DE60029461T2

DE60029461T2 - Synthetische und chimere promotoren, expressionskassetten, plasmide, vektore, transgene pflanzen und diese enthaltende samen, sowie verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE60029461T2
Application number: DE60029461T
Authority: DE
Inventors: Veronique Gruber; Frederic Norre; Manfred Theisen
Original assignee: Meristem Therapeutics SA
Current assignee: Meristem Therapeutics SA
Priority date: 1999-09-30
Filing date: 2000-09-28
Publication date: 2007-03-08
Anticipated expiration: 2020-09-29
Also published as: US20020083486A1; FR2799205A1; ATE333505T1; EP1220935B1; CA2353540A1; AU7307600A; WO2001023593A1; CN1339067A; JP2003510088A; EP1220935A1; AU762024B2; FR2799205B1; DE60029461D1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf chimäre Promotoren für die Expression, einzusetzen insbesondere im Bereich der Pflanzenbiotechnologie.
Im Allgemeinen sind Promotoren für die Expression aus den Bereichen Biotechnologie und Genmanipulation bekannt. Mit besonderem Blick auf Pflanzenbiotechnologie hängt der Grad der Expression eines Gens, das ein Polypeptid kodiert, das in einer Wirtszelle produziert werden soll, oft von dem verwendeten Promotor ab. Die üblicherweise verwendeten verschiedenen Promotoren sind oft auf spezielle Anwendungen oder Gewebe beschränkt, was durch ihre Gewebespezifität oder die Stärke der Expression begründet wird. Es darf z.B. in Hinblick auf den 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus, einem Promotor, der im Vergleich z.B. mit dem Promotor aus dem nos-Gen relativ stark ist, erwähnt werden, dass diese beiden Promotoren besonders im Bereich der Pflanzenbiotechnologie eingesetzt werden. Es besteht daher ein Bedarf an neuen Promotoren, welche die Nachteile der existierenden Promotoren ausgleichen können.
Ein Versuch, der diesen Bedarf decken soll, wurde in der PCT-Patentanmeldung unter der Nummer WO 97/20056 veröffentlicht, in der die Erhöhung des Grades der Gen-Expression durch Enhancer in bekannten Promotoren beschrieben wird, (d.h. die Tatsache, einen positiven Effekt auf die Aktivität eines Promotors zu haben). Die Nukleotidsequenzen von Enhancern sind reich an A- und T-Basen, die Gesamtmenge dieser Basen stellt mehr als 50% der Nukleotidsequenzen des Enhancers dar. Insbesondere empfehlen die Anwender dieser Patentanmeldung die Verwendung einer Enhancer-Region, die aus dem Plastocyanin-Promotor der Erbse stammt.
Die in dieser Beschreibung und den Patentansprüchen verwendeten Begriffe haben folgende Bedeutung:

– der Begriff „Nukleinsäure" bedeutet DNA oder RNA;
– der Begriff „Nukleinsäuresequenz" meint ein einzel- oder doppelsträngiges Oligomer oder Polymer von Nukleotidbasen, die vom 5'-Ende bis zum 3'-Ende gelesen werden, darin enthalten sind selbst-replizierende Plasmide, Gene und DNA- oder RNA-Polymere, die ansteckend oder nicht-ansteckend sind, sowie funktionale oder nicht-funktionale DNA oder RNA. In der Nukleotid-Schreibweise, die in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, ist, außer wenn es besonders erwähnt wird, das linke Ende einer einzelsträngigen Nukleotid-Sequenz das 5'-Ende;
– der Ausdruck „abgeleitete Nukleinsäuresequenz" bedeutet, dass die Sequenz direkt oder indirekt aus der Sequenz stammt, auf die Bezug genommen wird, z.B. durch Substitution, Deletion, Addition, Mutation, Fragmentierung und/oder Synthese eines oder mehrerer Nukleotide;
– der Begriff „Promotor" oder der Ausdruck „Promotor-Nukleinsäuresequenz" bezeichnet einen Nukleinsäurebereich, der sich oberhalb des Translationsstartcodons befindet, und der an der Erkennung und Bindung von RNA-Polymerase und anderen zu transkribierenden Proteinen beteiligt ist;
– „Pflanzenpromotor" ist ein Promotor, der in der Lage ist, die Transkription in Pflanzenzellen zu initiieren;
– ein „konstitutiver Promotor" ist ein Promotor, der in der Lage ist, Nukleinsäuresequenzen zu exprimieren, die auf funktionale Weise mit besagtem Promotor verbunden sind, und das in allen oder praktisch allen Geweben des Wirtsorganismus während der Entwicklung des besagten Organismus;
– ein „gewebsspezifischer Promotor" ist ein Promotor, der in der Lage ist, solche Nukleinsäuresequenzen selektiv zu exprimieren, die in funktionaler Manier mit besagtem Promotor verbunden sind, und das in speziellen Geweben des Wirtsorganismus;
– der Ausdruck „auf funktionale Weise verbunden" bzw. „funktional verbunden" bezeichnet die Verbindung einer Nukleidsäuresequenz, z.B. eines Promotors oder einer regulatorischen oder funktionalen Box, zu einer anderen Nukleinsäuresequenz, z.B. einer anderen regulatorischen oder funktionalen Box oder einem Gen, das exprimiert werden soll und ein zu produzierendes Protein kodiert, damit die Sequenzen ihre Primärfunktionen in einer Zelle, einem Genom, einem Vektor oder einer Expressionskassette, in die sie eingeführt wurden, ausüben, d.h. dass sie in solchen Umgebungen funktional sind. Es sollte auch klar sein, dass im Fall eines Promotors die Sequenz des Promotors auch Sequenzen enthält, die zwischen der Startstelle der Transkription und der Startstelle der Translation transkribiert werden;
– der Begriff „Expressionskassette" bezeichnet Nukleotidsequenzen, die in der Lage sind, die Expression einer Nukleinsäuresequenz oder eines Gens zu lenken, indem ein Polypeptid kodiert wird, das in einem Wirtsorganismus produziert werden soll, der mit solchen Sequenzen kompatibel ist. Solche Kassetten enthalten mindestens einen Promotor und ein Signal zur Transkriptionstermination, sowie andere optionale Faktoren, die für die Expression erforderlich oder nützlich sind;
– der Begriff „Vektor" bezeichnet Expressionssysteme, z.B. DNA-beschichtete Projektile, nukleinsäurebasierte Transitvehikel und Nukleinsäuremoleküle, die angepasst wurden, um die Nukleinsäure zu liefern sowie autonome selbst-replizierende zirkuläre DNA, z.B. Plasmide, Cosmide, Phagemiden usw. Wenn eine rekombinante Zellkultur oder ein Mikroorganismus als Wirt eines „Expressionsvektors" beschrieben wird, beinhaltet dies extrachromosomale zirkuläre DNA (wie z.B. mitochondrische oder chloroplastische DNA) und DNA, die in das bzw. die Wirtschromosom/en integriert wurde, wobei der Vektor entweder während der Mitose durch die Zellen als eine autonome Struktur stabil repliziert werden kann, die in das Genom des Wirts integriert werden, oder im Nukleus oder Zytoplasma des Wirts erhalten bleiben kann;
– der Begriff „Plasmid" bezeichnet eine autonome zirkuläre DNA, die sich molekular in einer Zelle replizieren kann, und umfasst sowohl die sogenannten „Expressions"-Plasmide als auch die sogenannten „Nichtexpressions"-Plasmide. Wenn eine rekombinante Zellkultur oder ein Mikroorganismus als Wirt eines „Expressions"-Plasmids beschrieben wird, umfasst dies sowohl die extrachromosomalen zirkulären DNA-Moleküle als auch DNA, die in das/die Wirtschromosom/en integriert wurden. Wenn das Plasmid durch eine Wirtszelle erhalten bleibt, wird das Plasmid während der Mitose entweder durch die Zellen stabil als autonome Struktur repliziert oder in das Wirtsgenom integriert;
– der Begriff „heterologe Sequenz" oder „heterologe Nukleinsäuresequenz" bezeichnet eine Sequenz, die aus einer Quelle oder von einer Spezies stammt, die in ihrer Umgebung fremd ist, oder, wenn sie aus der selben Umgebung stammt, in Bezug auf ihre ursprüngliche Form modifiziert wurde. Die Modifizierung der Nukleinsäuresequenz kann z.B. stattfinden, wenn die Nukleinsäure mit einem Restriktionsenzym behandelt wird, um so ein Nukleinsäurefragment zu generieren, das in der Lage ist, auf funktionale Weise mit einem Promotor verbunden zu werden. Die Modifizierung kann auch durch Techniken wie ortsspezifische Mutagenese durchgeführt werden;
– der Begriff „Box" bezeichnet eine Nukleinsäuresequenz, der eine regulatorische Funktion zugewiesen wird;
– der Begriff „ähnlich" bedeutet, dass die Box und/oder Nukleinsäuresequenz, auf die sich dieser Begriff bezieht, eine gewisse Sequenzidentität oder eine Consensus-Sequenz mit einer Box und/oder einer bekannten sogenannten Referenz-Nukleinsäuresequenz enthält, vorzugsweise eine Sequenzidentität von mindestens 50%, oder noch besser eine Sequenzidentität von mindestens 75% oder sogar eine Sequenzidentität von mindestens 90% mit der Referenzsequenz aufweist. Die prozentuale Sequenzidentität wird auf der Basis eines Vergleichsfensters von mindestens 6 Nukleotidbasen berechnet. Die Festlegung eines Vergleichsfensters kann durchgeführt werden, indem ein Sequenzanordnungsalgorithmus verwendet wird, um Homologie mit einer Referenzsequenz zu bestimmen, z.B. der Algorithmus der fokalen Homologie, der Homologieanordnungsalgorithmus und der Ähnlichkeitensuchalgorithmus, diese Algorithmen existieren auch in Computerform unter den Namen GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA. Die prozentuale Sequenzidentität erhält man durch den Vergleich der Referenzsequenz mit der Box und/oder der Nukleinsäuresequenz;
– der Begriff „lokalisiert" bezeichnet die Position auf einer Nukleinsäuresequenz eines identifizierten Elements, wie einer „Box", einem Restriktionsort oder einem Codon mit einer spezifischen Funktion. Die durch eine Nummer angegebene Position bezieht sich auf eine Startposition des Elements in der Nukleinsäuresequenz, außer wo es besonders erwähnt wird, in Leserichtung der letzteren, d.h. in der Richtung 5' → 3';
– der Begriff „Element 300", „EM", „Endospermmotiv", „P-Box" oder „Prolamin-ähnliche"-Box bezeichnet ein regulatorisches oder funktionales Motiv oder Element, das Speicherproteine vieler Getreidearten kodiert, und das in dem üblichen regulatorischen Mechanismus enthalten ist, das die koordinierte Expression von Zein-Genen während der Entwicklung des Mais-Eiweißes vermittelt;
– der Begriff „G-ähnliche"-Box bezeichnet ein ACGT-Kernmotiv, den funktionalen Beitrag zur transkriptionalen Regulierung, für die einige Fälle definiert wurden, die aber für die maximale Expression eines Promotors erforderlich erscheinen;
– der Begriff „Enhancer"-Box bezeichnet regulatorische DNA-Sequenzen, die in Entfernung in cis-Form agieren können, und das unabhängig von ihrer Orientierung und ober- oder unterhalb ihres Zielpromoters, und die im Allgemeinen aus merhfachen kurzen Motiven bestehen, die eine Kombination von Trans-Faktoren binden, um möglicherweise Unverformbarkeit, Gewebsspezifität oder eine allgemeine Verbesserung der Aktivität eines Promotors zu verleihen;
– der Begriff „GATA"-Box bezeichnet ein regulatorisches oder funktionales Motiv oder Element, das für die Aktivität vieler lichtregulierter Promotoren erforderlich sein kann;
– der Begriff „as1"- oder „Aktivierungssequenz 1"-Box bezeichnet ein regulatorisches oder funktionales Motiv oder Element, das vorzugsweise aus dem 35S-Promotor CaMV (Blumenkohlmosaikvirus) stammt, das Expression in Wurzeln übertragen kann und durch synergistische Interaktionen mit anderen cis-aktivierenden Elementen eine komplexere Rolle in der Promotor-Regulation spielen kann, und das optionalerweise Salicylsäure-induzierbar sein kann;
– der Begriff „as2"- oder „Aktivierungssequenz 2"-Box bezeichnet ein regulatorisches oder funktionales Motiv oder Element, das vorzugsweise aus dem 35S-Promotor CaMV (Blumenkohlmosaikvirus) stammt, das Expression in photosynthetischen Geweben übertragen kann und eine transkriptionale Aktivator-Aktivität haben kann;
– der Begriff „Getreide"-Box bezeichnet ein regulatorisches oder funktionales Motiv oder Element, das an der spezifischen Expression von Weizensamen beteiligt sein kann;
– der Begriff „GC-reiche"-Box bezeichnet ein regulatorisches oder funktionales Motiv oder Element, das reich an G- oder C-Nukleotiden ist, z.B. weil es aus einem Geminivirus stammt;
– der Begriff „transgene Pflanze" bezeichnet eine Pflanze, die durch genetische Manipulationstechniken erhalten wurde, und deckt ganze Pflanzen ab, die durch solche Manipulationen erhalten wurden, regenerierte Pflanzen, die in ihr Genom solche Manipulationen, ihre Nachkommen und die Pflanzenorgane integrieren oder exprimieren, z.B. Wurzeln, Stängel und Blätter, die durch diese Techniken erhalten wurden. Die transgenen Pflanzen, auf die sich die vorliegende Erfindung bezieht, können verschiedene Ploidie-Grade haben, und können insbesondere polyploid, diploid oder haploid sein;
– der Begriff „Fortpflanzungseinheit" bezeichnet eine strukturierte oder unstrukturierte Gruppe von Pflanzenzellen, welche die Regeneration einer ganzen Pflanze ermöglicht, z.B. Explantate, Kallusen, Stängel, Blätter, Wurzeln, Stecklinge und sogar Samen.

Der Antragsteller der vorliegenden Erfindung hat einen Ansatz gewählt, der sich von dem Antrag der zuvor diskutierten PCT-Anwendung unterscheidet. insbesondere hat es der Antragsteller der vorliegenden Erfindung überraschenderweise erreicht, chimäre Promotoren zu produzieren, die es ermöglichen, das oben beschriebene Bedürfnis zu erfüllen, und die es insbesondere ermöglichen, den Expressionsgrad eines Gens oder einer Nukleinsäuresequenz, die ein zu produzierendes Polypeptid in einer Wirtszelle und insbesondere in einer Pflanzenzelle in Bezug auf die bestehenden, am häufigsten verwendeten Promotoren zu kodieren. Außerdem hat es der Antragsteller erreicht, gleichzeitig eine vollständige Reihe von Promotoren zu produzieren, um in der Lage zu sein, denjenigen auszuwählen, der für die vorgesehene Verwendung und die Implementierungsumgebung geeignet ist, und um so irgendwie in der Lage zu sein, den Expressionsgrad eines zu exprimierenden Gens zu steuern, das ein zu produzierendes Polypeptid kodiert. Ein Beispiel für die Verwendung dieses Prinzips wäre es, einen der schwächeren Promotoren der Erfindung zu verwenden, um die Expression eines Proteins oder Enzyms zu lenken oder zu steuern, z.B. ein Auswahlmittel in einer Pflanze, z.B. Resistenz gegenüber Antibiotika oder Herbiziden, oder ein Ko-Enzym oder Ko-Faktor, der zur Zusammensetzung eines wichtigeren Proteins erforderlich ist, und in Übereinstimmung mit der Erfindung einen stärkeren Promotor zu verwenden, um z.B. die Expression eines Polypeptids zu steuern, um einen therapeutischen Effekt zu haben.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass die in Zusammenhang mit der Erfindung präparierten Promotoren eine spezielle Expression in den Samen ermöglichen, aber ebenso eine Deregulierung, um die Expression in anderen Organen zu begünstigen, z.B. in Blättern, dem Stängel und dem Gefäßsystem der Pflanze.
Folglich ist ein Hauptthema der vorliegenden Erfindung ein chimärer Promotor, der mindestens eine Nukleinsäuresequenz enthält, die von einem Gen abgeleitet wurde, das ein hochmolekulares Weizenglutenin kodiert, und vorzugsweise eine Nukleinsäuresequenz, die von einem Weizen-Dx5- oder Bx7-Gen abgeleitet wurde, das ein hochmolekulares Weizenglutenin kodiert.
Vorzugsweise enthält der chimäre Promotor mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die von einem Gen abgeleitet wurde, das ein hochmolekulares Weizenglutenin kodiert, dessen Sequenz mit der Nummer SEQ.ID01 identifiziert wird.
Noch besser ist es, wenn die Nukleinsäuresequenz, die von einem Gen abgeleitet wurde, das ein hochmolekulares Weizenglutenin kodiert, einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt wurde, deren Sequenzen mit den folgenden Nummer identifiziert werden: ID02, SEQ.ID03, SEQ.ID04, SEQ.ID05, SEQ.ID06, SEQ.ID07, SEQ.ID08, SEQ.ID09, SEQ.ID10, SEQ.ID11, SEQ.ID12, SEQ.ID13, SEQ.ID16, SEQ.ID17, SEQ.ID18, SEQ.ID19, SEQ.ID20, SEQ.ID21 und SEQ.ID22.
Außerdem hat der Antragsteller darauf hingewiesen, dass es möglich ist, Promotoren zu konstruieren, und insbesondere Pflanzenpromotoren, die eine vorteilhafte Promotoraktivität sowohl in zweikeimblättrigen und einkeimblättrigen Pflanzen haben, indem sie eine gewissen Anzahl von regulatorischen oder funktionalen Boxen kombinieren, wozu sie eine Nukleinsäuresequenz verwenden, die von einem wie oben definierten Gen abgeleitet wurde, das ein hochmolekulares Weizenglutenin kodiert.
Folglich ist ein weiteres Thema der vorliegenden Erfindung ein chimärer Promotor zur Expression, der eine Nukleinsäuresequenz enthält, die von einem Gen abgeleitet wurde, das ein hochmolekulares Weizenglutenin kodiert, und das an der 3'-Position eine „TATA"-Box und eine Transkriptionsstartstelle enthält.
Vorzugsweise enthält der Promotor auch mindestens eine „Enhancer"-Box, die funktional an der 5'-Position oberhalb der „TATA"-Box und die Transkriptionsstartstelle (+1) gebunden ist.
Noch besser ist es, wenn der Promotor auch mindestens eine „G-ähnliche"-Box enthält, die funktional an der 5'-Position oberhalb der „Enhancer"-Box gebunden ist.
Sogar noch besser ist es, wenn der Promotor auch mindestens eine „P-ähnliche"-Box enthält, die funktional an der 5'-Position oberhalb der „Enhancer"-Box gebunden ist.
Vorteilhaft ist es, wenn der Promotor auch mindestens eine „GATA"-Box enthält, die funktional an der 5'-Position oberhalb von zumindest der „Enhancer"-Box gebunden ist.
Vorzugsweise enthält der Promotor auch mindestens eine Getreide-Box, die funktional an der 5'-Position oberhalb der „Enhancer"-Box gebunden ist.
Sogar noch besser ist es, wenn der Promotor zwei benachbarte Getreide-Boxen enthält, die funktional an der 5'-Position oberhalb der „Enhancer"-Box gebunden sind.
Entsprechend einer bevorzugten Zusammenfassung der Promotoren im Sinne der vorliegenden Erfindung, enthalten sie auch mindestens eine "as1"-Box oder mindestens eine "as2"-Box, oder eine "as1/as2" oder "as2/as1" Kombination von Boxen oder Wiederholungspermutationen derselben, die funktional an der 5'-Position oberhalb der Transkriptionsstartstelle gebunden sind.
Entsprechend einer anderen bevorzugten Zusammenfassung der Erfindung, ist (sind) die „as1", „as2", „as1/as2" oder "as2/as1" Box(en) oder ihre Wiederholungspermutation(en) funktional abwärts an der 3'-Position der Enhancer-Box gebunden.
Entsprechend einer weiteren bevorzugten Zusammenfassung der Erfindung enthalten die Promotoren auch eine „GC"-Box, die funktional oberhalb der „Enhancer"-Box gebunden ist.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn der Promotor zwei „Getreide"-Boxen, die funktional an der 5'-Position oberhalb der „Enhancer"[lacuna]-Box gebunden ist, die selbst funktional an der 5'-Position oberhalb einer „as2/as1"-Box gebunden ist.
Entsprechend einer weiteren bevorzugten Zusammenfassung der Promotoren der vorliegenden Erfindung, enthalten sie mindestens ein Element, das aus einer Gruppe besteht, die aus einer „Enhancer"-Box, einer „G-ähnlichen" Box, einer „P-ähnlichen" Box, einer „Getreide"-Box, einer „as1"-Box, einer „as2"-Box und/oder einer as1/as2 oder "as2/as1" Kombination von Boxen gewählt wurde, die beliebig wiederholt werden, und einer „GC"-Box, die funktional in umgekehrter Orientierung und/oder unterhalb der 3'-Position der Transkriptionsstartseite gebunden ist.
Letztendlich enthalten die chimären Promotoren nach der vorliegenden Erfindung mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die aus der Gruppe gewählt wurden, die aus SEQ.ID02, SEQ.ID03, SEQ.ID04, SEQ.ID05, SEQ.ID06, SEQ.ID07, SEQ.ID08, SEQ.ID09, SEQ.ID10, SEQ.ID11, SEQ.ID12, SEQ.ID13, SEQ.ID16, SEQ.ID17, SEQ.ID18, SEQ.ID19, SEQ.ID20, SEQ.ID21 und SEQ.ID22 bestehen.
Ein weiteres Thema der vorliegenden Erfindung ist eine Expressionskassette, die mindestens eine Promotor-Nukleinsäuresequenz enthält, die von einem Gen abgeleitet wurde, das ein hochmolekulares Weizenglutenin kodiert, und die in funktionaler Weise an eine Nukleinsäuresequenz gebunden ist, um exprimiert zu werden und um ein zu produzierendes Polypeptid zu kodieren, die selbst an eine Nukleinsäuresequenz zur Transkriptionstermination gebunden ist.
Vorzugsweise enthält diese Expressionskassette mindestens eine Promotor-Nukleinsäuresequenz, die von einem Gen abgeleitet wurde, das ein hochmolekulares Weizenglutenin kodiert, dessen Sequenz mit der Nummer SEQ.ID01 identifiziert wird.
Noch besser ist es, wenn die Expressionskassette mindestens eine Promotor-Nukleinsäuresequenz enthält, die von einem Gen abgeleitet wurde, das ein hochmolekulares Weizenglutenin kodiert, und das aus der Gruppe gewählt wurde, die aus Sequenzen besteht, die unter den Nummern SEQ.ID02, SEQ.ID03, SEQ.ID04, SEQ.ID05, SEQ.ID06, SEQ.ID07, SEQ.ID08, SEQ.ID09, SEQ.ID10, SEQ.ID11, SEQ.ID12, SEQ.ID13, SEQ.ID16, SEQ.ID17, SEQ.ID18, SEQ.ID19, SEQ.ID20, SEQ.ID21 und SEQ.ID22 identifiziert werden.
Ein weiteres Thema der vorliegenden Erfindung ist eine isolierte Promotor-Nukleinsäuresequenz, die so charakterisiert ist, dass sie einer Sequenz entspricht, die von der Sequenz abgeleitet wurde, die mit der Nummer SEQ.ID01 identifiziert wird.
Vorzugsweise entspricht die isolierte Promotor-Nukleinsäuresequenz einer Sequenz, die aus der Gruppe gewählt wurde, die aus den Sequenzen besteht, die unter den Nummern SEQ.ID02,SEQ.ID03, SEQ.ID04, SEQ.ID05, SEQ.ID06, SEQ.ID07, SEQ.ID08, SEQ.ID09, SEQ.ID10, SEQ.ID11, SEQ.ID12, SEQ.ID13, SEQ.ID16, SEQ.ID17, SEQ.ID18, SEQ.ID19, SEQ.ID20, SEQ.ID21 und SEQ.ID22 identifiziert werden.
Ein weiteres Thema der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor, der einen Promotor oder eine Promotor-Nukleinsäuresequenz enthält, die in der Lage ist, die Transkription einer solchen Nukleinsäuresequenz zu starten, die ein zu produzierendes Polypeptid kodiert, das so charakterisiert ist, dass der Promotor oder die Promotor-Nukleinsäuresequenz einem wie oben definierten chimären Promotor oder einer Promotor-Nukleinsäuresequenz entspricht.
Vorzugsweise wird der Vektor aus der Gruppe gewählt, die aus den Binärvektoren besteht, die unter den Nummern pMRT1207, pMRT1177, pMRT1178, pMRT1179, pMRT1180 und pMRT1181 identifiziert werden.
Ein weiteres Thema der vorliegenden Erfindung ist eine transgene Pflanze, die in ihrem Genom mindestens einen wie oben definierten Promotor oder mindestens eine Promotor-Nukleinsäuresequenz stabil integriert hat.
Vorzugsweise wird die Pflanze aus zweikeimblättrigen Arten gewählt, z.B. Kartoffel, Tabak, Baumwolle, Salat, Tomate, Melone, Gurke, Erbse, Raps, Rote Bete oder Sonnenblume, oder aus einkeimblättrigen Arten wie Weizen, Gerste, Hafer, Reis oder Mais.
Ein weiteres Thema der vorliegenden Erfindung ist eine Fortpflanzungseinheit einer wie oben definierten transgenen Pflanze und vorzugsweise ist diese Fortpflanzungseinheit ein Samen.
Noch ein weiteres Thema der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle, die einen Promotor oder eine wie oben definierte Promotor-Nukleinsäuresequenz enthält, und vorzugsweise ist diese Zelle eine Pflanzenzelle.
Unter den bevorzugten Themen der Erfindung befindet sich auch eine Methode zur Expression einer Nukleinsäuresequenz oder eines Gens, die bzw. das in einer Zelle ein zu produzierendes Polypeptid kodiert, die so charakterisiert ist, dass sie die folgenden Schritte umfasst:

– Transformation der Zelle mit einem Vektor, der mindestens einen Promotor oder mindestens eine wie oben definierte Promotor-Nukleinsäuresequenz enthält;
– Vorbereitung einer Zellkultur unter Bedingungen, welche die Expression der Nukleinsäuresequenz oder des Gens durch Kodierung der Polypeptide ermöglicht.

