie DNA przeprowadzone od obydwu końców insercji A5 (patrz przykład 6C) wykazało obecność ORF odpowiadającej końcowi Ε2-β ORF (ORF-2) (bkdH) (fig. 6).

Analizę składu ślizgających się zasad sekwencjonowanego obszaru genomowego zawierającego otwarte ramki odczytu (ORF) S. avermitilis El -a, El-β i E2 (częściowo) bkd przeprowadzono za pomocą oprogramowania „DNA Inspector” (Textco, N.H.). Analiza ta zapewnia profil średniej bieżącej zawartości G+C przy długości rozciągłości 30 zasad i wielkości odchylenia 20. Ogólna zawartość G+C dla tego obszaru chromosomu S. avermitilis wynosiła 69%. Zanalizowano także zawartość G+C w funkcji pozycji kodonu. Otwarte ramki odczytu wykryto przy pomocy programu „CodonPreference” (Genetics Computer Group, Madison, Wl) z tablicą występowania kodonów Sterptomyces dla 64 genów (F. Wright and M. J. Bibb, 1992, Gene, 113: 55-65). Program Codon Preference jest programem wyszukującym geny specyficzne względem ramki, który próbuje rozpoznać sekwencje kodujące białko na podstawie ich podobieństwa do tablicy częstości kodonów lub odchylenia ich składu (zazwyczaj GC) w trzeciej pozycji każdego kodonu. ORF przedstawiono jako ramki pod krzywą dla ich odpowiednich ramek odczytu. Wykryto również wszystkie kodony inicjacyjne (ATG) i terminacyjne, przedstawiając je liniami pionowymi. Rzadkie kodony stwierdzone w każdej z ramek odczytu zaznaczono poniżej każdego wykresu ORF. Zawartość C+G wyliczano stosując ślizgające się okno 25 kodonów, tak że oczekiwano około 25 kodonów przed zaobserwowaniem pełnego obszaru kodującego białko. Uzyskano 3 profile: 1, pierwsza pozycja w tryplecie; 2, druga pozycja w tryplecie; 3, trzecia pozycja w tryplecie. W wyniku tej analizy zlokalizowano trzy ORF bkd odpowiadające podjednostkom BCKDH: El-α, El-a, and E2.

(i) Konstrukcja mutanta S. avermitilis bkd

Technika zastosowana do wprowadzania delecji stanowi wariant metod podstawienia genowego zastosowanych w odniesieniu do Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli i Bacillus subtilis(Scherer S. iR.W. Davis, 1979, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 76: 4951-4955; ShortieD. i inni, 1982, Science, 217: 371-373; Stahl M.L. i Ferrari E., 1984, J. Bacteriol., 158: 411-418). Ogólny opis tej techniki zastosowanej w odniesieniu do Streptomyces znaleźć można w publikacji przeglądowej „Genetic Manipulation Streptomyces: Integrating Yectors and Gene Replace

178 993 ment”, Kieser T. i Hopwood D. A. (1991, Methods in Enzylomogy, vol. 204, 430-458). Szczegółowy opis tej metody wraz z dodatkowym etapem protoplastowania niezbędnym dla zapewnienia uzyskania izolatów pojedynczych kolonii oraz zwiększenia częstości eliminacji plazmidu znaleźć można również w publikacji Anzai i inni, „Replecement Streptomyces hygroscopicus genomie segments with in vitro altered DNA sequences”, Journal Antibiotics, 1988, vol. XLI, nr 2, 226-233.

Kluczowy etap w uzyskiwaniu zmutowanego szczepu do zastosowań przemysłowych na drodze podstawienia genowego stanowi konstrukcja integracyjnego wektora, który będzie działać wydajnie w odniesieniu do konkretnego szczepu. Dodatkowo przy zastępowaniu genów w chromosomie Streptomyces jednym z ważniejszych problemów jest eliminacja wektora. Plazmidy Escherichia coli z selektywnymi markerami względem Streptomyces mogą wydawać się idealne, gdyż nie mogą one ulegać replikacji w Streptomyces. Plazmidy E. coli zastosowano z powodzeniem w S. ambofaciens i S. lividas (Kieser T. i Hopwood D. A., 1991, Genetic Manipulation Streptomyces: Integrating Vectors and Gene Replacement, w: Methods in Enzymołogy, vol. 204, 430-458). Jednakże w przeprowadzonych doświadczeniach strategia taka zapewniała małą wydajność integracji w S. avermitilis, tak że zachodziło przede wszystkim pojedyncze crossing-over.

Ostatnio opracowano szereg czułych wektorów dwufunkcj onalnych przydatnych w klonowaniu zarówno w S. avermitilis jak w E. coli, oraz w wielu zastosowaniach technice genetyki molekularnej w przypadku Streptomyces (C.D. Denoya, 1993, „Novel Bacterial Plasmid Shuttle Vectors for Streptomyces sp. and Eschericha coli”, zgłoszenie patentowe USA nr 032,925 z 18 marca 1993). Takie wektory dwufunkcjonalne są strukturalnie trwałe i ulegająwydajnie replikacji w E. coli oraz w szeregu gatunków Streptomyces, co umożliwia przeniesienia klonowanych fragmentów DNA o szerokim zakresie wielkości z jednego gospodarza do drugiego i na odwrót. Trzy wektory dwufunkcjonalne (pCD262, pCD385 i pCD500) przenoszą wrażliwe na temperaturę źródło replikacji, które reguluje liczbę kopii od średniej do wysokiej w Streptomyces. Wrażliwość temperaturowa tej replikacji umożliwia jej wykorzystanie w podstawianiu genu Streptomyces i konstrukcji mutantów.

Wektory dwufunkcjonalne pCD262 i pCD500 z powodzeniem zastosowano do konstrukcji szczepu według wynalazku zubożonego w bkd. Wektor ten jest trwale utrzymywany w postaci wielkiej liczny kopii samoreplikujących się plazmidów w S. avermitilis. Jednakże gdy szczep S. avermitilis, który został stransformowany którymś z tych wektorów poddaje się ostrej obróbce w warunkach takich jak wysoka temperatura, sporulacja lub protoplastowanie i regeneracja, odzyskać można wiele kolonii pozbawionych tego plazmidu. Wykorzystano tą cechę przy stosowaniu pCD262 lub pCD500 jako wektora integracji w doświadczeniach rozbijania genu S. avermitilis.

Mechanizm podstawienia genowego w S. avermitilis obejmuje prawdopodobnie podwójny crossing-over lub pojedynczy crossing-over prowadzący do integracji, po której następuje etap rozdziału, w którym zintegrowany plazmid zostaje wycięty. W przypadku obydwu mechanizmów, podwójnego crossing-over i pojedynczego crossing-over, po którym następuje wycięcie, zapewniają uzyskanie tego samego produktu. Wykorzystując takie rozwiązanie można było rozbić otwartą ramkę odczytu El-a odpowiadającą genowi bkdF ze skupienia genów bkd S. avermitilis. Rozbicie obejmowała delecję z chromosomu fragmentu o około 1, 4 kb obejmującego 5'-połowę genu kodującego podjednostkę El -a kompleksu BCKDH. Uzyskany szczep mutantowy, który wykazuje wszystkie charakterystyczne cechy fenotypowe mutanta bkd, jest trwały i może być wykorzystany do wytwarzania cennych nowych produktów awermektynowych na drodze fermentacji.

W szczególności skonstruowano mutant bkdF zastępując segment El-a genu BCKDH (bkdF) w chromosmie S. avermitilis ATCC 31272 SC2 genem ermE (oporności na erytromycynę) z Saccharopolyspora erythraea. Jak to zaznaczono powyżej, osiąga się to przez zastosowanie nowego dwufunkcjonalnego wektora (E. coli/Streptomyces) (pCD262), który, jak to stwierdzono, działa wydajnie zarówno w klonowaniu jak i w eksperymentach podstawienia genowego w

178 993

S. avermitilis. Jak to pokazano na fig. 7,3 sąsiednie fragmenty restrykcyjne BamHI w chromosomie S. avermitilis chromosomowe zostały zmapowane (od lewej do prawej): 2,3 kb, 1,4 kb i 4,1 kb. Fragment genomowy 1,4 kb BamHI przenosi początek otwartej ramki odczytu E1 -a (ORF-1) (gen bkdF). 4,1 kb BamHI przenosi resztę skupienia genowego bkd (koniec bkdF, bkdG i bkdH).

Plazmid pCD768 jest pochodną wektora dwufunkcjonalnego pCD262 przenoszącego 2 genomowe fragmenty S. avermitilis (2,3 i 4,1 kb BamHI), które flankują fragment 1,4 kb BamHI (fig. 8). Na dodatek pCD768 przenosi marker ermE zlokalizowany między fragmentami BamHI 2,3 i 4,1 kb. Marker ermE jest zorientowany odwrotnie do ORF-1 (bkdF), aby uniknąć ewentualnych problemów związanych z nadekspresjądalszych genów. Oczekuje się, że konstrukt będzie wprowadzać delecję 1,4 kb (ORF 1 zostanie naruszona) w genomie gospodarza w wyniku rekombinacji.

Plamizd pCD768 przeniesiono do protoplastów gospodarza S. avermitilis 31272 SC2. Wyselekcjonowano dwa transformanty wykazujące odporność na antybiotyki, zarówno erytromycynę (erm-R) jak i tiostrepton (tsr-R). Transformant nr 1 (CD783) hodowano w ciekłym ośrodku, po czym protoplasty wypreparowano i posiano na ośrodku agarowym zawierającym erytromycynę. Wybrano 50 klonów, które zanalizowano dokładniej: 46 było erm-R, tsr-R; 4 były erm-R, tsr-S (ppl5, ppl7, pp22 i pp40). 4 klony z ostatniej grupy oraz 2 klony z pierwszej grupy (ppl4 i pp21, patrz tablica 1 w przykładzie 9) dokładniej zanalizowano. Wszystkie wykazywały fenotyp zubożony w bkd, na co wskazywało: Wszystkie klony 4 erm-R, tsr-S nie mogły rosnąć na płytkach z minimalnym ośrodkiem ILV; nie wykazywały wykrywalnej aktywności składnika El kompleksu BCKDH; oraz w czasie fermentacji nie były one zdolne do wytwarzania naturalnych awermektyn, o ile ośrodek nie został uzupełniony kwasem (S)-(+)-2-metyłomasłowym lub kwasem izomasłowym (patrz przykład 9). Na dodatek po dodaniu CHC do ośrodka fermentacji, nastąpiła synteza nowych awermektyn (CHC-awermektyn), co wykazuje, że blok bkd nie wpływa na układ biosyntezy awermektyny w komórce. Jeden klon z tej grupy 4 klonów (klon pp 15) nazwano jako szereg S. avermitilis CD794 i zdeponowano w American Type Culture Collection jako przykładowy szczep według wynalazku. Ponadto analiza hybrydyzacyjna Southern potwierdziła, że ORF-1 odpowiadająca genowi bkdF zgodnie z oczekiwaniem uległa rozbiciu w wyniku podstawienia genowego w S. avermitilis ATCC 31272 SC2 (patrz przykład 5).

Przykłady

Poniżej podano szczegółowe przykłady procedur eksperymentalnych wykorzystywanych do identyfikacji, klonowania i analizy genów bkdFGH z S. avermitilis, zilustrowanych również na załączonych rysunkach. Opisano ponadto konstrukcję dwóch mutantów zubożonych w bkd przez podstawienie genowe. Dodatkowe szczegóły standardowych technik, znane specjalistom w dziedzinie biologii molekularnej oraz przeznaczenie konkretnych stosowanych enzymów opisane jest np. w podręczniku laboratoryjnym „Molecular Cloning”, Sambrook i inni (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Przykład I. Wytwarzanie genomowego DNA S. avermitilis

Micelium S. avermitilis ATCC 31272 SC2 (izolat w postaci pojedynczej kolonii nr 2) hodowano w postaci zlewającej się warstwy na pożywce agarowej YPD-2 przez 7 dni w 29°C. Ośrodek zawierał:

Ekstrakt drożdżowy Difco	10 g
Bacto-pepton Difco	10 g
Dekstroza	5 g
Bacto agar Difco	20 g
Octan sodowy	2 g
MOPS	10 g
pH doprowadzono	do 7.0.
Objętość końcowa:	1 litr.

