BR112019011603A2 - isolados de streptomyces fungicidicus modificados e seu uso - Google Patents

Abstract

A presente invenção é desenvolvida para isolados de Streptomyces fungicidicus modificados, composições compreendendo estes isolados e métodos de utilização de tais isolados, e composições para sintetizar biologicamente enduracidina (enramicina). Além disso, a presente invenção é desenvolvida para isolados de Streptomyces fungicidicus modificados que sintetizam biologicamente enduracidina e facilitam a produção de enramicina em uma maneira mais eficiente.

Description

ISOLADOS DE STREPTOMYCES FUNGICIDICUS MODIFICADOS E SEU USO REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade sob 35 U.S.C. Parágrafo 119(c) do pedido provisório U.S. Nº 62/430.455 depositado em 6 dezembro de 2016, cujo conteúdo é incorporado na presente invenção a título de referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se a isolados de Streptomyces fungicidicus modificados, composições compreendendo estes isolados e métodos de utilizar tais isolados e composições para sintetizar biologicamente enduracidina (enramicina). A presente invenção refere-se ainda a isolados de Streptomyces fungicidicus modificados que sintetizam biologicamente enduracidina e facilitam a produção de enramicina em uma maneira mais eficiente.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] Enduracidina, também conhecida como enramicina, e vendida como Enradinº pela MSD Animal Health, é um antibiótico de lipodepsipeptídeo de 17 aminoácidos que ocorre naturalmente que é biossintetizado e excretado pela bactéria Streptomyces fungicidicus, um fabricante natural para produzir enduracidina.

[004] Enduracidina é o nome genérico de análogos de enduracidina e inclui enduracidina A, B, Ce D. O peptídeo pode ser isolado do caldo de fermentação e micelia principalmente como uma mistura de enduracidinas A e B, que se diferem por um carbono no comprimento da cadeia lipídica ligada. Estruturalmente, as enduracidinas são distinguidas por uma porção de ácido graxo ramificado 27,4E C12 ou C13 ligada por uma ligação amida a um resíduo de ácido aspártico, e a presença de numerosos resíduos de aminoácido não proteinogênicos tais como enduracididina, 4-hidróxifenilglicina, 3,5-dicloro-4- hidróxifenilglicina, citrulina e ornitina.

[005] Enduracidina exibe potente atividade antibacteriana in vitro e in vivo contra um amplo espectro de organismos Gram-positivos, incluindo Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) e Enterococcus resistente à vancomicina (VRE). A enduracidina inibe a biossíntese da parede celular de peptidoglicano bacteriana por complexação com Lipídeo Il extracelular, um precursor para a parede celular bacteriana. O sítio de complexação de Lipídeo |! com enduracidina é distinto daquele reconhecido por vancomicina e responde pela ação de enduracidina contra organismos resistentes à vancomicina. Até o momento, não há resistência cruzada documentada de enduracidina com qualquer antibiótico clinicamente utilizado e nenhuma evidência de resistência desenvolvida, adquirida ou transferível. A ausência de qualquer forma conhecida de mecanismo de resistência transferível, a falta de biodisponibilidade oral, sua baixa toxicidade, e atividade antibacteriana significativa para Clostridium spp. fizeram enduracidina um antibiótico chave para controlar enterite clostridial em aves.

[006] Consequentemente quando administrada em rações para aves, a enduracidina inibe o crescimento das bactérias que causam enterite necrótica e depressão do crescimento em aves. A enduracidina também possui um período de retirada de tempo zero. Além disso, a enduracidina é estável em rações e pílulas, pode ser administrada a frangos em uma dose muito baixa, e resulta em nenhum resíduo encontrado na carne e ovos dos frangos tratados.

[007] Ao longo dos anos, foram obtidas várias cepas de Streptomyces fungicidicus que foram modificadas para melhorar a eficiência destes micro- organismos “produtores de enduracidinay por exemplo, Streptomyces fungicidicus B-5477 (IFO-12439, ATCC-21013) e Streptomyces fungicidicus B-

5477-m (1IFO-12440, ATCC-21014) [ver, por exemplo, U.S. 3,577,530, U.S. 3,786,142 e U.S. 4,465,771], Entretanto, permanece uma necessidade significativa de melhorar ainda mais tais isolados de Streptomyces fungicidicus modificados para criar micro-organismos produtores de enduracidina ainda mais eficientes.

[008] A citação de qualquer referência na presente invenção não deve ser interpretada como uma admissão de que tal referência está disponível como “técnica anterior” para a aplicação imediata.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009] Consequentemente, a presente invenção fornece novos isolados de Streptomyces fungicidicus modificados que produzem mais eficientemente enduracidina. Em certas modalidades, o isolado de Streptomyces fungicidicus modificado codifica uma ou mais, ou todos das seguintes: uma Orf2798 que possui 95 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, e que retém um resíduo de serina na posição 2 de aminoácido; uma Orf3866 que possui 95 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, e que retém um resíduo de treonina na posição 124 de aminoácido; uma Orf5175 que possui 95 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, e que retém um resíduo de serina na posição 91 de aminoácido; e uma Orf5387 que possui 95 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, e que retém um resíduo de serina na posição 164 de aminoácido. Em certas modalidades, o isolado de Streptomyces fungicidicus modificado: (i) compreende um ácido nucleico que codifica uma Orf4755 compreendendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 9, no lugar da sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 23; e/ou (ii) falta uma proteína Orf682 funcional; e/ou (iii) falta uma proteína Orf4868 funcional. Em modalidades particulares deste tipo, a falta de uma proteína

Orf682 funcional e/ou a falta de uma proteína Orf4868 funcional é devido a uma mutação frame-shift em um gene que codifica a proteína Orf682 e/ou a proteína Orf4868.

[010] Em modalidades particulares, o isolado de Streptomyces fungicidicus modificado codifica uma ou mais, ou todos das seguintes: uma Orf2798 que possui 98 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, e que retém um resíduo de serina na posição 2 de aminoácido; uma Orf3866 que possui 98 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 e que retém um resíduo de treonina na posição 124 de aminoácido; uma Orf5175 que possui 98 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, e que retém um resíduo de serina na posição 91 de aminoácido; e uma Orf5387 que possui 98 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, e que retém um resíduo de serina na posição 164 de aminoácido. Em certas modalidades, o isolado de Streptomyces fungicidicus modificado: (i) compreende um ácido nucleico que codifica uma Orf4755 compreendendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 9, no lugar da sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 23; e/ou (ii) falta uma proteína Orf682 funcional; e/ou (iii) falta uma proteína Orf4868 funcional. Em modalidades particulares deste tipo, a falta de uma proteína Orf682 funcional e/ou a falta de uma proteína Orf4868 funcional é devido a uma mutação frame-shift em um gene que codifica a proteína Orf682 e/ou a proteína Orf4868.

[011] Em ainda outras modalidades, o isolado de Streptomyces fungicidicus modificado codifica uma ou mais, ou todos das seguintes: uma Orf2798 que possui 99 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, e que retém um resíduo de serina na posição 2 de aminoácido; uma Orf3866 que possui 99 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, e que retém um resíduo de treonina na posição 124 de aminoácido; uma Orf5175 que possui 99 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, e que retém um resíduo de serina na posição 91 de aminoácido; e uma Orf5387 que possui 99 % ou mais de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8, e que retém um resíduo de serina na posição 164 de aminoácido. Em certas modalidades, o isolado de Streptomyces fungicidicus modificado: (i) compreende um ácido nucleico que codifica uma Orf4755 compreendendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 9, no lugar da sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 23; e/ou (ii) falta uma proteína Orf682 funcional; e/ou (iii) falta uma proteína Orf4868 funcional. Em modalidades particulares deste tipo, a falta de uma proteína Orf682 funcional e/ou a falta de uma proteína Orf4868 funcional é devido a uma mutação frame-shift em um gene que codifica a proteína Orf682 e/ou a proteína Orf4868.

[012] Em ainda outras modalidades, o isolado de Streptomyces fungicidicus modificado codifica uma ou mais, ou todos das seguintes: uma Orf2798 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, uma Orf3866 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, uma Orf5175 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6, e uma Orf5387 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8. Em certas modalidades, o isolado de Streptomyces fungicidicus modificado: (i) compreende um ácido nucleico que codifica uma Orf4755 compreendendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 9, no lugar da sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 23; e/ou (ii) falta uma proteína Orf682 funcional; e/ou (iii) falta uma proteína Orf4868 funcional. Em modalidades particulares deste tipo, a falta de uma proteína Orf682 funcional e/ou a falta de uma proteína Orf4868 funcional é devido a uma mutação frame-shift em um gene que codifica a proteína Orf682 e/ou a proteína Orf4868.

[013] Em modalidades relacionadas, o Streptomyces fungicidicus modificado: (i) compreende um ácido nucleico que codifica uma Orf4755 compreendendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 9, no lugar da sequência de nucleotídeos da SEQID NO: 23; e/ou (ii) falta uma proteína Orf682 funcional; e/ou (iii) falta uma proteína Orf4868 funcional. Em modalidades particulares deste tipo, a falta de uma proteína Orf682 funcional e/ou a falta de uma proteína Orf4868 funcional é devido a uma mutação frame-shift em um gene que codifica a proteína Orf682 e/ou a proteína Orf4868.

[014] Em modalidades específicas, o isolado de Streptomyces fungicidicus modificado compreende as características imunogênicas e/ou físicas e/ou genéticas de um isolado de Streptomyces fungicidicus modificado tendo o número de depósito ATCC PTA-122342. Em mais modalidades específicas, o Streptomyces fungicidicus modificado é um isolado tendo o número de depósito ATCC PTA-122342 ou uma progênie de e/ou derivado do isolado tendo o número de depósito ATCC PTA-122342. Em um aspecto relacionado, todos os Streptomyces fungicidicus modificados da presente invenção também são fornecidos como isolados de Streptomyces fungicidicus modificados isolados.

[015] Conjuntos de iniciadores tendo as sequências de nucleotídeos de: SEQ ID NOs: 29 e 30; SEQ ID NOs: 31 e 32; SEQ ID NOs: 33 e 34; SEQ ID NOs: 35 e 36; SEQID NOs: 37 e 38; SEQ ID NOs: 39 e 40; SEQ ID NOs: 41 e 42; SEQID NOs: 43 e 44; SEQ ID NOs: 45 e 46; SEQ ID NOs: 47 e 48; SEQ ID NOs: 49 e 50; e/ou qualquer combinação das mesmas, também são incluídos na presente invenção. Além disso, os kits compreendendo um ou mais de tais conjuntos de iniciadores também são parte da presente invenção. Além disso, a utilização destes iniciadores em um ensaio para identificar um genoma de Streptomyces fungicidicus da presente invenção também é incluída na presente invenção.

[016] Estes e outros aspectos da presente invenção serão melhores avaliados com referência à Figura, Descrição Detalhada e Exemplos.

BREVE DESCRIÇÃO DA FIGURA

[017] A FIG. 1 representa o local de 11 polimorfismos no genoma de S. fungicidicus BM38 utilizados como marcadores de mutação para a triagem com base em PCR descrita nos exemplos abaixo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[018] O desenvolvimento de metabólitos secundários bacterianos, ou produtos naturais, para aplicações comerciais, tais como medicina humana ou aplicações agrícolas, apresenta desafios tais como superar os baixos rendimentos do composto desejado do organismo precursor/tipo selvagem. Avanços em nossa compreensão de biossíntese de produto de natural nas últimas décadas têm revelado que a produção de metabólitos secundários pode ser regulada e controlada de várias maneiras. Na maioria dos casos, os genes para biossíntese de produto de natural bacteriano, incluindo os genes responsáveis pela formação de precursores, montagem estrutural, modificação pós-montagem, auto resistência e regulação, são agrupados em conjunto no cromossoma bacteriano. A biossíntese de produtos naturais pode ser desencadeada por moléculas de sinalização extracelular e intracelular que interagem com reguladores específicos da via ou reguladores pleiotrópicos que controlam a produção de mais de um produto. As mutações que ocorrem em qualquer um destes genes ou sistemas reguladores pode aumentar, diminuir, ou abolir a produção de antibiótico.