Vorzugsweise ist das zu produzierende Polypeptid ein Enzym oder Protein bzw. ein Derivativ der letzteren, das Aktivität in vitro und/oder in Menschen und/oder in Tieren aufweist, besagte Aktivität umfasst verdauungsfördernde, pankreatische, biliäre, antivirale, entzündungshemmende, pulmonale, antimikrobielle, nutritive, kosmetische und strukturelle Aktivität, Aktivität im Blut, kardiovaskuläre, ophthalmische, antigene und immunstimulierende Aktivität sowie Aktivität im Gehirn. Beispiele für solche Proteine sind u.a. Insuline, Interferone, gastrische, pankreatische oder biliäre Lipasen, Elastasen, Antiproteasen wie alpha-1 Antitrypsin, strukturbildende Proteine wie Collagen, Transferrine wie Laktoferrin, aus Blut stammende Proteine wie menschliches Hämaglobin oder Albumine, und Blut-Ko-Faktoren und Antioxidantien wie Superoxiddismutase.
Vorzugsweise ist die bei dieser Methode verwendete Zelle eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle.
Sogar noch besser ist es, wenn die Zelle eine Zelle ist, die aus der Gruppe ausgewählt wurde, die aus mikrobiellen Zellen, Pilzzellen, Insektenzellen, Tierzellen und Pflanzenzellen besteht, und idealerweise handelt es sich um eine Pflanzenzelle.
Letztendlich ist ein weiteres Thema der vorliegenden Erfindung eine Methode zum Erhalt einer wie oben definierten transgenen Pflanze oder einer Fortpflanzungseinheit, die dadurch charakterisiert ist, dass sie die folgenden Schritte enthält:

– Transformation der Zelle mit einem Vektor, der mindestens einen Promotor oder mindestens eine wie oben definierte Promotor-Nukleinsäuresequenz enthält;
– Auswahl der Pflanzenzelle, die den Promotor oder die Promotor-Nukleinsäuresequenz integriert hat;
– Vermehrung der transformierten und ausgewählten Pflanzenzelle, entweder in Kultur oder durch Regeneration von ganzen chimären oder transgenen Pflanzen.

BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
Zum besseren Verständnis der Erfindung werden im Folgenden die verschiedenen Zusammenfassungen durch nicht-limitierende Beispiele und in Bezug auf die beigelegten Zeichnungen ausführlicher beschrieben, wobei:
die 1, 2, 3 und 4 schematisch synthetische und chimäre Promotorkonstrukte in Zusammenhang mit der Erfindung repräsentieren. In 1 sind sie Konstrukte, die eine Serie von Deletionen enthalten, beginnend bei dem ganzen, aus dem Dx 5-Gen stammenden Promotor, der aus Weizen stammt und der ein hochmolekulares Weizenglutenin kodiert, und einer Serie von Konstrukten, die Elementwiederholungen enthalten, die eine „Enhancer"-Box, kombiniert mit einer „G-ähnlichen"-Box, enthält.
2 stellt schematisch Konstrukte anderer synthetischer und chimärer Promotoren im Zusammenhang mit der Erfindung dar, darin enthalten Einfügungen von regulatorischen und/oder funktionalen Elementen, die kombinierte „as1/as2"-Boxen enthalten;
3 zeigt schematisch Konstrukte anderer synthetischer und chimärer Promotoren im Zusammenhang mit der Erfindung, darin enthalten Einfügungen von regulatorischen und/oder funktionalen Elementen, die kombinierte „as2/as2/as1"-Boxen enthalten;
4 stellt schematisch Konstrukte anderer synthetischer und chimärer Promotoren im Zusammenhang mit der Erfindung dar, darin enthalten Einfügungen von regulatorischen und/oder funktionalen Elementen, die kombinierte „Getreide"-Boxen enthalten, die aus dem Bx 7-Gen stammen und ein hochmolekulares Weizenglutenin kodieren, entweder allein oder in Kombination mit „as2/as1"-Boxen, sowie eine Konstruktion, die eine „GC-reiche"-Box enthält;
5 stellt Fotografien von Tabakblättern dar, die durch Vektoren transformiert wurden, welche die oben beschriebenen Promotoren oder [lacuna] Nukleinsäuresequenzen enthalten, die funktional an das Gen gebunden sind, welches die GUS (beta-Glukuronidase) kodiert, und diese nach histochemischer Enthüllung zeigen, wobei die blauen Punkte die Anwesenheit von Zellen, die durch besagte Konstrukte transformiert wurden, und somit die Aktivität des Promotors anzeigen;
die 6 und 7 stellen Diagramme dar, in denen die Promotoraktivität in Bezug auf die verschiedenen Konstrukte nach der transienten Expression in Mais-Eiweiß verglichen wird. Drei Tage nach der Bombardierung ist das Eiweiß gemahlen und der Rohextrakt wird durch Zentrifugation geklärt. Die Aktivität der β-Glukuronidase und der Luziferase werden durch Liminometrie an einem aliquoten Teil des Rohextrakts gemessen, und dann wird die GUS-/LUC-Aktivitätsrate bestimmt. Die Histogramme entsprechen der Durschnittsrate für dasselbe Konstrukt +/–dem Standarddurchschnittsfehler (SEM).
8 zeigt ein Diagramm, in dem die Promotoraktivität von MPM139, MPM200 und MPM131 mit der des 512 gamma-zein-Promotors in stabiler Expression in Mais-Eiweiß 30 Tage nach der Bestäubung (30 DAP) verglichen wird. Entsprechend wurden die β-Glukuronidase-Aktivität und die Gesamtmenge der Proteine durch Luminometrie und Spektrometrie bestimmt. Die Histogramme entsprechen den Durchschnittsraten der GUS-Aktivität/Gesamtproteine, für jede Pflanze Samen für Samen gemessen, +/–Standarddurchschnittsfehler. Der Name einer jeden Transformante ist angegeben.
9 stellt die temporale β-Glukuronidase-Aktivität dar, die durch den Promotor MPr1139 in stabiler Expression in Mais-Eiweiß gesteuert wird. Die β-Glukuronidase-Aktivität und die Gesamtmenge der Proteine wurden durch Luminometrie und Spektrometrie bestimmt. Die Histogramme entsprechen den Durchschnittsraten der GUS-Aktivität/Gesamtproteine, für die Pflanze 151.C1 in verschiedenen Entwicklungsstadien Samen für Samen gemessen, +/–Standarddurchschnittsfehler.
10a stellt einen Längsabschnitt eines Maissamens bei 13 DAP dar, 10b zeigt einen Längsabschnitt eines Maissamens bei 20 DAP, und 10c ist ein fein geschlitzter Maissamen aus der Vogelperspektive. Alle offenbaren die β-Glukuronidase-Aktivität unter Steuerung durch den Promotor MPr1139 in stabiler Expression in Maissamen, visualisiert durch histochemische Färbung (blaue Farbe), wobei die Buchstaben die folgende Bedeutung haben: E (Embryo); Em (Endosperm); AC (Aleuronzellen); P (Perikarp)
11 zeigt ein Diagramm, in dem die Promotoraktivität von MPM139 in Maissamen der ersten Generation (T1) mit der des transgenischen Maissamens in zweiter Generation (T2) 18 Tage nach der Bestäubung (18 DAP) verglichen wird. Die β-Glukuronidase-Aktivität und die Gesamtmenge der Proteine wurden durch Luminometrie und Spektrometrie bestimmt. Die Histogramme entsprechen den Durchschnittsraten der GUS-Aktivität/Gesamtproteine, für jede Pflanze Samen für Samen gemessen, +/–Standarddurchschnittsfehler. Der Name einer jeden Transformante ist angegeben.
12 zeigt ein Diagramm, in dem die Promotoraktivität von MPM139, MPr1200 und MPr1131 mit der des 512 gamma-zein-Promotors in stabiler Expression in Maisblättern 3 Wochen nach Akklimatisierung in einem Treibhaus verglichen wird. Die β-Glukuronidase-Aktivität und die Gesamtmenge der Proteine wurden durch Luminometrie und Spektrometrie bestimmt. Die Histogramme entsprechen den Durchschnittsraten der GUS-Aktivität/Gesamtproteine, gemessen in den Blättern von verschiedenen Maisblättern. Der Name einer jeden Transformante ist angegeben.
13 zeigt ein Diagramm, in dem die Promotoraktivität von MPM130 MPM131, MPr1135, MPM138 und MPM139 mit den Referenzpromotoren CaMV D35S und HMWG-Dx5 in stabiler Expression in Tabakblättern in dem Entwicklungsstadium 11 Wochen nach Akklimatisierung in einem Treibhaus verglichen wird. Die β-Glukuronidase-Aktivität und die Gesamtmenge der Proteine wurden durch Luminometrie und Spektrometrie bestimmt. Die Histogramme entsprechen den Raten der GUS-Aktivität/Gesamtproteine gemessen in den Blättern von verschiedenen Tabakblättern.
14 zeigt ein Diagramm, in dem die Promotoraktivität von MPr1130, MPr1131, MPr1135, MPr1138 und MPr1139 mit der des Referenz-Promotors CaMV D35S in stabiler Expression in reifen Tabaksamen der ersten Generation verglichen wird. Die β-Glukuronidase-Aktivität und die Gesamtmenge der Proteine wurden durch Luminometrie und Spektrometrie bestimmt. Die Histogramme entsprechen den Raten der GUS-Aktivität/Gesamtproteine, gemessen in den Blättern von verschiedenen Tabakpflanzen.
In der folgenden ausführlichen Beschreibung wurden die enzymatischen Behandlungen, die durch die Restriktionsenzyme und die DNA-Modifikationsenzyme vorgenommen wurden, gemäß den Empfehlungen der Vertragsfirma New England Biolabs durchgeführt. In Folge jeder enzymatischen Behandlung wurde die DNA systematisch mit Hilfe von „QIAquick PCR Purification" (QIAGEN) oder "Concert Rapid PCR Purification System" (GIBCO BRL Life Technologies) nach Anweisung des Herstellers gereinigt, oder, falls so festgelegt, mit Hilfe von „QIAquick Gel Extraction" (QIAGEN) oder „Concert Rapid Gel Extraction System" (GIBCO BRL Life Technologies). Der verwendete „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler wird durch Perkin Elmer Applied Biosystems vertrieben.
BEISPIELE
Beispiel 1
Konstrukte für Vergleichszwecke (Kontrollen).
Um den Vergleich der in diesem Patent beschriebenen chimären Promotoren zu ermöglichen, wurde das uidA-Gen, das die 20 b-Glukuronidase kodiert (Jefferson et al., 1986) und die Sequenz von intron IV2 des Kartoffel-Patatin-Gen enthält S I^–-LSI (Vancanneyt et al., 1990) (uidA-/M2) unter Steuerung eines der Referenzpromotors und des Nopalin-Synthase-Gen-Terminators (term-nos) des Agrobacterium tumefaciens, in dem Plasmid pGEMSZ platziert, das durch die Promega Corp. (Madison, USA) vertrieben wird.
1.1. Konstruktion der negativen Kontrolle pMRT1144.
Das Plasmid pMRT1144 wird ohne irgendeine Promotorsequenz als negative Kontrolle verwendet. Es wird von dem Plasmid pGEMSZ abgeleitet, in das die Sequenz „uidA-IV2/term-nos" eingeführt wurde.
Zuerst wurden 5 μg des Plasmids pB1221 (Clonetech, CA, USA) 1 h bei 37°C mit den Restriktrionsenzymen EcoRI und BamHI aufgeschlossen. Die durch den Nopalin-Synthase-Terminator kontrollierte uidA-Sequenz wurde dann auf einem 0,8% Agarose-Gel mit Hilfe des "QIAquick Gel Extraction" Kits isoliert.
Parallel dazu wurden 5 μg des Plasmids pGEMSZ mit dem Restriktionsenzympaar EcoRI und BamHI 1 h lang bei 37°C aufgeschlossen. Das Vektorfragment wurde dann auf 0,8% Agarose-Gel mit Hilfe des „QIAquick Gel Extraction" Kits isoliert, und mit 40 E Calf intestine alkaline Phosphatase (New England Biolabs) in Gegenwart von Puffer 3 (1×) bei 37°C für 1 h dephosphoryliert.
Die Ligationsreaktion wurde mit 50 ng des „uidA-IV2/term-nos" Fragments und 100 ng des Plasmids pGemSZ durchgeführt, und so in einer 10 μl Reaktionsmischung unter Anwesenheit des T4 DNA Ligase-Puffers (1×) und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler behandelt. Es besteht aus einem 30 Sekunden langen Zyklus bei 10°C und 200 identischen Zyklen, die jeweils aus den folgenden Schritten bestehen: 30 Sek. bei 30°C, 30 Sek. bei 10°C und 30 Sek. bei 30°C. Escherichia coli DH5a Bakterien, die im Voraus kompetent gemacht worden waren, wurden mit der gesamten Ligations-Reaktionsmischung transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, die aus Luria-Bertani medium (LB, 10 g/l Baktotrypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl, pH 7,2 und 15 g/l Agar-Agar) ergänzt mit Ampizillin (50 mg/l) gewählt wurde, wurde nach der alkalischen Lysemethode (Birnboim and Doly, 1983) extrahiert und mit enzymatischen Aufschließungen analysiert. Das entstehende Plasmid wurde pGEM3Z/uidA/term-nos genannt.
Zweitens wurde zum Einfügen des 192-bp intron IV2 des Kartoffel-Patatin-Gens in die uidA-Kodierungssequenz von pGEM3Z/uidA/term-nos eine interne Portion dieses Gens (710-bp SnaBI/BstBI-Fragment) herausgeschnitten und dann mit der entsprechenden Sequenz, die das intron IV2 (902-bp SnaBI/BstBI-Fragment) enthält.
Dazu wurden 10 μg des Plasmids pGEM3Z/uidA/term-nos 1 h lang bei 37°C mit SnaBI (Restriktionsort an Position +383 bp unterhalb des ATG-Start-Codons des uidA-Gens lokalisiert) aufgeschlossen, und dann 1 h lang bei 65°C mit BstBI (Ort an Position +1093 bp lokalisiert). Das so aus dem 710-bp Fragment entfernte Plasmid wurde auf 0,8% Agarose-Gel mit Hilfe des „QIAquick Gel Extraction" Kits isoliert und mit 40 E Calf intestine alkaline Phosphatase (New England Biolabs) in Anwesenheit von Puffer 3 (1×) 1 h lang bei 37°C dephosphoryliert.
Das 902-bp BstBI/SnaBI-Fragment, das der Sequenz des Introns IV2 entspricht, gefolgt von der uidA-Sequenz, wurde erhalten, indem 10 μg des Plasmids p35S GUS INT (Vancanneyt et al., 1990) mit dem Restriktionsenzym SnaBI (Restriktionsort an Position +383 bp unterhalb des ATG-Start-Codons des uidA-Gens lokalisiert) 1 h lang bei 37°C aufgeschlossen wurde, und das Restriktionsenzym BstBI (Ort an Position +1285 bp lokalisiert) 1 h lang bei 37°C. Das 902-bp-Fragment wurde dann auf 1% Agarose-Gel mit Hilfe des „Concert Rapid Gel Extraction System" Kits isoliert.
Die Ligationsreaktion wurde mit 100 ng des Vektors pGEM3Z/uidA/term-nos und 50 ng des so behandelten 902 bp BstBI/SnaBI-Fragments in einer 10 μl Reaktionsmischung in Anwesenheit des T4 DMA Ligase-Puffers (1×) und 400 Einheiten T4 DMA-Ligase (New England Biolabs) im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler wie oben beschrieben behandelt. Escherichia coli DH5a Bakterien, die im Voraus kompetent gemacht worden waren, wurden mit der gesamten Ligations-Reaktionsmischung transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, die aus LB-Medium, ergänzt mit Ampizillin (50 mg/l) gewählt wurde, wurde nach der alkalischen Lysemethode extrahiert und mit enzymatischen Aufschließungen analysiert. Das erhaltene Plasmid wurde pMRT1144 genannt.
1.2. Konstruktion der positiven Kontrolle pMRT1218.
Um eine Referenzsequenz zu haben, die ein Promotor im Mais-Eiweiß SN 87 165 (L2) ist, wurde der 1.7-kb ganze g-zein Promotor (Prg-zein), der im Plasmid p63 enthalten ist, beschrieben von Reina et al. (1990), oberhalb der Sequenz uidA-IV2/term-nos platziert.
Der 1.7-kb g-zein Promotor wurde durch Aufschließung von 15 μg des Plasmids p63 mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI 1 h lang bei 37°C erhalten. Das so gelöste 1.7-kb Prg-zein-Fragment wurde auf 0,8% Agarose-Gel mit Hilfe des „Concert Rapid Gel Extraction System" Kits isoliert.
Parallel dazu wurden auch 10 μg des Plasmids pMRT1126 (beschrieben in Abschnitt 3.4 von Beispiel 3) mit dem Restriktionsenzympaar HindIII und BamHI 1 h lang bei 37°C aufgeschlossen. Das Vektorfragment wurde dann auf 0,8% Agarose-Gel mit Hilfe des „QIAquick Gel Extraction" Kits isoliert, und mit 40 E Calf intestine alkaline Phosphatase (New England Biolabs) in Gegenwart von Puffer 3 (1×) bei 37°C für 1 h dephosphoryliert.
Die Ligationsreaktion wurde mit 50 ng des g-zein-Promotor-Fragments und 100 ng des so behandelten Plasmids pMRT1126 durchgeführt und in einer 10 μl Reaktionsmischung unter Anwesenheit des T4 DMA Ligase-Puffers (1×) und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler behandelt. Escherichia coli DH5a Bakterien, die im Voraus kompetent gemacht worden waren, wurden mit der gesamten Ligations-Reaktionsmischung transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, die aus LB-Medium, ergänzt mit Ampizillin (50 mg/l) gewählt wurde, wurde nach der alkalischen Lysemethode extrahiert und mit enzymatischen Aufschließungen analysiert. Das erhaltene Plasmid wurde pMRT1218 genannt.
1.3. Konstruktion der positiven Kontrolle pMRT1092.
Um eine Referenzsequenz zu haben, die ein Promotor in den photosynthetischen Geweben von Tabak ist (Nicotiana tabacum L, cultivar PBD6), wurde der Doppel-35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV PrD35S) oberhalb der Sequenz uidA-IV2/term-nos platziert.
Zuerst wurde das 192-bp Intron IV2 des Kartoffel-Patatin-Gens in die uidA Kodierungssequenz an der Position +383 bp wie in Abschnitt 1.1 beschrieben eingefügt. Dazu wurde 1 μg des Plasmids pBI221 (Clontech, CA, USA) 1 h 30 Min. bei 37°C mit SnaBI und dann 1 h 30 Min. bei 65°C mit BstBI aufgeschlossen. Das Plasmid, aus dem ein 710-bp-Fragment entfernt wurde, wurde auf einem 0,8% Agarose-Gel isoliert und dann auf einer Qiaquick-Affinitätsspalte gereinigt. Eine Menge von 20 ng des BstBI/SnaBI pBI221 Vektors und 80 ng des 902-bp BstBI/SnaBI Fragments aus dem oben beschriebenen p35S GUS INT wurden über Nacht bei 18°C in einer 10 μg Reaktionsmischung in Anwesenheit des T4 DNA Ligase-Puffers (1×) und 400 Einheiten T4 DNA Ligase-Enzym (New England Biolabs) ligiert. Escherichia coli DH5a Bakterien, die im Voraus kompetent gemacht worden waren, wurden mit der Hälfte der Ligations-Reaktionsmischung transformiert. Die DNA der erhaltenen Klone, die aus LB-Medium, ergänzt mit Ampizillin (50 mg/l) gewählt wurde, wurde nach der alkalischen Lysemethode extrahiert und mit enzymatischen Aufschließungen analysiert. Das erhaltene Plasmid wurde pBI221/uidA-IV2 genannt.
Als zweites wurde die Sequenz des CaMV 35S-Promotors, der im Plasmid pBI221/uidA-IV2 vorhanden war, durch die Sequenz des „CaMV PrD35S" ersetzt. Das Plasmid pBI221/uidA-IV2 wurde 10 h 30 Min. lang bei 37°C mit HindIII aufgeschlossen und dann wurden die klebrigen Enden durch das Klenow-Fragment (New England Biolabs) in 30 Min bei 37°C geglättet. Das Produkt dieser Reaktion wurde dann über Nacht bei 37°C mit BamHI aufgeschlossen. Das Plasmid-DNA-Fragment, das dem Vektor entspricht, der aus dem 828-bp CaMV 35S Promotor-Fragment entfernt wurde, wurde auf einem 0,8% Agarose-Gel isoliert und dann auf einer Qiaquick-Affinitätsspalte gereinigt.
Parallel dazu wurde der CaMV D35S-Promotor aus dem Plasmid pJIT163D erhalten. Dieses Plasmid ist aus dem Plasmid pJIT163 abgeleitet, das selbst aus dem Plasmid pJIT160 abgeleitet wurde (Guerineau und Mullineaux, 1993). Das Plasmid pJIT163 besitzt ein ATG-Codon zwischen den HindIII- und SaiI-Orten des Polylinkers. Um dieses ATG zu entfernen und um das Plasmid pJIT163D zu erhalten, wurde die pJIT163 Plasmid-DNA mit HindIII und SaiI aufgeschlossen, auf einem 0,8% Agarose-Gel gereinigt, elektro-eluiert, in Anwesenheit von 1/10 Volumen 3 M-Natriumacetat pH 4,8, und 2,5 Volumen wasserfreiem Ethanol bei –80°C 30 Min ausgefällt, bei 12,000 g 30 Min zentrifugiert, mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet, der Aktion des Klenow-Fragments (New England Biolabs) 30 Min bei 37°C unterworfen, durch Extraktion mit einem Volumen Phenol deproteinisiert, dann mit einem Volume Phenol/Chloroform/Isoamyl-Alkohol (25/24/1 v/v/v) und schließlich mit einem Volumen Chloroform/Isoamyl-Alkohol (24/1 v/v), ausgefällt in Anwesenheit von 1/10 Volume 3 M-Natriumacetat, pH 4,8, und 2,5 Volumen von wasserfreiem Ethanol bei –80°C für 30 Min, dann bei 12,000 g für 30 Min zentrifugiert, mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und schließlich in Anwesenheit des T4 DMA Ligase-Puffers (1×) und 2,5 Einheiten T4 DMA-Ligase (Amersham) bei 14°C für 16 h ligiert. Escherichia coli DH5a Bakterien, die im Voraus kompetent gemacht worden waren, wurden transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, die aus LB-Medium, ergänzt mit Ampizillin (50 mg/l) gewählt wurde, wurde nach der alkalischen Lysemethode extrahiert und mit enzymatischen Aufschließungen analysiert. Als nächstes wurden 10 μg des Plasmids pJIT163D 10 h 30 Min. bei 37°C mit KpnI (Ort bei 5' des Promotors lokalisiert) aufgeschlossen, und dann wurden die klebrigen Enden mit 6 Einheiten T4 DMA-Polymerase (New England Biolabs) 30 Min lang bei 37°C geglättet. Das Produkt dieser Reaktion wurde dann über Nacht bei 37°C mit BamHI aufgeschlossen. Das erhaltene 761-bp-Fragment, das dem CaMV D35S-Promotor entspricht, wurde auf einem 1% Agarose-Gel isoliert und dann auf einer Qiaquick-Affinitätsspalte gereinigt. Die Ligation wurde mit 10 ng des Plasmid-Vektors und 100 ng des 761-bp-Fragments in einer 10 μl Reaktionsmischung in Anwesenheit des T4 DMA-Ligase-Puffers (1×) und 400 Einheiten T4 DMA-Ligase (New England Biolabs) über Nacht bei 18°C durchgeführt. Escherichia coli DH5a Bakterien, die im Voraus kompetent gemacht worden waren, wurden mit der Hälfte der Ligations-Reaktionsmischung transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, die aus LB-Medium, ergänzt mit Ampizillin (50 mg/l) gewählt wurde, wurde nach der alkalischen Lysemethode extrahiert und mit enzymatischen Aufschließungen analysiert. Das erhaltene Plasmid wurde pMRT1092 genannt. 1.3. Beschreibung des Referenzplasmids pCaMV35Sluc.
Das als interne Referenz in der transienten Expression verwendete Plasmid ist pCaMVSSSluc (Torrent et al., 1997), das die Kassette zur Expression des Luziferase-(luc)Indikatorgens unter Kontrolle des CaMV 35S Promotors und des RNA-Terminators enthält.
Beispiel 2.
Konstruktion von Plasmiden, welche die vollständige Promotorsequenz und entnommene oder duplizierte Promotorsequenzen eines hochmolekularen Weizenglutenin-Gens enthalten.
Der vollständige Promotor (PrHMWG-Dx5 (SEQ.ID01)) des hochmolekularen Weizenglutenin-Gens, das die Dx5 25 Untereinheit, auch bezeichnet als GluD1-1b des hexaploiden Weizens Triticum aestivum L. cv Cheyenne (Anderson et al., 1989) kodiert, entspricht einer 417-bp Sequenz (Zugangsnr. X12928), die sich von Position –378 bp zu Position +39 bp erstreckt, an der diverse potentiell regulatorische Sequenzen identifiziert werden und an der 5' Steile in Richtung der 3' Stelle gelistet sind, mit Bezug auf den +1 Transkriptionsstartpunkt (I):

