JPH099982A - Ｌ−含硫アミノ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 (A) Ｌ−セリンと、(B) 硫化物と、(C)
アセチルＣｏＡと、(D)アセチルリン酸と、(K) セリン
アセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）、ホスホトラン
スアセチラーゼ（ＰＴＡ）およびＯ−アセチルセリンリ
アーゼ（ＯＡＳＬ）をそれぞれコードするＤＮＡをベク
ターＤＮＡに組込んだ組換え体ＤＮＡにて形質転換した
微生物の菌体および／またはその処理物とを反応させて
Ｌ−含硫アミノ酸を生成させることを特徴とする、Ｌ−
含硫アミノ酸の製造方法。 【効果】 Ｌ−セリンからＬ−含硫アミノ酸を簡便に、
しかも従来法と比較して、高収率で製造することができ
る。しかも、ＰＴＡとアセチルリン酸との存在下で反応
を行うことから、大量のアセチルＣｏＡを添加する必要
がなく、Ｌ−含硫アミノ酸を安価に製造することができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、組換え体ＤＮＡに
て形質転換した微生物が産生する、セリンアセチルトラ
ンスフェラーゼ（以下、ＳＡＴという。）、ホスホトラ
ンスアセチラーゼ（以下、ＰＴＡという。）およびＯ−
アセチルセリンリアーゼ（以下、ＯＡＳＬという。）を
利用したＬ−含硫アミノ酸の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ−含硫アミノ酸、すなわちＬ−システ
インやＬ−シスチンは、化粧品、医薬品、食品添加物等
として有用である。そのようなＬ−含硫アミノ酸の酵素
的生産法の一つとして、ＳＡＴおよびＯＡＳＬの存在
下、Ｌ−セリン、アセチルＣｏＡおよび硫化物を反応さ
せ、反応物中にＬ−含硫アミノ酸を生成させる方法が提
案されている（N.M.Kredich, G.M.Tomkins : J. Bacter
iol., 241, 4955-4965(1966)）。しかしながら、この反
応では、高価なアセチルＣｏＡを大量に必要とするこ
と、ＳＡＴ活性が生成したＬ−含硫アミノ酸により厳し
いフィードバック阻害（feedback inhibition ）を受け
るため（D.Denk, A.Bock, ：J. Gen. Microbiol., 133,
515-525 (1987) ）、Ｌ−含硫アミノ酸の生産量が極め
て低いことなどの問題点を有している。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、微生
物が産生するＳＡＴおよびＯＡＳＬを利用して、Ｌ−セ
リン、アセチルＣｏＡ、および硫化物を反応させてＬ−
含硫アミノ酸を生成させる方法において、高価なアセチ
ルＣｏＡを大量に使用することなく、Ｌ−含硫アミノ酸
を、簡便、高収率で、かつ安価に製造する方法を提供す
ることにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決するために鋭意研究した結果、微生物が産生する
ＳＡＴおよびＯＡＳＬを利用して、Ｌ−セリン、アセチ
ルＣｏＡ、および硫化物を反応させてＬ−含硫アミノ酸
を生成させる際に、ＰＴＡおよびアセチルリン酸の存在
下で反応を行うと、Ｌ−セリンからＬ−含硫アミノ酸が
合成されると同時に、消費されたアセチルＣｏＡが再生
されるので、大量のアセチルＣｏＡを添加することなし
に高収率でＬ−含硫アミノ酸を合成することができると
の知見を得た。本発明はその知見に基づいて完成された
ものである。

【０００５】すなわち、本発明は、(A) Ｌ−セリンと、
(B) 硫化物と、(C) アセチルＣｏＡと、(D) アセチルリ
ン酸と、(E) セリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡ
Ｔ）をコードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組込んだ組
換え体ＤＮＡにて形質転換した微生物の菌体および／ま
たはその処理物と、

【０００６】(F) ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴ
Ａ）をコードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組込んだ組
換え体ＤＮＡにて形質転換した微生物の菌体および／ま
たはその処理物と、(G) Ｏ−アセチルセリンリアーゼ
（ＯＡＳＬ）をコードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組
込んだ組換え体ＤＮＡにて形質転換した微生物の菌体お
よび／またはその処理物とを反応させてＬ−含硫アミノ
酸を生成させることを特徴とする、Ｌ−含硫アミノ酸の
製造方法を提供する。

【０００７】また、本発明は、上記(A) 〜(D) 成分と、
(F')少なくともホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）
をコードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組込んだ組換え
体ＤＮＡにて形質転換した微生物の菌体および／または
その処理物と、(H) セリンアセチルトランスフェラーゼ
（ＳＡＴ）およびＯ−アセチルセリンリアーゼ（ＯＡＳ
Ｌ）をそれぞれコードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組
込んだ組換え体ＤＮＡにて形質転換した微生物の菌体お
よび／またはその処理物とを反応させてＬ−含硫アミノ
酸を生成させることを特徴とする、Ｌ−含硫アミノ酸の
製造方法を提供する。

【０００８】更に、本発明は、上記(A) 〜(D) 成分と、
(E')少なくともセリンアセチルトランスフェラーゼ（Ｓ
ＡＴ）をコードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組込んだ
組換え体ＤＮＡにて形質転換した微生物の菌体および／
またはその処理物と、(I) ホスホトランスアセチラーゼ
（ＰＴＡ）およびＯ−アセチルセリンリアーゼ（ＯＡＳ
Ｌ）をそれぞれコードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組
込んだ組換え体ＤＮＡにて形質転換した微生物の菌体お
よび／またはその処理物とを反応させてＬ−含硫アミノ
酸を生成させることを特徴とする、Ｌ−含硫アミノ酸の
製造方法を提供する。

【０００９】更に、本発明は、上記(A) 〜(D) 成分と、
(G')少なくともＯ−アセチルセリンリアーゼ（ＯＡＳ
Ｌ）をコードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組込んだ組
換え体ＤＮＡにて形質転換した微生物の菌体および／ま
たはその処理物と、(J) セリンアセチルトランスフェラ
ーゼ（ＳＡＴ）およびホスホトランスアセチラーゼ（Ｐ
ＴＡ）をそれぞれコードするＤＮＡをベクターＤＮＡに
組込んだ組換え体ＤＮＡにて形質転換した微生物の菌体
および／またはその処理物とを反応させてＬ−含硫アミ
ノ酸を生成させることを特徴とする、Ｌ−含硫アミノ酸
の製造方法を提供する。

【００１０】更に、本発明は、上記(A) 〜(D) 成分と、
(K) セリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）、ホ
スホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）およびＯ−アセチ
ルセリンリアーゼ（ＯＡＳＬ）をそれぞれコードするＤ
ＮＡをベクターＤＮＡに組込んだ組換え体ＤＮＡにて形
質転換した微生物の菌体および／またはその処理物とを
反応させてＬ−含硫アミノ酸を生成させることを特徴と
する、Ｌ−含硫アミノ酸の製造方法を提供する。

【００１１】更に、本発明は、セリンアセチルトランス
フェラーゼ（ＳＡＴ）、ホスホトランスアセチラーゼ
（ＰＴＡ）およびＯ−アセチルセリンリアーゼ（ＯＡＳ
Ｌ）をそれぞれコードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組
込んだ組換え体ＤＮＡを提供する。更に、本発明は、セ
リンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）、ホスホト
ランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）およびＯ−アセチルセリ
ンリアーゼ（ＯＡＳＬ）をそれぞれコードするＤＮＡを
ベクターＤＮＡに組込んだ組換え体ＤＮＡにて形質転換
した微生物を提供する。

【００１２】以下、本発明を詳細に説明する。(A) 〜(D) 成分 本発明は、微生物の産生する酵素、すなわちＳＡＴ、Ｐ
ＴＡおよびＯＡＳＬを利用して、(A) Ｌ−セリン、(B)
硫化物、(C) アセチルＣｏＡ、および(D) アセチルリン
酸を反応させて、Ｌ−セリンからＬ−含硫アミノ酸を合
成するものである。消費されたアセチルＣｏＡの再生酵
素であるＰＴＡの存在下で反応させることから、原料と
して高価なアセチルＣｏＡの添加量を低く抑えることが
でき、(C) 成分のアセチルＣｏＡの添加量はＬ−セリン
１mmol当たり、通常、0.0005〜１mmol、好ましくは 0.0
01〜0.5mmol である。

【００１３】また、(B) 成分の硫化物としては、例え
ば、硫化水素、硫化ナトリウム、硫化カリウム、水硫化
ナトリウム等が挙げられる。硫化物の添加量は、Ｌ−セ
リン１mmol当たり、通常、 0.1〜１mmolである。(D) 成
分のアセチルリン酸の添加量は、Ｌ−セリン１mmol当た
り、通常、0.05〜２mmol、好ましくは 0.1〜0.6mmol で
ある。

【００１４】(E) 〜(K) 、(E')、(F')および(G')成分 (E) 成分はＳＡＴをコードするＤＮＡをベクターＤＮＡ
に組込んだ組換え体ＤＮＡにより、(F) 成分はＰＴＡを
コードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組込んだ組換え体
ＤＮＡにより、(G) 成分はＯＡＳＬをコードするＤＮＡ
をベクターＤＮＡに組込んだ組換え体ＤＮＡにより、

【００１５】(H) 成分はＳＡＴおよびＯＡＳＬをそれぞ
れコードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組込んだ組換え
体ＤＮＡにより、(I) 成分はＰＴＡおよびＯＡＳＬをそ
れぞれコードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組込んだ組
換え体ＤＮＡにより、(J) 成分はＳＡＴおよびＰＴＡを
それぞれコードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組込んだ
組換え体ＤＮＡにより、

【００１６】(K) 成分はＳＡＴ、ＰＴＡおよびＯＡＳＬ
をそれぞれコードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組込ん
だ組換え体ＤＮＡにより、(E')成分は少なくともＳＡＴ
をコードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組込んだ組換え
体ＤＮＡにより、(F')成分は少なくともＰＴＡをコード
するＤＮＡをベクターＤＮＡに組込んだ組換え体ＤＮＡ
により、(G')成分は少なくともＯＡＳＬをコードするＤ
ＮＡをベクターＤＮＡに組込んだ組換え体ＤＮＡによ
り、形質転換した微生物の菌体および／またはその処理
物である。

【００１７】尚、(E')成分は、具体的には、(E) 成分、
(H) 成分、(J) 成分および(K) 成分から選ばれる。(F')
成分は、具体的には、(F) 成分、(I) 成分、(J) 成分お
よび(K) 成分から選ばれる。(G')成分は、具体的には、
(G) 成分、(H) 成分、(I) 成分および(K) 成分から選ば
れる。上記のＳＡＴ、ＰＴＡおよびＯＡＳＬをそれぞれ
コードする遺伝子は、どのような微生物に由来するもの
でもよいが、特に、遺伝的、構造的に解明されている大
腸菌由来のものが好適に用いられる。