[019] A melhoria das cepas pode desempenhar um papel na produção em escala industrial de custo eficaz de antibióticos ou outros metabólitos secundários microbianos. As cepas mutantes capazes de produzir rendimentos aumentados de metabólitos particulares podem ser geradas por meio de mutações aleatórias, por rompimento direcionado de genes específicos, ou pela introdução de gene(s) que elimina(m) as obstruções em uma via de biossíntese. A manipulação genética de genes reguladores, bem como genes biossintéticos, para gerar a hiperprodução de metabólitos secundários específicos tem provado ser uma estratégia poderosa e bem-sucedida de melhoria na cepa de actinomiceto. Em um aspecto particular da invenção, foram identificadas sequências de codificação chave de Streptomyces fungicidicus que, quando modificadas e/ou eliminadas levam a isolados que têm propriedades melhoradas para a biosintetização e/ou produção de enduracidina para propósitos comerciais.

[020] Uma sequência de DNA de 116 pares de quilobase de S. fungicidicus ATCC 21013 de tipo selvagem que abriga o cluster de genes biossintéticos de enduracidina e suas regiões flanqueadoras foi previamente relatada [US. 8,188,245, que é incorporado na presente invenção por referência em sua totalidade] e está disponível no GenBank [Nº de acesso DO403252], como indicado abaixo, a sequência de genoma total de BM38-2 (ATCC Nº PTA-122342) foi determinada e comparada com o genoma de tipo selvagem. Esta análise comparativa permitiu a identificação de pelo menos 77 polimorfismos ou diferenças mutacionais entre os genomas, e a seleção de sete (7) estruturas de leitura abertas chave que se relacionam com as propriedades melhoradas de ATCC Nº PTA-122342, como mostrado abaixo. Inesperadamente, entretanto, nenhuma destas sete estruturas de leitura abertas chave estão associados com o cluster de genes biossintéticos de enduracidina e suas regiões flanqueadoras do cromossoma de S. fungicidicus. Inesperadamente, entretanto, a modificação destas sete estruturas de leitura abertas chave permite a fácil construção de novos isolados de Streptomyces fungicidicus modificados por tecnologia recombinante padrão que têm propriedades comparáveis ou mesmo superiores aos isolados relatados anteriormente.

[021] A utilização de termos singulares por conveniência na descrição não é de forma alguma intencionada a ser limitante. Assim, por exemplo, a referência a um “isolado” inclui a referência a um ou mais de tais isolados, a menos que de outro modo especificado. A utilização de termos plurais também não está intencionada a ser limitante, a menos que de outro modo especificado.

[022] Como utilizado na presente invenção, o termo “aproximadamente” é utilizado permutavelmente com o termo “cerca de” e geralmente significa que um valor está dentro de vinte e cinco por cento do valor indicado, a menos que de outro modo indicado, por exemplo, “cerca de” um aumento de 4 vezes na produção de enduracidina pode ser um aumento de 3 a 5 vezes.

[023] Como utilizado na presente invenção, uma sequência de aminoácidos é 100 % “idêntica” a uma segunda sequência de aminoácidos quando os resíduos de aminoácidos de ambas as sequências são idênticos. Consequentemente, uma sequência de aminoácidos é 50 % “idêntica” a uma segunda sequência de aminoácidos quando 50 % dos resíduos de aminoácidos das duas sequências de aminoácidos são idênticos. A comparação de sequências é realizada sobre um bloco contínuo de resíduos de aminoácidos compreendido por uma dada proteína, por exemplo, uma proteína ou uma porção do polipeptídeo que está sendo comparado. Em uma modalidade particular, eliminações ou inserções selecionadas que podem de outro modo alterar a correspondência entre as duas sequências de aminoácidos são consideradas.

[024] Como utilizado na presente invenção, a identidade percentual de sequências de nucleotídeos e aminoácidos pode ser determinada utilizando C, MacVector (MacVector, Inc. Cary, NC 27519), Vector NTI (Informax, Inc. MD), Oxford Molecular Group PLC (1996) e o algoritmo Clustal W com os parâmetros padrão de alinhamento e parâmetros padrão para identidade. Estes programas comercialmente disponíveis também podem ser utilizados para determinar similaridade de sequência utilizando os mesmos parâmetros padrão ou análogos. Alternativamente, uma pesquisa do Advanced Blast sob as condições de filtro padrão pode ser utilizada, por exemplo, utilizando o programa de pileup GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Versão 7, Madison, Wisconsin) utilizando os parâmetros padrão.

[025] Como utilizado na presente invenção, um organismo que compreende um polipeptídeo “que carece de um funcional” ou polipeptídeo “que falta um funcional” (por exemplo, um Orf682) é um organismo que não expressa este polipeptídeo e/ou expressa um polipeptídeo modificado que possui no máximo 10 % da função biológica natural do polipeptídeo de tipo selvagem correspondente, por exemplo, uma enzima truncada que possui uma atividade enzimática (por exemplo, eficiência enzimática, isto é, Vnnax/Km) para seu substrato natural que é no máximo 10 % daquela determinada para a enzima de tipo selvagem correspondente sob as mesmas condições de ensaio padrão. Em modalidades particulares, um polipeptídeo “que carece de um funcional” em um organismo é equivalente à ausência da função biológica específica daquele polipeptídeo.

[026] Como utilizado na presente invenção, uma estrutura de leitura aberta que foi “anulada” foi modificada por, por exemplo, uma deleção in-frame, mudança na estrutura de leitura, inserção e/ou mutação pontual, de tal modo que um organismo que compreende uma estrutura de leitura aberta que foi “anulada” não expressa o polipeptídeo codificado pela uma estrutura de leitura aberta de tipo selvagem correspondente no todo e/ou expressa um polipeptídeo modificado que possui no máximo 10 % da função biológica natural do polipeptídeo de tipo selvagem correspondente. Em modalidades particulares, existe uma ausência da função biológica específica do polipeptídeo codificado pela uma estrutura de leitura aberta de tipo selvagem correspondente em um organismo que compreende uma estrutura de leitura aberta que foi “anulada”.

[027] Como utilizado na presente invenção, um “cluster de genes” é um conjunto de elementos genéticos agrupados em conjunto no cromossoma, cujos produtos de proteína têm uma função relacionada, tal como a formação de uma via biossintética de produto natural.

[028] Uma substituição conservadora é uma substituição de aminoácido que geralmente não altera substancialmente a atividade (especificidade ou afinidade de ligação) da molécula. As substituições de aminoácidos tipicamente conservadoras envolvem substituições de um aminoácido por outro aminoácido com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga Ou hidrofobicidade). A seguinte tabela mostra exemplos de substituições de aminoácidos conservadoras: Resíduo Substituições Resíduo Original Substituições Preparação de Streptomyces fungicidicus modificado

[029] Os métodos e materiais adequados para a prática das modalidades divulgadas são descritos abaixo. Além disso, qualquer técnica ou método apropriado bem conhecido do técnico no assunto pode ser utilizado no desempenho das modalidades divulgadas. Alguns métodos e técnicas convencionais aplicáveis à presente divulgação são descritos, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2º ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3º ed., Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel et al., Current Protocols em Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (e Suplements to 2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4º ed., Wiley & Sons, 1999; Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990; Harlow e Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999; e Kieser, T., Bibb, M.J., Buttner, M.J., Chater, K.F., e Hopwood, D.A.: Practical Streptomyces genetics, John Innes Centre, Norwich Research Park, Colney, Norwich NR4 &UH, England, 2000.

[030] Os vetores de plasmídeo de expressão de Streptomyces fungicidicus recombinantes podem ser preparados para o uso na produção dos isolados de Streptomyces fungicidicus modificados da presente invenção. Em algumas modalidades, um vetor de Streptomyces fungicidicus recombinante modificado compreende pelo menos uma estrutura de leitura aberta selecionada de Streptomyces fungicidicus. Em certas modalidades, um vetor de Streptomyces fungicidicus recombinante modificado compreende pelo menos uma estrutura de leitura aberta selecionadade Streptomyces fungicidicus expressado sob o controle de um promotor. Em outras modalidades, o promotor é um promotor constitutivo forte de Streptomyces que resulta na produção aumentada de enduracidina quando o vetor é expressado em uma cepa de Streptomyces fungicidicus. Em algumas modalidades, a estrutura de leitura aberta está operativamente ligada a um promotor heterólogo ao invés de seu próprio promotor nativo. Por exemplo, pode estar operativamente ligado a um promotor constitutivo, tal como um promotor de expressão constitutivo forte ou um promotor induzível. Em modalidades específicas, o promotor constitutivo forte é ermE*p do produtor de eritromicina, Saccharopolispora erythraea. Em outros, o promotor induzível é o promotor indutível de tiostrepton, tipA. Em ainda outras modalidades, o sistema P(nitA)-NIitR [Herai et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A., 101(39): 14031 - 14035 (2004)] ou o promotor SF14 de Streptomycete é utilizado. Em ainda outras, um promotor nativo do gene amRp resistente à apramicina é utilizado. Em ainda outras, Prras, Ptcps2o €/ou Pneos são utilizados. Em certas modalidades, o vetor recombinante modificado compreende uma estrutura de leitura aberta orf2798 compreendendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1 e/ou uma estrutura de leitura aberta rf682, que foi anulada.

[031] Consequentemente, podem ser construídas cepas recombinantes de Streptomyces fungicidicus que são capazes de produzir rendimentos aumentados de enduracidina em comparação com uma cepa de Streptomyces fungicidicus de tipo selvagem. Em certas modalidades, uma cepa de Streptomyces fungicidicus recombinante modificado compreende pelo menos uma estrutura de leitura aberta selecionada de Streptomyces fungicidicus introduzida no cromossoma e expressada sob o controle de um promotor, tal como um promotor de Streptomyces constitutivo forte, que resulta na produção aumentada de enduracidina na cepa modificada. Em outras modalidades, a expressão da estrutura de leitura aberta introduzida no Streptomyces fungicidicus é dirigida por um promotor heterólogo ao invés do seu próprio promotor nativo. Por exemplo, pode estar operativamente ligado a um promotor constitutivo, tal como um promotor de expressão constitutivo forte ou um promotor indutível. Em algumas modalidades, o promotor constitutivo forte é ermE*p. Em outras modalidades, o promotor induzível é tipA. Em alguns exemplos, o sistema P(nitA)-NitR [ver acima] ou o promotor SF14 é utilizado. Em ainda outras modalidades, o promotor de expressão constitutivo é amRp. Em ainda outras modalidades, promotores Prrasg, Ptcpa30 €/ou Pneos são utilizados.

[032] Em algumas modalidades, a cepa modificada compreende uma estrutura de leitura aberta orf3866 de Streptomyces fungicidicus. Em modalidades particulares deste tipo, a estrutura de leitura aberta orf3866 está operativamente ligada a um promotor heterólogo. Por exemplo, pode estar ligada a um promotor constitutivo forte tal como ermE*p. Em outros exemplos, a estrutura de leitura aberta orf3866 está operativamente ligado a promotor tipA, SF14, amRp, Pahrav, Ptcps30 E€/ou Pneos.

[033] Em outras modalidades, a cepa modificada codifica uma estrutura de leitura aberta alterado orf4868. A estrutura de leitura aberta orf4868 pode ser anulada por interrupção de inserção, deleção in-frame, mudança na estrutura de leitura e/ou mutação pontual. Em alguns exemplos, a estrutura de leitura aberta orf4868 é anulada por uma deleção in-frame. Em geral, qualquer deleção interna in-frame em orf4868 deve resultar em uma função anulada de orf4868 devido à sua incompletude. Em modalidades relacionadas, a cepa modificada envolve dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou mais estruturas de leitura abertas de Streptomyces fungicidicus.

