DE68922669T2

DE68922669T2 - DNS-Konstruktionen und enthaltende Pflanzen.

Info

Publication number: DE68922669T2
Application number: DE68922669T
Authority: DE
Inventors: Susan Ely; Mary Elizabeth Knight; John Anthony Ray; Wolfgang Walter Schuch
Original assignee: Zeneca Ltd
Current assignee: Syngenta Ltd
Priority date: 1988-08-05
Filing date: 1989-07-19
Publication date: 1995-10-05
Anticipated expiration: 2009-07-20
Also published as: AU3918389A; ATE122717T1; EP0353908B1; EP0353908A2; NZ230206A; JPH0286783A; EP0353908A3; DE68922669D1; GB8818706D0; AU617499B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Konstruktionen und Pflanzen, die sie enthalten.
Die Manipulation von Kulturpflanzen zur Verbesserung der Produktivität erfordert die Expression von fremden oder endogenen Genen in Pflanzengeweben.
In vielen Situationen kann die konstitutive Expression von Genen erforderlich sein. Die Beschränkung auf bestimmte Gewebetypen kann jedoch ebenso erforderlich sein. Beispielsweise werden Toxin-Gene am besten nicht im Endosperm der Getreidepflanzen exprimiert, weil es sich dabei um den zur Ernährung verwendeten Teil der Pflanzen handelt.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine für das grüne Gewebe spezifische Expressionskassette zur Expression von exogenen Genen in Pflanzen.
Wenn photosynthetische Pflanzen der Einwirkung von Licht ausgesetzt werden, kommt es zu einer Anzahl wichtiger Ereignisse. Zu diesen gehören die Reorganisation der Membranen in Chloroplasten, die Aktivierung von darin enthaltenen Enzymen und die Aktivierung von Kerngenen, die für die Synthese von Licht sammelnden Polypeptiden verantwortlich sind, und der durch Licht angetriebene Elektronentransport. Eines dieser Proteine ist das Chlorophyll a/b Bindungsprotein (CAB), das mit dem Photosystem II der Thylakoidmembranen assoziiert ist (1-4). Die CAB-mRNA und -Polypeptide sind nach der Beleuchtung von im Dunklen gezüchteten Maispflanzen erhöht. Die CAB-mRNA kann in grünenden jungen Blättern Spiegel erreichen, die 0,5 - 1 % der mRNA in der Zelle ausmachen (5).
Daher wird das Mais-CAB-Gen als günstige Quelle zur Isolierung von spezifischen Promotoren für das grüne Gewebe vorgeschlagen, und es wird erwartet, daß damit insbesondere in Mais die Expression von fremden Proteinen in großen Mengen möglich ist.
CAB-mRNAs und -Gene wurden aus einer Anzahl von Quellen kloniert, einschließlich Weizen (mRNA und Gene) (6), Erbse (mRNA und Gene) (7), Gurke (mRNA) (8), Mais (mRNA) (4), Tomate (mRNA und Gene) (9) und Tabak (10). Es wurde gezeigt, daß die Promotoren des Weizen-CAB-Gens whAB 1.6 (11) und des Erbsen-CAB-Gens AB 80 (12) ein bakterielles Markergen in transgenem Tabak exprimieren können. Innerhalb des Promotorfragments von 1,8 kb (whAB 1.6) wurde eine kürzere Sequenz von 268 Basenpaaren beschrieben, welche die durch Licht regulierte Expression des bakteriellen Markergens erlaubt (12). Es wurde gezeigt, daß die gleiche Sequenz im Erbsengen vorhanden ist (13). Innerhalb dieser Sequenz wurde auch ein Element gefunden, das die Expression dieses Promotors in Wurzeln (13) "still" macht.
Es wurde ein CAB-Gen aus Mais (Zea mays) isoliert, so daß der Promotor dieses Gens zur Expression von exogenen Genen in Mais und anderen Pflanzen wie beispielsweise Weizen und Gerste und in zweikeimblättrigen Pflanzen wie dem Tabak, der Tomate, der Kartoffel und der Zuckerrübe verwendet werden kann. Der Mais-CAB-Promotor kann eine große Vielzahl von exogenen Genen exprimieren, und zwar einschließlich insbesondere das δ-Endotoxin-Gen aus B. thuringiensis in transgenen Pflanzen, was den Schutz dieser Pflanzen gegen Insektenbefall zur Folge hat.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung eine DNA-Konstruktion bereit, die den Promotor von einem Chlorophyll a/b-Bindungs (CAB)-Protein-Gen, das von der Pflanze Zea mays stammt, enthält, wobei der Promotor operativ an DNA gebunden ist, die für Zea mays exogene RNA codiert, wodurch die Konstruktion die exogene RNA nur unter der Kontrolle des Promotors exprimiert.
Die Erfindung stellt weiterhin Vektoren bereit, die derartige DNA-Konstruktionen enthalten, wobei derartige Vektoren beispielsweise Bacteriophagen und Plasmide sein können.