【００１８】また、本発明に用いるベクターＤＮＡとし
ては、如何なるものでもよく、例えば、細菌の場合、プ
ラスミドベクターＤＮＡ、バクテリオファージベクター
ＤＮＡなどを挙げることができる。具体的には、例え
ば、プラスミドpBR322ＤＮＡ〔セスダ・リサーチ・ラボ
ラトリーズ（Bethesda Research Laboratories）社
製〕、プラスミドpUC118ＤＮＡ（宝酒造社製）、ファー
ジλcI₈₅₇ １１２１（特開昭58-212781 号公報）などが
好適である。

【００１９】ＰＴＡ、ＳＡＴおよびＯＡＳＬをそれぞれ
コードする遺伝子、すなわちｐｔａ、ｃｙｓＥおよびｃ
ｙｓＫは、その構造、塩基配列も公知である（Z. Leish
ら,Appl. Environ. Microbiol., 59, 892-898 (1993)
；A. Matsuyamaら, Biochim.Biophys. Acta, 1219, 55
9-562 (1994)を参照のこと）。ｐｔａ遺伝子の塩基配列
および該塩基配列から導き出されるＰＴＡのアミノ酸配
列を図１〜３に、ｃｙｓＥ遺伝子およびｃｙｓＫ遺伝子
の塩基配列をそれぞれ図４および図５に示す。それら遺
伝子をベクターＤＮＡに組込んだ組換え体ＤＮＡにて形
質転換した微生物の調製法は、上記文献に記載された方
法に準じるか、通常の公知の方法を用いて行うことがで
きる。例えば、次のような方法および手順で調製され
る。

【００２０】まず、目的遺伝子が調製される。これに
は、例えば、次のような方法が用いられる。 １）化学的合成法：この方法は、目的遺伝子の構造、お
よびその塩基配列が分っている大腸菌の場合に好適に用
いることができる。公知の塩基配列に従って化学的に全
合成し、クローニング用ベクター中にクローニングす
る。

【００２１】２）公知の方法で、目的遺伝子のｍＲＮＡ
を調製し、それから目的のｃＤＮＡクローンを逆合成
し、クローニング用ベクターにクローニングする。この
方法は、かび、酵母などの真核生物に好適に用いられ
る。 ３）目的酵素を精製し、その酵素蛋白質の一部のアミノ
酸配列を決定する。それに基づいて、目的遺伝子のオリ
ゴＤＮＡプライマーを化学合成する。そのプライマーを
用いて、サザンブロッティング法により目的遺伝子を含
むＤＮＡ断片混合物から目的遺伝子ＤＮＡを取り出す。
それを鋳型として、ＰＣＲ法により増幅させ、そのＤＮ
Ａ断片をクローニング用ベクター中にクローニングす
る。そして、制限酵素により切断して目的遺伝子のＤＮ
Ａ配列部分だけのものにする。前記ＤＮＡ断片混合物
は、染色体ＤＮＡの各種制限酵素による切断や物理的せ
ん断などの公知方法で調製できる。この方法は原核生物
について、好適に用いることができる。

【００２２】４）目的遺伝子の構造、塩基配列が分って
いる場合に好適に用いられる方法であるが、Ｎ末端、Ｃ
末端の塩基配列の一部を化学合成し、それらをプライマ
ーとして、ＰＣＲ法により、目的遺伝子ＤＮＡ断片を含
む染色体ＤＮＡ（遺伝子供給源となる微生物から抽出精
製した染色体ＤＮＡ）断片混合物中、若しくは目的遺伝
子ＤＮＡを保持する染色体ＤＮＡ（遺伝子供給源となる
微生物から抽出精製した染色体ＤＮＡ）において、目的
遺伝子だけを増幅させる。反応物をアガロース電気泳動
し、増幅された目的遺伝子をゲル板から取り出し、クロ
ーニング用ベクターにクローニングする。この方法は、
大腸菌の場合に好適に用いられる。

【００２３】上記１）〜４）の方法により調製された目
的遺伝子を組込んだ組換え体ベクターＤＮＡを用いて、
微生物、例えば前記エッシェリヒア属に属する大腸菌株
を形質転換あるいは形質導入してそれぞれの菌株を得
る。この形質転換はディー・エム・モーリソン（D.M.Mo
rrison）の方法（Methods in Enzymology, 68, 326-331
(1979) 参照）により行なうことができる。また形質導
入はビー・ホーン（B.Hohn）の方法（Methods in Enzym
ology, 68, 299-309 (1979) 参照）によって行なうこと
ができる。

【００２４】各目的遺伝子を組込んだ組換え体ベクター
ＤＮＡにて形質転換あるいは形質導入した各菌株につい
て、各目的遺伝子が目的の酵素、すなわち、ＳＡＴ、Ｐ
ＴＡおよび／またはＯＡＳＬを生産しているかどうかを
確認するために各酵素の活性を測定する。それによっ
て、目的の遺伝子がクローニングされたかどうかが確認
される。

【００２５】また、最も一般的な方法であるが、目的遺
伝子は、下記の方法によっても調製することができる。 ５）目的遺伝子を含有する染色体ＤＮＡから公知の方法
でＤＮＡ断片混合物を調製する。これらのＤＮＡ断片を
アトランダムに公知の方法でクローニング用ベクターに
クローニングする。

【００２６】次いで、上記５）の方法により調製された
目的遺伝子を組込んだ組換え体ベクターＤＮＡを用い
て、微生物、例えば前記エッシェリヒア属に属する大腸
菌株を形質転換あるいは形質導入してそれぞれの菌株を
得る。そして、上記菌株からＳＡＴ、ＰＴＡおよび／ま
たはＯＡＳＬ生産性を有する菌株を公知の方法によりス
クリーニングすることにより、各遺伝子を含有するＤＮ
ＡをベクターＤＮＡに挿入した組換え体ＤＮＡを含み、
ＳＡＴ、ＰＴＡおよび／またはＯＡＳＬ生産性を有する
大腸菌菌株を得ることができる。

【００２７】上記のスクリーニングとしては、例えば、
形質転換された大腸菌株あるいは形質導入された大腸菌
株を適宜な寒天培地にまいて、コロニーを形成させる。
コロニーを適宜なメンブランに移しとり、メンブラン上
で菌体を溶菌する。前記コロニーが溶菌されたメンブラ
ン上で、溶菌コロニーと各酵素の一部のアミノ酸配列か
ら化学合成されたオリゴＤＮＡを放射能標識するか、抗
体を用いて酵素標識し、これらの標識化オリゴＤＮＡと
のハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーシ
ョンをしたコロニーを、適宜な培地に釣上げて、培養す
る。

【００２８】スグリーニングにより得られた菌株から純
化された新規な組換え体ＤＮＡを得る方法としては、例
えば、ピー・グーリー（P.Guerry）らの方法（J.Bacter
iol., 116, 1064-1066 (1973) 参照）、デ・ビ・クレウ
エル（D.B.Cleweel ）の方法（J.Bacteriol., 110, 667
-676 (1972) 参照）などが挙げられる。次いで、上記の
純化された新規な組換え体ＤＮＡに、例えば、制限酵素
Sma IおよびKpn I （いずれも宝酒造社製）を作用させ
て、ＤＮＡ断片混合物を得る。上記ＤＮＡ断片混合物よ
り各種遺伝子を単離するには、ティ・マニアティス（T.
Maniatis）らの方法（Molecular Cloning 、 173-178
頁、1982年、Cold SpringHarbor Laboratory 出版）に
より得ることができる。

【００２９】上記のようにして単離された目的の遺伝子
ｃｙｓＥ、ｐｔａおよびｃｙｓＫ、すなわち、ＳＡＴ、
ＰＴＡおよびＯＡＳＬをコードするＤＮＡ配列に、公知
の方法で、宿主細胞に応じた、公知の適宜なプロモータ
ー、例えばラック(Lac）プロモーター、トリップ(Trp）
プロモーター、あるいは制御配列などを連結する。勿
論、ｃｙｓＥ、ｐｔａ、ｃｙｓＫ自身のプロモーター、
制御配列を好適に用いることができる。

【００３０】更に、宿主細胞に応じた、公知のターミネ
ーター配列、或いは終止コドンＵＡＡ、ＵＡＧ、ＵＧＡ
を公知の方法で連結する。また、ｃｙｓＥ、ｐｔａ、ｃ
ｙｓＫ自身の終止コドン、ターミネーター配列も好適に
用いることができる。このようにして、ＳＡＴ、ＯＡＳ
Ｌおよび／またはＰＴＡを生産する組換え体ＤＮＡを調
製することができる。

【００３１】なお、発現用ベクター自体に含有されるプ
ロモーター、ターミネーターなどを好適に用いることも
できる。得られたプロモーター等を連結したＤＮＡをク
ローニング用ベクターに挿入ないし連結する。次いで、
このクローニング用ベクターに組み込まれた目的遺伝子
ＤＮＡ断片を、適宜な制限酵素で該ベクターより切り出
して、公知の通常の発現用ベクターに挿入ないし連結し
て、組換え体発現ベクターが調製される。公知の発現ベ
クターとしては、すなわち、プラスミドベクターとして
は、例えば、pBR322、ファージベクターとしては、例え
ば、λcI₈₅₇ １１２１（特開昭58-212781号公報）など
挙げることができる。

【００３２】この場合、ベクターにＳＡＴ、ＰＴＡおよ
びＯＡＳＬから選ばれる１種の酵素をコードするＤＮＡ
を組込んだ組換え体発現ベクターを調製することもでき
る。また、同一ベクターにＳＡＴ、ＰＴＡおよびＯＡＳ
Ｌから選ばれる２種をそれぞれコードするＤＮＡ２種を
組込んだ組換え体発現ベクターを調製することもできる
し、同一ベクターにＳＡＴ、ＰＴＡおよびＯＡＳＬをそ
れぞれコードするＤＮＡ３種を組込んだ組換え体発現ベ
クターを調製することもできる。これは、前記D. Leish
らの方法、松山らの方法（特開平1-228473号公報）によ
り達成できる。例えば、遺伝子ＤＮＡ或いはプロモータ
ーＤＮＡ領域の両外側に新たに制限酵素切断部位を作製
することにより、同一ベクターに２種以上の遺伝子ＤＮ
Ａをそれぞれ１個以上挿入することができる。

【００３３】また、ＳＡＴは、合成されたＬ−含硫アミ
ノ酸によりフィードバック阻害を受けるので、Ｌ−含硫
アミノ酸によるフィードバック阻害を受けないようにＳ
ＡＴをコードする遺伝子ｃｙｓＥを処理することが、本
発明においては極めて好適である。それには、Ｍｕｔａ
ｎ^tm−Ｋ（宝酒造社製）キットなどが一般的に用いられ
る。具体的にはD.Denkらの方法（J. Gen. Microbiol.,
133, 515-525 (1987)）に従って、一塩基置換などを行
えばよい。また、亜硝酸、ギ酸、ヒドラジン等の処理す
ること〔新基礎生化学実験講座７、遺伝子工学、丸善
（株）出版、90頁、1988年〕、微生物自体のＳＡＴ活性
がこのような阻害を受けにくくなった変異株より取り出
した遺伝子ｃｙｓＥを用いることなどによっても好適に
達成できる。