[034] Em certas modalidades, o isolado de Streptomyces fungicidicus modificado é derivado de uma cepa precursora de tipo selvagem, tal como, mas não limitado a Streptomyces fungicidicus American Tissue Culture Company (ATCC) Nº 21013. Em outras modalidades, a cepa modificada de Streptomyces fungicidicus é derivada das cepas mutantes convencionais, tais como, mas não limitado a Streptomyces fungicidicus ATCC 31729, Streptomyces fungicidicus ATCC 31730 e Streptomyces fungicidicus ATCC 31731.

[035] Em certas modalidades, a produção aumentada de enduracidina é um aumento de pelo menos 1,2 vezes, tal como pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 2,5 vezes, um aumento de pelo menos 3 vezes, pelo menos 3,5 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 4,5 vezes, incluindo, mas não limitado a um aumento de 1,2 a 10 vezes, um aumento de 1,2 a 4,6 vezes e cerca de um aumento de 2 a 5 vezes na produção de enduracidina em comparação com a cepa de Streptomyces fungicidicus de tipo selvagem.

[036] Em certas modalidades, o Streptomyces fungicidicus modificado pode ser construído pela integração de um plasmídeo recombinante compreendendo pelo menos uma estrutura de leitura aberta que melhora a produção de enduracidina no cromossoma de uma cepa precursora de Streptomyces fungicidicus. O vetor conjugal integrativo pode ter, ou pode ser modificado para ter, um forte promotor de Streptomyces constitutivo. Em algumas modalidades, o plasmídeo pode faltar um replicon de estreptomiceto e pode estar integrado no cromossoma por recombinação homóloga de cruzamento único específica de sítio. Em outras modalidades, o plasmídeo pode estar presente como um plasmídeo livre. Em algumas modalidades, um vetor conjugal pode ser modificado no qual a inserção de plasmídeo carrega um gene de interesse parcialmente ou completamente suprimido, e suas regiões flanqueadoras, que podem estar integradas no cromossoma depois da recombinação homóloga de cruzamento duplo para gerar uma deleção in-frame mutante.

Produção de Enduracidina a partir de Cepas Recombinantes de Streptomyces fungicidicus

[037] As cepas recombinantes de Streptomyces fungicidicus fornecidas pela presente invenção proporcionam métodos para produzir níveis aumentados de enduracidina. Este avanço técnico na técnica permite poupar custos significativos associados à produção de enduracidina. Em certas modalidades, o método de produção de enduracidina compreende cultivar uma cepa recombinante divulgada de Streptomyces fungicidicus sob condições suficientes para produzir enduracidina. Em outras modalidades, o método compreende ainda isolar a enduracidina do meio de cultura após a cultura. Em ainda outras modalidades, o método compreende ainda determinar a atividade antibacteriana da enduracidina produzida, tal como por análise de HPLC ou bioensaio utilizando o S. aureus ATCC 29213 ou Bacillis subtilis ATCC 6633 como micro-organismos indicadores.

[038] Em algumas modalidades, enduracidina é produzida por uma cepa de Streptomyces fungicidicus divulgada utilizando condições de fermentação como previamente descrito para a produção de enduracidina [Higashide et a/., J. Antibiot. 21: 126 - 137 (1968)]. Depois da produção, os compostos podem ser purificados e/ou analisados incluindo análise de HPLC. Os métodos de produção de enduracidina e colheita deste composto a partir do meio de crescimento pode ser encontrado em U.S. 4,465,771, que é incorporado na presente invenção por referência em sua totalidade.

[039] Em modalidades particulares, um isolado de Streptomyces Ffungicidicus divulgado da presente invenção é cultivado em caldo de soja tríptica (TSB) em um agitador (tal como a 225 rpm e 30ºC por 48 horas) e então transferido para um meio de produção de enduracidina (EPM, Tabela 1 abaixo) por um período de tempo para fermentação contínua, tal como por pelo menos cinco dias e até onze dias, incluindo 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 dias de fermentação contínua. Em mais modalidades particulares, a produção de enduracidina por cepas de tipo selvagem e derivados é conduzida em fermentadores automáticos.

TABELA 1 Composição de Meio de Produção de Enduracidina (EPM) (pH 6,7)

Cu es e | 2,0 Lactose 0,5 milho oe | us TABELA 2

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID Estrutura de Tipo SEQ ID Estrutura de Tipo eo mean | e mn O | comes | memo | WT B-5477 PTA-122342 Coe De 7 | es |)

AA é uma sequência de aminoácidos; NA é uma sequência de ácidos nucleicos.

DEPÓSITO BIOLÓGICO

[040] As culturas do seguinte material biológico foram depositadas com o seguinte depositário internacional: American Type Culture Collection (ATCC) 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, U.S.A., sob condições que satisfazem os requisitos do Tratado de Budapeste.

Organismo Nº de Acesso Data de Depósito Streptomyces PTA-122342 5 de agosto de 2015 fungicidicus (BM38-2)

[041] A presente invenção pode ser melhor entendida por referência aos seguintes Exemplos não limitativos, que são fornecidos como exemplares da invenção. Os exemplos seguintes são apresentados de modo a mais completamente ilustram as modalidades preferidas da invenção. Eles não devem de modo algum ser interpretados, entretanto, como limitando o amplo escopo da invenção.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 Isolado de streptomyces fungicidicus modificado Produção de Biomassa de Streptomyces fungicidicus para o uso na Biossíntese de Enduracidina

[042] Afermentação de Streptomyces fungicidicus pode ser concluída em fermentadores industriais de projeto sanitário de tanque profundo com sistemas para monitorar e controlar o pH, temperatura, oxigênio, aeração e agitação.

Cada lote fermentado de S. fungicidicus é iniciado a partir de um estoque de sementes de trabalho caracterizado e controlado da semente de produção armazenada em um local seguro e mantida em ambiente de baixa temperatura. O processo de fermentação ocorre em três estágios, seguido por processamento adicional a jusante: Estágio |:

[043] Culturas de sementes de trabalho, contendo 10” a 10º esporos/mL podem ser utilizadas para iniciar um lote de fermentação. Um a cinco frascos de semente congelada são retirados do armazenamento de baixa temperatura e descongelados naturalmente na bancada, ou colocados em um banho de água entre 28 a 32ºC até o conteúdo ser descongelado. As culturas descongeladas são transferidas assepticamente em 800 a 1.000 mL de água estéril mantida na temperatura ambiente e misturadas suavemente para ressuspender a cultura.

Estágio |l:

[044] A cultura ressuspensa é transferida assepticamente em meio de semeadura. O meio de semeadura é composto de glicose (0,5 g/L), Dextrina (2,5 g/L), licor de milho íngreme (1,0 a 4,0 mL/L), pó de soja (3,0 g/L), sulfato de amônio (0,25 g/L), fosfato monopotássico (0,13 a 0,54 g/L), sulfato ferroso (0,00 a 0,5 g/L), hidróxido de potássio (0,13 mL/L), carbonato de cálcio precipitado (1,5 g/L), agente de formação de espuma à base de silicona (0,1 mL/L) e água, q. s. O meio é esterilizado a 125ºC por 45 minutos e depois esfriado a 28ºC. O volume de meio é ajustado utilizando água estéril para o volume de trabalho desejado. O pH é ajustado entre 6,6 a 6,8. Os parâmetros operacionais do ciclo de aumento de sementes incluem: temperatura de incubação de 28ºC + 2ºC, uma pressão interna de 0,5 a 1,5 kg/cm?, uma taxa de aeração de 2 a 4 NMm?/min, e uma taxa de agitação de aproximadamente 80 rpm, dependendo do tamanho e configuração do vaso. O pH, consumo de oxigênio e viscosidade são monitorados, mas não controlados. A cultura é cultivada por 50 a 60 horas antes da transferência para o fermentador de produção principal. A viscosidade no momento da transferência deve variar de 350 a 600 cps, e o pH deve ser <6,0, e deve haver um aumento no consumo de oxigênio. A cultura de sementes é transferida assepticamente no meio de fermentação principal para completar o ciclo de fermentação.

Estágio Ill:

[045] Acomposição do meio de fermentador de produção principal inclui: amido de milho (13,0 a 15,0 % p/v), farinha de glúten de milho (3,0 a 6,0 % p/v), farinha de semente de algodão (0,3 % p/v), licor de milho íngreme (0 a 0,6 % v/v), cloreto de sódio (0,3 % p/v), sulfato de amônio (0,25 a 0,6 % p/v), ácido láctico (0 a 0,5 % v/v), cloreto de zinco (0,01 % p/v), sulfato ferroso (0,0 a 0,02 % p/v), hidróxido de potássio (0,20 a 0,5 % v/v), sulfato de cálcio (0,0 - 0,5 % p/v), carbonato de cálcio precipitado (0,5 % p/v), alfa amilase (0,056 % p/v), hidróxido de potássio (0,05 % v/v), óleo de soja (0,5 a 2,0 % v/v), agente de formação de espuma e água, q. s. Os ingredientes são adicionados de acordo com a ordem listada. Água é adicionada aos ingredientes através de alfa amilase, então a composição resultante é aquecida a 80ºC por 15 minutos para permitir que a enzima —decomponha os carboidratos complexos. Os ingredientes remanescentes são então adicionados, o pH é ajustado ao pH 6,6 a 6,8, e a água é adicionada a q. s. Os meios são esterilizados a 125ºC por 45 minutos, esfriados a 28ºC, e a água é adicionada a q. s. ao volume de trabalho desejado.

[046] O conteúdo do fermentador de sementes é transferido para o meio de fermentação principal e o fermentador é ajustado para as seguintes condições: temperatura 28ºC, taxa de aeração 40 Nmº?/min, pressão interna 0,5 kg/cm?, e o equivalente da taxa de agitação é ajustado a cerca de 1,85 kW/m?. As condições operacionais são alteradas após duas horas do início do ciclo de fermentação para ajustar o oxigênio dissolvido a 12,75 ppm, aumentando a aeração para 50 Nmº?/min, e aumentando a pressão interna para 0,7 kg/cm?. As taxas de aeração, pressão interna e agitação são ajustadas a seguir para garantir que o oxigênio dissolvido não seja um determinante de limite de taxa. Água estéril é adicionada à cultura quando a viscosidade aumenta a um ponto em que o oxigênio dissolvido é restrito. Durante todo o ciclo, a formação de espuma é cuidadosamente controlada para evitar a contaminação ou escoamento. Aproximadamente 3 horas depois que a demanda de oxigênio aumenta, o controle do pH é iniciado. Os seguintes parâmetros são controlados e/ou monitorados ao longo do ciclo de fermentação: pH, aeração, oxigênio dissolvido, CO,, viscosidade, pureza, velocidade de agitação, pressão interna e açúcar residual. Até que o crescimento de bactérias cesse, o pH é mantido a 6,8, mas depois é permitido que ele mude naturalmente até a colheita. O ciclo de fermentação típico é de 220 a 300 horas. A cultura está pronta para se colhida quando a potência do bioensaio é superior a 5.000 ug/L, o pH sobe para pH 7,5 ou superior, a viscosidade diminuiu e a demanda de oxigênio cessa. A fermentação é colhida aquecendo-se a cultura a 70ºC por 30 minutos para inativar as bactérias, e depois os fluidos de colheita são esfriados entre 25º a 28ºC.

Processamento a jusante:

[047] Água é removida da biomassa, a biomassa seca, então formulada em pré-mistura.

EXEMPLO 2 Efeito de otimização da produção de enduracidina de streptomyces fungicidicus

[048] As melhorias de rendimento foram feitas ao longo dos anos pelos tratamentos da cepa precursora (como listado na Tabela 3). A cepa BM38-2

(PTA-122342) produz os maiores rendimentos de enduracidina.

A cepa foi otimizada tratando-se GAB-453 (ATCC 31729) utilizando uma série de tratamentos culturais e físicos.

