DE4222407C1 - Modulartiges Promotor-Konstrukt - Google Patents
Modulartiges Promotor-KonstruktInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein modulartiges Promotor-Konstrukt
mit den in
Anspruch 1 wiedergegebenen Merkmalen.
Es bestand schon immer das Bedürfnis, agronomisch wichtige Getreidepflanzen
mit verbesserten Eigenschaften auszustatten.
Früher hat man auf klassischem Wege Erbanlagen bzw. Gene in
die betreffenden Pflanzen eingekreuzt. Seit Etablierung der
Gentechnologie ist es möglich, definierte Gene in das Genom
von Getreidepflanzen, wie beispielsweise Reis, Mais, Weizen
und Gerste, einzuschleusen. Neben der Auswahl des richtigen
selektiven Marker-Gens und der agronomisch wichtigen Gene ist
die Wahl des richtigen Promotors zur effektiven Expression des
gewünschten Gens maßgeblich. Der am meisten verwendete Promotor
zur Erhöhung der Expression von chimären Genen in monoklotyledonen
Getreidepflanzen stammt aus dem Cauliflower Mosaic
Virus (CaMV) 35S RNA-Gen (Odell et al., Nature 313, Seiten 810
bis 820, 1985). Dieser Promotor ist jedoch im Vergleich zu dikotyledonen
Pflanzen relativ wenig aktiv in monokotyledonen
Pflanzen (Töpfer et al., Meth. Enzymol., "Rec. DNA", im
Druck). so sind alternative Genexpressionsvektoren unter Verwendung
starker Promotoren, wie die Promotoren des Aktin 1-
Gens aus Reis (Mc Elroy et al., Plant Cell 2, Seiten 163 bis
171, 1990) und des Ubiquitin-Gens aus Mais (Christensen and
Fox, International Society für Plant Molecular Biology Meeting,
Program Abstracts, No. 287, 1991) beschrieben worden.
In Analogie zu tierischen Systemen (Dynan, Cell 58, Seiten 1
bis 4, 1989) ist es ebenfalls für Pflanzengene wahrscheinlich,
daß die durch die RNA-Polymerase II vermittelte Transkription
von modulartigen, d. h. aus verschiedenen regulierenden DNA-Sequenzen
bestehenden Elementen abhängt. Es ist bereits für eine
Anzahl von verschiedenen modulartigen Elementen gezeigt worden,
daß sie eine wichtige Rolle bei z. B. der gewebespezifischen
Transkription spielen (Katagiri und Chua, trends Gent.
8, Seiten 22 bis 70, 1992).
So ist aus der DE-OS 41 24 537 eine modulartige Promotor-Konstruktion
bekannt, mit der die Genexpression fremder Gene in
Pflanzenzellen gesteigert werden kann. Dabie wird eine DNA-Sequenz
aus dem Exon 1 des Saccharosesynthase-Gens aus Zea mays
L. zwischen Promotor und das zu exprimierende Gen eingesetzt.
Eine weitere multiplikative Steigerung der Genexpression ist
möglich, wenn an die genannte DNA-Sequenz eine weitere DNA-Sequenz
gekoppelt wird, die im wesentlichen dem Intron 1 aus dem
Sacccharosesynthase-Gen aus Zea mays L. entspricht.
Die Isolierung von in der 5′-Region liegenden Promotorsequenzen
des Aktin 1-Gens aus Reis ist von Mc Elroy et al., a.a.O.,
beschrieben worden. Es hat sich herausgestellt, daß eine positive
Korrelation zwischen den Promotorsequenzen und den nachfolgenden
Intronsequenzen besteht. So hat sich ein Promotor-
Konstrukt aus diesen Sequenzen bei Transformationsuntersuchungen
von Reis-Protoplasten als wirksamer Regulator der konstitutiven
Expression eines fremden Gens erwiesen.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen
Promotor zur Verfügung zu stellen, mit dem man fremde Gene in
Pflanzen mit hoher Effizienz exprimieren kann.
