CZ174496A3 - Izolovaný segment DNA, rekombinantní DNA, plasmid, hostitelská buňka, geny a způsob výroby přírodního nebo nového avermektinu - Google Patents

Description

Vynález se týká nových sekvencí DNA, které kódují komplex rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy (BCKDH) organismu spadajícího do rodu Streptomyces. Také se týká produkce rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy - deficientního [(bkd)-deficientního] mutantu technologií genového inženýrství. bkd-Deficientní mutant nevykazuje aktivitu rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy a je užitečný pro fermentační produkci nových (nepřirozených) avermektinu.

Dosavadní stav techniky

Streptomyces avermitilis produkuje osm rozdílných, ale příbuzných antiparazitických polyketidových sloučenin, které jsou označovány názvem avermektiny. Avermektinový komplex produkovaný S. avermitilis obsahuje čtyři hlavní složky: Ala, A2a, Bia a B2a a čtyři vedlejší složky: Alb, A2b, Blb a B2b. Struktura těchto různých složek je znázorněna dále.

o2

Avermektin R¹ R² X-Y

Ala	sek.butyl	Me	CH=CH
Alb	isopropyl	Me	CH=CH
A2a	sek.butyl	Me	ch2-ch(oh)
A2b	ispropyl	Me	ch2-ch(oh)
Bia	sek.butyl	H	CH=CH
Blb	isopropyl	H	CH=CH
B2a	sek.butyl	H	ch2-ch(oh)
B2b	ispropyl	H	ch2-ch(oh)
	Polyketidová struktura	avermektinu	je odvozena

sedmi acetátových molekul, pěti propionátových molekul a jedné molekuly α-rozvětvené mastné kyseliny, kterou je bud S(+)-2-methylmáselná kyselina nebo isomáselná kyselina. Označení A se vztahuje k avermektinu, v němž je 5-substituentem methoxyskupina a označení B se vztahuje k avermektinu, v němž je 5-substituentem hydroxyskupina. Označení 1 se vztahuje k avermektinům, v nichž je dvojná vazba přítomna v poloze 22-23 a označení 2 k avermektinům, obsahujícím v poloze 22 vodík a v poloze 23 hydroxyskupinu. Konečně v poloze C-25 jsou možné dva substituenty: v avermektinech ze série a je přítomna sek.butylskupina (získaný zavedením S(+)-2-methylmáselné kyseliny) a v avermektinech ze série b'je přítomna isopropylskupina (získaná zavedením kyseliny isomáselné). Přehled viz Fisher Μ. H. a Mrozik Η., 1984, Macrolide Antibiotics, Academie Press, kapitola 14.

Pod označením přírodní avermektiny se rozumějí avermektiny produkované S. avermitilis, v nichž je substituentem v poloze 25, jak již bylo uvedeno, bud isopropylskupina nebo sek.butylskupina. Avermektiny, které v poloze 25 obsahují jinou skupinu než isopropylskupinu nebo sek.butylskupinu, jsou v tomto popisu označovány názvem nové nebo nepřirozené avermektiny.

Jedna metabolická dráha vedoucí k přirozeným arozvětveným mastným kyselinám ve formě CoA zahrnuje reakci α-rozvětvené aminokyseliny, isoleucinu a valinu, s rozvětvená aminokyselina transaminasou, po níž se provede reakce s rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasou. (Alternativně mohou vzniknout rozvětvený alifatický acyl-CoA-deriváty novou syntézou z rozvětvených α-ketokyselin.) Tyto metabolické dráhy jsou znázorněny dále.

CH₃CHCH(NH₂)COOH)

CH3CH2CHCH (NH₂) cooh ch₃ valin ch₃ isoleucin rozvětvená aminokyselina transaminasa transaminasa

CH₃CHCOCOOH

I

CH₃

2-oxoisovalerová kyselina

CH₃CH₂CHCOCOOH

I ch₃

2-oxo-3-methylvalerová kyselina nová syntéza komplex rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy nova syntéza

CH₃CHCO.SCoA I

CH₃ isobutyryl-CoA

CH₃CH₂CHCO.SCoA

I

CH₃

2-methylbutyryl-CoA degradační dráha (propionyl-CoA, methylmalonyl-CoA)

degradační dráha (acetyl-CoA, propionyl-CoA, methylmalonyl-CoA)

Biosyntéza avermektinu

Ri

CHCO.SCoA r₂

Ri

CHCOOH r₂ exogenní rozvětvená mastná kyselina

Nedávno byl izolován mutant S. avermitilis, který nevykazuje žádnou detegovatelnou aktivitu rozvětvená a-ketokyselina dehydrogenasy (BCKDH) v posledně uvedeném enzymu (Hafner et al, 1988, Evropská patentová přihláška EP 284 176 vydaná 20. 10. 1993). Tento mutant byl izolován po standardní chemické mutagenesi kmene S. avermitilis ATCC 31 272 za použití screeníngu na nepřítomnost produkce ¹⁴CO₂ z ¹⁴C-1 značené 2-oxoisokapronové kyseliny (analog leucinu), jako substrátu. Tento mutant není schopen syntetizovat přírodní avermektiny, pokud se k médiu, v němž je fermentován, nepřidá S(+)-2-methylmáselná kyselina nebo kyselina isomáselná nebo nebo její prekursor nesoucí isopropylovou nebo sek.butylovou skupinu (v S-formě). Tento mutant je dále schopen produkovat nové či nepřirozené avermektiny při fermentaci za vodných aerobních podmínek v živné půdě obsahující zvnějšku přidanou příslušnou alternativní karboxylovou kyselinu, jako cyklohexankarboxylovou kyselinu (CHC) nebo její prekursor, jak to bylo uvedeno výše.

Klonování genů kódujících komplex rozvětvená a-ketokyselina dehydrogenasy z S. avermitilis je vysoce žádoucí. Manipulace těchto genů pomocí technik s rekombinantní DNA by měla umožnit produkci přírodních a nových avermektinů. U některých kmenů by bylo možno očekávat zvýšení titru přírodních avermektinů na základě zvýšení počtu kopií genů bkd. Kromě toho, vytvoření ireveresibilně blokovaného kmene bkd, vykazujícího permanentně vypuštěnou nebo modifikovanou aktivitu BCKDH prostřednictvím nahrazení genu, by představovalo zlepšenou alternativu k běžnému mutantu bkd, který byl získán, jak je uvedeno výše, chemickou mutagenesi.

Multienzymové komplexy α-ketokyselina dehydrogenasy, tj. komplex rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasa (BCKDH), komplex pyruvát dehydrogenasa (PDH) a komplex aketoglutarát dehydrogenasa (KGDH), katalyzuj i oxidační de6 karboxylace α-ketokyselin s rozvětveným řetězcem, pyruvátu a α-ketoglutarátu, které jsou spojeny s uvolňováním oxidu uhličitého a tvorbou odpovídajících acyl-CoA a NADH (Perham, R. N., 1991, Biochemistry 30: 8501 až 8512). Každý Z těchto komplexů sestává ze tří různých katalytických enzymů: dekarboxylasy (El), dihydrolipoamid acyltransferasy transacylasy (E2) a dihydrolipoamid dehydrogenasy (E3).

Rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasa (BCKDH) je multienzymovým komplexem, který se skládá ze tří funkčních složek: dekarboxylasy (El), transacylasy (E2) a lipoamid dehydrogenasy (E3). Purifikované komplexy z Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa a Bacillus subtilis se skládájí ze čtyř polypeptidů. Také purifikované savčí komplexy se skládají ze čtyř polypeptidů, Ela, Εΐβ, E2 a E3. Komplex α-ketokyselina dehydrogenasy byl izolován z Bacillus subtilis vykazujícího jak pyruvát, tak rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasovou aktivitu. Tento komplex s dvojí funkcí oxiduje pyruvát a poskytuje mastné kyseliny s rozvětveným řetězcem pro membránové fosfolipidy.

Klonování prokaryontních rozvětvená a-ketokyselina dehydrogenasových genů bylo oznámeno v případě Pseudomonas a Bacillus. Zjistilo se, že v těchto systémech vytvářejí geny kódující BCKDH shluk v operonu. Geny komplexu BCKDH Pseudomonas putida byly klonovány a byla stanovena nukleotidová sekvence této oblasti (Sykes et al., 1987, J. Bacteriol. 169: 1619 až 1625 a Burns et al., 1988, Eur. J. Biochem., 176: 165 až 169 a 176: 311 až 317). Molekulová hmotnost Ela je 45 289, Εΐβ 37 138, E2 45 134 a E3 48 164. Tyto čtyři geny jsou spojeny do shluku o sekvenci Ela, Εΐβ, E2 a E3. Analýza Northern blot ukazuje, že exprese těchto čtyř genů probíhá z jediné mRNA a že tyto geny tvoří operon. Bezprostředně před počátkem Ela kódující oblasti je zde přítomen typický prokaryontní konvenční (consensus) promo7 tor, který umožňuje konstitutivní expresi genů Pseudomonas bkd. Iniciátorový kodon pro Εΐβ kódující oblast je umístěn jen 40 nukleotidů za koncem otevřeného čtecího rámce (ORF) Ela. Naproti tomu mezi ORF Εΐβ a ORF E2 neexistuje žádný intergenový prostor, poněvadž stop kodon ORF Εΐβ představuje triplet bezprostředně předcházející iniciátorový kodon ORF E2. Intergenový prostor mezi ORF E2 a ORF E3 je redukován pouze na dva nukleotidy. Geny Pseudomonas bkd jsou tedy těsně spojeny. Podobně byl klonován operon kódující duální komplex Bacillus subtilis BCKDH/PDH (Hemila et al., 1990,

J. Bacteriol., 172: 5052 až 5063). Tento operon obsahuje čtyři otevřené čtecí rámce kódující čtyři proteiny o velikosti 42, 36, 48 a 50 kilodalton (kDa), u nichž byla prokázána vysoká homologie s podjednotkami Ela, Εΐβ, E2 a E3 shluku Pseudomonas bkd. Nedávno byly také klonovány a sekvenovány geny kódující a a β podjednotky složky El duálního multienzymového komplexu BCKDH/PDH z Bacillus stearothermophilus (odhadovaná molekulová hmotnost a podjednotky je přibližně 41 000 a β podjednotky přibližně 35 000) (Hawkins et al., 1990, Eur. J. Biochem., 191: 337 až 346) .

Dále byla také publikována sekvence četných eukaryontních podjednotek Ela a β BCKDH (humánního, hovězího a krysího původu). Nedávno bylo počítačovou analýzou provedeno srovnání všech publikovaných sekvencí známých pro Ela a Εΐβ složky komplexů PDH a BCKDH z několika druhů (Wexler et al. 1991, FEBS Letters, 282: 209 až 213). Zjistila se zajímavá skutečnost, že několik identifikovaných oblastí a a β podjednotek má vysoce konzervovaný charakter nejen ve všech až dosud popsaných PDH, nýbrž i v jak prokaryontních, tak eukaryontních komplexech BCKDH.

Nedávno byly také tři geny kódující a (bkdA) a β (bkdB) podjednotku El složky a E2 (bkdc) složky komplexu

BCKDH ze Streptomyces avermitilis klonovány, sekvenovány a analyzovány za použití expresního systému pro heterologní geny (Denoya C. D., 1993, Cloned Genes Encoding BranchedChain α-Ketoacid Dehydrogenase Complex from Streptomyces avermitilis, patentová přihláška USA č. 08/100,518, podaná 30. července 1993. Analýza sekvence DNA ukázala přítomnost pravděpodobných sekvencí promotoru transkripce a bkd strukturních genů uspořádaných do shluku organizovaného následujícím způsobem: promotorové sekvence, otevřené čtecí rámce El-α (bkdA), El-β (bkdB) a E2 (bkdC). Dále byl úplný shluk genů S. avermitilis bkdABC klonován za silný promotor T7 z Escherichia coli pro expresi v E. coli, jako hostiteli. Podobně byly klonovány také otevřené čtecí rámce El-a a El-β, buď odděleně nebo dohromady, za promotor T7 a každý ze získaných konstruktů byl zkoušen na expresi. Tyto studie ukázaly, že alespoň dva otevřené čtecí rámce bkd genového shluku S. avermitilis (El-α [bkdA] a El-β [bkdB]) jsou plně přeložitelné při expresi v E. coli. Kromě toho, enzymatické zkoušky zaměřené na analýzu specificky složky El komplexu BCKDH jednoznačně potvrdily, že dva z rekombinantních klonů E. coli, jeden nesoucí celý shluk genů bkd a druhý nesoucí dohromady otevřené čtecí rámce Ela a Εΐβ, vykazují El BCKDH-specifickou enzymatickou účinnost.

Předložený vynález se týká molekulárního klonování a analýzy druhého shluku nových genů kódujících rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasu (BCKDH) ze Streptomyces avermitilis. Tento shluk obsahuje alespoň tři geny (bkdF, bkdG a bkdH) kódující v tom pořadí, v jakém jsou tyto geny uvedeny Ela, Εΐβ a E2 pod jednotku komplexu BCKDH S. avermitilis. Shluk genů bkd, který je zde popsán, je umístěn přibližně 12 kilobází (kb) za prvním bkd shlukem (geny bkdA, bkdB a bkdC), jejích přítomnost nedávno oznámil Denoya C. D. ,

1993, patentová přihláška USA č. 08/100,518, podaná 30. července 1993. Oba shluky mají podobnou organizaci genů a jsou v chromosomu S. avermitilis orientovány ve stejném směru. Odpovídající strukturní geny v obou shlucích vykazují sice vysokou homologii, ale jsou rozdílné.

Kromě toho se vynález také týká konstrukce bkd mutantu technologií genového inženýrství. Mutant bkd nesoucí chromosomální deleci ovlivňující gen bkdF postrádá aktivitu rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy, není schopen růst na isoleucinu, leucinu a valinu, jako jediném zdroji uhlíku a také není schopen produkovat přirozené avermektiny v médiu, které neobsahuje ani S-2-methylmáselnou kyselinu ani isomáselnou kyselinu. Popisovaný mutant je užitečný pro produkci nových (nepřirozených) avermektinů fermentaci v médiu obsahujícím vhodnou alternativní karboxylovou kyselinu, jako je cyklohexankarboxylová kyselina (CHC). Dále se vynález také týká konstrukce mutantu, který nese chromosomální deleci ovlivňující jak gen bkdF, tak genový shluk bkdABC.

Streptomyces obsahují jednu genetickou spojovací skupinu, jeden chromosom, který je často přítomen ve více kopiích v hyfálním oddělení, ale který je ve sporách přítomen pouze v jedné kopii. Genom Streptomyces je mezi prokaryontními organismy charakteristicky velký (5 x 10³ až 7 x 10³ kb; Gladek A. a Zakrzewska J., 1984, FEMS Microbiol. Lett., 24: 73 až 76), což je přibližně dvojnásobek velikosti genomu E. coli.

Jedním zajímavým aspektem genetiky Streptomyces jsou časné chromosomální přesmyky zahrnující obsáhlé delece, které jsou často doprovázeny intenzivními amplifikacemi DNA (Birch A. et al., 1990, J. Bacteriol. 172: 4138 až 4142). Amplifikace a delece jsou co do velikosti u Streptomyces dvakrát až třikrát větší než podobné amplifikace a delece u E. coli a B. subtilis. Byly oznámeny delece představující 18 % chromosomu a amplifikace představující 45 % genomu. Přes inherentní dlouhodobou nestabilitu k duplikaci určitých genů dochází s frekvencí jednou v 10⁴ buňkách. Takové duplikace jsou obvykle vytvořeny nelegitimními fázemi crossing-over, které zahrnují krátké, zčásti homologní sekce DNA při dělení dceřiných chromosomů. Takové duplikační příhody vytvářejí nové úseky DNA ve stejném chromosomu a automaticky mají sklon k tomu, aby po nich následovaly další genové amplifikační nebo eliminační příhody. Více kopií nejen stejného genu, ale také dvou různých genů s vysoce podobnými strukturami bude mít sklon k rekombinaci a vzniku delecí. Inherentní stabilita genu tedy vyžaduje, aby nebyl příliš podobný jakémukoliv jinému genu.

Přítomnost více kopií genu nebo skupiny genů není u Streptomyces neobvyklá. Byla oznámena modulární organizace genů vyžadovaná pro syntézu polyketidové části makro lidového antibiotika erythromycinu v Saccharopolyspora erythraea (Donadio et al., 1991, Science, 252: 675 až 679).