TABELA 3: Melhoria de Rendimento de Streptomyces fungicidicus B-54577 ATCC Nº CEPA TRATAMENTO RENDIMENTO ng/mL ATCC 21013 Cepa Precursora, tipo (Previamente B-5477 730 selvagem Divulgado) ATCC 21014 (Previamente B-5477m Irradiação y Divulgado) ATCC 31729 (Previamente GAB-453 Irradiação UV 1290 Divulgado) ATCC 31730 (Previamente Emt 36-3 m-Fluoro-DL-tirosina 2560 Divulgado) ATCC 31731 N-metil-N'-nitro-N- (Previamente Emt 2-140 | nitrosoquanidina mais m- 4360 Divulgado) fluoro-DL-tirosina PTA-122342 (Não Múltiplos tratamentos Previamente BM38-2 9690 culturais e físicos Divulgado) Referência: Patente 4,465,771; 14 de abril de 1984, Nogami, et.al.

Takeda Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japão.

Referência: Patente 3,577,530, 4 de maio de 1971, para ATCC 21388.

1. ATCC 21013: cepa de Streptomyces fungicidicus selvagem Original B- 5477, depositada por Takeda

2. ATCC 21014: mutante derivado por irradiação y de B-5477, cepa designada como B-5477w, depositado por Takeda

3. ATCC 31729: mutante derivado por irradiação UV de B-5477, cepa designada como GAB-453, depositado por Takeda

4. ATCC 31730: mutante obtido desenvolvendo-se B-5477 em placas de ágar contendo m-fluoro-DL-tirosina (MFT); mutante designado como Emt-36-3, depositado por Takeda

5. ATCC 31731: mutante duplo obtido submetendo-se GAB-453 primeiro a N-metil-N'-nitro-N-nitrosoquanidina, — depois —m-fluoro-DL-tirosina — (MFT), resultando na designação de cepa mutante como Emt 2-140, depositado por Takeda

6. ATCC 21388: cepa intimamente relacionada a Streptomyces fungicidicus (S. macrosporeus), depositada por Squibb e Sons.

[049] Em termos de biossíntese de enramicina mais alta a mais baixa: ATCC Nº PTA-122342>ATCC 31731>ATCC 31730>ATCC 31729>ATCC 21013 e ATCC 21014.

[050] Notavelmente, há um aumento maior que duas vezes de enduracidina obtida quando o ATCC PTA-122342 é comparado ao segundo isolado mais produtivo e um aumento maior que 12 vezes de enduracidina obtida quando o ATCC PTA-122342 é comparado à Cepa Precursora, tipo selvagem.

EXEMPLO 3 Análise genômica de isolados de streptomyces fungicidicus

[051] Uma análise genômica comparativa foi realizada entre a cepa de tipo selvagem de Streptomyces fungicidicus, ATCC 21013 (B-5477) e uma cepa derivada da presente invenção, BM38-2, que incluiu as regiões em torno do cluster de genes da biossíntese de enduracidina (enramicina).

[052] Um total de 77 variações de sequência de DNA foram identificadas diferenciando o efeito de manipulações físicas e culturais da cepa precursora B-

5477. A informação obtida a partir da análise do genoma permitiu a comparação rápida e definitiva da cepa selecionando-se 11 variações representativas localizadas ao longo do genoma de BM38-2 como marcadores de mutação (ver, Figura 1). Os iniciadores de PCR foram projetados para cada um dos marcadores de mutação que amplificariam os fragmentos de DNA contendo os locais de mutação para subsequente sequenciação e comparação (ver, Tabela 4).

[053] Os iniciadores de PCR que alvejam as regiões marcadoras foram utilizados para analisar cinco (5) cepas produtoras de enramicina mais uma (1) cepa intimamente relacionada disponível através de ATCC incluindo tipo selvagem e mutantes depositados por Takeda, e comparados à cepa BM38-2. A Tabela 5 resume os achados e mostra a assinatura de DNA nos 11 marcadores mutacionais.

TABELA 4 Conjuntos de iniciadores de PCR (com SEQ ID NOS: correspondentes) utilizados para amplificar 11 marcadores de mutação localizados no genoma BM38 de S. fungicidicus Nº do | SE | Sequênci | Sequênci | Iniciador SEQ de Iniciador Tamanh Marc. | Q | ade WT' a de o de de ID BM38-2 Prod.” Muta. | NO: (bp) "

GGACGATGCCATCAAAAC rs e

ACTGCTTGATCACCGAGG TG

CTGTTCAACCTGACCGGG 2 31 AC TT 954

AA GAAGACCACGACCTCGAT GG

GGGCAGGAGTTCTTGAGG 3 G A 864

AC CCACGTCAAGAACCTGGT GA

GGCAAGTCGACCCTCATC 35 GA AT 428

AA ATGACCGAGAACAGCGTC TC

CGCATCTGTTCCAGGCAA 37 A G 459

TG TCATCGTGGCGCATAGGT AC

TGTGGGGATGTCCTTCGG 39 G A 173

AA CGACGATGCCAAGAGACT GT

GGACGATGCCATCAAAAC 7 AGGGCG | CGGGCC SF7F 685 ce

ACTGCTTGATCACCGAGG SF7R

TG

TGCTGCTGTCGATCATGG AT GA 686

AG AGGAAGGGCTGGTAGGTC AT

CGAGTCCGAAGCAGAAGG 45 G Cc 745

AG LE a mm]

o 47 Cc T SF10F 976

AG SF10R

TC 11 | 49 Cc T SF11F 1000

GA ACTGCTTGATCACCGAGG

TG *Nº do Marcador de Mutação, “Tamanho do Produto de PCR Esperado *Cepa de tipo selvagem (WT): ATCC 21013 TABELA 5A Análise do marcador de mutação de cepas de Streptomyces fungicidicus depositadas comparadas a ATCC Nº PTA-122342 Nº do Precursor B- ATCC | ATCC | ATCC | ATCC | PTA- Marcador | de B-5477 | 5477m |21388* | 31729 | 31730 | 31731 [122342 de de ATCC de Mutação 21013 ATCC 21014 rom jo wo ww || mm | apo wo MW MM qr povo jm ww ww fr | me spo jo wo mM MM mM os povo ww ww a | mM | mM rp jo wo ww | tm ço om ja ww ww ||

GET E E O GT Ts ee | WT = corresponde ao Precursor de tipo selvagem. M = corresponde à sequência de mutação de PTA-122342 *Cepa de S. macrosporeus intimamente relacionada a S. fungicidicus TABELA 5B Mutações compartilhadas com BM38-2 ou utilizadas como marcadores para comparação de PCR Nº do 21013 | 31729 | 31730 | 31731 | BM38-2 Nº do Nucleotídeo Marcador de Mutação sssees | wr | m | wo a | mM | a seas pm jm mM mm | as vw as

TFT TF TT TT TA Ga PT 3 Ge Tr Dr Gs TT Gees Ta Tr Gases Ta De a ar e Gs e rw | Gs e TT TT css Tv TWT NT Gs vw rr Ge rr Gs vw rr Gs Gs cv rr o se Tv o ss rr ss vw Ga Tv ss cv rr e cv rr o ss E E o o ss rr GE cv rr Fa TF as Tv ss ess cv rr ss TF —— Gs rr o o Gs vo o Ge vm o o o Gs O O Gm vw rr es vw sr we Te TE Ge ss [vw

GR RR WT = corresponde ao Precursor tipo selvagem. M = corresponde à sequência de mutação de PTA-122342

[054] As Tabelas 5A-5B identificam diferenças genéticas entre a cepa precursora (B-5477 de ATCC 21013) e cepas relatadas anteriormente. A maioria destas cepas relatadas anteriormente são cepas derivadas de B-5477 de ATCC 21013 que foram obtidas através de manipulações culturais e/ou físicas. As diferenças genéticas mais dramáticas foram encontradas para BM38-2 (ATCC Nº PTA-122342). Como é evidente, os iniciadores da Tabela 4 também podem ser utilizados para identificar inequivocamente BM38-2 (PTA-122342) de outras cepas de Streptomyces fungicidicus e/ou espécie de Streptomyces intimamente relacionada.

EXEMPLO 4 Análise de mutações selecionadas em BM38-2 de Streptomyces fungicidicus

[055] A cepa industrial de S. fungicidicus ATCC Nº PTA-122342 foi desenvolvida através de rodadas repetidas de mutagênese seguidas por seleção de mutantes produtores de enramicina alta. Para obter uma visão em mutações introduzidas em ATCC Nº PTA-122342 que podem contribuir aos rendimentos elevados de enramicina, a sequência de genoma total de ATCC Nº PTA-122342 foi determinada e comparada com a da antecessora de S. fungicidicus de tipo selvagem. Esta análise comparativa identificou pelo menos 77 polimorfismos, ou diferenças mutacionais, entre os dois genomas. Surpreendentemente, apenas uma diferença foi detectada na região do cromossomo que abriga o cluster de genes da biossíntese de enramicina. Esta diferença foi uma única mudança de nucleotídeo no gene endC. A mutação de nucleotídeo 6.260.317 de um Ca T no gene endC, resulta na mudança de um códon CTC para um códon CTT, uma mutação silenciosa na medida em que ambos são códons para leucina. Portanto, é improvável que esta mutação desempenhe um papel significativo no aumento observado no rendimento de enramicina em BM38-2. A ausência de outras mutações dentro do cluster de genes de enramicina indica que as alterações cromossômicas responsáveis para o aumento no rendimento de enramicina em BM38-2 podem residir em elementos reguladores pleiotrópicos (não específico de via) ou genes reguladores globais localizados em outras partes do genoma.

[056] Vários reguladores de resposta em actinomicetos mostraram afetar a biossíntese de produto natural em mais de uma via. Um exemplo chave é o loco absAIA2, encontrado no cluster do gene CDA de 5. coelicolor, que codifica um sistema de transdução de sinal de dois componentes similar àquele encontrado no cluster do gene da biossíntese de enramicina de S. fungicidicus. À forma fosforilada de AbsA2 mostrou-se inibir a produção de antibiótico ao interferir diretamente com a expressão de reguladores específicos da via dos clusters do gene biossintético de CDA, actinorhodina e undecilprodigiosina. As mutações que inibe a atividade de cinase de AbsA2 realçando a produção de antibiótico. Um outro exemplo de regulação pleiotrópica é encontrado em S. clavuligerus, onde ccaR, um gene encontrado dentro do cluster de cefamicina C, codifica uma proteína reguladora que controla a produção de cefamicina C e ácido clavulânico.

[057] As mutações no genoma de ATCC Nº PTA-122342 que pode ter a maior probabilidade de estar relacionado a aumentos no rendimento de enramicinas podem ser aquelas que ocorrem nos genes previstos pela análise bioinformática para codificar produtos reguladores, incluindo aqueles que podem ter propriedades reguladoras pleiotrópicas. Os exemplos de genes reguladores putativos identificados no genoma BM38-2 de S. fungicidicus que têm diferenças mutacionais comparadas à cepa de S. fungicidicus de tipo selvagem são fornecidos abaixo. [As diferenças de mutação em cada um dos exemplos seguintes são destacadas por um asterisco ausente e os nucleotídeos diferentes/ausentes/inseridos estão em negrito.]