– eine Prolamin-„ähnliche" Box, die sich von Position –357 zu Position –350 bp erstreckt,
– zwei GATA-Boxen, die sich von Position –309 zu Position –306 bp und von Position –292 zu Position –289 bp erstrecken,
– eine Prolamin-„ähnliche" Box, die sich von Position –252 zu Position –246 bp erstreckt,
– eine 8-bp G-„ähnliche" Box, die sich von Position –218 zu Position –211 bp erstreckt,
– ein 38-bp aktivierendes Element, das sich von Position –186 zu Position –149 bp erstreckt und aus einem Mosaik aus putativen cis-aktivierenden Motiven zusammengesetzt ist:
• eine Prolamin-Box, die sich von Position –182 zu Position –176 bp erstreckt,
• eine Sequenz mit fehlerhafter Symmetrie, die sich von Position –178 zu Position –161 bp erstreckt,
• eine direkte Wiederholung des Pentanukleotids GCTCC zwischen den Positionen –176 und –163 bp, eine „E"-Box, die sich von Position –172 zu Position –167 [lacuna] erstreckt,
• eine direkte Wiederholung des Pentanukleotids TTGCT zwischen den Positionen –169 und –158 bp,
– eine „TATA"-Box, die von Position 30 bis Position –24 [lacuna] die Consensus-Sequenz TATAAAA aufweist,
– den +1-Transkriptionsstartpunkt (Position 1),
– eine untranslatierte 5' Region, die sich von Position +1 zu Position +39 bp erstreckt.