【００３４】前記のようにして調製された、目的遺伝子
を組込んだ組換え体発現ベクターを用いて、各種微生物
を形質転換あるいは形質導入して形質転換体を得る。こ
の場合、前記の目的遺伝子クローニングに用いた形質転
換法あるいは形質導入法をそのまま用いることができ
る。なお、遺伝子の供給源となる微生物からの染色体Ｄ
ＮＡの抽出は、通常の公知の方法で行うことができる。
目的酵素の活性を有する微生物の培養菌体をリゾチーム
および界面活性剤で処理して、溶菌する。これについ
て、除蛋白処理を施す。次いで、エタノールで沈殿させ
る斉藤、三浦の方法（Biochim. Biophys. Acta, 72, 61
9 (1963)）により単離できる。

【００３５】上記の組換え体ＤＮＡにより形質転換され
る宿主は特に限定されないが、よく用いられるものとし
て、例えば、エッシェリヒア属に属する大腸菌を挙げる
ことができる。具体的には、大腸菌Ｋ−１２、好ましく
は、ＨＢ１０１（ATCC33694)、ＤＨＩ（ATCC33489)、ｘ
−１７７６（ATCC31244)、１１００〔Max-Plank-Instit
ut（ハイデルベルグ）より入手〕、ＪＭ１０１（ATCC33
876)等を挙げることができる。

【００３６】本発明で用いる形質転換された微生物は、
前記したように、ＳＡＴ、ＰＴＡおよびＯＡＳＬの中の
少なくとも一つの酵素をコードするＤＮＡが組み込まれ
たものであればよいが、使用する微生物の種類を減らす
ことができるという観点から、上記酵素の中の二つ以上
の酵素をそれぞれコードするＤＮＡが組み込まれたもの
を使用するのが好ましく、更に上記三つの酵素をそれぞ
れコードするＤＮＡが組み込まれたものを使用するのが
好ましい。尚、一つの酵素をコードするＤＮＡが組み込
まれたものは、(E) 、(F) および(G) 成分であり、二つ
の酵素をコードするＤＮＡが組み込まれたものは、(H)
、(I) および(J) 成分であり、三つの酵素をコードす
るＤＮＡが組み込まれたものは(K) 成分である。

【００３７】上記のＳＡＴ、ＰＴＡおよび／またはＯＡ
ＳＬ生産性を有する微生物の培養は、通常の微生物の培
養に通常用いられる合成ないし天然培地を用いて行なう
ことができる。そして、その成分は、例えば、次のよう
なものを用いられる。 （１）炭素源：ブドウ糖、果糖、庶糖、マルトース、粗
糖類、糖密類（例えば、甜菜糖密、甘藷糖密）、各種澱
粉類（例えば、タピオカ、サゴヤシ、甘藷、馬鈴薯、ト
ウモロコシ）またはその酸糖化液類、酵素糖化液類。

【００３８】（２）窒素源：ペプトン、大豆粉、コーン
スティープリカー、酵母エキス、肉エキス、大豆そのも
のまたは脱脂大豆またはそれらの粉体または粒体または
それらの抽出液、尿素などの有機窒素源類、また硫酸、
硝酸、塩酸、炭酸などのアンモニウム塩類、アンモニア
ガス、アンモニア水などの無機窒素源類。 （３）その他：菌の生育に必要な各種無機塩類、例え
ば、カルシウム、カリウム、ナトリウム、マグネシウ
ム、マンガン、鉄、銅、亜鉛などの硫酸塩類、塩酸塩
類、リン酸塩類、酢酸塩類。また、アミノ酸類、ビタミ
ン類。アミノ酸類としては、グルタミン酸、アスパラギ
ン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、ヒスチ
ジンなど、ビタミン類としてはビオチン、サイアミンな
どを挙げることができる。

【００３９】これらの成分もしくは素材が適当に選択さ
れ、単独または組合せて、かつＳＡＴ、ＰＴＡおよびＯ
ＡＳＬの生産ができるように、それらを含有せしめて、
無機もしくは有機合成培地または天然培地の液体培地が
製造される。その際、培地のｐＨは、５〜９、好ましく
は６〜８に苛性ソーダ、苛性カリ、アンモニアなどで調
整される。培地の殺菌は、通常の方法、例えば、 110〜
140 ℃で８〜15分間加熱して行なえばよい。

【００４０】培養は、振とう培養、通気撹拌培養などの
好気的条件下で行なう。培養温度は25〜45℃、好ましく
は30〜40℃が適当である。培養時のｐＨは５〜９、好ま
しくは６〜８が適当である。ｐＨの調節は水酸化ナトリ
ウム、水酸化カリウム、アンモニア、またはそれらの水
溶液によって行なう。培養期間は通常２〜７日間であ
る。

【００４１】このようにして得られた培養物あるいは培
養物から遠心分離、または限外慮過、若しくは通常の慮
過など操作により得られた生菌体、その乾燥菌体、生菌
体を自己消化、各種磨砕あるいは各種音波処理などを施
すことにより得られる菌体処理物、およびこれらの菌体
の抽出物より得られる酵素含有物が、ＳＡＴ、ＰＴＡお
よびＯＡＳＬの酵素源として用いられる。また、上記菌
体もしくは酵素含有物を固定化した菌体処理物なども好
適な酵素源として用いることができる。

【００４２】尚、上記菌体の処理物からＳＡＴ、ＯＡＳ
Ｌ、ＰＴＡを分離精製することも可能である。これらの
酵素を分離精製するには、通常のこれら酵素の分離精製
法が適用される（酵素ハンドブック、238 頁、246 頁、
710 頁；朝倉書店出版、1982年；丸尾文治、田宮信雄監
修）。すなわち、プロタミン処理、エタノール分画、硫
安分画、カルシウムアパタイト処理もしくはそれによる
クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグ
ラフィー、ＤＥＡＥ−セハデックスクロマトグラフィ
ー、ＱＡＥ−セルロースクロマトグラフィー、ＱＡＥ−
セハデックスクロマトグラフィー、セハデックスＧ−２
００、１００、もしくは５０などまたはセファロース６
Ｂによるゲル慮過クロマトグラフィー、ポリアクリルア
ミドゲルなどを用いる電気泳動、各種充填材によるＨＰ
ＬＣなど、またはそれらの適宜な組合せにより分離精製
される。

【００４３】また、上記のように組換え体ＤＮＡにより
形質転換した微生物は、ＳＡＴ、ＯＡＳＬおよび／また
はＰＴＡ生産能が高い、即ち、菌体蛋白質１mgあたりの
ＳＡＴ、ＯＡＳＬおよび／またはＰＴＡ活性が高いこと
から、上記のように微生物菌体から酵素を分離精製する
ことなく、菌体または磨砕、破壊などの処理物をそのま
ま酵素源として用いることができる。具体的には、ＳＡ
ＴをコードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組込んだ組換
え体ＤＮＡにて形質転換した微生物のＳＡＴ活性は、菌
体蛋白質１mg当たり 0.1〜30Ｕである。また、ＯＡＳＬ
をコードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組込んだ組換え
体ＤＮＡにて形質転換した微生物のＯＡＳＬの活性は菌
体蛋白質１mg当たり２〜300 Ｕである。更に、ＰＴＡを
コードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組込んだ組換え体
ＤＮＡにて形質転換した微生物のＰＴＡの活性は菌体蛋
白質１mg当たり５〜300 Ｕである。

【００４４】尚、ＳＡＴ活性が 0.1Ｕ／mg未満の場合
は、菌体自体のＬ−含硫アミノ酸の分解系の酵素活性が
強くなるために、菌体および／またはその処理物をその
まま酵素源として用いることはできない。ＯＡＳＬ活性
が２Ｕ／mg未満、ＰＴＡ活性が５Ｕ／mg未満の場合も同
様である。またＳＡＴ活性が30Ｕ／mgを超える微生物菌
体を調製することは現在むずかしい。ＯＡＳＬが 300Ｕ
／mgを超える場合、ＰＴＡ活性が 300Ｕ／mgを超える場
合も同様である。

【００４５】Ｌ−含硫アミノ酸の製造法 (A) 〜(D) 成分と、(E) 〜(G) 成分とを反応させるか、
(A) 〜(D) 成分と、(F')成分および(H) 成分とを反応さ
せるか、(A) 〜(D) 成分と、(E')成分および(I) 成分と
を反応させるか、(A) 〜(D) 成分と、(G')成分および
(J) 成分とを反応させるか、(A) 〜(D) 成分と、(K) 成
分とを反応させることにより、Ｌ−含硫アミノ酸を生成
させることができる。

【００４６】この場合、反応は適宜な緩衝液中で行う
が、(A) 〜(D) 成分は予め緩衝液に混合した後に、微生
物の菌体および／またはその処理物と混合するのが好ま
しい。上記の混合において、混合する各種成分の濃度に
は特に制限はないが、一般的には、(A) 成分のＬ−セリ
ンは50〜150 ｍＭ、好ましくは60〜130 ｍＭ、(B) 成分
の硫化物は10〜50ｍＭ、好ましくは20〜32ｍＭ、(C) 成
分のアセチルＣｏＡは0.1〜１ｍＭ、好ましくは 0.3〜
0.5 ｍＭ、(D) 成分のアセチルリン酸５〜30ｍＭ、好ま
しくは10〜30ｍＭである。

【００４７】微生物の菌体および／またはその処理物の
添加量は菌体の処理方法により異なるが特に制限がな
く、基質の濃度、前記三つの酵素の活性、その他の種々
の条件により適宜変更できる。この反応の場合、反応液
中のＳＡＴの活性を、0.01〜30Ｕ（以下Ｕは国際単位と
する）、好ましくは0.03〜30Ｕ、特に好ましくは 0.1〜
30Ｕ、ＯＡＳＬの活性を１〜300 Ｕ、好ましくは３〜30
0 Ｕ、特に好ましくは５〜300 Ｕ、ＰＴＡの活性を 0.5
〜300 Ｕ、好ましくは１〜300 Ｕ、特に好ましくは５〜
300 Ｕになるように微生物の菌体および／またはその処
理物を反応液に存在させることが、Ｌ−含硫アミノ酸の
反応収率を上げるのによい。すなわち、アセチルＣｏＡ
再生系を強化することにより、高価な原料であるアセチ
ルＣｏＡを低濃度にして、Ｌ−含硫アミノ酸の反応収率
を上げることができる。

【００４８】この場合、反応液中のＳＡＴ活性が0.01Ｕ
未満の場合は、該活性が反応生成物であるＬ−含硫アミ
ノ酸による阻害すなわちフィードバック阻害を受けるよ
うになり、Ｌ−含硫アミノ酸の反応収率が低下する。Ｏ
ＡＳＬ活性が１Ｕ未満の場合は、Ｏ−アセチル−Ｌ−セ
リンが反応液中に生成蓄積するがＬ−含硫アミノ酸の生
成蓄積量はすくなくなる。ＰＴＡ活性が 0.5Ｕ未満の場
合は、アセチルＣｏＡの生成量が少なくなので、上記原
料の他にアセチルＣｏＡを多量添加しないと反応が円滑
に進行しなくなる。また、ＳＡＴ活性が30Ｕを超える場
合は、反応に必要とする以上の量であるので、Ｌ−含硫
アミノ酸の生産コストが上昇するので、好ましくない。
ＯＡＳＬ活性が 300Ｕを超える場合、ＰＴＡ活性が 300
Ｕを超える場合も同様である。