COMPARAÇÕES DE SEQUÊNCIAS

[058] orf682: previsto codificar uma proteína reguladora na família TetR contendo um domínio de ligação ao DNA de hélice-volta-hélice (HTH). Um G adicional é inserido em uma sequência homopolimérica induzindo um deslocamento de estrutura. BM38.2 682 GTGGTGTCACTGACTGACAAGATGTCGGCGAACGCCATTTCGGATGTGTGGACGEGCEGEC WT 682 GTGGTGTCACTGACTGACAAGATGTCGGCGAACGCCATTTCGGATGTGTGGACGGCEGGECC

SESCIOERIOSIEIIEIOIOESOIOEIEIOESOOEIEIOOEISIOSESIOEIEIOEICIOECIORIEOEEICIOEIEACIOX BM38.2 682 GGACGGCGGCCCCTCGTTATGCTGCEGEGECGEGECCAGAGGACGGGGACGGTEGAGCGAG WT 682 GGACGGCGGCCCCTCGTTATGCTECEGEGEGE-GECAGAGGACGEGEGACEGTEGAGCGAG

AAXKAXARAENKAARAA RARA RARANAA RARA EXAAAXARAXARXAAA ARA AAAR AAA BM38.2 682 CGTGCGCCAGACGCCGGTTGAGGCACTECEGCAGEGEACGACEGEGECCEGEGECCTETC WT 682 CGTGCGCCAGACGCCGGTTGAGGCACTGCGGCAGEGGACGACGEGGGGCCGGEGECCTETC

SESEIOROEIIOIENIOEIEOOESOIOKIOGOEIOOOEROOKIGIOOESXOOEIEO RICO RACIORIECREICIOK ACID BM38.2 682 CCTCGTCGAGCGCCGCAAGGCGGCACTGCGCTTCGAGATCGCCTGCGCGGCGGTGCACTT WT 682 CCTCGTCGAGCGCCGCAAGGCEGCACTGCGCTTCGAGATCGCCTGCGCEGCEGTECACTT

NAXKAXARE NARA AAA A KARA NARA AAA KARA XARXARAXAAAAAKXARA AR RARERAARA BM38. 2 682 GTTCACCTCGCAGGGGGTCGCCGCCACGACGGGCGAACAGATCGCGCAGTCCGTGGGGAT WT 682 GTTCACCTCGCAGGGGGTCGCCGCCACGACGGGCGAACAGATCGCGCAGTCCGTGGGGAT

AAXKAXARANKAEA KRA NARA RAEX AAA KAKA RKAEXARARAKARAENARA REA AREA RARA BM38.2 682 CTCCTCCCGCACCCTGTGGCEGCCATTTCCCCACGAAGGAGAGCTGCGTCCTTCCCCTGCT WT 682 CTCCTCCCGCACCCTGTGGCGCCATTTCCCCACGAAGGAGAGCTGCGTCCTTCCCCTGCT

SEIERORORERROKIENEROESENOROEIOIOKIEIOROESECROESOOIGIOOESOIOEIEROICIO IGOR ICE ECO BM38. 2 682 GACGGCGGCGCTCGACTTCGCCGTGGACCGCCTGCGTCACTGGCCGGCGGAGACGAGCCOT WT 682 GACGGCGGCGCTCGACTTCGCCGTGGACCGCCTGCETCACTGGCCEGCEGAGACGAGCCT

AAXKAXARE NANA ARA KARA NARA AAA RARA XARXARA RARA RAE NARA XRRA RARA ARA BM38.2 682 GCTGGACTTCTTCGCCGAGACCTGCCGCAAGGEGTGACCTGCCCGCCECCACCCCGGAGAT WT 682 GCTGGACTTCTTCGCCGAGACCTGCCGCAAGGGTGACCTGCCCGCCGCCACCCCGGAGAT

RACK ICORIECROEIERROEROOK IRES REI OGRO ESCOAR CIO IEICIOR SECRI BM38.2 682 CCTCGACCTGATCCGCATGACCTCCACCGAACCGGCCCTGCGCEGCCETETEGCTCCAGEC WT 682 CCTCGACCTGATCCGCATGACCTCCACCGAACCGGCCCTGCGCGCCGETETGGCTCCAGEC

AXAXAAAAARANANER KARA NANA NAN AA AAA KANE ARA NA NEAR ARA AA AAA AAATAA BM38.2 682 CCACGACGACGCGCTTCCCGTCCTCEGCEGECTTCTCGCECEGCECTCCEGCECCGATGC WT 682 CCACGACGACGCGCTTCCCGTCCTCGEGCGGEGCTTCTCGCGCGEGCGCTCCGEGCGCCGATGC

SEXEROROEIEIORIENEROEIENOROEIOIOKIEIOROEIEIOROEIOOIGIOOESCGIOEIEIOEOIGIOOEICIOEIEICEICIO ICI BM38.2 682 CGGCGACCTGAGGGTGACGGTGCACGCGGCGACECTEGAACGEGCGCCCTEGCGEGGCEGCEST WT 682 CGGCGACCTGAGGGTGACGGTGCACGCEGCEACGCTEAACGGCECCCTGCEGECEGCEST - fe de sl de sl ko sl sde sk de skol skol ol loko ko deooko look ko ko ko ok ok ok loko loko ok oo ko ooo BM38. 26 82 GGAGGACTTCGCCCGGCGEGETACECEGACCGEGCCEGACGCCGCEGACGCCGAACTCGCCEG WT 682 GGAGGACTTCGCCCGGCEGTACGCGGACCGEGCCGGACECCGCEGACGCCGAACTCGCCCG

AAXKAXARA NARA RARA KARA NARA AAA RARA XARXARA RARA RAE NARA REA AREAL BM38.2 682 CTGTCTCGACGCCGCCCTECECECEGCCTCGGAGGGACTCCCCTACTGA [SEQ ID NO: 11) WT 682 CTGTCTCGACGCCGCCCTGCECECEGCCTCGGAGGGACTCCCCTACTGA [SEQ ID NO: 25]

RAKXKKAKKA NARA RAR AKAKAXKEA KRA KAKA RARA KRA RARA KARA KAA >WT 682 produto de gene traduzido

WSLTDKMSANAISDVWTAGGRRPLVMLRGGAEDGDGGASVRQOTPVEALROGTTGAGGLSLVERRKAALRFEIACA AVHLFTSQGVAATTGEQIAQÇQSVGISSRTLWRHFPTKESCVLPLLTAALDFAVDRLREWPAETSLLDFFAETCRKG

DLPAATPEILDLIRMTSTEPALRAVWLOAHDDALPVLGGLLARRSGADAGDLRVTVEHAATLNGALRAAVEDFARR YADRPDAADAELARCLDAALRAASEGLPY [SEQ ID NO: 26] >BM38.2 682 produto de gene traduzido WSLTDKMSANAISDVWTAGGRRPLVMLRGGGRGRGRWSERAPDAG [SEQ ID NO: 12]

[059] orf2798: previsto codificar um regulador de transcrição de ligação ao DNA na família MurR/RpiR. Contém domínios de hélice-volta-hélice (HTH) e isomerase de açúcar (SIS). Uma mutação G para A resulta na mudança de um Gly para um Ser. BM38.2 2798 ATGAGCGGCACCGGGAGCCCTGCEGCECECCTECAGECGCTCTTCGAGGGGCATCGGCTG WT 2798 ATGGGCGGCACCGGGAGCCCTGCGGCECECCTECAGGCGCTCTTCGAGGEGGCATCGEGCTGE - AAA ERRAR ERRA AAA AIR AIRE A AAA AAA AAA AAA AAA RARA AA AAA AAA AAA RARA AA AAA BM38. 22 798 ACGCCGACCCAGCGGCGCATCGCGCACAGCATGGTCCGGCGCGCCGCCGACGTGCCGTTC WT 2798 ACGCCGACCCAGCGGCGCATCGCGCACAGCATGGTCCGGCECECCECCGACGTGCCGTTC

AAXKAXARAENKRA RARA NARA RARA AAA RARA KARA AAA RARA KARA RAE RARA AREA RARA BM38.2 2798 CTGTCCAGCGTGGAGCTGGCCGAGCTEGCCEGEGTCAGCCAGCCGTCGETEACCCGGTTC WT 2798 CTGTCCAGCGTGGAGCTGGCCGAGCTGGCCEGEGTCAGCCAGCCGTCGGTGACCCGETTC - Ge sd sl ole sl cl sl ke ole ok ole skol sl ole sl cl ol ko olk ole ok ole ok le ok fe ok koto ok ole ok le ok fe ok look loko lolol le lo o ooo ole lodo ko o lool BM38. 22 798 GCCGTCGCCCTCGGCTTCGACGGCTATCCGGCGCTGCGCCGGCACCTGCGCGAGETCGECG WT 2798 GCCGTCGCCCTCGGCTTCGACGGCTATCCGGCECTEGCECCEGCACCTGCGECGEAGETCECGS - RARA AR AREA ARA RARA AAA RARA RA AAA AA RARA AAA RARA AA AA AAA RARA RARA AA ARA BM38.2 2798 CCCGCCGAACCGEGCECCEGAGACCGGCTCCTCCAACGAGTACCAGCAGGCCGTCGAGECC

WT 2798 CCCGCCGAACCGGCGCCGGAGACCGGCTCCTCCAACGAGTACCAGCAGGCCGTCGAGGCC JEkRERORORIERORCIOROR ERON RO OE ORE EO IEROR EOROESREE E ROO OE RECORRER GET OE BM38.2 2798 GAGATCGAGAACCTGCGGCATCTGGCGGAGGTGCTGEGCCEGACCCCCGGCCEGTECEGCAGS WT 2798 GAGATCGAGAACCTGCGGCATCTGGCEGAGETECTGGCCEACCCCCGECCEGTECEGCAG

ROXO IO ROCK IERORIECRORCIE RO RONCO SOR RORCKOEIOR RICROROIEROE IEROROERO RECORRE RICCI BM38.2 2798 GCCEGGECECATGCTEGCEGEGAGCCEGCCGECTECCCETECTEGEACTECEGECEGCESCS WT 2798 GCCGGECECATGCTEGCEGEGAGCCEGCCECTECCCETECTEGEACTECEGECEGCEGCE

AREA ERROR EE EO OE SEE OROE E OE GEORGE EO EEE E ROROEREE OE RECORRER OEA OE BM38.2 2798 GCCCAGGCGCACGGCTTCGCEGTACTTCGCCGCCAAGGTCCATCCCGACGTACGGCTGCTC WT 2798 GCCCAGGCGCACGGCTTCGCETACTTCGCCGCCAAGGTCCATCCCGACGTACGGCTGCTC

ERORERORORSENORIOROROIESROROIEROROESRENORROROESJENORCIOROR IES SEROROESOESESOR ERROR SERIO SECCO BM38.2 2798 AACGAGGGCGGCACCATGCTCCACGACCGGATCGACGCCGCCGCECEGECCEGEGCSGAGE WT 2798 AACGAGGGCGGCACCATGCTCCACGACCGGATCGACGCCECCECECEGECCEGEGCGAGE

AAAAAAARA ARA AAA A AAA ARA RA RARA ARA AAA AAA ARA AAA AAA ARA AAA AAA AAA BM38.2 2798 GCCCTGCTGTGCTTCGCGCTECCCCGCCATCCCCGGGAGGTCGTCGACGCCCTCATCCAC WT 2798 GCCCTGCTGTGCTTCGCEGCTECCCCGCCATCCCCGGGAGGTCGTCGACGCCCTCATCCAC

AREA IERRACROR AEREAS ERROR E EEE EO EO EEE EO OE ER OE RECO EI OE EO EGOR OE BM38.2 2798 GCCAAGGAGACGGGGCTGACCGETGEGTCACCGTCGCCGACTCGCCGTTCECECCEGTCECC WT 2798 GCCAAGGAGACGGGGCTGACCGTGGTCACCGTCGCCGACTCGCCGTTCGCGCCEGTCGCC

HORROR JENORCIOROR ERR IE IEROR EROROEAOR RICO IEROIERORIERO EXCETO BM38.2 2798 GGGCTGTCCGACCTGCTGCTECCCECEGCCETCGGGACCGGCCTCGCCTTCGACACGEGCGS WT 2798 GGGCTGTCCGACCTGCTGCTECCCGCEGCCETCEGGACCGGCCTCGCCTTCGACACGEGCG