V souvislosti s vynálezem se zjistilo, že Streptomyces avermitilis obsahuje přinejmenším 2 shluky bkd genů, přičemž jeden z nich zahrnuje geny bkdA, bkdB a bkdC a druhý geny bkdF, bkdG a bkdH. Původci tohoto vynálezu předpokládají, že jak shluk genů bkdABC (popsaný nedávno v US patentové přihlášce č. 08/100,518, podané 30. července 1993), tak shluk genů bkdFGH vznikl duplikací genu v S. avermitilis a že byly akumulovány dvě kopie mutacemi dostatečně rozrůzněné, aby se zajistilo přežití (a aby bylo možno se vyhnout rekombinačním a delečním příhodám).

Původci tohoto vynálezu v tomto popisu zveřejňují nejen druhý shluk genů kódujících BCKDH, nýbrž také sestrojení mutantu Streptomyces avermitilis bkdF technologií genového inženýrství. Mutant bkdF neobsahuje aktivitu roz11 větvená α-ketokyselina dehydrogenasy, není schopen růst na isoleucinu, leucinu a valinu, jako jediném zdroji uhlíku a také není schopen produkovat přirozené avermektiny v médiu, které neobsahuje ani S-2-methylmáselnou kyselinu ani isomáselnou kyselinu. Popisovaný mutant je užitečný pro produkci nových (nepřirozených) avermektinů fermentaí v médiu obsahujícím vhodnou alternativní karboxylovou kyselinu, jako je cyklohexankarboxylová kyselina (CHC). Dále také zveřejňují sestrojení mutantu, který nese chromosomální deleci ovlivňující jak gen bkdF, tak genový shluk bkdABC.

Vytvoření mutantů Streptomycetes za použití chemických a fyzikálních mutagenů představuje důležitou technologii pro analýzu a regulaci funkce genu a pro vývoj zlepšených průmyslových kmenů. Výsledky nedávného vývoje dosažené při klonování genu Streptomycetes mají za následek možnost manipulace obrovského množství klonovaných genů, jako jsou geny resistence, biosyntetické geny a regulační geny a možnost objasnění a regulace organizace genů pomocí rekombinantní DNA technologie. Další mutagenní přístup, nahrazování genů, byl úspěšně aplikován u Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli a Bacillus subtilis (Scherer, S. a R. W. Davis, 1979, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 76: 4951-4955; Shortle, D., et al., 1982, Science, 217:371-373; Stáhl,

M. L. a Ferrari, Ε., 1984, J. Bacteriol., 158:411-418) a také u Saccharopolyspora erythraea (Weber, J. M. a Losick, R., 1988, Gene, 68:173-180) a u několika druhů Streptomycetes. Tato technika umožňuje zavedení mutace vytvořené in vitro a nesené na plasmidu do chromosomu hostitelského kmene. Tento přístup je založen na objevu, že mezi hostitelským chromosomem a plasmidem obsahujícím homologickou oblast dochází k rekombinací.

Nahrazování genu u S. avermitilis probíhá prostřednictvím homologní rekombinace mezi klonovanými sekvencemi nesenými ve vektoru a jejich chromosomálními protějšky. Pravděpodobně současně dochází ke dvěma crossover nebo k jedinému crossover vedoucímu k integraci a následné resoluci, při níž dojde k excisi integrovaného plasmidů. Při tom dojde k reciproční výměně mezi klonovanou a residentní sekvencí. U S. avermitilis byl původci tohoto vynálezu pozorován jak dvojitý, tak jednoduchý crossover. Oba mechanismy, jak dvojnásobný, tak jednoduchý crossover, s následnou excisi vedou ke stejnému produktu. Za použití této metody se původcům podařilo rozlomit otevřený čtecí rámec El-α genu bkdF S. avermitilis. Rozlomení zahrnuje chromosomální deleci přibližně 1,4 kb, která postihuje 5'-polovinu genu kódujícího podjednotku El-α komplexu BCKDH. Výsledný mutantní kmen, který vykazuje všechny charakteristické znaky fenotypv mutantu bkd, je stabilní a může se ho použít pro fermentační přípravu nových cenných avermektinů.

Všechny publikace uvedené v tomto dokumentu jsou zde citovány náhradou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.

Technické termíny, kterých se používá v tomto popisu, jsou dobře známy odborníkům v oboru molekulární genetiky. Definice termínů, kterých se v tomto popisu často používá, jsou uvedeny dále.

Pod označením amplifikace se rozumí produkce přídavných kopií chromosomální sekvence vyskytující se jako intrachromosomální nebo extrachromosomální DNA.

Pod označením gen resistence vůči antibiotiku se rozumí sekvence DNA, která po zavedení do hostitelské buňky, jež je přirozeně sensitivní vůči určitému antibiotiku, uděluje buňce resistenci vůči tomuto antibiotiku. Tento gen bývá také označován názvem antibiotický markér.

Pod označením klon se rozumí velký počet buněk nebo molekul, které jsou identické s jedním předkem.

Pod pojmem klonovací vektor se rozumí jakýkoliv plasmid, do kterého je možno vložit cizí DNA, jež má být klonována. Klonovací vektor vnáší při transformaci cizí DNA do hostitelské bakteriální buňky.

Pod označením CoA se rozumí koenzym A.

Pod označením kohesní (lepivá) koncová sekvence (Cos) se rozumí sekvence DNA pocházející z bakteriofágu lambda a umožňující sbalování in vitro.

Pod označením kosmid se rozumí plasmid, do něhož byla vložena bakteriofágová lambda cos místa. V důsledku toho může dojít ke sbalení plasmidové DNA (nesoucí cizí inserty DNA) in vitro ve fágovém povlaku.

Pod označením cRNA se rozumí jednořetězcová RNA, která je komplementární k DNA syntetizované z této RNA transkripcí in vitro.

Pod označením crossover se rozumí místo, v němž dochází k reciproční výměně materiálu mezi klonovanou sekvencí a jejím chromosomálním protějškem.

Pod označením Dalton se rozumí jednotka hmotnosti, které se obvykle používá ve spojení s rozměry molekul. Tato jednotka odpovídá hmotnosti jednoho atomu vodíku.

Pod označením ligace DNA se rozumí tvorba chemické vazby spojující dva fragmenty DNA.

Pod označením dvojnásobný crossover se rozumějí dva crossovery, k nimž dochází bud současně nebo následně. V jeho důsledku dochází k reciproční výměně mezi klonovanou a residentní sekvencí.

Pod označením shluk genů (gene cluster) se rozumí skupina genů, které se v chromosomu nacházejí ve fyzické blízkosti.

Pod označením nahrazení genu se rozumí technika umožňující zavedení in vitro získané mutace nesené na plasmidú do chromosomu. K nahrazení dojde, když chromosom hostitele rekombinuje s plasmidem obsahujícím oblast, která je k němu homologní.

Pod označením genom se rozumí celý soubor chromosomů, tj. celý soubor všech genů jednotlivce.

Pod označením hybridizace nebo hybridizace kolonií se rozumí technika, které se používá pro identifikaci bakteriálních kolonií nesoucích chimérické vektory, jejichž vložená DNA se podobá určité konkrétní sekvenci.

Pod označením hypha se rozumí základní prvek rostoucí nebo vegetativní formy plísně. Hyphae jsou trubkovité struktury o průměru asi 2 až 10 μιη, které vytvářejí hmotu vzájemně propletených provazců, jež se nazývá mycelium.

Pod zkratkou kb se rozumí tisíc bázových párů DNA nebo RNA.

Pod označením linker se rozumí krátký syntetický duplexní oligodeoxynukleotid obsahující cílové místo pro jeden nebo více restrikčních enzymů. Přidává se k vektoru za účelem vytvoření nového polylinkeru nebo několikanásobného klonovacího místa (MCS).

Pod označením NADH se rozumí redukovaný nikotinamid-adeninový dinukleotid.

Pod označením nukleotid se rozumí stavební kámen, či monomerní jednotka, nukleových kyselin.

Pod označením oligonukleotid se rozumí krátký řetězec nukleotidů.

Pod označením operon se rozumí úplná jednotka exprese a regulace bakteriálního genu zahrnující strukturní geny, regulátorové geny a kontrolní prvky v DNA rozpoznatelné produktem nebo produkty regulátorového genu.

Pod označením piasmid se rozumí autonomní extrachromosomální kružnicová DNA, která se sama replikuje.

Pod označením počet plasmidových kopií se rozumí počet plasmidových molekul udržovaných v bakterii pro každý hostitelský chromosom.

Pod označením primer se rozumí krátká sekvence DNA nebo RNA, která vytvoří pár s jedním řetězcem DNA a dodá volný 3'-OH konec, na němž může DNA polymerasa zahájit syntézu deoxyribonukleotidového řetězce.

Pod označením prokaryontní buňka se rozumí malá, poměrně jednoduchá buňka. Většina mikroorganismů zahrnuje tyto buňky.

Pod označením promotor se rozumí oblast DNA, která je zodpovědná za iniciaci transkripce.

Pod označením restrikční enzym se rozumí enzym, který je schopen rozpoznat a rozštěpit specifickou krátkou sekvenci DNA.

Pod označením sekvence rozpoznávání restrikce se rozumí sekvence DNA, která je specificky rozpoznána určitým restrikčním enzymem. Rovněž se označuje názvem cílové místo.

Pod označením vektor shuttle se rozumí bifunkční klonovací vektor, který je schopen se replikovat v jednom nebo více alternativních hostitelích (například E. coli a Streptomyces).

Pod označením jednoduchý crossover se rozumí jednoduchá reciproční genetická rekombinace, k níž dochází v jednom místě. Způsobuje integraci vstupujícího cirkulárního plasmidu nebo fágového vektoru a duplikaci v homologní chromosomové sekvenci.

Pod označením Southern Blotting se rozumí postup spočívající v přenesení denaturované DNA z agarosového gelu na nitrocelulosový filtr, kde může být hybridizována s komplementární nukleokyselinovou próbou.

Pod označením subklonování se rozumí přenášení klonovaných fragmentů DNA z jednoho typu vektoru do jiného, například z rekombinantního kosmidu do plasmidu. Nový rekombinantní plasmid se potom tranformuje do vhodné hostitelské buňky za vzniku subklonového kmene.

Pod označením transformace bakteriálních buněk se rozumí získání nových genetických markérů zavedením přídavné DNA.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je izolovaný segment DNA kódující komplex rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy z organismu, který náleží do rodu Streptomyces.

Předmětem vynálezu je dále také izolovaný segment DNA popsaný výše, který dále obsahuje oblast DNA regulující expresi tohoto komplexu rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy.

Předmětem vynálezu je dále také izolovaný segment DNA, který kóduje komplex rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy ze Streptomyces avermitilis.

Dále je předmětem vynálezu také segment DNA zahrnující sekvenci DNA odpovídající SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 nebo SEQ ID NO: 4 (viz dále) nebo allelové obměně takové sekvence. Vynález zahrnuje též segment DNA, který je podmnožinou výše uvedeného segmentu DNA a je mu funkčně ekvivalentní.

Dále je předmětem vynálezu také a) rekombinantní DNA zahrnující sekvenci DNA odpovídající SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 nebo SEQ ID NO: 4 nebo allelové variaci této sekvence; b) plamid obsahující takovou rekombinantní DNA a c) hostitelská buňka, do které byla taková rekombinantní DNA zavedena.

Předmětem vynálezu jsou dále geny pro komplex rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy obsažené v segmentu DNA zvoleném ze souboru zahrnujícího pCD713, pCD740, pCD747 a pCD854 (definice jsou uvedeny dále).

Dále je předmětem vynálezu také segment DNA zahrnující sekvenci DNA odpovídající SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 nebo SEQ ID NO: 4 (viz dále) nebo allelové obměně takové sekvence.

Vynález zahrnuje též segment DNA obsahující sekvenci DNA, jež je podmnožinou sekvence DNA SEQ. ID NO. 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 nebo SEQ ID NO: 4 nebo její allelové variace a který je schopen hybridizace s příslušnou sekvencí SEQ. ID NO. 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 nebo SEQ ID NO: 4 nebo její allelovou variací, když se ho použije jako próby nebo který je schopen amplifikovat celou takovou sekvenci nebo její část, když se ho použije jako primerů pro řetězovou reakci za použití polymerasy.

Předmětem vynálezu je také v podstatě purifikovaný polypeptid zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:

5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 nebo SEQ ID NO: 8.

Dále je předmětem vynálezu způsob výroby přírodního avermektinu, jehož podstata spočívá v tom, že se za podmínek a ve fermentačním médiu vhodném pro produkci takového přírodního avermektinu fermentuje Streptomyces avermitilis se zvýšeným počtem kopií genomového fragmentu obsahujícího jeden nebo více genů bkdF, bkdG a bkdH.

Dále je předmětem vynálezu způsob výroby přírodního avermektinu, jehož podstata spočívá v tom, že se za podmínek a ve fermentačním médiu vhodném pro produkci takového přírodního avermektinu fermentuje Streptomyces avermitilis, u něhož byla exprese genomového fragmentu obsahujícího jeden nebo více genů bkdF, bkdG a bkdH zvýšena manipulací nebo nahrazením genů zodpovědných za tuto expresi.

Dále je předmětem vynálezu způsob výroby nového avermektinů, jehož podstata spočívá v tom, že se za podmínek a ve fermentačním médiu vhodném pro produkci takového nového avermektinů fermentuje Streptomyces avermitilis, u něhož byla exprese genomového fragmentu obsahujícího jeden nebo více genů bkdF, bkdG a bkdH snížena nebo eliminována delecí, inaktivací, nahrazením nebo jinou manipulací genů zodpovědných za tuto expresi.

V přednostním provedení je předmětem vynálezu výše uvedený způsob výroby nového avermektinů, jehož podstata spočívá v tom, že se za podmínek a ve fermentačním médiu vhodném pro produkci takového nového avermektinů fermentuje Streptomyces avermitilis, u něhož byl vypuštěn nebo inaktivován genomový fragment obsahující jeden nebo více genů bkdF, bkdG a bkdH.

Dále je předmětem vynálezu způsob výroby nového avermektinů, jehož podstata spočívá v tom, že se za podmínek a ve fermentačním médiu vhodném pro produkci takového nového avermektinů fermentuje Streptomyces avermitilis, u něhož byla exprese genomového fragmentu obsahujícího jeden nebo více genů bkdA, bkdB a bkdC a jeden nebo více genů bkdF, bkdG a bkdH snížena nebo eliminována delecí, inaktivací, nahrazením nebo jinou manipulací genů zodpověd- ných za tuto expresi.

V přednostním provedení je předmětem vynálezu výše uvedený způsob výroby nového avermektinů, jehož podstata spočívá v tom, že se za podmínek a ve fermentačním médiu vhodném pro produkci takového nového avermektinů fermentuje Streptomyces avermitilis, u něhož byl vypuštěn nebo inaktivován genomový fragment obsahující jeden nebo více genů bkdA, bkdB a bkdC a jeden nebo více genů bkdF, bkdG a bkdH.

Přehled obr, na výkresech

Na obr. 1 je znázorněna nukleotidová sekvence primerů pro řetězovou reakci katalyzovanou polymerasou (PCR) použitých pro klonování fragmentu genu bkdF z S. avermitilis (El-α BCKDH). Každý primer byl zkonstruován nad konzervovanou oblastí devíti aminokyselin. Kodony odpovídající každé konzervované aminokyselině jsou uvedeny nad odpovídající sekvencí DNA. Pravosměrný primer byl zkonstruován nad oblastí zahrnující aminokyseliny 192 až 200 humánní podjednotky El-α BCKDH, které bylo použito jako reprezentativního modelu podjednotky El-α BCKDH. Levosměrný primer byl zkonstruován nad oblastí zahrnující aminokyseliny 286 až 293 podjednotky El-α BCKDH. U 5'-konce pravosměrného primeru jsou navíc umístěny dva nukleotidy obsahující adenin a dvě sekvence rozpoznávané restrikčními enzymy (EcoRI a Sací), které byly přidány pro usnadnění klonování PCR produktů. Podobně i u 5' konce levosměrného primeru jsou navíc umístěny dva nukleotidy obsahující adenin a dvě sekvence rozpoznávané restrikčními enzymy (BamHI a Xbal).