Autoklawowanie przez 25 minut w 121°C.

Grzybnię zastosowano następnie do zaszczepiania 30 ml ośrodka AS-7 (patrz Hafner i inni, 1988, zgłoszenie patentowe europejskie nr 88300353.5, publikacja nr 0 284176) w 300 ml kolbie

178 993 z przegrodami, którą utrzymywano z wytrząsaniem (230 obrotów/minutę) w 29°C przez 24 go dziny.

Ośrodek zawierał:

Rozcieńczona skrobia¹ 20g

Ardamine ρΉ² 5g

Pharmamedia'³15 g

CaCO₃ 2g pH doprowadzono do 7.2 za pomocą NaOH.

Objętość ostateczna: 1 litr.

Autoklawowano przez 25 minut w 121°C.

¹ Otrzymano przez hydrolizę skrobi „termamylem”, α-amylaząz Bacillus lichneniformis, dostępna Novo Enzymes, Wilton, CT, do równoważnika dekstrozowego około 40%.

² Z Yeast Products, Inc., Clifton, NJ 07012.

³ Z Traders Protein, Memphis, TN 38108.

Około 0,3 ml powyższej hodowli zastosowano do zaszczepiania innej 300 ml kolby z przegrodami, zawierającej 30 ml pożywki w postaci zmodyfikowanego ciekłego ekstraktu drożdżowego/ekstraktu słodowego Yeast Extract Malt Extract (YEME) (Bibb M.J., Freeman R.F. i D.A. Hopwood, 1977, Mol. Gen. Genetics, 154: 155-166). Zmodyfikowana pożywka YEME zawie rała (w litrze):

Ekstrakt drożdżowy Didco 10g

Bacto-pepton Difco 10g

Ekstrakt Oxoid Malt 3g

Sacharoza 300g

Glukoza 10g

Autoklawowano przez 40 minut w 121°C.

Po autoklawowaniu dodano 2 ml 2,5 M MgCl₂ · 6H₂O.

Ostateczną objętość doprowadzono do 1 litra

Hodowle prowadzono przez 48-72 godziny w 29°C. Grzybnie oddzielono przez wirowanie, po czym genomowy DNA wypreparowano zgodnie z procedurą „Isolation Streptomyces Total DNA by Caesium Chloride Gradient Centrifugation: Procedurę 2”, podaną w podręczniku „Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manuał”, The John Innes Foundation, Norwich, U.K., 1985, D.A. Hopwood i inni. Osady DNA zawieszono w 3 ml buforu TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA).

Przykład II. Amplifikacja genomowego DNA S. avermitilis za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy

Enzymatyczną amplifikację genomowego DNA S. avermitilis przeprowadzono stosując aparat do cyklicznej obróbki termicznej Perkin-Elmer Cetus. Reakcję PCR prowadzono stosując polimeraz Taq (Perkin Elmer Cetus) oraz bufor dostarczony przez producenta, w obecności 200 μΜ dNTP, po 0,5 μΜ każdego startera, 50 ng matrycowego DNA, i 2.5 jednostki enzymu, w ostatecznej objętości 100 μΐ, przeprowadzając 30 cykli. Profil termiczny pierwszego cyklu był następujący: 95°C przez 3 minuty (etap denaturacji), 55°C przez 2 minuty (etap hybrydyzacji) i 72°C przez 2 minuty (etap wydłużania). Profil termiczny w następnych 29 cyklach był podobny, z tym że etap denaturacji skrócono do 1,5 minuty. Sondy DNA zostały dostarczone przez Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). Jako starter prawostronny (fig. 1) zastosowano

5'-AAGAATTCGAGCTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3', a jako starter lewostronny (fig. 1)

5'-AAGGATCCTCTAGAGGTSSWGTGGKGGCCGATSCGGWA-3'.

Do opisu sekwencji DNA wykorzystano zasady nomenklatury nukleotydów The International Union Biochemistry (IUB). Powtórki oznacza się zgodnie z kodem IUB Group Codes, następująco: K=G+T, S=G+C oraz W=A+T. Sekwencje rozpoznające restrykcję, nie homologiczne względem genów El-abkd, wprowadzone do starterów w celu klonowania, sąpodkre

178 993 ślone (fig. 1). Produkty amplifikacji rozfrakcjonowano względem wielkości metodą elektroforezy na żelu agarozowym. Próbkę PCR poddawano elektroforezie w poziomym 1 % żelu agarozowym w buforze 1 X TBE (90 mM Tris-HCl, pH 8,5,90 mM kwas borowy, 2,5 mM EDTA) przez 1,5 godziny przy 100 V, w sposób opisany przez Sambrooka i innych, 1989, „Molecular Cloning: A Laboratory Manuał”, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Lab, N.Y. Rozdzielone produkty DNA z PCR lokalizowano na żelu przez barwienie bromkiem etydiowym i wizualizaję pasm fluorescencyjnych światłem nadfioletowym przy 365 nm. W opisanych powyżej warunkach pCR wykryto pojedyncze pasmo DNA (o długości około 550 par zasad) przy stosowaniu kombinacji wymienionych starterów.

Przykład III. KlonowaniezamplifikowanegometodąPCRgenomowegoDNAS. avermitilis o 0,55 kb w wektorze E. coli, a następnie transformacja w gospodarzach E. coli host.

A. Oddzielanie produktu PCR o 0,55 kb

Jak to wspomniano powyżej, fragment DNA o 0,55 kb zamplifikowano metodą PCR, stosując genomowy DNA S. avermitilis jako matrycę oraz kombinację startera prawostronnego i lewostronnego. Jak to pokazano na fig. I, starter prawostronny zawiera miejsce rozpoznawane przez EcoRI, zlokalizowane przy końcu 5', a starter lewostronny zawiera miejsce rozpoznawane przez Xbal przy końcu 5'. Fragment PCR o 0,55 kb sklonowane z wykorzystaniem procedury ligowania, zgodnie z którą zarówno insert jak i wektor klonowania trawi się EcoRI i Xbal. Po amplifikacji (w sposób opisany w przykładzie II) około 80μΐ mieszaniny reakcyjnej PCR załadowano na 1% żel agarozowy i przeprowadzono elektroforezę. Fragment DNA o 0,55 kb uwidoczniono w sposób opisany powyżej, odzyskując go na drodze elektroeluowania, w sposób następujący: pasmo o 0,55 bp wycięto ostrzem żyletki i DNA wydzielono z żelu agarozowego przez elektroeluowanie przez 35 minut przy 80 V, w naczyniu w kształcie litery V, wypełnionym 7,5 M octanem amonu, stosując jednokierunkowy elektroeluator (International Biotechnology Inc., New Haven, CT). DNA wytrącono następnie etanolem, odwirowano i rozpuszczono w 20 μΐ buforu DNA (10 mM Tris-HCl, 4 mM NaCl, 0,1 mM EDTA; pH 7,5).

B. Trawienie enzymami restrykcyjnymi EcoRI and Xbal

Całość materiału z PCR odzyskanego w sposób podany powyżej strawiono równocześnie dodając po 1 jednostce enzymów restrykcyjnych EcoRI i Xbal, w sposób zalecany przez dostawcę (Boehringer Mannheim Biochemicals). Także około 1 pg plazmidu pGEM-3Z (Promega Corp., Madison, WI) 2 jednostki enzymów restrykcyjnych EcoRI i Xbal (wszystkie enzymy restrykcyjne dostarczone zostały z Boehringer Mannheim Biochemicals) inkubowano w buforze do testu, zalecanym przez dostawcę, w 37°C przez 4 godziny, w całkowitej objętości 60 μΐ, otrzymując liniowe cząsteczki. Z kolei fragment z PCR i linearyzowany wektor oddzielnie wyekstrahowano dwukrotnie równymi objętościami mieszaniny fenol/chloroform i dwukrotnie równymi objętościami eteru, a na koniec DNA wydzielono przez strącanie absolutnym etanolem. Wytrącone DNA oddzielono przez wirowanie przy 10 000 x g przez 10 minut i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Osad fragmentu z PCR rozpuszczono w 20 μΐ buforu DNA, a osad linearyzowanego wektora rozpuszczono w 12 μΐ buforu DNA.

C. Ligowanie prowadzące do powstawania pCD613

Około 11 μΐ fragmentu produktu DNA o 0,55 kb z PCR po obróbce EcoRI/XbaI i około 1 μΐ pGEM-3Z linearyzowanego EcoRI/XbaI inkubowano przez noc z 1 jednostką ligazy (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) w warunkach określonych przez dostawcę, w 15°C, przy całkowitej objętości mieszaniny reakcyjnej 20 μΐ. Reakcję kończono umieszczając mikroprobówkę w lodzie; uzyskaną mieszaniną reakcyjną (20 μΐ) zastosowano do transformowania kompetentnych komórek E. coli DH5-O, zgodnie ze standardową procedurą opisaną przez Sambrooka i innych, 1989, „Molecular Cloning: A Laboratory Manuał”, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Lab, N.Y. Odzyskano wiele transformantów odpornych na ampicylinę. Wektor plazmidowy pGEM-3Z zawiera segment DNA pochodzący od operonu lac Escherichia coli kodującego fragment od strony końca aminowego β-galactozydazy [Yanisch-Perron,C., Vieira, J. i J. Messing, Gene, 33,103,1985]. Fragment ten, którego syntezę można zainicjować przez izopropylotio-p-D-galaktozyc (ITPG), jest zdolny do wewnątrzallelowej (a) komplementacji ze zdefe

178 993 ktowaną formą β-galaktozydazy kodowanej przez komórki gospodarza E. coli wystawione na działanie induktora ITPG, syntetyzuje.obydwa fragmenty enzymu i tworzy błękitne kolonie po posianiu na ośrodku zawierającym chromogeniczny substrat, 5-bromo-4-chloro-3-indolilo^-D-galaktozyd (X-gal). Insercja obcego DNA do miejsca poliklonowania plazmidu powoduje dezaktywację aminowego końca fragmentu β-galaktozydazy i uniemożliwia α-komplementację. W związku z tym bakterie przenoszące zrekombinowane plazmidy tworzą białe kolonie. Z doświadczenia transformacji odzyskano liczne białe kolonie. Kolonie te powinny zawierać plazmid pCD613. Potwierdzono to wybierając jedną kolonię, którą oznaczono jako szczep CD613, do dalszej analizy. Pojedynczą kolonię bakteryjną szczepu E. coli CD613 zaszczepiono na ciekłej pożywce LuriaBertani (LB) zawierającej 50 pg/ml ampicyliny, zgodnie ze standardową procedurą mikrobiologiczną. Ośrodek LB zawierał:

Trypton Bacto 10g

Ekstrakt drożdżowy Bacto 5g

NaCl 10g pH doprowadzono do 7,0 za pomocą 5 N NaOH.

Ostateczną objętość roztworu doprowadzono do 1 litra

Sterylizowano przez autoklawowanie przez 20 min. w 121°C.

Hodowlę inkubowano przez noc w 35°C. Następnego ranka komórki bakteryjne zebrano przez wirowanie przy 10 000 obrotów/minutę przez 5 minutw4°C. Wektor plazmidowy wydzielono ze świeżo zebranych komórek Escherichia coli CD613 stosując modyfikację metody Bimboima i Dol/ego (Nucleic Acids Res., 1979, 7: 1513-1523), którą opisali Denoya i inni (Microbios Lett., 1985, 29: 87-93). Wydzielony plazmid DNA rozpuszczono w buforze DNA (10 mM Tris-HCl, 4 mM NaCl, 0,1 mM EDTA; pH 7,5), uzyskując stężenie około 1 pg pCD613/10 pl buforu. Potwierdzająca analiza restrykcyjna z zastosowaniem EciRI i Xbal wykazała, zgodnie z oczekiwaniem, że pCD613 przenosi insert DNA o 0,55.