Die Erfindung stellt außerdem Pflanzengenome mit stabil darin einverleibter rekombinanter DNA bereit, die den Promotor eines von der Pflanze Zea mays stammenden Chlorophyll a/b-Bindungsprotein-Gens enthält, der operativ an für Zea mays exogene RNA codierende DNA gebunden ist, wodurch die RNA nur unter der Kontrolle des Promotors exprimiert wird.
Außerdem werden Pflanzen bereitgestellt, die in ihrem Genom rekombinante DNA stabil einverleibt enthalten, die den Promotor eines Chlorophyll a/b-Bindungsprotein-Gens enthält, der operativ an DNA gebunden ist, welche die Expression von für Zea mays exogene RNA codiert, wodurch die RNA nur im grünen Pflanzengewebe exprimiert wird.
Die durch die Pflanzen nach der Erfindung produzierte exogene RNA kann ein funktionelles Protein codieren, z.B. ein exogenes Protein, beispielsweise ein insecticides Protein wie das δ-Endotoxin von Bacillus thuringiensis. Alternativ kann es eine gewisse andere Funktion in der Pflanzenzelle haben. Beispielsweise kann es sich um Anti-sense-RNA handeln, d.h. RNA, die komplementär (in der Basenpaarung und Sequenzorientierung) zu natürlich durch die Pflanzenzelle produzierter RNA ist. Diese Anti-sense-RNA inhibiert selektiv die Translation der natürlich vorkommenden RNA in Protein. Auf diese Weise stellt die Erfindung ein Mittel bereit, mit dem nicht nur die Bildung von fremden Proteinen im grünen Pflanzengewebe gefördert wird, sondern auch die Bildung von natürlich vorhandenen Proteinen verringert oder inhibiert wird. Beispiele für fremde Proteine, die in grünen Pflanzengeweben gebildet werden können, sind Enzyme, die Schutz gegen den Angriff durch äußere Mittel wie beispielsweise Herbicide, Pilze und Insekten verleihen. Beispielsweise kann grünes Pflanzengewebe gegen Herbicide wie Glyphosat resistent gemacht werden, indem ein resistentes AroA-Gen einverleibt wird, oder gegen Herbicide wie Imidazolin- und Sulfonamid-Herbicide, indem ein resistentes Acetolactat-Synthase (ALS)-Gen einverleibt wird.
Es ist besonders vorteilhaft, wenn in grünem Pflanzengewebe die Bildung von Proteinen gefördert werden kann, welche dieses Gewebe gegen den Befall durch Insekten resistent machen. Besonders nützliche Proteine für diesen Zweck sind Thionine, Chitinasen, Protease-Inhibitoren und das δ-Endotoxin von Bacillus thuringiensis.
Die Beispiele für natürlich vorkommende Proteine, deren Bildung verringert oder beschränkt werden kann, sind zahlreich. Beispiele für Pflanzen, denen die Konstruktionen der Erfindung einverleibt werden können, sind beispielsweise sowohl einkeimblättrige als auch zweikeimblättrige Pflanzen. Obwohl mehrere Verfahren zur Transformierung von einkeimblättrigen Pflanzen beschrieben wurden, ist der Erfolg derzeit gering. Trotzdem erscheint es unumgänglich, daß derartige Techniken bald verfügbar werden, und folglich wird es möglich sein, die Konstruktionen der Erfindung vielen verschiedenen landwirtschaftlich wichtigen einkeimblättrigen Pflanzen einzuverleiben, einschließlich beispielsweise Weizen, Gerste, Mais, Roggen, Hafer, Zuckerrohr, Sorghum, Luzerne, Futtergräser und Reis. Mais ist besonders bevorzugt.
Allgemeine Verfahren zur Transformierung von zweikeimblättrigen Pflanzen (die im allgemeinen auf der Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder von diesem Mikroorganismus stammenden Material beruhen) sind derzeit verfügbar und können zur Herstellung von Pflanzen nach der Erfindung durch Transformieren von beispielsweise Tabak, Kartoffel, Tomate, Rübe und anderen Brassica-Arten wie Kohl, Ölsamen lieferndem Raps, Baumwolle, Erdnüssen, Soja und Sonnenblumen angewendet werden.
Es werden nun Beispiele der Erfindung und damit in Beziehung stehende Experimente konkret beschrieben, und zwar unter Bezugnahme auf die Zeichnungen, von denen:
Figur 1 schematische Restriktionskarten für die DNA- Konstruktionen gCAB48, pCAB48 und pCAB48.1 veranschaulicht.
Figur 2 die Basensequenz des pCAB48.1 xbaI/NcoI-Promotorfragments angibt.
Figur 3 die Struktur des CAB-Gens in pCAB48.1 zeigt.
Figur 4 diagrammartig die Konstruktion der Plasmide pCG1 und pCG2 aus pCAB48.1 und pTAK3 skzizziert.
Figur 5 die Basensequenz des bei der Konstruktion des Plasmids pOL1 verwendeten synthetischen Oligonukleotids zeigt.
Figur 6 diagrammartig die Bildung der Plasmide pCBT1 und pCBT2 skizziert.