Um die Auswirkungen der oben beschriebenen verschiedenen putativen cis-aktivierenden Elemente zu studieren, wurde eine ausführliche funktionale Analyse des HMWG-Dx5 Promotors (SEQ.ID01) durchgeführt.
Das uidA-IV2 Indikatorgen wurde unter die Steuerung des vollständigen HMWG-Dx5 Promotors (SEQ.ID01) und unter die Steuerung der synthetischen HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) Promotor gestellt, die entweder zunehmende Deletionen der 5' Regionen oder eine interne Deletion oder Duplikationen einer internen Portion aufweisen.
2.1. Konstruktion des Plasmids pbMT1125.
Das Plasmid pMRT1125 ist das Ergebnis des Klonens des vollständigen Promotors des hochmolekularen Weizenglutenin-Gens (PrHMWG-Dx5 (SEQ.ID01), I) oberhalb des uidA-IV2 Indikatorgens und stellt das Referenzkonstrukt für alle in diesem Patent beschriebenen synthetischen HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) Promotor dar.
Der von Anderson et al. (1989) beschriebene HMWG-Dx5 Promotor (SEQ.ID01) wurde aus der Expressionskassette „PrHMWG-Dx5 (SEQ.ID01)/uidA/term-nos" erhalten, die mit den üblichen Klontechniken in ein pUC19 Plasmid (Stratagene) eingefügt wurde. Zehn μg des erhaltenen Plasmids (pPUC19-HMWG) wurden mit EcoRI 1 h lang bei 37°C hydrolysiert und der Einwirkung von 20 E des Klenow-Fragments (New England Biolabs) 30 Min lang bei 37°C in Anwesenheit von 60 nmol jeder der dNTPs, von 12 μl 500 mM Tris-HCL, pH 7.5/500 mM MgCl2 Puffer und 6 μl von 1 M dithiothreitol (DTT) ausgesetzt. Die DNA wurde dann mit BamHI 1 h lang bei 37°C aufgeschlossen und das so erhaltene und behandelte HMWG-Dx5 Promotor-Fragment (SEQ.ID01) wurde auf 1,5% Agarose-Gel mit Hilfe des "QIAquick Gel Extraction" Kits isoliert.
Parallel dazu wurde das Vektorfragment aus dem Plasmid pMRT1097 präpariert (unveröffentlichte französische Patentanmeldung FR 9903635 ). Zwanzig μg des Plasmids pMRT1097 wurden 1 h lang bei 37°C mit SphI aufgeschlossen und die klebrigen Enden des so linearisierten Vektors pMRT1097 wurden unter Verwendung von 6 E des T4 DMA Polymerase-Enzyms (New England Biolabs) 30 Min lang bei 37°C geglättet. Das Produkt dieser Reaktion wurde dann mit BamHI hydrolysiert, und das Vektorfragment wurde auf 0,8% Agarose-Gel mit Hilfe des "QIAquick Gel Extraction" Kits isoliert, bevor es mit 40 E Calf intestine alkaline Phosphatase (New England Biolabs) in Anwesenheit von Puffer 3 (1×) bei 37°C für 1 h dephosphoryliert wurde. Der erhaltene Klonungsvektor wurde pGEM3Z-1 genannt.
Die Ligation wurde mit 100 ng des so behandelten HMWG-Dx5 Promotor-Fragments (SEQ.ID01) und 50 ng des Plasmids pGem3Z-1 über Nacht bei 16°C in einer 10 μl Reaktionsmischung in Anwesenheit des T4 DNA Ligase-Puffers (1×) und 400 Einheiten T4 DNA Ligase (New England Biolabs) durchgeführt. Escherichia coli DH5a Bakterien, die im Voraus kompetent gemacht worden waren, wurden mit der gesamten Ligations-Reaktionsmischung transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, die aus LB-Medium, ergänzt mit Ampizillin (50 mg/l) gewählt wurde, wurde nach der alkalischen Lemethode extrahiert und mit enzymatischen Aufschließungen analysiert.
Das erhaltene Plasmid wurde pMRT1125 genannt und der HMWG-Dx5 Promotor (SEQ.ID01) (schematisch in 1 dargestellt) wurde durch Sequenzierung überprüft.
2.2. Konstruktion des MPM128 Promotors.
Der MPR1128 Promotor (SEQ.ID04) wird aus PrHMWG-Dx5 (SEQ.ID01) abgeleitet, indem die oberhalb von Nukleotid –238 lokalisierte Sequenz entnommen wird, welche die beiden Prolamin-„ähnlichen" Boxen und die beiden GATA-Boxen enthält. Das Promotorfragment wurde durch PCR aus 5 ng von pMRT1125 Matrix-DNA (beschrieben in Abschnitt 2.1 von Beispiel 2) mit Hilfe von 100 pmol jeder der beiden 2 Oligodeoxynukleotide 5' ATCGGAATTCCAGAACTAGGATTACGCCG 3' verstärkt, welche den EcoRI Restriktionsort enthält, sowie 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3', welche den BamHI Restriktionsort besitzt, und das in Anwesenheit von 50 nmol jeder der dNTPs, des Vent DNA Polymerase-Puffers (1×) und 2 E Vent DNA-Polymerase (New England Biolabs). Die PCR-Verstärkungsreaktion wurde im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler durchgeführt. Nach einer Denaturation bei 94°C für 5 Min. wurde die DNA 30 Zyklen unterworfen, die jeweils aus den Schritten Denaturierung bei 94°C für 1 Min., Hybridisierung bei 50°C für 1 Min. und Elongation bei 72°C für 1 Min. 30 Sek. bestanden. Während des letzten Zyklus wurde die Elongation bei 72°C für 5 Min fortgesetzt.
Das DNA-Fragment, das aus der Verstärkung abgeleitet wurde, wurde auf 1,5% Agarose-Gel mit Hilfe des "QIAquick Gel Extraction" Kits isoliert, mit EcoRI 1 h lang bei 37°C hydrolysiert und der Aktion von 20 E des Klenow-Fragments (New England Biolabs) für 30 Min bei 37°C in Anwesenheit von 60 nmol jeder der dNTPs, von 12 μl 500 mM Tris-HCL, pH 7,5/500 mM MgCl2 Puffer und 6 μl von 1 M DTT ausgesetzt. Die so behandelte DNA wurde dann mit BamHI 1 h lang bei 37°C aufgeschlossen.
Die Ligation wurde mit 100 ng des so erhaltenen MPR1128 Promotor-Fragments (SEQ.ID04) und 50 ng des Plasmids pGEM3Z-1 (beschrieben in Abschnitt 2.1 von Beispiel 2) über Nacht bei 16°C in einer 10 μl Reaktionsmischung in Anwesenheit des T4 DNA Ligase-Puffers (1×) und 400 Einheiten T4 DNA Ligase (New England Biolabs) durchgeführt. Escherichia coli DH5a Bakterien, die im Voraus kompetent gemacht worden waren, wurden mit der gesamten Ligations-Reaktionsmischung transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, die aus LB-Medium, ergänzt mit Ampizillin (50 mg/l) gewählt wurde, wurde nach der alkalischen Lysemethode extrahiert und mit enzymatischen Aufschließungen analysiert.
Das erhaltene Plasmid wurde pMRT1128 genannt und die schematisch in I dargestellte MPR1128 Promotor-Sequenz (SEQ.ID04) wurde durch Sequenzierung überprüft.
2.3. Konstruktion des MPM127 Promotors (SEQ.ID03).
Der MPr1127 Promotor (SEQ.ID03) wird aus dem HMWG-Dx5 Promotor (SEQ.ID01) abgeleitet, indem die oberhalb von Nukleotid –205 lokalisierte Sequenz entnommen wird, welche die beiden Prolamin-„ähnlichen" Boxen, die beiden GATA-Boxen und die „G"-Box enthält. Das Promotorfragment wurde durch PCR verstärkt und auf die gleiche Weise behandelt wie der MPR1128 55 Promotor (SEQ.ID04) (beschrieben in Abschnitt 2.2 von Beispiel 2), außer dass die verwendeten 2 Oligodeoxynukleotide 5' ATCGGGAATTCGCAGACTGTCCAAAAAATC 3' sind, welche den EcoRI Restriktionsort enthält, und 5' TACggATCCCCg-gggATCTCTAgTTTgTggTgC 3', welche den BamHI Restriktionsort besitzt.
Das erhaltene Plasmid wurde pMRT1127 genannt und die schematisch in I dargestellte MPM127 Promotor-Sequenz (SEQ.ID3) wurde durch Sequenzierung überprüft.
2.4. Konstruktion des MPM126 Promotors (SEQ.ID02).
Der MPr1126 Promotor (SEQ.ID02) wird aus dem HMWG-Dx5 Promotor (SEQ.ID01) abgeleitet, indem die oberhalb von Nukleotid –142 lokalisierte Sequenz entnommen wird, welche die beiden Prolamin-„ähnlichen" Boxen, die beiden GATA-Boxen, die „G"-Box und das aktivierende Element enthält. Das Promotorfragment wurde durch PCR verstärkt und auf die gleiche Weise behandelt wie der MPR1128 Promotor (SEQ.ID04) (beschrieben in Abschnitt 2.2 von Beispiel 2), außer dass die verwendeten 2 Oligodeoxynukleotide 5' ATCGGAATTCGTGTTGGCAAACTGC 3' sind, welche den EcoRI Restriktionsort enthält, und 5' TACggATC-CCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3', welche den BamHI Restriktionsort besitzt. Das erhaltene Plasmid wurde pMRT1126 genannt und die schematisch in I dargestellte MPM126 Promotor-Sequenz (SEQ.ID02) wurde durch Sequenzierung überprüft.
2.5. Konstruktion des MPM183 Zwischenpromotors.
Der MPr1183 Promotor resultiert aus der Einfügung einem XbaI Restriktionsort oberhalb des MPR1128 Promotors (SEQ.ID04) (beschrieben in Abschnitt 2.2 von Beispiel 2). Das Promotorfragment wurde durch PCR aus 5 ng von pMRT1128 Matrix-DNA mit Hilfe von 100 pmol jeder der beiden 2 Oligodeoxynukleotide 5' ATCggAATTCTAgACgCCgATTACgT-ggCTTTAgC 3' verstärkt, welche den EcoRI und XbaI Restriktionsort enthält, sowie 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3', welche den BamHI Restriktionsort besitzt, und das in Anwesenheit von 50 nmol jeder der dNTPs, des Vent DNA Polymerase-Puffers (1×) und 2 E Vent DNA-Polymerase (New England Biolabs). Die PCR-Verstärkungsreaktion wurde im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler durchgeführt. Nach einer Denaturation bei 94°C für 5 Min. wurde die DNA 30 Zyklen unterworfen, die jeweils aus den Schritten Denaturierung bei 94°C für 1 Min., Hybridisierung bei 50°C für 1 Min. und Elongation bei 72°C für 1 Min. 30 Sek. bestanden. Während des letzten Zyklus wurde die Elongation bei 72°C für 5 Min fortgesetzt.
Das DNA-Fragment, das aus der Verstärkung abgeleitet wurde, wurde auf 1,5% Agarose-Gel mit Hilfe des „Concert Rapid Gel Extraction" Kits isoliert, mit EcoRI 1 h lang bei 37°C hydrolysiert und der Aktion von 20 E des Klenow-Fragments (New England Biolabs) für 30 Min bei 37°C in Anwesenheit von 60 nmol jeder der dNTPs, von 12 μl 500 mM Tris-HCL, pH 7,5/500 mM MgCl2 Puffer und 6 μl von 1 M DTT ausgesetzt.
Die Ligation wurde mit 100 ng des so behandelten MPR1128 Promotors und 50 ng des Plasmids pGem3Z-1 (beschrieben in Abschnitt 2.1 von Beispiel 2) über Nacht bei 16°C in einer 10 μl Reaktionsmischung in Anwesenheit des T4 DNA Ligase-Puffers (1×) und 400 Einheiten T4 DNA Ligase (New England Biolabs) durchgeführt. Escherichia coli DH5a Bakterien, die im Voraus kompetent gemacht worden waren, wurden mit der gesamten Ligations-Reaktionsmischung transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, die aus LB-Medium, ergänzt mit Ampizillin (50 mg/l) gewählt wurde, wurde durch PCR mit Hilfe von 25 pmol jeder der 2 Oligodeoxynukleotide 5' ATCggAATTCgCAgCCATggTCCTgAACC 3' und 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3', in Anwesenheit von 15 nmol jeder der dNTPs, des Taq DNA Polymerase-Puffers (1×), 75 nmol MgCl2 und 1,25 E Taq DNA Polymerase (Promega Corp.) in einem 50 μl Reaktionsvolumen analysiert. Die Verstärkungsreaktion wurde im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler durchgeführt. Nach einer Denaturation bei 94°C für 5 Min. wurde die DNA 25 Zyklen unterworfen, die jeweils aus den Schritten Denaturierung bei 94°C für 30 Sek., Hybridisierung bei 55°C für 1 Min. und Elongation bei 72°C für 1 Min. bestanden. Während des letzten Zyklus wurde die Elongation bei 72°C für 5 Min fortgesetzt.
Das erhaltene Plasmid wurde pMRT1183 genannt und die MPr1183 Promotorsequenz wurde durch Sequenzierung überprüft.
2.6. Konstruktion des MPM197 Promotors (SEQ.ID12)
Der MPM197 Promotor (SEQ.ID2) wird aus MPM183 (beschrieben in Abschnitt 2.5 von Beispiel 2) abgeleitet, indem die oberhalb von Nukleotid –57 lokalisierte Sequenz entnommen wird, und sie legt die minimalen in diesem Patent untersuchten HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) Promotor fest.
Dazu wurden 5 μg des Plasmids pMRT1183 sukzessiv 1 h lang bei 37°C mit XbaI und NcoI aufgeschlossen. Der so aus dem XbaI/NcoI-Fragment des MPr1183 Promotors entnommene Vektor pMRT1183 wurde auf einem 0,8% Agarose Gel mit Hilfe des „Concert Rapid Gel Extraction System" Kits isoliert, und der Aktion von 20 E des Klenow-Fragments (New England Biolabs) 30 Min bei 37°C in Anwesenheit von 60 nmol jeder der dNTPs, 12 μl 550 mM Tris-HCL, pH 7,5/500 mM MgCl2 Puffer und 6 μl von 1 M DTT ausgesetzt.
Die Ligationsreaktion wurde mit 150 ng des so modifizierten Plasmids in einer 10 μl Reaktionsmischung in Anwesenheit des T4 DNA Ligase-Puffers (1×) und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) wie oben beschrieben im „GeneAmp 55 PCR System 9700" Thermocycler durchgeführt. Escherichia coli DH5a Bakterien, die im Voraus kompetent gemacht worden waren, wurden mit der gesamten Ligations-Reaktionsmischung transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, die aus LB-Medium, ergänzt mit Ampizillin (50 mg/l), gewählt wurde, wurde nach der alkalischen Lysemethode extrahiert und mit enzymatischen Aufschließungen analysiert.
Das erhaltene Plasmid wurde pMRT1197 genannt und die MPr1197 Promotorsequenz (SEQ.ID12) wird schematisch in I dargestellt.
2.7. Konstruktion des MPM198 Promotors (SEQ.ID13)
Der MPM198 Promotor (SEQ.ID13) wird von dem MPR1128 Promotor (SEQ.ID04) (beschrieben in Abschnitt 2.2 von Beispiel 2) abgeleitet, indem die interne Promotorsequenz entnommen wird, die sich von Position –59 zu Position –135 bp erstreckt, wobei in dieser Sequenz die oben identifizierten cis-aktivierenden Elemente fehlen.
Es wurde konstruiert, indem an dem NcoI-Restriktionsort von pMRT1183 (beschrieben in Abschnitt 2.5 von Beispiel 2), ein durch PCR verstärktes Fragment aus 5 ng pMRT1128 Matrix-DMA mit Hilfe von 100 pmol jeder der 2 Oligodeoxynucleotides 5' ATCggAATTCTAgACgCCgATTACg7ggCTTTAgC 3', welche die EcoRI und XbaI Restriktionsorte enthalten, und 5' CATgCCATggCCAACACAAAAg-AAgCTgg 3', welche den NcoI Restriktionsort besitzen, in Anwesenheit von 50 nmol jeder der dNTPs, von Vent DMA-Polymerase-Puffer (1×) und 2 E Vent DMA Polymerase (New England Biolabs) fusioniert wurden. Die PCR-Verstärkungsreaktion wurde im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler durchgeführt. Nach einer Denaturation bei 94°C für 10 Min. wurde die DNA 25 Zyklen unterworfen, die jeweils aus den Schritten Denaturierung bei 94°C für 1 Min., Hybridisierung bei 55°C für 1 Min. und Elongation bei 72°C für 1 Min. 30 Sek. bestanden. Während des letzten Zyklus wurde die Elongation bei 72°C für 5 Min fortgesetzt. Das durch die Verstärkung abgeleitete DMA-Fragment wurde auf 1,5% Agarose-Gel mit Hilfe des „Concert Rapid Gel Extraction System" Kits isoliert und sukzessiv für 1 h bei 37°C mit NcoI und XbaI hydrolysiert.
Parallel dazu wurde das Vektorfragment aus dem Plasmid pMRT1183 präpariert, indem die 5' vom NcoI Restriktionsort lokalisierte MPr1183 Promotorregion entnommen wurde. Dazu wurden 5 μg des Plasmids pMRT1183 sukzessiv 1 h bei 37°C mit XbaI und NcoI aufgeschlossen, und das Vektorfragment von pMRT1183 wurde auf 0,8% Agarose-Gel mit Hilfe des „Concert Rapid Gel Extraction System" Kits isoliert, bevor es mit 40 E Calf intestine alkaline Phosphatase (New England Biolabs) in Anwesenheit von Puffer 3 (1×) bei 37°C für 1 h dephosphoryliert wurde.
Die Ligationsreaktion wurde mit 50 ng des Promotor-Fragments und 100 ng des so behandelten Plasmids in einer 10 μl Reaktionsmischung in Anwesenheit des T4 DMA Ligase-Puffers (1×) und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler behandelt. Escherichia coli DH5a Bakterien, die im Voraus kompetent gemacht worden waren, wurden mit der gesamten Ligations-Reaktionsmischung transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, die aus LB-Medium, ergänzt mit Ampizillin (50 mg/l) gewählt wurde, wurde nach der alkalischen Lysemethode extrahiert und mit enzymatischen Aufschließungen analysiert.
Das erhaltene Plasmid wurde pMRT1198 genannt und die schematisch in I dargestellte MPM198 Promotor-Sequenz (SEQ.ID13) wurde durch Sequenzierung überprüft.
2.8. Konstruktion des MPM216 Promotors (SEQ.ID17).
Der MPM216 Promotor (SEQ.ID17) wird von MPR1128 (SEQ.ID04) (beschrieben in Abschnitt 2.2 von Beispiel 2) abgeleitet, indem die Sequenz dupliziert wird, die sich von Position –225 zu Position –136 bp erstreckt, wobei diese Sequenz die „G"-Box und das aktivierende Element enthält.
Sie wurde konstruiert, indem in den Vektor pGEM3Z-1 (beschrieben in Abschnitt 2.1 von Beispiel 2) die folgenden beiden Promotorfragmente geklont wurden:
Das „MPM216 (SEQ.ID17) 5' Fragment", synthetisiert durch PCR, wurde aus 5 ng pMRT1128 Matrix-DNA mit Hilfe von 100 pmol jeder der 2 Oligodeoxynucleotides 5' ATCggAATTCgCCgATTACgTggCTTTAgC 3', welche den EcoRI Restriktionsort enthält, und 5'gCTCTAgACCAACACAAAAgAAgCTgg 3', das den XbaI Restriktionsort besitzt, und das in Anwesenheit von 50 nmol jeder der dNTPs, von Vent DNA Polymerase-Puffer (1×) und 2 E Vent DNA Polymerase (New England Biolabs) verstärkt. Die PCR-Verstärkungsreaktion wurde im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler durchgeführt. Nach einer Denaturierung bei 94°C für 10 Min. wurde die DNA 25 Zyklen unterzogen, die jeweils aus den Schritten Denaturierung bei 94°C für 1 Min., Hybridisierung bei 55°C für 1 Min. und Elongation bei 72°C für 1 Min. 30 Sek besteht. Während des letzten Zyklus wurde die Elongation bei 72°C für 5 Min. fortgesetzt. Das durch die PCR-Verstärkung abgeleitete DNA-Fragment wurde auf 1,5% Agarose-Gel mit Hilfe des „Concert Rapid Gel Extraction System" Kits isoliert und mit EcoRI 1 h bei 37°C hydrolysiert. Das DNA-Fragment wurde dann der Aktion von 20 E des Klenow-Fragments (New England Biolabs) 30 Min lang bei 37°C in Anwesenheit von 60 nmol jeder der dNTPs, von 12 μl 500 mM Tris-HCL, pH 7,5/500 mM MgCl2 Puffer und 6 μl von 1 M DTT unterworfen, und mit XbaI für 1 h bei 37°C aufgeschlossen. Das „MPM216 (SEQ.ID17) 3' Fragment", erhalten durch die Hydrolyse von 5 μg des Plasmids pMRT1183 mit den Restriktionsenzymen XbaI und BamHI, wurde auf einem 1,5% Agarose-Gel mit Hilfe des „Concert Rapid Gel Extraction System" Kits isoliert.
Die Ligationsreaktion wurde mit 50 ng des „MPM216 (SEQ.ID17) 5'-Fragments" und 5 ng des so behandelten „MPr1216 (SEQ.ID17) 3' Fragments" und 50 ng des Plasmids pGem3Z-1 in einer 10 μl Reaktionsmischung unter Anwesenheit des T4 DMA Ligase-Puffers (1×) und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler wie oben beschrieben durchgeführt. Escherichia coli DH5a Bakterien, die im Voraus kompetent gemacht worden waren, wurden mit der gesamten Ligations-Reaktionsmischung transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, die aus LB-Medium, ergänzt mit Ampizillin (50 mg/l) gewählt wurde, wurde durch PCR mit Hilfe von 10 pmol von jeder der 2 Oligodeoxynucleotides 5' ATCggAATTCgCCgATTACgTggCTTTAgC 3' und 5' TACggATCCCCg-gggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler wie oben beschrieben analysiert.
Das erhaltene Plasmid wurde pMRT1216 genannt und die schematisch in I dargestellte MPM216 Promotor-Sequenz (SEQ.ID17) wurde durch Sequenzierung überprüft.
2.9. Konstruktion des MPM217 Promotors (SEQ.ID37).
Der MPr1217 Promotor (SEQ.ID37) wird von MPR1128 (SEQ.ID04) (beschrieben in Abschnitt 2.2 von Beispiel 2) abgeleitet, indem die Sequenz wiederholt verdreifacht wird, die sich von den Nukleotiden –225 bis –136 bp erstreckt, wobei diese Sequenz die „G"-Box und das aktivierende Element enthält.
Der MPM217 Promotor (SEQ.ID37) wurde konstruiert, indem in den XbaI Restriktionsort von pMRT1183 (beschrieben in 2.5 von Beispiel 2), zwei identische Promotorfragmente eingefügt wurden, synthetisiert durch PCR aus 5 ng Matrix-DMA mit Hilfe von 100 pmol jedes der 2 Oligodeoxynukleotide 5' ATCggAATTCTAgACgCCgATTACgTggCTTTAgC 3', das die EcoRI und XbaI Restriktionsorte enthält, und 5' gCTCTAgACCAACACAAAAgAagCTgg 3', das den XbaI Restriktionsort besitzt, in Anwesenheit von 50 nmol jeder der dNTPs, von Vent DMA Polymerase-Puffer (1×) und von 2 E Vent DMA-Polymerase (New England Biolabs) besitzt. Die PCR-Verstärkungsreaktion wurde im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler durchgeführt. Nach einer Denaturation bei 94°C für 10 Min. wurde die DNA 25 Zyklen unterworfen, die jeweils aus den Schritten Denaturierung bei 94°C für 1 Min., Hybridisierung bei 55°C für 1 Min. und Elongation bei 72°C für 1 Min. 30 Sek. bestanden. Während des letzten Zyklus wurde die Elongation bei 72°C für 5 Min fortgesetzt. Das durch die PCR-Verstärkung abgeleitete DNA-Fragment wurde auf 1,5% Agarose-Gel mit Hilfe des „Concert Rapid Gel Extraction System" Kits isoliert und nacheinander für 1 h bei 37°C mit NcoI und XbaI hydrolysiert.
Parallel dazu wurde das Vektorfragment aus 10 μg des Plasmids pMRT1183 durch enzymatische Aufschließung des Restriktionsorts, der sich an 5' von MPr1183 befindet, 1 h lang bei 37°C vorbereitet. Das so linearisierte Vektorfragment wurde mit 40 E Calf intestine alkaline Phosphatase (New England Biolabs) in Anwesenheit von Puffer 3 (1×) bei 37°C für 1 h dephosporyliert.
Die Ligationsreaktion wurde mit 50 ng des Promotorfragments und 100 ng des so präparierten Vektorfragment in einer 10 μl Reaktionsmischung in Anwesenheit des 1 × T4 DMA Ligase-Puffers (New England Biolabs) und 400 Einheiten T4 DMA Ligase (New England Biolabs) im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler wie oben beschrieben durchgeführt. Escherichia coli DH5a Bakterien, die im Voraus kompetent gemacht worden waren, wurden mit der gesamten Ligations-Reaktionsmischung transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, die aus LB-Medium, ergänzt mit Ampizillin (50 mg/l) gewählt wurde, wurde durch PCR mit Hilfe von 10 pmol von jeder der 2 Oligodeoxynucleotides 5' ATCggAAT-TCgCCgATTACgTggCTTTAgC 3' und 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler wie oben beschrieben analysiert.
Das erhaltene Plasmid wurde pMRT1217 genannt und die schematisch in I dargestellte MPM217 Promotor-Sequenz (SEQ.ID37), die durch Sequenzierung überprüft wurde, hat ein C, das an Position –317 [lacuna] 4 bp oberhalb einer „G"-ähnlichen Box entnommen wurde.
Beispiel 3.
Konstruktion von Plasmiden, die chimäre Promotorsequenzen enthalten.
3.1. Konstruktion des MPM130 Promotors (SEQ.ID05).
Der MPr1130 Promotor (SEQ.ID05) resultiert aus dem Einfügen einer 55-bp Sequenz an Position –65 bp von PrHMWG-Dx5 (SEQ.ID01), die einer Duplizierung des as-2 Motivs (Lam and Chua, 1989) und des as-1 Motivs (Lam et al., 1989) von CaMV 35S entspricht. Es wurde durch Spleißen der Überlappungsverlängerung des „MPr1130 (SEQ.ID05) 5' Fragments" und des „MPr1130 (SEQ.ID05) 3' Fragments" konstruiert, die durch PCR synthetisiert wurden.
Das „MPr1130 (SEQ.ID05) 5' Fragment" wurde verstärkt durch PCR aus 5 ng pUC19-HMWG Matrix-DNA (beschrieben in Abschnitt 2.1 von Beispiel 2) mit Hilfe von 20 pmol jeder der 2 Oligodeoxynukleotide 5' TACgAATTCCCAgCTTTgAgTggCCgTAg 3', das den EcoRI Restriktionsort enthält, sowie 5' TgCgTCATCCCTTAC-gTCAgTggAgATATCACATCAATCTTgATATCACATCAATCACggigAggTTTgTTTAgCCTAAg 3', das die 55-bp Sequenz besitzt, die einer Duplizierung des as-2 Motivs (Lam and Chua, 1989) und des as-1 Motivs (Lam et al., 1989) von CaMV 35S in Anwesenheit von 10 nmol jeder der dNTPs, von Vent DNA Polymerase-Puffer (1×) und 2 E Vent DNA Polymerase (New England Biolabs), in einem 50 μl Reaktionsvolume entspricht. Die PCR-Verstärkungsreaktion wurde im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler durchgeführt. Nach einer Denaturation bei 94°C für 5 Min. wurde die DNA 15 Zyklen unterworfen, die jeweils aus den Schritten Denaturierung bei 94°C für 1 Min., Hybridisierung bei 55°C für 1 Min. und Elongation bei 72°C für 1 Min. 30 Sek. bestanden. Während des letzten Zyklus wurde die Elongation bei 72°C für 5 Min fortgesetzt. Vierzig μl des PCR-Reaktionsmediums wurden dann der Aktion von 12,5 E des Klenow-Fragments (New England Biolabs) in Anwesenheit von jeder der dNTPs 10 Min. bei 37°C ausgesetzt. Das so behandelte PCR-Produkt wurde dann auf 1,5% Agarose-Gel mit Hilfe des „QIAquick Gel Extraction" Kits isoliert.
Das „MPr1130 (SEQ.ID05) 3' Fragment" wurde synthetisiert und auf dieselbe Weise behandelt wie das „MPr1130 (SEQ.ID05) 5' Fragment", außer dass die beiden verwendeten 2 Oligodeoxynukleotide 5' ATTgATgTgATATCAAg-ATTgATgTgATATCTCCACTgACgTAAgggATgACgCACACgCAgCCATggTCCTgAACCTTC 3' sind, welche die 55-bp Sequenz besitzen, die einer Duplizierung des as-2 Motivs (Lam and Chua, 1989) und des as-1 Motivs (Lam et al., 1989) von CaMV 35S besitzen, und 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3', das den BamHI Restriktionsort enthält.
Das „MPr1130 (SEQ.ID05) 5' Fragment" und das „MPM130 (SEQ.ID05) 3' Fragment" wurden dann durch Überlappungsverlängerung zusammengefügt, um das „MPM130 Fragment (SEQ.ID05)" zu generieren. Dazu wurde eine PCR-Verstärkung unter Verwendung von 7,5 μl jedes der beiden so behandelten PCR-Produkte mit Hilfe von 20 pmol jedes der Oligodeoxynukleotide 5' TACgAATTCCCAgCTTTgAgTggCCgTAg 3', das den EcoRI Restriktionsort enthält, und 5' TACggATC-CCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3', das den BamHI Restriktionsort besitzt, in Anwesenheit von 10 nmol jedes der dNTPs, von Vent DNA Polymerase-Puffer (1×) und von 2 E Vent DNA Polymerase (New England Biolabs), in einem 50 μl Reaktionsvolumen durchgeführt. Die PCR-Verstärkungsreaktion wurde im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler durchgeführt. Nach einer Denaturation bei 94°C für 5 Min. wurde die DNA 15 Zyklen unterworfen, die jeweils aus den Schritten Denaturierung bei 94°C für 1 Min., Hybridisierung bei 55°C für 1 Min. und Elongation bei 72°C für 1 Min. 30 Sek. bestanden. Während des letzten Zyklus wurde die Elongation bei 72°C für 5 Min fortgesetzt. Das so synthetisierte „MPr1130 Fragment (SEQ.ID05)" wurde auf einem 1,5% Agarose-Gel mit Hilfe des „QIAquick Gel Extraction" Kits isoliert. Dieses Fragment wurde mit EcoRI 1 h lang bei 37°C hydrolysiert und der Einwirkung von 20 E des Klenow-Fragments (New England Biolabs) 30 Min lang bei 37°C in Anwesenheit von 60 nmol jeder der dNTPs, von 12 μl 500 mM Tris-HCL, pH 7,5 m/500 mM MgCl2 Puffer und 6 μl von 1 M DTT ausgesetzt. Schließlich wurde das MPM130 Fragment (SEQ.ID05) mit BamHI 1 h lang bei 37°C aufgeschlossen.
Die Ligation wurde mit 100 ng des so behandelten „MPM130 Fragments (SEQ.ID05)" und 50 ng des Plasmids pGem3Z-1 (beschrieben in Abschnitt 2.1 von Beispiel 2) über Nacht bei 16°C in einer 10 μl Reaktionsmischung in Anwesenheit des T4 DNA Ligase-Puffers (1×) und 400 Einheiten T4 DNA Ligase (New England Biolabs) durchgeführt. Escherichia coli DH5a Bakterien, die im Voraus kompetent gemacht worden waren, wurden mit der gesamten Ligations-Reaktionsmischung transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, die aus LB-Medium, ergänzt mit Ampizillin (50 mg/l) gewählt wurde, wurde durch PCR mit Hilfe von 25 pmol von jeder der 2 Oligodeoxynucleotides 5' TACgAATTCCCAgCTTTgAgTggCCgTAg 3' und 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler wie oben beschrieben analysiert.
Das erhaltene Plasmid wurde pMRT1130 genannt und die schematisch in I dargestellte MPM13 Promotor-Sequenz (SEQ.ID05) wurde durch Sequenzierung überprüft.
3.2. Konstruktion des MPM131 Promotors (SEQ.ID06).
Der MPr1131 Promotor (SEQ.ID06) resultiert aus dem Einfügen einer 38-bp Sequenz an Position –65 bp von PrHMWG-Dx5 (SEQ.ID01) (beschrieben in Abschnitt 2.1 von Beispiel 2), die dem as-2 Motiv (Lam and Chua, 1989) und dem as-1 Motiv (Lam et al., 1989) von CaMV 35S entspricht. Er wurde durch Spleißen der Überlappungsverlängerung des „MPM131 (SEQ.ID06) 5' Fragments" und des „MPr1131 (SEQ.ID06) 3' Fragments" konstruiert, die durch PCR synthetisiert worden waren.
Das „MPr1131 (SEQ.ID06) 5' Fragment" wurde synthetisiert und auf dieselbe Art behandelt wie das „MPM130 (SEQ.ID05) 5' Fragment" (beschrieben in Abschnitt 3.1 von Beispiel 3), außer dass die 2 verwendeten Oligodeoxynukleotide 5' TACgAATTCCCAgCTTTgAgTggCCgTAg 3' sind, welche den EcoRI Restriktionsort enthält, und 5' TgCgTCATCCCTTACgTCAgTggAgATATCACATCAATCACggTgAggTTTgTTTAgCCTA Ag 3', welche die 38-bp Sequenz enthält, die dem as-2 Motiv (Lam and Chua, 1989) und dem as-1 Motiv (Lam et al., 1989) von CaMV 35S entspricht. Das „MPr1131 (SEQ.ID06) 3' Fragment" wurde synthetisiert und auf dieselbe Art behandelt wie das „MPM130 (SEQ.ID05) 5' Fragment" (beschrieben in Abschnitt 3.1 von Beispiel 3), außer dass die 2 verwendeten Oligodeoxynukleotide 5' ATTgATgTgATATCTCCACTgACgTAAgggATgAC-gCACACgCAgCCATggTCCTgAACCTTC 3' sind, welche die 38-bp Sequenz enthält, die dem as-2 Motiv (Lam and Chua, 1989) und dem as-1 Motiv (Lam et al., 1989) von CaMV 35S und 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3', das den BamHI Restriktionsort enthält, entspricht.
Das „MPr1131 (SEQ.ID06) 5' Fragment" und das „MPr1131 (SEQ.ID06) 3' Fragment" wurden dann durch Überlappungsverlängerung zusammengefügt, um das „MPr1131 Fragment (SEQ.ID06)" zu generieren. Dazu wurde eine PCR-Verstärkung unter Verwendung von 7,5 μl jedes der beiden so behandelten PCR-Produkte mit Hilfe von 20 pmol jedes der Oligodeoxynukleotide 5' TACgAATTCCCAgCTTTgAgTggCCgTAg 3', das den EcoRI Restriktionsort enthält, und 5' TACggATC-CCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3', das den BamHI Restriktionsort besitzt, in Anwesenheit von 10 nmol jedes der dNTPs, von Vent DNA Polymerase-Puffer (1×) und von 2 E Vent DNA Polymerase (New England Biolabs), in einem 50 μl Reaktionsvolumen durchgeführt. Die PCR-Verstärkungsreaktion wurde im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler durchgeführt.
Nach einer Denaturierung bei 94°C für 5 Min. wurde die DNA 15 Zyklen unterworfen, die jeweils aus den Schritten Denaturierung bei 94°C für 1 Min., Hybridisierung bei 55°C für 1 Min. und Elongation bei 72°C für 1 Min. 30 Sek. bestanden. Während des letzten Zyklus wurde die Elongation bei 72°C für 5 Min fortgesetzt. Das so synthetisierte „MPr1131 Fragment (SEQ.ID06)" wurde auf einem 1,5% Agarose-Gel mit Hilfe des „QIAquick Gel Extraction" Kits isoliert. Dieses Fragment wurde mit EcoRI 1 h lang bei 37°C hydrolysiert und der Einwirkung von 20 E des Klenow-Fragments (New England Biolabs) 30 Min lang bei 37°C in Anwesenheit von 60 nmol jeder der dNTPs, 12 μl 500 mM Tris-HCL, pH 7,5 m/500 mM MgCl2 Puffer und 6 μl 1 M DTT ausgesetzt. Schließlich wurde das MPr1131 Fragment (SEQ.ID06) mit BamHI 1 h lang bei 37°C aufgeschlossen.
Die Ligation wurde mit 100 ng des so behandelten „MPM130 Fragments (SEQ.ID05)" und 50 ng des Plasmids pGem3Z-1 (beschrieben in Abschnitt 2.1 von Beispiel 2) über Nacht bei 16°C in einer 10 μl Reaktionsmischung in Anwesenheit von 1 μl des T4 DNA Ligase-Puffers (1×) und 400 Einheiten T4 DNA Ligase (New England Biolabs) durchgeführt. Escherichia coli DH5a Bakterien, die im Voraus kompetent gemacht worden waren, wurden mit der gesamten Ligations-Reaktionsmischung transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, die aus LB-Medium, ergänzt mit Ampizillin (50 mg/l) gewählt wurde, wurde durch PCR mit Hilfe von 25 pmol von jeder der 2 Oligodeoxynucleotides 5' TACgAATTCCCAgCTTTgAgTggCCg-Tag 3' und 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler wie oben beschrieben analysiert.
Das erhaltene Plasmid wurde pMRT1131 genannt und die schematisch in II dargestellte MPM131 Promotor-Sequenz (SEQ.ID06) wurde durch Sequenzierung überprüft.
3.3. Konstruktion des MPM135 Promotors (SEQ.ID07).
Der MPr1135 Promotor (SEQ.ID07) wird von dem MPr1130 Promotor (SEQ.ID05) (beschrieben in Abschnitt 3.1 von Beispiel 3) abgeleitet, indem die oberhalb von Nukleotid –293 lokalisierte Sequenz entnommen wird, welche die beiden Prolamin-„ähnlichen" Boxen und die beiden GATA-Boxen enthält.
Das Promotorfragment wurde durch PCR aus 5 ng von pMRT1130 Matrix-DNA mit Hilfe von 100 pmol jeder der beiden 2 Oligodeoxynukleotide 5' ATCGGAATTCCAGAACTAGGATTACGCCG 3' verstärkt, welche den EcoRI Restriktionsort enthält, sowie 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3', welche den BamHI Restriktionsort besitzt, und das in Anwesenheit von 50 nmol jeder der dNTPs, des Vent DMA Polymerase-Puffers (1×) und 2 E Vent DNA-Polymerase (New England Biolabs). Die PCR-Verstärkungsreaktion wurde im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler durchgeführt. Nach einer Denaturation bei 94°C für 5 Min. wurde die DNA 25 Zyklen unterworfen, die jeweils aus den Schritten Denaturierung bei 94°C für 1 Min., Hybridisierung bei 55°C für 1 Min. und Elongation bei 72°C für 1 Min. 30 Sek. bestanden. Während des letzten Zyklus wurde die Elongation bei 72°C für 1 Min fortgesetzt.
Das DNA-Fragment, das aus der Verstärkung abgeleitet wurde, wurde auf 2% Agarose-Gel mit Hilfe des "QIAquick Gel Extraction" Kits isoliert, mit EcoRI 1 h lang bei 37°C hydrolysiert und der Aktion von 20 E des Klenow-Fragments (New England Biolabs) für 30 Min bei 37°C in Anwesenheit von 60 nmol jeder der dNTPs, von 12 |ml 500 mM Tris-HCL, pH 7,5/500 mM MgCl2 Puffer und 6 μl von 1 M DTT ausgesetzt. Das so behandelte DNA-Fragment wurde dann mit BamHI 1 h lang bei 37°C aufgeschlossen.
Die Ligation wurde mit 100 ng des so behandelten MPR1135 Promotor-Fragments (SEQ.ID07)" und 50 ng des Plasmids pGem3Z-1 (beschrieben in Abschnitt 2.1 von Beispiel 2) über Nacht bei 16°C in einer 10 μl Reaktionsmischung in Anwesenheit des T4 DNA Ligase-Puffers (1×) und 400 Einheiten T4 DNA Ligase (New England Biolabs) durchgeführt. Escherichia coli DH5a Bakterien, die im Voraus kompetent gemacht worden waren, wurden mit der gesamten Ligations-Reaktionsmischung transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, die aus LB-Medium, ergänzt mit Ampizillin (50 mg/l) gewählt wurde, wurde durch PCR mit Hilfe von 25 pmol von jeder der 2 Oligodeoxynucleotides 5' ATCGGAATTCGTGTTGGCAAACTGC 3' und 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler wie oben beschrieben analysiert.
Das erhaltene Plasmid wurde pMRT1135 genannt und die schematisch in III dargestellte MPM13 Promotor-Sequenz (SEQ.ID07) wurde durch Sequenzierung überprüft.
3.4. Konstruktion des MPr1138 Promotors (SEQ.ID10).
Der MPr1138 Promotor (SEQ.ID10) wird aus dem MPr1131 Promotor (SEQ.ID06) abgeleitet (beschrieben in Abschnitt 3.2 von Beispiel 3), indem die oberhalb von Nukleotid –276 lokalisierte Sequenz entnommen wird, welche die beiden Prolamin-„ähnlichen" Boxen und die beiden GATA-Boxen enthält.
Das Promotorfragment wurde durch PCR aus 5 ng aus pMRT1131 Matrix-DNA verstärkt, behandelt und erhalten auf dieselbe Weise wie der MPM135 Promotor (SEQ.ID07) (beschrieben in Abschnitt 3.3 von Beispiel 3).
Das erhaltene Plasmid wurde pMRT1138 genannt und die schematisch in II dargestellte MPM138 Promotor-Sequenz (SEQ.ID10) wurde durch Sequenzierung überprüft.
3.5. Konstruktion des MPM137 Promotors (SEQ.ID09).
Der MPr1137 Promotor (SEQ.ID11) wird aus MPr1131 Promotor (SEQ.ID06) abgeleitet (beschrieben in Abschnitt 3.2 von Beispiel 3), indem die oberhalb von Nukleotid –243 lokalisierte Sequenz entnommen wird, welche die beiden Prolamin-„ähnlichen" Boxen, die beiden GATA-Boxen und die „G"-ähnliche Box enthält.
Das Promotorfragment wurde durch PCR aus 5 ng von pMRT1131 Matrix-DNA mit Hilfe von 100 pmol jeder der beiden 2 Oligodeoxynukleotide 5' ATCGGGAATTCGCAGACTGTCCAAAAATC 3' verstärkt, welche den EcoRI Restriktionsort enthält, sowie 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3', welche den BamHI Restriktionsort besitzt, behandelt und erhalten auf dieselbe Weise wie der MPr1135 Promotor (SEQ.ID07) (beschrieben in Abschnitt 3.3 von Beispiel 3).
Das erhaltene Plasmid wurde pMRT1137 genannt und die schematisch in II dargestellte MPM13 Promotor-Sequenz (SEQ.ID09) wurde durch Sequenzierung überprüft.
3.6. Konstruktion des MPM134 Promotors (SEQ.ID08).
Der MPM13 Promotor (SEQ.ID08) wird aus dem MPM13 Promotor (SEQ.ID05) abgeleitet (beschrieben in Abschnitt 3.1 von Beispiel 3), indem die oberhalb von Nukleotid –260 lokalisierte Sequenz entnommen wird, welche die beiden Prolamin-„ähnlichen" Boxen, die beiden GATA-Boxen und die „G"-ähnliche Box enthält.
Das Promotorfragment wurde durch PCR aus 5 ng von pMRT1130 Matrix-DNA mit Hilfe von 100 pmol jeder der beiden 2 Oligodeoxynukleotide 5' ATCGGGAATTCGCAGACTGTCCAAAAATC 3' verstärkt, welche den EcoRI Restriktionsort enthält, sowie 5' TACggATCCCGggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3', welche den BamHI Restriktionsort besitzt, behandelt und erhalten auf dieselbe Weise wie der MPr1135 Promotor (SEQ.ID07) (beschrieben in Abschnitt 3.3 von Beispiel 3).
Das erhaltene Plasmid wurde pMRT1134 genannt und die schematisch in III dargestellte MPM134 Promotor-Sequenz (SEQ.ID08) wurde durch Sequenzierung überprüft.
3.7. Konstruktion des MPr1136 Promotors (SEQ.ID08).
Der MPr1136 Promotor (SEQ.ID08) wird aus dem MPr1131 Promotor (SEQ.ID06) abgeleitet (beschrieben in Abschnitt 3.2 von Beispiel 3), indem die oberhalb von Nukleotid –180 lokalisierte Sequenz entnommen wird, welche die beiden Prolamin-„ähnlichen" Boxen, die beiden GATA-Boxen, die „G"-ähnliche Box und das aktivierende Element enthält.
Das Promotorfragment wurde durch PCR aus 5 ng von pMRT1131 Matrix-DNA mit Hilfe von 100 pmol jeder der beiden 2 Oligodeoxynukleotide 5' ATCGGAATTCGTGTTGGCAAACTGC 3' verstärkt, welche den EcoRI Restriktionsort enthält, sowie 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3', welche den BamHI Restriktionsort besitzt, behandelt und erhalten auf dieselbe Weise wie der MPr113 Promotor (SEQ.ID07) (beschrieben in Abschnitt 3.3 von Beispiel 3).
Das erhaltene Plasmid wurde pMRT1136 genannt und die schematisch in II dargestellte MPM136 Promotor-Sequenz (SEQ.ID08) wurde durch Sequenzierung überprüft.
3.8. Konstruktion des MPM133 Promotors (SEQ.ID35).
Der MPr1133 Promotor (SEQ.ID35) wird aus dem MPr1130 Promotor (SEQ.ID05) abgeleitet (beschrieben in Abschnitt 3.2 von Beispiel 3), indem die oberhalb von Nukleotid –197 lokalisierte Sequenz entnommen wird, welche die beiden Prolamin-„ähnlichen" Boxen, die beiden GATA-Boxen, die „G"-ähnliche Box und das aktivierende Element enthält.
Das Promotorfragment wurde durch PCR aus 5 ng von pMRT1130 Matrix-DNA mit Hilfe von 100 pmol jeder der beiden 2 Oligodeoxynukleotide 5' ATCGGAATTCGTGTTGGCAAACTGC 3' verstärkt, welche den EcoRI Restriktionsort enthält, sowie 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3', welche den BamHI Restriktionsort besitzt, behandelt und erhalten auf dieselbe Weise wie der MPM135 Promotor (SEQ.ID07) (beschrieben in Abschnitt 3.3 von Beispiel 3).
Das erhaltene Plasmid wurde pMRT1133 genannt und die schematisch in III dargestellte MPM133 Promotor-Sequenz (SEQ.ID35) wurde durch Sequenzierung überprüft.
3.9. Konstruktion des MPM139 Promotors (SEQ.ID11).
Der MPr1139 Promotor (SEQ.ID11) resultiert aus dem Einfügen einer 61-bp Sequenz an Position –405 bp von MPr1131 (SEQ.ID06) (beschrieben in Abschnitt 3.2 von Beispiel 3), welche die Duplizierung der „Getreide"-Box des Promotors des hochmolekularen Weizengluteningens entspricht, der die Untereinheit (PrHMWG-Bx7) des hexaploiden Weizens Triticum aestivum L cv Cheyenne (Anderson et al., 1998) kodiert.
Der MPr1139 Promotor (SEQ.ID11) wurde verstärkt durch PCR aus 5 ng pMRT1131 Matrix-DNA mit Hilfe von 100 pmol jedes der 2 Oligodeoxynukleotide 5' TACgAATTCCTCgACATggTTAgAAgTTTTgAgTgCCgCCACTACTCgACAT ggTTAgAAgTTTTgAgTggCCgTAgATTTgC 3', welche den EcoRI Restriktionsort und die beiden oben beschriebenen „Getreide"-Boxen enthält, und 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3', welche den BamHI Restriktionsort besitzt, und das in Anwesenheit von 50 nmol jeder der dNTPs, von Vent DMA Polymerase-Puffer (1×) und von 2 E Vent DNA-Polymerase (New England Biolabs). Die PCR-Verstärkungsreaktion wurde im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler durchgeführt. Nach einer Denaturation bei 94°C für 5 Min. wurde die DNA 25 Zyklen unterworfen, die jeweils aus den Schritten Denaturierung bei 94°C für 1 Min., Hybridisierung bei 55°C für 1 Min. und Elongation bei 72°C für 1 Min. 30 Sek. bestanden. Während des letzten Zyklus wurde die Elongation bei 72°C für 1 Min fortgesetzt.
Das DNA-Fragment, das aus der Verstärkung abgeleitet wurde, wurde auf 2% Agarose-Gel mit Hilfe des "QIAquick Gel Extraction" Kits isoliert und mit EcoRI 1 h lang bei 37°C hydrolysiert. Das DNA-Fragment wurde dann der Aktion von 20 E des Klenow-Fragments (New England Biolabs) für 30 Min bei 37°C in Anwesenheit von 60 nmol jeder der dNTPs, von 12 μl 500 mM Tris-HCL, pH 7,5/500 mM MgCl2 Puffer und 6 μl von 1 M DTT ausgesetzt.
Die Ligation wurde mit 100 ng des so behandelten MPM139 Promotor-Fragments (SEQ.ID11) und 50 ng des Plasmids pGem3Z-1 (beschrieben in Abschnitt 2.1 von Beispiel 2) über Nacht bei 16°C in einer 10 μl Reaktionsmischung in Anwesenheit des T4 DNA Ligase-Puffers (1×) und 400 Einheiten T4 DNA Ligase (New England Biolabs) durchgeführt. Escherichia coli DH5a Bakterien, die im Voraus kompetent gemacht worden waren, wurden mit der gesamten Ligations-Reaktionsmischung transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, die aus LB-Medium, ergänzt mit Ampizillin (50 mg/l) gewählt wurde, wurde durch PCR mit Hilfe von 25 pmol von jeder der 2 Oligodeoxynucleotides 5' ATCGGAATTCCAGAACTAGGATTACGCCG 3' und 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler wie oben beschrieben analysiert.
Das erhaltene Plasmid wurde pMRT1139 genannt und die schematisch in IV dargestellte MPM139 Promotor-Sequenz (SEQ.MPM139) wurde durch Sequenzierung überprüft.
3.10. Konstruktion des MPM200 Promotors (SEQ.ID15).
Der MPM200 Promotor (SEQ.ID15) resultiert aus dem Einfügen einer 79-bp Sequenz an Position –263 bp von MPr1138 (SEQ.ID10) (beschrieben in Abschnitt 3.4 von Beispiel 3), welche die Duplizierung der „Getreide"-Box des Promotors des hochmolekularen Weizengluteningens entspricht, der die Bx7 Untereinheit (PrHMWG-Bx7) des hexaploiden Weizens Triticum aestivum L. cv Cheyenne (Anderson et al., 1998) kodiert.
Der MPr1200 Promotor (SEQ.ID15) wurde konstruiert, indem in den Vektor pGEM3Z-1 (beschrieben in Abschnitt 2.1 von Beispiel 2) die folgenden beiden Promotorfragmente geklont wurden:
Das „MPM200 (SEQ.ID15) 5' Fragment", synthetisiert durch PCR, wurde aus 5 ng pMRT1139 Matrix-DNA (beschrieben in Abschnitt 3.9 von Beispiel 3) mit Hilfe von 100 pmol jeder der 2 Oligodeoxynukleotide 5' TACgAATTCCTCgACATgg 3', welches den EcoRI Restriktionsort enthält, und 5' gCTCTAgAgCAAATCTACggCCACTC 3', das den XbaI Restriktionsort besitzt, und das in Anwesenheit von 50 nmol jeder der dNTPs, von Vent DMA Polymerase-Puffer (1×) und von 2 E der Vent DMA Polymerase (New England Biolabs) verstärkt. Die PCR-Verstärkungsreaktion wurde im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler durchgeführt. Nach einer Denaturierung bei 94°C für 10 min. wurde die DNA 25 Zyklen unterzogen, die jeweils aus den Schritten Denaturierung bei 94°C für 1 Min., Hybridisierung bei 55°C für 1 Min. und Elongation bei 72°C für 1 Min. 30 Sek besteht. Während des letzten Zyklus wurde die Elongation bei 72°C für 5 Min fortgesetzt. Das durch die PCR-Verstärkung abgeleitete DMA-Fragment wurde auf 1,5% Agarose-Gel mit Hilfe des „Concert Rapid Gel Extraction System" Kits isoliert und mit EcoRI 1 h bei 37°C hydrolysiert. Das DNA-Fragment wurde dann der Aktion von 20 E des Klenow-Fragments (New England Biolabs) 30 Min lang bei 37°C in Anwesenheit von 60 nmol jeder der dNTPs, von 12 μl 500 mM Tris-HCL, pH 7,5/500 mM MgCl2 Puffer und 6 μl von 1 M DTT unterworfen, und mit XbaI für 1 h bei 37°C aufgeschlossen.
Das „MPr1200 (SEQ.ID15) 3' Fragment", synthetisiert durch PCR, wurde verstärkt aus 5 ng pMRT1138 Matrix-DNA mit Hilfe von 100 pmol jeder der 2 Oligodeoxynukleotide 5' ATCggAATTCTAgACgCCgATTACgTggCTTTAgC 3', welches den EcoRI Restriktionsort und den XbaI Restriktionsort enthält, sowie 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgT-ggTgC 3', das den BamHI Restriktionsort besitzt, und das in Anwesenheit von 50 nmol jeder der dNTPs, von Vent DNA Polymerase-Puffer (1×) und von 2 E Vent DNA-Polymerase (New England Biolabs) im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler unter denselben Bedingungen wie das „MPr1200 (SEQ.ID15) 5' Fragment". Das aus der PCR-Verstärkung abgeleitete DNA-Fragment wurde auf 1,5% Agaros-Gel mit Hilfe des „Concert Rapid Gel Extraction System" Kits isoliert und danach mit XbaI und BamHI für 1 h bei 37°C hydrolysiert.
Die Ligationsreaktion wurde mit 50 ng des so behandelten „MPr1200 (SEQ.ID15) 5' Fragments", 50 ng des so behandelten „MPM200 (SEQ.ID15) 3' Fragments" und 50 ng des Plasmids pGem3Z-1 in einer 10 μl Reaktionsmischung in Anwesenheit des T4 DNA Ligase-Puffers (1×) und von 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) im „GeneAmp PCR System 55 9700" Thermocycler wie oben beschrieben durchgeführt. Escherichia coli DH5a Bakterien, die im Voraus kompetent gemacht worden waren, wurden mit der gesamten Ligations-Reaktionsmischung transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, die aus LB-Medium, ergänzt mit Ampizillin (50 mg/l) gewählt wurde, wurde durch PCR mit Hilfe von 10 pmol von jedem der 2 Oligodeoxynukleotide 5' TACgAATTCCCAgCTTTgAgTggCCgTAg 3' und 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler wie oben beschrieben analysiert.
Das erhaltene Plasmid wurde pMRT1200 genannt und die schematisch in IV dargestellte MPr1200 Promotor-Sequenz (SEQ.ID15) wurde durch Sequenzierung überprüft.
3.11. Konstruktion des MPM213 Promotors (SEQ.ID16).
Der MPr1213 Promotor (SEQ.ID16) resultiert aus dem Einfügen einer 79-bp Sequenz an Position –225 bp von MPr1128 (SEQ.ID04) (beschrieben in Abschnitt 2.2 von Beispiel 2), welche die Duplizierung der „Getreide"-Box des Promotors des hochmolekularen Weizenglutenin-Gens enthält, der die Bx7 Untereinheit (PrHMWG-Bx7) des hexaploiden Weizens Triticum aestivum L cv Cheyenne (Anderson et al., 1998) kodiert.
Der MPr1213 Promotor (SEQ.ID16) wurde konstruiert, indem in den Vektor pGEM3Z-1 (beschrieben in Abschnitt 2.1 von Beispiel 2) die folgenden beiden Promotorfragmente geklont wurden:
Das „MPr1213 (SEQ.ID16) 5' Fragment", synthetisiert durch PCR, wurde aus 5 ng pMRT1139 Matrix-DNA (beschrieben in Abschnitt 3.9 von Beispiel 3) mit Hilfe von 100 pmol jeder der 2 Oligodeoxynukleotide 5' TAC-gAATTCCTCgACATgg 3', welches den EcoRI Restriktionsort enthält, und 5' gCTCTAgAgCAAATCTACggCCACTC 3', das den XbaI Restriktionsort besitzt, und das in Anwesenheit von 50 nmol jeder der dNTPs, von Vent DMA Polymerase-Puffer (1×) und von 2 E der Vent DNA Polymerase (New England Biolabs) verstärkt. Die PCR-Verstärkungsreaktion wurde im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler durchgeführt. Nach einer Denaturierung bei 94°C für 10 Min. wurde die DNA 25 Zyklen unterzogen, die jeweils aus den Schritten Denaturierung bei 94°C für 1 Min., Hybridisierung bei 55°C für 1 Min. und Elongation bei 72°C für 1 M in. 30 Sek besteht. Während des letzten Zyklus wurde die Elongation bei 72°C für 5 Min. fortgesetzt. Das durch die PCR-Verstärkung abgeleitete DNA-Fragment wurde auf 1,5% Agarose-Gel mit Hilfe des „Concert Rapid Gel Extraction System" Kits isoliert und mit EcoRI 1 h bei 37°C hydrolysiert. Das DNA-Fragment wurde dann der Aktion von 20 E des Klenow-Fragments (New England Biolabs) 30 Min lang bei 37°C in Anwesenheit von 60 nmol jeder der dNTPs, von 12 μl 500 mM Tris-HCL, pH 7,5/500 mM MgCl2 Puffer und 6 μl von 1 M DTT unterworfen, und mit XbaI für 1 h bei 37°C aufgeschlossen. Das „MPM213 (SEQ.ID16) 3' Fragment", erhalten durch die Hydrolyse von 5 μg des Plasmids pMRT1183 mit den Restriktionsenzymen XbaI und BamHI, wurde auf einem 1,5% Agarose-Gel mit Hilfe des „Concert Rapid Gel Extraction System" Kits isoliert.
Die Ligationsreaktion wurde mit 50 ng des „MPM213 (SEQ.ID16) 5'-Fragments" und 5 ng des so behandelten „MPr1213 (SEQ.ID16) 3' Fragments" und 50 ng des Plasmids pGem3Z-1 in einer 10 μl Reaktionsmischung unter Anwesenheit des T4 DNA Ligase-Puffers (1×) und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler wie oben beschrieben durchgeführt. Escherichia coli DH5a Bakterien, die im Voraus kompetent gemacht worden waren, wurden mit der gesamten Ligations-Reaktionsmischung transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, die aus LB-Medium, ergänzt mit Ampizillin (50 mg/l) gewählt wurde, wurde durch PCR mit Hilfe von 10 pmol von jedem der 2 Oligodeoxynukleotide 5' TACgAATTCCTCgACATgg 3' und 5' gCTCTAgAgCAAATCTACggCCACTC 3' im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler wie oben beschrieben analysiert.
Das erhaltene Plasmid wurde pMRT1213 genannt und die schematisch in IV dargestellte MPM213 Promotor-Sequenz (SEQ.ID16) wurde durch Sequenzierung überprüft.
3.12. Konstruktion des MPM199 Promotors (SEQ.ID14).
Der MPr119 Promotor (SEQ.ID14) resultiert aus dem Einfügen einer 27-bp Sequenz an Position –224 bp von MPR1128 (SEQ.ID04) (beschrieben in Abschnitt 2.2 von Beispiel 2), welche das „GC-reiche" Element der intergenischen Region des Maisstrichelvirus (MSV) (Fenoll et al., 1990) beinhaltet.
Der MPr199 Promotor (SEQ.ID14) wurde durch PCR aus 5 ng von pMRT1128 Matrix-DNA mit Hilfe von 100 pmol jeder der beiden 2 Oligodeoxynukleotide 5' ATCGGAATTCAAATGGGCCGGACCGGGCCGGCCCAGCGCCGATTACGTGGCTTTAGC 3' verstärkt, die das oben beschriebene „GC-reiche" Element und die EcoRI und XbaI Restriktionsorte enthält, sowie 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3', welche den BamHI Restriktionsort besitzt, und das in Anwesenheit von 50 nmol jeder der dNTPs, des Vent DMA Polymerase-Puffers (1×) und 2 E Vent DNA-Polymerase (New England Biolabs). Die PCR-Verstärkungsreaktion wurde im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler durchgeführt. Nach einer Denaturation bei 94°C für 5 Min. wurde die DNA 25 Zyklen unterworfen, die jeweils aus den Schritten Denaturierung bei 94°C für 1 Min., Hybridisierung bei 55°C für 1 Min. und Elongation bei 72°C für 1 Min. 30 Sek. bestanden. Während des letzten Zyklus wurde die Elongation bei 72°C für 1 Min fortgesetzt.
Das DNA-Fragment, das aus der Verstärkung abgeleitet wurde, wurde auf 1,5% Agarose-Gel mit Hilfe des „Concert Rapid Gel Extraction" Kits isoliert und mit EcoRI 1 h lang bei 37°C hydrolysiert. Das Fragment wurde dann der Aktion von 20 E des Klenow-Fragments (New England Biolabs) für 30 Min bei 37°C in Anwesenheit von 60 nmol jeder der dNTPs, von 12 μl 500 mM Tris-HCL, pH 7,5/500 mM MgCl2 Puffer und 6 μl von 1 M DTT ausgesetzt, und mit BamHI 1 h lang bei 37°C aufgeschlossen.
Die Ligation wurde mit 100 ng des so behandelten MPM199 Promotor-Fragments (SEQ.ID14) und 50 ng des Plasmids pGem3Z-1 (beschrieben in Abschnitt 2.1 von Beispiel 2) mit PCR-Zyklen im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler unter den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Escherichia coli DH5a Bakterien, die im Voraus kompetent gemacht worden waren, wurden mit der gesamten Ligations-Reaktionsmischung transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, die aus LB-Medium, ergänzt mit Ampizillin (50 mg/l) gewählt wurde, wurde durch PCR mit Hilfe von 25 pmol von jeder der 2 Oligodeoxynucleotides 5' ATCGGAATTCCAGAACTAGGATTACGCCG 3' und 5' TACggATCCCCg-gggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler wie oben beschrieben analysiert.
Das erhaltene Plasmid wurde pMRT1199mut genannt und die entsprechende MPr1199 (SEQ.ID14) mut-Promotorsequenz, die durch Sequenzierung überprüft wurde, weist eine Mutation in der untranslatierten Leitsequenz an Position +27 [lacuna] auf. Zur Wiederherstellung der unmutierten MPr1199 Sequenz (SEQ.ID14), wurde das „MPM199 (SEQ.ID14) 5' Fragment", das sich von Position –251 zu –58 bp erstreckt, an die Stelle des „MPM183 5' Fragments" geklont, das sich von Position –225 zu –58 bp erstreckt.
Dazu wurden 10 μg des Plasmids pMRT1199mut mit EcoRI for 1 h bei 37°C aufgeschlossen, und der Aktion von 20 E des Klenow-Fragments (New England Biolabs) 30 Min bei 37°C in Anwesenheit von 60 nmol jeder der dNTPs, von 12 μl 500 mM Tris-HCL, pH 7,5/500 mM MgCl2 Puffer und 6 μl von 1 M DTT unterworfen. Nach einer Aufschließung mit NcoI für 1 h bei 37°C, wurde das „MPr1199 (SEQ.ID14) 5' Fragment" auf einem 1,5% Agarose-Gel mit Hilfe des „Concert Rapid Gel Extraction System" Kits isoliert.
Parallel dazu wurden 5 μg des Plasmids pMRT1183 (beschrieben in Abschnitt 2.5 von Beispiel 2) 1 h bei 37°C mit XbaI aufgeschlossen, und der Aktion von 20 E des Klenow-Fragments (New England Biolabs) 30 Min. bei 37°C in Anwesenheit von 60 nmol jeder der dNTPs, von 12 μl/500 mM Tris-HCL, pH 7,5/500 mM MgCl2 Puffer und 6 μl von 1 M DTT unterworfen. Nach einer Aufschließung mit NcoI wurde der so aus dem „MPR1183 5' Fragment" entfernte Vektor pMRT1183 auf 0,8% Agarose-Gel mit Hilfe des „Concert Rapid Gel Extraction" Kits isoliert und mit 40 E Calf intestine alkaline Phosphatase (New England Biolabs) in Anwesenheit von Puffer 3 (1×) bei 37°C 1 h lang dephosphoryliert.
Die Ligationsreaktion wurde mit 100 ng des „MPM19 (SEQ.ID14) mut 5' Fragments" und 50 ng des so behandelten Plasmids pMRT1183 durchgeführt, und in einer 10 μl Reaktionsmischung unter Anwesenheit des T4 DNA Ligase-Puffers (1×) und 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler wie oben beschrieben behandelt. Escherichia coli DH5a Bakterien, die im Voraus kompetent gemacht worden waren, wurden mit der gesamten Ligations-Reaktionsmischung transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, die aus LB-Medium, ergänzt mit Ampizillin (50 mg/l) gewählt wurde, wurde nach der alkalischen Lysemethode extrahiert und mit enzymatischen Aufschließungen analysiert.
Das erhaltene Plasmid wurde pMRT1199 genannt und die MPM199 Promotor-Sequenz (SEQ.ID14) wird schematisch in IV dargestellt.
Beispiel 4.
Konstruktion der binären Plasmide, welche die MPr1130 (SEQ.ID05), MPr1131 (SEQ.ID06), MPr1135 (SEQ.ID07), MPr1138 (SEQ.ID10), MPr1139 (SEQ.ID11) und MPr1092 Promotoren, die bei der stabilen Transformation von Tabak verwendet werden, enthalten.
4.1. Konstruktion des binären Plasmids pMRT1177.
Das binäre Plasmid pMRT1177 wurde durch Einfügen der Expressionskassette „MPr1130 (SEQ.ID05)/uidA-IV2/term-nos" von pMRT1130 (beschrieben in Abschnitt 3.1 von Beispiel 3) in die EcoRI-Site des binären Plasmids pMRT1118 (unveröffentlicher Patentantrag FR 9911112 ) erhalten.
Dazu wurden 10 μg des Plasmids pMRT1130 sukzessiv mit EcoRI und XmnI 1 h bei 37°C aufgeschlossen. Die Expressionskassette wurde dann auf einem 0,8% Agarose-Gel mit Hilfe des „Concert Rapid Gel Extraction System" Kits isoliert.
Parallel dazu wurden 10 μg des binären Plasmids pMRT1118 mit EcoRI 1 h bei 37°C aufgeschlossen. Das linearisierte Vektorfragment wurde dann mit 40 E Calf Intestine Alkaline Phosphatase (New England Biolabs) in Anwesenheit des Puffers 3 (1×) bei 37°C für 1 h dephosphoryliert.
Die Ligation wurde mit 50 ng der Expressionskassette und 100 ng des so behandelten Plasmids pMRT1118 über Nacht bei 16°C in einer 10 μl Reaktionsmischung in Anwesenheit des T4 DNS Ligasepuffers (1×) und 400 Einheiten T4 DNS Ligase (New England Biolabs) durchgeführt. Escherichia coli DH5a Bakterien, die zuvor kompetent gemacht worden waren, wurden mit der gesamten Ligationsreaktionsmischung transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, die auf mit Kanamycin (50 mg/l) angereichertem LB-Medium selektiert wurden, wurde mittels der alkalischen Lysemethode extrahiert und mit enzymatischem Aufschließungen analysiert.
Das erhaltene Plasmid, genannt pMRT1177, wurde entsprechend der von Holsters et al. (1978) beschriebenen Technik in den LBA4404 Agrobacterium tumefaciens Stamm transferiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, die auf 2YT Medium (10 g/l Bactotrypton, 10 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, pH 7,2 und 15 g/l Agar-Agar), angereichert mit Rifampicin (50 mg/l) und Kanamycin (50 mg/l), selektiert wurden, wurde entsprechend der alkalischen Lysemethode extrahiert, die durch Zugabe von Lysozym (25 mg/ml) zum Zell-Resuspensionspuffer modifiziert wurde. Die Plasmid-DNA wurde durch enzymatische Aufschließung analysiert und der erhaltene Agrobacterium-Klon wurde A1177 genannt.
4.2. Konstruktion des binären Plasmids pMRT1178.
Das binäre Plasmid pMRT1178 wurde durch Einfügen der Expressionskassette „MPr1131 (SEQ.ID06)/uidA-IV2/term-nos" in die EcoRI-Site des binären Plasmids pMRT1118 erhalten, wie in Abschnitt 4.1 von Beispiel 4 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Expressionskassette aus dem Plasmid pMRT1131 isoliert wurde (beschrieben in Abschnitt 3.2 von Beispiel 3).
Das resultierende Plasmid wurde pMRT1178 genannt, und wurde in den LBA4404 Agrobacterium tumefaciens Stamm transferiert, entsprechend dem oben in Abschnitt 4.1 von Beispiel 4 beschriebenen Protokoll. Der erhaltene Agrobacterium-Klon wurde A1178 genannt.
4.3. Konstruktion des binären Plasmids pMRT1179.
Das binäre Plasmid pMRT1179 wurde durch Einfügen der Expressionskassette „MPr1135 (SEQ.ID07)/uidA-IV2/term-nos" in die EcoRI-Site des binären Plasmids pMRT1118 erhalten, wie in Abschnitt 4.1 von Beispiel 4 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Expressionskassette aus dem Plasmid pMRT1135 isoliert wurde (beschrieben in Abschnitt 3.3 von Beispiel 3).
Das resultierende Plasmid wurde pMRT1179 genannt und in den LBA4404 Agrobacterium tumefaciens Stamm transferiert, entsprechend dem oben in Abschnitt 4.1 von Beispiel 4 beschriebenen Protokoll. Der erhaltene Agrobacterium-Klon wurde A1179 genannt.
4.4. Konstruktion des binären Plasmids pMRT1180.
Das binäre Plasmid pMRT1180 wurde durch Einfügen der Expressionskassette „MPr1138 (SEQ.ID10)uidA-IV2/term-nos" in die EcoRI-Site des binären Plasmids pMRT1138 erhalten, wie in Abschnitt 4.1 von Beispiel 4 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Expressionskassette aus dem Plasmid pMRT1138 isoliert wurde (beschrieben in Abschnitt 3.4 von Beispiel 3).
Das resultierende Plasmid wurde pMRT1180 genannt und in den LBA4404 Agrobacterium tumefaciens Stamm transferiert, entsprechend dem oben in Abschnitt 4.1 von Beispiel 4 beschriebenen Protokoll. Der erhaltene Agrobacterium-Klon wurde A1180 genannt.
4.5. Konstruktion des binären Plasmids pMRT1181.
Das binäre Plasmid pMRT1181 wurde durch Einfügen der Expressionskassette „MPr1139 (SEQ.ID11)/uidA-IV2/term-nos" in die EcoRI-Site des binären Plasmids pMRT1118 erhalten, wie in Abschnitt 4.1 von Beispiel 4 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Expressionskassette aus dem Plasmid pMRT1139 isoliert wurde (in Abschnitt 3.9 von Beispiel 3 beschrieben).
Das resultierende Plasmid wurde pMRT1181 genannt und in den LBA4404 Agrobacterium tumefaciens Stamm transferiert, entsprechend dem oben in Abschnitt 4.1 von Beispiel 4 beschriebenen Protokoll. Der erhaltene Agrobacterium-Klon wurde A1181 genannt.
4.6. Konstruktion des binären Plasmids pMRT1182.
Das binäre Plasmid pMRT1182 wurde durch Einfügen des CaMV PrD35S Promotor-Fragments und die Sequenz uidA-IV2/term-nos in das binäre Plasmid pMRT1118 erhalten.
CaMV PrD35S wurde durch sukzessives Aufschließen von 10 μg des Plasmids pJIT163D mit KpnI und mit HindIII für 1 h bei 37°C isoliert. Das zu CaMV PrD35S gehörige 743-bp Fragment wurde auf einem 0,8% Agarose-Gel separiert und dann mit Hilfe des „QIAquick Gel Extraction" Kits gereinigt.
Die Sequenz uidA-IV2/term-nos wurde durch Aufschließen von 4 μg des Plasmids pMRT1092 mit HindIII und EcoRI für 1 h bei 37°C erhalten. Das zur Sequenz uidA-IV2/term-nos gehörige 2.2-kb Fragment wurde auf einem 0,8% Agarose-Gel separiert und dann mit Hilfe des „QIAquick Gel Extraction" Kits gereinigt.
Parallel dazu wurden 10 μg des binären Plasmids pMRT1118 mit KpnI und EcoRI 1 h bei 37°C sukzessiv aufgeschlossen. Das linearisierte Vektorfragment wurde dann mit 40 E Calf Intestine Alkaline Phosphatase (New England Biolabs) in Anwesenheit des Puffers 3 (1×) bei 37°C für 1 h dephosphoryliert.
Die Ligation wurde in Anwesenheit von 100 ng binärem Plasmid, 50 ng des CaMV PrD35S Fragments und 50 ng des zu der Sequenz uidA-IV2/term-nos gehörigen Fragments in einem 20 μl Reaktionsvolumen in Anwesenheit des T4 DNS Ligase-Puffers (1×) und 400 Einheiten T4 DNS Ligase-Enzym (New England Biolabs) durchgeführt. Die Inkubation wurde mit PCR-Zyklen im oben beschriebenen „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler durchgeführt. Escherichia coli DH5a Bakterien, die zuvor kompetent gemacht worden waren, wurden mit der Hälfte der Ligationsreaktionsmischung transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, die auf, mit Kanamycin (50 mg/l) angereichertem, LB-Medium selektiert wurden, wurde entsprechend der alkalischen Lysemethode extrahiert und mit enzymatischen Aufschließungen analysiert.
Das resultierende Plasmid wurde pMRT1182 genannt und in den LBA4404 Agrobacterium tumefaciens Stamm transferiert, entsprechend dem oben in Abschnitt 4.1 von Beispiel 4 beschriebenen Protokoll. Der erhaltene Agrobacterium-Klon wurde A1182 genannt.
Beispiel 5.
Konstruktion des binären Plasmids pMRT1207, das den MPR1139 Promotor (SEQ.ID11) enthält, der bei der stabilen Transformation von Mais benutzt wird.
Das binäre Plasmid pMRT1207 wurde durch Einfügen der Expressionskassette „MPr1139 (SEQ.ID11)/uidA-IV2/term-nos" von pMRT1139 in die HpaI-Site des binären Plasmids pMRT1195 (unveröffentlicher Patentantrag FR 9911112 ) erhalten.
Dazu wurden 7 μg des Plasmids pMRT1139 sukzessiv mit EcoRI und XmnI für 1 h bei 37°C aufgeschlossen. Die Expressionskassette wurde dann auf einem 0,7% Agarose-Gel mit Hilfe des „Concert Rapid Gel Extraction System" Kits isoliert, und der Aktion von 20 E des Klenow-Fragments (New England Biolabs) für 30 Min. bei 37°C in Anwesenheit von 60 nmol jedes der dNTPs, 12 μl MgCl₂ Puffer (500 mM) und 6 μl DTT (1 M), unterworfen.
Parallel dazu wurden 5 μg des binären Plasmids pMRT1195 mit HpaI für 1 h bei 37°C aufgeschlossen. Das linearisierte Vektorfragment wurde dann mit 40 E Calf Intestine Alkaline Phosphatase (New England Biolabs) in Anwesenheit des Puffers 3 (1×) bei 37°C für 1 h dephosphoryliert.
Die Ligation wurde mit 100 ng der Expressionskassette und 10 ng des so behandelten Plasmids pMRT1195 wie oben beschrieben mit PCR-Zyklen im „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler durchgeführt. Escherichia coli DH5a Bakterien, die zuvor kompetent gemacht worden waren, wurden mit der gesamten Ligationsreaktionsmischung transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, die auf, mit Kanamycin (50 mg/l) angereichertem, LB-Medium selektiert wurden, wurde entsprechend der alkalischen Lysemethode extrahiert und mit enzymatischen Aufschließungen analysiert.
Das erhaltene Plasmid, genannt pMRT1207, wurde, wie in Abschnitt 4.1 von Beispiel 4 beschrieben, in den LBA4404-pSB1 Agrobacterium tumefaciens Stamm transferiert, entsprechend dem oben beschriebenen Protokoll für die Produktion von A1177. Dieser Stamm leitet sich vom LBA4404 Agrobacterium tumefaciens Stamm im Anschluss an die Integration des Plasmids pSB1 ab (unveröffentlichter Patentantrag FR 9911112 ). Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, die auf 2YT Medium, angereichert mit Rifampicin (50 mg/l), Kanamycin (50 mg/l) und Tetracyclin (5 mg/l), selektiert wurden, wurde entsprechend der alkalischen Lysemethode extrahiert, die durch Zugabe von Lysozym (25 mg/ml) zum Zell-Resuspensionspuffer modifiziert wurde. Die Plasmid-DNA wurde durch enzymatische Aufschließungen analysiert und der erhaltene Agrobacterium-Klon wurde A1207 genannt.
Beispiel 6.
Messung und Vergleich der Aktivität der verschiedenen Promotoren bei der transienten Expression in Mais und Tabak.
6.1 Präparation der Planzenextrakte.
6.1.1. Produktion und Präparation der Maissamen.
Die Experimente zur transienten Expression wurden an Mais-Eiweiß 9N 87 165 (L2) aus Maispflanzen durchgeführt, die in einem Phytotron bei 24°C und 60% Luftfeuchtigkeit und einem Licht-Dunkel-Zyklus von 16 h Licht/8 h Dunkelheit gezüchtet wurden.
Zwölf Tage nach der Blütenbestäubung (DAP) wurde der Mais entfernt und durch 5 Minuten Rühren in einem 20%igen Domestos-Bad sterilisiert. Nach dem Entfernen des Domestos durch sukzessive Spülungen in sterilem, deionisierten Wasser, werden das Perikarp und die Aleuronzellenschicht sorgfältig unter sterilen Bedingungen entfernt. Tangentiale Schnitte des so extrahierten Eiweißes wurden präpariert und auf Filterpapier gelegt, das mit minimalem Murashige-Skoog-Medium (MS 5524, Sigma) getränkt war.
6.1.2. In-Vitro-Kultur von Tabak, Präparation der Blätter.
Die Experimente zur transienten Expression wurden an 6 Wochen alten Blättern von Tabak (Nicotiana tabacum L.) des Kultivars PBD6 durchgeführt. Reife Samen des Tabaks cv. PBD6 wurden 10 Min. in einer gesättigten Lösung von Calciumhypochlorit (70 g/l) sterilisiert und dann drei Mal 5 Min. in sterilem deionisierten Wasser gespült. Die sterilen Samen wurden auf MS20-Medium (Murashige und Skoog, 1962) aufgebracht und für 6 Wochen in einer Kulturkammer inkubiert (konstante Temperatur von 24°C, Photoperiode von 16 h Licht/8 h Dunkelheit).
Um die Zerstörung der Zellen des Blattmesophylls während der Transformation durch Biolistics zu minimieren, wurden die 2 Hauptblätter der 6 Wochen alten PBD6 Tabakpflanzen 24 h vor der Transformation entfernt, mit der oberen Seite des Blattes nach oben gerichtet, auf das sanfte Plasmolyse-Medium BY3 (4,4 g/l MS-5519 Salze, 100 mg/l Myoinositol, 1 mg/l Thiamin, 200 mg/l KH₂PO₄, 30 g/l Saccharose, 45,5 g/l Sorbitol, 1 mg/l 2,4 D, 8 g/l Agar, pH 5,8) gelegt und in eine Kulturkammer gestellt (konstante Temperatur von 25°C, Photoperiode von 16 h Licht/8 h Dunkelheit).
6.2. Adsorption der Plasmid-DNA auf Wolfram- oder Gold-Mikropartikeln.
Die Transformation durch Biolistics erforderte, die DNA zuvor auf kugelförmigen Mikropartikeln aus Wolfram oder Gold abzuscheiden, sie für 10 Minuten in absolutem Ethanol (99,98%, mit einem Wassergehalt von weniger als 0,02%) zu sterilisieren, sie 4 Mal mit sterilem, deionisiertem Wasser zu waschen, und sie bei –20°C in einer 50%igen Glycerinlösung für maximal 4 Wochen zu konservieren.
Die Konzentration aller Kontroll- und Test-Plasmide, die während der Transformation benutzt wurden, wurde auf 1 mg/ml eingestellt. Bei jedem der Transformationsexperimente, in denen die Aktivität des untersuchten Promotors mit einer luminometrischen Untersuchung ausgewertet wurde, wurde eine interne Referenz-Kontrolle (pCaMV35Sluc) co-transformiert, um die Variationen in der GUS-Aktivität zwischen den verschiedenen Experimenten zu normalisieren (Leckie et al., 1994). Wenn aber die Aktivität des untersuchten Promotors mit einer histochemischen Untersuchung bestimmt wurde, wurde das Referenz-Plasmid nicht co-transformiert.
Die Beschichtung der DNA auf den so präparierten Partikeln wurde in einer sterilen Laminarströmungskammer durchgeführt. Eine 1,8 mg aliquote Fraktion der sterilen Partikel-Suspension in 30 μl 50%igem Glycerin wurde durch 120minütige Verwirbelung kräftig gemischt und dann für 10 Sek. mit 20 μl der DNS-Suspension verwirbelt, die 5 μg eines der zu testenden Plasmide und 2 μg des Referenz-Plasmids pCaMV35Sluc enthielten. Dann wurden 20 μl 2,5 M CaCl₂ hinzugefügt und für 10 Sek. kräftig gemischt. Als nächstes wurden 20 μl 0,1 M Spermidin zu der Mischung hinzugefügt und alles zusammen wurde für weitere 30 Sek. verwirbelt. Die Beschichtung der DNA auf die Kügelchen wurde durch 15-minütige Inkubation der Mischung auf Eis fortgesetzt, dann wurden die beschichteten Kügelchen bei niedriger Geschwindigkeit für 5 Sekunden zentrifugiert und zweimal in absolutem Ethanol gewaschen. Die so beschichteten Partikel wurden in 32 μl absolutem Ethanol re-suspendiert, 15 Sek. durch Verwirbelung kräftig gemischt, und dann sofort als 4 identische aliquote Fraktionen auf die sterilen „Mikroträger"-Scheiben des PDS-1000/He Biolistic-Systems verteilt, das nach den Empfehlungen des Herstellers vorbereitet worden war (Bio-Rad, Hercule, USA). Das „Mikroträger-Halter/Mikroträger der die Partikelablagerung hält" Set wurde für 5 Min. getrocknet.
6.3. Transiente Transformation von Pflanzenextrakten durch Biolistics.
6.3.1. Bombardieren des Mais-Eiweißes und transiente Expression.
Die Bombardierung des Mais-Eiweißes wurde nach den allgemeinen Empfehlungen des Herstellers (Bio-Rad, Hercule, USA) zur Handhabung und Anordnung der verschiedenen Elemente der Ausrüstung mit dem PDS-1000/He Biolistic System durchgeführt. Jedes Eiweiß wurde zweimal sukzessiv mit Wolfram-Partikeln von 0,6 μm Durchmesser nach den folgenden Beschuss-Charakteristiken bombardiert:
der gewählte Helium-Druck zur Partikelbeschleunigung ist 6200 kPa (900 psi),
die Pflanzenprobe ist 6 cm von der Kugelbeschleunigungszone entfernt,
der Beschuss wird unter reduziertem Atmosphärendruck von 27 mm Quecksilber durchgeführt.
Nach der Bombardierung wurden die Eiweiße in denselben Bedingungen gelassen und für 24 h im Dunkeln in einer Kulturkammer bei 26°C inkubiert, um so die transiente Expression der in die Zelle eingeführten Transgene zu ermöglichen.
6.3.2. Bombardieren des Tabak-Blattgewebes und transiente Expression.
Die Bombardierung der Tabakblätter wurde in der gleichen Weise durchgeführt wie die Bombardierung der Mais-Eiweiße, mit zwei Ausnahmen:
die Proben wurden mit Goldpartikeln von 1 pm Durchmesser
bombardiert, die Proben wurden 9 cm von der Kugelbeschleunigungszone entfernt platziert.
Nach der Bombardierung wurden die Blätter in denselben Bedingungen gelassen und für 48 h in einer Kulturkammer inkubiert (konstante Temperatur von 25°C, Photoperiode von 16 h Licht/8 Stunden Dunkelheit), um so die transiente Expression der in die Zelle eingeführten Transgene zu ermöglichen.
6.4. Nachweis und Auswertung der Aktivität der verschiedenen Promotoren durch histochemische Färbung.
6.4.1. Nachweis der β-Glukuronidase-Expression.
Ein Nachweis der β-Glukuronidase-Expression wurde durch histochemische Färbung nach Jeffersson et al durchgeführt. (1987). Nach der Inkubationszeit in einer Kulturkammer wurden die Pflanzenextrakte in Gegenwart des β-Glukuronidase-Substrats X-Gluc (500 mg/l 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl Glukuronid), in 0,1 M Phosphat-Puffer, 0,05% Triton X100, pH 7,0, für 24 h bei 37°C inkubiert.
Nach der Färbung wurden die Mais-Eiweiße direkt analysiert oder bei 4°C für mehrere Wochen steril konserviert, während die Tabakblätter durch zwei sukzessive Durchgänge durch 95%ige Ethanolbäder für 3 und 12 h depigmentiert wurden und dann in destilliertem Wasser gespült und flach zwischen zwei Cellophanblättern getrocknet wurden.
Die Promotor-Aktivität der verschiedenen Konstrukte wurde durch Abschätzen der Zahl und Intensität der von jedem Pflanzenextrakt gezeigten blauen Punkte berechnet.
6.4.2. Qualitative Auswertung der Aktivität der Promotoren im Mais-Eiweiß.
Der histochemische Nachweis der β-Glukuronidase-Expression ermöglichte die Identifikation von drei Promotor-Kategorien:

