TWI770070B

TWI770070B - 經修飾之抗真菌鏈黴菌(streptomyces fungicidicus)分離株及其用途

Info

Publication number: TWI770070B
Application number: TW106134804A
Authority: TW
Inventors: T 馬克薩比斯基
Original assignee: 荷蘭商英特威國際公司
Priority date: 2016-12-06
Filing date: 2017-10-11
Publication date: 2022-07-11
Also published as: BR112019011603A2; MY194438A; PE20190967A1; UA127451C2; TW201827590A; WO2018103905A1; MX2019006586A; PH12019501225A1; RU2019117260A; CO2019005540A2; JP2020500509A; JP2023012549A; RU2019117260A3; CN110072881A

Abstract

本發明係關於經修飾之抗真菌鏈黴菌(Streptomyces fungicidicus )分離株、包含此等分離株之組合物及使用該等分離株及組合物以生物性地合成持久殺菌素(enduracidin) (持久黴素(enramycin))之方法。另外，本發明係關於經修飾之抗真菌鏈黴菌分離株，其以更有效的方式生物性地合成持久殺菌素且促進產生持久黴素。

Description

經修飾之抗真菌鏈黴菌(STREPTOMYCES　FUNGICIDICUS)分離株及其用途

本發明係關於經修飾之抗真菌鏈黴菌(Streptomyces fungicidicus)分離株、包含此等分離株之組合物及使用該等分離株及組合物以生物性地合成持久殺菌素(持久黴素)之方法。本發明進一步係關於經修飾之抗真菌鏈黴菌分離株，其以更有效的方式生物性地合成持久殺菌素且促進產生持久黴素。

由MSD Animal Health以Enradin^®出售之持久殺菌素(亦稱為持久黴素)為天然產生之17胺基酸脂縮酚肽抗生素，其係由會產生持久殺菌素的天然製造者的細菌抗真菌鏈黴菌生物性地合成及分泌。

持久殺菌素為持久殺菌素類似物之通用名稱且包括持久殺菌素A、B、C及D。肽可自醱酵液及主要呈持久殺菌素A與B之混合物形式的菌絲體分離，該等持久殺菌素在所連接之脂質鏈之長度方面相差一個碳。結構上，持久殺菌素可藉由C₁₂或C₁₃ 2Z、4E分支鏈脂肪酸部分及諸多非蛋白型胺基酸殘基(諸如持久雙殺黴素(enduracididine)、4-羥基苯甘胺酸、3,5-二氯-4-羥基苯甘胺酸、瓜胺酸及鳥胺酸)之存在進行區分，該部分藉由醯胺鍵連接至天冬胺酸殘基。

持久殺菌素呈現針對包括產氣莢膜芽胞梭菌(Clostridium perfringens)、抗二甲氧苯青黴素金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)及抗萬古黴素腸球菌(vancomycin-resistant Enterococcus，VRE)的廣泛範圍革蘭氏陽性(Gram-positive)生物之有效活體外及活體內抗菌活性。藉由與胞外脂質II(細菌細胞壁之前驅體)複合，持久殺菌素抑制細菌肽聚糖細胞壁生物性地合成。脂質II與持久殺菌素複合之位點不同於萬古黴素識別之位點，且引起持久殺菌素針對抗萬古黴素生物之作用。迄今為止，無文獻記載持久殺菌素與任何臨床上使用之抗生素之交叉抗性，且沒有跡象顯示會發展出抗性、獲得性抗性或可轉移抗性。不存在任何已知形式可轉移抗性機制、缺乏口服生物可用性、其低毒性及針對梭菌屬(Clostridium spp.)之顯著抗菌活性使持久殺菌素成為控制家禽中梭菌性腸炎的關鍵抗生素。

因此在家禽飼料中投與時，持久殺菌素抑制導致家禽中壞死性腸炎及生長抑制之細菌生長。持久殺菌素亦具有零停藥期。此外，持久殺菌素在飼料及丸劑中係穩定的，可以極低劑量向雞投與，且發現在經治療雞隻的肉或蛋中沒有殘餘物。

多年來，已獲得大量抗真菌鏈黴菌菌株，其經修飾以提高此等產生持久殺菌素之微生物之效能，例如抗真菌鏈黴菌B-5477(IFO-12439，ATCC-21013)及抗真菌鏈黴菌B-5477-m(IFO-12440，ATCC-21014)[參見例如U.S.3,577,530、U.S.3,786,142及U.S.4,465,771]。然而，仍十分需要針對該等經修飾之抗真菌鏈黴菌分離株做進一步改良，以形成甚至更有效的產生持久殺菌素的微生物。