Beispiel 1 - Isolation von gCAB 48

1.1 Konstruktion einer Mais-Genbibliothek

Aus ganzen Pflanzen der im Gewächshaus gezüchteten Mais- Linie BE10 (eine geschützte homozygote Mais-Linie von Holdens) wurde die Gesamt-DNA extrahiert. Zur Extraktion der DNA wurde das Verfahren von Murray und Thompson (14) angewendet. Die DNA wurde gereinigt und mit dem Restriktionsenzym Sau3A wie von Maniatis et al. (15) beschrieben teilweise verdaut. Aus Sucrose-Gradienten wurden DNA-Fragmente von ungefähr 20 kb isoliert und in den Phagenvektor EMBL3 kloniert, der mit BamHI geschnitten worden war. Die Genbibliothek wurde unter Standardbedingungen (Maniatis et al.) auf K803 Bakterienzellen ausplattiert.

1.2 Durchmusterung der Genbibliothek

Die Genbibliothek (10&sup5; Plaques) wurde unter Verwendung von synthetischen Oligonukleotiden durchmustert, die der veröffentlichten Weizen-CAB-Gensequenz (Aminosäurepositionen 56-63 und 202-207 des reifen CAB-Proteins) und der Gurken- CAB-cDNA (8) entsprachen.
Die Hybridisierungsbedingungen für die Oligonukleotide waren: 2XSSC, 42ºC, mit Waschungen in 2XSSC bei 42ºC. Die Gurken-CAB-cDNA wurde unter den folgenden Bedingungen hybridisiert: 2XSSC, 65ºC. Nach mehrfacher Hybridisierung und Plaque-Reinigung wurde ein Klon von etwa 20 kb isoliert, der sowohl mit Weizen-Oligonukleotiden als auch mit der Gurken-CAB-cDNA hybridisierte. Dieser Klon wurde gCAB 48 genannt. Eine Karte dieses Klons ist in Fig. 1 angegeben, in der auch die zur weiteren Analyse erzeugten Subklone angegeben sind. Unter Bezugnahme auf Fig. 1 handelt es sich bei pCAB48 um das Plasmid, das durch Klonierung des 13 kb EcoRI-Fragments von gCAB48 in das öffentlich zugängliche Plasmid pBR322 erhalten wurde. pCAB48.1 ist das Plasmid, das durch Klonieren des 2,8 kb PstI-Fragments von gCAB48 in das öffentlich zugängliche Plasmid pUC19 erhalten wurde.

