AT396249B - Verfahren zur expression von genen in hefe und dna-fragmente und diese dna-fragmente enthaltende plasmide zur verwendung bei diesem verfahren - Google Patents

Description

AT 396 249 B

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Expression von Genen in Hefe und DNA-Fragmente und Plasmide, die diese DNA-Fragmente «ithalten, für die Verwendung in dem neuen Verfahren.

Nachstehend werden folgende Begriffe verwendet;

Promotor-Bereich; Ein DNA-Fragment, das Promotor- und Ziel-Sequenzen der RNA-Pdymerase sowie 5 mögliche Aktivatorbereiche aufweist, die Zielsequenzen für Effektor-Substanzen der Transkription enthalten.

Effektor-Substanz: Substanzen, die eine Regulationsfuriktion ausüben oder vermitteln. Somit werden auch Substanzen als Effektor-Substanzen bezeichnet, die die Konzentration von Substanzen, die Regulationsfunktionen ausüben oder vermitteln, beeinflussen.

Signal-Sequenz: Mit diesem Begriff wird allgemein eine DNA-Sequenz bezeichnet, die zwar in mRNA 10 transkribiert wird, jedoch nicht in ein Protein translatiert wird. Die Signal-Sequenz umfaßt somit das DNA-Fragment von der Transkriptions-Startstelle bis zum Startcodon ATG der Translation.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird mit diesem Begriff üblicherweise ein kurzes DNA-Fragment bezeichnet, das 40 bis 70 bp aufweist und Zielsequenzen für eine posttranskriptionelle Regulation entiiält, die durch intracelluläre Häm-Gruppen ausgeübt oder vermittelt wird. IS CAP-Additions-Stelle: Stelle, an der die 7-Methyl-GTP-Gruppe an die entsprechende mRNA angehängt wird. DNA-Sequenz, DNA-Segment oder DNA-Molekül: Lineare Abfolge von durch Phosphodiesterbindungen zwischen den 3'- und 5'-Kohlenstoffatomen benachbarter Pentose-Reste verbundenen Nucleotiden.

Expression; Vorgang der Bildung einesPolypeptids, ausgehend von einem Strukturgen. Dies istdieKombination von Transkription und Translation und gegebenenfalls vorkommenden posttranslationalen Modifikationen. 20 Flanken: DNA-Sequenzen, die die codierenden Bereiche umgeben. 5-Flanken enthalten einen Promotor. 3-Flanken können beispielsweise Transkriptions-Terminations-Signale enthalt«!.

Gen: Eine aus 3 oder 4 Teilen zusammengesetzte DNA-Sequ«iz. Bei diesen Teilen handelt es sich um (1) die für das Genprodukt codierende Sequenz, (2) die Sequenzen des Promotorbereichs, die die Expression des Gens steuern, (3) die Sequenzen am 3'-Ende, die die Termination der Transkription undgegebenenfalls diePolyadenylierung 23 bestimmen, sowie gegebenenfalls (4) intervenierende Sequenzen.

Intervenierende Sequenzen: DNA-Sequenzen innerhalb eines Gens, die nicht für ein Peptid codieren. Die intervenierend«! S equenzen werden in eine Prä-mRNA transkribiert und durch Modifikation dieser Vorläufer-RNA eliminiert. Dabei wird die mRNA erhalten,

Clonierung: Verfahren, durch das eine Population von Organismen oder von einem dieser Organismen 30 abgeleiteten DNA-Sequenzen durch asexuelle Vermehrung erhalten wird. Insbesondere w«den bei diesem V«fah- ren bestimmte Organismen oder Teile davon isoliert und anschließend vermehrt, so daß eine homogene Population der gewonnenen Subfragmente erhalten wird.

Codierende Sequenz: DNA-Sequenz, die die Aminosäure-Sequenz eines Polypeptids bestimmt.

Boten(messenger)-RNA (mRNA): Durch Trankription eines Gens und gegebenenfalls durch Modifikation der 35 Vorläufer-RNA gebildetes RNA-Molekül. Ein Teil des mRNA-Moleküls wird zur Aminosäure-Sequenz eines Polypeptids translatiert. Auf diese Weise vermittelt das mRNA-Molekül die genetische Botschaft.