本文任何參考文獻之引用不應解釋為承認該等參考文獻可作為「先前技術」用於本申請案。

因此，本發明提供更有效地產生持久殺菌素的新穎經修飾之抗真菌鏈黴菌分離株。在某些實施例中，經修飾之抗真菌鏈黴菌分離株編碼以下中之一或多者或全部：與SEQ ID NO：2之胺基酸序列具有95%或更高一致性且在胺基酸位置2處保留絲胺酸殘基的Orf2798；與SEQ ID NO：4之胺基酸序列具有95%或更高一致性且在胺基酸位置124處保留蘇胺酸殘基的Orf3866；與SEQ ID NO：6之胺基酸序列具有95%或更高一致性且在胺基酸位置91處保留絲胺酸殘基的Orf5175；及與SEQ ID NO：8之胺基酸序列具有95%或更高一致性且在胺基酸位置164處保留絲胺酸殘基的Orf5387。在某些實施例中，經修飾之抗真菌鏈黴菌分離株進一步：(i)包含編碼包含SEQ ID NO：9之核苷酸序列代替SEQ ID NO：23之核苷酸序列的Orf4755的核酸；且/或(ii)缺乏功能性Orf682蛋白；且/或(iii)缺乏功能性Orf4868蛋白。在此類型之特定實施例中，缺乏功能性Orf682蛋白及/或缺乏功能性Orf4868蛋白歸因於編碼Orf682蛋白及/或Orf4868蛋白的基因中之框移突變。

在特定實施例中，經修飾之抗真菌鏈黴菌分離株編碼以下中之一或多者或全部：與SEQ ID NO：2之胺基酸序列具有98%或更高一致性且在胺基酸位置2處保留絲胺酸殘基的Orf2798；與SEQ ID NO：4之胺基酸序列具有98%或更高一致性且在胺基酸位置124處保留蘇胺酸殘基的Orf3866；與SEQ ID NO：6之胺基酸序列具有98%或更高一致性且在胺基酸位置91處保留絲胺酸殘基的Orf5175；及與SEQ ID NO：8之胺基酸序列具有98%或更高一致性且在胺基酸位置164處保留絲胺酸殘基的 Orf5387。在某些實施例中，經修飾之抗真菌鏈黴菌分離株進一步：(i)包含編碼包含SEQ ID NO：9之核苷酸序列代替SEQ ID NO：23之核苷酸序列的Orf4755的核酸；且/或(ii)缺乏功能性Orf682蛋白；且/或(iii)缺乏功能性Orf4868蛋白。在此類型之特定實施例中，缺乏功能性Orf682蛋白及/或缺乏功能性Orf4868蛋白歸因於編碼Orf682蛋白及/或Orf4868蛋白的基因中之框移突變。

在又其他實施例中，經修飾之抗真菌鏈黴菌分離株編碼以下中之一或多者或全部：與SEQ ID NO：2之胺基酸序列具有99%或更高一致性且在胺基酸位置2處保留絲胺酸殘基的Orf2798；與SEQ ID NO：4之胺基酸序列具有99%或更高一致性且在胺基酸位置124處保留蘇胺酸殘基的Orf3866；與SEQ ID NO：6之胺基酸序列具有99%或更高一致性且在胺基酸位置91處保留絲胺酸殘基的Orf5175；及與SEQ ID NO：8之胺基酸序列具有99%或更高一致性且在胺基酸位置164處保留絲胺酸殘基的Orf5387。在某些實施例中，經修飾之抗真菌鏈黴菌分離株進一步：(i)包含編碼包含SEQ ID NO：9之核苷酸序列代替SEQ ID NO：23之核苷酸序列的Orf4755的核酸；且/或(ii)缺乏功能性Orf682蛋白；且/或(iii)缺乏功能性Orf4868蛋白。在此類型之特定實施例中，缺乏功能性Orf682蛋白及/或缺乏功能性Orf4868蛋白歸因於編碼Orf682蛋白及/或Orf4868蛋白的基因中之框移突變。

在另其他實施例中，經修飾之抗真菌鏈黴菌分離株編碼以下中之一或多者或全部：包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之Orf2798、包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列之Orf3866、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之Orf5175及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之Orf5387。在某些實施例中，經修飾之抗真菌鏈黴菌分離株進一步：(i)包含編碼包含SEQ ID NO：9之核苷酸序列代替SEQ ID NO：23之核苷酸序列的Orf4755的核酸；且/或(ii)缺乏功能性Orf682蛋白；且/或(iii)缺乏功能性Orf4868蛋白。在此類型之特定實施例中，缺乏功能性Orf682蛋白及/或缺乏功能性Orf4868蛋白歸因於編碼Orf682蛋白及/或Orf4868蛋白的基因中之框移突變。

在相關實施例中，經修飾之抗真菌鏈黴菌：(i)包含編碼包含SEQ ID NO：9之核苷酸序列代替SEQ ID NO：23之核苷酸序列的Orf4755的核酸；且/或(ii)缺乏功能性Orf682蛋白；且/或(iii)缺乏功能性Orf4868蛋白。在此類型之特定實施例中，缺乏功能性Orf682蛋白及/或缺乏功能性Orf4868蛋白歸因於編碼Orf682蛋白及/或Orf4868蛋白的基因中之框移突變。

在具體實施例中，經修飾之抗真菌鏈黴菌分離株包含具有ATCC寄存號PTA-122342之經修飾之抗真菌鏈黴菌分離株的免疫原性及/或物理及/或基因特徵。在更具體實施例中，經修飾之抗真菌鏈黴菌為具有ATCC寄存號PTA-122342之分離株，或具有ATCC寄存號PTA-122342之分離株之後代及/或衍生物。在一相關態樣中，本發明之所有經修飾之抗真菌鏈黴菌亦以分離的經修飾之抗真菌鏈黴菌分離株形式提供。