1.3 Sequenzanalyse des in gCAB 48 codierenden Gens

Aus gCAB48 wurde DNA präpariert, und das hybridisierende Pst1-Fragment von 2,8 kb wurde zur Sequenzanalyse in M13 subkloniert. Dies erfolgte nach dem Verfahren von Sanger et al. (16). Es wurde die vollständige Sequenz dieses Gens und seine 5'- und 3'-flankierenden Regionen, die in dem PstI- Fragment enthalten waren, bestimmt. Fig. 2 zeigt die Basenseqenz des XbaI/NcoI-CAB-Promotorfragments. Fig. 3 zeigt die schematische Darstellung des in pCAB48.1 codierten CAB- Gens. Dieses Gen codiert ein vollständiges CAB-Gen von 264 Aminosäuren einschließlich einer Leadersequenz von 32 Aminosäuren, die zur Zielausrichtung auf die Chloroplastenmembranen erforderlich ist. Es enthält auch 5'-Stromaufwärtssequenzen von 1,9 kb, die für die erforderliche spezifische Expression im grünen Gewebe ausreichen.

Beispiel 2 - Verwendung des CAB-Promotors zum Antrieb der spezifischen Expression eines fremden Gens im grünen Gewebe transgener Pflanzen.

2.1 Isolation des CAB-Promotors für Translationsfusionen

Das 2,8 kb PstI-Fragment aus 1.3 oben, welches das vollständige CAB-Gen enthielt, wurde unter Erhalt des Vektors pCAB 48.1 in den üblichen Kloniervektor pUC19 subkloniert. Der CAB-Promotor kann ohne weiteres aus diesem Plasmid auf einem XbaI-NcoI-Fragment isoliert werden. Dieses DNA-Stück enthält 1,0 kb einer 5'-Stromaufwärtsregion (Promotor), 60 Basen der 5'-untranslatierten Region der CAB-mRNA und 18 Basen, die Aminosäuren der prä-CAB-Polypeptid-Sequenz codieren. Dieser Promotor ist zur Konstruktion von Translationsfusionen verwendbar.

2.2 Fusion des CAB-Promotors an das bakterielle GUS-Gen (vgl. Fig. 4).

Die Translationsfusion des CAB-Promotors an das bakterielle β-Glucuronidase (GUS)-Gen wurde bewirkt, indem pCAB 48.1 mit NcoI geschnitten und die Enden unter Standardbedingungen unter Verwendung des Klenow-Fragments A der DNA-Polymerase aufgefüllt wurden. Dann wurde das Plasmid mit XbaI geschnitten. Das 1,2 kb Promotorfragment wurde nach der Auftrennung durch Agarosegel-Elektrophorese isoliert und durch Phenol-Extraktion und Ethanol-Fällung gereinigt. Das Fragment wurde dann in pTAK3 (17) kloniert und mit XhoI und SmaI geschnitten. Dieses Verfahren lieferte das Plasmid pCG1, einen binären Pflanzentransformationsvektor. Die CAB-GUS-Expressionskassette wurde ohne weiteres auf das öffentlich zugängliche Plasmid pUC18 übertragen, und zwar durch Restriktion mit HindIII und EcoRI, wie in Fig. 4 gezeigt. Das erhaltene Plasmid wurde pCG2 genannt.