【００４９】本発明の方法において、生菌体、または乾
燥菌体自体を酵素源として用いる場合、各種界面活性剤
または各種有機溶剤を反応液中に添加することにより、
より収率よく生成物を得ることができる。界面活性剤と
しては、ポリオキシエチレン・ステアリルアミン（例え
ばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）、セチルトリ
メチルアンモニウムブロマイドなどのカチオン性界面活
性剤、ナトリウムオレイルアミド硫酸などのアニオン性
界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン・モノステ
アレート（例えば、ノニオンＳＴ２２１、日本油脂社
製）などの非イオン界面活性剤などＬ−含硫アミノ酸の
生成を促進するものならば、いずれでも使用できる。こ
れらは通常、反応液１ml当たり１〜50mg、好ましくは１
〜20mgの濃度で用いられる。

【００５０】有機溶剤としては、トルエン、キシレン、
アセトン、脂肪族アルコール、ベンゼンあるいは酢酸エ
チルなどを用いることができる。これらは、通常、反応
液１ml当たり、 0.1〜50μｌ、好ましくは１〜20μｌの
濃度で用いられる。反応温度は、通常10〜60℃、好まし
くは20〜50℃、特に好ましくは36〜48℃であり、ｐＨは
通常５〜９、好ましくは６〜8.5 である。また、反応
は、通常、１〜８０時間で完了する。

【００５１】反応液からのＬ−含硫アミノ酸、すなわち
Ｌ−システインおよび／またはＬ−シスチンの分離精製
は、通常の酵素反応液、発酵液からのアミノ酸の精製に
用いられる方法を用いて行なうことができる。たとえ
ば、反応終了後に反応液に通気を行なえば、Ｌ−システ
インは酸化されてＬ−シスチンとなって沈殿するので容
易に単離できる。このようにして得られるＬ−シスチン
は電気分解などによる還元により容易にＬ−システイン
となる。

【００５２】

【実施例】以下本発明を実施例をもって説明する。本発
明においては、Ｌ−含硫アミノ酸、すなわちＬ−システ
インおよびＬ−シスチンの定量法、ＳＡＴ、ＯＡＳＬ、
ＰＴＡの活性測定法は以下のとおりである。

【００５３】〔Ｌ−含硫アミノ酸の定量法〕Ｌ−システ
インおよびＬ−シスチンを、ＨＰＬＣ（高速液体クロマ
トグラフィー）で定量した。本発明ではＬ−システイン
とＬ−シスチンの合計量を本発明の酵素反応により生成
したＬ−含硫アミノ酸量とした。

【００５４】ＨＰＬＣによる定量は、ＮＢＤ−Ｆ（7-fl
uoro-4-nitorobenzo-2-oxa-1,3-diazole）を用いたＨＰ
ＬＣ−蛍光法（Y.Watanabe, K.Imai, J.Chromatofr., 2
39,723(1982))をもとに行った。反応液を４０倍に希釈
し、その１００μl を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ８．０）７００μl に加えた。これに１０ｍＭＮ
ＢＤ−Ｆのアセトニトリル溶液１００μl を加え、遮光
下６０℃で４分間加熱することによってアミノ酸を蛍光
ラベル化した。３０秒間氷冷し、１Ｎ塩酸を１００μl
加えて反応を停止した。生成物２０μl をＨＰＬＣカラ
ムに注入し、下記条件にて分析を行った。即ち、カラム
はWaters社製μBONDAPAK C18 125A10μｍ（ 3.9×150m
m)を室温で用い、溶出液Ａ（50mM 酢酸アンモニウム−
アセトニトリル−メタノール（80:10:10、v/v)）を 5.5
分、次に溶出液Ｂ（50mM 酢酸アンモニウム−アセトニ
トリル−メタノール（30:30:40、v/v)) を流速 0.8ml/m
inで用いた。検出は蛍光検出器（HITACHIF-1000 Fluoro
photometer) を用いてλext470nm、λem 540nmで行っ
た。この条件下での保持時間はシステイン19分、シスチ
ン22分であり、各アミノ酸は標準品から得た検量線より
算出した。

【００５５】〔ＳＡＴ活性〕 試薬１：１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．６）（１ｍＭ
Na₂EDTA含有）、１ｍＭ Ｌ−セリン、および０．１
ｍＭ アセチルＣｏＡを含有する。試験管（１×８ｃ
ｍ）に試薬１を１．９５mlとり、適宜に希釈した酵素液
を０．０５ml加えて、１分間当りの２３２ｎｍでの吸光
度の減少（アセチルＣｏＡの消費量）を測定する。次式
により酵素活性を算出する。 （△ＯＤ／４．２）×４０＝酵素液１ml当りの活性（Ｕ
／ml）

【００５６】〔ＯＡＳＬ活性〕 試薬２：１６０ｍＭ トリス塩酸、１００ｍＭ Ｏ−ア
セチル−Ｌ−セリン、３．２ｍＭ 硫化ナトリウム、
０．８ｍＭ EDTAおよび０．２ｍＭ ピリドキサールリ
ン酸を含む溶液（ｐＨ７．２〜７．３） 試薬３：１ｍＭ 亜硝酸溶液（０．１Ｍ NaNO₂／０．
４Ｎ H₂SO₄ 、１ｖ／９９ｖ）

【００５７】試薬４：２％スルファミン酸ナトリウム溶
液 試薬５：塩化水銀溶液（下記のＡ、Ｂ、Ｃ溶液を１：
４：２（ｖ／ｖ）の割合で混合した） Ａ：２％塩化水銀溶液（０．４Ｎ 塩酸で調製） Ｂ：６．８８％スルファミン酸アミド溶液（０．４Ｎ
塩酸で調製） Ｃ：０．２％Ｎ−１−ナフチル−エチレンジアミン無水
塩酸塩溶液（０．４Ｎ 塩酸で調製）

【００５８】試験管（１×８ｃｍ）に試薬２を１９０μ
ｌとり、次に適宜に希釈した酵素液１０μｌ加えて４分
間酵素反応を行う。試薬３を１ml加えて反応を停止さ
せ、６分後、試薬４を０．１ml加え、２分間撹拌する。
試薬５を１．６ml加え、６〜１０分後、発色した色を５
４０ｎｍで比色定量する。次式に活性を算出する。 （△ＯＤ／４／０．２７／１０）×２０×希釈率＝酵素
液１ml当りの活性（Ｕ／ml）

【００５９】〔ＰＴＡ活性〕 試薬６：１００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．０）、５ｍ
Ｍ 塩化マグネシウム、０．５ｍＭ ＮＡＤ、０．５ｍ
Ｍ ＣｏＡ、５ｍＭ Ｌ−リンゴ酸、１２．５μｇ／ml
リンゴ酸脱水素酵素、２５μｇ／mlクエン酸合成酵素
（citrate synthase）。

【００６０】試薬７：１００ｍＭ アセチルリン酸溶
液。 試験管（１×８ｃｍ）に試薬６を２．７mlとり、適宜に
希釈した酵素液０．１mlを加え、次に試薬７を０．２ml
加えて３０℃にて２分間酵素反応を行なう。その間の３
４０ｎｍの吸光度の増加（ＮＡＤＨの生成量＝アセチル
ＣｏＡの生成量）を測定する。次式により酵素活性を算
出した。 （△ＯＤ／２／６．２２０）×３０×希釈率＝酵素液１
ml当りの活性（Ｕ／ml）

【００６１】〔実施例１〕−組換え体微生物の作製− （１）大腸菌1100株の染色体ＤＮＡの調製 大腸菌（Escherichia coli）1100株｛Max-Plank-Inst
itut（ハイデルベルグ；ドイツ）より入手｝をＴ−Ｙ培
地｛１％（w/v ）トリプトン（Difco 社製）、０．５％
酵母エキス（Difco 社製）、および０．５％（w/v ）Na
Cl、ｐＨ７．２｝１００mlに接種し、温度３７℃で８時
間振盪培養し、培養物を得た。

【００６２】この培養物を、１０，０００rpmで１５分
間、常法により遠心分離処理し、湿潤菌体０．５ｇを得
たのち、該菌体から斎藤、三浦の方法（Biochem. Bioph
ys.Acta, 72, 619 (1963)）により染色体ＤＮＡを得
た。次いで、この染色体ＤＮＡ６０μｇおよび制限酵素
Sau3AI（東洋紡績社製）３Ｕを、１０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（５０ｍＭ NaCl、１０ｍＭ MgSO₄および１ｍＭ
ジチオスレイトール含有、ｐＨ７．４）に各々混合し、
温度３７℃で３０分間反応させた。反応終了後、該液を
常法により、フェノール抽出処理したのち、エタノール
沈殿処理し、このSau3AIで消化されたＤＮＡ断片が再結
合することを防止するために、アルカリフォスファター
ゼ処理（Molecular Cloning 、133-134 頁）し、ＤＮＡ
断片末端の脱リン酸化を行なった。更に常法によりフェ
ノール抽出処理し、更にエタノール沈殿処理して、Sau3
AIで消化された大腸菌1100株の染色体ＤＮＡ断片５０μ
ｇを得た。

【００６３】ｐｔａの単離 （２）組換え体プラスミドpPT100ＤＮＡの作製 プラスミドpBR322ＤＮＡ（Bethesda Research Laborato
ries社製）１０μｇおよび制限酵素BamHＩ（宝酒造社
製）１００Ｕを50mMトリス−HCl緩衝液（100mM NaCl、
１０ｍＭ MgSO₄含有、ｐＨ７．４）に混合し、温度３
７℃で２時間反応させて消化液を得た後、該液を常法に
よりフェノール抽出およびエタノール沈殿処理して、Ba
mHI で消化されたプラスミドpBR322ＤＮＡを得た。

【００６４】次いで、このBamHI で消化されたプラスミ
ドpBR322ＤＮＡ１０μｇ、項（１）で得られたSau3AIで
消化された大腸菌1100株の染色体ＤＮＡ断片１０μｇお
よび５ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Boehringer Manheim社
製）を６．６ｍＭ MgCl₂、１０ｍＭジチオスレイトー
ルおよび１０ｍＭ ＡＴＰを含有する６６ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．５）に添加し、温度１６℃で１６時
間反応させ、ＤＮＡを連結させ、種々の組換え体プラス
ミドＤＮＡを得た。

【００６５】そして、ディ・エム・モーリソン（D. M.
Morrison）の方法（Methods in Enzymology, 68, 326-3
31 (1979) ）により、塩化カルシウム処理した大腸菌11
00株を、上記のように連結させた種々の組換え体プラス
ミドＤＮＡで形質転換し、アンピシリン耐性およびテト
ラサイクリン感受性の形質転換株３０００株を得た。こ
のようにして得られた形質転換株のＰＴＡ活性を前記の
ようにして測定し、宿主大腸菌1100株よりＰＴＡ活性が
上昇している形質転換株である大腸菌1100（pPT100）株
を得た。

