JPH07508653A - モジュール・プロモーター構築物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 モジュール・プロモーター構築物 本発明は、米からのアクチン１遺伝子（ａｃｔｉｎ　１　ｇｅｎｅ）のエクソン ｌに基くモジュール・プロモーター構築物（ＩＩｏｄｕｌａｒ　ｐｒｏｍｏｔｅ ｒ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）に関する。

農業経済学的に重要な穀物植物に改良特性を提供する必要性が常に存在する。

従来は、遺伝的特性又は遺伝子が古典的方法を使用して関連植物に交配された。

組換えＤＮＡ技術が確立されたので、穀物植物、例えば、例えば、米、メイズ、 小麦及び大麦のゲノム中に所定の遺伝子を挿入することが可能である。適当な選 択マーカー遺伝子及び農業経済学的に重要な遺伝子を選択することに加え、適当 なプロモーターを選ぶことも所望の遺伝子を効率的に発現するために決定的に重 要である。単子葉穀物植物におけるキメラ遺伝子の発現を増加させるために最も 使用されるプロモーターは、カリフラワー・モザイク・ウィルス（ＣＬＭＶ）の ３５Ｓ　ＲＮＡ遺伝子から得られる（Ｏｄｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒ ｅ　３１３．８１０〜８２０頁、　１９８５）、しかしながら、双子葉植物にお けるその活性に比較して、このプロモーターは、単子葉植物においてあまり活性 でない（Ｔｏｅｐｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　 ”Ｒｅｃ、　ＤＮＡ”。

ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）。これ故、強いプロモーター、例えば、米からのアクチンｌ 遺伝子（ＭｃＥＩｒｏｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　２．１６３ 〜１７１頁、　１９９０）及びメイズからのユビキチン遺伝子（Ｃｈｒｉｓｔｅ ｎｓｅｎ　ａｎｄ　Ｆｏｘ、　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ　 ｆｏｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅモ浮撃≠■ Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｍｅｅｔｉｎｇ、　Ｐｒｏｇｒａｍ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ、　 Ｎｏ、　２８７．１９９１）のプロモーターを使用した他の遺伝子発現ベクター がある。

動物系との類似において（Ｄｙｎａｎ、　Ｃｅ１１５８．１〜４頁、　１９８９ ）　、おそらく、植物遺伝子の場合においても、ＲＮＡポリメラーゼ■１により 仲介される転写は、モジュール要素、すなわち、様々な調節ＤＮＡ配列から成る 要素に依存する。多数の異なるモジュール要素が、例えば、組織特異的転写にお いて重要な役割を演じていることは、既に証明されている（Ｋａｔａｇｉｒｉ　 ａｎｄ　Ｃｈｕａ、　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｔ、　８．２２〜７０頁。

１９９２）。

従って、ＤＢ−Ｏ３４１２４５３７は、植物細胞内での外来遺伝子の発現を増加 させるために使用されることができるモジュール・プロモーター構築物について 開示している。この場合には、Ｚｅａ　ｌｌ１ａｙｓ　Ｌ、からのシュクロース ・シンターゼ遺伝子のエクソン１からのＤＮＡ配列がそのプロモーターと発現さ れるべき遺伝子との間に挿入される。Ｚｅａ　ＩＩＩａｙｓ　Ｌ、からのシュク ロース・シンターゼ遺伝子のイントロンＩに本質的に一致する追加のＤＮＡ配列 がそのＤＮＡ遺伝子にカップリングされる（ｃｏａｐｌｅｄ）場合には、遺伝子 発現におけるさらなる倍数的増加が可能である。

ＭｃＥｌｒｏｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｏｃ、　ｃｉｔ、、は、その５°領域内に 在る米アクチンｌ遺伝子のプロモーター配列の単離について記載している。それ は、プロモーター配列とその後のイントロン配列との間の陽性相関が存在するこ とを明らかにした。従って、米プロトプラストの形質転換の調査において、これ らの配列のプロモーター構築物が外来遺伝子の構成的発現の有効なレギュレータ ーであることが証明された。