Na obr. 2 je znázorněna genomová restrikční mapa uvádějící umístění a subklony genového shluku Streptomyces avermitilis bkd FGH. Také je zde uvedeno umístění dříve popsaného shluku genů gkd ABC (viz Denoya C. D., patentová přihláška USA č. 08/100,518, citovaná výše), černé obdélníčky pod mapou označují umístění a orientaci počátečních ΕΙ-α-specifických genomových fragmentů z S. avermitilis klonovaných za použití PCR. Jsou zde označeny genomové subklony (deriváty pGEM-3Z). Také je zde uvedeno umístění a organizace strukturních genů bkdF, bkdG a bkdH kódujících podjednotky Ε1-α, El-β a E2 BCKDH. Polarita identifikovaných otevřených čtecích rámců (označených obdélníčky) je zleva doprava. Používá se těchto zkratek: B = BamHI, Bg = BglII,

P = Pstl a S = SphI. Symbol X označuje umístění transposonu mini-gamma-delta-1 inserce použitého pro sekvenování oblastí DNA za otevřeným čtecím rámcem bkdF, jak je to popsáno dále.

Na obr. 3 jsou uvedeny nukleotidová sekvence a dedukované translační produkty 501bp genomového DNA fragmentu z S. avermitilis (CD613) klonovaného pomocí PCR za použití primerů znázorněných na obr. 1. Tento genomový fragment obsahuje část genu bkdF (El-α BCKDH). Nukleotidy jsou číslovány nad řádky sekvence. Dedukovaná aminokyselinová sekvence je uvedena pod odpovídající kodonovou sekvencí.

Na obr. 4 jsou uvedeny nukleotidová sekvence a dedukované translační produkty 201bp genomové DNA oblasti z S. avermitilis sekvenované od Pstl konce subklonu pCD746 za použití vektorového primeru SP6. Dedukovaný translační produkt představuje část složky El-β komplexu BCKDH odpovídajícího genu bkdG. Nukleotidy jsou číslovány nad řádky sekvence. Dedukovaná aminokyselinová sekvence je uvedena pod odpovídající kodonovou sekvencí.

Na obr. 5 jsou znázorněny nukleotidová sekvence (sekvence CD785) a dedukované translační produkty 194bp genomové DNA oblasti z S. avermitilis sekvenované od obou konců mini-gamma-delta-1 inserce A3 umístěné přibližně 1,7 kb od BamHI konce s obsahem genu bkdF v 4,lkb genomovém fragmentu BamHI. Dedukovaný translační produkt představuje C-terminální konec El-β složky komplexu BCKDH odpovídajícího genu bkdG. Nukleotidy jsou číslovány nad řádky sekvence.

Dedukovaná aminokyselinová sekvence je uvedena pod odpovídající kodonovou sekvencí.

Na obr. 6 jsou znázorněny nukleotidové sekvence (sekvence CD786) a dedukované translační produkty 455bp genomové DNA oblasti z S. avermitilis sekvenované od obou konců mini-gamma-delta-1 inserce A5 umístěné přibližně 3 kb od BamHI konce s obsahem genu bkdF v 4,lkb genomovém fragmentu BamHI. Dedukovaný translační produkt představuje C-terminální konec E2 složky komplexu BCKDH odpovídajícího genu bkdH. Nukleotidy jsou číslovány nad řádky sekvence. Dedukovaná aminokyselinová sekvence je uvedena pod odpovídající kodonovou sekvencí.

Na obr. 7 je znázorněna konstrukce vektoru pCD768 pro nahrazení genu a genomová restrikční mapa S. avermitilis bkdF mutantního kmene CD794. Plasmid pCD768 je derivátem shuttle vektoru pCD262 nesoucího 2,3 a 4,lkb BamHI genomové fragmenty S. avermitilis lemující markér ermE (černá šipka). Plasmid pCD76l je intermediární konstrukt, jak je to popsáno dále. Také jsou znázorněny genomové restrikční mapy (divokého typu a nahrazených kmenů) oblasti chromosomu S. avermitilis obsahující gen bkdF. Tyto mapy byly dedukovány z analýzy hybridizací Southern za použití 5,0kb Pstl genomového fragmentu, jako próby. Použité zkratky: B = BamHI, P = Pstl. Čísla nad každým fragmentem DNA označují délku v kb.

Na obr. 8. je znázorněna restrikční mapa vektoru pCD768 pro nahrazení genu. Stínované oblasti označují: tsr = markér resistence vůči thiostreptonu; amp = markér resistence vůči ampicilinu; 2.3 = 2,3kb genomový fragment BamHI z S. avermitilis; erm = fragment resistence vůči erythromycinu; 4.1 = 4,lkb genomový fragment BamHI z S. avermitilis. Také jsou zde uvedeny oblasti počátku repli23 kace z Streptomyces a E. coli. Bílé segmenty označují oblast vektoru E. coli. šipky označují směr transkripce a translace.

Na obr. 9 je znázorněna konstrukce mutantu bkdABCF. Je zde uvedena genomová restrikční mapa a zjednodušené složení vektorových konstruktů a cílových genomových oblastí. Umístění shluků genů bkd, orientace otevřených čtecích rámců a použité zkratky jsou stejné jako na obr. 3 (viz příslušnou legendu). Vypuštěné segmenty jsou označeny jako šedé oblasti. Plné čáry označují chromosomální DNA a přerušované čáry označují vektorovou DNA. Tlusté čáry označují klonované genomové fragmenty použité při nahrazování genu. Vertikální šipky ukazují umístění inserce markéru resistence vůči antibiotiku.

Následuje podrobný popis tohoto vynálezu.

Nové sekvence DNA podle tohoto vynálezu byly klonovány za použití kombinace dvou technik molekulární genetiky, tj. řetězové reakce s DNA polymerasou (PCR) a próbování homologie.

Postupy pro identifikaci a klonování nových sekvencí DNA podle tohoto vynálezu a pro konstrukci bkd mutantu nahrazením genu jsou popsány dále.

Nejprve se zkonstruují dva PCR primery označené názvy pravosměrný a levosměrný (viz obr. 1) nad konzervovanými oblastmi identifikovanými ze seřazení několika dedukovaných sekvencí El-α BCKDH peptidu z různých druhů a dostupných z literatury. PCR produkt o délce přibližně 0,55 kb se deteguje PCR amplifikaci genomové DNA z S. avermitilis za použití jak pravosměrného, tak levosměrného primeru. PCR-amplifikovaný fragment DNA se potom klonuje do E.

coli vektoru pGEM-3Z za vzniku rekombinantního plasmidú pCD613. Potom se plasmid pCD613 transformuje do E. coli DH5-a kompetentních buněk. Jeden z transformantů se označí jako kmen CD613. Sekvenování DNA klonovaného fragmentu DNA CD613 ukazuje existenci otevřeného čtecího rámce s dedukovaným peptidem, který je vysoce homologický vzhledem k El-α BCKDH podjednotce (viz obr. 3). Klonovaného fragmentu genomové DNA CD613 se potom použije jako próby pro screening chromosomální knihovny S. avermitilis hybridizací kolonií. Je identifikováno několik kosmidových klonů. Restriční analýza a analýza Southern Blot ukazuje, že tyto všechny zvolené kosmidové klony nesou překrývající se genomové fragmenty. DNA sekvenování chromosomální oblasti získané ze subklonovaných genomových DNA fragmentů (jak je to podrobně vysvětleno v příkladu 6) ukazují, že sekvence CD613 je součástí úplného shluku genů bkd. Klonované geny S. avermitilis bkd zahrnují oblast chromosomu o délce přibližně 4 kb (viz obr. 2).

Analýza sekvence DNA ukazuje přítomnost strukturních genů BKD uspořádaných do shluku, který je organizován následujícím způsobem: El-α (bkdF), El-β (bkdG) a E2 (bkdH) otevřené čtecí rámce (viz obr. 2 a 6).

Potom se zkonstruuje plasmid nesoucí inaktivovanou verzi genu bkdF. Jak je to znázorněno na obr. 2, v chromoromu S. avermitilis jsou mapovány tři sousední BamHI restrikční fragmenty (od leva do prava): 2,3kb, l,4kb a 4,lkb. l,4kb BamHI genomový fragment nese začátek El-α otevřeného čtecího rámce (ORF-1) (gen bkdF). 4,lkb BamHI genomový fragment nese zbytek genového shluku bkd (konec bkdF, bkdG a bkdH). Plasmid pCD768 je derivátem shuttle vektoru pCD262 nesoucího dva genomové fragmenty z S. avermitilis (2,3 a 4,lkb fragment BamHI), které sousedí z obou stran s l,4kb BamHI fragmentem chromosomu. Kromě toho, nese pCD768 markér ermE, který je umístěn mezi 2,3 a 4,lkb BamHI fragmenty. Markér ermE (který uděluje resistenci vůči erythromycinu) je umístěn v obrácené orientaci vzhledem k ORF-1 (bkdF), aby se zabránilo možným obtížím vyvolaným nadexpresí genů umístěných dále. Tento konstrukt vyvolává při rekombinací l,4kb deleci (postižen je ORF-1) v hostitelském genomu, jak je to uvedeno dále.

Plasmid pCD768 se transformuje do protoplastů hostitele S. avermitilis 31272 SC2. Selekcí se oddělí dva transformanty vykazující resistenci k oběma antibiotikům, totiž erythromycinu (erm-R) a thiostreptonu (tsr-R). Transformant č. 1 (CD783) se pěstuje v kapalném médiu, připraví se protoplasty a navzorkují se na agarové médium s obsahem erythromycinu. Selektuje se 50 klonů, které se dále analyzují: 46 z nich je erm-R, tsr-R a 4 jsou erm-R, tsr-S. Poslední čtyři klony vykazují bkd-deficientní genotyp: jsou neschopné růst v miskách s ILV minimálním médiem; nevykazují žádnou detegovatelnou El (rozvětvený řetězec dekarboxylasa) aktivitu; a při fermentací nejsou schopny syntetizovat přírodní avermektiny, pokud se nepřidá buď S(+)-2-methylmáselná kyselina nebo isomáselná kyselina (viz příklad 9). Kromě toho, když se k fermentačnímu médiu přidá CHC, syntetizují se nové avermektiny (CHC-avermektiny), což ukazuje, že bkd blok nepostihl biosyntetické buněčné mechanismy vedoucí k avermektinům. Jeden klon z této skupiny čtyř klonů (klon ppl5) obdržel formální označení S. avermitilis kmen CD794 a byl uložen ve sbírce American Type Culture Collection pro účely doložení tohoto vynálezu příklady. Konečně se pomocí analýzy hybridizací Southern potvrdí, že ORF-1 odpovídající genu bkdF je přerušen, jak lze očekávat na základě nahrazení genu v S. avermitilis ATCC 31272 SC2.

Následuje úplný popis experimentálních stupňů prováděných při klonování genů S. avermitilis bkd a výsledky, které při nich byly dosaženy.

(a) Identifikace konzervovaných oblastí v podjednotce peptidů El-a BCKDH, které by mohly sloužit jako potenciální místa pro navázání PCR primerů

Čtyři peptidové sekvence El-a BCKDH, z člověka (Fisher et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:3448-3453), krysy (Zhang et al., 1987.. J. Biol. Chem. 262: 15220-15224), Pseudomonas putida (Sokatch et al., 1988, Eur. J. Biochem. 176: 311-317) a Bacillus stearothermophilus (Perham et al., 1990, Eur. J. Biochem., 191: 337-346) se seřadí do zákrytu, aby bylo možno identifikovat konzervované oblasti, které by mohly sloužit jako potenciální sekvence pro konstrukci odpovídajících PCR primerů. Počítačová analýza pro identifikaci oblastí podjednotky El-a, které jsou vysoce konzervovány jak v prokaryontních, tak eukaryontních komplexech BCKDH, se provádí za použití programů LineUp a Pretty z balíku programů pro analýzu GCG sekvence (Madison, WI, USA). Ze seřazení těchto čtyř El-a BCKDH peptidů je zřejmé, že existuje několik oblastí s rozšířenou homologií (Wexler, I. D., et al., 1991, FEBS Letters, 282: 209-213). Thiaminpyrofosfátový vazebný motiv (Perham et al., 1989, FEBS Letters, 255: 77-82) umístěný mezi humánními El-a aminokyselinami 182 až 229 a oblast zahrnující fosforylační místa 1 a 2 v rozmezí aminokyselin 291 až 307 jsou pozoruhodně konzervovány ve všech čtyřech analyzovaných peptidech El-a BCKDH. Také je zde přítomna již dříve popsaná oblast s vysokou homologií, která leží v rozmezí aminokyselin 245 až 289. Tato oblast se zdá být jedinečnou pro α-ketokyselina dehydrogenasy, které obsahují jak α-, tak β-podjednotky a není homologická s žádnou sekvencí v E. coli PDH El nebo ve složkách El a-ketoglutarát dehydrogenasových komplexů E. coli a kvasinek, což jsou dimery, které se skládají pouze z jediného El polypeptidu. Z výše uvedených důvodů se předpokládá, že posledně uvedená oblast homologie bude hrát roli při interakci podjednotky (Patel et al., 1991, FEBS Letters, 282: 209 až 213). Konzervované oblasti zvolené pro konstrukci PCR primeru kódují aminokyselinové zbytky 192 až 200 a 286 až 293 humánního El-a BCKDH proteinu.

(b) Konstrukce nových oligonukleotidů vyrobených na konzervovaných oblastech El-a BCKDH, kterých má být použito jako PCR primeru

Jak již bylo uvedeno výše, při studii seřazení

El-a BCKDH peptidových sekvencí se zvolí dvě konzervované oblasti. Pravosměrný PCR primer (obr. 1) se zkonstruuje na oblasti zahrnující aminokyseliny 192 až 200 z humánní El-a BCKDH podjednotky, které se použije jako reprezentativního modelu El-a BCKDH podjednotky. Tyto aminokyseliny jsou umístěny v thiaminpyrofosfátovém vazebném motivu. Levosměrný PCR primer (obr. 1) se zkonstruuje na oblasti zahrnující aminokyseliny 286 až 293 El-a BCKDH podjednotky. Posledně uvedená aminokyselinová sekvence zahrnuje koncovou část místa interakce podjednotky a počáteční část konzervovaných oblastí fosforylačního místa. Používá se přiřazení kodonu genu Streptomyces (F. Wright a M. J. Bibb, 1992, Gene, 113: 55 až 65). U 5' konce pravosměrného primeru jsou umístěny navíc dva nukleotidy obsahující adenin a dvě sekvence rozpoznávané restrikčnimi enzymy (EcoRI a Sací) pro usnadnění klonování PCR produktů. Podobně jsou u 5'konce levosměrného primeru umístěny navíc dva nukleotidy obsahující adenin a dvě sekvence rozpoznávané restrikčnimi enzymy (BamHI a Xbal).

Úplná sekvence pravosměrného PCR primeru je

5’ -AAGAATTCGAGCTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3' (SEQ ID NO: 9) a úplná sekvence levosměrného PCR primeru je

5'-AAGGATCCTCTAGAGGTSSWGTGGKGGCCGATSCGGWA-3' (SEQ ID NO: 10).

Pro popis sekvencí DNA se použije pravidel nomenklatury pro nukleotidy podle International Union of Biochemistry (IUB). Redundance jsou identifikovány podle kódů UIB Group Codes takto: K = G+T, S = G+C a W = A+T. Sekvence rozpoznávané při restrikci, které nejsou homologické vzhledem k El-α bkd genům, zavedené do primerů pro účely klonování jsou podtrženy (viz obr. 1).

(c) PCR amplífíkace fragmentů genomové DNA S. avermitilis

Genomová DNA S. avermitilis se enzymaticky amplifikuje za reakčních podmínek vhodných pro DNA s vysokým obsahem GC, které umožňují účinnou a specifickou amplifikaci DNA ze Streptomycetes (viz příklad 2). PCR se provádí za použití kombinace primerů popsané výše (pravosměrný primer: 5’-AAGAATTCGAGCTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3' (SEQ ID NO: 9) a levosměrný primer: 5'-AAGGATCCTCTAGAGGTSSWGTGGKGGCCGATSCGGWA-3' (SEQ ID NO: 10)). Amplifikační produkty se frakcionují podle velikosti elektroforézou na agarosovém gelu. Za PCR podmínek popsaných výše a za použití výše uvedené kombinace primerů se deteguje jediný pás DNA (o délce přibližně 550 bázových párů).