具有以下核苷酸序列之引子組亦包括於本發明中：SEQ ID NO：29及30；SEQ ID NO：31及32；SEQ ID NO：33及34；SEQ ID NO：35及36；SEQ ID NO：37及38；SEQ ID NO：39及40；SEQ ID NO：41及42；SEQ ID NO：43及44；SEQ ID NO：45及46；SEQ ID NO：47及48；SEQ ID NO：49及50；及/或其任何組合。另外，包含該等引子組中之一或多者的套組亦為本發明之一部分。此外，在檢驗法中使用此等引子以識別本發明之抗真菌鏈黴菌基因組亦包括於本發明中。

藉由參考圖式、實施方式及實例將更好地瞭解本發明之此等及其他態樣。

圖1描繪用作描述於以下實例中之基於PCR篩選之突變標記的抗真菌鏈黴菌BM38基因組上11個多形現象之位置。

本申請案根據35 U.S.C.§ 119(c)規定主張2016年12月6日申請之美國臨時申請案第62/430,455號的優先權，其內容以全文引用之方式併入本文中。

開發用於諸如人類藥品或農業應用之商業應用之細菌次級代謝物或天然產物存在難題，諸如克服來自親本型/野生型生物之所需化合物之低產率。過去數十年內吾等對天然產物生物性地合成之理解的進展顯示以若干方式可調節及控制次級代謝物之產生。在大多數情況下，用於細菌天然產物生物性地合成之基因，包括負責前驅體形成、結構總成、組裝後修飾、自抗性及自調節的基因，在細菌染色體上叢集在一起。天然產物之生物性地合成可由胞外及胞內信號傳導分子引起，該等傳導分子與控制超過一種產物產生之路徑特異性調節因子或多效性調節因子相互作用。在此等調節基因或系統中之任一者中發生的突變可增加、減少或消除抗生素產生。

菌株改良可在抗生素或其他微生物次級代謝物之成本效益工業規模生產中起作用。能夠產生特定代謝物之經提高之產率的突變菌株可藉由無規突變、藉由靶向破壞特異性基因或藉由引入消除生物性地合成路徑中之瓶頸的基因來產生。基因操作調節基因以及生物性地合成基因以產生特異性次級代謝物之超高產量已證實為放線菌(actinomycete)菌株改良之強力且成功的策略。在本發明之一特定態樣中，已經鑑別了抗真菌鏈黴菌的關鍵編碼序列，當經修飾及/或消除時，其產生具有出於商業目的生物性地合成及/或產生持久殺菌素的改良之特性的分離株。

先前已報導來自容納持久殺菌素生物性地合成基因叢集及其側接區域之野生型抗真菌鏈黴菌ATCC 21013的116千鹼基對DNA序列[US.8,188,245，其以全文引用的方式併入本文中]，且其可於GenBank中得到[寄存編號DQ403252]。如以下所指示，BM38-2(ATCC第PTA-122342號)之總基因組序列已經確定且與野生型基因組相比。如下文所示，此比較分析允許識別各基因組之間的至少77個多形現象或突變差異且選擇七(7)個關於ATCC第PTA-122342號之改良之特性的關鍵開放閱讀框架。然而，出乎意料地，此等七個關鍵開放閱讀框架中無一者與抗真菌鏈黴菌染色體之持久殺菌素生物性地合成基因叢集及其側接區域相關。然而無論如何，藉由標準重組技術，此等七個關鍵開放閱讀框架之修飾使得易於構築具有與先前報導之分離株相當或甚至優良特性的新穎經修飾之抗真菌鏈黴菌分離株。

在描述中為方便起見單數術語之使用決不意欲如此限制。因此例如，除非另外說明，否則提及「分離株」包括提及該等分離株中之一或多者。除非另外說明，否則複數術語之使用亦並不意欲為限制性。

如本文所用，除非另外指示，否則術語「大約」可與術語「約」互換使用，且通常表示值在所指示之值之百分之二十五內，例如，持久殺菌素產量增加「約」4倍可為增加3至5倍。

如本文所用，在兩個序列之胺基酸殘基一致時，一個胺基酸序列與第二個胺基酸序列100%「一致」。因此，在兩個胺基酸序列之50%胺基酸殘基一致時，一個胺基酸序列與第二個胺基酸序列50%「一致」。序列比較在由給定蛋白(例如蛋白或經比較之一部分多肽)包含之胺基酸殘基之連續嵌段內進行。在一特定實施例中，考慮可以其他方式改變兩個胺基酸序列之間之對應性的經選擇之缺失或插入。

如本文所用，核苷酸及胺基酸序列百分比一致性可使用具有比對預設參數及一致性預設參數之C,MacVector(MacVector,Inc.Cary,NC 27519)、Vector NTI(Informax,Inc.MD)、Oxford Molecular Group PLC(1996)及the Clustal W演算法來測定。此等市售程式亦可用於使用相同或類似預設參數測定序列相似性。或者，可使用在預設過濾條件下之Advanced Blast檢索，例如，使用預設參數使用GCG(Genetics Computer Group,Program Manual for the GCG Package,Version 7,Madison,Wisconsin)堆積程式。