本発明の重要な目的は、高程度の効率をもって植物内で外来遺伝子を発現させる ために使用されることができるプロモーターを入手可能にすることである。

この目的は、特許請求の範囲ｌに記載のモジュール・プロモーター構築物により 達成される。

サブクレームは、新規プロモーター構築物の好ましい態様に関する。

本発明は、植物細胞内で活性なプロモーター及び米アクチンｌ遺伝子のエクソン ｌからのＤＮＡ配列をもつモジュール・プロモーター構築物に、そしてこのモジ ュール・プロモーター構築物の対立遺伝子及び誘導体に関する。

本発明は、さらに、上記新規プロモーター構築物を含むベクターに関する。

本発明は、上記ベクターにより形質転換された植物細胞にも関する。

本発明は、さらに、植物、及び上記植物細胞から再生されたそれらの子孫に関す る。

最後に、本発明は、高められた遺伝子発現をもつ植物を生産するために上記新規 プロモーター構築物を使用することにも関する。

図面は、本発明を明瞭にするのに役立つ：図１は、過渡的遺伝子発現実験のため のキメラ遺伝子構築物を示し、図２は、使用されたエクソンＩ　ＤＮＡ配列を含 む米アクチン１（ａｃｔｌ）遺伝子の略図であり、 図３は、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ）プロトプラスト内のキメ ラ構築物の過渡的発現の薄層クロマトグラムを示し、 図４は、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ）プロトプラスト内 のキメラ構築物の過渡的発現の薄層クロマトグラムを示し、そして図５は、オオ ムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ）プロトプラスト内のさらなる過渡的遺 伝子発現の薄層クロマトグラムを示す。

本新規プロモーター構築物は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩを刺激するプロモーター である。本新規調節プロモーター構築物は、植物細胞内で活性であるプロモータ ー及びこのプロモーターにカップリングした調節ＤＮＡ配列を有する。このＤＮ Ａ配列は、米からのアクチンｌ遺伝子（ａｃｔｌ／ｅｘｏｎｌ配列）のエクソン ｌから得られる。

上記プロモーター構築物内に含まれるＤＮＡ配列は、好ましくは、図２中に示す ように、上記アクチンｌ遺伝子のエクソンｌ内の＋４位から＋５７位までの配列 に一致する。未翻訳エクソンｌは、イントロン（ｉｎｔｒｏｎ　１）によりエク ソン２内の翻訳開始点から分割される。これ故、エクソンｌは、転写されるが翻 訳されないアクチンｌ遺伝子の５°領域内に位置する。上記遺伝子のエクソン１ の全体配列が、ＭｃＥＩｒｏｙ　ｅｔ　ａｌ、、（ｌｏｃ、　ｃｉｔ、）中に与 えられる。

ａｃｔｌ／ｅｘｏｎｌ配列は、ＧＣ−リッチ（７７％）であり、そしてそれがそ の転写開始部位の下流に位置するとき、ＲＮＡポリメラーゼ１■−刺激要素とし て作用する。

新規のモジュール・プロモーター構築物が植物細胞内で発現されるべき遺伝子に カップリングするとき、この遺伝子の発現がその後実質的に増加され、その遺伝 子の発現において少なくとも１０倍の増加を観察することができるということが 、見つかった。

この遺伝子の発現は、ａｃｔｌ／ｅｘｏｎｌ配列がＺｅａ　ｍａｙｓシュクロー ス・シンターゼ遺伝子のイントロンｌと組み合わされる場合に、さらに１００倍 高められることができ、これは驚くべきことに、その遺伝子の発現において少な くとも１０００倍の増加をもたらす。

オクトピン・シンターゼ・プロモーター（ＯＣＳエンハンサ−）の１８塩基対の ＯＴＦ結合部位が、例えば、ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターに匹敵することが明 らかにされている。このＯＴＦ結合部位がａｃｔｌ／ｅｘｏｎｌ配列及びＺｅａ 　ｍａｙｓシュクロース・シンターゼ遺伝子のイントロンｌと組み合わされる場 合、その遺伝子の活性は、少なくとも４０００の係数により急激に増加する。