Diese Aufgabe wird durch ein modulartiges Promotor-Konstrukt
gemäß Patentanspruch 1 gelöst.
Die Unteransprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen des
Promotor-Konstrukts nach Anspruch 1.
Die Erfindung betrifft somit ein modulartiges Promotor-Konstrukt,
das einen in Pflanzenzellen wirksamen Promotor und
eine DNA-Sequenz aus dem Exon 1 des Aktin 1-Gens aus Reis aufweist
und die Allele sowie Derivate dieses modulartigen Promotor-
Konstrukts.
Die Erfindung betrifft weiterhin Vektoren, die die erfindungsgemäßen
Promotor-Konstrukte enthalten.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzenzellen, die mit den
genannten Vektoren transformiert sind.
Die Erfindung betrifft außerdem Pflanzen und deren Vermehrungsgut,
die aus den genannten Pflanzenzellen regeneriert
sind.
Schließlich betrifft die Erfindung auch die Verwendung der erfindungsgemäßen
Promotor-Konstrukte zur Herstellung von Pflanzen
mit erhöhter Genexpression.
Die Figuren dienen zur Erläuterung des beanspruchten Gegenstandes. Es zeigt
Fig. 1 chimäre Genkonstrukte für transiente Genexpressionsexperimente,
Fig. 2 eine schematische Darstellung des Aktin 1 (Akt
1)-Gens aus Reis mit der verwendeten Exon 1-
DNA-Sequenz,
Fig. 3 ein Dünnschichtchromatogramm der transienten
Expresion von chimären Konstrukten in Hordeum
vulgare Protoplasten,
Fig. 4 ein Dünnschichtchromatogramm der transienten
Expression von chimären Konstrukten in Triticum
monococcum Protoplasten und
Fig. 5 ein Dünnschichtchromatogramm einer weiteren
transienten Genexpression in Hordeum vulgare
Protoplasten.
Bei dem erfindungsgemäßen Promotor-Konstrukt handelt es sich
um einen die RNA-Polymerase II stimulierenden Promotor. Das
erfindungsgemäße modulartige Promotor-Konstrukt weist einen in
Pflanzenzellen wirksamen Promotor und eine daran gekoppelte
regulatorische DNA-Sequenz auf. Diese DNA-Sequenz stammt aus
dem Exon 1 des Aktin 1-Gens (Akt1-Exon1-Sequenz) aus Reis. Die
im Promotor-Konstrukt enthaltene DNA-Sequenz entspricht vorzugsweise
der Sequenz von der Position +4 bis +57 im Exon 1
des Aktin 1-Gens, wie aus Fig. 2 zu entnehmen ist. Das
untranslatierte Exon 1 ist vom Startpunkt der Translation in
Exon 2 durch ein Intron (Intron 1) getrennt. Das Exon 1 liegt
somit in der 5′-transkribierten, jedoch untranslatierten
Region des Aktin 1-Gens. die gesamte Sequenz des Exon 1 des
genannten Gens ist bei Mc Elroy et al., (a.a.o.) beschrieben.
Die Akt1-Exon1-Sequenz ist GC-reich (77%) und wirkt als die
RNA-Polymerase II stimulierendes Element, wenn es sich in
downstream-Richtung der Transkrioptionsstartstelle befindet.
Es wurde gefunden, daß, wenn das erfindungsgemäße modulartige
Promotor-Konstrukt an ein in einer Pflanzenzelle zu exprimierendes
Gen gekoppelt ist, die Expression dieses Gens erheblich
gesteigert wird, wobei eine mindestens 10fache Steigerung der
Genexpression festgestellt werden konnte.
Die Genexpression kann weiterhin um das 100fache erhöht werden,
wenn die Akt1-Exon1-Sequenz mit dem Intron 1 des Saccharosesynthase-
Gens aus Zea mays kombiniert wird, was überraschenderweise
zu einer Erhöhung der Genexpression auf bis mindestens
das 1000fache führt.