Przykład IV. Wytwarzanie równomiernie znaczonych sond dwuniciowego DNA

Sondy dwuniciowego DNA otrzymano metodą nick-translacji (patrz Sambrook i inni, 1989, „Molecular Cloning: A Laboratory Manuał”, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Lab, N.Y.), gdzie podano ogólny opis tej techniki). Najpierw wytworzono określony fragment DNA przenoszący sekwencję docelowąprzeprowadzając odpowiednie trawienie restrykcyjne i oczyszczanie elektroelucyjne, w sposób opisany w przykładzie I. Około 1 pg DNA znaczono stosując w każdym przypadku [a-³²P]dCTP (a-³²P] sól tetra(trietyloamoniową) 5'-trifosforanu dezoksycytydyny) dostępną z NEN-Dupont oraz układ BRL Nick Translation System dostępny z BRL Life Technologies, Inc., zgodnie z instrukcjami otrzymanymi od dostawcy. Typowa objętość mieszaniny reakcyjnej wynosiła 60 pl. Po dodaniu 5 pl buforu Stop (zgodnie z zalecana procedurą BRL) znaczony DNA oddzielono od niepodstawionych nukleotydów w kolumnie rozdzielającej Stratagene, zgodnie z zaleceniami dostawcy. W taki sposób otrzymywano zazwyczaj ³²P-znaczony DNA o aktywności właściwej ponad 10⁸cpm/pg.

PrzykładV. Analiza genomowego DNA S. avermitilis metodą hybrydyzacji Southern

Około 10 pg oczyszczonego genomowego DNA strawiono 2 jednostkami enzymu restrykcyjnego BamHI w 37°C przez co najmniej 2 godziny. Po zakończeniu trawienia fragmenty DNA rozdzielono na drodze elektroforezy na 1 % żelu agarozowym (patrz przykład IA) i przeniesiono na noc na membranę nylonową (wielkość porów 0,45 pm) (Membrany Schleicher i Schuell Nytran) stosując metodąprzenoszenia kapilarnego (Southern E.M., 1975, J. Mol. Biol., 98: 503). Następnego dnia membrany nylonowe opakowano w plastikowe opakowania i stroną z DNA wystawiono na działanie promieniowania promieniowanie nadfioletowego (302 nm) w celu związania DNA z membraną. Hybrydyzację radioznaczonych sond RNA lub DNA prowadzono sposobem opisanym przez Sambrooka i innych w podręczniku (1989), „Molecular Cloning: A Laboratory Manuał”, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Lab, N.Y. (poniżej określanej jako „Sambrook i inni Manuał”). Hybrydyzację wstępną i hybrydyzację prowadzono w 42°C. Jako roztwór hybrydyzacyjny zastosowano: 6 x SSC (1 x: 0,15 M NaCl, 15 mM cytrynian Na, pH 7,0), 10 x odczynnik Denhardta [1 x: 0,02% ficoll, 0,02% poliwinylopirolidon,

178 993

0,02% albumina surowicy bydlęcej], 1% SDS (dodecylosiarczan sodowy), 100 pg/ml zdenaturowanego, pociętego DNA z mlecza łososia, 100 pg/ml E. coli TRNA i 50% formamidu (Fluka). Po hybrydyzacji przez noc membrany przemyto w sposób następujący: 2 przemycia 1 x SSC, 0,1% SDS w temperaturze pokojowej przez 15 minut i 2 przemycia 0,1 X ssc, 0,1% SDS w 42°C przez 15 minut. W pewnych doświadczeniach hybrydyzację prowadzono w 65°C bez formamidu, a SSPE (1 x: 0,18 MNaCl, 10mMNaPO₄, pH 7,7,1 mMEDTA) zastosowano zamiast SSC. Na koniec membrany eksponowano na błonę rentgenowskąw celu uzyskania obrazu autoradiograficznego.

Przykład VI. SekwencjonowanieDNA

A. Sekwencjonowanie dwuniciowego DNA z produktu PCR, przenoszonego w plazmidzie pCD613

Superskręcony plazmid pCD613 otrzymano w sposób podany w przykładzie II. Około 4 pg dwuniciowego pCD613 przekształcono w formę jednoniciową przed sekwencjonowaniem. Osiągnięto to przez denaturację alkaliczną opisaną w publikacji Taq Track Sequencing Systems Technical Manuał (Promega Co., Madison, WI). Startery sekwencjonowania oligonukleotydów zostały zsyntetyzowane przez Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). Starter wektorowy 1 (5'-AAGGATCCTGCAGCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGA-3') mapuje w górę od miejsca EcoRI w miejscu wielokrotnego klonowania (MCS) pGEM-3Z (pozycje 2689-2712), a starter 2 (5'-AAGGATCCTGCAGACAGCTATGACCATGATTACGCCA-3') mapuje w dół od miejsca Hindlll w MCS (pozycje 91-114).

B. Klonowanie pochodzącego z pCD613 genomowego fragmentu 0,45 kb Sali z S. avermitilis w baketriofagu Ml3 i sekwencjonowane DNA

Jak to opisano powyżej, analiza restrykcyjna wykazała, że otrzymany w PCR genomowy fragment CD613 zawiera wewnętrzny fragment Sali o 0,35 kb. Ten fragment Sali o 0,35 kb z S. avermitilis sklonowano w bakteriofagach Μ13 mp 18 w celu uzyskania jednoniciowego zrekombinowanego DNA do stosowania jako matryca w metodzie Sangera sekwencjonowania didezoksy (Sanger i inni, 1977, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467). Około 2 pg plazmidu pCD613, otrzymanego metodą minipreparatywną opisaną powyżej, strawiono enzymem restrykcyjnym Sali w 37°C przez 2 godziny w celu uwolnienia genomowego fragmentu S. avermitilis o 0,35 kb. Mieszaninę z trawienia poddano elektroforezie na 1,2% żelu agarozowym, po czym fragment 0,3 5 kb oddzielono przez elektroeluowanie i wytrącanie, jak to opisano powyżej. Ponadto około 1 pg oczyszczonej, dwuniciowej, replikacyjnej formy (RF) Ml3mpl8 DNA strawiono Sali, odfosforylowano alkalicznąfosfataząz jelita bydlęcego (CIAP) (otrzymaną w Promega Corp., Madison, WI), a na koniec zligowano z fragmentem DNA o 0,35 kb, jakto opisano powyżej. Oczyszczony wektor kodowania RF Ml3 otrzymano z New England Biolabs. Mieszaniny ligacyjne zastosowano do transfekcji kompetentnych komórek E. coli JM109. Uzyskano szereg białych łysinek. Wybrano 2 białe łysinki z transfekcji mp 18, zawierające insert o przeciwnych orientacjach i rozwinięto w fagu, po czym jednoniciowy DNA otrzymano w sposób opisany w pracy Sambrook i inni Manuał. Sekwencjonowanie DNA każdej z matryc jednoniciowego DNA przeprowadzono stosując M13-specyficzny starter sekwencjonujący-40 (New England Biolabs, Catalog No. 1212), 5'-[a-tio]trifosforam dezoksyadenozyny, [³⁵S] (NEN-Dupont), oraz zestaw do sekwencjonowania TaqTrack (Promega), zgodnie z instrukcjami podanymi przez dostawcę (Promega).

C. Ułatwione przez transpozon sekwencjonowanie pewnych obszarów genomowych zlokalizowanych na klonowanym fragmencie BamHI o 4,1 kb, przenoszącym część genu bkdF

Insercje mini-γ-δ-1 transpozonu zastosowano do sekwencjonowania obszarów DNA zlokalizowanych w dół od otwartej ramki odczytu bkdF w klonowanym genomowym fragmencie BamHI o 4,1 kb z S. avermitilis. Element mini-γ-δ-Ι stanowi niewielką(l,8 kb) pochodnąy-5 (TnlOOO), która zawiera gen kan z Tn5 i miejsce rozdzielania (res) z γ-δ klonowanego między dwoma 40-bp odwróconymi powtórkami jednego z końców γ-δ (Berg C.M. i inni, 1992, Gene, 11 3’9-16). Mini-γ-δ-Ι nie zawiera genów kodujących transposazę i resolwazę i z tego względu opiera się na gospodarzu, który zapewnia funkcję transpozycji i rozdzielczości. W związku z tym w szczepach nie zawierających pomocnika transpozonu mini-γ-δ-Ι nie będzie ulegać transpozy

178 993 cji, tak że insercja będzie trwała. Pomiędzy końcami z odwróconymi powtórkami znajdują się unikatowe sekwencje, które można wykorzystać jako miejsca wiązania startera przy sekwencjonowaniu DNA Insercje transpozonu przeprowadzono w sposób opisany przez Berga C.M. i innych, (1993, Methods in Enzymology, Academic Press, vol. 218,279-306). Każdy ze wstawionych transpozonów zastosowano jako wyjściową matrycę do sekwencjonowania DNA Each inserted transposon zastosowano as the initial template to seąuence Streptomyces zlokalizowanego na obydwu stronach insertu. Zastosowano dwa „uniwersalne” startery: starter „res” (5'-GTAGGGAGCCTGATATG-3') i starter „kan” (5'-GCTATCCGCGCATCCAT-3'). Dwie mini-γ-δ insercje oznaczono jako „A3” (klon CD785) i „A5” (klon CD786) zlokalizowano odpowiednio o około 1,7 kb i 3 kb od końca BamHI zawierającego ORF bkdF. Sekwencjonowanie DNA przeprowadzone na obydwu końcach każdego z insercji wykazały, że insercja A3 (sekwencja C%) jest bliżej końcaEl-pORF (bkdG)(fig. 5),ainsercjaA5 (sekwencja CD786) jest blisko końca E2 ORF (bkdH) (fig. 6).

Przykład VII. Klonowanie pełnego skupienia genu bkd S. avermitilis i konstrukcja mapy chromosomowej

Przeprowadzono restrykcję około 4 pg oczyszczonego pCD613 stosując enzym restrykcyjny Sali i fragmenty DNA rozdzielono przez elektroforezę w 1,2% żelu agarozowym. Fragment Sali DNA o około 0,35 kb, przenoszący sekwencję specyficzną dla genu S. avermitilis bkdf El-a, odzyskano przez elektroeluowanego, po czym przeprowadzono znakowanie metodą nick translacji, jak to opisano poprzednio. The [³²P]-znaczony fragment DNA zastosowano następnie jako sondę do selekcjonowania biblioteki genomowych kosmidów S. avermitilis. Szczegółowy opis wytwarzania bibliotek genomowych znaleźć można w pracy Sambrook i inni Manuał. Pełny opis wytwarzania chromosomowej biblioteki streptomyces podano w Genetic Manipulation Streptomyces A Laboratory Manuał, Hopwood i inni (1985). Opis wektorów kosmidowych przedstawiono w „Cosmid Vectors for Streptomyces Genomie DNA Cloning”, Denoya C.D., zgłoszenie patentowe USA nr 048 719 z 16 kwietnia 1993.

Po selekcji ponad 2000 klonów z biblioteki rekombinantów zidentyfikowano 10 klonów. 10 hybrydyzowanych klonów (oznaczonych jako klony E. coli CD519, CD521, CD691, CD692, CD694, CD695, CD696, CD697, CD698 i CD699) hodowano w ciekłym ośrodku LB i z każdej hodowli otrzymano plazmid, jak to opisano powyżej. Restrykcja i analiza metodą hybrydyzacji Southern potwierdziły, że 10 klonów jest spokrewnionych i zawierająone nakładające się obszary chromosomowe. Należy podkreślić, że dwa z wymienionych klonów kosmidowych, a mianowicie CD519 i CD521, znajdująsię również na liście klonów kosmidowych zidentyfikowanych z wykorzystaniem sondy bkda (patrz C.D. Denoya, zgłoszenie patentowe USA nr 08/100,518, wspomniane powyżej). Genomową mapę restrykcyjną S. avermitilis pokrywającą cały obszar chromosomowy obejmujący sekwencję otrzymano w znany sposób, przedstawiając jąna fig. 2. Na rysunku tym pokazano także połączenie między nowymi genami bkd według wynalazku i opisanymi uprzednio (C.D. Denoya, zgłoszenie patentowe USA nr 08/100,518, z 30 lipca 1993). Obydwa skupienia genów bkd znajdują się w odległości około 12 kb.