遺伝子発現が、発現されるべき遺伝子にカップリングした調節ＤＮＡ配列に依存 して増幅されることができることが、上記からの明らかである。従って、新規の モジュール・プロモーター構築物は、遺伝子活性における倍数的増加を達成する ために使用されることができる。

新規のモジュール・プロモーター構築物、及びベクターは、植物内で活性である プロモーターとして、例えば、例えば、ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーター、ツバリ ン・シンターゼ・プロモーター又はシュクロース・シンターゼ・プロモーターを 含む。

新規のモジュール・プロモーター構築物は、全タイプの外来遺伝子、例えば、Ｅ Ｐ−Ａ　Ｏ２５７５４２及びＥＰ−Ａ　Ｏ２７５９５７中に記載されているよう な、例えば、耐性遺伝子を発現させるために、そしてまた、例えば、ＤＤ−Ａ　 １２６５１６４に従って植物内でタンパク質生成（ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｏｕ ｓ）活性化合物を生産するために、好適である。

保存タンパク質、例えば、ゼイン（ｚｅｉｎｓ）又はホルデイン（ｈｏｒｄｅｉ ｎｓ）のための遺伝子は特に重要である。

発現されるべき遺伝子の下流に、新規モジュール・プロモーター構築物、及びこ の新規モジュール・プロモーター構築物を含むベクターは、Ｃａ１Ｊｖ３５Ｓ遺 伝子又はオクトビン（ｏｃｔｏｐｉｎｅ）シンターゼ（ＯＣ３）遺伝子からのポ リアゾニレ−ジョン領域を含む（Ｈｅｉｎ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ 、　Ｇｅｎｅｔ、、　１９９．１６１−１６８頁（１９８５））。

本新規モジュール・プロモーター構築物は、単子葉及び双子葉植物内での外来遺 伝子の発現に好適である。好適な単子葉植物の例は、小麦、大麦、ノイズ及び米 である。タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｃｕｍ）は、満足に形質転換 されることができる双子葉植物の例である。

上記モジュール・プロモーター構築物の対立遺伝子変異体及び誘導体も、これら の修飾されたモジュール・プロモーター構築物が上記のプロモーター構築物と同 一の機能を遂行する、すなわち、遺伝子発現に対する刺激効果をもつ限り、本発 明の範囲内に包含されることは自明である。対立遺伝子変異体及び誘導体は、例 えば、その新規プロモーター構築物の個々の配列の欠失、置換、挿入、逆位又は 付加を含む。

新規モジュール・プロモーター構築物を使用した外来遺伝子による植物の形質転 換は、慣用の形質転換方法の助けにより行われることができる。特に好ましいも のは、プロトプラスト形質転換、その後の形質転換されたプロトプラストから生 じた植物細胞の植物への再生である。

特に好ましい新規モジュール・プロモーター構築物の態様を以下の実施例中に記 載する。

以下に記載するプラスミド構築物を図１中に与える。この図中に示すキメラ遺伝 子構築物を過渡的遺伝子発現実験のために使用した。転写開始部位及びＣａＭＶ ３５Ｓ遺伝子ポリアゾニレ−シコン・シグナルは、全ての構築物内で同一である 。

クローニングに関係する制限部位も含まれた。転写開始と翻訳開始との間のポリ リンカー（Ｐ）は、その５゛末端からその３゛末端まで、制限部位Ｘ　、　Ｄ　 ＳＦ！１及びＫを包含する。これらの制限部位を、以下の：Ｂｃｌ　Ｉ（Ｂ）、 ＲｃｏＲＩ（Ｉｌｌ）　、ＥｃｏＲＶ（ＥＶ）、Ｈｉｎｄ＋１１（Ｈ）、Ｈｉｎ ａｌｌ（Ａ）　、Ｋｐｎｌ（Ｋ）　、Ｓａｍｌ（Ｓ）　、５ｓｔｌｌ（Ｃ）及び Ｘｈｏｌ（Ｘ）ように略す。

ＣａＭＶ　３５３プロモーターを、”エンハンサ−・コア”により示し、モして ＯＴＦ結合部位を”ＯＣ３”により示す。

すべてのプラスミド構築物を、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｉａｂｉｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａ ｌ、　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒ凵@Ｐｒｅｓｓ＋ Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８９中に 記載されるような慣用の方法により、調製した。