2.3 Translationsfusion des CAB-Promotors an das δ- Endotoxin-Gen von B. thuringiensis HD73 (vgl. Fig. 6).

Der CAB-Promotor kann verwendet werden, um die Expression eines insecticiden Gens wie dem δ-Endotoxin-Gen aus B. thuringiensis (B.t.) zu betreiben. Dies wird hier durch die Fusion des aus dem Stamm HD73 (vom US-Landwirtschaftsministerium erhältlich) isolierten Gens veranschaulicht. Stattdessen kann jedoch jedes andere B. thuringiensis-Gen verwendet werden. Durch Klonieren eines synthetischen Oligonukleotids mit der in Fig. 5 gezeigten Struktur in pUC18 wurde ein Zwischenvektor pOL1 konstruiert. In diesem Vektor wurde das geschnittene B.t.-Gen aus pJRD2 (siehe unten) kloniert. Dies ist in Fig. 6 gezeigt. Das Plasmid pJRD2 wurde konstruiert, indem der N-terminale Teil des δ- Endotoxin-Gens auf einem Dra1-Fragment mit 2,2 kb ausgeschnitten und dieses Fragment hinter den CaMV35S-Promotor im Plasmid pJR1 kloniert wurde (20). Es wurde gezeigt, daß Plasmide, die dieses Fragment enthalten, Bakterienstämmen und von diesen stammenden Pflanzen insecticide Eigenschaften verleihen.
pOL1 wurde dann mit XbaI und NcoI verdaut, und das 1,1 kb Xbal/NcoI Promotor-Fragment von pCAB48.1 wurde einkloniert. Dies ergab das Plasmid pCOL1. Aus diesem wurde das Plasmid pCBT1 erzeugt, und zwar durch Verdauen mit ClaI und Hind III und Einklonieren des 2,2 kb Fragments, das durch Teilverdauung mit Hind III und ClaI aus pJRD2 isoliert worden war. Aus pCBT1 wurde anschließend pCBT2 hergestellt, und zwar indem das durch Verdauung mit Hind III und EcoRI (teilweise) gebildete 3,6 kb CAB-Bt-nos-Fragment isoliert und in Bin 19 kloniert wurde.

2.4 Isolation des CAB-Promotors für Transkriptionsfusionen.

In einer Anzahl von Fällen kann es erforderlich sein, daß der CAB-Promotor die Expression eines fremden Gens in einer Transkriptionsfusion betreibt. Das Promotorfragment kann aus einem XbaI-Sau3A-Fragment nach Xba1- und teilweiser Sau3A-Verdauung isoliert werden. Die Sau3A-Stellen sind 12 und 7 Basen vom Methionin-Startcodon lokalisiert.

2.5 Fusion des CAB-Promotors an das GUS-Gen

Das CAB-Promotorfragment kann in die GUS-Expressionsvektoren pTAK1/3 (17) kloniert werden, und zwar durch Insertion in die XbaI-BamH1-Stellen, die sich in der Polylinkerregion dieser Vektoren befinden.

2.6 Fusion des CAB-Promotors an das B.t.-Gen

Der aus einem XbaI-Sau3A-Fragment isolierte CAB-Promotor wird in mit BamH1 und Xba1 geschnittenen pUC19 kloniert. Dies ergibt pTCAB1. Das B.t.-Gen wird durch Schneiden mit HindIII und teilweises Schneiden mit ClaI aus pJRD2 ausgeschnitten. Das erhaltene 2,4 kb Fragment, welches das B.t.- Gen und den Nos-Terminator enthält, wird unter Verwendung von Klenow-Polymerase-Fragment A stumpfendig gemacht. Dieses Fragment wird in mit SmaI geschnittenen pTCAB1 kloniert, und zwar unter Erhalt von pTCBT1. Bei dieser Transkriptionsfusion handelt es sich einen direkten DNA-Transformationsvektor. Zur Überführung in Bin 19 zur Verwendung für die durch Agrobacterium vermittelte Transformation wird pTCBT1 mit EcoRI und HindIII geschnitten. Das erhaltene Fragment wird in Bin 19 kloniert.