Przykład VIII. Transformacja Streptomyces lividans wektorami dwufunkcjonalnymi i wytwarzanie w dużej skali wektorów plazmidowych z transformantów S. lividans

Szczep S. lividans TH64 zastosowano w tych eksperymentach. Ośrodki stosowane w hodowli i usuwaniu ścian komórkowych S. lividans oraz wytwarzanie protoplastów i transformacji opisali D.A. Hopwood i inni, Genetic Manipulation Streptomyces - a laboratory manuał, 1985, The John Innes Foundation, Norwich, U.K. W publikacji tej podano ponadto pełny opis szczepu S. lividans TK64. Protoplasty S. lividans transformowane bezpośrednio wektorem dwufunkcjonalnym pCD262 lub szeregiem pochodnych, wybrano na podstawie odporności na tiostrepton. Plazmidowe DNA otrzymano z wybranych transformantów w sposób następujący: hodowlę prowadzono w ciekłym ośrodku YEME (Bibb, M.J., Freeman, R.F. i D.A. Hopwood, 1977, Mol. Gen. Genetics, 154:155166). Ośrodek YEME zawiera w litrze: 3 g ekstraktu drożdżowego, 5 g baktopeptonu, 3 g ekstraktu słodowego, 340 g sacharozy. Po autoklawowaniu dodano 2 ml 2,5 M MgCl₂ -6H₂O. Hodowle prowadzono przez 40-48 godzin w 30°C. Grzybnię z 500 ml hodowli ko

178 993 morek sterptomyces zebrano przez wirowanie i zawieszono do ostatecznej objętości 50 ml w roztworze lysozymu (2 mg/ml kysozymu w 0,3 M sacharozy, 0,025 M Tris-HCl (pH 8.0) i 0,025 M EDTA). Po tym etapie plazmidy otrzymano zgodnie z procedurą alkalicznej lizy, w sposób opisany w podręczniku: ”Genetic Manipulation Streptomyces, A Laboratory Manuał”, The John Innes Foundation, Norwich, 1985. Osady DNA rozpuszczano w 500 ml 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA i dokładniej oczyszczono przez ultrawirowanie gradientowe w układzie chlorek cezu-bromek etydiowy, jak to opisano w publikacji Sambrook i inni Manuał. Wydzielony plazmidowy DNA rozpuszczono na koniec w buforze DNA (10 mM Tris-HCl, 4 mM NaCl, 0,1 mM EDTA; pH 7,5) do uzyskania stężenia około 1 pg plazmidowego DNA w 10 μΐ buforu.

Przykład IX. Konstrukcja mutanta a S. avermitilis bkdf

Technikę stosowaną do wprowadzania delecj i chromosomowej stanowi wariant technik podstawienia genowego stosowanego w odniesieniu do Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli i Bacillus subtilis(Scherer S. iR. W. Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 76:4951-4955; Shortle D. i inni, 1982, Science, 217: 371-373; Stahl M.L. i Ferrari E., 1984, J. Bacteriol. 158: 411-418). Ogólny opis tej techniki, w szczególności w odniesieniu do Streptomyces, znaleźć można w publikacji przeglądowej „Genetic Manipulation Streptomyces: Integrating Vectors and Gene Replacement”, Kieser T. i Hopwood D.A., 1991. w: Methods in Enzymology, vol. 204, 430-458. Ponadto szczegółowy opis tej techniki, wraz z dodatkowym etapem protoplastowania niezbędnym dla zapewnienia uzyskania izolatów pojedynczych kolonii oraz zwiększenia częstości eliminacji plazmidu znaleźć można również w publikacji Anzai i inni, „Replacement Streptomyces hydroscopicus genomie segments with in vitro altered DNA sequences”, Journal Antibiotics, 1988, vol. XLI, nr 2,226-233. Etap protoplastowania i regeneracji często powoduje straty plazmidu. Jednakże większość dwufunkcyjnych (E. coli/Streptomyces) wektorów (takich jak pCD262 stosowany w tej pracy) powoduje powstanie przypadkowych komórek pozbawionych plazmidu po 1 lub 2 rundach nieselektywnego wzrostu (Kieser T. i Hopwood D.A., 1991, w: Methods in Enzymology, vol. 204,430-458).

A. Konstrukcja wektor dwufunkcjonalnego przenoszącego nieaktywną kopię genu bkdf Jak to opisano na fig. 7, zmapowano 3 sąsiednie fragmenty restrykcyjne BamHI w obszarze chromosomowym S. avermitilis zawierającym skupienie genowe bkd, od lewej do prawej 2,3 kb, 1,4 kb i 4,1 kb. Fragment genomowy 1,4 kb BamHI przenosi początek otwartej ramki odczytu Ε1 -a (ORF-1) (bkdF). Fragment 4,1 kb BamHI przenosi resztę skupienia genowego bkd (koniec bkdF, bkdG i bkdH). Każdy z 3 fragmentów restrykcyjnych subklonowano w wektorze E. coli pGEM-3Z. Uzyskano konstrukty: plazmid pCD740, przenoszący fragment 2,3 kb BamHI; plazmid pCD854, przenoszący fragment 1,4 kb BamHI; i plazmid pCD713, przenoszący fragment 4.1 kb BamHI (patrz fig. 2). Konstrukcję wektora przenoszącego nieaktywną kopię genu bkdF wykonano w dwóch etapach. W pierwszym fragment 4,1 kb BamHI S. avermitilis i fragment 1,6 kb Bglll przenoszący marker ermE, który nadaje odporność na antybiotyk erytromycynę, sklonowano w wektorze dwufunkcyjnym pCD262 (C.D. Denoya, „Novel Bacterial Plazmid Shuttle Vectors for Streptomyces sp. and Escherichia coli”, zgłoszenie patentowe USA nr 032 925, z 18 marca 1993) w sposób następujący: około 1,5 pg plazmidu pCD713 pocięto enzymem restrykcyjnym BamHI i przeprowadzono elektroforezę na 0,8% żelu agarozowym. Po elektroforezie fragment 4,1 kb BamHI odzyskano z żelu stosując zestaw GeneCleanil i procedury zalecane przez producenta (Bio 101 Inc., La Jolla, CA). Podobnie około 2 pg pIJ4026 pocięto enzymem restrykcyjnym Bq 1II i przeprowadzono elektroforezę na 0,8% żelu agarozowym. Plazmid pIJ4026 stanowi pochodną wektora klonowania E. coli pUC18 przenoszącą gen ermE Sccharopoluspora erythraea (uprzednio Streptomyces erythraeus (patrz M. Bibb i inni, 1985, Gene, 41: 357-368, oraz D. A. Hopwood i inni, Genetic Manipulation Streptomyces - A Laboratory manuał, 1985, The John Innes Foundation, Norwich, U.K.). Po elektroforezie fragment 1,6 kb Balii odzyskano z żelu stosując zestaw GeneCleanil i procedury zalecane przez producenta (Bio 101 Inc., La Jolla, CA). Dodatkowo próbkę oczyszczonego plazmidu pCD262 zlinearyzowano enzymem restrykcyjnym Balii, odfosforylowano alkaliczną fosfatazą zj elita bydlęcego (CIAP) (dostępnązPromega Corp., Madison, WI) i na koniec zligowano z 4,1 kb BamHI i oczyszczonymi fragmentami

178 993

1,6 kg BgHI opisanymi powyżej. Reakcję ligowania zakończono umieszczając mikroprobówkę w lodzie; uzyskaną mieszaninę reakcyjna (20 μΐ) zastosowano do transformowania kompetentnych komórek E. coli DH5-O, zgodnie ze standardowąprocedurąopisanąw przykładzie 1. Odzyskano wiele transformantów odpornych na ampicylinę. Kolonie te powinny zawierać plazmid pCD761. Potwierdzono to wybierając jedną kolonię, oznaczonąjako szczep CD761, i zanalizowano zrekombinowany plazmid odzyskany z tego szczepu szeregiem enzymów restrykcyjnych. Plazmid pCD761 stanowi pochodną wektora dwufunkcjonalnego pCD262, przenoszącego zarówno fragment genomowy 4,1 kb S. avermitilis BamHI jak i fragment DNA 1,6 kg BgHI przenoszący marker ermE marker, obydwa zorientowane w sposób pokazany na fig. 7. Po drugie plazmid pCD761 zlinearyzowano Bglll, odfosforylowano stosując CIAP, i zligowano z fragmentem pCD740. Reakcję ligowania zakończono umieszczając mikroprobówkę w lodzie; uzyskaną mieszaninę reakcyjną (20 μΐ) zastosowano do transformowania kompetentnych komórek E. coli DH5-oc, zgodnie ze standardową procedurą opisaną w przykładzie I. Odzyskano wiele transformantów odpornych na ampicylinę. Kolonie te powinny zawierać plazmid pCD768. Potwierdzono to wybierając jedną kolonię, oznaczonąjako szczep CD768 i zanalizowano zrekombinowany plazmid odzyskany z tego szczepu szeregiem enzymów restrykcyjnych. Plazmid pCD768 stanowi pochodną wektora dwufunkcyjnego pCD262, przenoszącego dwa genomowe fragmenty S. avermitilis (2,3 i 4,1 kb BamHI) sąsiadujące z każdą stroną fragmentu 1,4 kb BamHI chromosomu dzikiego. Ponadto pCD768 przenosi marker ermE marker zlokalizowany między fragmentami 2,3 i 4,1 kb BamHI. Marker ermE znajduje się w przeciwnej orientacji względem ORF-1 (bdF), aby uniknąć ewentualnych problemów związanych z nadekspresjądalszych genów. Konstrukt ten w wyniku rekombinacji wprowadza delecję 1,4 kb wpływającą na koniec 5' genu bkdF.

B. Transformacja Streptomyces avermitilis wektorami dwufunkcjonałnymi

Wektory dwufunkcjonalne (pCD262, pCD768) zastosowane do transformowania protoplastów S. avermitilis otrzymano z transformowanych komórek E. coli DH5-alub E. coli CD 167 (szczep CD 167 stanowi izolat pojedynczej kolonii otrzymanej z E. coli Genetic Stock Center, Yale University-) (patrz przykład I) lub z transformowanych komórek S. lividans TK64 (patrz przykład VIII).

Pojedynczą kolonię nr 2 (SC2) szczepu S. avermitilis ATCC 31272 zastosowano we wszystkich doświadczeniach. 3 wariantowe inokula zastosowano do wytwarzania protoplastów S. avermitilis: 1. Spory (otrzymane w sposób, który podali Hopwood i inni, 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces - A Laboratory Manuał, The John Innes Foundation, Norwich, U. K.), 2. Zamrożone grzybnie po obróbce ultradźwiękami (patrz opis poniżej) oraz 3. Hodowle na agarze YPD-2 (patrz przykład I). Zamrożone grzybnie po obróbce ultradźwiękami otrzymano w sposób następujący: hodowle grzybni prowadzono w bulionie Trypticase Soy Broth (TSB) do zmętnienia 2-9 przy 600 nm, po czym 10 razy przeprowadzono ich homogenizację w młynku z tkaniną szklaną. Zhomogenizowanągrzybnię rozcieńczono dwukrotnie w TBS i porcję 20 ml wprowadzono do sterylnej polipropylenowej probówki do wirowania. Sondę ultradźwiękową (Bronwill Biosonik III) zanurzono na głębokość 1-2 cm w cieczy i próbkę obrabiano ultradźwiękami przy intensywności 50% (połowa maksymalnej mocy) przez 10 s. Obróbka spowodowała zdyspergowanie masy grzybniowej na jedno- lub dwukomórkowe elementy, które wykazują szybki wykładniczy wzrost przy subhodowli. Preparaty grzybniowe po obróbce ultradźwiękami rozcieńczono do ostatecznego stężenia 40% gliceryną, odpipetowano do fiolek i zamrożono w -95°C. Spory, grzybnie i homogenizowane kolonie zastosowano do zaszczepiania ośrodka YEME (patrz przykład I) zawierającego 0,1% glicyny. Wytwarzanie protoplastów S. avermitilis i transformację przeprowadzono w sposób opisany w pracy D. A. Hopwood i inni, Genetic Manipulation Streptomyces A Laboratory Manuał, 1985, The John Innes Foundation, Norwich, U.K., zgodnie z modyfikacjami, które opisali MacNeilD.J., Klapko L.M., K. IndustrailMicrobiol., 1987,2,209-218. Protoplasty S. avermitilis transformowane wektorem dwufunkcjonalnym pCD262, lub pochodną taką jak pCD768, wyselekcjonowano na podstawie odporności odpowiednio na tiostrepton i erytromycynę.