すべてのプラスミド構築物は、ＣＡＴマーカー遺伝子（ＣＡＴ＝クロラムフェニ コール・トランスアセチラーゼ）を含むキメラ・プラスミドｐＲＴ　１０１　Ｃ ＡＴ　ａｂ（Ｐｒｏｅｌｓｅｔ　ａｔ、、　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１１．　Ｒｅｐ、 　７．２２１〜２２４頁、　１９８８）から得た。キメラ・プラスミドｐｃＭ１ １０６を調製するために、＋４位から＋５７位までのアクチンｌ遺伝子のエクソ ンｌの非翻訳配列（ａｅｔｌ／ｅｘｏｎｌ配列）をｐＲＴ　ｌ０ＩＣＡＴプラス ミドの５°−非翻訳リーダー内のユニークＳ＋ｎａ　Ｉ制限部位（単数又は複数 ）内に挿入した。この文脈においては、使用されるエクソンｌからの配列及びエ クソン１内のその位置を示す図２を参照することができる。上記ＤＮＡ配列の挿 入は、アクチンｌ要素の３−末端シトシン残基のために上記Ｓｍａ　Ｉ制限部位 を修復する（図２をも参照のこと、＋５５〜＋５７位）。

マイズのシュクロース・シンターゼ遺伝子（Ｓｈｌ）からのイントロンｌ配列（ ＋４３〜＋１０８４）を、ＤＥ−Ｏ５４１２４５３７中に開示されたキメラ・プ ラスミドｐｓｐ　１０７６　＋１０８４からの＋１ｉｎｅｌｌ制限断片として単 離し、そしてこの断片を、ｐＣＭ　１１０６のＳｍａｌ制限部位内に挿入する。

この方法において、キメラ・プラスミド構築物ｐＣＭ　１１１１が得られる。

ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓＬｅｍｓ　３８０　Ｂ）を、図 ２中に示す米アクチンｌ遺伝子のエクソン１からの配列、及び配列ＡＡＣＧＴＡ ＡＧＣＧＣＴＴＡＣＧＴＴをもっ１８塩基対のＯＴＦ結合部位（Ｅｌｌｉｓ　ｅ ｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、　６．３２０３〜３２０８頁、　１９８７）を合成 するために使用する。このＯＴＦ結合部位を次に商業的に入手可能なプラスミド ｐｕｃ　１９内のユニークＳｍａ　ｌ制限部位中にサブクローン化し、ｐＯＴＦ 　１８をもたらす。キメラ・プラスミドｐｃＭ１１１２及びｐＣＭ　２１０７を 調製するために、）１ｉｎｃｌｌ（Ａ）／Ｈｉｎｄｌｌｌ（Ｈ）制限断片をｐＣ Ｍ　１１１１及びｐＣＭ　２１０６から単離しくｔｌｉｎｄｌｌ＋は、ｐＣＭ　 １１１１の部分消化である）、モしてｐＯＴＦ　１８内のユニークＨｉｎｃｌ＋ 制限部位内に挿入する。

プラスミドｐＣＭ　１１０７を調製するために、キメラ・プラスミドｐＣＭ　１ １０６内のポリリンカーをＸｈｏｌ（Ｘ）／Ｋｐｎｌ（Ｋ）を使用した制限消化 により取り除く。突き出し末端を５１による注意深い処理により取り除く。自己 連結は、ｐＣＭ　１１０６と比較して、その転写開始部位とａｃｔ　Ｉ／ｅｘｏ ｎｌ配列との間に１１塩基対の欠失をもつプラスミド構築物ｐＣＭ　１１０７を もたらした。

プロモーター欠失プラスミドｐＣＭ　２１０６を、−９０位におけるＥｃｏＲＶ （ＥＶ）制限部位の上流のｐＣＭ　１１０６からのＣａＭＶ　３５Ｓプロモ一タ ー配列を除去することにより調製する。

の細胞懸濁液から、メイズについて記載された方法（Ｍａａｓ　ａｎｄ　Ｗｅｒ ｒ、　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ。