Es hat sich herausgestellt, daß die 18 bp OTP-Bindungsstelle
des Promotors der Octopinsynthase (OCS-Enhancer) beispielsweise
mit dem CaMV 35S-Promotor kompatibel ist. Wenn man
die OTF-Bindungsstelle mit der Akt1-Exon1-Sequenz und dem Intron
1 aus dem Saccharosesynthase-Gen aus Zea mays L. kombiniert,
erhält man eine sprunghafte Steigerung der Genaktivität
um mindestens das 4000fache.
Aus dem Vorstehenden ergibt sich, daß sich die Genexpression
in Abhängigkeit von der mit dem zu exprimierenden Gen
gekoppelten regulativen DNA-Sequenz multipliziert. Somit kann
mit dem erfindungsgemäßen modulartigen Promotor-Konstrukt eine
Multiplikation der Genaktivität erreicht werden.
Die erfindungsgemäßen modulartigen Promotor-Konstrukte sowie
die Vektoren enthalten als einen in Pflanzenzellen wirksamen Promotor,
wie beispielsweise den CaMV 35S-Promotor, den
Nopalinsynthase-Promotor oder den Saccharosesynthase-Promotor.
Das erfindungsgemäße modulartige Promotor-Konstrukt eignet
sich für die Expression aller Arten von Fremdgenen, wie beispielsweise
Resistenzgenen, wie sie z. B. aus der EP-A 02 57 542
und der EP-A 02 75 957 bekannt sind, wie auch zur
Herstellung von proteinogenen Wirkstoffen in Pflanzen
beispielsweise nach DD-A 12 65 164. Von besonderer Bedeutung
sind Gene für Speicherproteine, wie z. B. Zeine oder Hordeine.
In downstream-Richtung an das zu exprimierende Gen enthalten
die erfindungsgemäßen modulartigen Promotor-Konstrukte sowie
die Vektoren, die die erfindungsgemäßen Promotor-Konstrukte
enthalten, Polyadenylierungsregionen aus dem CaMV 35S- oder
Octopinsynthase (OCS)-Gen (Hein et al., Mol. Gen. Genet, 199,
Seiten 161 bis 168 (1985).
Das erfindungsgemäße modulartige Promotor-Konstrukt eignet
sich zur Expression fremder Gene in monokotyledonen und dikotyledonen
Pflanzen. Als monokotyledone Pflanzen kommen beispielsweise
Getreidepflanzen, wie Weisen, Gerste, Mais und
Reis in Frage.Als dikotyledone Pflanze läßt sich z. B. Tabak
(Nicotiana tabaccum) in zufriedenstellender Weise transformieren.
Es ist selbstverständlich, daß im Rahmen der Erfindung auch
allelische Varianten und Derivate des oben genannten modulartigen
Promotor-Konstrukts erfaßt sind, unter der Voraussetzung,
daß diese modifizierten modulartigen Promotor-Konstrukte
die gleiche Funktion wie die oben genannten Promotor-Konstrukte
ausüben, d. h. stimulierend auf die Genexpression wirken.
Zu den allelischen Variationen und Derivaten zählen beispielsweise
Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen
oder Additionen der einzelnen Sequenzen des erfindungsgemäßen
Promotor-Konstrukts.
Die Transformation von Pflanzen mit einem fremden Gen unter
Verwendung des erfindungsgemäßen modulartigen Promotor-Konstrukts
kann mit Hilfe üblicher Transformationsverfahren
durchgeführt werden. Besonders bevorzugt ist die Protoplastentransformation
mit anschließender Regeneration der aus den
transformierten Protoplasten entstandenen Pflanzenzellen zu
einer Pflanze.
In den nachfolgenden Beispielen werden besonders bevorzugte
Ausführungsformen des erfindungsgemäßen modulartigen Promotor-
Konstrukts beschrieben.
Die nachfolgend beschriebenen Plasmidkonstruktionen lassen
sich der Fig. 1 entnehmen. Die dort gezeigten chimären Genkonstruktionen
wurden für transiente Genexpressionsexperimente
verwendet. Die Startstelle der Transkription und das Polyadenylierungssignal
des CaMV 35S-Gens sind in allen Konstruktionen
gleich. Die für das Klonieren relevanten Restriktionsstellen
sind zusätzlich eingeführt worden. Der Polylinker
(P) zwischen dem Transkriptions- und translationsstart umfaßt
vom 5′- zum 3′-Ende die Restriktionsstellen X, D, EI und K.