178 993

C. Wydzielanie mutanta S. avermitilis odpornego na erytromycynę i wrażliwego na tiostrepton z zastosowaniem pCD768

Plazmid pCD768 przeniesiono do protoplastów S. avermitilis 31272 SC2,jakto opisano poprzednio. Pierwotne transformanty S. avermitilis wyselekcjonowano z 4 pg erytromycyny/ml na płytkach w ośrodku regeneracji (RM 14) (skład ośrodka podano wyżej). Wybrano 2 transformanty odporne na erytromycynę (erm-R) (nr 1 i 2) na płytkach agarowych YPD-2 (patrz przykład I) zawierających 4 pg/ml erytromycyny lub 4 μ/ml tiostreptonu. Obydwa transformanty były odporne na obydwa antybiotyki (erm-R, tsr-R). Transformant nr 1 (nazywany S. avermitilis szczep CD783) wybrano do dalszej pracy. Szczep ten hodowano w ciekłym ośrodku YEME, po czym wypreparowano protoplasty i posiano je na płytkach z ośrodkiem regeneracyjnym zawierającym erytromycynę (4 pg/ml). Etap regeneracji protoplastu przeprowadzono w tym celu, aby zapewnić wydzielenie pojedynczej kolonii i zwiększyć ubytek plazmidu (Anzai H. i inni, 1988, „Replacement Streptomyces hydroscopicus genomie segments with in vitro altred DNA sequences”, The Journal Antibiotics, vol. XLI, No. 2, pp. 226-233). Zregenerowano liczne kolonie, a 50 klonów wybrano na płytkach zawierających erytromycynę lub tiostrepton. 46 spośród 50 kolonii mogło rosnąć na tiostreptonie. Tak więc 46 kolonii było erm-R, tsr-R, jedynie 4 kolonie były erm-R, tsr-S. Kolonie erm-R, tsr-S wykazują fenotyp oczekiwany w wyniku integracji zjawisko podwójnego crossing-over, a wolny replikon został stracony. Do dalszej analizy wybrano 4 klony wykazujące fenotyp erm-R i tsr-S (ppl5, ppl7, pp22 i pp40), wraz z 2 klonami erm-R, tsr-R (stosowanymi w celach kontrolnych) (ppl4 i pp21) wybrano do analizy.

D. Mutant S. avermitilis bkdF: Fenotyp S. avermitilis przenoszący delecję chromosomową wpływającą na koniec 5' genu bkdF

Przeprowadzono następującą analizę: 1. Zdolność do wzrostu na płytkach agarowych z minimalnąpożywkązawierającąizoleucynę, leucynę i walinę (ILV) jako jedyne źródła węgla (c); 2. Test aktywności dehydrogenazy α-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu (BCKDH) El; oraz 3. Zdolność do wytwarzania naturalnych lub nowych awermektyn w czasie fermentacji. Poniżej podano opis tych metod:

1. Płytki ILV: Zastosowano wariant klasycznego minimalnego ośrodka M9 (Anderson E.H., 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 32:120-128). Modyfikowany ośrodek M9 zawiera (w litrze):

Agaroza (SeaKem ME, FMC BioProducts, Rockland, ME) 7,5 g

Woda destylowana 650 ml

Autoklawowano przez 15 minut w 121°C. Po schłodzeniu dodano następujące sterylne roztwory:

x M9 roztworu soli 40 ml

Roztwór bazowy składników mineralnych 2,1 ml 01 MFeSO₄-7H₂O 0,lml

Mieszanka ILV 250 ml pH doprowadzono do 7,0

Ostateczną objętość: 1 litr.

Około 25 ml wylano na każdą płytkę.

Sole 25 x M9 otrzymano rozpuszczając następujące sole w wodzie dejonizowanej do ostatecznej objętości 1,2 litra

K2HPO4	125 g
NaH2PO4H2O	55 g
NaNO3	48 g
pH doprowadzono do	7,0

Roztwór soli podzielono na porcje po 160 ml i wysterylizowano przez autoklawowanie w 121°C przez 15 minut.

Skład bazowego roztworu składników mineralnych:

lMMgSO₄-7H₂O

IM CaCl₂

178 993

0,25M MnSO₄H₂O

Autoklawowano przez 15 minut w 121°C

Mieszankę ILV otrzymano przez rozpuszczenie L-izoleucyny, L-leucyny i L-waliny w ilościach po 10 g w 1 litrze wody destylowanej. Mieszankę wysterylizowano przez filtrację.

Na płytkach tych mutanty bez bkd nie mogły rosnąć. Brak wykorzystania ILV oceniono po 14 dniach inkubacji w 29°C.

2. Test BCKDH El: Aktywność BCKDH El oznaczano zmodyfikowanym wariantem testu radiochemicznego opisanego uprzednio (Hafner E.W. i inni, 1991, J. Antibiotics, 44: 349-356). Wybrane izolaty hodowano na płytkach agarowych YPD-2 przez 6-7 dni w 29°C. Następnie grudki komórek o wielkości „główki od szpilki” zebrano z każdej kolonii rosnącej na płytkach agarowych YPD-2 za pomocą sterylnej pincetki i przeniesiono na dno 15 ml szklanej fiolki scyntylacyjnej. Komórki zdyspergowano i przesycono dodając 100 μΐ mieszanki toluen/a-[l-¹⁴C]-ketoizokapronian (otrzymanej w sposób opisany poniżej). Otwór fiolki natychmiast przykryto bibułą Whatman 4CHR (nr katalogowy Whatman 3004614), impregnowaną środkiem Solvable (solubilizator tkanki i żelu dostępny z NEN-Dupont). Plastikową zakrętką szczelnie zamknięto fiolkę, zakrętkę i górną połówkę fiolki oblano parafiną i fiolki inkubowano z łagodnym wytrząsaniem przez 3,5 godziny w 29°C. Po zakończeniu inkubacji bibułę przeniesiono do 7 ml szklanej fiolki scyntylacyjnej zawierającej 4 ml środka „Ready Safe” (Beckman), ciekłego koktajlu scyntylacyjnego do oznaczania radioaktywności. Radioaktywność oznaczano po ekwilibracji 4 godzinnej lub dłuższej. Mieszankę toluen/a-[l-¹⁴C]-ketoziokapronian otrzymano dodając 22 μΐ bazowego roztworu a-[l-¹⁴C]-ketoizokapronianu do 1 ml ośrodka solnego M9 (Davis R.W. i inni, 1980, Appendix 1: Media, drug concentration, and nutritional supplements, w „A Manuał for Genetic Engineering - Advanced Bacterial Genetics”, p. 203, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.), zawierającego 5% toluenu, poddanego obróbce ultradźwiękami, aby otrzymać mleczną dyspersję toluenu. Bazowy roztwór a-[l-^,4C]-ketoizokapronianu otrzymano przez zmieszanie 2,8 μΐ 20 mMα-ketoizokapronianu (sól sodowa, Sigma K-0629), 50 μΐ a-[l-¹⁴C] ketoizokapronianu (55 mCi/mmol, 50 pCi/mol, Amersham) i wody w takiej ilości, aby ostateczna objętość wynosiła 1 ml. Stężenie białka oznaczano stosując test białkowy Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Califomia), oparty na procedurze wiązania barwnika według Bradforda (Bradford M., Anal. Biochem. 72: 248, 1976). Aktywność właściwą składnika El dehydrogenazy a-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu wyraża się w pmolach CO₂ wydzielonego na minutę na mg białka (tabela I).

3. Wytwarzanie awermektyny. Grzybnię S. avermitilis ATCC 31272 SC2 lub szczep S. avermitilis CD794 (bkdF) hodowaną na świeżych, zmodyfikowanych płytkach agarowych YPD-2 (modyfikacja obejmowała wyeliminowanie octanu ze zwykłego ośrodka YPD-, patrz przykład I) przez 5-7 dni zaszczepiono w50ml(lx6 cala) probówkach do hodowli, zawierających 8 ml minimalnego określonego ośrodka (patrz poniżej). Probówki wytrząsano pod kątem 45° z szybkością 200 obrotów/minutę w 29°C przez 72 godziny. Po wyhodowaniu porcję 2 ml hodowli zaszczepiającej zastosowano do zaszczepiania nowej 300 ml kolby zawierającej 25 ml minimalnego określonego ośrodka, do którego można dodać różne kwasy tłuszczowe. Ośrodek fermentacji przyrządzono w sposób opisany uprzednio (Hafner, E. W. i inni, 1991, J. Antibiotics, 44:349-356), z tym, że hydrolizowaną skrobię (114 g/litr) zastosowano zamiast rozcieńczonej rozpuszczalnej skrobi ziemniaczanej, pominięto leucyna i NaCl, a dodano glicynę (2 g/litr). W pewnych fermentacjach do ośrodka dodawano kwas S-(+)-2-metylomasłowy lub cykloheksanokarboksylowy (CHC) (ostateczne stężenie 0,04%). Po wytrząsaniu przez 12 dni (200 obrotów/minutę) w 29°C zawartość kolby wyekstrahowano 4 objętościami mieszaniny rozpuszczalników acetonitryl: metanol (7:118) i w supernatancie zawartość awermektyny oznaczano metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Analizę HPLC przeprowadzano stosując 5 pm kolumnę Beckman Ultrasphere ODC C-18 (4,6 mm x 25 cm), przy szybkości przepływu 0,75 ml/minutę, z detekcjąna podstawie absorbancji przy 240 nm. Fazę ruchomą stanowiła woda (178 ml), acetonitryl (102 ml) i metanol do ostatecznej obj ętości 2 litry.

178 993

Wyniki testów zestawiono w tabeli I. 4 klony wrażliwe na tiostrepton, które utraciły swój replikon, wykazują typowy fenotyp deficytu bkd., a mianowicie: Wszystkie 4 klony nie mogą rosnąć na płytkach z minimalnym ośrodkiem ILV. i nie wykazują aktywności w oznaczeniu składnika El kompleksu BCKDH. Badania fermentacji wykazały, że blokowane hodowle nie są zdolne do wytwarzania naturalnych awermektyn. Natomiast po dodaniu do ośrodka fermentacji kwasu S-(+)-2-metylomasłowego (ostateczne stężenie 0,4%); wytworzone zostały naturalne formy „a” awermektyny; także dodatek kwasu cykloheksanokarboksylowego (CHC) doprowadził do syntezy nowych CHC-awermektyn. Te wyniki fermentacji wskazują, że blokowanie bkd nie wpływa na mechanizm komórkowej biosyntezy awermektyny. Jeden klon z tej grupy 4 klonów (klon pp 15, patrz tabela I) formalnie oznaczono jako szczep S. avermitilis CD794 i zdeponowano w American Type Culture Collection jako przykład według wynalazku. Stosowną informację dotyczącą tego depozytu znaleźć można na formularzu PCT RO/134, który załączono jako stronę 55 zgłoszenia.