Ｒｅｐ、　８．１４８〜１５１頁、　１９８９）に従って、７２０　ｍｏｓｍの 浸透度（ｏｓ＋ｎｏｌａｒｉ　ｔｙ）を使用して、単離する。系Ｔｒｉｔｉｃｕ ｍ　ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ（１粒小麦）の細胞懸濁液を培養し、そしてプロトプ ラストを、Ｌｏｅｒｚ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　 １９９．１７８〜１８２頁。

１９８５及びＭａｔｚｅｉｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ＋　３．２ ４７〜２５８頁、　１９９１により本質的に記載されているように、単離した。

Ｈｏｒｄｅｕ＋ｎ　ｖｕｌｇａｒｅ及びＴｒｉｔｉｃｕｍ　ｍｏｎｏｃｏｃｃｕ ｍプロトプラストをＭａａｓ及びＷｅｒｒ上　゛配別用文中（ｆｏｅ、　Ｃ目、 ）及びＭａａｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｏｃ、　Ｃ４ｔ、中に記載されているよう に形質転換した。約１　ｘ　１０　’プロトプラストを２５μｇのプラスミドＤ ＮＡ及び１００μｇの音波処理したウシ胸腺ＤＮＡにより形質転換し、モしてＰ Ｉ！Ｇ−仲介遺伝子転移を行う（ＰＥＧ溶液＝２５％ＰＥＧ　（１５００）、　 ０．１　Ｍ　ＭｇＣ１ｔ　、ｐＨ６，０）。遺伝子発現を形質転換の１５〜１９ 時間後において形成されたタンパク質含量に基づいて調査する。

２．２ＣＡＴ活性の測定 ＣＡＴ活性の測定のために、形質転換細胞を遠心分離により沈め、６０μｍの７ ．５のｐＨにおける５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ（２ｍｌＪ　ＰＭＳＦ）中に 再懸濁させ、そして凍結及び解凍の２サイクルにより溶解させる。抽出物を遠心 分離により清澄化する。２０μｌの上清をＢｒａｄｆｏｒｄ、　Ａｎａｌ、　Ｂ ｉｏｃｈｅＩｌｌ、７２．２４８〜２５４頁、　１９７６に従ってタンパク質を 測定するために使用する。ＣＡＴ活性を、Ｇｏｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ １．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　２．１０４４〜１０５１頁、　１９８２により 本質的に記載されているように薄層クロマトグラフィーを使用して測定する。抽 出物を６５℃においてＩＯ分間前インキュベートし、２５０μｇのＢＳ＾をその 反応混合物に添加する。

２つの形質転換をそれぞれのプラスミド構築物について並行して行った。処理し たプラスミドを培養し、そして異なる形質転換の効率のよる差異を減少させるた めに組み合わせた。この混合物の１／２（１ｘ　１０’プロトプラスト）をＣＡ Ｔ活性について分析する。非希釈抽出物中の高いＣＡＴ活性のために、一連の１ ：１０希釈物（１：１０　、ｌ：ｌｏｏ　、　Ｉ：１０００）を調製し、それに より、オートラジオグラフの濃度計検査のための線形ＣＡＴ活性を得る。

２．３検査結果 ２．３．　Ｉ　Ｈｏｒｄｅｕａ＋　ｖｕ１ｇａｒｅ実施例１中に記載したキメラ ・プラスミドを含むＨｏｒｄｅｕ＋ｎ　ｖｕ１ｇａｒｅプロトプラストにおける 遺伝子発現の検査は、以下の結果を導いた。

相対ＣＡＴ活性についての結果を、図３中の薄層クロマトグラムから見ることが できる。粗抽出物中の高いＣＡＴ活性のために、その活性をＩ　Ｘ　１０’プロ トプラストを含むＩ：Ｉ００希釈物中において測定した。略号は、以下の意味を もつ・ＣＡＴ＝クロラムフェニコール・トランスアセチラーゼ；　Ｃｍ＝Ｃ”− 標識材はクロラムフェニコール単独；　ｃｏｎｔ＝非形質転換対照プロトプラス トのタンパク質抽出物、並びに１．３．及び１．３Ｃｍ＝所定の位置においてア セチル化されたクロラムフェニコール。