AAA KARA AIR AA KAA AA R AAA ARRAIAL AR RAAA AR RAARAA RAR AAA RA BM38.2 2798 TGCGCGCCGATGCTGCTGGECCEGETGCTECTGGAGECGATGTGCGACGACCTGCCCGAC WT 2798 TGCGCGCCGATGCTGCTGGGCCGEGETGCTGCTGGAGGCGATGTGCGACGACCTGCCCGAC JARRA IEkORCIROROIERORCESAOROESREOEOROR SEO OE OR IES EROR EEE REOKOEREROE SEO IEEE EO OE OE BM38.2 2798 GCGCAGGCACGGCTGGAGGAGTTCGACGTGAGGGCEGCEGCECECEGACTGTTCGTGGAC WT 2798 GCGCAGGCACGGCTGGAGGAGTTCGACGTGAGGGCGGCEGCECECEGACTGTTCGTGGAC

AAAKAAAAKARAAAAAANAAARARARARAAAAAAAAKAARAAANARAKRAAAARAAAAARARA BM38.2 2798 TGA [SEQ ID NO: 1] WT 2798 TGA [SEQ ID NO: 15] xxx >WT 2798 produto de gene traduzido

MGGTGSPAARLOALFEGHRLTPTORRIAHSMVRRAADVPFLSSVELAELAGVSQPSVTRFAVALGFDGYPALRRH LREVAPAEPAPETGSSNEYQQAVEAE IENLRHLAEVLADPRPVRQAGRMLAGSRPLPVLGLRAAAAQAHGFAYFA

AKVHPDVRLLNEGGTMLHDRIDAAARAGASALLCFALPREPREWDALIHAKETGLTWTIVADSPFAPVAGLSDLLL PAAVGTGLAFDTACAPMLLGRVLLEAMCDDLPDAÇARLEEFDVRAAARGLFVD [SEQ ID NO: 16] >BM38.2 2798 produto de gene traduzido

MSGTGSPAARLQALFEGHRLTPTORRIAHSMVRRAADVPFLSSVELAELAGVSQPSVTRFAVALGFDGYPALRRH LREVAPAEPAPETGSSNEYQQAVEAEIENLRHLAEVLADPRPVRQAGRMLAGSRPLPVLGLRAAAAQÇQAHGFAYFA AKVHPDVRLLNEGGTMLHDRIDAAARAGASALLCFALPRHPREWDALIHAKETGLTWTVADSPFAPVAGLSDLLL

PAAVGTGLAFDTACAPMLLGRVLLEAMCDDLPDAQARLEEFDVRAAARGLEVD [SEQ ID NO: 2]

[060] orf3866: previsto codificar um regulador de resposta de ligação ao DNA na família OMpR. Contém domínio REC, que recebe o sinal do parceiro de sensor em um sistema de dois componentes e um domínio de hélice alada (wHTH) característico de Proteínas Reguladoras de Antibiótico Streptomyces (SARPs). Uma mutação de A para G resulta na mudança de um Ala para um Thr. BM38.2 3866 TTGCCGGCCCGCCAGGCGCAGGCGCGCACCGACCGAGAGCACACGAGGACTGAGAGCACC WT 3866 TTGCCGGCCCECCAGECECAGECECGCACCGACCGAGAGCACACGAGGACTGAGAGCACC

SEOCIEIOSIEISIEESOOOIEIOOEIOEROOEICIOCIECORIECE ICONE CESCICEIEACIOX BM38. 2 38 66 GGGATGGCAGACCAGACCCACGTCCTGTTCGTCGAGGACGACGACGTCATCCGCGAGGCC WT 3866 GGGATGGCAGACCAGACCCACGTCCTGTTCGTCGAGGACGACGACGTCATCCGCGAGGCC

AAXKAXARANAAARRA RARA RARA AAA RARA RAEXARA RARA AAAENARARARAAERAARA BM38.2 3866 ACCCAGCTGGCCCTGGAGCGGGACEGCTTCECEGTCACCGCGAAGCCCGACGGECTETCGÇ WT 3866 ACCCAGCTGGCCCTGGAGCGGGACGGCTTCGCGGTCACCGCGAAGCCCGACGEGGCTETCG

SEIEIOROEIEROKIENEROEJENOROEIOIOKIEIOROEJEOROEJOOOIGIOOESOIOEIEIO CIO IAGO IICA ICAC BM38. 2 38 66 GGCCTGGAGGCGTTCCACACCGACCGTCCCGACATCGCGCTGCTGGACGTCATGGTCCCC WT 3866 GGCCTGGAGGCGTTCCACACCGACCGTCCCGACATCGCGCTGCTGGACETCATGGTCCCC BM38.2 3866 GGTCTGGACGGGETCGAGCCTGTGCCGEGCECATACGGGACGAGTCGATGGTGCCGGTGATC WT 3866 GGTCTGGACGGGETCAGCCTETECCEGCECATACGGGACGAGTCGATGETECCEGTEATC

RACKKKAKKIN KEIRA KAKA KEA KAKA AA AIRE AKIRA RARA KARA KERIA AKIRA KAS BM38.2 3866 ATGCTGTCGGCEGCEGECCGACGCCATCGACGTGGTGCTEGECCTEGAGECEGECECCGAC WT 3866 ATGCTGTCGGCGCEGGECCGACGCCATCGACGTGGTGCTGGGCCTGGAGGCGGGCGCCGACÇ

SESCIOEIIOSIEIIEIOIOOERIOEIEOOEIOOOEIOOEIOIOOESCIOEIEROOIEIOCIEICIORIE ESC IACIOX BM38.2 3866 GACTATGTGACCAAGCCGTTCGACGGCGCCGTGCTGEGTGGCCCGGATCCGCGECEGTECTE WT 3866 GACTATGTGGCCAAGCCGTTCGACGGCECCETEGCTEGTEGCCCGEGATCCGCGCEGTECTE

AKAAXXAAA KXKXXAAAAKAA AAA XANA AR KAAAAAAAA AAA AA AA AAA RA AXAAA ARA BM38.2 3866 CGCCGCTTCGGGCEGECGAACEGCEGCCEGEAGGEAACCGEGCGGCEGACECCEGEGETETGE WT 3866 CGCCGCTTCGGGECEGECGAACGGCGGCCGGEAGGAACCGGCGGCGGACGECCGGEGGTECTGÇ

HAKKKA KAKA KEA KRA KRA KEX KRA KAKA KR XKKA RARA KKE XIRA NARRA KRA A KRA BM38.2 3866 CTGGCGTTCGGCGAACTGGAGATCGACACCGGGGGCATGGAGGTGCGCCGGECEGEGÇAG WT 3866 CTGGCGTTCGGCGAACTGGAGATCGACACCGGEGEGCATEGAGETECECCEGECEGEGÇAG

SECIERIOSIEIIEIEIESIOEIEIOEIOOOIEROOUERCIOESCIOSIEOEEICIOOECIORIEICECICIONIECIDEX BM38. 2 3866 CCGETGGCECTGACGECCGACCGAGATGCGGCTEGCTGCTGGAGTTCTCGGCEGCECCEGECS WT 3866 CCGGTEGCECTEGACGCCGACCGAGATGCEGCTECTGCTGGAGTTCTCGGCEGCECCEGEC

AARKEXARENRAA KRA X ARA RARA ARA KAKA KKAEXKRARRKARAENRRA REAR A ARA R ARA BM38.2 3866 ACGGTGCTCTCCCGCGACAAGCTGCTCGAACGGGTETGGGAGTACGEGCTEGEGCEGTEAC WT 3866 ACGGTGCTCTCCCGCGACAAGCTGCTCGAACGGEGTEGTGGEGAGTACGGCTGGGGCGETÇAÇ

AAXKAXARE NARA ARA XARA RAR XARA RARA AARX ARA RARA KARA ARA AAA AAA ARA BM38.2 3866 ACCCGGGTCGTCGACGTCCATGTGCAGCGGCTGCECACGAAGATCGGCCAGGACCGCATC WT 3866 ACCCGGGTCGTCGACGTCCATGTGCAGCGGCTGCGCACGAAGATCGGCCAGGACCGCATC

SEXEROROEIEIORIENEROEIENOROEIOIOKIEIOROEIEIOROEIOOIGIOOESGIOEIEIOEOIGIOOEICIOEIEICEICIOICIGIOEE BM38.2 3866 GAGACGGTCCGCGGTTTCGGTTACAAGCTGAAGGCCTGA [SEQ ID NO: 3] WT 3866 GAGACGGTCCGCGGTTTCGETTACAAGCTGAAGECCTEA [SEQ ID NO: 17] - fede de do dedo de dede dede dedo ooo kkk ko ok ok kk kkk Ok kkk >WT 3866 produto de gene traduzido

LPARQAQÇQARTDREHTRTESTGMADOTHVLEVEDDDVIREATOLALERDGFAVTAKPDGLSGLEAFHTDRPDIALL DVMVPGLDGVSLCRRIRDESMVPVIMLSARADAIDWLGLEAGADDYVAKPFDGAVLVARIRAVLRRFGRANGGRE

EPAADAGGVLAFGELEIDTGGMEVRRAGQPVALTPTEMRLLLEFSAAPGTVLSRDKLLERVWEYGWGGDTRWDVH VORLRTKIGQODRIETVRGFGYKLKA [SEQ ID NO: 18] >BM38.2 3866 produto de gene traduzido

LPARQAQÇQARTDREHTRTESTGMADOTHVLEVEDDDVIREATOLALERDGFAVTAKPDGLSGLEAFHTDRPDIALL DVMVPGLDGVSLCRRIRDESMVPVIMLSARADAIDWLGLEAGADDYVTKPFDGAVLVARIRAVLRRFGRANGGRE

EPAADAGGVLAFGELEIDTGGMEVRRAGQPVALTPTEMRLLLEFSAAPGTVLSRDKLLERVWEYGWGGDTRWDVH VORLRTKIGODRIETVRGFGYKLKA [SEQ ID NO: 4]

[061] orf4755: previsto codificar o fator sigma-70 de RNA polimerase, família sigma-E. Uma mutação T para G em um códon Arg (CGT -> CGG) é uma mutação silenciosa.

BM38. 24 755 TTGCACGGGAAGACCGAGACACCGGTGGAGGGCATGACCGAGGAAGAGTTCGACGCTTTC WT 4755 TTGCACGGGAAGACCGAGACACCGGTGGAGGGCATGACCGAGGAAGAGTTCGACGCTTTC

NAXKKXARANKREA KRA AAKANAEX AAA KAKA RKAEXARARAKARAENARAR RR AREA NARA BM38.2 4755 TACGCGGCCGCGTTCCCCCGCCTGACCGGACAGTTGTACGTCTTCACCGGTGACCTCGGC WT 4755 TACGCGGCCGCGETTCCCCCGCCTGACCGGACAGTTGTACGTCTTCACCGGTGACCTCGGC

EREROROEIIORIENEROEJENORORIOIOKOIEIOROEJENOROESOOROIGIOOESOIOIEIOERIEIOOE SCI IEEE BM38.2 4755 GAGGCCCAGGACGTCGTCCAGGAGGCGTTCGTACGGGCCTGEGACCGECGCEGEAGECTGE WT 4755 GAGGCCCAGGACGTCGTCCAGGAGGCGTTCGTACGGGCCTEGEACCEGCGCEGGAGECTGE - RARA AEARIARA ARA AA RAR AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AA RA RARA AAA BM38. 24 755 ATCGCCGACGAGGCGCCCGAGGCETGGGTEGCECACCGTCGCCATGCGGCTCGCGGTGAGCE WT 4755 ATCGCCGACGAGGCGCCCGAGECETEGETECEGCACCGTCGCCATGCEGCTCGCEGTEAGE