如本文所用，包含「缺乏功能性(lack of a functional/lacks a functional)」多肽(例如Orf682)之生物為不表現該多肽及/或表現經修飾之多肽的生物，該經修飾之多肽具有對應野生型多肽之至多10%天然生物功能，例如截短酶，其對於其天然受質具有之酶活性(例如，酶解效率，亦即，Vmax/Km)為在相同標準檢驗條件下針對對應野生型酶所測定之活性的至多10%。在特定實施例中，生物中「缺乏功能性」多肽等效於該多肽之特異性生物功能不存在。

如本文所用，已為「失去效力」的開放閱讀框架已藉由例如框內缺失、框移、插入及/或點突變修飾，以使得包含已為「失去效力」的開放閱讀框架之生物完全不表現由對應野生型開放閱讀框架編碼之多肽及/或表現具有對應野生型多肽之至多10%天然生物功能的經修飾之多肽。在特定實施例中，不存在由包含已為「失去效力」之開放閱讀框架之生物中對應野生型開放閱讀框架所編碼的多肽之特異性生物功能。

如本文所用，「基因叢集」為一組在染色體上分組在一起的基因要素，其蛋白產物具有相關功能，諸如形成天然產物生物性地合成路徑。

保守取代為通常不實質上改變分子活性(特異性或結合親和力)的胺基酸取代。保守胺基酸取代通常涉及一種胺基酸取代另一具有類似化學特性(例如，電荷或疏水性)的胺基酸。下表展示示例性保守胺基酸取代：

經修飾之抗真菌鏈黴菌之製備

用於實施所揭示之實施例的適合方法及材料描述如下。另外，一般熟習此項技術者熟知之任何適當方法或技術可用於執行所揭示之實施例。一些適用於本發明之習知方法及技術描述於以下中，例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press,2001；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates,1992(及2000之增刊)；Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，第4版，Wiley & Sons,1999；Harlow及Lane,Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1990；Harlow及Lane,Using Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999；及Kieser,T.,Bibb,M.J.,Buttner,M.J.,Chater,K.F.，及Hopwood,D.A.：Practical Streptomyces genetics,John Innes Centre,Norwich Research Park,Colney,Norwich NR4 &UH,England,2000。

可製備重組抗真菌鏈黴菌表現質體載體以用於製備本發明之經修飾之抗真菌鏈黴菌分離株。在一些實施例中，經工程改造之重組抗真菌鏈黴菌載體包含抗真菌鏈黴菌之至少一個經選擇之開放閱讀框架。在某些實施例中，經工程改造之重組抗真菌鏈黴菌載體包含在啟動子控制下表現的抗真菌鏈黴菌之至少一個經選擇之開放閱讀框架。在其他實施例中，啟動子為強力的組成性鏈黴菌啟動子，其在載體表現於抗真菌鏈黴菌之菌株中時導致持久殺菌素之提高的產量。在一些實施例中，開放閱讀框架可操作地與異源啟動子而非其自身天然的啟動子連接。舉例而言，其可操作地與組成性啟動子(諸如強力的組成性表現啟動子或可誘導的啟動子)連接。在具體實施例中，強力的組成性啟動子為來自紅黴素生產者(紅色糖多孢菌，Saccharopolyspora erythraea)之ermE ^*p。在其他實施例中，可誘導的啟動子為硫鏈絲菌(thiostrepton)可誘導的啟動子tipA。在又其他實施例中，採用P(nitA)-NitR系統[Herai等人，Proc Natl Acad Sci U S A.,101(39)：14031-14035(2004)]或鏈黴菌啟動子SF14。在另其他實施例中，採用安普黴素(apramycin)抗性基因amRp之天然啟動子。在又其他實施例中，採用P_hrdB、P_tcp830及/或Pneos。在某些實施例中，經工程改造之重組載體包含含有SEQ ID NO：1之核苷酸序列的開放閱讀框架orf2798及/或業經失去效力的開放閱讀框架orf682。

因此，可構築重組抗真菌鏈黴菌菌株，其相比於野生型抗真菌鏈黴菌菌株能夠產生提高之持久殺菌素產率。在某些實施例中，經工程改造之重組抗真菌鏈黴菌菌株包含來自抗真菌鏈黴菌之至少一個經選擇之開放閱讀框架，該抗真菌鏈黴菌經引入至染色體上且在諸如強力的組成性鏈黴菌啟動子之啟動子控制下表現，導致經工程改造之菌株中之持久殺菌素之提高的產量。在其他實施例中，異源啟動子而非其自身天然的啟動子驅使抗真菌鏈黴菌中引入之開放閱讀框架的表現。舉例而言，其可操作地與組成性啟動子(諸如強力的組成性表現啟動子或可誘導的啟動子)連接。在一些實施例中，強力的組成性啟動子為ermE ^*p。在其他實施例中，可誘導的啟動子為tipA。在一些實例中，採用P(nitA)-NitR系統[參見上文]或SF14啟動子。在另其他實施例中，組成性表現啟動子為amRp。在又其他實施例中，採用P_hrdB、P_tcp830及/或Pneos啟動子。