【００６６】（３）組換え体プラスミドpPT100 ＤＮＡ
の単離 前記大腸菌1100（pPT100ｐ）株からT.Maniatisらの方法
（Molecular cloning、86-96 頁、1982年；Cold Spring
Harbor Laboratory 出版）により、組換え体プラスミ
ドpPT100を単離精製した。すなわち、前記Ｔ−Ｙ培地
で、３７℃、２４時間前培養して得た大腸菌1100（pPT1
00）株の培養液２０mlを、該培地１ｌに接種し、３７℃
で３時間振盪培養したのち、培養液にクロラムフェコー
ル０．２ｇ添加し、更に同一温度で２０時間培養し、培
養液を得た。

【００６７】次いで、この培養液を、常法により１０，
０００rpmで１０分間遠心分離処理して湿潤菌体を得
た。これを２０mlの２５％（w/v ）ショ糖を含有する５
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁したの
ち、さらに、これに、リゾチーム１０mg、０．２５Ｍ
ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）８mlおよび２０％（w/v ）
ドデシル硫酸ナトリウム溶液８mlを夫々添加し、６０℃
で３０分間、保温して溶菌し、溶菌液を得た。

【００６８】この溶菌液に、５Ｍ ＮａＣｌ溶液１３ml
を添加し、４℃で１６時間処理したものを常法により１
５，０００rpmで３０分間遠心分離して抽出液を得た。
これを常法によりフェノール抽出したのち、常法により
エタノール沈殿処理し、沈殿物を得た。そして、この沈
殿物を、常法により減圧乾燥処理したものを、１ｍＭ
ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭトリス塩酸緩衝液６ml（ｐ
Ｈ７．５）に溶解し、更に、これに塩化セシウム６ｇお
よび１０mg／mlエチジウムブロマイド０．２mlを添加し
たものを、常法により３９，０００rpmで４２時間超遠
心分離機を用いて平衡密度勾配遠心処理を行なった。該
処理物から組換え体プラスミドpPT100ＤＮＡを単離し、
また、更に、ｎ−ブタノールを使用してエチジウムブロ
マイドを除いたのち、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有の１０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析を行ない
純化された組換え体プラスミドpPT100ＤＮＡ（１０．０
kb）１mgを得た。

【００６９】（４）新規な組換え体プラスミドpAK222LL
の作製 大腸菌の遺伝子ｐｔａは、リンケージ・マップ（Microb
iological Reviews 第４７巻、第２号、１８０〜２３０
頁（１９８３年））上、アセテートカイネース遺伝子の
すぐ下流に位置づけられている。上記（３）で得られた
pPT100ＤＮＡと、アセテートカイネース遺伝子を含むpA
K122ＤＮＡ(FERM BP-1534)の制限酵素地図を比較した結
果、KpnIとBamHIの間がオーバーラップしていることが
明らかとなった。そこで、pAK122 DNA上のアセテートカ
イネース遺伝子上流にあるプロモーター領域を利用して
遺伝子ｐｔａの発現が可能なプラスミドDNAを以下の通
り作製した。

【００７０】組換え体プラスミドpAK122ＤＮＡ(FERM BP
-1534) 0．2μg並びに制限酵素BamHＩ,HindIII （とも
に、宝酒造社製）で切断し、該液を常法によりフェノー
ル抽出及びエタノール沈殿処理して、BamHＩ,HindIII
で消化されたプラスミドpAK122ＤＮＡを得た。次いで、
項（３）で得られた組換え体プラスミドpPT100ＤＮＡ 1
μgをBamHI、HindIII で反応させて得た消化液を０．７
％アガロースゲル電気泳動したのち、ゲルより１．６kb
のＤＮＡ断片をＲ．Ｃ．Ａ．Ｙａｎｇらの方法（Method
s in Enzymology,68巻,176〜182頁,1971年）により目的
のＤＮＡを溶出した。溶出物をフェノール抽出処理、エ
タノール沈殿処理をして目的の精製されたＤＮＡ断片
０．３μgを得た。

【００７１】上記のようにして得た０．３μgのBamH
Ｉ、HindIII で消化したプラスミドpAK122ＤＮＡ及びBa
mHＩ、HindIII で消化した0.3μgのpPT100プラスミドＤ
ＮＡ由来の１．６kbのDNA断片を、各々７ulの水に溶解
し、これに混液（77mMトリス塩酸(pH7.4)/15mM MgCl2/1
5mM ジチオスレイトール/0.15mM ATP)13μl及び１ＵのT
4DNAリガーゼを添加し、８℃で１８時間連結反応を行っ
た。この反応液を用いて、Journal of Bacteriology（1
19巻、1072〜1074頁）記載の形質転換法により、大腸菌
JM101(ATCC33876)株を形質転換した。得られた形質転換
株の含有するプラスミドＤＮＡの制限酵素切断パターン
を検討し、目的の組換えプラスミドＤＮＡを得て、pAK2
22と命名した。

【００７２】次に、pAK222上のｐｔａ遺伝子の両外側に
EcoRI切断部位をつけるために、 5'CGCGAATTCGAAGCTTCTAGA3' 5'CGCGTCTAGAAGCTTCGAATT3' の配列からなるオリゴヌクレオタイドを合成し、MluＩ
で切断したpAK222ＤＮＡと混合し、T4DNA ligaseで連結
し、常法に従い大腸菌JM101を形質転換した。得られた
形質転換株の含有するプラスミドＤＮＡの制限酵素切断
パターンを検討した結果、上記オリゴヌクレオタイドが
挿入された目的のプラスミドＤＮＡを得て、pAK222Lと
命名した。

【００７３】引き続き、 5'ACTAGTCTCGAGAATTCTAGAGC3' 5'TCTAGAATTCTCGAGACTAGTGC3' の配列からなるオリゴヌクレオタイドを合成し、KspＩ
（ベーリンガー・マンハイム社製）で切断したpAK222L
ＤＮＡと混合し、常法に従いT4DNA ligaseを作用させて
連結後、大腸菌JM101を形質転換した。得られた形質転
換株の含有するプラスミドＤＮＡの制限酵素切断パター
ンを検討し、上記オリゴヌクレオタイドが挿入された目
的のプラスミドＤＮＡを得た。これをpAK222LLと命名し
た。また、このプラスミドでの大腸菌形質転換体をJM10
1(pAK222LL)と命名した。尚、図６に、項（１）〜
（４）に記載のpAK222LL作製の手順を制限酵素地図にて
示した。

【００７４】ｃｙｓＥの単離 （５）野生型大腸菌より遺伝子の単離、及び組換え体プ
ラスミドの作製 遺伝子ｃｙｓＥは前記Ｄ．Ｄｅｎｋらによって報告（D.
Denk, A.Bock:J.Gen.Microbiol., 133, 515-525 (198
7)）された遺伝子塩基配列をもとにＰＣＲ法を用いて単
離された。まず、Ｎ末端側に相当する 5'ATGTCGTGTGAAGAACTGGAA3' と、Ｃ末端側に相当する 5'ACATTAGATCCCATCCCCATACTCAAATGTATGGTTAATACCGTTGAAATGCTGGTCTAT3' の配列からなるオリゴヌクレオチドを、アプライトバイ
オシステムズ社製 Model392 DNA/RNA シンセサイザーを
用いて、常法により合成した。精製は、アプライトバイ
オシステムズ社製オリゴヌクレオチド精製カートリッジ
を用いて常法により行った。

【００７５】これら合成オリゴヌクレオチドをプライマ
ーＤＮＡとして用い、in vitroのＤＮＡ増幅によりｃｙ
ｓＥ遺伝子を単離した。具体的には、Perkin-Elmer Cet
us Instruments社製のＤＮＡ Thermal Cycler、及び宝
酒造社製GeneAmp ＤＮＡ Amplification Reagen Kit を
用い、下記の条件で反応を行った。即ち、項（１）で作
製した大腸菌1100染色体ＤＮＡ溶液２０μｌ（０．８μ
g／２０μl ＴＥバッファー）に、２Ｎ NaOH １０μl
および滅菌水７０μlを加え、７０℃で、１０分間加熱
処理した。さらに、７．５Ｍ酢酸アンモニウム５０μl
および冷エタノール４５０μlを加え、−８０℃で３０
分間放置した後遠心し、沈殿を７０％エタノールで洗浄
後、吸引乾固し滅菌水２０μlに溶解した。こうして得
られたＤＮＡ溶液をテンプレートＤＮＡ溶液として用い
た。反応は、反応バッファー１０μl、ｄＮＴＰ混合物
１６μl、Taq polymerase ０．５μlにＮ末端側プライ
マーＤＮＡ５μl、Ｃ末端側プライマーＤＮＡ５μl、テ
ンプレートＤＮＡ０．２μl、滅菌水を加え全量を１０
０μlとし、下記の反応温度条件で行った。

【００７６】即ち、９４℃３分、５５℃１分３０秒およ
び７２℃２分３０秒の反応を１サイクル行い、次に９４
℃１分３０秒、５５℃２分および７２℃２分の反応を２
５サイクル行った。最後に７２℃で７分間放置した後、
４０分かけて４℃に下げた。反応終了後、増幅された約
１kbのフラグメントをアガロース電気泳動により常法に
より単離精製し、T4 DNA polymeraseを作用させて末端
を平滑化した。

【００７７】プラスミドベクターpBR322ＤＮＡ（宝酒造
社製）をEcoRＩ及びNruＩで消化後、DNA blunting Kit
（宝酒造社製）で平滑末端とした．次に、常法に従って
アガロースゲル電気泳動をおこない、GENECLEAN II KIT
（フナコシ（株）製）により複製起点を含む約３．４kb
のＤＮＡ断片を取得した。得られたＤＮＡをT4DNA liga
seにより環状にした後、EcoRIで切断し、直鎖にした。

【００７８】次いで、以下に示すような大腸菌ラクトー
スオペロン等に由来するプロモーター、オペレーター、
リボソーム結合部位及びターミネーター等の発現調節領
域並びにHpaI切断部位及びマルチクローニングサイトを
含むDNA配列をDNA Synthesizer Model 392（アプライド
バイオシステムズ社製）をもちいて合成し、上記で得ら
れたEcoRI断片と連結して発現ベクターpUTE100を作製し
た。 AATTCGGTACCGGATCCGCTAGCTTTACATTATGCTTCCGGCTCGTATAATGTGATGGAATTGTGAGCGG GCCATGGCCTAGGCGATCGAAATGTAATACGAAGGCCGAGCATATTACACTACCTTAACACTCGCC ATAACAATTCCATCGTTAGGAGGTTTTAGTTAACTAAACTAGTAGATCTGGTACCG TATTGTTAAGGTAGCAATCCTCCAAAATCAATTGATTTGATCATCTAGACCATGGCTTAA

【００７９】上記で平滑化した1kbのDNA断片をpUTE100
のHpaI siteに導入し、pOHE100を得た。大腸菌株JM101
を該形質転換プラスミドを用いて、前記同様に形質転換
して形質転換株JM101(pOHE100)を得た。