参照プラスミドｐＲＴ　１０１　ＣＡＴに比較してキメラ・プラスミドｐＣＭ　 １１０６の場合においてマーカー遺伝子発現における少なくとも１０倍の増加が 存在する。

キメラ・プラスミドｐｃＭＩＩＮから、マーカー遺伝子発現が、ａｃｔｌ／ｅｘ ｏｎｌ配列がシュクロース・シンターゼ遺伝子からのイントロンｌ配列と組み合 わされるとき、少なくとも１０００倍増加されることを、見ることができる。

オクトピン・シンターゼ・プロモーターの１８塩基対ＯＴＦ結合部位は、完全な ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと一緒になって、ａｃｔｌ／ｅｘｏｎｌ配列及びシ ュクロース・シンターゼ遺伝子のイントロンｌと相互作用することができる。こ のＯＴＦ結合部位の、キメラ・プラスミドｐＣＭ　１１１１であってａｃｔｌ／ ｅｘｏｎｌ配列及びシュクロース・シンターゼ遺伝子のイントロンｌからの配列 を含むものへの挿入は、刺激比において少なくともさらに３〜４倍の増加をもた らす（ｐＣＭ　１１１２を参照のこと。）。この結果は、Ｉ　：　１０００倍希 釈物を使用しても得られる（図示せず。）。従って、異なる個々のＤＮＡ配列の 組み合わせの刺激効果が倍数的であり且つ付加的でないということが明白に証明 される。

これに関して、以下の表１を参照することができ、これは、プラスミドｐＲＴ　 １０１ＣＡＴ（活性＝１）のものに対するＨｏｒｄｅｕｏ＋　ｖｕ１ｇａｒｅプ ロトプラスト内のキメラ・プラスミドｐＣＭ　１１０６、ｐＣＭ　１１１１及び ｐＣＭ　１１１２の、図３からのＣＡＴ活性を列記している。

表１ 実施例１中に記載したキメラ・プラスミドを含むＴｒｉｔｉｃｕｍ　ｍｏｎｏｃ ｏｃｃｕｉ＋プロトプラスト内における遺伝子発現の調査は以下の結果を導いた 。

図４中から見られるように、Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕ１ｇａｒｅプロトプラストに より得られるのと同様の遺伝子発現刺激比が形質転換されたＴｒｉｔｉＣｕｌｎ 　ｍｏｎＯｃＯｃｃＬＩｍプロトプラストにより得られる。従って、ａｃｔｌ／ ｅｘｏｎｌ配列の挿入は、マーカー遺伝子発現（ｐＣＭ　１１０６）における少 なくとも１０倍の増加をもたらす。ａｃｔｌ／ｅｘｏｎｌ配列とシュクロース・ シンターゼ遺伝子のイントロンｌ配列との組み合わせは、遺伝子発現における少 なくとも１０００倍の増加をもたらす。

これに関して、以下の表２を参照することができる。ここで、図４からのキメラ ・プラスミドｐＣＭ　１１０６及びｐｃｕ　１１１１のＣＡＴ活性を、キメラ参 照プラスミドｐＲＴｌｏｔ　ＣＡＴのもの（活性＝１）と関係付けた。

図５中の薄層クロマトグラムは、ａｃｔｌ／ｅｘｏｎｌ配列が上流の調節配列の 存在なしには遺伝子発現におけるいずれの増加も生じさせないということを示し ている。

ａｃｔｌ／ｅｘｏｎｌ配列は、それが完全ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーター（ｐＣ Ｍ　１１０６）の下流に挿入されるとき少なくともｌＯ倍マーカー遺伝子発現を 増加させる。これに反して、キメラ・プラスミドｐＣＭ　１１０６内のＣａＭＶ 　３５Ｓプロモーターの欠失は（ｐＣＭ　２１０Ｂ　、図１）、ａｃｔｌ／ｅｘ ｏｎｌ配列の刺激能力を完全に欠く。