Beispiel 3

Transformation von Tabak.

3.1 Transormation von Tabakpflanzen mit pCG1.

Der oben in 2.2 beschriebene Vektor pCG1 (Fig. 4), der auf dem binären Pflanzentransformationsvektor Bin19 basiert, wurde durch triparentale Paarung auf Agrobacterien übertragen. Eine Kultur dieser Bakterien wurde dann verwendet, um pCG1-DNA unter Anwendung von Standardprotokollen (18) auf Tabakpflanzen zu übertragen. Die transformierten Pflanzen wurden nach der Selektion auf kanamycin-haltigem Medium (unter Anwendung des in EPA 270 248 beschriebenen Verfahrens) erzeugt. Die mit dem GUS-Expressionsmodul transformierten Pflanzen wurden bei Raumtemperatur unter Anwendung von Standardprotokollen auf GUS-Aktivität untersucht.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3.1 angegeben. Sie zeigen, daß der Mais-CAB-Gen-Promotor die Expression von fremden Genen in transgenen Pflanzen betreibt. Tabelle 3.1 Pflanze Fu*/h/ug Protein Tabelle 3.1 (Fortsetzung) Pflanze Fu*/h/ug Protein Kontrollpflanzen Gus +ve Gus -ve * Fluoreszenzeinheiten

3.2 Transformation von pCBT2 in Tabakpflanzen

Die Transformation von Tabakpflanzen, nämlich wie in 3.1, wurde unter Verwendung des Vektors pCBT2 aus Beispiel 2.3 wiederholt. Die mit den B.t.-Expressionskassetten transformierten Pflanzen wurden auf ihre Widerstandsfähigkeit gegen Infektion durch einen Testorganismus, nämlich Heliothis virescens, untersucht. Sechs Larven des ersten Erscheinungsstadiums wurden auf transformierte Pflanzen aufgebracht. Die abgefressene Blattfläche wurde unter Anwendung eines halbquantitativen Tests bestimmt.
Ein erster Bioassay wurde mit 24 Pflanzen unter Verwendung von sechs Heliothis-Larven zum Befall jeder Pflanze durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3.2 angegeben und zeigen, daß die transformierten Pflanzen in einem geringeren Ausmaß geschädigt werden als Kontrollpflanzen ähnlicher Größe. Bei den Pflanzen 21 und 31 beträgt die Schädigung beispielsweise nur 33 % der Kontrolle. Tabelle 3.2 Pflanze % Abgefressene Blattfläche Durchschnitt Stand.-Abw. Gesamtblattfläche (mm²) Lebende Larven Larven-Gewicht Tabelle 3.2 (Fortsetzung) Pflanze % Abgefressene Blattfläche Durchschnitt Stand.- Abw. Gesamtblattfläche (mm²) Lebende Larven Larven-Gewicht Tabelle 3.2 (Fortsetzung) Pflanze Kontrollen % Abgefressene Blattfläche Durchschnitt Stand.-Abw. Gesamtblattfläche (mm²) Lebende Larven Larven-Gewicht Tabelle 3.2 (Fortsetzung) Pflanze Kontrollen % Abgefressene Blattfläche Durchschnitt Stand.-Abw. Gesamtblattfläche (mm²) Lebende Larven Larven-Gewicht
Der Anteil an Pflanzen, die zu einem gewissen Ausmaß geschützt sind, ist in Anbetracht der Anzahl der untersuchten Pflanzen unerwartet hoch. Aufgrund früherer Erfahrung wurde erwartet, daß nur etwa 14 der 24 Pflanzen überhaupt eine signifikante Expression des δ-Endotoxins zeigen würden. Ebenso wurde erwartet, daß bei nur 1 von 60 Pflanzen ein drastisch erhöhter Schutz auftreten würde, und in der Tat zeigte keine der untersuchten transformierten Pflanzen einen drastischen Anstieg des Schutzes gegen Befall.