【００８０】（６）システインによるフィードバック阻
害解除型ｃｙｓＥの作製、及び組換え大腸菌の作製 さらに、ｃｙｓＥにおけるMet256をIle256 に変換する
ために、Kunkel法(Proc. Natl. Acad. Sci.、８２巻、
４８８頁、１９８５年）に基づく部位特異的変異処理
（site-directed mutagenesis ）を行った。具体的に
は、Met256の領域を含むオリゴヌクレオチド(5'-AATGCT
GGTCAATATCCATTG-3') を常法により合成し、T4polynucl
eotide kinaseによるリン酸化を行った。次に、pOHE100
とリン酸化オリゴヌクレオチドのアニーリング、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてのリペ
アー反応を行った後、このプラスミドＤＮＡを用いて大
腸菌の形質転換を行った。得られた形質転換体よりプラ
スミドＤＮＡを回収し、それにコードされているｃｙｓ
Ｅ遺伝子の塩基配列を確認したところ、Met256を示すAT
GがIle256を示すＡＴＴに正しく変換されていることが
明らかになった。

【００８１】こうして得られた変異型ｃｙｓＥ遺伝子を
含むプラスミドをpOHE100Tとした。そしてこのプラスミ
ドで、前記ｐｔａの単離に記した方法により大腸菌JM10
1を形質転換し、形質転換大腸菌株JM101(pOHE100T)を得
た。更に、前記同様の調製法で、この形質転換体を用い
て、組換え体プラスミドpOHE100TＤＮＡ １mgを得た。
尚、図７に、項（５）〜（６）に記載のpOHE100T作製の
手順を制限酵素地図にて示した。

【００８２】ｃｙｓＫの単離 （７）野生型大腸菌より遺伝子の単離、及び組換え体プ
ラスミドの作製 前記D．Denkらによって報告された遺伝子塩基配列をも
とにＰＣＲ法を用いて、ｃｙｓＫ遺伝子を単離した。ま
ず、Ｎ末端側に相当する 5'ATGAGTAAGATTTTTGAAGA3' とＣ末端側に相当する 5'CAAGCTGGCATTACTGTTGC3' の配列からなるオリゴヌクレオチドを、アプライトバイ
オシステムズ社製 Model392 DNA/RNAシンセサイザーを
用いて、常法により合成した。精製は、アプライトバイ
オシステムズ社製オリゴヌクレオチド精製カートリッジ
を用いて常法により行った。これら合成オリゴヌクレオ
チドをプライマーＤＮＡとして用い、invitro ＤＮＡ増
幅によりｃｙｓＫ遺伝子を単離した。具体的には、Perk
in-ElmerCetus Instruments社製のDNA Thermal Cycle
r、及び宝酒造（株）製のGeneAmpDNA Amplification Re
agent Kitを用い、下記の条件で反応を行った。

【００８３】即ち、前記大腸菌1100染色体ＤＮＡ溶液20
μｌ（0.8μg／20μlＴＥバッファー）に、2N NaOH 10
μl、滅菌水70μlを加え、70℃、10分間加熱処理した。
さらに、7.5Ｍ酢酸アンモニウム50μl、冷エタノール45
0μlを加え、-80℃で30分間放置した後、遠心し、沈殿
を70％エタノールで洗浄後、吸引乾固し滅菌水20μlに
溶解した。こうして得られたＤＮＡ溶液をテンプレート
ＤＮＡ溶液として用いた。反応は、反応バッファー10μ
l、dNTPmix16μl、Taq polymerase0.5μlにＮ末端側Ｄ
ＮＡ5μl、Ｃ末端側ＤＮＡ5μl、テンプレートＤＮＡ0.
2μl、滅菌水を加え全量を100μlとし、下記の反応温度
条件で行った。即ち、STEP 1（94℃ 3分、55℃ 1分30
秒、72℃ 2分30秒）を１サイクル行い、次にSTEP 2（94
℃ 1分30秒、55℃ 2分、72℃ 2分）を25サイクル行っ
た。最後にSTEP 3（72℃ 7分、40分かけて 4℃におとす
）を行った。

【００８４】反応終了後、アガロース電気泳動により約
１kbのフラグメントを常法により単離精製し、T4 DNA p
olymeraseを作用させて末端を平滑化し、pUTE100のHpaI
sitに導入した。該プスミドＤＮＡをpOHK100と命名し
た。このようにして得られたプラスミドを用い、前記し
た方法により大腸菌JM101を形質転換し、形質転換体大
腸菌株JM101(pOHK100)を得た。更に、前記同様にして、
この形質転換体を用いて、pOHK100 ＤＮＡ １mgを得
た。尚、図８に、項（７）に記載のpOHK100 作製の手順
を制限酵素地図にて示した。

【００８５】同一ベクターにｃｙｓＥおよびｃｙｓＫ遺
伝子を含有する組換え体プラスドＤＮＡの調製 （８）組換え体プラスミドpOHC100Tの調製 項（７）で作製した、lac-promoterより発現可能なｃｙ
ｓＫを保持するpOHK100をSpel切断部位で切断した。次
に、項（６）で作製したpOHE100TをSpeI、NheIで切断
し、lac-promoterと変異型ｃｙｓＥを含む断片を、pOHK
100のSpeI部位に導入した。その結果、変異型ｃｙｓ
Ｅ、ｃｙｓＫ（共にlac-promoterの支配下にある）の外
側にEcoRI、KpnI切断部位を共に保持するpOHC100Tを得
た。そして、このプラスミドを用いて、前記の方法によ
り大腸菌JM101を形質転換し、形質転換大腸菌株JM101(p
OHC100T)を得た。更に組換え体プラスミドpOHC100TＤＮ
Ａ １mgを前記同様にして調製した。

【００８６】（遺伝子ｐｔａを含有する組換え体ファー
ジＤＮＡの調製） （９）バクテリオファージλcI₈₅₇ １１２１の調製 特開昭58ー212781号公報記載の実施例と全く同様にして
バクテリオファージλcI₈₅₇ １１２１〔このファージ
は、このファージを常法により前記記載の大腸菌1100に
溶原化して得られる溶原菌、すなわち、E.coli 1100(λ
cI₈₅₇ １１２１)「微工研条寄第１３３号(FERM BP-13
3)」として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され
ている。〕を調製し、このバクテリオファージλcI₈₅₇
１１２１から、T.Maniatisらの方法（Molecular Clonin
g 、７６〜８５頁、１９８２年；ColdSpring Harbor La
boratory 出版）によりバクテリオファージλcI₈₅₇ １
１２１のＤＮＡを得た。

【００８７】（１０）バクテリオファージλcI₈₅₇ １１
２１Ｓの調製 次いで、このようにして得られたバクテリオファージλ
cI₈₅₇ １１２１のＤＮＡ２．１μｇ及び１０ユニットの
EcoRI（宝酒造社製）を５０ｍＭトリスーＨＣｌ緩衝液
（100mM NaClおよび10mM MgSO4含有、pH7.4）中で３７
℃で１時間反応させた、常法によりフェノール抽出及び
エタノール沈殿を行いバクテリオファージλcI₈₅₇ １１
２１のEcoRI消化物を得た。

【００８８】このＤＮＡ断片０．４μｇを、λcI₈₅₇ Sa
m ７ＤＮＡ（米国ワシントン社より入手）に添加した
後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ユニットを添加し、７℃で４
８時間保持して、組換え体ＤＮＡの混合物を得、更に該
ＤＮＡ混合物を、イン・ビトロ・パッケージング（in v
itro packaging）法（Methods in Enzymology 、６８
巻、２８１〜２９８頁、１９７９年；Academic Press出
版）によりバクテリオファージの被膜蛋白質で包み、バ
クテリオファージ粒子を得た。

【００８９】次いで、この様にして得たバクテリオファ
ージ粒子を大腸菌QD5003（九州大学より入手、以下、同
株使用）を指示菌としてトリプトン寒天培地上に巻き、
３７℃で１６時間培養した後、生じたプラークを観察し
た。これより、大腸菌1100を指示菌として用いた場合は
プラークを形成せず、大腸菌QD5003を指示菌として用い
た場合はプラークを形成する性質を有し、且つ後期プロ
モーターP'r部位より下流域で、その付着末端に至るＤ
ＮＡ部分にのみEcoRI による切断部位が一カ所存在し、
且つまた、溶菌に関与する遺伝子が該遺伝子が変異した
ＤＮＡ断片（λcI₈₅₇ Sam7 ＤＮＡ由来）に組み換えら
れたために、宿主細菌を溶解する能力を欠出したバクテ
リオファージλcI₈₅₇ １１２１Ｓを分解して得た。

【００９０】（１１）λcI₈₅₇ １１２１Ｓの後期プロモ
ーターより下流域で、その付着末端に至るＤＮＡ部分に
存在するエンドヌクレアーゼ切断部位に、PTA遺伝子断
片を挿入した組換え体バクテリオファージλEN1121S-PT
Aの調製 前項（１０）で得られたバクテリオファージλcI₈₅₇ １
１２１ＳＤＮＡ１０μｇおよび、前項で得られた組換え
体プラスミドPAK222LLＤＮＡ３μｇを混合し、これを50
mMトリス−ＨＣｌ(pH7.4)／100mM NaCl／10mM MgSO₄
の組成の溶液５０μｌに添加し、更に５０ユニットのEc
oRIを添加し、３７℃で２時間作用させた後、常法によ
りフェノール抽出及びエタノール沈殿処理を行い、沈殿
物を得、これを50mMトリス−ＨＣｌ(pH7.4)／10mM ジ
チオスレイトール／10mM MgCl2／0.1mM ＡＴＰの組成
の溶液８μｌに添加し、４℃で18時間作用させて連結反
応を行った。

【００９１】得られたＤＮＡ１０μｇを前記イン・ビト
ロ・パッケージング法によりλバクテリオファージの被
膜蛋白質で包み、バクテリオファージ粒子を調製した。
このファージ粒子溶液５０μｌに、大腸菌1100（１０⁹
個／ml、０．５μｌ）を加え、３０℃で３０分間孵置し
た。これに、更にバクテリオファージλcb2（１０¹⁰個
／ml、０．１ml）を加え、３０℃で３０分間孵置した
（この操作により非溶原菌は死滅する）。これをＴ−Ｙ
培地に撒き、３２℃で１６時間培養した。

【００９２】尚バクテリオファージλcb2は、大腸菌Ｋ
−１２（λ）（ATCC12435 ）より、A.D.Kaiser（Virolo
gy、３巻、２４頁、１９５７年）およびG.kellenberger
ら（J.Mol.Biol. 、３巻、３９９〜４０８頁、１９６１
年）の方法により調製した。以上の如くして培養し、生
育してきた菌株のうち、λcI₈₅₇ １１２１Ｓ ＤＮＡ上
にpta遺伝子を保持する組換え体バクテリオファージＤ
ＮＡによる溶原菌を以下の方法で検索した。そして、数
菌株のバクテリオファージＤＮＡ上にpta遺伝子を有す
る溶原菌を得た。