– Die Eiweiße, die mit dem pMRT1197, pMRT1126, pMRT1127 und pMRT1199 Konstrukt bombardiert wurden, zeigen systematisch eine Zahl von blauen Punkten, die kleiner 10 ist. Die Anwesenheit von blauen Flecken auf den Eiweißen, die mit dem pMRT1197 Konstrukt transformiert wurden, zeigt, dass die 96-bp Sequenz von MPr1197 (SEQ.ID12) die minimale Promotor-Sequenz des NMWG-Dx5 Promotors (SEQ.ID01) darstellt, der in der Lage ist, einfache transkriptorische Aktivität in das Mais-Eiweiß zu leiten. Die Abwesenheit von blauen Flecken bei den Eiweißen, die mit dem pMPRT1144 Konstrukt bombardiert wurden, dem die Promotor-Sequenz fehlt (negative Kontrolle), bestätigt die Funktionalität der in dieser Kategorie zusammen gruppierten Promotoren.
– Die Eiweiße, die mit den pMRT1128, pMRT1213, pMRT1216, pMRT1217, pMRT1136, pMRT1137, pMRT1135 und pMRT1138 Konstrukten bombardiert wurden, zeigen im Durchschnitt eine Anzahl von blauen Punkten, die equivalent zu den Eiweißen ist, die mit den pMRT1125 (PrNMWG-Dx5 (SEQ.ID01)) und pMRT1218 (Prg-Zein, positive Kontrolle) Konstrukten transformiert wurden.
– Schließlich zeigen die Eiweiße, die mit den pMRT1130, pMRT1131, pMRT1139 und pMRT1200 Konstrukten bombardiert wurden, eine intensive und diffuse blaue Färbung, die das Zählen der Anzahl von blauen Punkten schwierig macht, die aber zu der Annahme führt, dass die MPr1130 (SEQ.ID05), MPr1131 (SEQ.ID06), MPr1139 (SEQ.ID11) und MPr1200 (SEQ.ID15) Promotoren im Mais-Eiweiß 12 Tage nach der Blütenbestäubung sehr hoch aktiv sind.