NAXKAXARA NARA RARA ARA NARA AAA KAKA AX ARXARA RARA RAR XARA RARA RARA ARA BM38.2 4755 CGCTGGCGCCEGCECGAAACGCTEGCTEGAACTCGTACGGCACTCCCCGCCCCCGGAGACG WT 4755 CGCTGGCECCECECGAAACGCTGGCTGGAACTCGTACGGCACTCCCCGCCCCCGGAGACG - e sd sh cl sl ck sl ke ole ok ole skol sl ole sl cl oh ck all ole ok ole ok le ok leo koto ok ole ok le ok le ok look look lolol le lo o ol lool lo de ko o lool ok BM38. 2 4755 ACCCCCGGCCCEGGGCCCCGACCGCACCGCCCTGGTCGCCGCGCTGCGCCAACTGCCCGAG WT 4755 ACCCCCGECCCEGEGCCCCGACCGCACEGCCCTEGTCECCECECTECGCCAACTGCCCGAG - RARA R ERA RARA RARA RAIA AAA AAA A AAA AA AAA RARA AAA AAA AAA AA RARA RARA ARA BM38.2 4755 CACCAGCGCATGGCCGTCGTCCTCCATCACCTGTGCGACCTCAGCGTCGAACAGGTAGCC WT 4755 CACCAGCGCATGGCCGTCGTCCTCCATCACCTGTGCGACCTCAGCGTCGAACAGGTAGCC

AAXKAXARE NANA AARA KARA NARRA KARA XARXARA RARA RAE NARA ARA A AREA ARA BM38.2 4755 TCCGAGACCGGCGCACCCGTGEGCACGETCAAGGECCAGGECTCTCCCGECEGACEGECEGÇA WT 4755 TCCGAGACCGGCGCACCCGTGGECACEGTCAAGGCCAGGCTCTCCCGCGEGACEGGCEGCA

SEXEIOROEIEIORIENEREIEIOROEIOIOKIGIOREIEIROEIOOEIGIOOESGIOEIEIOEOICGIOOEICIOEIEICEEICIOICICIOX BM38.2 4755 CTGGCCAGACATCTGGCGGTGGACGAGECCGACGAGTCEGCCTEGAGEGAGEGCEGCCEG WT 4755 CTGGCCAGACATCTGGCGGTGGACGAGGCCGACGAGTCGGCCTEGGAGEGAGGGCEGCCET - fede sfe de sl de sde ko desk de kd skol loko loko loko de ko ko o ko oo ko ko ko ko kkk oo ko ok ok ok ko BM38.2 4755 GTCGGATGA [SEQ ID NO: 9] WT 4755 GTCGGATGA [SEQ ID NO: 23]

AARRAAAAA >WT 4755 produto de gene traduzido

LHGKTETPVEGMTEEEFDAFYAAAFPRLTGOLYVFTGDLGEAÇDWOEAFVRAWDRRGRLIADEAPEAWVRTVAMR

LAVSRWRRAKRWLELVRHSPPPETTPGPGPDRTALVAALRQLPEHQORMAWLHHLCDLSVEQVASETGAPVGTVKA RL SRGRAALARHLAVDEADESANWREGGRVG [SEQ ID NO: 24] >BM38.2 4755 produto de gene traduzido

LHGKTETPVEGMTEEEFDAFYAAAFPRLTGOLYVFTGDLGEAQDWOEAFVRAWDRRGRLIADEAPEAWVRTVAMR

LAVSRWRRAKRWLELVRHSPPPETTPGPGPDRTALVAALROQLPEHQORMAWLHHLCDLSVEQVASETGAPVGTVKA RLSRGRAALARHLAVDEADESAWREGGRVG [SEQ ID NO: 10]

[062] orf4868: previsto codificar um regulador de transcrição proteína. Contém domínio receptor de Sinal REC que recebe o sinal do parceiro de sensor em um sistema de dois componentes. Uma deleção (perda de um C) em uma sequência de repetição em tandem resulta em uma mutação de deslocamento de estrutura.

BM38.2 4868 ATGCGCCCGCCCGTCACCCACCACCACCCTGCCGGAGECGCTGCGCGCCGCCCCTATCGA WT 4868 ATGCGCCCGCCCGTCACCCACCACCACCCTGCCGGAGECGECTGCGCGCCGCCCCTATCGA

SESOIOOEICIOIENCROEJEOOESOIOKIOOROESOOEROOKIGIOESXOOEIEIOROCIO CIO ICE ACIOX BM38.2 4868 CTCTTGATCGTGGAGGACGAGAABACGCCTCGCTCTCTCCCTCGCCAAGGGACTCACCOGCC WT 4868 CTCTTGATCGTGGAGGACGAGAAACGCCTCGCTCTCTCCCTCGCCAAGGGACTCACCGCC

AAAXKAXARINAAAARA KARA NARA AAA KARA XARX ARA KARA NARA XAAA AAA AAA BM38. 24 868 GAGGGCTACGCCGTGGACGTCGTCCACGACGGCCGEGGAGGGCCTGCACCGGECCACGGAG WT 4868 GAGGGCTACGCCGTGGACGTCGTCCACGACGGCCEGGAGGGCCTGCACCGGGCCACGGAG

EIEROROEIEIOIENEROEJENCROEROIOKIEICROEJEROEREOOOIEIORESOORIEIOK CIO ICO AERCREICICCIRACAOE BM38.2 4868 GGGACGTACGACCTCCTCATCCTGGACATCATGCTGCCCGGTCTCAACGGCTACCGGGTC WT 4868 GGGACGTACGACCTCCTCATCCTGGACATCATGCTGCCCGGETCTCAACGGCTACCGGGTC - fe sl sl de sl ke sl sk le sk le sk ole sl le sl cl sl olk ole ok le ok leal leal koto sk loko look fe ok lool loool lo lo ooo ooo ooo leo BM38. 24 868 TGCGCCGCECTCCGCECCGCCGGACACGACGTGCCGATCCTGATGCTCACGGCCAAGGACÇ WT 4868 TGCGCCGCGCTCCEGCECCECCEGACACGACGTGCCGATCCTGATGCTCACGGCCAAGGAC

AAXKAXARE XANA ARA AAKA NARA AAA KAKA NARA ARA RARA RAE XA RA AA RARARA ARA

BM38. 24 868 GGCGAGTACGACGAGGCGGAGGGCCTGGACACCGGCGCCGACGACTACCTCACCAAGCCG WT 4868 GGCGAGTACGACGAGGCGGAGGGCCTEGACACCGGCGCCGACGACTACCTCACCAAGCCGE - AREA REAR ER ERR RARE REAR ERA RARA AAA RARA ARA RA RARA ARA RARA RA AAA AAA RARA BM38.2 4868 TTCTCGTACGTCGTCCTCGTCGCCAGGATCAAGGCGCTECTECECCECCEGCCEGCCEGE WT 4868 TTCTCGTACGTCGTCCTCGTCGCCAGGATCAAGGCGCTGCTGCECCGCCGGCCEGCCEGE

RACK KAKA KIKI AKK IARA KAKA K RARE KR AIR AKIRA KAIRI KARA IR A BM38.2 4868 GCCTCCCC-ATCCATGTCCACGGCEGACCTCAAGGTGGACACCGCCGCCCGCCECETCTTC WT 4868 GCCTCCCCCATCCATGTCCACGGCGACCTCAAGGTGGACACCGCCGCCCGCCGCETCTTC - AR AA AAA EEE ARA E REA ER ERA RARA AAA AAA EA RARA ARA RARA RAE AAA ERA RARA BM38.2 4868 CTGGGCGAGGACGAAGTGGCGCTGA [SEQ ID NO: 13] WT 4868 CTGGGCGAGGACGAAGTGGCGCTGA [SEQ ID NO: 27]

CEI IRICOOEICIORRO >WT 4868 produto de gene traduzido

MRPPVTHEHPAGGAARRPYRLLIVEDEKRLALSLAKGLTAEGYAVDWHDGREGLHRATEGTYDLLILDIMLPGLN

GYRVCAALRAAGHDVPILMLTAKDGEYDEAEGLDTGADDYLTKPFSYWLVARIKALLRRRPAGASPIHVHGDLKV DTAARRVFLGEDEVAL [SEQ ID NO: 28] >BM38.2 4868 produto de gene traduzido

MRPPVTHHHPAGGAARRPYRLLIVEDEKRLALSLAKGLTAEGYAVDWHDGREGLHRATEGTYDLLILDIMLPGLN

GYRVCAALRAAGHDVPILMLTAKDGEYDEAEGLDTGADDYLTKPFSYWLVARIKALLRRRPAGASPSMSTATSRW TPPPAASSWARTKWR [SEQ ID NO: 14]

[063] orf5175: previsto codificar uma proteína reguladora de transcrição de histidina cinase. Contém um domínio receptor de Sinal REC que recebe o sinal do parceiro de sensor em um sistema de dois componentes. Uma mutação de T para C resulta na mudança de um Pro para um Ser.

BM38.2 5175 ATGGTGCAGAAGGCCAAGATCCTCCTGGTCGATGACCGGCCGGAGAATCTGCTCGCGCTG WT 5175 ATGGTGCAGAAGGCCAAGATCCTCCTGGTCGATGACCGGCCGGAGAATCTGCTCGCGCTG - ARA RA AAA AAA RARA RARA AAA AAA AAA RARA AA RARA AAA RAR AAA AAA AAA AAA A AAA BM38.2 5175 GAGGCGATCCTCTCGGCGCTCGATCAGACGCTGGETGCGGGCATCGTCCGGGGAGGAAGCG WT 5175 GAGGCGATCCTCTCGGCGCTCGATCAGACGCTGGTGCGGECATCGTCCGGGGAGGAAGOG

NAKXKKXKKA NARRA KARA KAKA KEA KAKA KAKA KKEXKKA RARA KKR NARA RARA RARA KA BM38.2 5175 CTCAAAGCGCTGCTGACGGACGACTTCGCGGTCATTCTGCTGGACGTCCAGATGCCGGGC WT 5175 CTCAAAGCGCTGCTGACGGACGACTTCGCGGTCATTCTGCTGGACGTCCAGATGCCEGEC " fede sd sdeo ko dede de de leo do ko ok ok ok ok ok ok kkk ROCK Ok Ok Ok Ok Ok RR kk E kk kk BM38. 251 75 ATGGACGGTTTCGAGACCGCGGCCCACATCAAGCGGCGGEGAACGCACCCGGGACATCOCG WT 5175 ATGGACGGTTTCGAGACCGCGGCCCACATCAAGCGGCGEGAACGCACCCGGGACATCCCG

HARXKAXARE NARA RRA RARA NARA AAA KAKA KARNAK A RARA RAE NARA RARA AREA ARA BM38.2 5175 ATCATCTTCCTCACCGCGATCAACCACGGTTCGCACCACACGTTCCGGEGCTACECEGCE WT 5175 ATCATCTTCCTCACCGCGATCAACCACGGTCCGCACCACACGTTCCGGGGCTACGCEGCGE - Ge sde sh cl sl ck sl ke ode kda skol skol ol ke olok loko le ake ok fe ok ok koto ok fe ok ooo ole ol o ole oo ooo ooo soe soe lool

BM38. 2 5175 GGTGCGGTCGACTACATCTCGAAGCCGTTCGACCCGTGGGTEGCTGCGCGCGAAGGTCTCG WT 5175 GGTGCGGTCGACTACATCTCGAAGCCGTTCGACCCGTGEGTECTECECGCGAAGGETCTCG - AEE REAR ER ERA EAR ERRAR ERA RARA AAA RARA ARA RARA RA AA ARA RARA EA EA ERA RARA BM38.2 5175 GTCTTCGTCGAGCTGTACATGAAGAACTGCCAGCTGCGGGAGCAGGCGGECECTECTECEG WT 5175 GTCTTCGTCGAGCTGTACATGAAGAACTGCCAGCTGCGGGAGCAGGCGGCGCTGCTECEG