(d) Klonování amplifikovaného fragmentu genomové DNA do klonovacího vektoru Escherichia coli a následující transfor mace do hostitele E. coli

Jak již bylo uvedeno výše, do pravosměrného PCR primerů se pro usnadnění klonování zavede restrikční místo EcoRI, přičemž u 5' konce levosměrného primerů je přítomno restrikční místo Xbal. Z agarosového gelu se elektroelucí získá 0,55kb PCR fragment, a ten se podrobí štělení dvěma restrikčními enzymy, totiž EcoRI a Xbal. Po ligaci specifického fragmentu do linearizovaného vektoru E. coli (pGEM-3Z) za účelem získání rekombinantního plasmidů pCD613 a po jeho transformaci do kompetentních buněk E. coli se získá mnoho rekombinantních klonů. Pro další charakterizaci se zvolí jeden transformant, který se označí jako kmen CD613. Restrikční analýzou se potvrdí, že piasmid pCD613 izolovaný z E. coli kmene CD613 skutečně obsahuje 0,55kb insert z S. avermitilis.

(e) Sekvenování DNA klonovaného fragmentu a identifikace bkd-specifických sekvencí

0,55kb insert přítomný v plasmidů pCD613 se sekvenuje dvouřetězcovým sekvenačním postupem za použití dvojice vektorových primerů (viz příklad 6A). Kromě toho se 0,35kb Sáli fragment umístěný uvnitř 0,55kb PCR insertu subklonuje do bakteriofágu M13 a sekvenuje podle jednořetězcového sekvenačního protokolu (viz příklad 6B). Sekvenování DNA se provádí metodou zahrnuj ící terminaci dideoxynukleotidových řetězců. Za použití jednořetězcového DNA templátu a soupravy TaqTrack kit (Promega). Kodonová preferenční analýza (balík software programů GCG Sequence Analysis, Madison, WI, USA) sekvenačních dat DNA ukazuje přítomnost otevřeného čtecího rámce vykazujícího očekávané použití kodonu u genu streptomycetes.

Potom se pravděpodobný otevřený čtecí rámec přeloží do aminokyselinové sekvence za použití programů Seq and Translate, IntelliGenetics Suitě software (IntelliGenetics Inc. Mountain View, California, USA). Nakonec se provede zjišťování podobnosti zkoumané peptidové sekvence pomocí databanky a programu FASTDB ze software IntelliGenetics. Všechny rešerše v databance, ať již se prohledávají databanky DNA (GenBank(^R), National Institute of Health,

EMBL, European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg,

SRN) nebo proteinové databanky (PIR a Swiss-Prot) neomylně ukazují, že sekvence získaná z klonu CD613 je vysoké homologická, ale nová a odlišná od všech ostatních El-a BCKDH peptidů uvedených v těchto databankách, a£ již se jedná o peptidy prokaryontního nebo eukaryontního původu. Kromě toho se provede srovnání s novou sekvencí peptidu Streptomyces avermitilis El-α BCKDH kódovanou genem bkdA (viz Denoya, C. D., 1993, Cloned Genes Encoding BranchedChain α-Ketoacid Dehydrogenase Complex from Streptomyces avermitilis, patentová přihláška USA č. 08/100,518 podaná 30. července 1993). Na základě této analýzy je možno učinit závěr, že 550bp genomový PCR produkt z S. avermitilis klonovaný v E. coli kmene CD613 skutečně představuje nový El-α bkd genový fragment.

(f) Klonování úplného genového shluku z S. avermitilis bkd, restrikce a analýza Southern Blot a konstrukce chromosomové mapy

Jak již bylo uvedeno výše, původní 0,55kb PCR fragment obsahuje vnitřní 0,35kb Sáli fragment. Tohoto malého fragmentu se použije jako radioaktivně značené próby pro sereening genomové kosmidové knihovny S. avermitilis prostřednictvím hybridizace kolonií. Je identifikováno a získáno deset klonů. Analýza restrikcí a hybridizací Southern Blot ukazuje, že tyto klony obsahují překrývající se sekvence pocházející ze stejné chromosomové oblasti. Stejné próby se použije za podmínek vysoké stringence proti Southern blotům štěpené chromosomové DNA z S. avermitilis ATCC 31272 SC2. Posledně uvedená analýza potvrzuje totožnost těchto klonů získaných z genomové knihovny. S překvapením se zjistilo, že dva z těchto kosmidových klonů hybridizují také k bkdA-specifické próbě (viz Denoya, C. D., 1993, Cloned Genes Encoding Branched-Chain α-Ketoacid Dehydrogenase

Complex from Streptomyces avermitilis, patentová přihláška USA č. 08/100,518 podaná 30. července 1993), což ukazuje, že popsaný bkd gen (označený jako bkdF je pravděpodobné umístěn v blízkosti shluku genů zahrnujícího bkdA, bkdB a bkdC. Zkonstruuje se restrikční mapa genomové oblasti obsahující sekvenci S. avermitilis CD613, která je znázorněna na obr. 2. Jak lze předvídat, na základě hybridizačních dat diskutovaných výše, je gen bkdF oddělen od shluku genů bkdABC pouze 12 kilobázemi.

(g) Subklonování genomových DNA fragmentů získaných z kosmidových klonů a sekvenování DNA z chromosomální oblasti z S. avermitilis nesoucí bkd genový shluk

Genomové fragmenty BamHI a Pstl pokrývající celou oblast CD613 bkd chromosomu S. avermitilis se subklonují z kosmidových klonů z DNA knihovny do E. coli vektoru pGEM-3Z. Seznam subklonů zkonstruovaných během této práce zahrnuje následující krátký popis každého plasmidů:

1. plasmid pCD740 obsahující 2,3kb BamHI fragment;

2. plasmid pCD854 obsahující l,4kb BamHI fragment;

3. plasmid pCD713 obsahující 4,lkb BamHI fragment;

4. plasmid pCD747 obsahující přibližně 5kb Pstl insert

Kmeny Escherichia coli CD740, CD854, CD713 a CD747, které odpovídají výše uvedeným čtyřem plasmidům, byly uloženy ve sbírce American Type Culture Collection. Relevantní informace vztahující se k těmto uloženým kmenům je možno nalézt v PCT formuláři RO/134, který je zařazen v závěru této přihlášky.

Kromě toho byl z 4,lkb BamHI fragmentu neseného v plasmidů pCD713 získán subklon obsahující přibližně 3,lkb fragment Pstl/BamHI. Tento nový konstrukt byl označen jako plasmid pCD746 a bylo ho použito pro sekvenování DNA způsobem popsaným dále. Totožnost každého subklonu se potvrdí pomocí restrikčního mapování, hybridizace Southern a analýzy PCR plasmidu.

(h) Počítačová analýza dat ze sekvenování DNA získaných při analýze klonovaných fragmentů DNA a identifikace otevřených čtecích rámců S. avermitilis El-a, El-β a E2 bkd

Data ze sekvenování DNA získaná z řady různých subklonů a konstruktů jsou uvedena dále.

1. CD613: Tento klon představuje původní PCR klon popsaný v částech C a D uvedených výše a v příkladech 2 a 3. Obsahuje část otevřeného čtecího rámce 1 (OFR-l) odpovídající genu bkdF, který kóduje složku El-a komplexu BCKDH (viz obr. 3).

2. CD746: Tento klon představuje 3,lkb fragment Pstl/BamHI získaný z pCD713 (viz část G výše). Data ze sekvenování DNA získaná při sekvenování Pstl konce pCD746 insertu za použití vektorového primerů SP6 (zakoupen od firmy Promega Co.) ukazují přítomnost ORF-2 odpovídajícího genu bkdG, který kóduje složku El-β komplexu BCKDH (viz obr. 4).

3. CD785: Jedná se o transposon mini-gamma-delta-1 inserce použitý pro sekvenování oblastí DNA umístěných za otevřeným čtecím rámcem bkdF v klonovaném 4,lkb genovém fragmentu BamHI. Tato mini-gamma-delta-1 inserce, označená jako A3, byla zjištěna přibližně 1,7 kb od konce BamHI obsahujícího gen bkdF. Sekvenování DNA provedené od obou konců inserce A3 (viz příklad 6C) ukázalo přítomnost ORF odpovídajícího konci El-β ORF (ORF-2) (bkdG) (viz obr. 5).

4. CD786: Jedná se o transposon mini-gamma-delta-1 inserce použitý pro sekvenování oblastí DNA umístěných za otevřeným čtecím rámcem bkdF v klonovaném 4,lkb genovém fragmentu BamHI. Tato mini-gamma-delta-1 inserce, označená jako A5, byla zjištěna přibližně 3 kb od konce BamHI obsahujícího gen bkdF. Sekvenování DNA provedené od obou konců inserce A5 (viz příklad 6C) ukázalo přítomnost ORF odpovídajícího konci E2 ORF (ORF-3) (bkdH) (viz obr. 6).

Klouzavá analýza složení (sliding base composition analysis) sekvenované genomové oblasti obsahující otevřené čtecí rámce (ORF) S. avermitilis El-a, El-β a E2 (zčásti) bkd se provede na použití software DNA Inspector (Textco N. H.) . Tato analýza poskytuje profil zahrnující běžný průměrný obsah (running average) G+C za použití protažené délky (stretch length) 30 bází a přesahové hodnoty (offset value) 20. Celkový obsah G+C odpovídající této oblasti chromosomu S. avermitilis je 69 %. Také se analyzuje obsah G+C v závislosti na poloze kodonu. Otevřené čtecí rámce se detegují za použití programu CodonPreference (Genetics Computer Group, Madison, WI, USA) a za použití tabulky Streptomyces codon usage pro 64 genů (F. Wright a M. J. Bibb, 1992, Gene, 113: 55 až 65). Program CodonPreference je rámcově specifický hledač genů, který se snaží rozpoznat kódující sekvence proteinu na základě jejich podobnosti s tabulkou kodonových frekvencí nebo na základě kompoziční tendence (obvykle GC) ve 3. poloze každého kodonu. Otevřené čtecí rámce jsou znázorněny jako čtverečky pod grafem příslušných čtecích rámců. Také se detegují všechny start kodony (ATG) a stop kodony (vertikální čárky). Pod každým grafem ORF jsou také označeny vzácné kodony nalezené v každém otevřeném čtecím rámci. Obsah G+C se vypočítá za použití klouzavého okénka (sliding window) 25 kodonů, takže se očekává interval (lag) asi 25 kodonů před kódující oblastí proteinu. Získají se následující tři profily: 1. první poloha v tripletu; 2. druhá poloha v tripletu a 3. třetí poloha v tripletu. Na základě této analýzy se lokalizují tři otevřené čtecí rámce bkd, které odpovídají následujícím podjednotkám BCKDH: El-α, Ε1-β, E2.

(i) Konstrukce S. avermitilis bkd mutantu

Pro zavedení delece se použije techniky, která představuje obměnu metod nahrazování genů použitých u Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli a Bacillus subtilis (Scherer, S. a R. W. Davis, 1979, Proč. Nati. Acad.

Sci. USA, 76: 4951-4955; Shortle, D., et al., 1982, Science, 217:371-373; Stáhl, M. L. a Ferrari, E., 1984, J. Bacteriol., 158:411-418). Obecný popis této techniky specificky aplikované na Streptomyces je možno najít v přehledné práci Genetic Manipulation of Streptomyces: Integrating Vectors and Gene Replacement”, Kieser T. a Hopwood D. A. (1991, Methods in Enzymology, sv. 204, 430 až 458). Podrobný popis této techniky, včetně přídavného stupně protoplastování, kterého je zapotřebí pro zajištění jednokoloniových izolátů a pro zvýšení frekvence eliminace plasmidů, je také možno najít v práci Anzai et al., Replacement of Streptomyces hygroscopicus genomic segments with in vitro altered DNA sequences, Journal of Antibiotics, 1988, sv. XLI, č. 2, str. 226 až 244.

Rozhodujícím stupněm při vývoji mutantního průmyslového kmene technikou nahrazování genů je konstrukce integračního vektoru, který bude účinný v tom kterém konkrétním kmeni. Při nahrazování genu v chromosomu Streptomyces je kromě toho jedním z hlavních problémů eliminace tohoto vektoru. Plasmidy Escherichia coli se selekčními markéry pro Streptomyces by se mohly zdát být ideální, poněvadž se nemohou replikovat v Streptomyces. Plasmidů E.

coli bylo s úspěchem použito u S. ambofaciens a S. lividans Genetic Manipulation of Streptomyces: Integrating Vectors and Gene Replacement, Kieser T. a Hopwood D. A. (1991, Methods in Enzymology, sv. 204, 430 až 458). Původci tohoto vynálezu však učinili zkušenost, že tato strategie vykazuje nízkou účinnost integrace v S. avermitilis, přičemž většinou vede pouze k jednoduchým crossoverům.

Původci tohoto vynálezu nedávno vyvinuli řadu universálních shuttle vektorů užitečných pro klonování jak ve Streptomyces, tak v E. coli. Tyto shuttle vektory se hodí pro různé aplikace zahrnující techniky molekulární genetiky u Streptomyces (C. D. Denoya, 1993, Novel Bacterial Plasmid Shuttle Vectors for Streptomyces sp. and Escherichia coli, patentová přihláška USA 032 925 podaná 18. března 1993). Tyto shuttle vektory jsou strukturně stálé a replikují se účinně v E. coli a řadě druhů Streptomyces, přičemž umožňují transfer širokého rozmezí velikosti klonovaných DNA fragmentů sem a tam v jednoho hostitele do druhého. Tři z těchto shuttle vektorů (pCD262, pCD385 a pCD500) nesou teplotně citlivý počátek replikace Streptomyces, který reguluje počet kopií ve Streptomyces od středního do vysokého počtu. Citlivost tohoto replikonu na teplotu umožňuje jeho aplikaci při experimentech s nahrazováním genů Streptomyces a při experimentech zahrnujících konstrukci mutantů.

Shuttle vektorů pCD262 a pCD500 bylo s úspěchem použito při konstrukci bkd-deficientního kmene charakterizovaného v tomto popisu. Tento vektor se v S. avermitilis stabilně uchovává jako automomně se replikující plasmid s vysokým počtem kopií. Když se však kmen S. avermitilis transformovaný některým z těchto vektorů vystaví stresovým podmínkám, jako je vysoká teplota, sporulace, nebo protoplastování a regenerace, mohou se získat četné kolonie bez tohoto plasmidu. Původci tohoto vynálezu využili této vlastnosti při aplikaci pCD262 a pCD500 jako integračního vektoru při pokusech s rozbíjením genů v S. avermitilis.

Mechanismus nahrazování genů v S. avermitilis pravděpodobně zahrnuje dvojitý nebo jednoduchý crossover vedoucí k integraci a následující resoluční stupeň, při němž dochází k excizi integrovaného plasmidu. U S. avermitilis původci pozorovali jak dvojnásobný, tak jednoduchý crossover. Oba tyto mechanismy, tj. dvojnásobný i jednoduchý crossover, vždy s následující excizi, mají za následek vznik stejného produktu. Za použití tohoto přístupu se původcům podařilo rozbít otevřený čtecí rámec El-α odpovídající genu bkdF genového shluku S. avermitilis bkd popsaného výše. Toto rozbití zahrnuje chromosomální deleci v délce přibližně 1,4 kb postihující 5' polovinu genu kódujícího El-α podjednotku komplexu BCKDH. Výsledný mutantní kmen, který vykazuje všechny charakteristické znaky fenotypu bkd mutantu, je stálý a může se ho použít pro fermentační výrobu nových cenných avermentinových produktů.

Konkrétně byl zkonstruován mutant bkdF nahrazením segmentu genu El-α BCKDH (bkdF) v chromosomů S. avermitilis ATCC 31272 SC2 za použití genu ermE (gen resistence vůči erychromycinu) z Saccharopolyspora erythraea. Jak již bylo uvedeno výše, tohoto úspěchu bylo dosaženo za použití nového bifunkčního (E. coli/Streptomyces) vektoru (pCD262), který byl účinný jak při experimentech s klonováním, tak při experimentech s nahrazováním genů u S. avermitilis. Jak je zřejmé z obr. 7, byly v mapě chromosomů S. avermitilis identifikovány tři sousední BamHI restrikční fragmenty (od leva do prava): 2,3kb, l,3kb a 4,lkb. l,4kb BamHI genomový fragment nese začátek El-α otevřeného čtecího rámce (ORF-1) (gen bkdF). 4,lkb BamHI genomový fragment nese zbytek genového shluku bkd (konec bkdF, bkdG a bkdH).