Tabela

Aktywność dehydrogenazy El α-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu w różnych szczepach S. avermitilis

Szczep S. avermitilisa	Fenotyp odpomościb	Wzrost na IVLC	Aktywność właściwe El BCKDHde	Wytwarzanie naturalnych awermektyn
ATCC 31272 SC2	Erm-S, Tsr-S	+	69	+
PF 402-77	Erm-S, Tsr-S	-	0s	-/+'
CD783	Erm-R, Tsr-R	+	67	+
ppl4	Erm-R, Tsr-R	4-	65	+
PP21	Erm-R, Tsr-R	+	50	+
ppl5 (CD794)	Erm-R, Tsr-S	-	0B	-/+
ppl7	Erm-R, Tsr-S	-	0s	NT41
pp22	Erm-R, Tsr-S	-	0s	-/+
pp40	Erm-R, Tsr-S	-	0s	NTh

a. Zastosowano następujące szczepy S. avermitilis: ATCC 31272 SC2, pojedynczy izolat kolonii szczepu ATCC 31272; PF402-77, zubożona w bkd pochodna mutantowa szczepu ATCC 31272 SC2 otrzymana na drodze mutagenezy chemicznej; CD783, pochodna szczepu ATCC 31272 SC2 transformowana plazmidem pCD768 (patrz przykład IX); ppl4-40, pojedyncza kolonia, pochodna CD783 wydzielonego po protoplazmowaniu i regeneracji (patrz przykład IX).

_“b Erm-R, odporny na erytromycynę; Tsr-R, odporny na tiostrepton.

c. + lub zdolność lub niezdolność do wzrostu na minimalnym ośrodku uzupełnionym izoleucyna, leucyną i waliną jako jedynymi źródłami węgla

d. Aktywność właściwa składnika El dehydrogenazy α-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu, pmole CO₂ wydzielonego w ciągu minuty przez mg białka.

e. Wyniki stanowią średnią z dwóch pomiarów.

f. + lub -, wytwarzanie lub nie wytwarzanie naturalnych awermektyn na drodze fermentacji.

g 0 = nie wykrywalny.

h NT - nie badano.

i -/+ = brak produkcji naturalnych awermektyn na drodze fermentacji; jednakże zachodzi wytwarzanie naturalnej awermektyny po dodaniu kwasu S-(+)-2-metylmasłowego do ośrodka fermentacji oraz wytwarzanie nowych CHC-awermektyn po dodaniu CHC do ośrodka fermentacji

178 993

E. Analiza hybrydyzacyjna Southern potwierdzająca genotyp bkd-minut

Analizę hybrydyzacji Southema przeprowadzono dla dwóch klonów erm-R, tsr-S, ppl5 (formalnie nazywanych szczep CD794) and pp22 (formalnie nazywany szczep CD798). Analizy te wykazały, że chromosomowa integracja markera ermE i równoczesna delecja fragmentu genomowego 1,4 kb BamHI przenoszącego otwartą ramkę odczytu (ORF-1) na końcu 5' wystąpiła w wyniku podwójnego crossing-over. Fragmenty restrykcyjne chromosomowego DNA rozdzielono na drodze elektroforezy przez 1% żel agarozowy i przeniesiono na nylon, w sposób zasadniczo odpowiadający metodzie Southema (1975) opisanej w przykładzie V.

Przyk ład X. Konstrukcja mutanta S. avermitilis bkdABCF

W przykładzie tym opisano konstrukcję trwałych wielokrotnych mutantów S. avermitilis obejmujących następujące geny bkd: bkdA, bkdB, bkdC i bkdF. Pierwsze 3 z tych genów, bkdA, bkdB i bkdC, kodują odpowiednio podjednostki El-a, El-β i E2 kompleksu dehydrogenazy α-ketokwasu o rozgałęzionym łańuchu. Geny te stanowią część skupienia genowego bkdABC, które opisał Denoya C.D., zgłoszenie patentowe USA nr 08/100,518, z 30 lipca 1993. Gen bkdf zlokalizowany jest w skupieniu genowym bkdFGH opisanym powyżej, przy czym koduje on podjednostkę El-a kompleksu dehydrogenazy α-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu.

A. Projektowanie i konstrukcja wektora dostarczającego, przenoszącego docelowy obszar chromosomowy (bkdC) zaznaczony selekcjonującym markerem odporności na antybiotyk (ermE)

Najpierw przeprowadzono subklonowanie genomowego fragmentu 6,5 kb Sphł S. avermitilis 31272 (przenoszącego skupienie genomowe bkdABC) w miejsce klonowania Sphl wektora bifunkcjonalnego/dostarczającego pCD500 (patrz Denoya C.D., „Novel Bacterial Plazmid Shuttle Vectors for Streptomycetes and Escherichia coli”, zgłoszenie patentowe U SA nr 08/032,925, z 18 marca 1993), uzyskując plazmid pCD544 (patrz fig. 9). Następnie fragment 1,7 kb Bglll pU4026 przenoszący marker ermE wstawiono do unikatowego miejsca Bglll w insercie pCD544. Plazmid pIJ4026 stanowi pochodną wektora klonowania E. coli pUCl 8 przenoszącego gen ermE Saccharopolyspora enythraea (uprzednio Streptomyces erythraeus) (patrz M. Bibb i inni, 1985, Gene, 41: 357-368, oraz D.A. Hopwood i inni, Genetic Manipulation Streptomyces A Laboratory Manuał, 1985, The John Innes Foundation, Norwich, U.K.). Uzyskany konstrukt (pCD547) zawiera insercyjne zdezaktywowanąkopię genu bkdC.

B. Konstrukcja genetycznie znaczonego genu mutantowego bkdC

Stosując plazmid pCD547 jako wektor doprowadzający (patrz sekcja poprzednia), dziki szczep S. avermitilis ATCC 31272 SC2 jako gospodarza, oraz postępując zgodnie ze standardowymi procedurami podstawiania genu (patrz przykład IX), wybrani 12 protoplastowanych/ a następnie zregenerowanych pojedynczych kolonii wykazujących fenotyp odporności na erytromycynę, wrażliwości na tiostrepton. Jedną z kolonii z tej grupy 12 formalnie nazwano szczep S. avermitilis CD570 (patrz fig. 9) i zastosowano jako gospodarza w poniższych etapach podstawienia genowego (patrz poniżej).

C. Projektowanie i konstrukcja wektora dostarczającego, przenoszącego zmutowany (zdeletowany) obszar docelowy

Plazmid pCD728 stanowi pochodną wektora dwufunkcjonalnego pCD262 (patrz Denoya C.D., „Novel Bacterial Plazmid Shuttle Vectors for Streptomycetes and Escherichia coli”, zgłoszenie patentowe USA nr 08/032,925 z 18 marca, 1993) przenoszącego dwa chromosomowe fragmenty S. avermitilis (7 kb BamHI, otrzymany z subklonu pCD528 i 6,5 kb Balll/BamHI, otrzymany z subklonu pCD559 (patrz fig. 9). Pełny opis wykorzystanych subklonów - patrz Denoya C.D., zgłoszenie patentowe USA nr 08/100,518, z 30 lipca 1993.

D. Konstrukcja nieznakowanego szczepu delecyjnego bkdABC

Plazmid pCD728 przeniesiono do protoplastów S. avermitilis szczep CD570, a przepuszczalne transformanty odzyskano. Plazmid kontrolny pCD739 z jednym z fragmentów genomowych

178 993 wstawionych w złej orientacji, także wprowadzono do szczepu CD570 na drodze transformacji. Uzyskano wiele mutantów, w których marker ermE zastąpiono zdeletowanym konstruktem bkdABC, a plazmid doprowadzający (pCD262) ubył z komórki. W podsumowaniu w wyniku transformacji i podwójnej rekombinacji crrossing over pCD728 spowodował delecję około 2 kb chromosomu S. avermitilis obejmującągeny bkdA (El-oc), bkdB (El-β) i bkdC (E2). Odzyskane składniki wykazywały fenotyp wrażliwości na erytromycynę, wrażliwości na tiostrepton fenotyp. Analiza metodąblottingu Southern potwierdziła, że marker ermE został zastąpiony zdeletowaną sekwencją. Jedną pojedynczą kolonię reprezentującą tą grupę wybrano do dalszych badań i oznaczono jako szczep CD757 (patrz fig. 9).

E. Projektowanie i konstrukcja wektora podstawiającego gen bkdF

Konstrukcję tego wektora opisano w przykładzie IX, część A. W skrócie plazmid pCD768 stanowi pochodną wektora dwufunkcjonalnego pCD262 przenoszącego 2 fragmenty genomowe S. avermitilis (2,3 i 4,1 kb BaMHI), w sąsiedztwie obydwu końców fragmentu 1,4 kb BamHI w dzikim chromosomie. Dodatkowo pCD768 przenosi marker ermE zlokalizowany między fragmentami 2,3 4,1 kb BamHI. Marker ermE znajduje się w przeciwnej orientacji względem ORF-1 (bkdF), co zapobiega potencj alnej śmiertelności spowodowanej nadekspresj ą genów w dół. Konstrukt wytwarza delecję 1,4 kb (wpływającą na koniec 5' genu bkdF) w genomie gospodarza po rekombinacji.

Konstrukcja wielokrotnego mutanta bkd S. avermitilis (bkdABCF)

Plazmid pCD768 przeniesiono do protoplastów szczepu S. avermitilis CD575 (bkdABC) (patrz etap D, powyżej), zasadniczo w sposób opisany w przykładzie IX. Odzyskano wiele transformantów i domniemane składniki wybrano na podstawie standardowej procedury. Jeden składnik tej grupy reprezentujący fenotyp odporności na erytromycynę, wrażliwości na tiostrepton, nazwano jako szczep CD797 i poddano dalszej analizie (patrz fig. 9). Hodowla CD797 wykazuje typowy fenotyp zubożenia w bkd, gdyż jest niezdolna do wzrostu na płytkach z minimalnym ośrodkiem ILV (patrz przykład 9) oraz nie wykazuje aktywności składnika El kompleksu BCKDH. Badania fermentacji wykazały, że blokowana hodowla nie była zdolna do syntezy naturalnych awermektyn, o ile nie została uzupełniona kwasem S-(+)-2-metylomasłowym lub izomasłowym. Ponadto po dodaniu kwasu cykloheksanokarboksylowego (CHC) uzyskano nowe CHC-awermektyny. Wyniki tej fermentacji wykazują, że wielokrotny blok bkd obejmujący rozkład lub delecję 4 genów bkd (bkdA, bkdC, bkdC i bkdF), nie wpływa na mechanizm biosyntezy awermektyny przez komórkę.

Zestawienie sekwencji (1) Informacja ogólna:

(i) Zgłaszający: DENOYA CLAUDIO D. (tylko dla USA)' STUTZMAN-ENGWALL, KIM J. (tylko dla USA)

PFIZER INC. (we wszystkich krajach z wyjątkiem

USA) ) (ii) Geny kodujące kompleks dehydrogenazy a-ketokwasu

178 993 o rozgałęzionym łańcuchu ze Streptomyces avermitilis (iii) liczba sekwencji: 8 (iv) Adres korespondencyjny:

(A) Adresat: dr Peter C. Richardson, PFIZER INC (B) Ulica: 235 EAST 42ND STREET, 20TH FLOOR (C) Miasto: NEW YORK (D) Stan: NEW YORK (E) Państwo: U.S.A.