6.4.3. Quantitative Auswertung der Aktivität der Promotoren in den Tabakblättern.
Die in 5 gezeigten Ergebnisse der histochemischen Tests, die mit den Tabakblättern durchgeführt wurden, die mit den pMRT1125 (PrHMWG-Dx5 (SEQ.ID01)), pMRT1130, pMRT1131, pMRT1133, pMRT1134, pMRT1135, pMRT1136, pMRT1137, pMRT1138 und pMRT1092 (CaMV PrD35S, positive Kontrolle) Konstrukten tranformiert wurden, ermöglichten es, die untersuchten Promotoren in vier Kategorien zu unterteilen. Es wurden keine blauen Flecken auf den Blättern beobachtet, die mit dem pMRT1125 (PrHMWG-Dx5 (SEQ.ID01)) Konstrukt bombardiert wurden. Die Blätter, die mit den pMRT1133, pMRT1134, pMRT1136 und pMRT1137 Konstrukten bombardiert wurden, zeigen im Durchschnitt zwischen 50 und 100 blaue Flecken. Die Blätter, die mit den pMRT1135, pMRT1138 und pMRT1139 Konstrukten transformiert wurden (Ergebnisse nicht gezeigt), zeigen eine beträchtliche Zahl an blauen Flecken, die equivalent zu denen auf den Blättern ist, die mit dem Referenz-Konstrukt pMRT1092 (CaMV PrD35S) bombardiert wurden. Schließlich zeigen die Blätter, die mit den pMRT1130 und pMRT1131 Konstrukten bombardiert wurden, eine viel höhere Zahl von diffusen und intensiven blauen Flecken als die Blätter, die mit dem Referenz-Konstrukt pMRT1092 (CaMV PrD35S) bombardiert wurden.
Durch diese Ergebnisse können mehrere wichtige Informationen abgeleitet werden:
die CaMV 35S as-1 und as-2 aktivierenden Sequenzen deregulieren die Aktivität des HMWG-Dx5 Promotors (SEQ.ID01) in den Tabakblättern,
die CaMV 35S as-1 und as-2 aktivierenden Sequenzen agieren synergistisch mit cis-regulierenden Motiven, die im HMWG-Dx5 Promotor (SEQ.ID01) vorhanden sind. Die „G"-ähnliche Box scheint eines der Schlüsselelemente dieser kombinatorischen Kontrolle zu sein. Die GATA-Boxen, in Kombination mit der „G"-ähnlichen Box und den CaMV 35S as-1 und as-2 aktivierenden Sequenzen, sind vielleicht für die sehr hohe Aktivität von MPr1130 (SEQ.ID05) und MPr1131 (SEQ.ID06) verantwortlich,
das Verdoppeln der CaMV 35S as-2 aktivierenden Sequenz verleiht keinen merklichen positiven zusätzlichen Effekt,
die „Getreide-Boxen", in Kombination mit den CaMV 35S as-1 und as-2 aktivierenden Sequenzen, scheinen einen negativen transkriptorischen Effekt auf die Tabakblätter zu haben.
Schließlich, da der CaMV D35S Promotor gemeinhin in der Literatur als chimärer Promotor beschrieben wird, der eine Zunahme der Promotoraktivität des GUS-Indikatorgens liefert, die 8 bis 12 Mal größer ist als die von dem CaMV 35S Promotor gelieferte (Kay et al., 1987), sind die MPr1135 (SEQ.ID07), MPr1138 (SEQ.ID10), MPr1139 (SEQ.ID11), MPr1130 (SEQ.ID05) und MPr1131 (SEQ.ID06) Promotoren sicherlich die stärksten in Tabakblättern aktiven chimären Promotoren, die bis heute beschrieben wurden.
Die MPr1133 (SEQ.ID35), MPr1134 (SEQ.ID08), MPr1136 (SEQ.ID08) und MPr1137 (SEQ.ID09) Promotoren, deren Aktivität in Tabakblättern schwächer ist, haben auch einen Vorteil, da sie, um die Selektion von transgenen Pflanzen zu ermöglichen, die Expression der Resistenzgene in gleicher Art und Weise wie z.B. die Promotoren vom „nos"-Typ dirigieren können.
6.5. Quantifizierung der Aktivität der verschiedenen Promotoren im Mais-Eiweiß durch luminometrische Untersuchung der β-Glukuronidase-Expression.
Die bereits durch Biolistics transformierten Eiweiße wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und mit Hilfe eines an einem Bohrer befestigten Glasstabs gemahlen. Das Pulver wurde dann in Extraktionspuffer aufgetaut (25 mM Tris-Phosphat, pH 7,8, 2 mM Dithiothreitol, 2 mM 1,2-Diaminocyclohexan, N,N,N',N'-Tetraessigsäure, 10% Glycerin, 1% Triton X100) im Verhältnis von 1 ml Puffer pro 250 mg Gewebe. Die Mischung wurde homogenisiert und dann für 1 h bei 4°C inkubiert, bevor sie durch 5-minütige Zentrifugation bei 16060 g geklärt wurde.
Die GUS-Aktivität wurde an 10 μl geklärtem Rohextrakt mit Hilfe des „GUS-Light chemilumi-nescent reporter gene assay" Nachweis-Kits (Tropix Inc., Bedford, USA) nach den Empfehlungen des Herstellers gemessen. Die Messung der Lichtemission wurde mit einem Lumat LB 9507 Luminometer (EGG-Berthold, Bad Wildbad, Deutschland) durchgeführt.
Parallel dazu wurde die Luciferase-Aktivität an 10 μl geklärtem Rohextrakt mit Hilfe des "Luciferase-Assay-System" Nachweis-Kits (Promega Corp., Madison, USA) nach den Empfehlungen des Herstellers gemessen. Die Messung der Lichtemission wurde mit Hilfe des Lumat LB 9507 Luminometers in einem kalten Raum bei 4°C durchgeführt.
Die 6 und 7 zeigen die Ergebnisse. Für jeden Assay (drei Halbeiweiße = ein Rohextrakt) wurde das Verhältnis zwischen der mit dem Luminometer gemessenen β-Glukuronidase-Aktivität und der Luciferase-Aktivität berechnet. Der Mittelwert von mindestens 5 unabhängigen Assays pro Konstrukt und die Standardabweichung vom Mittelwert wurden bestimmt.
Um den Effekt der in diesem Patent beschriebenen verschiedenen Modifikationen zu analysieren, die an jedem der Promotoren vorgenommen wurden, wurden die genannten Promotoren in zwei getrennte Gruppen aufgeteilt. Gruppe I (6) besteht aus den Promotoren, die es möglich machen, eine detaillierte funktionelle Sezierung des HMWG-Dx5 Promotors (SEQ.ID01) durchzuführen, und Gruppe II (7) enthält die Promotoren, die es ermöglichen, den Effekt der in diesem Patent untersuchten verschiedenen cis-aktivierenden Elemente in Kombination mit dem HMWG-Dx5 Promotor (SEQ.ID01) zu bestimmen.
Gruppe I enthält die MPr1128, MPr1127 (SEQ.ID03), MPr1126 (SEQ.ID02), MPr1197 (SEQ.ID12), MPr1198 (SEQ.ID13), MPr1216 (SEQ.ID17) und MPr1217 (SEQ.ID37) Promotoren, den HMWG-Dx5 Referenz-Promotor (SEQ.ID01) und das Referenz-Konstrukt pMRT1144 (negative Kontrolle), diesem Konstrukt fehlt die Promotor-Sequenz (6). Die Ergebnisse der luminometrischen Assays erlauben die Ableitung verschiedener Beobachtungen: Die graduelle Deletion der 5' Region des HMWG-Dx5 Promotors (SEQ.ID01) führt zu einer graduellen Abnahme der durch diese Promotoren verliehenen mittleren relativen Aktivität. Die gesamte 417-bp PrHMWG-Dx5 Promotor-Sequenz (SEQ.ID01) scheint somit benötigt zu werden, um maximale Aktivität des HMWG-Dx5 Promotors (SEQ.ID01) zu ermöglichen.
Der leichte Unterschied in der aufgezeichneten Aktivität zwischen den MPR1128 (SEQ.ID04) und PrHMWG-Dx5 (SEQ.ID01) Promotoren zeigt, dass die oberhalb von Nukleotid –238 liegende Sequenz nicht die hauptsächlichen cis-aktivierenden Elemente enthält, die für die Aktivität des HMWG-Dx5 Promotors (SEQ.ID01) verantwortlich sind.
Die signifikante Abnahme der Aktivität zwischen den MPR1128 (SEQ.ID04) und MPr1127 (SEQ.ID03) Promotoren führt zu der Annahme, dass die oberhalb von Nukleotid –205 liegende Sequenz, die eine „G"-ähnliche Box enthält, eine Hauptrolle in der Aktivität des HMWG-Dx5 Promotors (SEQ.ID01) spielt.
Der leichte Unterschied in der aufgezeichneten Aktivität zwischen den MPr1127 (SEQ.ID03) und MPR1126 (SEQ.ID02) Promotoren erlaubt es nicht, einen Schluss bezüglich der tatsächlichen Rolle des Enhancer-Elements zu ziehen.
Die Aktivität des MPr1197 (SEQ.ID12) Promotors, die sehr schwach ist, aber stärker als die mit dem pMRT1144 Konstrukt erhaltene, das keinen Promotor enthält, zeigt, dass die 96-bp Minimum PrHMWG-Dx5 (SEQ.ID01) Sequenz einen Grund-Transkriptions-Level verleiht. Die schwache Aktivität von MPr1198 (SEQ.ID13), verglichen mit der von MPR1128 (SEQ.ID04), zeigt, dass die PrHMWG-Dx5 (SEQ.ID01) Sequenz, die sich von Nukleotid –59 zu Nukleotid –135 erstreckt, obwohl ihr putative cis-Aktivierungs-Elemente fehlen, eine vorherrschende Rolle bei der Aktivität des HMWG-Dx5 Promotors (SEQ.ID01) spielt. Dieses Ergebnis impliziert, dass die Funktionalität und folglich die Zugänglichkeit des trans-Aktivierungs-Faktors an der „G"-Box und an dem aktivierenden Element, vom Abstand zwischen ihnen und der TATA-Box abhängen.
Eine Verdopplung der MPR1128 (SEQ.ID04) Sequenz, die sich von Nukleotid-136 bis Nukleotid-225 erstreckt, die die „G"-Box und das aktivierende Element beherbergen, verleiht dem MPr1216 Promotor (SEQ.ID17) β-Glukuronidase-Aktivität, die wenigstens so hoch ist wie die von PrHMWG-Dx5 (SEQ.ID01) gesteuerte. Umgekehrt hat die Verdreifachung derselben Sequenz im MPr1217 Promotor (SEQ.ID37) keinen zusätzlichen additiven Effekt.
Gruppe II enthält die MPr1128, MPr1213 (SEQ.ID16), MPr1199 (SEQ.ID14), MPr1136 (SEQ.ID08), MPr1137 (SEQ.ID09), MPr1138 (SEQ.ID10), MPr1131 (SEQ.ID06), MPr1135 (SEQ.ID09), MPr1130 (SEQ.ID05), MPr1139 (SEQ.ID11) und MPr1200 (SEQ.ID15) Promotoren, den HMWG-Dx5 Referenz-Promotor (SEQ.ID01) und den g-Zein Promotor, der als positive Kontrolle dient (7). In der gleichen Art wie für die Promotoren der Gruppe I machen es die Ergebnisse der luminometrischen Assays möglich, verschiedene Beobachtungen abzuleiten:
Die Verschmelzung der CaMV 35S as-2 (Lam und Chua, 1989) und as-1 (Lam et al., 1989) aktivierenden Sequenzen an Position –65 bp der HMWG-Dx5 Promotor- (SEQ.ID01) und HMWG-Dx5 Promotor-(SEQ.ID01)Derivate verstärkt sehr stark die Aktivität der resultierenden MPr1130 (SEQ.ID05), MPr1131 (SEQ.ID06), MPr1136 (SEQ.ID08) MPr1137 (SEQ.ID09), MPr1135 (SEQ.ID09) und MPr1138 (SEQ.ID10) Promotoren. Mittels Indikation sind die MPr1131 (SEQ.ID06) und MPr1130 (SEQ.ID05) Promotoren 3,2- bzw. 3,8-Mal aktiver als der HMWG-Dx5 Promotor (SEQ.ID01).
Die CaMV 35S as-2 und as-1 aktivierenden Sequenzen agieren synergistisch mit den cis-aktivierenden Elementen des HMWG-Dx5 Promotors (SEQ.ID01). Die graduelle Abnahme der Aktivität der MPr1131 (SEQ.ID06), MPr1138 (SEQ.ID10), MPr1137 (SEQ.ID09) und MPr1136 (SEQ.ID08) Promotoren, die mit der graduellen 5' Deletionen des HMWG-Dx5 Promotors (SEQ.ID01) zusammenfallen, bestätigen dies.