Plasmid pCD768 je derivátem shuttle vektoru pCD262 nesoucího dva genomové fragmenty z S. avermitilis (2,3 a 4,lkb fragment BamHI), které lemují z obou stran l,4kb BamHI fragment (viz obr. 8). Kromě toho, nese pCD768 markér ermE, který je umístěn mezi 2,3 a 4,lkb BamHI fragmenty. Markér ermE (který uděluje resistenci vůči erythromycinu) je umístěn v obrácené orientaci vzhledem k ORF-1 (bkdF), aby se zabránilo možným obtížím vyvolaným nadexpresí genů umístěných dále. Tento konstrukt podle očekávání vyvolává při rekombinaci l,4kb deleci (postižen je ORF-1) v hostitelském genomu.

Plasmid pCD768 se transformuje do protoplastú hostitele S. avermitilis ATCC 31272 SC2. Selekcí se oddělí dva transformanty vykazující resistenci k oběma antibiotikům, totiž erythromycinu (erm-R) a thiostreptonu (tsr-R) (viz příklad 9). Transformant č. 1 (CD783) se pěstuje v kapalném médiu, připraví se protoplasty a navzorkují se na agarové médium s obsahem erythromycinu. Selektuje se 50 klonů, které se dále analyzují: 46 z nich je erm-R, tsr-R a 4 jsou erm-R, tsr-S (ppl5, ppl7, pp22 a pp40). Čtyři klony z poslední skupiny a dva klony z první skupiny (ppl4 a pp2l, viz tabulka I v příkladu 9) se podrobí další analýze. Všechny vykazují bkd-deficientní genotyp: všechny čtyři klony erm-R, tsr-S jsou neschopné růst v miskách s ILV minimálním médiem; nevykazují žádnou aktivitu při stanovení El složky komplexu BCKDH a při fermentaci nejsou schopny syntetizovat přírodní avermektiny, pokud se nepřidá bud S(+)-2-methylmáselná kyselina nebo isomáselná kyselina (viz příklad 9). Kromě toho, když se k fermentačnímu médiu přidá CHC, syntetizují se nové avermektiny (CHC-avermektiny), což ukazuje, že bkd blok nepostihl biosyntetické buněčné mechanismy vedoucí k avermektinům (viz příklad 9). Jeden klon z této skupiny čtyř klonů (klon ppl5) obdržel formální označení S. avermitilis kmen CD794 a byl uložen ve sbírce American Type

Culture Collection pro účely doložení tohoto vynálezu příklady. Konečně se pomocí analýzy hybridizací Southern potvrdí, že ORF-1 odpovídající genu bkdF je přerušen, jak lze očekávat na základě nahrazení genu v S. avermitilis ATCC 31272 SC2 (viz příklad 5).

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném směru neomezují.

Příklady provedeni vynálezu

Následující příklady představují podrobné příklady experimentálních postupů použitých pro identifikaci, klonování a analýzu genů bkdFGH z S. avermitilis, které jsou rovněž ilustrovány v přiložených výkresech. Kromě toho je zde také popsána konstrukce dvou bkd-deficientních mutantů nahrazováním genů. Přídavné podrobnosti standardních technik, které jsou dobře známy odborníkům v oboru molekulární biologie a označování specifických enzymů je například popsáno v latoratorní příručce Molecular Cloning,

Sambrook, et al. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Příklad 1

Příprava genomové DNA z S. avermitilis

Mycelium S. avermitilis ATCC 31272 SC2 (jednokoloniový izolát č. 2) se napěstuje v podobě konfluentního porostu na agarovém médiu YPD-2 v průběhu 7 dnů při 29°C. Toto médium obsahuje:

kvasinkový extrakt Difco 10 g baktopepton Difco 10 g dextrosu 5 g baktoagar Difco 20 g octan sodný 2 g MOPS 10 g hodnota pH přizpůsobena na 7,0 konečný objem: 1 litr medium zpracováno v autoklávu 25 minut při 121 °C

Narostlého mycélia se potom použije pro inokulaci 30 ml média AS-7 (viz Hafner et al., 1988, evropská patentová přihláška č. 88300353.5, publikační číslo 0 284 176) ve 300ml baňce s narážkami, která se třepe (230 min^-1) při 29°C po dobu 24 hodin. Toto médium obsahuje:

modifikovaný škrob¹ 20 g Ardamin pH² 5 g Pharmamedia³ 15 g uhličitan vápenatý (CaCO₃) 2 g pH nastaveno hydroxidem sodným na 7,2 konečný objem: 1 litr medium zpracováno v autoklávu 25 minut při 121 “C ¹ vyrobí se hydrolýzou škrobu působením a-amylasy (termamyl) z Bacillus licheniformis (výrobek firmy Novo Enzymes, Wilton, CT, USA) do dextrosového ekvivalentu přibližně 40 % ² od firmy Yeast Products lne., Clifton, NJ 07012, USA ³ od firmy Traders Protein, Memphis, TN 38108, USA.

Přibližně 0,3 ml výše uvedené kultury se použije pro inokulaci další 300ml baňky s narážkami s obsahem 30 ml modifikovaného kapalného média s kvasinkovým a sladovým extraktem (Yeast Extract Malt Extract (YEME) medium) (Bibb, M. J., Freeman, R. F. a D. A. Hopwood, 1977, Mol. Gen. Genetics, 154: 155-166). Modifikované médium YEME obsahuje v 1 litru kvasinkový extrakt Difco 3 g baktopepton Difco 5 g sladový extrakt Oxoid 3 g sacharósa 300 g glukosa 10 g

Médium se 40 minut zpracovává v autoklávu při 121°C a potom se k němu přidají 2 ml 2,5M roztoku hexahydrátu chloridu horečnatého a výsledný objem se nastaví na 1 litr.

Kultury se nechají růst 48 až 72 hodin při 29'C. Mycelium se oddělí centrifugací a genomová DNA se připraví podle protokolu Isolation of Streptomyces Total DNA by Cesium Chloride Gradient Centrifugation: Proceduře 2 uvedeného v příručce Genetic Manipulation of Streptomyces, A. Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich,

Velká Británie, 1985, autoři Dr. D. A. Hopwood et al. Pelety DNA se resuspendují ve 3 ml pufru TE (lOmM tris-HCl, pH 8,0, lmM EDTA).

Příklad 2

Amplifikace genomové DNA z S. avermitilis řetězovou reakcí za použití polymerasy

Genomová DNA z S. avermitilis se enzymaticky amplifikuje za použití tepelného cyklovače Perkin-Elmer Cetus. Reakce PCR se provádí za použití polymerasy Taq (PerkinElmer Cetus) a pufru dodaného výrobcem za přítomnosti 200 μΜ dNTP, 0,5 μΜ každého z primerů, 50 ng templátové DNA a 2,5 jednotky enzymu v konečném objemu 100 μΐ v celkem 30 cyklech. Tepelný profil prvního cyklu je následující:

95°C po dobu 3 minut (denaturační stupeň), 55°C po dobu 2 minut (stupeň teplotní hybridizace) a 72°C po dobu 2 minut (prodlužovací stupeň). Následujících 29 cyklů má podobný tepelný profil, pouze s tím rozdílem, že denaturační stupeň je zkrácen na 1,5 minuty. DNA primery jsou dodány od firmy Genosys Biotechnologies lne. (Texas, USA). Pravosměrný primer (viz obr. 1) má sekvenci

5' -AAGAATTCGAGCTCGGCGACGGCGCCACCTCCGAGGGCGAC-3 ' (SEQ ID NO: 9) a levosměrný primer: (viz obr. 1) má sekvenci ’ -AAGGATCCTCTAGAGGTSSWGTGGKGGCCGATSCGGWA-3 ’ (SEQ ID NO: 10).

Pro popis sekvencí DNA se použije pravidel nomenklatury pro nukleotidy podle International Union of Biochemistry (IUB). Redundance jsou identifikovány podle kódů UIB Group Codes takto: K = G+T, S - G+C a W = A+T. Sekvence rozpoznávané při restrikci, které nejsou homologické vzhledem k El-α bkd genům, zavedené do primerů pro účely klonování jsou podtrženy (viz obr. 1). Amplifikační produkty se frakcionují podle velikosti elektroforézou na agarosovém gelu. Vzorek PCR se zpracovává elektroforézou na hořizonálním 1% agarosovém gelu v IX TBE pufru (90mM Tris-HCl, pH 8,5, 90mM kyselina boritá, 2,5mM ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA)), 1,5 hodiny při 100 V (viz výše uvedená citace Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Sambrook, et al. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Oddělené PCR DNA produkty se na gelu lokalizují barvením ethidiumbromidem a vizualizují jako fluorescentní pásy v ultrafialovém světle 365 nm. Za podmínek PCR uvedených výše a za použití výše uvedené kombinace primerů se deteguje jediný pás DNA (přibližné o délce 550 bp).

Příklad 3

Klonování 0,55kb PCR-amplifikovaného fragmentu genomové DNA z S. avermitilis do vektoru E. coli a následující transformace do hostitele E. coli

A. Izolace 0,55kb PCR produktu

Jak již bylo uvedeno výše, 0,55kb fragment DNA se amplifikuje PCR za použití genomové DNA z S. avermitilis, jako templátu a výše uvedené kombinace pravosměrného a levosměrného primeru. Jak je zřejmé z obr. 1, pravosměrný primer obsahuje místo rozpoznávané restrikčním enzymem EcoRI u 5' konce a levosměrný primer obsahuje místo rozpoznávané restrikčním enzymem Xbal u 5' konce. Potom se klonuje 0,55kb PCR fragment za použití ligačního postupu, při němž se jak insert, tak klonovací vektor štěpí EcoRI a Xbal. Po amplifikaci (popsané v příkladu 2) se přibližně 80 μΐ PCR reakční směsi nanese na 1% agarosový gel, kde se podrobí elektroforéze. 0,55kb DNA fragment se vizualizuje způsobem popsaným výše a izoluje elektroelucí, která se provádí takto: 0,55kb DNA pás se sejme holicí čepelkou a DNA se izoluje z agarosového gelu 35minutovou elektroelucí při 80 V do jímky tvaru písmene V naplněné 7,5M octanem amonným za použití jednosměrného elektroelutoru (International Biotechnoiogy lne.

New Haven, CT, USA). Potom se DNA vysráží ethanolem, peletizuje a nakonec znovu rozpustí ve 20 μΐ DNA pufru (lOmM Tris-HCl, 4mM chlorid sodný, 0,lmM EDTA, pH 7,5).

B. Štěpení restrikčními enzymi EcoRI a Xbal

Celé množství PCR materiálu získaného výše uvedeným způsobem se podrobí simultánnímu štěpení restrikčními enzymy EcoRI a Xbal (vždy 1 jednotka enzymu) podle doporučení dodavatele (Boehringer Mannheim Biochemicals). Podobně se přibližně 1 gg plasmidu pGEM-3Z (Promega Corp. Madison,

WI, USA) a 2 jednotky restrikčního enzymu EcoRI a Xbal (všechny restrikční enzymy byly zakoupeny od firmy Boehringer Mannheim Biochemicals) se inkubují v pufru pro stanovení (specifikovaném dodavatelem) při 37°C po dobu 4 hodin v celkovém reakčním objemu 60 μΐ. Tak se získají lineární molekuly. Potom se jak PCR fragment, tak linearizovaný vektor separátně extrahuje dvakrát vždy stejným objemem směsi fenolu a chloroformu, dvakrát vždy stejným objemem etheru a nakonec se DNA vysráží přídavkem dvou objemů absolutního ethanolu. Vysrážená DNA se izoluje lOminutovou centrifugací při 10 000 x g a vysuší se za vakua. Získaná peleta PCR fragmentu se znovu rozpustí ve 20 μΐ DNA-pufru.

C. Ligace za vzniku pCD613

Přibližně 11 μΐ 0,55kb PCR DNA produktu zpracovaného EcoRI/Xbal a asi 1 μΐ EcoRI/Xbal-linearizovaného pGEM-3Zf se inkubuje přes noc s 1 jednotkou ligasy (New England BioLabs, IC, Beverly, MA, USA) za podmínek specifikovaných dodavatelem při 15’C v celkovém reakčním objemu 20 μΐ. Reakce se ukončí tím, že se mikrozkumavka, ve které se stanovení provádí, vloží do ledu. Získaných 20 μΐ reakční směsi se potom použije pro transformaci kompetentních buněk E. coli DH5-a za použití standardního postupu popsaného ve výše uvedené citaci Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Sambrook, et al. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).. Získá se mnoho ampicilinresistentních transformantů. Plasmidový vektor p-GEM-3Z obsahuje segment

DNA pocházející z lac operonu Escherichía coli, který kóduje aminoterminální fragment β-galaktosidasy (Yanisch-Perron,

C., Vieira, J. a J. Messing, 1985, Gene, 33, 103). Tento fragment, jehož syntézu je možno indukovat isopropylthio-βD-galaktosidem (IPTG) je schopen intra-allelové (a) komplementace s defektní formou β-galaktosidasy kódovanou hostitelem. Buňky E. coli po expozici indukčnímu IPTG syntetizují oba fragmenty enzymu a na miskách s médiem obsahujícím chromogenní substrát 5-brom-4-chlor-3-indolyl^-D-galaktosid (X-gal) vytvářejí modré kolonie. Vložení cizí DNA do polyklonovacího místa plasmidu inaktivuje aminoterminální fragment β-galaktosidasy a ruší α-komplementaci. Bakterie nesoucí rekombinantní plasmidy proto vytvářejí bílé kolonie. Při tomto transformačním pokusu se izolují četné bílé kolonie. Tyto kolonie by měly obsahovat plasmid pCD613. Tato skutečnost se potvrdí následujícím pokusem. Vybere se jedna kolonie, která se označí jako kmen CD613, a podrobí se další analýze. Jediná bakteriální kolonie E. coli kmene CD613 se inokuluje na kapalné médium Luria-Bertani (LB) s obsahem 50 mg/ml ampicilinu za použití standardních mikrobiologických postupů. Použité LB médium obsahuje:

baktotrypton 10 g bakto-kvasinkový extrakt 5 g chlorid sodný 10 g hodnota pH nastavena na 7,0 5N roztokem hydroxidu sodného konečný objem roztoku nastaven na 1 litr médium sterilizováno v autoklávu 20 minut při 121'C

Kultura se inkubuje přes noc při 35°C. Následujícího rána se bakteriální buňky sklidí 5minutovou centrifugací při frekvenci otáčení 10 000 min”¹ a teplotě 4°C. Plasmidový vektor se izoluje z čerstvě sklizených buněk Escherichía coli CD613 za použití modifikace Birnboimovy a

Dolyho metody (Nucleic Acids Res., 1979, 7; 1513 až 1523); tato modifikace je popsána v Denoya et al., 1985, Microbios Lett. 29: 87 až 93. Izolovaná plasmidová DNA se potom rozpustí v DNA pufru (lOmM Tris-HCl, 4mM chlorid sodný, O,lmM kyselina ethylendiamintetraoctová, pH 7,5) na koncentraci přibližné 1 μ9 pCD613 v 10 μΐ pufru. Potvrzující restrikční analýza za použití restrikčních enzymů EcoRI a Xbal ukazuje, že podle očekávání pCD613 nese 0,55kb insert DNA.

Příklad 4

Příprava rovnoměrně radioznačených dvouřetězcových DNA prób

Dvouřetězcové DNA próby se připraví translací nick (obecný postup této techniky je popsán v publikaci Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Sambrook, et al. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Nejprve se připraví specifický fragment DNA nesoucí cílovou sekvenci vhodným restrikčním štěpením a tento fragment se purifikuje elektroelucí v podstatě za podmínek uvedených v příkladu 1. Přibližně 1 μg DNA se vždy označí za použití [a-³²P]dCTP ([a-³²P]-značená tetra(triethylamoniová) sůl deoxycytidin-5'-trifosfátu) zakoupené od firmy NEN-Dupont, a systému BRL Nick Translation System (výrobek zakoupen od firmy BRL Life Technologies Inc.) podle instrukcí získaných od dodavatele. Obvykle se tato reakce provádí v objemu 50 μΐ. Po přidání 5 μΐ Stop pufru (jak je to popsáno v doporučeném postupu od firmy BRL) se značená DNA oddělí od neinkorporovaných nukleotidů pomocí protlačovacího sloupce Stratagene způsobem uvedeným v instrukčním manuálu dodavatele. Těmito postupy se vždy rutinním způsobem získá ³²P-značená DNA se specifickou aktivitou zaručeně vyšší než 10⁸ cpm/^g.