RACKKK AKON KAR ARA RA ARE KAA KRA AIKI KAKA KAKA RAIA IARA KARA IAR A BM38.2 5175 CTCCAGTTGGACGGCGGCGAGAAGGACGATGCCGAGECAGECGACTCEGCEGEGCTECTC WT 5175 CTCCAGTTGGACGGCGECGAGAAGGACGATGCCGAGGCAGGCGACTCGGCEGGEGCTGCTC - ARA AERRERRRR REAR RR RR ERA RAE R ARA AAA RARE AAA AA AA ARA ARA RARA EA ERA RARA BM38. 251 75 GCCGAGCTGTCGGCEGCEGCTCGCEGCCETCEAGEAGCAGGCCGAGGCGCTGACCAAGCAG WT 5175 GCCGAGCTGTCGGCGCEGCTCECEGCCETCEAGGAGCAGECCGAGEGCGCTEGACCAAGCAG - ARE E RE R ERR RARA ERR RIR ARA R ARA ARA RA AAA RARA RA ARA EA RARA RARA ERA RARA BM38.2 5175 CTCAACGACGAGTCGACGGACGCGGCCECEGTEGCCACEGCGGCTCATCTGGAGCGCAAG WT 5175 CTCAACGACGAGTCGACGGACGCGECCECEGTGECCACGGCGGCTCATCTGGAGCGCAAG " ole sh le shock shock look look ko ok ke sk ke ol ko le ok le ok le ok le ok colo ok lo ok lo ok le ko loko lo lo lo lo ko le lo le ko le ko alo lo alo e lo lo lo alo leal io BM38.2 5175 CTCACGGGGTTGCGGCEGECECTEGACGCCCTGGAGCCCGGGACCGGCAGCGCGTCGTCGS WT 5175 CTCACGGGGTTGCEGCEGECECTEGACGCCCTGGAGCCCGGEACCGGCAGCGCGTCGTCG " fede dedo dedo de ode de do dedo dedo ko ooo ko ok ok ok Ok kk kk Ok COR Ok Ok O E kk E kk ooo BM38.2 5175 GTGCCGTCGCAGAACTGA [SEQ ID NO: 5] WT 5175 GTGCCGTCGCAGAACTGA [SEQ ID NO: 19]

AAXKAXARAENRAA RARA AA >WT 5175 produto de gene traduzido

MVOKAKILLVDDRPENLLALEAILSALDOTLVRASSGEEALKALLTDDFAVILLDVOMPGMDGFETAAHIKRRER TRDIPIIFLTAINHGPHHTFRGYAAGAVDYISKPFDPWVLRAKVSVEVELYMKNCOLREQAALLRLOLDGGEKDD

AEAGDSAGLLAELSARLAAVEEÇQAEALTKOLNDESTDAAAVATAAHLERKLTGLRRALDALEPGTGSASSVPSQN [SEQ ID NO: 20] >BM38.2 5175 produto de gene traduzido

MVOKAKILLVDDRPENLLALEAILSALDOQTLVRASSGEEALKALLTDDFAVILLDVQMPGMDGFETAAHIKRRER TRDIPIIFLTAINHGSHHTFRGYAAGAVDYISKPFDPWVLRAKVSVEVELYMKNCOLREQAALLRLOLDGGEKDD

AEAGDSAGLLAELSARLAAVEEQÇQAEALTKOLNDESTDAAAVATAAHLERKLTGLRRALDALEPGTGSASSVPSQN [SEQ ID NO: 6]

[064] orf5387: previsto codificar um regulador de transcrição na família MerR. Contém um domínio de ligação ao DNA HTH e um domínio de REC que recebe o sinal do parceiro de sensor em um sistema de dois componentes. Uma mutação de C para A resulta na mudança de um Tyr para um Ser.

BM38. 2 5387 ATGGTGCGGGAAGCGCTGGCCGCACTGCTCGAACTCGAGGACGACATCCGGGTGGTEGCA WT 5387 ATGGTGCGGGAAGCGCTGGCCECACTGCTCGAACTCGAGGACGACATCCGGGTEGTEGCA - RARA AAA EAR ERA RARA RAE ARA RARA AAA RARA AAA AAA AAA AA AAA AA RARA RARA AA ARA BM38.2 5387 GAAGTCGGCTCCGETGAGGACGTACTCGACGCEGCCAGEGEAACACGTCCCGACCTCGTG

WT 5387 GAAGTCGGCTCCGGTGAGGACGTACTCGACGCGGCCAGGGGAACACGTCCCGACCTCGTG - ele sl cl sl ck le k le ok le ok le ok leal ck ol ck ohk le ok le ok le ok de ok koto ok lo ok le ok le ok look loko lool lo le lo lo kl ole o lo o loko loko ko BM38.2 5387 ATCGTGGACGTCAACATGCCGEGACTCGACGGGECTCACCGCGGCCGAGCGGCTGCECÇGAG WT 5387 ATCGTGGACGTCAACATGCCGGGACTCGACEGECTCACCGCEGCCEAGCGEGCTECECGAG - ARE REAR ERR R ERA RARA ERRAR ARA RA AAA AAA RARA RARA RARA RARA RARA RAE RA RARA BM38.2 5387 CAGCTGCCCGACTCCCGCATCCTGGTGCTGEACCETCCTGGACGCGCCCAACGTCCTGCGC WT 5387 CAGCTGCCCGACTCCCGCATCCTGGTGCTEACCETCCTGGACGCGCCCAACGETCCTECEC

NAXKKXAKA NARA RAAAKA NARRA KRA KARAN KR XKKA KAKA KE NARA RAR AR RARA KRA BM38.2 5387 CGGGCGCAGGACGTCCGEGTCGACGGCTACCTCGTCAAGAACGCTCCGGTGGAGCACCTC WT 5387 CGGGCGCAGGACGTCCGEGTCGACGGECTACCTCGTCAAGAACGCTCCGGETGEGAGCACCOTC - fede sl de sl dk sl sk desk de skol skol sl dk olok loko look le ok de deooko koto ko loko loko ko look loko loko loko do ok ooo oo ooo BM38.2 5387 GTCAAGGCCGTGCGCCAGATCATGGCCGGGGAACGCGTCATCTCACCGGAGCTGGCGCTE WT 5387 GTCAAGGCCGTGCGCCAGATCATGGCCGGGEAACGCETCATCTCACCGGAGCTGGCECTE

AAXKAXARANARA RARA XANA NARA NARA RARA RARA ARA RARA ARENA RAR ARERAARA BM38.2 5387 GCCGCCTGGGAGGGCAAGGCCAGCCCGCTCACCGCGCGEGAGECCGATGTGCTCCGGATC WT 5387 GCCGCCTGEGAGEGCAAGGCCAGCCCGCTCACCGCGCEGEAGGCCGATGTGCTCCGGATC

NAXKKXARE NARA RARA XAKA NARA NANA KARA XKEREXARA RAR AXE XARAXRRA RARA ARA BM38.2 5387 GCGGCEECCEGCECEGAGACCGCCGAGATCGCCGAGTACCTGCATCTTTCACCGGGCACG WT 5387 GCGGCEGGCCEGCECEGAGACCGCCGAGATCGCCGAGTACCTGCATCTTTCACCGGGCACG - fede sl sl dk del de skol loko loko do oko eo ok ok look kk ok ok ok ok ok ok kk ok ok kk ko BM38. 2 5387 GTGCGGAACTCCATGACCACCATCATCGCCAAGCTCGACGCGCGCAACCGGCTCGACECC WT 5387 GTGCGGAACTACATGACCACCATCATCGCCAAGCTCGACGCGCGCAACCGGCTCGACGECC

AAXKAXARAA KXXKAAARA NARA AAA RARA XAEXARA RARA AA AARAXARARERAARA BM38.2 5387 ATCCGCATCGCACGCGACGCCGEGGTEGGCTCCTCAACTCCTGA [SEQ ID NO: 7] WT 5387 ATCCGCATCGCACGCGACGCCGGGTGGCTCCTCAACTCCTGA [SEQ ID NO: 21]

RACK AO REC R AO IR IECR KIKA A RAR AX A RARA RA >WT 5387 produto de gene traduzido

MVREALAALLELEDDIRWAEVGSGEDVLDAARGTRPDLVIVDVNMPGLDGLTAAERLREQLPDSRILVLTVLDAP

NVLRRAQDVRVDGYLVKNAPVEHLVKAVROIMAGERVISPELALAAWEGKASPLTAREADVLRIAAAGAETAEIA EYLHLSPGTVRNYMTTIIAKLDARNRLDAIRIARDAGWLLNS [SEQ ID NO: 22] >BM38.2 5387 produto de gene traduzido

MVREALAALLELEDDIRWAEVGSGEDVLDAARGTRPDLVIVDVNMPGLDGLTAAERLREQLPDSRILVLTVLDAP

NVLRRAQDVRVDGY LVKNAPVEHLVKAVRQIMAGERVISPELALAAWEGKASPLTAREADVLRIAAAGAETAEIA EYLHLSPGTVRNSMTTIIAKLDARNRLDAIRIARDAGWLLNS [SEQ ID NO: 8]

[065] Deve ser entendido que todos os tamanhos de base ou tamanhos de aminoácido, e todos os valores de peso molecular ou massa molecular, fornecidos para descrever ácidos nucleicos e polipeptídeos de acordo com a invenção são aproximados dentro de variações de medição convencionais.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. Um isolado de Streptomyces fungicidicus modificado que codifica uma proteína Orf2798 que possui 95% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; em que a sequência de aminoácidos da proteína Orf2798 compreende um resíduo de serina na posição 2 de aminoácido; e em que uma produção aprimorada de enduracidina é obtida com o dito Streptomyces fungicidicus modificado em comparação com aquela obtida com uma cepa de Streptomyces fungicidicus de tipo selvagem.

2. O isolado de Streptomyces fungicidicus modificado da reivindicação 1, em que a proteína Orf2798 é codificada pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 1.

3. O isolado de Streptomyces fungicidicus modificado da reivindicação 1 ou 2 que codifica ainda uma proteína Orf3866 que possui 95% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4; em que a sequência de aminoácidos da proteína Orf3866 compreende um resíduo de treonina na posição 124 de aminoácido.

4. O isolado de Streptomyces fungicidicus modificado da reivindicação 3 em que a proteína Orf3866 é codificada pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 3.

5. O isolado de Streptomyces fungicidicus modificado de 1, 2, 3 ou 4 que codifica ainda uma proteína Orf5175 que possui 95% ou mais de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQID NO: 6; em que a sequência de aminoácidos da proteína Orf5175 compreende um resíduo de serina na posição 91 de aminoácido.

6. O isolado de Streptomyces fungicidicus modificado da reivindicação 5 em que a proteína Orf5175 é codificada pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID

NO: 5.

7. O isolado de Streptomyces fungicidicus modificado da reivindicação 1, 2, 3,4,5 ou 6 que codifica ainda uma proteína Orf5387 que possui 95 % ou mais de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; em que a sequência de aminoácidos da proteína Orf5387 compreende um resíduo de serina na posição 164 de aminoácido.

8. O isolado de Streptomyces fungicidicus modificado da reivindicação 7 em que a proteína Orf5387 é codificada pela sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 7.

9. O Isolado de Streptomyces fungicidicus modificado da reivindicação 1, 2, 3,4, 5,6,7 ou 8, que compreende ainda a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 9, mas não a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 23.

10. O isolado de Streptomyces fungicidicus modificado da reivindicação 1, 2,3,4,5,6,7,8 ou 9 que não codifica uma proteína Orf682 funcional.

11. O isolado de Streptomyces fungicidicus modificado da reivindicação 10, em que a falta de uma proteína Orf682 funcional é devido ao dito isolado de Streptomyces fungicidicus modificado compreendendo uma mutação frame- shift em um gene que codifica a proteína Orf682.

12. O isolado de Streptomyces fungicidicus modificado da reivindicação 1, 2,3,4,5,6,7,8,9,10 ou 11 que não codifica uma proteína Orf4868 funcional.

13. O isolado de Streptomyces fungicidicus modificado da reivindicação 12, em que a falta de uma proteína Orf4868 funcional é devido ao dito isolado de Streptomyces fungicidicus modificado compreendendo uma mutação frame- shift em um gene que codifica a proteína Orf4868.

14. Um método de produzir enduracidina, compreendendo cultivar o isolado de Streptomyces fungicidicus modificado da reivindicação 1, 2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 em um meio de cultura sob condições suficientes para produzir enduracidina.

15. O método da reivindicação 14 que compreende ainda isolar enduracidina do meio de cultura.