在一些實施例中，經工程改造之菌株包含來自抗真菌鏈黴菌之開放閱讀框架orf3866。在此類型之特定實施例中，開放閱讀框架orf3866可操作地與異源啟動子連接。舉例而言，其可與諸如ermE ^*p之強力的組成性啟動子連接。在其他實例中，開放閱讀框架orf3866可操作地與啟動子tipA、SF14、amRp、P_hrdB、P_tcp830及/或Pneos連接。

在其他實施例中，經工程改造之菌株編碼變化之開放閱讀框架orf4868。開放閱讀框架orf4868可藉由插入型破壞、框內缺失、框移及/或點突變而失去效力。在一些實例中，開放閱讀框架orf4868係藉由框內缺失而失去效力。一般而言，orf4868內任何內部框內缺失由於其不完整性應產生orf4868之無效功能。在相關實施例中，經工程改造之菌株包含抗真菌鏈黴菌之兩個、三個、四個、五個、六個、七個或更多個開放閱讀框架。

在某些實施例中，經修飾之抗真菌鏈黴菌分離株衍生自野生型親本菌株，例如但不限於，抗真菌鏈黴菌American Tissue Culture Company(ATCC)第21013號。在其他實施例中，抗真菌鏈黴菌之經工程改造之菌株衍生自習知突變菌株，例如但不限於，抗真菌鏈黴菌ATCC 31729、抗真菌鏈黴菌ATCC 31730及抗真菌鏈黴菌ATCC 31731。

在某些實施例中，持久殺菌素之提高之產量增加至少1.2倍，諸如相比於野生型抗真菌鏈黴菌菌株，持久殺菌素產量增加至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍，包括但不限於增加1.2至10倍、增加1.2至4.6倍、及增加約2至5倍。

在某些實施例中，經修飾之抗真菌鏈黴菌可藉由將包含至少一個提高持久殺菌素產量之開放閱讀框架的重組質體整合至抗真菌鏈黴菌之親本菌株之染色體中來構築。整合之接合載體可具有或可經工程改造以具有強力的組成性鏈黴菌啟動子。在一些實施例中，質體可能缺乏鏈黴菌複製子且可藉由位點特異性單一交換同源重組整合至染色體中。在其他實施例中，質體可以游離質體形式存在。在一些實施例中，接合載體可經工程改造，其中質體插入物攜帶部分或完全缺失之相關基因，及其側接區域，其在雙交換同源重組之後可整合至染色體中以產生框內缺失突變。

來自抗真菌鏈黴菌之重組菌株之持久殺菌素的產生

由本發明提供之抗真菌鏈黴菌之重組菌株提供產生提高之持久殺菌素含量的方法。此項技術中之此技術進展使得與持久殺菌素之產生相關之成本節省顯著。在某些實施例中，產生持久殺菌素之方法包含在足以產生持久殺菌素的條件下培養所揭示之抗真菌鏈黴菌之重組菌株。在其他實施例中，該方法進一步包含在培養之後自培養基分離持久殺菌素。在另其他實施例中，該方法進一步包含測定產生之持久殺菌素之抗菌活性，諸如藉由HPLC分析或使用金黃色葡萄球菌ATCC 29213或枯草芽孢桿菌(Bacillis subtilis)ATCC 6633作為指示微生物之生物檢驗。

在一些實施例中，持久殺菌素如先前針對持久殺菌素之產生所描述藉由利用醱酵條件由所揭示之抗真菌鏈黴菌菌株產生[Higashide等人，J.Antibiot.21：126-137(1968)]。產生後，化合物可經純化及/或分析，包括HPLC分析。自生長培養基產生持久殺菌素及收集此化合物之方法可見於U.S.4,465,771中，其以全文引用之方式併入本文中。

在特定實施例中，將本發明之所揭示之抗真菌鏈黴菌分離株在搖動器(諸如在30℃下以225rpm搖動48小時)上於胰酶大豆培養液(tryptic soy broth，TSB)中培養，且隨後轉移至持久殺菌素生產培養基(enduracidin production medium，EPM，下表1)維持一段時間以用於持續醱酵，諸如至少五天且至多十一天，包括連續醱酵5、6、7、8、9、10或11天。在更特定實施例中，藉由野生型及衍生菌株產生持久殺菌素在自動醱酵槽中進行。

AA為胺基酸序列；NA為核酸序列。

生物寄存

在滿足布達佩斯條約(the Budapest Treaty)之要求之條件下以下生物材料之培養物已寄存於以下國際儲藏所中：美國菌種保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)10801 University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209,U.S.A.。

參考以下非限制性實例可更好地理解本發明，該等實例作為本發明之例示而提供。為了更全面說明本發明之較佳實施例，呈現以下實例。然而，其決不應解釋為限制本發明之廣泛範疇。