Příklad 5

Analýza genomové DNA z S. avermitilis hybridizací Southern

Přibližně 10 μg purifikované genomové DNA z S. avermitilis se štěpí 2 jednotkami restrikčního enzymu BamHI při 37 °C nejméně po dobu 2 hodin. Na konci štěpení se fragmenty DNA oddělí elektroforézou na 1% agarosovém gelu (viz příklad 1A) a přes noc se přenesou na nylonovou membránu o velikosti pórů 0,45 μη (Schleicherovy a Schuell Nytranovy membrány) za použití kapilární přenosové metody (Southern, E.M. 1975, J. Mol. Biol. 98: 503). Následujícího dne se nylonové membrány zabalí do plastového obalu a ta strana každé membrány, která obshuje DNA, se exponuje zdroji ultrafialového záření (302 nm), aby se DNA fixovala k membráně. Hybridizace radioznačených RNA a DNA prób k DNA imobilizované na nylonové membráně se provádí podle protokolu popsaného ve výše uvedené publikaci Molecular Cloning:

A Laboratory Manual, 2. vydání, Sambrook, et al. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) (ále je tato publikace označování názvem Sambrookův manuál). Prehybridizace a hybridizace se provádí při 42°C. Hybridizačni roztok obsahuje: 6x SSC (lx: 0,15M chlorid sodný, 15mM citran sodný, pH 7,0), lOx Denhardtovo činidlo (lx: 0,02% ficoll, 0,02% polyvinylpyrrolidon, 0,02% hovězí sérový albumin), 1% SDS (natriumdodecylsulfátu), 100 μg/ml denaturovanou fragmen to vanou DNA z lososího sperma, 100 μg/ml E. coli tRNA a 50% formamid (Fluka). Hybridizace se provádí přes noc a potom se membrány opláchnou následujícím způsobem: dva oplachy 1 x SSC, 0,1% SDS při teplotě místnosti po dobu 15 minut a 2 oplachy 0,1 x SSC, 0,1% SDS při 42°C po dobu 15 minut. Při některých pokusech se hybridizace provádí při 65°C za nepřítomnosti formamidu a používá se SSPE (lx: 0,18M chlorid sodný, lOmM fosforečnan sodný (NaPO₄), pH

7,7, lmM EDTA) místo SSC. Nakonec se membrány exponují na rentgenografický film, by se získal autoradiografický obraz.

Příklad 6 Sekvenování DNA

A. Sekvenování dvouřetězcového DNA PCR produktu neseného v plasmidů pCD613

Plasmid pCD613 v podobě nadšroubovice se připraví způsobem popsaným v příkladu 2. Před sekvenováním se přibližně 4 μg dvouřetězcového pCD613 převede na jednořetězcovou formu. To se provede alkalickou denaturací popsanou v příručce v Taq Track Sequencing Systems Technical Mannual (Promega Co., Madison, WI, USA). Pro sekvenaci se použije oligonukleotidových primerů syntetizovaných v Genosys Biotechnologies, lne., Texas, USA. Vektorový primer 1 (5¹AAGGATCCTGCAGCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGA-3 ' SEQ ID NO: 11) mapuje před místem EcoRI několikanásobného klonovacího místa pGEM-3Z (MCS) (polohy 2689 až 2712) a primer 2 (5'-AAGGATCCTGCAGACAGCTATGACCATGATTACGCCA-3' SEQ ID NO: 12) mapuje za místem HindlII MCS (polohy 91 až 114).

B. Klonování 0,35kb genomového fragmentu Sáli z S. avermitilis pocházejícího z pCD613 do bakteriofágu M13 a sekvenování DNA

Jak to již bylo diskutováno výše, restrikční analýza ukazuje, že genomový fragment CD613 získaný pomocí PCR obsahuje vnitřní 0,35kb Sáli fragment. Tento 0,35kb Sáli fragment DNA z S. avermitilis se klonuje do bakteriofágu M13mpl8 za účelem přípravy jednořetězcových rekombinantních DNA pro použití jako templátů při Sangerově dideoxy-sekvenační metodě (Sanger et al., 1977, Proč. Nati. Acad. Sci.

USA 74: 5463 až 5467). Asi 2 μg plasmidů pCD613 vyrobeného minipreparačním postupem popsaným výše se štěpí restrikčním enzymem Sáli 2 hodiny při 37°C za účelem uvolnění 0,35kb genomového fragmentu S. avermitilis. Po štěpení se směs podrobí elektroforéze na 1,2% agarosovém gelu a 0,35kb fragment se podrobí elektroeluci a vysráží se výše uvedeným způsobem. Kromě toho se asi 1 μg každé purifikované dvouřetězcové replikační formy (RF) DNA z M13mpl8 štěpí Sáli, defosforyluje alkalickou fosfatasou z telecího střeva (CIAP) (enzym zakoupen od firmy Promega Corp., Madison, WI, USA) a nakonec liguje k 0,35kb DNA fragmentu způsobem popsaným výše. Purifikovaný klonovací vektor RF M13 je zakoupen od firmy New England BioLabs. Ligačních směsí se použije pro transfekci kompetentních buněk E. coli JM109. Získá se několik bílých plaků. Vyberou se dva jednotlivé bílé plaky z transfekce mpl8 nesoucí inserty s opačnými orientacemi a podrobí fágovému růstu, načež se připraví jednořetězcová DNA způsobem popsaným v Sambrookově manuálu. Sekvenování DNA každého jednořetězcového DNA templátu se provádí za použití M13-specifického-40 sekvenačního primeru (New England Biolabs, katalogové číslo 1212), deoxyadenosin-5’-(a-thio)trifosfátu, [³⁵S] (NEN-Dupont) a sekvenační soupravy TaqTrack (Promega) podle instrukcí dodavatele, tj. Promega.

C. Sekvenování některých genomových oblastí umístěných v klonovaném 4,lkb BamHI fragmentu nesoucím část genu bkdF pomocí transposonu

Pro sekvenaci oblastí DNA umístěných za otevřeným čtecím rámcem bkdF v klonovaném 4,lkb BamHI genomovém fragmentu z S. avermitilis se použije insercí mini-gamma-delta1 transposonu. Mini-gamma-delta-1 element je malý (l,8kb) gamma-delta-(TnlOOO)derivát, který obsahuje gen kan z Tn5 a resoluční (res) místo z gamma-delta klonovaného mezi dvě 40-bp inversní repetice jednoho z gamma-delta konců (Berg C.

M. et al., 1992, Gene, 113: 9 až 16). Mini-gamma-delta-1 postrádá geny kódující transposasu a resolvasu, a proto je závislý na hostiteli, pokud jde o dodání transpozičních a resolučních funkcí. V kmenech postrádajících pomocný transposon, tedy mini-gamma-delta-1 netransponuje a inserce je stabilní. Vnitřní konce obrácené k inversním repeticím jsou jedinečné sekvence, kterých lze použít jako vazebných míst pro primer za účelem sekvenování DNA. Transposonové inserce se připraví v podstatě způsobem popsaným v Berg C.

M. et al., 1993, Method in Enzymology, Academie Press, sv. 218, str. 279 až 306. Každého vloženého transposonu se použije jako počátečního templátu pro sekvenování Streptomyces DNA umístěné v obou místech inserce. Použije se dvou universálních primerů: res primerů (5'-GTAGGGAGCCTGATATG-3 SEQ ID NO: 13) a kan primerů (5'-GCTATCCGCGCATCCAT-3' SEQ ID NO: 14). Dvě mini-gamma-delta-1 inserce, označené jako A3 (klon CD785) a A5 (klon CD786), se umístí přibližně 1,7 kb a 3 kb od BamHI konce obsahujícího bkdF ORF. Sekvenování DNA prováděné u obou konců každé inserce ukazuje, že inserce A3 (sekvence CD785) je blízko konce El-β OFR (bkdG) (obr. 5) a inserce A5 (sekvence CD786) je blízko konce E2 OFR (bkdH) (obr. 6).

Příklad 7

Klonování úplného shluku genů z S. avermitilis bkd a sestrojení chromosomální mapy

Přibližně 4 μ-g purif ikovaného pCD613 se štěpí za použití restrikčního enzymu Sáli. Fragmenty DNA se oddělí elektroforézou na 1,2% agarosovém gelu, elektroelucí se získá přibližně 0,35 kb dlouhý Sáli DNA fragment nesoucí sekvenci specifickou pro gen El-α z S. avermitilis bkdF a ten se značí nick translací v podstatě způsobem popsaným výše. Získaného [³²P]-značeného DNA fragmentu se potom použije jako próby pro screening genomové kosmidové knihovny S. avermitilis. Podrobný obecný popis přípravy genomových knihoven je možno nalézt v Sambrookově manuálu. Úplný popis přípravy chromosomální knihovny streptomycetes je uveden v příručce Genetic Manipulation of Streptomyces - A Laboratory Manual, Hopwood et al. (1985). Popis kosmidových vektorů je možno nalézt v americké patentové přihlášce č. 08/048,719, podané 16. dubna 1993 o názvu Cosmid Vectors for Streptomyces Genomic DNA Cloning původce Denoya C. D.

Při screeningu více než 2200 rekombinantních klonů v knihovně jsou identifikováno deset klonů. Těchto deset hybridizujících klonů (označených jako klony E. coli CD519, CD521, CD691, CD692, CD694, CD695, CD696, CD697, CD698 a CD699) se nechají růst na LB médiu a z každé kultury se výše uvedeným způsobem připraví plasmid. Restrikční analýza a hybridizační analýza Southern blot ukazuje, že těchto deset klonů je příbuzných a obsahuje překrývající se chromosomové oblasti. Je zajímavé, že dva z těchto kosmidových klonů, totiž CD519 a CD521 byly také uvedeny v seznamu kosmidových klonů identifikovaných za použití próby bkdA (viz C. D. Denoya, patentová přihláška USA č. 08/100,518, citovaná výše). Standardními postupy se také získá restrikční mapa genomu S. avermitilis pokrývající celou chromosomovou oblast včetně sekvence CD613 (tato restrikční mapa je znázorněna na obr. 2). Na tomto obrázku jsou také znázorněny vazby mezi zde popsanými novými bkd geny a geny popsanými dříve (viz C. D. Denoya, patentová přihláška USA č. 08/100,518, podaná 30. července 1993). Oba shluky genů bkd jsou od sebe umístěny přibližně 12 kb.

Příklad 8

Transformace Streptomyces lividans shuttle vektory a příprava plasmidových vektorů z transformantů S. lividans ve velkém měřítku

Při těchto pokusech se použije S. lividans kmene TK64. Média pro růst a protoplastování S. lividans a příprava protoplastů a transformace se provádějí způsobem popsaným v D. A. Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces - A Laboratory Manual, 1985, The John Innes Fundation, Norwich, Velká Británie). V této citaci je kromě toho také uveden úplný popis S. lividans kmene TK64. Protoplasty S. lividans transformované přímo shuttle vektorem pCD262 nebo řadou jeho derivátů se podrobí selekci na resistenci vůči thiostreptonu. Ze selektovaných transformantů se následujícím způsobem vyrobí plasmidové DNA. Kultury se nechají růst v modifikovaném kapalném médiu s kvasinkovým a sladovým extraktem (Yeast Extract Malt Extract (YEME) medium) (Bibb, M. J., Freeman, R. F. a D. A. Hopwood, 1977, Mol. Gen. Genetics, 154: 155-166). Modifikované médium YEME obsahuje v 1 litru kvasinkový extrakt (3 g), baktopepton 5 g), sladový extrakt (3 g) a sacharosu (340 g). Médium se zpracuje v autoklávu a potom se k němu přidají 2 ml 2,5M roztoku hexahydrátu chloridu hořečnatého. Kultury se nechají růst 40 až 48 hodin při 30°C. Mycelium z 500ml kultury buněk streptomycetes se oddělí centrifugací a resuspenduje na konečný objem 50 ml v roztoku lysozymu (2 mg/ml lysozymu v 0,3M roztoku sacharosy, 0,025M Tris-HCl, pH 8,0 a 0,025M EDTA). Po tomto stupni se připraví plasmidy za použití postupu s alkalickou lyží. Tento postup je v podtatě popsán v manuálu Genetic Manipulation of Streptomyces A Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, Velká Británie, 1985. Pelety DNA se resuspendují ve 500 ml lOmM pufru Tris-HCl o pH 8,0 s přísadou EDTA (lmM) a potom se provede další purifikace ultracentrifugací za použití gradientu chloridu česného a ethidiumbromidu v podstatě způsobem popsaným v Sambrookově manuálu. Izolovaná plasmidová DNA se nakonec rozpustí v DNA pufru (lOmM Tris-HCl, 4mM chlorid sodný, O,lmM EDTA, pH 7,5) za vzniku roztoku plasmidové DNA o koncentraci přibližně 1 μg plasmidu/10 μΐ pufru.

Příklad 9

Sestrojení S. avermitilis bkdF mutantu

Pro zavedení chromosomální delece se použije techniky, která představuje obměnu metod nahrazování genů použitých u Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli a Bacillus subtilis (Scherer, S. a R. W. Davis, 1979,

Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 76: 4951-4955; Shortle, D. , et al., 1982, Science, 217:371-373; Stáhl, M. L. a Ferrari, Ε., 1984, J. Bacteriol., 158:411-418). Obecný popis této techniky specificky aplikované na Streptomyces je možno najít v přehledné práci Genetic Manipulation of Streptomyces: Integrating Vectors and Gene Replacement, Kieser T. a Hopwood D. A. (1991, Methods in Enzymology, sv. 204, 430 až 458). Podrobný popis této techniky, včetně přídavného stupně protoplastování, kterého je zapotřebí pro zajištění jednokoloniových izolátů a pro zvýšení frekvence eliminace plasmidu, je také možno najít v práci Anzai et al., Replacement of Streptomyces hygroscopicus genomic segments with in vitro altered DNA sequences, Journal of Antibiotics, 1988, sv. XLI, č. 2, str. 226 až 233. Stupeň protoplastování a regenerace často stimuluje ztrátu plasmidu. Většina bifunkčních vektorů E. coli/Streptomyces (jako je pCD262, použitý v této práci) však vyvolává příležitostný vznik buněk neobsahujících plasmid po jednom nebo dvou kolech neselektivního růstu (Kieser T. a Hopwood D. A. (1991, Methods in Enzymology, sv. 204, 430 až 458).