(F) Kod pocztowy: 10017-5755 (v) Postać odczytywana prze komputer:

(A) Rodzaj nośnika: dyskietka (B) Komputer: kompatybilny z IBM PC (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patentln Release nr 1.0, Version nr 1.25 (vi) Dane dotyczące bieżącego zgłoszenia:

(A) nr zgłoszenia: US 08/168,602 (B) data zgłoszenia: 16-DEC-1993 (C) Klasyfikacja:

(viii) Informacje o rzeczniku/pełnomocniku:

(A) Nazwisko: DEBENEDICTIS, KAREN (B) nr rejestracyjny: 32,977 (C) nr rejestracyjny rzecznika: PC8529A (ix) Informacja telekomunikacyjna (A) Telefon: (212)573-5425 (B) Telefaks: (212)573-1939 (C) Teleks: N/A (2) Informacja o sekwencji ID nr 1:

178 993 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) długość: 501 par zasad (B) Typ: kwas nukleionowy (C) Niciowość: podwójna (D) Topoligia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID nr 1:

TACGTCTTCC CGACCTACCG CGAGCACGGC GTCGCCTGGT CCGGCGGGGT CGACCCCACC AACCTGCTCG GCATGTTCCG CGGCGTGAAC AACGGCGGCT GGGATCCCAA CAGCAACAAC TTCCACCTCT ACACGATCGT CATCGGCTCG CAGACGCTGC ACGCCACCGG CTACGCCATG GGTATCGCCA AGGACGGCGC CGACTCGGCC GTGATCGCGT ACTTCGGTGA CGGCGCCTCC AGCCAGGGTG ACGTCGCCGA ATCGTTCGCC TTCTCCGCGG TCTACAACGC CCCTGTCGTC TTCTTCTGCC AGAACAACCA GTGGGCGATC TCGAGCCCCA CCGAOAAGCA GACCCGCGTC CCGCTCTACC AGCGCGCGCA GGGCTACGGC TTCCCGGGCG TCCGCGTCGA CGGCAACGAC GTACTGGCCT GCCTCGCCGT CACCAAGTGC CTCGAGCGGG CCCGCCGGGG CGAGGGGCCC ACGTTGGTCG AGGCGTTCAC G (2) Informacja o sekwencji ID nr 2:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) długość: 201 par zasad (B) Typ: kwas nukleionowy (C) Niciowość: podwójna (D) Topoligia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID nr 2:

CTCGCCGAGT CGGGCATCGT CGGCACGGCG ATCGGTCTCG CCCTGCGCGG CTACCGGCCG

GTGGTGGAGA TCCAGTTCGA CGGCTTCGTC TTCCCGGCGT ACGACCAGAT CGTCACGCAG

CTCGCGAAGA TGCACGCGCG GGCGTCGGGC AA.GATCAAGC TCCCCGTTGT CGTCCGCATC

120

180

240

300

360

420

480

501

120

180

178 993

CCGTACGGCG GCGGCATCGG C

201 (2) Informacja o sekwencji ID nr 3:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) długość: 217 par zasad (B) Typ: kwas nukleionowy (C) Niciowość: podwójna (D) Topoligia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID nr 3:

CGCCGGTGTT CCTGGGCGGC GGGCCGCCGG AGATCGCCGC CCGCATCACG GAGCGCTGCT60

TCTACCACCT GGAGGCACCC GTGCTGAGGG TCGGCGGCTA CCACGCCCCG TATCCGCCGG120

CGCGTCTGGA AGAGGAGTAC CTTCCGGGCC TTGACCGGGT GCTCGATGCC GTCGACCGCT 180

CGCTGGCGTA CTGAGGAGAG GGTCGTGACG ACGATGA217 (2) Informacja o sekwencji ID nr 4:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) długość: 453 pary zasad (B) Typ: kwas nukleionowy (C) Niciowość: podwójna (D) Topoligia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (xi) Opis sekwencji: SEQ ID nr 4:

AACCAGGAGA TCGTCCTCAA GCACTATGTG AACCTGGGCA TCGCGGCGGC CACCCCGCGC 60

GGTCTGATCG TCCCGAACAT CAAGGACGCC CACGCCAAGA CCGTGCCGCA ACTGGCCGAG 120

TCACTGGGTG AGTTGGTGTC GACGGCCCGC GAGGGCAAGA CGTCCCCGAC GGCCATGCAG 150

GGCGGCACGG TCACGATCAC GAACGTCGGC GTTCTTCGGC GTCGACACGG GCACGCCGAT 240

CCTATCCTCA ACCCCGGCGA GTCCGCGATC CTCGGCTTCG GCGCGATCAA GCTCCAGCCG 300

178 993

TGGGTCCACA	AGGGCAAGGT	CAAGCCCCGA	CAGGTCACCA	CGCTGGCGCT	CAGCTTCGAC	360
CATCGCCTGG	TCGACGGCGA	GCTGGGCTCC	AAGGTGCTGG	CCGACGTGGC	GGCGATCCTG	420
GAGCAGCCGA	AGCGGCTGAT	CACCTGGGCC	TAG			453

(2) Informacja o sekwencji ID nr 5:

(i) Charakterystyka...sekwencj m:

(A) długość: 501 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topoligia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis

Tyr Val Phe Pro 1 fal Asp Pro Thr 20

Gly Trp Asp Pro 35

Gly Ser Gin Thr 50

Asp Gly Ala Asp 65

Ser Gin Gly Asp

Ala Pro Val fal

100

Pro Thr Glu Lys sekwencji: SEQ

Thr Tyr Arg Glu 5

Asn Leu Leu Gly

Asn Ser Asn Asn

Leu His Ala Thr

Ser Ala fal Ile fal Ala Glu Ser 85

Phe Phe Cys Gin

Gin Thr Arg fal

ID nr 5:

His Gly fal Ala Trp 10

Met Phe Arg Gly fal 25

Phe His Leu Tyr Thr 45

Gly Tyr Ala Met Gly

Ala Tyr Phe Gly Asp 75

Phe Ala Phe Ser Ala

Asn Asn Gin Trp Ala 105

Pro Leu Tyr Gin Arg

Ser Gly Gly

Asn Asn Gly 30

Ile fal Ile

Ile Ala Lys

Gly Ala Ser fal Tyr Asn

Ile Ser Ser

110

Ala Gin.Gly

115

120

125

178 993

Val Arg Val Asp Gly Asn

135

Cys Leu Glu Arg Ala Arg

150 155

Phe Thr

Ala 165 Informacja o sekwencji ID nr 6: Charakterystyka sekwencji: długość: 67 aminokwasów Typ: aminokwas Niciowość: pojedyncza Topoligia: liniowa cząsteczki: peptyd sekwencji: SEQ ID nr 6: Gly 5 1 Val Ile

Lys

Tyr Gly Phe Pro Gly 130

Leu Ala Val Thr Lys 145

Thr Leu Val Glu (2) (i) (A) (B) (C) (D) (ii) Typ (xi) Opis

Leu Ala Glu Ser

Gly Tyr Arg Pro

Ala Tyr Asp Gin 35

Ser Gly Lys Ile 50

Gly Ile Gly 65

Ile Val Gly Thr Ala Ile

Val Glu Ile Gin Phe Asp

Val Thr Gin Leu Ala Lys

Leu Pro Val Val Val Arg

Asp Val Leu Ala Cys 140

Arg Gly Glu Gly Pro

160

Gly Leu Ala Leu Arg

Gly Phe Val Phe Pro

Met His Ala Arg Ala 45

Ile Pro Tyr Gly Gly 60 (2) Informacja o sekwencji ID nr 7:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) długość: 63 aminokwasów

178 993 (B) Typ: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topoligia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID nr 5:

Pro

Val

Phe

Leu

Gly

Gly

Gly

Pro

Pro

Glu

Ile

Ala

Ala

Arg

Ile

Thr

1

5

10

15

Clu

Arg

Cys

Phe

Tyr

His

Leu

Glu

Ala

Pro

Val

Leu

Arg

Val

Gly

Gly

20

25

30

Tyr

His

Ala

Pro

Tyr

Pro

Pro

Ala

Arg

Leu

Glu

Glu

Glu

Tyr

Leu

Pro

35

40

45

Gly

Leu

Asp

Arg

Val

Leu

Asp

Ala

Val

Asp

Arg

Ser

Leu

Ala

Tyr

50

55

60

(2) Informacja o sekwencji ID nr 8:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) długość: 150 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Niciowość: pojedyncza (D) Topoligia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID nr 8:

Aen Gin Glu Ile Val Leu Lys His Tyr Val Aen Leu Gly Ile Ala Ala

10 15

Ala Thr Pro Arg Gly Leu Ile Val Pro Asn Ile Lys Asp Ala His Ala

Lys Thr Val Pro Gin Leu Ala Glu Ser Leu Gly Glu Leu Val Ser Thr

178 993

Ala Arg Glu Gly Lys

Thr Ile Thr Asn Val

Pro Ile Leu Asn Pro

Lys Leu Gin Pro Trp

100

Thr Thr Leu Ala Leu

115

Gly Ser Lys Val Leu

130

Arg Leu Ile Thr Trp

Thr Ser Pro Thr Ala

Gly Val Leu Arg Arg 70

Gly Glu Ser Ala Ile 90

Val His Lys Gly Lys

105

Ser Phe Asp His Arg

120

Ala Asp Val Ala Ala

135

Ala

145

Met Gin Gly Gly Thr Val

Arg His Gly His Ala Asp

80

Leu Gly Phe Gly Ala Ile

Val Lys Pro Arg Gin Val

110

Leu Val Asp Gly Glu Leu

125

Ile Leu Glu Gin Pro Lys

140

178 993

178 993

m

o u

Cl

00 o

o o o

X

CN W

o < o

X

UD CN

o Eh <

M

O CN

u 0 0

<

CN

0 0 Eh

S

00 rn

0 0 0

<

CN

0 0 Eh

0

<0 CO

0 Eh Eh

X

o

E-

o

0

0

0

O

O

0

<

Eh

Eh

<

0

0

0

o

Ξ*

o

Cl

0

X

0

>

Eh

X

0

θ'

0

X

0

<

<

Eh

o

o

0

U

0

O

0

0

0

o

o

0

0

0

<

<

Eh

0

o

o

Ε-

3

Eh

0

<

Eh

ω

<<

z

U

θ'

U

i-3

U

X

o

Ο

0

0

<

0

0

<

0

o

e

<

0

<

<

Eh

0

o

u

o

O

O

O

Eh

ω

0

x

<

z

Eh

0

>

0

0

o

o

0

U

0

0

0

O

0

u

o

o

<

0

<

Eh

<

<

H

ω

o

0

H

en

0

Q

0

<

0

θ'

0

X

0

Q

0

X

o

o

0

U

U

0

0

U

0

o

<c

o

0

Eh

0

0

<

0

Eh

2

z

o

0

0

0

Ξ>

Eh

0

U

X

<

Z

0

0

U

o

o

U

0

0

U

0

0

u

0

<

Eh

Eh

0

0

o

<

2

z

<

Ι-Η

0

0

0

Q

Eh

X

0

>

0

0

U

X

o

u

0

0

Eh

U

0

u

(j

Eh

Eh

Eh

<

0

Eh

0

0

O

>

O

>

0

>

0

Q

0

0

Eh

X

0

X

0

Q

0

X

O

O

0

0

0

0

0

0

U

O

O

Eh

<

Eh

0

Eh

u

o

O

O

o

<

1-1

3

X

0

θ'

0

>

<

Eh

0

>

0

u

U

LT)

0

cn

o

m

0

f*.

U

rH

0

m

o

o>

0

CN

<

00

o

U

00

u

0

Οϊ

Eh

LT>

<C

o

0

LT»

0

0

X

u

X

<—I

<

Eh

t—ł

0

<

CN

<

cn

CN

0

>

m

U

θ'

0

X

u

0-

o

o

0

u

0

Eh

0

0

0

<

Eh

<

Eh

0

0

Eh

<

o

x

Eh

X

Eh

>h

<

M

Eh

ω

0

X

<

X

0

>

0

d

o

O

O

0

O

0

U

O

o

E-

Ε-

0

0

0

<

0

Eh

o

X

C

z

υ

X

0

0

0

<

0

<

0

X

0

0

o

. 1

o

0

0

0

0

O

U

0

U

»—4

<

o

<

Η

0

<

U

0

0

o

o

U

X

<

Z

0

0

<

z

Eh

0

X

Eh

o

ω

U

0

U

0

0

U

0

O

0

u

Eh

U

<

<

o

Eh

<c

o

<

E-

o

X

Eh

X

0

<

0

Q

Eh

0

X

Eh

X

<

y;

<

Eh

o

o

0

U

Eh

U

0

0

u

o

o

P

<

0

Eh

0

0

Eh

u

X

u

X

<

z

>->

0

0

0 >

<

ω

0

0

<

P-4

Eh

X

u

o

U

O

U

0

0

O

o

0

H

0

Eh

0

0

<

Eh

U

H

X

z

z

0

0

Eh

X

0

<

Eh

ω

Eh

0

*>

0

<

o

0

U

O

U

U

0

O

O

0

Eh

o

0

0

<

u

Eh

0

U

<c

o

>

<

Eh

<

ω

<

Eh

Eh

Eh

ω

<

i—1

0

0

0

0

X

o

o

o

U

0

0

0

0

O

o

<

u

«c

u

0

Eh

O

<

Eh

Eh

Eh

u

X

3

z

0

<

0

<

Eh

X

0

<

O

θ'