Die Restriktionsstellen werden folgendermaßen abgekürzt: Bcl I
(B), EcoRI (EI), EcoRV, (EV), Hind III (H), Hinc II (A), Kpn I
(K), Sma I (S), Sst II (C), Xho I (X). Der CaMV 35S-Promotor ist
mit "enahncer core" und die OTF-Bindungsstelle mit "OCS" gekennzeichnet.
Sämtliche Plasmidkonstruktionen wurden nach üblichen Verfahren,
wie sie beispielsweise bei Sambrook et al, Molecular cloning:
A laboratory manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, beschrieben
sind, hergestellt.
Alle Plasmidkonstruktionen leiten sich vom chimären Plasmid
pRT 101 CAT ab (Pröls et al., Plant Cell. Rep. 7, Seiten 221
bis 224, 1988), welches das CAT-Markergen (CAT=Chloramphenicol-
Transacetylase) enthält. Zur Herstellung des chimären
Plasmids pCM 1106 wurde die nicht-translatierte Sequenz des
Exon 1 des Aktin 1-Gens (Akt1-Exon1-Sequenz) von der Position
+4 bis +57 in die einzige SmaI-Restriktionsstelle (S) im 5′-
nicht translatierten Leader des pRT 101 CAT-Plasmids eingefügt.
Hierzu sei auf die Fig. 2 verwiesen, woraus die verwendete
Sequenz aus dem Exon 1 und ihre Position innerhalb des
Exon 1 zu entnehmen ist. Bei Einführung der genannten DNA-Sequenz
stellt man die Sma I-Restiktionsstelle durch 3[-terminale
Cystosinreste des Aktin 1-Elements wieder her (siehe auch
Fig. 2, Positon +55 bis +57).
Man isoliert die Intron 1-Sequenzen aus dem Saccharosesynthase-
Gen (Sh1) aus Mais (Position +43 bis +1084) aus dem aus
der DE-OS 41 24 537 bekannten chimären Plasmid pSP 1076+1084
als Hinc II-Restriktionsfragment und fügt es in die Sma I-Restriktionsstelle
von pCM 1106. Auf diese Weise erhält man die
chimäre Plasmidkonstruktion pCM 1111.
Man synthetisiert mit einem DNA-Synthesizer (Applied Biosystem
380 B) die in Fig. 2 gezeigte Sequenz aus dem Exon 1 des Aktin
1-Gens aus Reis und die 18 bp OTP-Bindungsstelle mit der Sequenz
AACGTAAGCGCTTACGTT (Ellis et al., EMBO J. 6, Seiten 3203
bis 3208, 1987). Man subkloniert dann die OTF-Bindungsstelle
in die einzige Sma I-Restriktionsstelle des handelsüblichen
Plasmids pUC 19 und erhält pOTF 18. Für die Herstellung der
chimären Plasmide pCM 1112 und pCM 2107 isoliert man aus pCM
1111 und pCM 2106 ein Hinc II (A)/Hind III (H)-Restriktionsfragment
(Hind III ist ein partieller Verdau von pCM 1111) und fügt
es in die einzige Hinc II-Restriktionsstelle von pOTF 18 ein.
Für die Herstellung des Plasmids pCM 1107 entfernt man den Polylinker
des chimären Plasmids pCM 1106 durch eine Restriktionsverdauung
mit Xho I (X)/Kpn I (K). Man entfernt die überstehenden
Enden mit einer vorsichtigen S1-Behandlung. Die Autolegierung
führt zu dem Plasmidkonstrukt pCM 1107, welches im
Vergleich zu pCM 1106 eine Deletion von 11 Basenpaaren zwischen
der Stelle des Transkrioptionsstartes und der Akt1-Exon1-
Sequenz aufweist.