【００９３】すなわち、上記により得られた溶原菌、す
なわち、λcb2耐性且つ温度感受性菌を各々Ｔ−Ｙ培地
を用いて３２℃で１６時間振とう培養した。得た培養液
０．５mlを１５０ml容の三角フラスコ中の10mlのＴ−Ｙ
培地に接種し、クレットユニット（Klett unit）が約１
００になったところで温度を４３℃に上昇させて２５分
間振とうした後再び温度を３２℃に降下させて約３時間
振とう培養を続けた。

【００９４】この様にして得た培養液のうち１mlを超音
波破砕処理した物を細胞抽出液とし、前記記載の方法に
従い、ＰＴＡの酵素活性を測定し、活性の高い菌株を選
択した。この活性の高い溶原菌を、１０mlのＴ−Ｙ培地
を用い３２℃で振盪培養した。クレットユニットが約１
００になったところで温度を４３℃に上昇させて２５分
間振盪した後、再び温度を３７℃に降下させて約３時間
振盪培養した。該培養液より等容量のフェノール／クロ
ロホルム混合溶媒を用いてＤＮＡを抽出し、得られたＤ
ＮＡをエタノール沈殿させてＤＮＡを得た。

【００９５】この様にして得られたＤＮＡをトリス−Ｈ
Ｃｌ(pH7.5)／1mM EDTA組成の溶液１mlに溶解した。該
溶液４μｌを10mMトリス−ＨＣｌ(pH7.4)／100mM NaCl
／10mM MgSO4／1mM ジチオスレイトールの組成の溶液
３０μｌに添加し、更に５０ユニットのEcoRIおよび２
０μｇのRNaseA（シグマ社製）を添加し、３７℃で１時
間作用させて消化した。これをアガロースゲル電気泳動
処理し、ＤＮＡ断片の大きさを分析した。

【００９６】その結果、ＰＴＡ高活性の溶原菌全てに、
約４．６kbｐの組換え体プラスミドPAK222LL ＤＮＡ由
来のＤＮＡ断片が検出された。以上の如くして大腸菌
(E.coli)1100( λEN1121S-PTA) を分離し、所期の組換
え体バクテリオファージλEN1121S-PTAＤＮＡの調製を
行った。尚、図９に、項（９）〜（１１）に記載のλEN
1121S-PTA作製の手順を制限酵素地図にて示した。

【００９７】同一ベクターに遺伝子ｃｙｓＥ、ｃｙｓＫ
を同時に含有した組換え体ファージＤＮＡの調製 （１２）バクテリオファージλEN501S-Tcのコート蛋白
質製造の遺伝子情報部分に存在するエンドヌクレアーゼ
切断部位に、ｃｙｓＥ、ｃｙｓＫ遺伝子を挿入したバク
テリオファージλEN501S-CYSの調製 前記記載のバクテリオファージEN501S-Tc ＤＮＡ１０μ
ｇ及び前記記載の組換え体プラスミドpOHC100T ３μｇ
を混合し、これを50mMトリスーＨＣｌ緩衝液（100mM N
aCl及び10mM MgSO₄含有、pH7.5）５０μｌに添加し、更
に、５０ＵのEcoRI を添加し、３７℃で２時間反応させ
た。該反応物について、常法によりフェノール抽出及び
エタノール沈殿を行い、沈殿物を得た。これを50mMトリ
スーＨＣｌ緩衝液（10mM MgCl₂及び0.1mM ATP含有、pH
7.4）８μｌに添加し、更に２ユニットのＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを添加し、４℃で１８時間作用させて連結反応を
行った。

【００９８】得られたＤＮＡ１０μｇをイン・ビトロ・
パッケージング法によりλバクテリオファージの被覆蛋
白質で包み、バクテリオファージ粒子を調製した。この
ファージ粒子溶液５０μｌに大腸菌1100(１０⁹／ml、
０．５μｌ）を加え３０℃で３時間孵置した。これを、
更に前記記載の方法と同様にλcb２で処理し、更にＴｃ
（テトラサイクリング）耐性の菌株を選択することによ
り溶原菌を得た。この溶原菌をＴ−Ｙ培地を用いて３２
℃で１６時間振盪培養した。該培養液０．５mlを１５０
ml容三角フラスコ中の１０mlのＴ−Ｙ培地に接種し、培
養した。クレットユニットが約１００になったところで
温度を４３℃の上昇させて２５分間振盪培養した後、再
度温度を３２℃に降下させて約３時間振盪培養を続け
た。

【００９９】このようにして得た培養液のうち、１mlを
超音波器による破砕処理をした。この破砕物を細胞抽出
液とし、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１２８
巻、１０４７〜１０５２頁、１９８２年）に記載の方法
に従い、ＳＡＴ、ＯＡＳＬの酵素活性を測定した。そし
て、活性の高い株を選択した。この溶原菌より、前記記
載の方法と同様にしてＤＮＡを抽出し、１０ユニットの
EcoRＩで３７℃で２時間消化した。該消化物のＤＮＡ断
片の大きさを、アガロース電気泳動に掛け、分析した。
その結果、ＳＡＴ、ＯＡＳＬ高活性の溶原菌は約２．１
kbｐのpOHC100T由来のＤＮＡ断片を保持していた。

【０１００】以上の如くして大腸菌(E.coli)1100( λEN
501S-CYS) を分離し、所期の組換え体バクテリオファー
ジλEN501S-CYSの作製を行った。尚、図１０に、項（１
２）に記載のλEN501S-CYS作製の手順を制限酵素地図に
て示した。

【０１０１】同一ベクターにｃｙｓＥ、ｃｙｓＫ、ｐｔ
ａを同時に含有する組換え体ファージＤＮＡの調製 （１３）大腸菌1100(501CYS×PTA)の調製 前記記載のバクテリオファージλEN501S-CYS DNA１０μ
gおよびλEN1121S-PTADNA １０μgを各々混合し、これ
を50mMトリス-HCl(pH7.5)/10mM MgCl₂/1mMジチオスレイ
トール/100mM NaCl組成の溶液50μlに添加し、更に50ユ
ニットのNhel（ベーリンガーマンハイム山之内社製）を
添加し、３７℃で２時間作用させた後、常法によりフェ
ノール抽出及びエタノール沈殿して沈殿物を得た。これ
を50mMトリス-HCl(pH7.4)/10mM MgCl2/10mMジチオスレ
イトール／0.1mM ATPの組成の溶液８μｌに添加し、更
に２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマン
ハイム山之内社製）を添加し、４℃で１８時間作用させ
て、連結反応を行った。

【０１０２】得られたＤＮＡ１０μｇを前記イン・ビト
ロ・パッケージング法によりλバクテリオファージの被
覆蛋白質で包み、バクテリオファージ粒子を調製した。
このファージ粒子溶液５０μｌに大腸菌1100（１０⁹／m
l、０．５μｌ）を加え３０℃で２時間孵置した。この
ものから、前記と同様にλcb２で処理し、溶原菌を得
た。

【０１０３】該溶原菌は、１．５μｇ／mlのテトラサイ
クリングを含有する培地で生育せず、プラーク形成能を
欠失している株として選択した。この選択された組換え
体ＤＮＡを含有する菌株より組換え体ＤＮＡを検出する
方法を以下に示した。選択された組換え体ＤＮＡを含有
する溶原菌をＴ−Ｙ培地に接種して、クレットユニット
が約１００になったところで温度を４３℃に上昇させて
２５分間振とうした後再び、温度を３２℃に降下させて
約３時間振とうを続けた。このようにして得られた培養
液にクロロホルム５０μｌを添加し、更に温度３２℃で
２０分間振とうを続け（この操作により溶菌する。）、
常法によりフェノール抽出及びエタノール沈殿を行いＤ
ＮＡを抽出した。

【０１０４】このようにして得られたＤＮＡを、前記の
如くしてEcoRIで処理し、アガロース電気泳動にかけＤ
ＮＡ断片の大きさを分析した。その結果、選択された溶
原菌の保持する組換え体ＤＮＡは、ｃｙｓＥ、ｃｙｓＫ
遺伝子を含むpOHC100Tおよびｐｔａ遺伝子を含むpAK222
LL由来のＤＮＡ断片を保持することが判明した。以上の
如くして大腸菌(E.coli)1100 (λ501CYS×PTA)を分離し
た。尚、図１１に、項（１３）に記載のλ501CYS×PTA
作製の手順を制限酵素地図にて示した。

【０１０５】〔実施例２〕−大腸菌形質転換体1100 (λ
501CYS×PTA)株を用いるＬ−含硫アミノ酸の製造− 前記記載の大腸菌1100( λ501CYS×PTA)株をＴ−Ｙ培地
（トリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウ
ム０．５％）2ml中に接種し、３０度で16時間振とう培
養した。

【０１０６】得られた培養物1mlを、500ml容枝付き三角
フラスコに分注し、滅菌した50mlのＴＹ培地（トリプト
ン２％、酵母エキス１％、塩化ナトリウム０．７５％、
塩化マグネシウム１ｍＭ）に接種し、３２℃で振盪培養
し、クレットユニットが約１００になったところで温度
を４２℃に上昇させて２０分間振盪培養した。再び、温
度を３７℃に降下させて約４時間振盪培養を続けた。

【０１０７】培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を
集め、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に
懸濁後超音波破砕し、粗酵素液とした。得られた粗酵素
液（80μｇ蛋白質相当量）を、セリン20ｍＭ、アセチル
ＣｏＡ0.1ｍＭ（Ｌ−セリン１mmolあたり０．００５mmo
lである）、アセチルリン酸40ｍＭ、硫化水素20ｍＭ、E
DTA0.8mM、ピリドキサルリン酸0.2mMを含む１０ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液０．５ml（ｐＨ７．５）に加え、30
℃で30分間反応させた。反応終了後直ちにミリポア Ult
ra free C3GC (MW=10000)を用いて膜濾過することによ
り菌体を除いた反応液を得た。

【０１０８】なお、上記反応液中のＳＡＴ活性は０．１
６Ｕ、ＯＡＳＬ活性は３．７Ｕ、ＰＴＡ活性は３．０Ｕ
であった。反応終了後の反応液中のＬ−含硫アミノ酸の
含有量を測定して表１に示した（本発明１）。また、比
較のため、ｃｙｓＥおよびｃｙｓＫ遺伝子のみを強化し
たプラスミドＤＮＡを有する大腸菌1100株（λEN501S-C
YS) についても同様にＬ−含硫アミノ酸の生成反応を行
った（対照１）。これらの結果をまとめて表１に示し
た。

【０１０９】

【表１】 ────────────────────────── 菌株 Ｌ−含硫アミノ酸生産量 (mM/30min.) ────────────────────────── （本発明１）大腸菌1100 １．２ (λ501CYS×PTA) （対照１） 大腸菌1100 ０．６ (λEN501S-CYS) ──────────────────────────

【０１１０】表１より、本発明により得られる、すなわ
ち、大腸菌1100(501CYS×PTA)から得られる粗酵素液
は、対照の粗酵素液に比してＬ−含硫アミノ酸の生産量
が増加して、ＰＴＡの存在によるアセチルＣｏＡ再生系
の強化の効果がでていることがわかる。なお、上記対照
１において、Ｌ−含硫アミノ酸の製造量を本発明のもの
にするためには、アセチルＣｏＡの反応液中の濃度を
０．３ｍＭ（Ｌ−セリン１mmolあたり０．０１５mmol）
にする必要があった。