– Der Vergleich der MPr1130 (SEQ.ID05) und MPr1135 (SEQ.ID07) Promotoren mit den MPr1131 (SEQ.ID06) und MPr1138 (SEQ.ID10) Promotoren zeigt, dass die Verdopplung der CaMV 35S as-2 aktivierenden Sequenz keinen signifikanten additiven aktivierenden Effekt erzeugt.

Schließlich sind die MPr1139 (SEQ.ID1) und MPr1200 (SEQ.ID15) Promotoren, da sie 4 bzw. 3,9-mal aktiver sind als der Prg-Zein Promotor, der gewöhnlich in der Pflanzen-Biotechnologie verwendet wird, um die Proteinexpression auf hohe Level zu bringen, fraglos leistungsfähige Werkzeuge, die in der Lage sind, den Expressionsgrad von heterologenen Proteinen im Mais-Eiweiß zu verbessern. Außerdem muss man anmerken, dass die MPr1130 (SEQ.ID05), MPr1131 (SEQ.ID06), MPr1135 (SEQ.ID07), MPr1138 (SEQ.ID10), MPr1137 (SEQ.ID09) und MPr1136 (SEQ.ID08) Promotoren β-Glukuronidase-Aktivität in den Mais-Eiweißen verleihen, die wenigstens so groß ist wie die mit dem Prg-Zein Promotor erzielte. Schließlich sind auch die weniger effektiven Promotoren sehr wertvoll, da sie dazu benutzt werden können, die Kontrolle der Expression der Resistenzgene oder von Genen zu liefern, die enzymatische Proteine kodieren.
Beispiel 7.
Expression und Auswertungen der Aktivität der verschiedenen Promotoren bei der stabilen Expression in Mais und Tabak.
7.1. Stabile Gen-Transformation bei Mais mit Agrobacterium tumefaciens.
Die verwendete Technik wird von Ishida et al beschrieben. (1996). Unreife Embryos der Länge 1,0 bis 1,2 mm (9 bis 14 Tage nach der Blütenbestäubung) wurden in LS-inf-Medium gewaschen, dann, wie bei Ishida et al. (1996) beschrieben präpariert, in die Agrobakterien-Suspension eingetaucht, für 30 sec. verwirbelt und 5 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Die so behandelten unreifen Embryos wurden auf LS-AS Medium bei 25°C für 3 Tage im Dunkeln kultiviert, dann auf LSD 1,5 Medium, angereichert mit Phosphinotricin 5 mg/l und Cefotaxim 250 mg/l, transferiert, bei 25°C für 2 Wochen im Dunkeln kultiviert und schließlich auf LSD 1,5 Medium, angereichert mit Phosphinotricin 10 mg/l und Cefotaxim 250 mg/l, gebracht, und bei 25°C für 3 Wochen im Dunkeln kultiviert. Die so erzeugten Kalluse vom Typ I wurden isoliert, fragmentiert und auf LSD 1,5 Medium, angereichert mit Phosphinotricin 10 mg/l und Cefotaxim 250 mg/l, transferiert, und bei 25°C für 3 Wochen im Dunkeln kultiviert. Dann wurden die Kalluse vom Typ I, die sich vermehrt hatten, isoliert und auf LSZ Medium, angereichert mit Phosphinotricin 5 mg/l und Cefotaxim 250 mg/l, aufgebracht, und bei einer Photoperiode von 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit bei 25°C für 2 bis 3 Wochen kultiviert. Die regenerierten Jungpflanzen wurden dann auf LSF 1/2 Medium, mit einer Photoperiode von 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit bei 25°C für 1 bis 2 Wochen, und dann in ein Phytotron und ein Treibhaus transferiert.
7.2. Stabile Gen-Transformation bei Tabak mit Agrobacterium tumefaciens.
Die Transformation des Tabaks (Nicotiana tabacum L., des PBD6 Kultivars) wurde durch Infektion von Blattscheiben, die aus 6 Wochen alten Tabakpflanzen in vitro isoliert wurden, mit rekombinanten Agrobakterien nach der von Horsch et al. (1985) beschriebenen Methode durchgeführt. (1985).
Alle In-Vitro Kulturen werden in einem klimatisierten Bereich präpariert, in dem die Lichtintensität 200 μE·m2·s-1 beträgt. Die Photoperiode ist 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit und die Temperatur beträgt 25°C.
Mit Ausnahme des initialen Co-Kultur-Schritts wurden die Regenerations-, Entwicklungs- und Bewurzelungsschritte auf verschiedenen selektiven Medien durchgeführt, die mit einem bakteriostatischen Mittel angereichert wurden, nämlich Augmentin 400 mg/l, und mit einem selektiven Mittel, nämlich Kanamycin 200 oder 100 mg/l.
Die verschiedenen Schritte und die verwendeten Medien sind die folgenden:
Nach dem Vorkultivieren der Agrobakterien in 5 ml 2YT Medium (10 g/l Bactotrypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, pH 7,2), angereichert mit 6 mM CaCl₂ und mit passenden Antibiotika, bei 28°C für 48 Stunden, wird eine Kultur in 10 ml 2YT Medium, angereichert mit CaCl₂ und Antibiotika bei 28°C über Nacht präpariert. Die Kultur wird dann für 10 Min. bei 3000 g zentrifugiert und die Bakterien werden in 10 ml flüssigem MS30 (4,4 g/l M0404 von SIGMA, angereichert mit 30 g/l Saccharose, pH 5,7) resuspendiert.
Das Co-Kultivieren wird durchgeführt, indem ca. 1 cm² Blattexplante, die aus In-Vitro-Jungpflanzenblättern geschnitten wurden, mit der in flüssigem MS30 10-fach verdünnten Agrobakterien-Suspension für 20 Min. in Kontakt gebracht werden.
Dann werden die so behandelten Explantate schnell auf Filterpapier getrocknet und auf einem festen Co-Kultur-Medium (CM) (MS30, Benzylaminopurin (BAP) 1 mg/l, Indol-3-Essigsäure (IAA) 0,1 mg/l, Agar-Agar 8 g/l) für 48 Stunden in dem klimatisierten Bereich aufgebracht.
Die behandelten Explantate werden dann auf ein festes Regenerations-Medium (festes CM, Augmentin 400 mg/l, Kanamycin 200 mg/l) aufgebracht. Die Explantate werden auf demselben Medium nach 2 Wochen subkultiviert.
Nach 2 Wochen werden die Knospen auf einem festen Entwicklungsmedium subkultiviert (4,4 g/l M0404 von SIGMA, angereichert mit 20 g/l Saccharose, pH 5,7 (flüssiges MS20), Augmentin 400 mg/l, Kanamycin 100 mg/l, Agar-Agar 8 g/l).
Nach 2 Wochen werden die transformierten Jungpflanzen auf festem Bewurzelungs-Medium subkultiviert, das identisch mit dem Entwicklungs-Medium ist. Die Bewurzelung dauert 2 bis 3 Wochen. Danach werden die Jungpflanzen in Jiffy-Pots für 10 Tage (Photoperiode von 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit, 23°C und 70% Luftfeuchtigkeit) in den Phytotron verbracht und dann in ein Treibhaus transferiert.
7.3. Messung der β-Glukuronidase-Aktivität in Mais- und Tabakpflanzen.
Um die β-Glukuronidase-Aktivität zu messen, wurden die von den transgenen Pflanzen genommenen Proben in flüssigem Stickstoff eingefroren und mit Hilfe eines an einem Bohrer befestigten Glasstabs gemahlen. Das Pulver wurde dann in Extraktionspuffer resuspendiert (25 mM Tris-Phosphat, pH 7,8, 2 mM Dithiothreitol, 2 mM 1,2-Diaminocyclohexan, N,N,N',N'-Tetraessigsäure, 10% Glycerin, 1% Triton X100) im Verhältnis von 1 ml Puffer pro 250 mg Gewebe. Die Mischung wurde homogenisiert und dann für 1 h bei 4°C inkubiert, bevor sie durch 5-minütige Zentrifugation bei 16060 g geklärt wurde.
Die GUS-Aktivität wurde an 10 μl geklärtem Rohextrakt mit Hilfe des „GUS-Light chemilumi-nescent reporter gene assay" Nachweis-Kits (Tropix Inc., Bedford, USA) nach den Empfehlungen des Herstellers gemessen. Die Messung der Lichtemission wurde mit einem Lumat LB 9507 Luminometer (EGG-Berthold, Bad Wildbad, Deutschland) durchgeführt.
Die Menge an Gesamtprotein im Rohextrakt wurde entsprechend der Bradford-Technik (1976) mit dem "Bio-Rad Protein-Assay" Reagens (Bio-Rad, München, Deutschland) gemessen.
7.4. Stabile Expression und chimäre Promotor-Aktivität in Mais-Endosperm und Blättern.
7.4.1. Expression in Samen.
Die β-Glukuronidase-Aktivität, die durch die chimären HMWG Promotoren bei der stabilen Expression in Mais Endosperm kontrolliert wird, wurde mit der durch den Referenz-Promotor 512 gamma-Zein kontrollierten verglichen, von dem bekannt ist, dass er in Mais-Eiweiß hochaktiv ist (Marzabal et al., 1998). Sechs Samen pro Kolben wurden verschiedenen Wachstumsstadien untersucht, beginnend an der Kolbenspitze und fortschreitend zu seiner Basis.
Als eine Indikation entspricht das 30 DAP-Stadium Maissamen, die 30 Tage nach der Blütenbestäubung entnommen wurden. Die luminometrische Menge β-Glukuronidase-Aktivität wurden entsprechend der in Abschnitt 7.3 von Beispiel 7 beschriebenen Methode bestimmt.
Die in 8 dargestellten Ergebnisse reflektieren die β-Glukurenidase-Aktivität unter der Kontrolle der von dem chimären HMWG-Dx5 abgeleiteten Promotoren (MPr1139, MPr1200 und MPr1131) und des Referenz-Promotors 512 gamma-Zein, während der stabilen Expression in reifen Maissamen, geerntet nach 30 DAP. Der Vergleich der Aktivitäten jeder Pflanzenpopulation gibt einen guten Hinweis auf die Stärke der verschiedenen Promotoren. Die β-Glukuronidase-Aktivität unter der Kontrolle der Promotoren MPr1139, MPr1200 und MPr1131 ist im Durchschnitt in der Größenordnung von 1,5- bis 2-mal so groß wie die unter der Kontrolle des Referenz-Promotors 512 gamma-Zein. Trotzdem zeigen die Samen der Pflanzen 302.A3 und 347.H1, die jeweils das GUS-Protein unter der Kontrolle der Promotoren MPr1139 und MPr1131 exprimieren, eine β-Glukuronidase-Aktivität, die 7- bzw. 14-mal so hoch ist wie diejenige der durch den Referenz-Promotor 512 gamma-Zein kontrollierten Aktivität. Es wurde kein signifikanter Unterschied in der β-Glukuronidase-Aktivität bei Pflanzen festgestellt, die das GUS-Protein unter der Kontrolle der Promotoren MPr1139, MPr1200 und MPr1131 exprimieren. Jedoch variiert die β-Glukuronidase-Aktivität in jeder Pflanzenpopulation beträchtlich. Dieses Phänomen, das schon bei der Mehrheit der in Pflanzen eingeführten Gene beobachtet wurde, kann durch Positionierungseffekte des Transgens und der Kopienzahl erklärt werden. Die luminometrischen Bestimmungen, die an den 13 und 18 DAP Entwicklungsstufen durchgeführt wurden (Ergebnisse nicht dargestellt) deuten an, dass die β-Glukuronidase-Aktivität im Zeitablauf variiert, aber dass die für die höchste β-Glukuronidase-Aktivität verantwortlichen Promotoren am 30 DAP-Stadium auch die stärksten Promotoren in den früheren Entwicklungsstadien bei 13 und 18 DAP sind. Also wird die Klassifizierung der Promotoren während der Entwicklung beibehalten. Das in 9 dargestellte Histogramm zeigt zeitliche Schwankungen der β-Glukuronidase-Aktivität unter der Kontrolle des Promotors MPr1139. Diese Resultate zeigen an, dass die GUS-Aktivität von 10 DAP ab nachweisbar ist, ein Plateau zwischen 16 und 28 DAP erreicht und danach bis zu 30 DAP abnimmt. Das GUS-Aktivitäts-Plateau, das man bei Pflanzen erhält, die man in der Sommer-Periode nimmt, wurde ebenfalls für die Entwicklungsperiode zwischen 12 und 20 DAP beobachtet (Ergebnisse nicht dargestellt). Die an Längsabschnitten von Maissamen bei 13 DAP (10a), 18 DAP (10b) oder an fein geschlitzten Maissamen (10c) durchgeführten histochemischen Tests zeigen an, dass der Promotor MPr1139, in Maissamen spezifisch im Eiweiß ausgeprägt ist. Es wurde keine Färbung im Embryo, im Aleuron oder im Perikarp nachgewiesen. Desweiteren deuten die in 11 dargestellten Histogramme an, dass die Expression des MPr1139 stabil ist oder zumindest größer als in der zweiten Generation (T2).
Aus den vorangegeangenen Daten können die folgenden Informationen zusammengefasst werden:
die aktivierenden Sequenzen as-1 und as-2 des CaMV 35S Promotors, verschmolzen zur Promotor-Sequenz HMWG-Dx5, scheinen sehr starke cis-aktivierende Elemente in Mais-Eiweiß zu sein.
die aktivierenden Sequenzen as-1 und as-2 des CaMV 35S Promotors deregulieren nicht die Aktivität des HMWG-Dx5 Promotors in Maissamen (10).
die Getreide-Boxen haben keinen signifikanten cis-regulierenden Effekt bei der stabilen Expression in Maissamen, der Promotor
MPr1131 ist wenigstens so aktiv wie der Promotor MPr1139.
die Promotor-Sequenz HMWG-Dx5, die sich oberhalb der „G"-Box befindet und sich von Nukleotid –238 bis –378 pb erstreckt, spielt keine Schlüssel-regulatorische Rolle innerhalb der chimeren Promotoren, die vom HMWG abgeleitet sind. Der Promotor MPr1200 ist bei der stabilen Expression von Maissamen wenigstens so aktiv wie der Promotor MPr1139.
Schließlich sind die vom HMWG (MPr1139 MPr1131 und MPr1200) abgeleiteten chimären Promotoren, die im5 Durchschnitt ungefähr 1,5- bis 2-Mal oder noch aktiver für die besten Expressoren 302. A3 und 347. H1 als der Referenz-Promotor 512 gamma-Zein sind, zweifellos äußerst nützliche Werkzeuge, die fähig sind, die Expression von heterologen Proteinen in Mais-Eiweiß zu verbessern. Die vom HMWG abgeleiteten Promotoren können nach der vorliegenden Erfindung dazu benutzt werden, endogene Proteine in monokotyledonischen Pflanzensamen zu überexprimieren, wobei sie im Verhältnis zur Stärkeproduktion einen Vorteil z.B. für die Landwirtschaft, bei der Produktion von Reis oder Weizen, darstellen.
7.4.2 Stabile Expression in Blättern.
Die β-Glukuronidase-Aktivität unter der Kontrolle der Promotoren MPr1139, MPr1131 und MPr1200 wurde durch stabile Expression in Maisblättern bestimmt. Die luminometrischen Bestimmungen der β-Glukuronidase-Aktivität wurden entsprechend der in Abschnitt 7.3 von Beispiel 7 beschriebenen Methode an zwei Blattscheiben durchgeführt, die je einen Durchmesser von zwei Zentimetern aufweisen und 3 Wochen nach der Akklimatisierung in einem Treibhaus von Maispflanzen entnommen wurden.
Der Vergleich der Aktivitäten für jede Pflanzenpopulation zeigt an, dass die durch die chimären Promotoren MPr1139, MPr1200 und MPr1131 kontrollierte β-Glukuronidase-Aktivität höchstens 30 mal größer als das gemessene Untergrundrauschen bei Pflanzen ist, die das GUS-Protein unter der Kontrolle des 512 gamma-Zein Promotors exprimieren (12), mit dem Ergebnis, dass die Promotoren MPr1139, MPr1200 und MPr1131 in den Blättern von Maispflanzen im Entwicklungsstadium drei Wochen nach der Akklimatisierung in einem Treibhaus leicht oder überhaupt nicht aktiv sind. Dennoch offenbaren die histochemischen Tests, die an den Blättern der primären Transformanten (Jungpflanzen) durchgeführt wurden, die das GUS-Protein unter der Kontrolle der vom HMWG abgeleiteten chimären Promotoren exprimieren, während der Bewurzelung bei der In-Vitro-Kultivierung systematisch eine blaue Färbung (Ergebnisse nicht angezeigt).
Diese Ergebnisse sind sehr interessant, da die Aktivität der Promotoren MPr1139, MPr1200 und MPr1131 niedrig aber ausreichend ist, um frühe Tests an den Blättern von transgenem Mais ohne jedes größere Toxizitätsrisiko durchzuführen.
7.5. Stabile Expressions-Aktivität von chimären Promotoren in Tabakblättern und Samen.
7.5.1. Stabile Expression in Blättern.
Die stabile Expressions-β-Glucuronidase-Aktivität unter Kontrolle der Promotoren MPr1130, MPr1131, MPr1135, MPr1138 und MPr1139 wurde mit derjenigen von dem CaMV D35S Promotor kontrollierten in Tabakblättern verglichen. Die luminometrischen Messungen der β-Glukuronidase-Aktivität wurden entsprechend der in Abschnitt 7.3 von Beispiel 7 beschriebenen Methode an zwei Blattscheiben von je zwei Zentimeter Durchmesser, entnommen von verschiedenen Blättern an der Basis des oberen Drittels der primären Transformanten, in den Entwicklungsstadien 2, 5, 8 und 11 Wochen nach der Akklimatisierung in einem Treibhaus durchgeführt. Um die Variationen des Expressionsgrads des Indikatorgens zu begrenzen, die hauptsächlich durch zufällige Integration und die Kopienzahl der Expressionskassette eingebracht wird, wurden für jede Konstruktion 10 bis 30 unabhängige Transformanten untersucht.
Die in 13 dargestellten Ergebnisse geben die β-Glukuronidase-Aktivität der stabilen Expression unter der Kontrolle der chimären Promotoren, die vom HMWG abgeleitet wurden, und der Referenz-Promotoren HMWG-Dx5 und CaMV D35S in Tabakblättern, 11 Wochen nach der Akklimatisierung in einem Treibhaus, wieder. Der Vergleich der Aktivitäten jeder Pflanzenpopulation gibt einen guten Hinweis auf die Stärke der verschiedenen Promotoren. Die kontrollierte β-Glukuronidase-Aktivität, die durch die chimären Promotoren der vorliegenden Erfindung, die vom HMWG abgeleitet sind, ist signifikant größer als die unter der Kontrolle des HMWG-Dx5 Promotors gemessene, aber ungefähr 5- bis 10-Mal niedriger als die unter der Kontrolle des CaMV D35S-Promotors. Unter den verschiedenen HMWG chimären Promotoren wurde kein signifikanter Unterschied in der Aktivität beobachtet, mit Ausnahme der Promotors MPr1139, der geringfügig weniger aktiv war. Die im 2, 5 und 8 Wochen Entwicklungsstadium nach Akklimatisierung in einem Treibhaus gemachten luminometrischen Bestimmungen (Ergebnisse nicht gezeigt), deuten an, dass die β-Glukuronidase-Aktivität mit der Zeit unabhängig vom verwendeten Promotor in jeder Pflanze zunimmt. Aber die stärksten Promotoren im Entwicklungsstadium von 11 Wochen verleihen die höchste β-Glukuronidase-Aktivität in den früheren Entwicklungsstadien (2, 5 und 8 Wochen nach der Akklimatisierung in einem Treibhaus). Folglich trifft die Klassifizierung der Promotoren im 11 Wochen-Stadium auch auf alle anderen Entwicklungsstadien bei Tabak zu.
Aus diesen Daten wird offensichtlich, dass die vom HMWG abgeleiteten chimären Promotoren funktionell, aber nur schwach aktiv in der stabilen Expression in Tabakblättern sind. Der Antragsteller schließt, dass die aktivierenden Sequenzen as-1 und as-2 die Aktivität des HMWG-Dx5 Promotors in Tabakblättern deregulieren, aber keinen starken aktivierenden Effekt in Zusammenhang mit den in der HMWG-Dx5 Promotor-Sequenz vorhandenen cis-regulierenden Elementen hat.
Um diesen scheinbaren Widerspruch zwischen diesen Ergebnissen und denen aus transienten Expressions-Experimenten zu erklären, wurden zwei Hypothesen aufgestellt:
die vom HMWG abgeleiteten chimären Promotoren werden durch Verletzung und/oder Stress während der biolistischen Transformation der Tabakblätter induziert;