Das Promotordeletionsplasmid pCM 2106 wird hergestellt, indem
CaMV 35S-Promotorsequenzen von pCM 1106 in upstream-Richtung
der EcoRV (EV)-Restriktionsstelle bei Position -90 entfernt
werden.
Man führt nach der für Mais beschriebenen Methode (Maas und
Werr, Plant Cell. Rep. 8, Seiten 148 bis 151, 1989) eine Protoplastenisolation
aus einer Zellsuspension der Gerstenlinie
Hordeum vulgare L. cv. Golden Promise mit der Maßgabe durch,
daß man eine Osmolarität von 720 mosm verwendet. Die Aufzucht
einer Zellsuspension der Linie Triticum monococcum (Einkorn)
und Protoplastenisolation wurde wie im wesentlichen durch Lörz
et al., Mol. Gen. Genet. 199, Seiten 178 bis 182, 1985 und
Matzeit et al., Plant Cell 3, Seiten 247 bis 258, 1991)
beschrieben, durchgeführt.
Die Transformation der Hordeum vulgare und Triticum monococcum
Protoplasten wurde wie bei Maas und Werr a.a.o. und Maas et
al., a.a.O., beschrieben durchgeführt. Man transformiert etwa
1×10⁶ Protoplasten mit 25 µg Plasmid-DNA und 100 µg sonifizierter
Kalbsthymus-DNA und fügt einen durch PEG vermittelten
Gentransfer durch (PEG-Lösung: 25% PEG (1500), 0,1
M MgCl₂, pH 6,0). Man untersucht die Genexpression anhand des
Gehalts an gebildetem Protein 15 bis 19 Stunden nach der
Transformation.
Man zentrifugiert die transformierten Zellen für die CAT-Aktivitätsbestimmung,
resuspendiert in 60 µl 500 mM Tris/HCl bei
einem pH-Wert von 7,5 (2 mM PMSF) und lysiert in zwei Zyklen
unter Frieren und Tauen. Man klärt den Extrakt durch Zentrifugieren
auf. Man verwendet 20 µl des Überstandes zur Proteinbestimmung
gemäß Bradford, Anal. Biochem. 72, Seiten 248 bis
254, 1976. Die CAT-Aktivitätsbestimmung wird, wie im wesentlichen
durch Gorman et al., Mol. Cell. Biol. 2, Seiten 1044 bis
1051, 1982 beschrieben, über Dünnschichtchromatographie durchgeführt.
Die Extrakte wurden während 10 Minuten bei 65°C
vorinkubiert, wobei 250 µg BSA in die Reaktionsmischung hinzugefügt
wurde.
Für jedes Plasmidkonstrukt wurde parallel zwei Transformationen
durchgeführt. Man kultiviert die behandelten Protoplasten
und vereinigt sie, um die Unterschiede durch die verschiedenen
Transformationsleistungen herabzusetzen. Man analysiert
eine Hälfte (1×10⁶ Protoplasten) dieser Mischung auf
CAT-Aktivität. Aufgrund der hohen CAT-Aktivitäten in unverdünnten
Extrakten stellt man serienmäßig 1 : 10-Verdünnungen
(1 : 10, 1 : 100, 1 : 1000) her, um somit lineare CAT-Aktivitäten
für die densitometrische Untersuchung der Autoradiographien zu
erhalten.
Die Untersuchungen der Genexpression in Hordeum vulgare Protoplasten
mit den in Beispiel 1 beschriebenen chimären Plasmiden
hat zu folgenden Ergebnissen geführt.
Die Ergebnisse der relativen CAT-Aktivitäten lassen sich dem
Dünnschichtchromatogramm der Fig. 3 entnehmen. Aufgrund der
hohen CAT-Aktivitäten im Rohextrakt wurde die Aktivität einer
1 : 100-Verdünnung mit 1×10⁴ Protoplasten gemessen. Die Abkürzungen
haben folgende Bedeutungen: CAT=Chloramphenicol-
Transacetylase; Cm=C¹⁴-markiertes Chloramphenicol allein;
Cont=Proteinextrakte von nicht transformierten Kontrollprotoplasten
und 1, 3, 1,3 Cm=an den angegebenen Positionen
acetyliertes Chloramphenicol.