【０１１１】〔実施例３〕大腸菌JM101(pOHE100)株、JM
101(pOHE100T) 株、JM101(pOHK100)株およびJM101(pAK2
22LL) 株を実施例２と同様に各々培養した。更に、各々
の菌体について、実施例２と同様にして粗酵素液を調製
した。各粗酵素液を、表２に示す活性になるように添加
する以外は、実施例２と同様にＬ−含硫アミノ酸の生成
反応を行った。そして、Ｌ−含硫アミノ酸の生産量を測
定し、結果を表２に示した。

【０１１２】

【表２】 ─────────────────────────────────── 菌株 添加した 添加した酵素 Ｌ−含硫アミノ酸 酵素の種類 活性（Ｕ） 生産量(mM/30min.) ─────────────────────────────────── （本発明２） JM101(pOHE100T) 株 ＳＡＴ^I ０．１６ JM101(pOHK100)株 ＯＡＳＬ ３．７ ０．９５ JM101(pAK222LL) 株 ＰＴＡ ３．０ （本発明３） JM101(pOHE100)株 ＳＡＴ １６．０ JM101(pOHK100)株 ＯＡＳＬ ３．７ ０．４５ JM101(pAK222LL) 株 ＰＴＡ ３．０ （対照２） JM101(pOHE100T) 株 ＳＡＴ^I ０．１６ JM101(pOHK100)株 ＯＡＳＬ ３．７ ０．２６ （対照３） JM101(pOHE100)株 ＳＡＴ １６．０ JM101(pOHK100)株 ＯＡＳＬ ３．７ ０．１５ ─────────────────────────────────── 注１）ＳＡＴ^I ：Ｌ−システインによるフィードバック阻害を受けにくくなった 酵素

【０１１３】表２から、本発明の方法による場合、Ｌ−
含硫アミノ酸の生産量が対照のものに比べて、高いこと
がわかる。即ち、ＰＴＡを添加してアセチルＣｏＡ再生
系を強化すると、Ｌ−含硫アミノ酸の生産量が増加して
いる。また、ＳＡＴ活性がＬ−システインによるフィー
ドバック阻害を受けにくくなったものでは、その生産量
がより顕著に増加しており（本発明３）、反応液に添加
するＳＡＴの量も本発明２の約１／１００でよいことが
わかる。

【０１１４】〔実施例４〕大腸菌1100 (λEN501S-CYS)
株、および1100 (λEN1121S-PTA)株を実施例２と同様に
各々培養した。更に、各々の菌体について、実施例２と
同様にして粗酵素液を調製した。各粗酵素液を、表３に
示す活性になるように添加する以外は、実施例２と同様
にＬ−含硫アミノ酸の生成反応を行った。そして、Ｌ−
含硫アミノ酸の生産量を測定し、結果を表３に示した。

【０１１５】

【表３】 ─────────────────────────────────── 菌株 添加した 添加した酵素 Ｌ−含硫アミノ酸 酵素の種類 活性（Ｕ） 生産量(mM/30min.) ─────────────────────────────────── （本発明４） 1100 (λEN501S-CYS) 株 ＳＡＴ^I ０．１６ ＯＡＳＬ ３．７ ０．８８ 1100 (λEN1121S-PTA)株 ＰＴＡ ３．０ （対照４） 1100 (λEN501S-CYS) 株 ＳＡＴ^I ０．１６ ＯＡＳＬ ３．７ ０．３０ ─────────────────────────────────── 注１）ＳＡＴ^I ：Ｌ−システインによるフィードバック阻害を受けにくくなった 酵素

【０１１６】表３から、本発明の方法による場合、Ｌ−
含硫アミノ酸の生産量が対照のものに比べて、高いこと
がわかる。即ち、ＰＴＡを添加してアセチルＣｏＡ再生
系を強化すると、Ｌ−含硫アミノ酸の生産量が増加して
いる。

【０１１７】

【発明の効果】本発明によれば、ＳＡＴ、ＰＴＡおよび
ＯＡＳＬ生産能に優れた形質転換体を用いることによ
り、Ｌ−セリンからＬ−含硫アミノ酸を簡便に、しかも
従来法と比較して、高収率で製造することができる。し
かも、ＰＴＡとアセチルリン酸との存在下で反応を行う
ことから、大量のアセチルＣｏＡを添加する必要がな
く、Ｌ−含硫アミノ酸を安価に製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐｔａ遺伝子の塩基配列および該塩基配列から
導き出されたＰＴＡのアミノ酸配列を示す図である。

【図２】ｐｔａ遺伝子の塩基配列および該塩基配列から
導き出されたＰＴＡのアミノ酸配列を示す図である（つ
づき）。

【図３】ｐｔａ遺伝子の塩基配列および該塩基配列から
導き出されたＰＴＡのアミノ酸配列を示す図である（つ
づき）。

【図４】ｃｙｓＥ遺伝子の塩基配列を示す図である。

【図５】ｃｙｓＫ遺伝子の塩基配列を示す図である。

【図６】pAK222LL作製の手順を制限酵素地図にて示した
図である。

【図７】pOHE100T作製の手順を制限酵素地図にて示した
図である。

【図８】pOHK100 作製の手順を制限酵素地図にて示した
図である。

【図９】λEN1121S-PTA作製の手順を制限酵素地図にて
示した図である。

【図１０】λEN501S-CYS作製の手順を制限酵素地図にて
示した図である。

【図１１】λ501CYS×PTA 作製の手順を制限酵素地図に
て示した図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成８年７月５日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５０】有機溶剤としては、トルエン、キシレン、
アセトン、脂肪族アルコール、ベンゼンあるいは酢酸エ
チルなどを用いることができる。これらは、通常、反応
液１ml当たり、 0.1〜50μｌ、好ましくは１〜20μｌの
濃度で用いられる。反応温度は、通常10〜60℃、好まし
くは20〜50℃、特に好ましくは36〜48℃であり、ｐＨは
通常５〜９、好ましくは６〜8.5 である。また、反応
は、通常、１〜８０時間で完了する。なお、反応中、反
応液に通気等の操作で酸素を供給することにより、生成
したＬ−システインをＬ−シスチンに変換することがで
きる。また、Ｌ−システインによるＳＡＴ活性のフィー
ドバック阻害を解除することができる。そのために、Ｌ
−含硫アミノ酸の反応収率は高められる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｎ 9/88 15/09 9162−4Ｂ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 13/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 大竹 秀子 千葉県野田市野田339番地 キッコーマン 株式会社内 (72)発明者 中野 衛一 千葉県野田市野田339番地 キッコーマン 株式会社内

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 (A) Ｌ−セリンと、 (B) 硫化物と、 (C) アセチルＣｏＡと、 (D) アセチルリン酸と、 (E) セリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）をコ
   ードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組込んだ組換え体Ｄ
   ＮＡにて形質転換した微生物の菌体および／またはその
   処理物と、 (F) ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）をコードす
   るＤＮＡをベクターＤＮＡに組込んだ組換え体ＤＮＡに
   て形質転換した微生物の菌体および／またはその処理物
   と、 (G) Ｏ−アセチルセリンリアーゼ（ＯＡＳＬ）をコード
   するＤＮＡをベクターＤＮＡに組込んだ組換え体ＤＮＡ
   にて形質転換した微生物の菌体および／またはその処理
   物とを反応させてＬ−含硫アミノ酸を生成させることを
   特徴とする、Ｌ−含硫アミノ酸の製造方法。
2. 【請求項２】 (A) Ｌ−セリンと、 (B) 硫化物と、 (C) アセチルＣｏＡと、 (D) アセチルリン酸と、 (F')少なくともホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）
   をコードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組込んだ組換え
   体ＤＮＡにて形質転換した微生物の菌体および／または
   その処理物と、 (H) セリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）およ
   びＯ−アセチルセリンリアーゼ（ＯＡＳＬ）をそれぞれ
   コードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組込んだ組換え体
   ＤＮＡにて形質転換した微生物の菌体および／またはそ
   の処理物とを反応させてＬ−含硫アミノ酸を生成させる
   ことを特徴とする、Ｌ−含硫アミノ酸の製造方法。
3. 【請求項３】 (A) Ｌ−セリンと、 (B) 硫化物と、 (C) アセチルＣｏＡと、 (D) アセチルリン酸と、 (E')少なくともセリンアセチルトランスフェラーゼ（Ｓ
   ＡＴ）をコードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組込んだ
   組換え体ＤＮＡにて形質転換した微生物の菌体および／
   またはその処理物と、 (I) ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）およびＯ−
   アセチルセリンリアーゼ（ＯＡＳＬ）をそれぞれコード
   するＤＮＡをベクターＤＮＡに組込んだ組換え体ＤＮＡ
   にて形質転換した微生物の菌体および／またはその処理
   物とを反応させてＬ−含硫アミノ酸を生成させることを
   特徴とする、Ｌ−含硫アミノ酸の製造方法。
4. 【請求項４】 (A) Ｌ−セリンと、 (B) 硫化物と、 (C) アセチルＣｏＡと、 (D) アセチルリン酸と、 (G')少なくともＯ−アセチルセリンリアーゼ（ＯＡＳ
   Ｌ）をコードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組込んだ組
   換え体ＤＮＡにて形質転換した微生物の菌体および／ま
   たはその処理物と、 (J) セリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）およ
   びホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）をそれぞれコ
   ードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組込んだ組換え体Ｄ
   ＮＡにて形質転換した微生物の菌体および／またはその
   処理物とを反応させてＬ−含硫アミノ酸を生成させるこ
   とを特徴とする、Ｌ−含硫アミノ酸の製造方法。
5. 【請求項５】 (A) Ｌ−セリンと、 (B) 硫化物と、 (C) アセチルＣｏＡと、 (D) アセチルリン酸と、 (K) セリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）、ホ
   スホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）およびＯ−アセチ
   ルセリンリアーゼ（ＯＡＳＬ）をそれぞれコードするＤ
   ＮＡをベクターＤＮＡに組込んだ組換え体ＤＮＡにて形
   質転換した微生物の菌体および／またはその処理物とを
   反応させてＬ−含硫アミノ酸を生成させることを特徴と
   する、Ｌ−含硫アミノ酸の製造方法。
6. 【請求項６】 セリンアセチルトランスフェラーゼ（Ｓ
   ＡＴ）、ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）および
   Ｏ−アセチルセリンリアーゼ（ＯＡＳＬ）をそれぞれコ
   ードするＤＮＡをベクターＤＮＡに組込んだ組換え体Ｄ
   ＮＡ。
7. 【請求項７】 セリンアセチルトランスフェラーゼ（Ｓ
   ＡＴ）、ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）および
   Ｏ−アセチルセリンリアーゼ（ＯＡＳＬ）をそれぞれコ
   ードするＤＮＡが大腸菌由来のものである請求項６に記
   載の組換え体ＤＮＡ。
8. 【請求項８】 請求項６または７に記載の組換え体ＤＮ
   Ａにて形質転換した微生物。
9. 【請求項９】 微生物が大腸菌である、請求項８に記載
   の微生物。