A. Sestrojení shuttle vektoru nesoucího inaktivovanou kopii bkdF genu

Jak je to znázorněno na obr. 7, mapovány jsou tři sousední BamHI restrikční fragmenty v oblasti chromosomu S. avermitilis zahrnující genový shluk bkd (od leva do prava): 2,3kb, 1,4kb a 4,lkb. 1,4kb BamHI genomový fragment nese začátek El-α otevřeného čtecího rámce (ORF-1) (gen bkdF). 4,lkb BamHI genomový fragment nese zbytek genového shluku bkd (konec bkdF, bkdG a bkdH). Každý z těchto restrikčních fragmentů se subklonuje do E. coli vektoru pGEM-3Z. Získají se následující konstrukty: plasmid pCD740 obsahující 2,3kb BamHI fragment; plasmid pCD854 obsahující l,4kb BamHI fragment; plasmid pCD713 obsahující 4,lkb BamHI fragment (viz obr. 2). Sestrojení vektoru nesoucího inaktivovanou kopii bkdF genu se provádí ve dvou stupních. V prvním stupni se oba fragmenty, tj. 4,lkb BamHI S. avermitilis fragment a l,6kb BglII fragment nesoucí ermE markér, udělující resisten ci vůči antibiotiku erythromycinu, klonují do shuttle vektoru pCD262 (C. D. Denoya, 1993, Novel Bacterial Plasmid Shuttle Vectors for Streptomyces sp. and Escherichia coli, patentová přihláška USA 032 925 podaná 18. března 1993) takto: Přibližně 1,5 μg pCD713 se rozštěpí restrikčním enzymem BamHI a podrobí elektroforéze na 0,8% agarosovém gelu. Po elektroforéze se z gelu za použití soupravy GeneClean Kit podle instrukcí výrobce (Bio 101 lne.,

La Jolla, CA, USA) získá 4,lkb BamHI fragment. Podobně se asi 2 μg plJ4026 rozštěpí restrikčním enzymem BglII a podrobí elektroforéze na 0,8% agarosovém gelu. Plasmid plJ4026 je derivátem E. coli klonovacího vektoru pUC18 nesoucího gen ermE z Saccharopolyspora erythraea (dříve Streptomyces erythraeus) (M. Bibb et al., 1985, Gene, 41:357 až 368 a D. A. Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces - A Laboratory Manual, 1985, The John Innes Fundation, Norwich, Velká Británie). Po elektroforéze se z gelu za použití soupravy GeneClean Kit podle instrukcí výrobce (Bio 101 lne., La Jolla, CA, USA) získá l,6kb BglI fragment. Kromě toho se alikvot purifikovaného plasmidu pCD262 linearizuje restrikčním enzymem BglII, defosforyluje alkalickou fosfatasou z telecího střeva (CIAP) (enzym zakoupen od firmy Promega Corp., Madison, WI, USA) a nakonec liguje k 4,lkb BamHI a l,6kb BglII purifikovaným fragmentům popsaným výše. Ligační reakce se přeruší tím, že se mikrozkumavka, ve které se stanovení provádí, vloží do ledu. Získaných 20 μΐ reakční směsi se potom použije pro transformaci kompetentních buněk E. coli DH5-a za použití standardního postupu popsaného v příkladu 1. Získá se mnoho ampicilinresistentních transformantů. Tyto kolonie by měly obsahovat plasmid pCD761. To se potvrdí tak, že se zvolí jedna kolonie (označená jako kmen CD761) a rekombinantní plasmid získaný z tohoto kmene se analyzuje za použití několika restrikčních enzymů. Plasmid pCD761 je derivátem shuttle vektoru pCD262 nesoucího jak 4,lkb S. avermitilis BamHI genonový fragment, tak l,6kb BglII DNA fragment nesoucí ermE markér, přičemž oba tyto fragmenty jsou orientovány způsobem znázorněným na obr. 7. Potom se plasmid pCD761 linearizuje restrikčním enzymem BglII, defosforyluje alkalickou fosfatasou z telecího střeva (CIAP) (enzym zakoupen od firmy Promega Corp., Madison, WI, USA) a nakonec liguje k 2,3kb BamHI S. avermitilis fragmentu izolovanému z plasmidu pCD740. Ligační reakce se přeruší tím, že se mikrozkumavka, ve které se stanovení provádí, vloží do ledu. Získaných 20 μΐ reakční směsi se potom použije pro transformaci kompetentních buněk E. coli DH5-a za použití standardního postupu popsaného v příkladu 1. Získá se mnoho ampicilinresistentních transf ormantů. Tyto kolonie by měly obsahovat plasmid pCD768. To se potvrdí tak, že se zvolí jedna kolonie (označená jako kmen CD768) a rekombinantní plasmid získaný z tohoto kmene se analyzuje za použití několika restrikčních enzymů. Plasmid pCD768 je derivátem shuttle vektoru pCD262 nesoucího jak 2,3kb S. avermitilis BamHI genonový fragment, tak 4,lkb BamHI S. avermitilis genomový fragment. Tyto fragmenty sousedí z každé strany s l,4kb BamHI fragmentem v chromosomu divokého typu. pCD768 kromě toho nese ermE markér , který je umístěn mezi 2,3 a 4,lkb BamHI fragmenty. Markér ermE je umístěn v obrácené orientaci vzhledem k ORF-1 (bkdF), aby se zabránilo možným obtížím vyvolaným nadexpresí genů umístěných dále. Tento konstrukt podle očekávání vyvolává při rekombinaci l,4kb deleci (postižen je 5' konec bkdF genu) v hostitelském genomu.

B. Transformace Streptomyces avermitilis shuttle vektory

Shuttle vektory (pCD262 a pCD768) použité pro transformaci protoplastů S. avermitilis se připraví bud z transformovaných buněk E. coli DH5-a nebo E. coli CD167 (kmen CD 167 je jednokoloniový izolát získaný z E. coli GM163; posledně uvedený izolát poskytl Dr. B. J. Bachmann, Curator, E. coli Genetic Stock Center, Yale University) (viz příklad 1) nebo z transformovaných buněk S. lividans TK64 (viz příklad 8).

Důsledně se používá S. avermitilis kmene ATCC 31272 jednokoloniového izolátu č. 2 (SC2). Pro přípravu protoplastů S. avermitilis se použije tří alternativních inokul:

1. spor (připravených způsobem popsaným v D. A. Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces

- A Laboratory Manual, 1985, The John Innes Fundation, Norwich, Velká Británie,

2. zmrazeného mycelia zpracovaného ultrazvukem (příprava viz dále) a

3. kolonií na agaru YPD-2 (viz příklad 1).

Zmrazené mycelium zpracované ultrazvukem se připraví takto: myceliální kultura se nechá růst v médiu Trypticase Soy Broth (TSB) až do turbidity 2 až 9 při 600 nm a potom se desetkrát homogenizuje ve skleněném rozmělňovacím zařízení pro tkáně. Homogenizované mycelium se zředí dvakrát pomocí TSB a 20 ml výsledného přípravku se předloží do sterilní polypropylenové centrifugační zkumavky. Ultrazvuková próba (Bronwill Biosonik III) se ponoří do hloubky 1 až 2 cm do kapaliny a vzorek se zpracovává ultrazvukem při 50% intenzitě (výkon ve wattech je nastaven na polovinu po dobu 10 sekund). Zpracováním ultrazvukem se myceliální hmota disperguje na jedno- nebo dvojbuněčné jednotky, které vykazují rychlý exponenciální růst při přenesení do subkultury. Myceliální přípravek zpracovaný ultrazvukem se zředí glycerolem na výslednou koncentraci 40 %, pipetou se přenese do lahvičky a nechá zmrazit při -85°C. Sporami, myceliem nebo homogenizovanou kolonií se inokuluje médium YEME (viz příklad 1) s obsahem 0,5 % glycinu. Příprava protoplastů S. avermitilis a transformační protokol se provádí způsobem popsaným v D. A. Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces - A Laboratory Manual, 1985, The John Innes Fundation, Norwich, Velká Británie s modifikacemi popsanými v MacNeil, D. J. a Klapko L. Μ., J. Industrial Microbiol, 1987, 2, 209 až 218. Protoplasty S. avermitilis transformované shuttle vektorem pCE262 nebo jeho derivátem, jako je shuttle vektor pCD768, se podrobí selekci na thiostrepton (pCD262) nebo erythromycin (pCD768).

C. Izolace erythromycin-resistentního, thiostrepton-sensitivního mutantu S. avermitilis za použití pCD768

Výše popsaným způsobem se plasmid pCD768 transformuje do protoplastů S. avermitilis 30272 SC2. Primární transformanty S. avermitilis se podrobí selekci za použití 4 μg erythromycinu na 1 ml regeneračního média (RM14) v misce (složení tohoto média je uvedeno výše). Dva erythromycin-resistentní (erm-R) transformanty (č. 1 a 2) se přenesou do misek s agarem YPD-2 (viz příklad 1) s obsahem bud 4 gg/ml erythromycinu nebo 4 μg/ml thiostreptonu. Oba transformanty jsou resistentní vůči oběma antibiotikům (erm-R, tsr-R). Transformant č. 1 (označený jako S. avermitilis kmen CD783) byl zvolen pro další práci. Tento kmen se nechá růst v kapalném médiu YEME. Připraví se protoplasty, a ty se přenesou na misky s regeneračním médiem s obsahem erythromycinu 4 μg/ml. Tento stupeň regenerace protoplastů se provádí pro zajištění jednokoloniové izolace a také pro zvýšení ztráty plasmidu (Anzai H. et al., 1988, Replacement of Streptomyces hygroskopicus Genomic Segments with in Vitro Altered DNA Sequences, The Journal of Antibiotics, sv. XLI, č. 2, str. 226 až 233). Regenerují se četné kolonie a 50 klonů se přenese na misky obsahující erythromycin nebo thiostrepton. 46 kolonií z 50 je schopno růst na thiostreptonu. Je možno shrnout, že 46 kolonií je erm-R, tsr-R a pouze 4 kolonie jsou erm-R, tsr-S. Kolonie erm-R, tsr-S představují fenotyp, který je očekáván po provedené integraci (dvojnásobný efekt crossover), přičemž volný replikon je ztracen. Další analýze se proto podrobí 4 klony s fenotypem erm-R a tsr-S (ppl5, ppl7, pp22 a pp40) spolu se dvěma klony erm-R, tsr-R (kterých se použije jako kontrolních klonů) (ppl4 a pp21).

D. S. avermitilis bkdF mutant: fenotyp S. avermitilis nesoucí chromosomální deleci postihující 5' konec genu bkdF

Provedou se následující analýzy: 1. analýza schopnosti růstu v miskách s minimálním agarovým médiem obsahující isoleucin, leucin a valin (ILV) jako jediný zdroj uhlíku; 2. stanovení aktivity rozvětvená a-ketokyselina dehydrogenasy (BCKDH) El a 3. zkouška schopnosti produkovat přírodní a nové avermektiny během fermentace. Následuje popis těchto tří metod.

1. Misky s ILV: Použije se obměny klasického minimálního média M9 (Anderson Ε. Η., 1946, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 32: 120 až 128). Modifikované médium M9 obsahuje v 1 litru 7,5 g agarosy (SeaKem ME, FMC BioProducts, Rockland, ME a 650 ml destilované vody. Médium se 15 minut zahřívá v autoklávu na teplotu 121°C, potom se ochladí a přidají se k němu následující sterilní roztoky:

roztok 25 x M9 solí 40 ml minerální zásobní roztok 2,1 ml

0,1M roztok heptahydrátu síranu železnatého 0,1 ml směs ILV 250 ml pH nastaveno na 7,0 konečný objem: 1 litr objem vztažený na misku: 25 ml

Roztok 25 x M9 solí se připraví rozpuštěním následujících solí v deionizované vodě a upravením objemu deionizovanou vodou na 1,2 litru:

hydrogenorthofosforečnan draselný 125 g monohydrát dihydrogenorthofosforečnanu sodného 55 g dusičnan sodný 48 g pH nastaveno na 7,0

Solný roztok se rozdělí na 160ml alikvoty, které se sterilizují zahříváním v autoklávu na 121C po dobu 15 minut.

Minerální zásobní roztok obsahuje:

heptahydrát síranu hořečnatého (1M) chlorid vápenatý (1M) a monohydrát síranu manganatého (0,25M)

Vzniklý roztok se 15 minut zahřívá v autoklávu na teplotu 121°C.

Směs ILV se připraví rozpuštěním 10 g L-isoleucinu, 10 g L-leucinu a 10 g L-valinu v 1 litru deionizované vody. Vzniklý roztok se sterilizuje filtrací.

V těchto miskách jsou bkd-deficientní mutanty neschopny růstu. Vyhodnocení mikroorganismů, které nejsou schopny utilizovat ILV se provádí po 14-denní inkubaci při 29°C.

2. Stanovení El komponenty komplexu rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy (BCKDH) z S. avermitilis

Aktivita BCKDH El se stanoví modifikovaným postupem radiochemického stanovení popsaného výše (Hafner E. W. et al., 1995, J. Antibiotics 44: 349 až 356). Zvolené izoláty se nechájí růst v miskách s agarem PD-2 6 až 7 dnů při 29C. Když dojde k nárůstu, přenese se z každé kolonie rostoucí na miskách s agarem YPD-2 shluk buněk o velikosti špendlíkové hlavičky pomocí sterilního zubního párátka na dno 15ml skleněné scintilační nádoby. Buňky se resuspendují a permeabilizují přídavkem 100 μΐ směsi obsahující toluen/a-[l-^⁴C]-ketoisokaproát (vyrobené dále popsaným způsobem); Hrdlo lahvičky se ihned zakryje papírem Whatman 4CHR (Whatman katalogové číslo 3004614), který je napuštěn prostředkem Solvable (tkáňový a gelový solubilizátor zakoupený od firmy NEN-Dupont). Lahvička se potom těsně uzavře plastovým uzávěrem, přičemž jak uzávěr, tak horní polovina lahvičky se obalí parafilmem. Inbubace za mírného protřepávání se provádí 3,5 hodiny při 29°C. Po skončení inkubace se filtrační papír přenese do 7ml skleněné scintilační kyvety obsahující 4 ml kapalného scintilačního koktejlu Ready Safe (Beckman) za účelem stanovení radioaktivity.

Radioaktivita se měří po ekvilibraci v tomto rozpouštědle po dobu 4 nebo více hodin. Směs toluen/a-[l-¹⁴C]-ketoisokaproát se připraví přídavkem 22 μΐ zásobního roztoku a-[l-¹⁴C]ketoisokaproátu k 1 ml solného média M9 (Davis, R. W. et al., 1980, Appendix 1: Media, drug concentrations, and nutritional supplements v A Mannual for Genetic Engineering - Advanced Bacterial Genetics str. 203, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., USA) obsahujícího 5 % toluenu, které bylo zpracováváno ultrazvukem až do vzniku mléčně bílé disperse toluenu. a-[l-¹⁴C]-ketoisokaproátový zásobní roztok se vyrobí tak, že se smíchá 2,8 μΐ 20mM a-ketoisokaproátu (sodná sůl, Sigma, K-0629), 50 μΐ α-[l-¹⁴C]ketoisokaproátu (55 mCi/mmol, 50 μΟί/ιηΙ, Amersham) a dostatečným množstvím vody do celkového objemu 1 ml. Koncentrace proteinu se stanoví zkouškou na proteiny Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornie, USA), která je založena na Bradfordově vazbě barviva (Bradford M. Anal. Biochem., 72: 248, 1976). Specifická aktivita El složky rozvětvená a-ketokyselina dehydrogenasy se uvádí v pmol oxidu uhličitého uvolněného na minutu na 1 mg proteinu (viz tabulka I).

3. Produkce avermektinu: Mycelium buď S.avermitilis ATCC 31272 SC2, nebo S. avermitilis kmene CD794 (bkdF) pěstované na miskách s čerstvým modifikovaným agarem YPD-2 (modifikace spočívá ve vypuštění acetátu z normálního média YPD-2, viz příklad 1) po dobu 5 až 7 dnů se inokuluje do 50ml (2,54 x 16,8 cm) kultivační zkumavky obsahující 8 ml minimálního definovaného média (viz dále). Zkumavka se třepe v úhlu 45° při frekvenci otáčení třepačky 200 min^-1 72 hodin při 29°C. Potom se 2ml alikvotní vzorek narostlé očkovací kultury použije pro inokulaci nové 300ml baňky obsahující 25 ml minimálního definovaného média, k němuž byly popřípadě přidány různé mastné kyseliny. Fermentační médium se připraví výše popsaným způsobem (Hafner E. W. et al., 1995, J. Antibiotics 44: 349 až 356) pouze s tím rozdílem, že se použije hydrolyzovaného škrobu (114 g/litr) místo zředěného rozpustného bramborového škrobu, leucin a chlorid sodný se vypustí a přidá se glycin (2 g/litr). Při některých fermentacích se k médiu přidá S(+)-2-methylmáselná kyselina nebo cyklohexankarboxylová kyselina (CHC) (v konečné koncentraci 0,04 %). Po 12 dnech třepání (frekvence otáčení třepačky 200 min^-1) při 29°C se obsah baňky extrahuje 4 objemy rozpouštědlové směsi acetonitril/methanol (7/118) a supernatant se analyzuje na avermektiny vysoce výkonnou kapalinovou chromatografií (HPLC). Stanovení HPLC se provádí za použití sloupce (4,6 mm x 25 cm) s náplní Beckman 5 μιη Ultrasphere ODS C-18 při průtokové rychlosti 0,75 ml/min a detekci měřením absorbance při 240 nm. Jako mobilní fáze se používá vody (178 ml), acetonitrilu (102 ml) a methanolu do konečného objemu mobilní fáze 2 litry.