Es ergibt sich beim chimären Plasmid pCM 1106 im Vergleich zum
Referenzplasmid pRT 101 CAT eine bis zu mindestens 10fache
Erhöhung der Markergenexpression.
Am chimären Plasmid pCM 1111 ist zu erkennen, daß, wenn die
Akt1-Exon1-Sequenz mit den Intron 1-Sequenzen aus dem
Saccharosesynthase-Gen kombiniert wird, die Markergenexpression
auf das mindestens 1000fache erhöht wird.
Die 18 bp OTF-Bindungsstelle des Octopinsynthase-Promotors mit
dem gesamten CaMV 35S-Promotor kann mit der Akt1-Exon1-Sequenz
sowie dem Intron 1 aus dem Saccharosesynthase-Gen interagieren.
Die Einführung der OTF-Bindungsstelle in das chimäre
Plasmid pCM 1111, welches die Akt1-Exon1-Sequenz und Sequenzen
aus dem Intron 1 des Saccharosesynthase-Gen enthält, führt zu
einer weiteren mindestens 3- bis 4fachen Erhöhung des Stimulationsverhältnisses
(siehe pCM 1112). Dieses Ergebnis erhält
man auch mit einer 1 : 1000fachen Verdünnung (nicht gezeigt).
Somit ist eindeutig belegt, daß die stimulierende Wirkung der
Kombination aus verschiedenen individuellen DNA-Sequenzen multiplikativ
und nicht additiv ist.
In diesem Zusammenhang wird auf die nachfolgende Tabelle 1
verwiesen, worin die CAT-Aktivitäten aus Fig. 3 der chimären
Plasmide pCM 1106, pCM 1111 und pCM 1112 in Relation zum Referenzplasmid
pRT 101 CAT (Aktivität=1) in Hordeum vulgare
Protoplasten aufgeführt sind.
Die Untersuchungen der Genexpression in Triticum monococcum
Protoplasten mit den in Beispiel 1 beschriebenen chimären
Plasmiden hat zu folgenden Ergebnissen geführt.
Wie sich aus Fig. 4 entnehmen läßt, erreicht man mit
transformierten Triticum monococcum Protoplasten gleiche Stimulationsverhältnisse
der Genexpression wie mit Hordeum vulgare
Protoplasten. So führt die Einführung der Akt1-Exon1-Sequenz
zu einer mindestens 10fachen Erhöhung der Markergenexpression
(pCM1106). Die Kombination der Akt1-Exon1-
Sequenz mit den Intron 1-Sequenzen des Saccharosesynthase-Gens
ergeben eine mindestens 1000fache Erhöhung der Genexpression.
In diesem Zusammenhang wird auf die nachfolgende Tabelle 2
verwiesen, worin die CAT-Aktivitäten der chimären Plasmide pCM
1106 und pCM 1111 der Fig. 4 in Relation zum chimären Referenzplasmid pRT 101 CAT (Aktivität=1) verglichen werden.
Das Dünnschichtchromatogramm in Fig. 5 zeigt, daß die Akt1-
Exon1-Sequenz nicht ohne regulatorische Sequenzen in upstream-
Richtung zu einer Erhöhung der Genexpression führt. Die Akt1-
Exon1-Sequenz erhöht die Markergenexpression bis auf das mindestens
10fache, wenn sie in downstream-Richtung des gesamten
CaMV 35S-Promotors eingefügt ist (pCM 1106). Dagegen hebt die
Deletion des CaMV 35S-Promotor im chimären Plasmid pCM 1106
(pCM 2106, Fig. 1) das Stimulationsvermögen der Akt1-Exon1-Sequenz
völlig auf.