3.3 Transformation von Tabak-Protoplasten

Tabakblatt-Mesophyllprotoplasten wurden nach veröffentlichten Verfahren (19) präpariert und in PEG-vermittelten DNA-Aufnahmeexperimenten mit dem Plasmid pCG2 aus Beispiel 2.2 verwendet. Die durch den CAB-Promotor betriebene Expression des bakteriellen Marker-Gens (GUS) wurde unter Anwendung von Standardverfahren gemessen. Die Ergebnisse zeigen, daß der Mais-CAB-Promotor die Expression des GUS- Gens in diesem System sehr effektiv betreibt (Tabelle 3.3). Tabelle 3.3 Konstruktion GUS-Aktivität (Einheiten) Plasmid Keine rDNA CaMV35S-GUS CAB-GUS (Licht) CAB-GUS (dunkel)

Beispiel 4: Analyse von transformierten Tabakpflanzen

4.1 Southern-Analyse

Die DNA wurde aus den in Beispiel 3 produzierten transformierten Pflanzen isoliert und die Gegenwart der übertragenen Gen-Konstruktionen wurde durch Southern-Hybridisierung demonstriert.
Die Plasmide und Konstruktionen, auf die in dieser Beschreibung Bezug genommen wird, wurden im Wirt Escherichia coli des Stamms TG2 bei der National Collections of Industrial und Marine Bacteria (NCIMB), Torry Research Station, P0 Box 31, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Scotland, am angegebenen Datum und unter den folgenden Zugangsnummern hinterlegt: Plasmid Beispiel oder Experiment NCIMB-Nr. Datum

Literatur

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19. Negrutiu et al., Plant Mol. Biol. 8, 363 - 373 (1987),
20. EPA 270248 (ICI).
Die Offenbarung der obigen Dokumente wird durch Bezugnahme hier aufgenommen.

Claims

1. DNA-Konstruktion, die den Promotor von einem Chlorophyll a/b-Bindungs (CAB)-Protein-Gen, das von der Pflanze Zea mays stammt, enthält, wobei der Promotor operativ an exogene DNA gebunden ist, die für Zea mays exogene RNA codiert, wodurch die Konstruktion die exogene RNA nur unter der Kontrolle des Promotors exprimiert.

2. Konstruktion nach Anspruch 1, wobei die exogene DNA ein δ-Endotoxin von Bacillus thuringiensis codiert.

3. Konstruktion nach Anspruch 1, wobei die exogene DNA Anti-sense-mRNA mit komplementärer Sequenz zu durch ein endogenes Pflanzen-Gen exprimierter mRNA codiert.

4. Vektor, der eine DNA-Konstruktion nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 oder Anspruch 3 enthält.

5. Vektor nach Anspruch 4, der einen Bacteriophagen oder ein Plasmid umfaßt.

6. Pflanzengenom mit einer stabil darin einverleibten rekombinanten DNA, die den Promotor eines von Zea mays stammenden CAB-Protein-Gens enthält, der operativ an für Zea mays exogene RNA codierende DNA gebunden ist, wodurch die RNA nur unter der Kontrolle des Promotors exprimiert wird.

7. Pflanze, die in ihrem Genom eine stabil einverleibte rekombinante DNA enthält, die den Promotor eines von Zea mays stammenden CAB-Protein-Gens enthält, der operativ an DNA gebunden ist, welche die Expression von für Zea mays exogene RNA codiert, wodurch die BNA nur im grünen Pflanzengewebe exprimiert wird.

8. Mais-CAB-Protein-Genpromotor, der das aus Zea mays stammende Fragment mit der in Figur 2 angegebenen Basensequenz enthält.

9. DNA-Konstruktion, die einen an ein δ-Endotoxin-Gen des Bacillus thuringiensis-Stamms HD-73 fusionierten CAB- Protein-Genpromotor enthält, wobei sich die Konstruktion im Plasmid pCBT1 (NCIMB 40038) befindet.