– bei der stabilen Tabak-Expression werden die vom HMWG abgeleiteten chimären Promotoren hauptsächlich in den sehr frühen Entwicklungsstadien exprimiert. Die an den primären Tabak-Transformanten in vitro (Jungpflanzen) während des Regenerationsschritts durchgeführten histochemischen Tests deuten eine hohe β-Glukuronidase-Aktivität der vom HMWG abgeleiteten chimären Promotoren an (Ergebnisse nicht gezeigt).

Die vom HMWG abgeleiteten chimären Promotoren, d.h. MPr1130, MPr1131, MPr1135, MPr1138 und MPr1139, können, obwohl sie bei der stabilen Expression von Tabakblättern nur schwach aktiv sind, als Beispiel für die Kontrolle der Expression eines Enzyms dienen, das in einen Biosynthese-Stoffwechselweg der Pflanze impliziert ist. Sie können ebenfalls zur Kontrolle der Expression von Genen verwendet werden, um der Pflanze eine Resistenz zu verleihen, z.B. eine Resistenz gegen ein Antibiotikum oder ein Herbizid, was ein nützliches Auswahlmittel wäre.
7.5.2. Stabile Expression in Tabaksamen.
Die β-Glukuronidase-Aktivität wurde mittels Luminometrie an reifen T1 Tabaksamen (100 mg pro Transformant) bestimmt, entnommen aus 10 bis 30 separaten primären Transformanten, die unabhängig für jede Konstruktion erhalten worden waren. Die Aktivität variiert von Pflanze zu Pflanze in einem gegebenen Konstrukt (vgl. 14), was durch Positionierungseffekte und die Transgen-Kopienzahl im Genom erklärt werden kann.
Die Ergebnisse zeigen, dass bestimmte vom HMWG abgeleitete chimäre Promotoren die β-Glukuronidase-Aktivität in Tabaksamen wenigstens so stark wie der CaMV D35S-Promotor steigern können. Tatsächlich können die Promotoren wie folgt klassifiziert werden:
die Promotoren MPr1130, MPr1131 und MPr1139, welche die β-Glukuronidase-Aktivität im gleichen Maße steigern wie der CaMV D35S Promotor;
die Promotoren MPr113 und MPr1138, die in Tabaksamen zweimal so aktiv sind wie der CaMV D35S-Promotor.
Die erhaltenen Ergebnisse deuten an, dass:
die aktivierenden Sequenzen as-1 und as-2 des CaMV 35S-Promotors in einer vom HMWG abgeleiteten Promotor-Sequenz, die nur eine „G-ähnliche"-Box und das „Enhancer"-Element besitzen, einen wichtigen cis-aktivierenden Effekt verleihen, wie für die Promotoren MPr1135 und MPr1138 beobachtet. Folglich agieren die aktivierenden Sequenzen as-1 und as-2 des CaMV 35S-Promotors in Synergie mit den cis-regulatorischen Elementen, die im HMWG-Dx5 Promotor vorhanden sind. Die „G-ähnliche"-Box und das „Enhancer"-Element scheinen die Schlüsselelemente in dieser Kombinationskontrolle in Tabaksamen zu sein. Die oberhalb der „G"-Box gelegene HMWG-Dx5 Promotor-Sequenz, die sich von Nukleotid –378 bis –238 erstreckt, verleiht den Promotoren MPr1130, MPr1131 und MPr1139 einen negativen cis-regulatorischen Effekt in Tabaksamen. Die Verdopplung der aktivierenden Sequenz as-2 des CaMV Promotors verursacht in Tabaksamen keinen merklichen positiven zusätzlichen Effekt. Tatsächlich erhält man keinen Aktivitäts-Unterschied für MPr1130 bezüglich MPr1131, und auch nicht für MPr1135 bezüglich MPr1138.
die „Getreidel"-Boxen verursachen keinen merklichen additiven cis-aktivierenden Effekt in Tabaksamen, da die für die Promotoren MPr1131 und MPR1139 erhaltenen Resultate ähnlich denen der Promotoren MPr1135 und MPr1138 sind, die bei der stabilen Expression in Tabaksamen hoch aktiv sind, welche wirksame Werkzeuge für die Kontrolle der Expression von heterologen Proteinen in zweikeimblättrigen Pflanzen sind, wie z.B. in solchen Pflanzen, die von hohem landwirtschaftlichem Interesse sind.
Beispiel 8.
Konstruktion des binären Plasmids pMRT1231, das den HMWG-Dx5 Promotor (SEQ.ID01) enthält, der bei der stabilen Transformation von Tabak benutzt wird.
Das binäre Plasmid pMRT1231 wurde durch Einfügen der Expressionskassette „HMWG-Dx5 (SEQ.ID01)uidA-IV2/term-nos" von pMRT1125 in den Restriktionsort HpaI des binären Plasmids pMRT1195 erhalten. Dies ist in der noch zu veröffentlichenden französischen Patentanmeldung FR9911112 beschrieben, hier durch Referenz mit Bezug auf die relevanten Passagen aufgenommen.
Dazu wurden 7 μg des Plasmids pMRT1125 sukzessiv mit EcoRI und XmnI für 1 h bei 37°C aufgeschlossen. Die Expressionskassette wurde dann auf einem 0,7% Agarose-Gel mit Hilfe eines „Concert Rapid Gel Extraction System" Kits isoliert, und der Aktion von 20 E des Klenow-Fragments (New England Biolabs) für 30 Min. bei 37°C in Anwesenheit von 60 nanomol jedes der dNTPs, 12 μl MgCl₂ Puffer (500 mM) und 6 μl DTT (1 M) unterworfen.
Parallel dazu wurden 5 μg des binären Plasmids pMRT1195 mit HpaI für 1 h bei 37°C aufgeschlossen. Das linearisierte Vektorfragment wurde dann mit 40 Einheiten Calf Intestine Alkaline Phosphatase (New England Biolabs) in Anwesenheit des Puffers 3 bei 37°C für 1 h dephosphoryliert.
Die Ligation wurde mit 100 ng der Expressionskassette und 10 ng des oben erhaltenen Plasmids pMRT1195, wie früher beschrieben, mit einer Abfolge von PCR-Zyklen in einem „GeneAmp PCR System 9700" Thermocycler durchgeführt. Vorher präparierte kompetente Escherichia coli DH5α wurden mit der gesamten Ligations-Reaktionsmischung transformiert. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, die auf mit Kanamycin (50 mg/l) angereichertem LB-Medium selektiert wurden, wurde entsprechend der alkalischen Lysemethode extrahiert und mit enzymatischen Aufschließungen analysiert.
Das erhaltene Plasmid, als pMRT1231 bezeichnet, wurde dann, wie bereits in Abschnitt 4.1 von Beispiel 4 beschrieben, in den Stamm Agrobacterium tumefaciens LBA4404-pSB1 transferiert, dessen Stamm sich vom Agrobacterium tumefaciens LBA4404 durch Integration des pSB1 Plasmids, entsprechend dem kürzlich beschriebenen Protokoll ableitet, um den Stamm A1177 zu erhalten. Dies wird in der noch zu veröffentlichenden französischen Patentanmeldung FR9911112 beschrieben, hier durch Referenz mit Bezug auf die relevanten Passagen aufgenommen. Die Plasmid-DNA der erhaltenen Klone, die auf 2Y7-Medium, angereichert mit Rifampicin (50 mg/l), Kanamycin (50 mg/l) und Tetracyclin (5 mg/l), selektiert wurden, wurde entsprechend der alkalischen Lysemethode extrahiert, die durch Zugabe von Lysozym (25 mg/ml) zum Zell-Resuspensionspuffer modifiziert wurde. Die erhaltene Plasmid-DNA wurde durch enzymatische Aufschließung bestimmt und die erhaltenen Agrobakterien als A1231 bezeichnet.
Die stabile genetische Transformation von Tabak wurde, wie in Abschnitt 7.2 von Beispiel 7 beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, dass das im Regenerations- und Entwicklungsmedium verwendete Selektionsmittel Glufosinat 0,5 bzw. 2 mg/l ist.
Beispiel 9.
Konstruktion des binären Plasmids einschließlich der Promotoren MPr1131, MPr1200 und 512 gamma-Zein, die zur stabilen genetischen Transformation von Mais benutzt werden.
9.1. Konstruktion des binären Plasmids pMRT1263.
Das binäre Plasmid pMRT1263 wurde durch Einfügen der Expressionskassette „MPR1131 (SEQ.ID06)/uidA-IV2/term-nos" in den Restriktionsort HpaI des binären Plasmids pMRT1195 erhalten. Dieses Plasmid wird in der noch nicht veröffentlichten französischen Patentanmeldung FR9911112 beschrieben und ist hier durch Referenz mit Bezug auf die relevanten Passagen aufgenommen. Die Einfügung wurde wie in Beispiel 5 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Expressionskassette aus dem Plasmid pMRT1131 isoliert wurde, beschrieben in Abschnitt 3.2 von Beispiel 3.
Das resultierende Plasmid wurde als pMRT1263 bezeichnet und in den Stamm Agrobacterium tumefaciens LBA4404-pSB1 entsprechend dem in Abschnitt 5.1 von Beispiel 5 beschriebenen Protokoll transferiert. Der erhaltene Agrobakterien-Klon wurde mit A1263 bezeichnet.
9.2. Konstruktion des binären Plasmids pMRT1266.
Das binäre Plasmid pMRT1266 wurde durch Einfügen der Expressionskassette „MPr1200 (SEQ.ID15)/uidA-IV2/term-nos" in den Restriktionsort HpaI des binären Plasmids pMRT1195 erhalten. Dies wird in der noch nicht veröffentlichten französischen Patentanmeldung FR9911112 beschrieben, der Text der relevanten Passagen wird hier durch Referenz aufgenommen. Die Einfügung wurde wie in Beispiel 5 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Expressionskassette aus dem Plasmid pMRT1200 isoliert wurde, beschrieben in Abschnitt 3.10 von Beispiel 3.
Das resultierende Plasmid wurde als pMRT1266 bezeichnet und in den Stamm Agrobacterium tumefaciens LBA4404-pSB1 entsprechend dem schon in Abschnitt 5.1 von Beispiel 5 beschriebenen Protokoll transferiert. Der erhaltene Agrobakterien-Klon wurde mit A1266 bezeichnet.
9.3. Konstruktion des binären Plasmids pMRT1209.
Um eine Referenz-Promotorsequenz in der stabilen Expression in Mais-Eiweiß SN 87 165 (L2) zu haben, wurde das uidA Gen unter der Kontrolle des Promotors 512 gamma-Zein und des nos-Terminators, der in den 526 gamma-Zein Plasmiden enthalten ist, beschrieben von Marzabal et al. (1998), in das binäre Plasmid pMRT1195 eingefügt, so wie bereits in Beispiel 5 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Expressionskassette aus dem 526 gamma-Zein-Plasmid isoliert wurde.
Das resultierende Plasmid pMRT1209 wurde in den Stamm Agrobacterium tumefaciens LBA4404-pSB1 transferiert, entsprechend dem schon in Abschnitt 5.1 von Beispiel 5 beschriebenen Protokoll. Der erhaltene Agrobakterien-Klon wurde mit A1209 bezeichnet.
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SEQUENZEN-AUFLISTUNG

Claims

Chimärer Promotor für die Expression, der zumindest eine Nukleinsäuresequenz aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eine Nukleinsäuresequenz aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Sequenzen besteht, die mit den Nummern SEQ.ID05, SEQ.ID06, SEQ.ID07, SEQ.ID09, SEQ.ID10, SEQ.ID11, SEQ.ID13, SEQ.ID15, SEQ.ID17, SEQ.ID37 angegeben werden.
Expressionskassette, die einen Promotor nach Anspruch 1 aufweist, der in funktioneller Weise mit einer zu exprimierenden auszuprägenden Nukleinsäuresequenz verbunden ist, die ein zu produzierendes Polypeptid kodiert, und selbst mit einer Transkriptionsterminations-Nukleinsäuresequenz verbunden ist.
Expressionskassette nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Sequenzen besteht, die mit den Nummern SEQ.ID05, SEQ.ID06, SEQ.ID07, SEQ.ID09, SEQ.ID10, SEQ.ID11, SEQ.ID13, SEQ.ID15, SEQ.ID17, SEQ.ID37 angegeben werden.
Isolierte Nukleinsäuresequenz eines Promotors, dadurch gekennzeichnet, dass sie einer Sequenz entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Sequenzen besteht, die mit den Nummern SEQ.ID05, SEQ.ID06, SEQ.ID07, SEQ.ID09, SEQ.ID10, SEQ.ID11, SEQ.ID13, SEQ.ID15, SEQ.ID17, SEQ.ID37 angegeben werden.
Vektor, der einen Promotor oder eine Expressionskassette aufweist, der bzw. die die Transkription einer Nukleinsäuresequenz einleiten kann, die ein zu produzierendes Polypeptid kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor einem Promotor nach Anspruch 1 oder einer Expressionskassette nach einem der Ansprüche 2 bis 3 entspricht.
Transgene Pflanze, in deren Genom zumindest ein Promotor oder eine Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 4 stabil eingebaut ist.
Transgene Pflanze nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus zweikeimblättrigen Spezies, wie Kartoffel, Tabak, Baumwolle, Lattich, Tomate, Melone, Gurke, Erbse, Raps, rote Rübe oder Sonnenblume, oder einkeimblättrigen Spezies, wie Weizen, Gerste, Hafer, Reis oder Mais, ausgewählt ist.
Vegetative Vermehrungseinheit einer transgenen Pflanze nach einem der Ansprüche 6 oder 7.
Vegetative Vermehrungseinheit einer transgenen Pflanze nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Samen ist.
Zelle, die einen Promotor oder eine Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.
Zelle nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Pflanzenzelle ist.
Verfahren zur Expression einer Nukleinsäuresequenz oder eines Gens, die bzw. das ein zu produzierendes Polypeptid kodiert, in einer Zelle, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte aufweist: – Transformieren der Zelle mit einem Vektor, der zumindest einen Promotor oder eine Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 4 aufweist; – Präparieren einer Kultur der Zelle unter Bedingungen, die die Expression der Nukleinsäuresequenz oder des Gens ermöglichen, die bzw. das das Polypeptid kodiert.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine Zelle ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus mikrobiellen Zellen, Pilzzellen, Insektenzellen, Tierzellen und Pflanzenzellen besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine Pflanzenzelle ist.
Verfahren für die Produktion einer transgenen Pflanze nach einem der Ansprüche 6 oder 7 oder einer vegetativen Vermehrungseinheit nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte aufweist: – Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Vektor, der zumindest einen Promotor oder eine Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 4 aufweist; – Selektion der Pflanzenzelle, in die der Promotor eingebaut ist; – Vermehren der transformierten Zelle und der ausgewählten Pflanzenzelle in einer Kultur oder durch Regenerieren von chimären oder transgenen vollständigen Pflanzen.