實例 實例1 經修飾之抗真菌鏈黴菌分離株

用於持久殺菌素生物性地合成之抗真菌鏈黴菌生物質量之產生

抗真菌鏈黴菌之醱酵可在具有監測及控制pH值、溫度、氧氣、充氣及攪拌之系統的深槽衛生設計工業醱酵槽中完成。各經醱酵之批次之抗真菌鏈黴菌由生產菌種的具有特徵及受控之工作菌種儲備引發，該等生產菌種儲存於安全位置中且保存於低溫環境中。醱酵製程以三個階段進行，隨後為下游進一步加工：

階段I：

含有10⁷-10¹⁰個孢子/mL之工作菌種培養物可用於起始醱酵批次。一至五個冷凍菌種小瓶自低溫儲存倉擷取，且自然地在工作台上解凍或置於28-32℃下之水浴中直至內容物解凍。將經解凍之培養物無菌地轉移至在室溫下保存的800-1000mL無菌水中，且輕輕混合至培養物再懸浮。

階段II：

將再懸浮之培養物無菌地轉移至菌種培養基中。菌種培養基由以下組成：葡萄糖(0.5g/L)、糊精(Dextrin)(2.5g/L)、玉米漿(1.0-4.0mL/L)、大豆粉(3.0g/L)、硫酸銨(0.25g/L)、磷酸一鉀(0.13-0.54g/L)、硫酸亞鐵(0.00-0.5g/L)、氫氧化鉀(0.13mL/L)、沈澱碳酸鈣(1.5g/L)、基於聚矽氧之去泡劑(0.1mL/L)及適量水。將培養基在125℃下殺菌45分鐘，且隨後冷卻至28℃。使用無菌水將培養基之體積調至所需工作體積。將pH值調至6.6-6.8。菌種規模擴大循環之操作參數包括：視容器之大小及組態而定，28℃±2℃之培養溫度、0.5-1.5kg/cm²之內部壓力、2-4Nm³/分鐘之充氣速率及大約80rpm之攪拌速率。監測但不控制pH值、耗氧量及黏度。使培養物生長50-60小時，然後轉移至主生產醱酵槽中。轉移時之黏度應在350-600cps範圍內，且pH值應

6.0，且耗氧量應增加。將菌種培養物無菌地轉移至主醱酵培養基中以完成醱酵循環。

階段III：

主生產醱酵槽培養基組成包括：玉米粉(13.0-15.0w/v%)、玉米蛋白粗粉(3.0-6.0w/v%)、棉籽粉(0.3w/v%)、玉米漿(0-0.6v/v%)、氯化鈉(0.3w/v%)、硫酸銨(0.25-0.6w/v%)、乳酸(0-0.5v/v%)、氯化鋅(0.01w/v%)、硫酸亞鐵(0.0-0.02w/v%)、氫氧化鉀(0.20-0.5v/v%)、硫酸鈣(0.0-0.5w/v%)、沈澱碳酸鈣(0.5w/v%)、α澱粉酶(0.056w/v%)、氫氧化鉀(0.05v/v%)、大豆油(0.5-2.0v/v%)、去泡劑及適量水。根據所列出之順序添加成分。將水添加至各成分中直至α澱粉酶，隨後將所得組合物加熱至80℃維持15分鐘，以使酶分解複合碳水化合物。隨後添加其餘成分，將pH值調至pH 6.6-6.8，且添加適量水。將培養基在125℃下殺菌45分鐘，冷卻至28℃，且添加適量水至所需工作體積。

將來自菌種醱酵槽之內容物轉移至主醱酵培養基中，且將醱酵槽設定為以下條件：溫度為28℃、充氣速率為40Nm³/分鐘、內部壓力為0.5kg/cm²，且攪拌速率當量設定成約1.85kW/m³。醱酵循環起始兩小時後改變操作條件：將溶氧設定為12.75ppm，將充氣提高至50Nm³/分鐘且將內部壓力提高至0.7kg/cm²。其後調節充氣速率、內部壓力及攪拌速率以確保溶氧不為速率限制決定因素。當黏度提高至溶氧受限的點時，將無菌水添加至培養物中。在整個循環中，謹慎控制發泡以防止污染或流出。氧氣需求增加後大約3小時開始控制pH值。在整個醱酵循環中控制及/或監測以下參數：pH值、充氣、溶氧、CO₂、黏度、純度、攪拌速度、內部壓力及殘餘糖。直至細菌生長停止，pH值維持在6.8，但隨後使其自然地改變直至收集。典型的醱酵循環為220-300小時。當生物檢驗效價高於5,000μg/L、pH上升至pH 7.5或更高、黏度降低且氧氣需求停止時，準備收集培養物。藉由將培養物加熱至70℃維持30分鐘以使細菌失去活性來收集醱酵，且隨後將收集之流體冷卻至25℃-28℃。

下游加工：

將水自生物質量移除，生物質量乾燥，隨後調配為預混物。

實例2 優化抗真菌鏈黴菌持久殺菌素產量之作用。

多年來藉由處理親本菌株使產率改良(如表3中所列出)。菌株BM38-2(PTA-122342)產生最高持久殺菌素產率。菌株藉由使用一系列培養及物理處理來處理GAB-453(ATCC 31729)而優化。