有効なマーカー遺伝子発現のために、ａｃｔｌ／ｅｘｏｎｌ配列が上流の調節要 素の存在を要求するため、キメラ・プラスミドｐＣＭ　２１０６の活性は、上流 の調節要素の挿入により回復されることができる。この理由により、１８塩基対 ＯＴＦ結合部位が、キメラ・プラスミドｐＣＭ　２１０７を形成するために、調 節配列としてキメラ・プラスミドｐＣＭ　２１０６のＣａＭＶ　３５５の上流に 挿入された（図１をも参照のこと。）。キメラ・プラスミド９ＣＭ　２１０７の 過渡的遺伝子発現は、非刺激性キメラ・プラスミドｐＣＭ　２１０６内のａｃｔ ｌ／ｅｘｏｎｌ配列がそのプラスミドがＯＴＦ結合部位を含む場合少なくともｌ Ｏの係数によりその刺激効果を再び示すということを、示している。

キメラ・プラスミドｐＣＭ　１１０６及びｐＣＭ　１１０７の例から、異種プロ モーターの転写開始部位までの距離も非常に重要であることも分かる。転写開始 部位とａｃｔｌ／ｅｘｏｎｌ配列との間に位置するｐＣＭ　１１０Ｂのポリリン カー内の１１塩基対の欠失は、そのプロモーター構築物（ｐＣＭ　１１０７）の 刺激効果を消滅させる。従って、転写開始部位とａｃｔｌ／ｅｘｏｎｌ配列との 間の距離は好ましくは少なくとも１１塩基対でなければならない。

図５中に示すキメラ・プラスミドにより得られた遺伝子発現における増加の相対 値を以下の表３中に与える。この表中において、Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕ１ｇａｒ ｅプロトプラスト内でのキメラ・プラスミドｐｃＭ　１１０６、ｐＣＭ　１１０ ７、ｐＣＭ　２１０６及びｐｃｌＪ　２１０７のＣＡＴ活性を、キメラ参照プラ スミドｐＲＴ　１０１　ＣＡＴのもの（活性＝１）と関係付けた。

これ故、新規のモジュール・プロモーター構築物は、場合により選択された個々 の調節ＤＮＡ配列から、少なくとも４０００の係数により植物細胞内で外来遺伝 子の発現を増加させることができるようなプロモーターを使用して、構築される 有効なプロモーターである。米アクチンｌ遺伝子のエクソンｌの５°−非翻訳領 域からのＤＮＡ配列が中心的な重要性を有する。この配列は、ＲＮＡポリメラー ゼＩ＋を刺激するｃｉｓ要素であり、これは、その転写開始部位の下流に配置さ れなければならず、且つ上流の調節ＤＮＡ配列の存在中に遺伝子発現に対するそ の刺激効果のみを示す。

ト 〈 「１°〇 一〇。

−，０ ΣΣ）−← （）１１γ膨ｄ ＦＩＧ、５ 手続補正書（方式） 平成７年り月！７日

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．植物細胞内で活性であるプロモーター及び米のアクチン１遺伝子のエクソン １からのＤＮＡ配列を有するモジュール・プロモーター構築物、並びにこのモジ ュール・プロモーター構築物の対立遺伝子及び誘導体。
2. ２．前記ＤＮＡ配列がアクチン１遺伝子のエクソン１内の＋４位〜＋５７位に一 致することを特徴とする、請求項１に記載のプロモーター構築物。
3. ３．それがメイズのシュクロース・シンターゼ遺伝子のイントロン１からのＤＮ Ａ配列をも含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のプロモーター構築物 。
4. ４．それがさらに１８塩基対のＯＴＦ結合部位を含むことを特徴とする、請求項 ３に記載のプロモーター構築物。
5. ５．植物細胞内で発現されるべき遺伝子にカップリングされている、請求項１〜 ４の中の１に記載のプロモーター構築物を含むベクター。
6. ６．請求項５に記載のベクターにより形質転換されている植物細胞。
7. ７．請求項６に記載の植物細胞から再生された、植物及びその子孫。
8. ８．高められた遺伝子発現を有する植物を生産するための、請求項１〜４に記載 のプロモーター構築物の使用。