0

t—1

0

178 993

o

CO

0

CM

0

un

<

o

<

<£>

Eh

Eh

>

r—ł

0

O

r—1

U

U

O

U

0

O

<

o

0

0

Q

id

o

U

U

u

<

Eh

o

Cd

Eh

>H

<

M

o

0

0

Ε-

U

<

υ

0

<

<

o

0

O

o

U

0

u

<

O

a,

0

0

o

U

0

u

H

Eh

U

0

o

0

U

X

Eh

Ul

0

0

E-

0

0

u

0

H

U

En

0

0

0

>

0

<

<

H

O

U

0

U

H

0

0

<

ł-ł

u,

U

cd

0

0

0

U

0

u

O

<

0

U

u

Q iRZ

O

0

0

0

<

0

0

p·^

0

1

U

in

u

cn

u

CM

U

H

CO

<

co

<

co

0

<

0

Q

rH

0

rH

0

0

0

0

0

u

0

Eh

Eh

<

0

0

H

tu

<

s:

En

>

O

0

0

0

Eh

<

<

U

0

>

0

O

<

U

a

0

U

0

U

E-

Eh

0

Eh

<

M

<

M

0

<

<

U

0

o

O

0

<

Eh

0

0

0

0

M

U

j

u

cd

0

0

0

u

U

H

<

Eh

E-

ω

0

>

U

o

0

>

0

0

0

U

<

U

E4

0

ω

0

>

<

Eh

0

>

U

0

O

U

0

Eh

Eh

0

<

U

CU

0

>

0

>

U

0

U

U

Eh

0

En

0

U

,-3

O

X

<

n

U

X

	<D U LO O u	o O r-H O	O eo H -Ή u	J
Cd	H u cu
	0		0	0
			u	Eh
	0	ω	0 <	0	>
	0		U	0
	O		<	0
	<	Eh	U X	U	cd
	0		o	U
	Eh			<
	<	H	Eh >	O	Q
	U		U	Eh
	0		0	Eh
	U	Cd	0 0	U	X
	U		U	0
	U		0	0
	0	<	0 0	0	0
	u		U	0
	u		Eh	U
	0	<	0 >	u	a
	u		0	Eh
	Eh		0	Eh
	<	t-ł	< cd	U	J
	0		0	0	C
	<		Eh	<	0
D	0	ω	U J		>4 H ·
0	CTl 0		m 0	Γ- 0	^h U
	C4 0		00 Eh	CO <C	en <
	O	CU	0 >	Χ 0	W En >
	0		U	0	0
	O		0	<	u
	u	a	u a	0	ω o <
	0		<	<	0
	0		u	<	En
	0	0	0 <	0	ω oj
	u		0	0	o
	0		<	Eh	u
	0	0	0 w	U	J En W
	u		0	Eh	U
	0		Eh	0	0
	0	0	0 J	U	cd o cd
	0		0	0	o
	Eh		<	U	<
	O	0	u X	0	< 0 Q
	U		u	0	u
	En		<	u	En
	Eh	Cu	Eh >h	0	a o >
	0		0	0	o
			Eh	o	o
	0		Eh tu	o	a o <
	0		O		En
	O		0	<	C
	u	a	Eh U	Eh	> 0 Q

178 993

AAC CAG GAG ATC GTC CTC AAG CAC TAT GTG AAC CTG GGC ATC GCG GCG GCC ACC

o 0

0

00

E-

Ol

u

0

o

u

0

r— U

u

E-

p··»

E-

OJ

co

0

t—

H O

CU

t—1

<

E-

OJ

U

Z

OJ

<

ł—<

ΟΊ

Z

m

0 0

Z

O

0

E-

0

u

U

0

Ε-

<

E-

U

Ε-

<

u

<

0

Z

0

>

0

0

>

0

Q

u

Z

u

u

U

U

0

U

0

o

0

0

U

Ε-

<

<

<

E-

0

0

0

0

Ε-

ω

Z

0

>

U

O

u

0

U

0

U

0

u

<

Ε-

<

0

H

<

z

0

ω

0

>

0

ω

0

0

U

Z

0

Z

o

U

U

U

0

U

0

o

0

0

<5

0

Ε-

M

u

<

U

z

<

z

0

0

<

Z

U

z

υ

z

u

u

0

U

u

E-

U

<

0

U

U

<

<

E-

O

u

z

0

<c

<

E-

U

z

u

Z

U

z

<

M

0

u

U

u

u

0

o

0

E-

Ε-

<

U

Z

u

<

E-

M

z

0

>

o

Q

0

o

0

0

u

0

u

0

<

0

U

Ε-

0

E-

U

Z

o

Q

E-

co

E-

υ

z

Ε-

s

E-

Z

0

<

o

0

u

u

0

u

0

<

E-

Ε-

U

0

Ε-

>

Z

0

>

0

>

<

I-I

U

z

<

CO

0

>

m O

p^.

0

rH

0

lD

E-

cn

0

m

u

p·^

U

oo E-

m

E-

σ\

U

U

o

c

un

Ε-

O

<

>

<

M

E-

Z

t—1

Ε-

OJ

U

Z

04

u

o

m

υ

z

0

Q

U

0

U

E-

u

0

U

0

<

Ε-

U

U

Z

Z

0

Cii

0

0

0

Q

υ

z

0

<

0

<

o

E-

U

U

0

0

0

o

0

0

U

Ε-

Ε-

z

o

&

0

0

0

0

0

<

z

υ

z

0

Z

o

0

0

U

U

0

0

E-

E-

<

E-

U

Ε-

z

O

>

0

Z

U

O

U

Z

M

E-

0

>

u

<

0

o

0

U

0

0

E-

0

U

U

<

>

HH

E-

CO

<

Z

0

0

0

<

<

E-

<

z

o

0

U

u

U

u

U

Ε-

<

u

0

Ε-

u

t-ł

υ

Z

0

ω

0

<

u

Z

0

0

0

>

Ε-

co

Ε-

0

0

<

U

U

υ

0

0

u

0

E-

<

O

ω

O

0

0

<

<

E-

U

z

E-

Z

U

O

O

0

(J

0

0

ε-

U

<

O

u

Ε-

u

0

0

O

Ε-

O

u

Z

0

z

u

z

u

z

0

0

u

z

υ

0

u

0

U

u

0

O

u

0

E-

u

<

Z

0

Z

U

O

E-

co

u

z

U

z

u

z

0

ω

CGG CTG ATC ACC TGG GCC TAG

178 993

Sonda

5.0

Podstawienie

PB BB P P B

4.3 0.9

178 993

FIG-8

BamHI

178 993

Β ΒΒ Β Β X X Β

izczepCD797 (erm-R, tsr-S)

178 993

F!Go ΙΑ ' -aagaattcgagctcggcgaćggćgććacćtccgagggć:gać-3

EcoRI SacI

FiG. IB

5'-AAGGATCCTCTAGAGGTSSWGTGGKGGCCGATSCGGWA-3'

BamHI Xbal

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (17)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Wydzielony segment DNA, znamienny tym, że koduje kompleks dehydrogenazy α-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu organizmu należącego do gatunku Streptomyces i jako sekwencję DNA zawiera sekwencję Id nr 1, sekwencję Id nr 2, sekwencję Id nr 3 lub sekwencję Id nr 4 albo wariant tych sekwencji kodujący zasadniczo taki sam polipeptyd.
2. 2. Wydzielony segment DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że koduje kompleks dehydrogenazy α-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu Streptomyces avermitilis.
3. 3. Wydzielony segment DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera ponadto obszar DNA, który reguluje ekspresję kompleksu dehydrogenazy α-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu.
4. 4. Wydzielony segment DNA według zastrz. 2, znamienny tym, że zawiera ponadto obszar DNA, który reguluje ekspresję kompleksu dehydrogenazy α-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu.
5. 5. Fragment DNA, znamienny tym, że stanowi fragment funkcyjnie równoważny segmentowi DNA o sekwencjach Id nr 1, Id nr 2, Id nr 3 lub Id nr 4 albo wariant tych sekwencji kodujący zasadniczo taki sam polipeptyd.
6. 6. Zrekombinowany DNA, znamienny tym, że zawiera segment DNA o sekwencjach Id nr 1, Id nr 2, Id nr 3 lub Id nr 4 albo wariant tych sekwencji koduj ący zasadniczo taki sam polipeptyd.
7. 7. Komórka gospodarza, znamienna tym, że zawiera wprowadzony zrekombinowany DNA o sekwencjach Id nr 1, nr 2, Id nr 3 lub Id nr 4 albo wariant tych sekwencji kodujący zasadniczo taki sam polipeptyd.
8. 8. Komórka gospodarza według zastrz. 7, znamienna tym, że zawiera wprowadzony zrekombinowany DNA, który zawiera segment DNA wybrany z grupy obejmującej pCD713, pCD740, pCD747 i pCD854.
9. 9. Plazmid, znamienny tym, że zawiera zrekombinowany DNA o sekwencjach Id nr 1, Id nr 2, Id nr 3 lub Id nr 4 albo wariant tych sekwencji kodujący zasadniczo taki sam polipeptyd.
10. 10. Segment DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że jest wybrany z grupy obejmującej pCD713 pochodzący z ATCC69493, pCD740 pochodzący z ATCC69494, pCD747 pochodzący z ATCC69495 i pCD854 pochodzący z ATCC69496.
11. 11. Segment DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera obszar DNA, który reguluje transkrypcję lub translację sekwencji DNA w postaci Id nr 1, Id nr 2, Id nr 3 lub Id nr 4 albo wariant tych sekwencji kodujący zasadniczo taki sam polipeptyd.
12. 12. Gen kompleksu dehydrogenazy α-ketokwasu o rozgałęzionym łańcuchu, ze Streptomyces avermitilis, znamienny tym, że zawiera segment DNA wybrany z grupy obejmującej pCD713, pCD740, pCD747 i pCD854.
13. 13. Segment DNA według zastrz. 1 zawierający sekwencję DNA, która stanowi fragment sekwencji DNA w postaci sekwencji Id nr 1, Id nr 2, Id nr 3 lub Id nr 4 albo wariant tych sekwencji kodujący zasadniczo taki sam polipeptyd i jest zdolny do hybrydyzacji odpowiednio z sekwencją Id nr 1, Id nr 2, Id nr 3 lub Id nr 4 albo wariantem tych sekwencji kodującym zasadniczo taki sam polipeptyd.

    178 993
14. 14. Oczyszczony polipeptyd, znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasów w postaci sekwencji Id nr 5, w postaci sekwencji Id nr 6, w postaci sekwencji Id nr 7 lub w postaci sekwencji Id nr 8.
15. 15. Polipeptyd, znamienny ty m, że został wytworzony w wyniku ekspresj i w komórce gospodarza, która zawiera wprowadzony zrekombinowany DNA o sekwencjach Id nr 1, Id nr 2, Id nr 3 lub Id nr 4 albo wariant tych sekwencji kodujący zasadniczo taki sam polipeptyd.
16. 16. Sposób wytwarzania naturalnej awermektyny, znamienny tym, że prowadzi się fermentację S. avermitilis, w którym została zwiększona liczba kopii fragmentu genomowego zawierającego jeden lub więcej spośród genów bkdF, bkdG, bkdH lub w którym ekspresja genomowego fragmentu zawierającego jeden spośród tych genów została wzmocniona na drodze manipulacji lub podstawienia genów bkdF, bkdG, bkdH odpowiedzialnych za regulację takiej ekspresji.
17. 17. Sposób wytwarzania nowej awermektyny, znamienny tym, że prowadzi się fermentację S. avermitilis, w którym ekspresja fragmentu genomowego zawierającego jeden lub więcej spośród genomów bkdA, bkdB, bkdC, bkdF, bkdG i bkdH została osłabiona lub wyeliminowana poprzez delecję, dezaktywację, podstawienie lub innąmanipulację genami odpowiedzialnymi za taką ekspresję lub w którym fragment genomowy zawierający jeden lub więcej spośród tych genów bkdA, bkdB, bkdC, bkdF, bkdG i bkdH został wycięty lub zdezaktywowany.