Naměřené výsledky jsou shrnuty v tabulce I. Čtyři thiostrepton-sensitivní klony, které ztratily volný replikon, vykazují typický bkd-deficientní fenotyp: všechny čtyři klony jsou neschopny růstu v miskách s ILV minimálním médiem a nevykazují žádnou aktivitu při zkoušení na složku El komplexu BCKDH. Fermentační studie ukazují, že blokované kultury nejsou schopny syntetizovat přírodní avermektiny. Kromě toho, když se k fermentačnímu médiu přidá S(+)-2methylmáselná kyselina (do konečné koncentrace 0,04 %), dojde k syntéze přírodní formy avermektinu a. Podobně, přidá-li se cyklohexankarboxylová kyselina (CHC), dojde k tvorbě nových CHC-avermektinů. Tyto fermentační výsledky ukazují, že bkd blok nepostihuje biosyntetické buněčné mechanismy vedoucí k avermektinu. Jeden klon z této skupiny čtyř klonů, totiž klon ppl5 (viz tabulka I) byl formálně označen názvem S. avermitilis kmen CD794 a byl uložen ve sbírce American Type Culture Collection, jakožto příklad ilustrující tento vynález. Relevantní informace vztahující se k tomuto uloženému kmeni je možno nalézt v PCT formuláři RO/134, který je zařazen v závěru této přihlášky.

Tabulka I

Aktivita rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy z El v různých kmenech Streptomyces avermitilis

Kmen S. Fenotyp Růst na avermitilis^a resistence¹³ ILV^C

Specifická aktivita El BCKDH^d'^e

Produkce přírodních avermektinů

ATCC 31272 SC2	Erm-S, Tsr-S	+
PF 402-77	Erm-S, Tsr-S	-
CD783	Erm-R, Tsr-R	+
pp14	Erm-R, Tsr-R	+
pp21	Erm-R, Tsr-R	+
pp15 (CD794)	Erm-R, Tsr-S	-
pp17	Erm-R, Tsr-S	-
pp22	Erm-R, Tsr-S	-
pp40	Erm-R, Tsr-S

69	+
0°	-/+'
67	+
65	+
50	+
0°	-/+’
0°	NT
0°	-/+'
0°	NT

^a Bylo použito těchto kmenů S. tj. jednokoloniového izolátu bkd-deficientního mutantního avermitilis: ATCC 31272 SC2, kmene ATCC 31272; PF402-77, derivátu kmene ATCC 31272 SC2 získaného chemickou mutagenesí; CD783, tj. derivátu kmene ATCC 31272 SC2 transformovaného plasmidem pCD768 (viz příklad 9); ppl4 až 40, tj. jednokoloniových derivátů CD783 izolovaných po protoplastování a regeneraci (viz příklad 9) ^b Erm-R = resistentní vůči erythromyčinu;

Tsr-R = resistentní vůči thiostreptonu ^c + nebo - vyjadřuje schopnost nebo neschopnost růstu na minimálním médiu doplněném isoleucinem,leucinem a valinem, jako jedinými zdroji uhlíku ^d specifická aktivita El složky rozvětvená a-ketokyselina dehydrogenasy je uvedena v pmol oxidu uhličitého uvolněného na minutu na 1 mg proteinu ^e výsledky představují střední hodnoty ze dvou stanovení £ + nebo - označuje, zda se jedná o producent nebo neproducent přírodních avermektinů při fermentaci

0 = nelze detegovat h NT = nezkoušeno ¹ -/+ znamená, že se jedná o kmen, který neprodukuje přírodní avermektiny při fermentaci, přičemž však po přidání S(+)-2-methylmáselné kyseliny k fermentačnímu médiu je tento kmen schopen produkovat přirozené avermektiny a po přidání CHC k fermentačnímu médiu je tento kmen schopen produkovat nové CHC-avermektiny

E. Analýza hybridizací Southern pro potvrzení bkd-minus genotypu

U dvou erm-R a tsr-S klonů, ppl5 (s formálním označením CD794) a pp22 (s formálním označením CD798) se provede analýza hybridizací Southern. Tato analýza ukazuje, že prostřednictvím dvojnásobného efektu crossover došlo k chromosomální integraci markéru ermE a současné deleci l,4kb BamHI genomového fragmentu nesoucího 5' konec otevřeného čtecího rámce bkdF (ORF-1). Restrikční fragmenty chromosomální DNA se oddělí elektroforézou na 1% agarosovém gelu a přenesou na nylon v podstatě způsobem popsaným Southernem (1975), jak je to popsáno v příkladu 5.

Příklad 10

Konstrukce bkdABCF mutantu S. avermitilis

Tento příklad uvádí konstrukci stabilního několikanásobného mutantu S. avermitilis, v němž jsou mutací ovlivněny následující bkd geny: bkdA, bkdB, bkdC a bkdF. První tři z těchto genů (bkdA, bkdB a bkdC) kódují El-a,

El-β a E2 podjednotku komplexu rozvětvená a-ketokyselina dehydrogenasy. Tyto geny jsou součástí shluku genů bkdABC, jak je to popsáno v publikaci C. D. Denoya, patentová přihláška USA č. 08/100,518, podaná 30. července 1993. Gen bkdF je umístěn ve shluku genů bkdFGH popsaném výše a kóduje podjednotku El-α komplexu rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy.

A. Navržení a sestrojení zaváděcího vektoru nesoucího cílovou chromosomální oblast (bkdC) označenou selektovatelným markérem resistence vůči antibiotiku (ermE)

Nejprve se 6,5kb Sphl genomový fragment S. avermitilis 31272 (nesoucí shluk genů bkdABC) subklonuje do Sphl klonovacího místa shuttle/zaváděcího vektoru pCD500 (C. D. Denoya, 1993, Novel Bacterial Plasmid Shuttle Vectors for Streptomycetes sp. and Escherichia coli, patentová přihláška USA 08/032 925 podaná 18. března 1993). čímž vznikne plasmid pCD544 (viz příklad 9). Potom se l,7kb fragment BglII plJ4026 nesoucí markér ermE vloží do jedinečného místa BglII, které je obsaženo v insertu pCD544. Plasmid plJ4026 je derivátem E. coli klonovacího vektoru pUC 18 nesoucího gen ermE nesoucího gen ermE z Saccharopoly65 spora erythraea (dříve Streptomyces erythraeus) (M. Bibb et al., 1985, Gene, 41:357 až 368 a D. A. Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces - A Laboratory Manual, 1985, The John Innes Fundation, Norwich, Velká Británie). Výsledná konstrukce (pCD547) obsahuje inserčně inaktivovanou kopii genu bkdC.

B. Konstrukce geneticky označeného mutantního kmene bkdC

Použije se plasmidu CD547, jako zaváděcího vektoru (viz předchozí část), divokého kmene S. avermitilis (ATCC 31272 SC2), jakožto hostitele a provedou se standardní postupy nahrazování genů (viz příklad 9) a selektuje se 12 protoplastovaných a poté regenerovaných jednotlivých kolonií vykazujících erythromycin-resistentní thiostrepton sensitivní fenotyp. Jedna kolonie z této skupiny 12 kolonií se formální označí názvem S. avermitilis kmen CD570 (viz obr. 9) a použije se jí jako hostitele při následujících stupních nahrazování genů (viz dále).

C. Navržení a konstrukce zaváděcího vektoru nesoucího mutovanou (vypuštěnou cílovou oblast bkdABC)

Plasmid pCD728 je derivátem shuttle vektoru pCD262 (C. D. Denoya, 1993, Novel Bacterial Plasmid Shuttle Vectors for Streptomycetes sp. and Escherichia coli, patentová přihláška USA 08/032 925 podaná 18. března 1993) nesoucího dva chromosomální fragmenty S. avermitilis (7kb BamHI fragment připravený ze subklonu pCD528 a 6,5kb fragment BglII/BamHI připravený ze subklonu pCD559 (viz obr. 9). Úplný popis použitých subklonu je uveden v C. D. Denoya, patentová přihláška USA č. 08/100,518, podaná 30. července 1993.

D. Konstrukce neznačeného kmene s deleci bkdABC

Plasmid pCD728 se transformuje do protoplastú S. avermitilis kmene CD570 a izolují se pravděpodobné transformanty. Do kmene CD570 se transformací zavede také kontrolní plasmid pCD739, v němž je jeden z genonových fragmentů vložen se špatnou orientací. Získá se mnoho rekombinantů, v nichž je markér ermE nahrazen deletovaným konstruktem bkdABC a zavedený plasmid (pCD262) je z buněk ztracen. Je možno shrnout, že po transformaci a dvojnásobné rekombinaci crossover poskytne pCD728 deleci přibližně dvou kb z chromosomu S. avermitilis, kterou jsou postiženy geny bkdA (El-α), bkdB (El—β) a bkdc (E2). Získané integranty jsou erythromycin-sensitivního thiostrepton sensitivního fenotypu. Analýza Southern blot potvrzuje, je markér ermE byl nahrazen deletovanou sekvencí. Pro další práci byla zvolena jedna jediná kolonie, která je reprezentativní pro tuto skupinu, a ta byla označená názvem kmen CD757 (viz obr. 9).

E. Návrh a konstrukce nahrazovacího vektoru pro gen bkdF

Konstrukce tohoto vektoru je popsána v příkladu 9, část A. V krátkosti lze uvést, že plasmid pCD768 je derivátem shuttle vektoru pCD262 nesoucího dva genomové fragmenty S. avermitilis (2,3 a 4,lkb BamHI fragment), které přiléhají z každé strany k l,4kb BamHI fragmentu v chromosomu divokého typu. Kromě toho nese pCD768 markér ermE umístěný mezi 2,3 a 4,lkb BamHI fragmentem. Markér ErmE má opačnou orientaci vzhledem k orientaci ORF-1 (bkdF), aby se zabránilo možné lethalitě vyvolané nadexpresí genů umístěných dále. Tento konstrukt produkuje při rekombinaci l,4kb deleci (postihující 5' konec genu bkdF) v hostitelském genomu.

- 67 F. Konstrukce několikanásobného bkd mutantu (bkdABCF) S. avermitilis

Plamid pCD768 se transformuje do protoplastů S. avermitilis kmene CD757 (bkdABC) (viz stupeň D výše) v podstatě způsobem popsaným v příkladu 9. Získá se mnoho transformantů a za použití standardního protokolu se z nich selekcí oddělí potenciální integranty. Jeden z těchto integrantů, který je pro tuto skupinu reprezentativní a který vykazuje erythromycin resistentní thiostrepton-sensitivní fenotyp se označí názvem CD797 a podrobí se další analýze (viz příklad 9). Kultura CD797 vykazuje typický bkddeficientní fenotyp: není schopna růst na miskách s ILV minimálním médiem (viz příklad 9) a nevykazuje žádnou aktivitu při stanovení El složky komplexu BCKDH. Fermentační studie ukazují, že blokované kultury nejsou schopny syntetizovat přírodní avermektiny, pokud se k ním nepřidá S(+)-2methylmáselná kyselina nebo isomáselné kyselina. Také přídavek cyklohexankarboxylové kyseliny (CHC) vede k tvorbě nových CHC-avermektinů. Tyto fermentační výsledky ukazují, že několikanásobný bkd blok zahrnující rozlomení nebo deleci čtyř bkd genů (bkdA, bkdB, bkdC a bkdF) nepostihuje biosyntetické buněčné mechanismy vedoucí k avermektinu.

Claims (27)

1. Izolovaný segment DNA kódující komplex rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy organismu rodu Streptomyces.

2. Izolovaný segment DNA podle nároku 1, kódující komplex rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy organismu Streptomyces avermitilis.

3. Izolovaný segment DNA podle nároku 1, který dále obsahuje oblast DNA regulující expresi komplexu rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy.

4. Izolovaný segment DNA podle nároku 2, který dále obsahuje oblast DNA regulující expresi komplexu rozvětvená α-ketokyselina dehydrogenasy.

5. Segment DNA, obsahující sekvenci DNA SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 nebo SEQ ID NO: 4 nebo allelovou variaci této sekvence.

6. Segment DNA, který je podmnožinou segmentu DNA podle nároku 5 a je mu funkčně ekvivalentní.

7. Rekombinantní DNA obsahující segment DNA podle nároku 5.

8. Hostitelská buňka se zavedenou rekombinantní DNA podle nároku 7.

9. Plasmid obsahující rekombinantní DNA podle nároku 7.

10. Segment DNA zvolený ze souboru zahrnujícího PCD713, pCD740, pCD747 a pCD854.

11. Hostitelská buňka se zavedeným segmentem DNA podle nároku 10.

12. Segment DNA podle nároku 5 obsahující oblast DNA, která reguluje transkripci nebo translaci sekvence DNA DNA SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 nebo SEQ ID NO: 4 nebo allelové variace této sekvence.

13. Geny pro komplex rozvětvená a-ketokyselina dehydrogenasu obsažené v segmentu DNA podle nároku 10.

14. Segment DNA obsahující sekvenci DNA, jež je podmnožinou sekvence DNA SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 nebo SEQ ID NO: 4 nebo allelové variace této sekvence a který je schopen hybridizace k SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:

2, SEQ ID NO: 3 nebo SEQ ID NO: 4 nebo allelové variaci této sekvence, pokud se jí použije jako próby, nebo která je schopna amplifikovat celou tuto sekvenci nebo její část, pokud se jí použije jako primeru při řetězové reakci působením polymerasy.

15. V podstatě purifikovaný polypeptid zahrnující aminokyselinovou sekvenci odpovídající SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 nebo SEQ ID NO: 8.

16. Polypeptid produkovaný expresí v hostitelské buňce podle nároku 8.

17. Způsob výroby přírodního avermektinů, vyznačující se tím, že se za podmínek a ve fermentačním médiu vhodném pro produkci takového přírodního avermektinů fermentuje Streptomyces avermitilis, v němž byl zvýšen počet kopií genomového fragmentu obsahujícího jeden nebo více genů bkdF, bkdG a bkdH.

18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se t í m , že se fermentuje S. avermitilis, v němž byl zvýšen počet kopií genomového fragmentu obsahujícího geny bkdF, bkdG a bkdH.

19. Způsob výroby přírodního avermektinu, vyznačující se tím, že se za podmínek a ve fermentačním médiu vhodném pro produkci takového přírodního avermektinu fermentuje Streptomyces avermitilis, u něhož byla zvýšena exprese genomového fragmentu obsahujícího jeden nebo více genů bkdF, bkdG a bkdH manipulací nebo nahrazením genů zodpovědných za regulaci této exprese.

20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se t í m , že se fermentuje S. avermitilis, u něhož byla zvýšena exprese genomového fragmentu obsahujícího geny bkdF, bkdG a bkdH.

21. Způsob výroby nového avermektinu, vyznačující se tím, že se za podmínek a ve fermentačním médiu vhodném pro produkci takového nového avermektinu fermentuje Streptomyces avermitilis, u něhož byla snížena nebo odstraněna exprese genomového fragmentu obsahujícího jeden nebo více genů bkdF, bkdG a bkdH, delecí, inaktivací, nahrazením nebo jinou manipulací genů zodpovědných za tuto expresi.

22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se t í m , že se fermentuje Streptomyces avermitilis, u něhož byla snížena nebo odstraněna exprese genomového fragmentu obsahujícího geny bkdF, bkdG a bkdH, delecí, inaktivací, nahrazením nebo jinou manipulací genů zodpovědných za tuto expresi.

23. Způsob podle nároku 21, vyznačující se t í m , že geny, které jsou vypuštěny, inaktivovány, nahrazeny nebo jinak manipulovány, jsou geny enhanceru, inhibitoru, aktivátoru nebo represoru.

24. Způsob výroby nového avermektinu podle nároku 21, vyznačující se tím, že se za podmínek a ve fermentačním médiu vhodném pro produkci takového nového avermektinu fermentuje Streptomyces avermitilis, v němž byl vypuštěn nebo inaktivován genomový fragment obsahující jeden nebo více genů bkdF, bkdG a bkdH.

25. Způsob výroby nového avermektinu podle nároku 24, vyznačující se tím, že se fermentuje Streptomyces avermitilis, v němž byl vypuštěn nebo inaktivován genomový fragment obsahující geny bkdF, bkdG a bkdH.

26. Způsob výroby nového avermektinu, vyznačující se tím, že se za podmínek a ve fermentačním médiu vhodném pro produkci takového nového avermektinu fermentuje Streptomyces avermitilis, u něhož byla snížena nebo odstraněna exprese genomového fragmentu obsahujícího jeden nebo více genů bkdA, bkdB a bkdC a jeden nebo více genů bkdF, bkdG a bkdH, deleci, inaktivací, nahrazením nebo jinou manipulací genů zodpovědných za tuto expresi. ,

27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se t i m , že se fermentuje Streptomyces avermitilis, u něhož byl vypuštěn nebo inaktivován genomový fragment obsahující geny bkdA, bkdB, bkdC a bkdF.