參考文獻：專利4,465,771；APR 14, 1984, Nogami，等人Takeda Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan。

參考文獻：專利3,577,530, 1971年5月4日，針對ATCC 21388。

1.ATCC 21013：抗真菌鏈黴菌初始野生菌株B-5477，由Takeda寄存

2.ATCC 21014：由B-5477之γ-輻射得到之突變體，稱為B-5477m之菌株，由Takeda寄存

3.ATCC 31729：由B-5477之UV-輻射得到之突變體，稱為GAB-453之菌株，由Takeda寄存

4.ATCC 31730：藉由在含有m-氟-DL-酪胺酸(MFT)之瓊脂板上生長B-5477而獲得之突變體；稱為Emt-36-3之突變體，由Takeda寄存

5.ATCC 31731：藉由使GAB-453首先經歷N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍隨後經歷m-氟-DL-酪胺酸(MFT)獲得之雙突變體，導致稱為Emt 2-140之突變菌株，由Takeda寄存

6.ATCC 21388：與抗真菌鏈黴菌(大孢子鏈黴菌，S.macrosporeus)密切相關之菌株，由Squibb and Sons寄存。

就最高至最低持久黴素生物性地合成而言：

ATCC第PTA-122342號>ATCC 31731>ATCC 31730>ATCC 31729>ATCC 21013及ATCC 21014。

值得注意地，當ATCC PTA-122342與次最高產分離株相比時，所獲得之持久殺菌素提高超過兩倍，且當ATCC PTA-122342與親本菌株，野生型相比時，所獲得之持久殺菌素提高超過12倍。

實例3 對抗真菌鏈黴菌分離株之基因組分析

比較性基因組分析在抗真菌鏈黴菌野生型菌株ATCC 21013(B- 5477)與本發明之衍生菌株BM38-2之間進行，本發明之衍生菌株包括持久殺菌素(持久黴素)生物性地合成基因叢集周圍的區域。

已鑑別總共77個DNA序列變異，區分物理及培養操作親本B-5477菌株之作用。藉由將11個位於整個BM38-2基因組中之代表性變異選作突變標記(參見圖1)，自基因組分析獲得之資訊准許迅速及確定的菌株比較。PCR引子經設計以用於每一突變標記，其將擴增含有突變部位之DNA片段以用於後續定序及比較(參見表4)。

靶向標記區域之PCR引子用於分析五(5)個產生持久黴素的菌株加一(1)個經由ATCC可用之密切相關之菌株，包括野生型及由Takeda寄存之突變體，且與BM38-2菌株相比。表5概括結果，且展示11個突變標記處之DNA標籤。

^#突變標記編號；^*期望PCR產物大小^†野生型菌株(WT)：ATCC 21013

WT=匹配親本野生型。M=匹配PTA-122342變異序列*與抗真菌鏈黴菌密切相關之大孢子鏈黴菌菌株

WT=匹配親本野生型。M=匹配PTA-122342突變序列

表5A-5B鑑別親本菌株(ATCC 21013 B-5477)與先前報導的菌株之間的基因差異。大多數此等先前報導之菌株為ATCC 21013 B-5477之衍生菌株，其經由培養及/或物理操作獲得。BM38-2(ATCC第PTA-122342號)可見最顯著的基因差異。正如顯而易見，表4之引子亦可用於從其他抗真菌鏈黴菌菌株及/或密切相關之鏈黴菌物種明確地識別出BM38-2(PTA-122342)。

實例4 抗真菌鏈黴菌BM38-2中經選擇之突變之分析

抗真菌鏈黴菌ATCC第PTA-122342號工業菌株係經由重複多輪突變誘發隨後選擇出會產生高持久黴素之突變體而產生的。為進一步理解引入ATCC第PTA-122342號中可能促使持久黴素之產率提高之突變，測定ATCC第PTA-122342號之總基因組序列並與其野生型抗真菌鏈黴菌前導子之序列相比。此比較性分析識別出在兩個基因組之間至少77個多形現象或突變差異。出人意料地，在具有持久黴素生物性地合成基因叢集之染色體之區域中僅檢測到一個差異。此差異為endC基因之單一個核苷酸改變。endC基因中核苷酸6,260,317自C突變成T導致CTC密碼子變為CTT密碼子，因為兩者皆為白胺酸之密碼子，所以是一種沉默突變。因此，此突變不大可能在觀測到之BM38-2中之持久黴素產率的增加中起重要作用。在持久黴素基因叢集內部存在其他突變表明，負責提高BM38-2中之持久黴素之產率的染色體變化可能在於多效性(非路徑特異性)調節元件或位於基因組其他地方中之全局調節基因。

放線菌中若干反應調節因子已展示在超過一個路徑中會影響天然產物生物性地合成。關鍵實例為absA1A2基因座，其見於天藍色鏈黴菌(S.coelicolor)之CDA基因叢集中，其編碼與發現於抗真菌鏈黴菌之持久黴素生物性地合成基因叢集中之系統相似的雙組分信號轉導系統。AbsA2之磷酸化形式經證明可藉由直接干擾CDA、放線菌紫素(actinorhodin)及十一烷基靈菌紅素(undecylprodigiosin)生物性地合成基因叢集之路徑特異性調節因子之表現來抑制抗生素產生。抑制AbsA2激酶活性之突變進而提高抗生素產量。多效性調節之另一實例見於棒狀鏈黴菌(S.clavuligerus) 中，其中ccaR，一種在頭黴素(cephamycin)C叢集內可見之基因編碼調節蛋白，其控制頭黴素C及克拉維酸(clavulanic acid)產量。