Da die Akt1-Exon1-Sequenz die Anwesenheit von regulatorischen
Elementen in upstream-Richtung zur effektiven Markergenexpression
benötigt, kann die Aktivität des chimären Plasmids pCM
2106 durch Einfügung von regulatorischen Elementen in upstream-
Richtung wieder hergestellt werden. So wurde die 18 bp
OTF-Bindungsstelle als regulatorische Sequenz in upstream-
Richtung des CaMV 35S-Promotors des chimären Plasmids pCM 2106
unter Bildung des chimären Plasmids pCM 2107 eingefügt (siehe
auch Fig. 1). Die transiente Genexpression des chimären Plasmids
pCM 2107 zeigt, daß die Akt1-Exon1-Sequenz im nicht stimulierenden
chimären Plasmid pCM 2106 wieder ihre mindestens
10fache stimulierende Wirkung entfaltet, wenn das Plasmid die
OTF-Bindungsstelle enthält.
Am Beispiel der chimären Plasmide pCM 1106 und pCM 1107 ist zu
erkennen, daß die Entfernung zur Transkriptionsstartstelle des
heterologen Promotors ebenfalls sehr wichtig ist. Die Deletion
von 11 Basenpaaren im Polylinker von pCM 1106, die sich zwischen
der Transkriptionsstartstelle und den Akt1-Exon1-Sequenzen
befinden, heben die stimulatorische Wirkung des Promotorkonstrukts
auf (pCM 1107). Demnach sollte die Entfernung zwischen
Transkriptionsstartstelle und Akt1-Exon1-Sequenz bevorzugt
mindestens 11 bp betragen.
Die relativen Werte der Erhöhung der Genexpression anhand der
in Fig. 5 gezeigten chimären Plasmiden sind aus der nachfolgenden
Tabelle 3 zu entnehmen. In dieser Tabelle werden die
CAT-Aktivitäten der chimären Plasmide pCM 1106, pCM 1107, pCM
2106 und pCM 2107 in Relation zum chimären Referenzplasmid pRT
101 CAT (Aktivität=1) in Hordeum vulgare Protoplasten
verglichen.
Bei dem erfindungsgemäßen modulartigen Promotor-Konstrukt handelt
es sich somit um einen ggf. aus einzelnen regulativen
DNA-Sequenzen aufgebauten effektiven Promotor, mit dem es möglich
ist, die Genexpression fremder Gene in Planzenzellen auf
das bis zu mindestens 4000fache zu erhöhen. Eine zentrale
Rolle spielt eine DNA-Sequenz aus dem 5′-nicht translatierten
Bereich des Exon 1 des Aktin 1-Gens aus Reis. Diese Sequenz
ist ein die RNA Polymerase II stimulierendes cis-Element, das
sich in downstream-Richtung der Transkriptionsstartstelle
befinden muß und nur in Gegenwart von regulatorischen DNA-
Sequenzen in upstream-Richtung seine stimulierende Wirkung auf
die Genexpression entfaltet.
Claims (8)
1. Modulartiges Promotor-Konstrukt, das einen in Pflanzenzellen
wirksamen Promotor und eine DNA-Sequenz aus dem Exon
1 des Aktin 1-Gens aus Reis aufweist und die Allele sowie Derivate
dieses modulartigen Promotor-Konstrukts.
2. Promotor-Konstrukt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die DNA-Sequenz der Position +4 bis +57 im Exon 1 des
Aktin 1-Gens entspricht.
3. Promotor-Konstrukt nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß es weiterhin eine DNA-Sequenz aus dem Intron
1 des Saccharosesynthase-Gens von Mais enthält.
4. Promotor-Konstrukt nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß es zusätzlich eine 18 bp OTP-Bindungsstelle enthält.
5. Vektor, enthaltend ein Promotor-Konstrukt nach einem der
Ansprüche 1 bis 4, das an ein in einer Pflanzenzelle zu exprimierendes
Gen gekoppelt ist.
6. Pflanzenzelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 5
transformiert ist.
7. Pflanze und deren Vermehrungsgut, regeneriert aus einer
Pflanzenzelle nach Anspruch 6.
8. Verwendung des Promotor-Konstrukt nach den Ansprüchen 1
bis 4, zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhter Genexpression.
Priority Applications (11)
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