ATCC第PTA-122342號基因組(其可能具有最大可能性與持久黴素產率增加相關)中之突變係為存在於生物資訊學分析預測的基因中以編碼調節產物的突變，包括具有多效性調節特性的突變。在與野生型抗真菌鏈黴菌菌株相比具有突變差異的抗真菌鏈黴菌BM38-2基因組中識別的推定調節基因之實例提供於下文中。[以下實例中之各者的突變差異係以缺少星號突出顯示，且不同/缺少/插入核苷酸係以粗體表示。]

序列比較

orf682：預測以編碼含有螺旋-轉角-螺旋(HTH)DNA結合域之TetR家族中的調節蛋白。額外G插入誘使框移的同聚物軌道中。

[SEQ ID NO：11]

[SEQ ID NO：25] *************************************************

>WT_682經轉譯之基因產物

[SEQ ID NO：26]

>BM38.2_682經轉譯之基因產物

VVSLTDKMSANAISDVWTAGGRRPLVMLRGGGRGRGRWSERAPDAG[SEQ ID NO：12]

orf2798：預測以編碼MurR/RpiR家族中之DNA結合轉錄調節因子。其含有螺旋-轉角-螺旋(HTH)及糖異構酶(SIS)域。G至A突變導致Gly變為Ser。

[SEQ ID NO：1]

[SEQ ID NO：15] ***

>WT_2798經轉譯之基因產物

[SEQ ID NO：16]

>BM38.2_2798經轉譯之基因產物

[SEQ ID NO：2]

orf3866：預測以編碼OmpR家族中之DNA結合反應調節因子。其含有REC域，其自鏈黴菌抗生素調節蛋白(SARP)之雙組分系統及翼狀螺旋(wHTH)域特徵中之感測子配偶體(sensor partner)接收信號。G至A突變導致Ala變為Thr。

[SEQ ID NO：3]

[SEQ ID NO：17] ***************************************

>WT_3866經轉譯之基因產物

[SEQ ID NO：18]

>BM38.2_3866經轉譯之基因產物

[SEQ ID NO：4]

orf4755：預測以編碼σ-E家族中之RNA聚合酶σ-70因子。A Arg密碼子中之T至G突變(CGT->CGG)為沉默突變。

[SEQ ID NO：9]

[SEQ ID NO：23] *********

>WT_4755經轉譯之基因產物

[SEQ ID NO：24]

>BM38.2_4755經轉譯之基因產物

[SEQ ID NO：10]

orf4868：預測以編碼轉錄調節因子蛋白。其含有REC信號接收域，其自雙組分系統中之感測子配偶體接收信號。串聯重複序列中之缺失(缺失C)導致框移突變。

[SEQ ID NO：13]

[SEQ ID NO：27] *************************

>WT_4868經轉譯之基因產物

[SEQ ID NO：28]

>BM38.2_4868經轉譯之基因產物

[SEQ ID NO：14]

orf5175：預測以編碼組胺酸激酶轉錄調節因子蛋白。其具有REC信號接收域，其自雙組分系統中之感測子配偶體接收信號。C至T突變導致Pro變為Ser。

[SEQ ID NO：5]

[SEQ ID NO：19] ******************

>WT_5175經轉譯之基因產物

[SEQ ID NO：20]

>BM38.2_5175經轉譯之基因產物

[SEQ ID NO：6]

orf5387：預測以編碼MerR家族中之轉錄調節因子。其具有HTH DNA結合域及REC域，其自雙組分系統中之感測子配偶體接收信號。A至C突變導致Tyr變為Ser。

[SEQ ID NO：7]

[SEQ ID NO：21] ******************************************

>WT_5387經轉譯之基因產物

[SEQ ID NO：22]

>BM38.2_5387經轉譯之基因產物

[SEQ ID NO：8]

應理解，提供以描述根據本發明之核酸及多肽之所有鹼基大小或胺基酸大小及所有分子量或分子質量值在習知量測偏差內近似。

【生物材料寄存】

國內寄存資訊

食品工業發展研究所；107年3月15日；BCRC 910832

國外寄存資訊

US美國；美國菌種保存中心(American Type Culture Collection,ATCC)；2015/08/05；PTA-122342

Claims

一種經修飾之抗真菌鏈黴菌分離株，其具有ATCC寄存號PTA-122342(BCRC 910832)；或為具有ATCC寄存號PTA-122342(BCRC 910832)之分離株之後代。
一種產生持久殺菌素之方法，該方法包含在培養基中於足以產生持久殺菌素之條件下培養如請求項1之經修飾之抗真菌鏈黴菌分離株。
如請求項2之方法，其進一步包含自該培養基分離該持久殺菌素。