Nucleotid:Einemonomere EinheitderDNAoder RNA,dieauseinemZuckerrest(Pentose),einerPhosphatgruppe und einer stickstoffhaltigen heterocyclischen Base besteht. Die Base ist mit dem Zuckerrest über eine glykosidische Bindung (Γ Kohlenstoffatom der Pentose) verbunden. Diese Kombination von Base und Zuckerrest wird als 40 Nucleotid bezeichnet. Die Base charakterisiert das Nucleotid. Die 4 in der DNA enthaltenen Basen sind Adenin (A),

Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T). Die 4 in der RNA enthaltenen Basen sind A, G, C und Uracil (LI).

Plasmid: Eine nichtchromosomale, doppelsträngige DNA-Sequenz, die ein funktionelles Replikon aufweist, so daß das Plasmid in ein« Wirtszelle repliziert werden kann. Wenn das Plasmid in einen einzelligen Organismus eingeführt wird, w«den die M«kmale des Organismus verändert oder als Ergebnis d« DNA des Plasmids 43 transformiert. Beispielsweise transformiert ein das Gen für Tetracyclin-Resistenz (Tc^) tragendes Plasmid eine zuvor Tetracyclin-sensitive Zelle in eine resistente Zelle. Eine durch ein Plasmid transformierte Zelle wird als Transformante bezeichnet.

Polypeptid: Eine lineare Abfolge von Aminosäuren, die durch Peptidbindungen zwischen den α-Amino- und Carboxy-Gruppen benachbarter Aminosäuren verbunden sind. 50 Rekombination: Konstruktion eines neuen DNA-Moleküls durch Kombination von DNA-Fragmenten unter schiedlichen Ursprungs.

Replikation: Verfahren zur Reproduktion von DNA-Molekülen.

Replikon: Ein selbstreplizi«endes genetisches Element, das einen Ursprung für die Initiation d« DNA-Replikation und die Gene aufweist, die die für die Steuerung der Replikation erforderlichen Funktionen codieren. 53 Restriktionsfragment: DNA-Fragment, das aus einer doppelsträngigen DNA mit einem Enzym erhalten wird, das eine spezifische DNA-Zielsequenz erkennt und spaltet RNA-Polymerase: Enzym, das die Transkription von DNA in RNA durchführt -2-

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Transformation: Vorgang, durch den ein Plasmid in eine Zelle eingeführt wird.

Translation: Verfahren der Herstellung eines Polypeptids, ausgehend von mRNA oder Verfahren, bei dem die genetische Information eines mRNA-Moleküls die spezifische Anordnung von Aminosäuren während der Synthese eines Polypeptids steuert 5 Transkription: Verfahren, bei dem eine komplementäre RNA-Sequenz, ausgehend von einer DNA-Sequenz, gebildet wird.

Vektor. Plasmid, Phagen-DNA oder andere DNA-Sequenzen, die zur Replikation in einer Wirtszelle fähig sind und eine einzige oder eine kleine Anzahl von Endonucleaseerkennungsstellen aufweisen, an denen DNA-Sequenzen in vorbestimmter Weise ohne Verlust einer wesentlichen biologischen Funktion der DNA, z. B. Replikation, Bildung 10 von Mantelproteinen oder Verlust einer Promotor- oder Bindungs-S teile, gespalten werden können und die einen für die Verwendung bei der Identifizierung transformierter Zellen geeigneten Mark»- enthalten, also beispielsweise Tetracyclin- oder Ampicillin-Resistenz vermitteln. Ein Vektor wird häufig auch als Clonierungs-Vehikel bezeichnet

Die Herstellung eines biologisch aktiven Erzeugnisses mit Hilfe der DNA-Rekombinaüonstechnik ist eine komplexe Aufgabe, deren Lösung viele Verfahrensschritte umfaßt, d. h. von der Initiation der Transkription bis hin 15 zum Erhalten des biologisch aktiven Moleküls.

Viele dieser Verfahrensschritte gibt es in prokaryontischen Organismen nicht Deshalb müssen in vielen Fällen eukaryontische Organismen zur Herstellung des biologisch aktiven Erzeugnisses verwendet werden.

Hefe ist ein eukaryontischer Organismus. Der Syntheseapparat der Hefe weist viele der Vorgänge und Regulationsmechanismen auf, die für höhere Organismen charakteristisch sind. Außerdem haben Hefezell«! eine 20 kurze Generationszeit. Ferner gibt es eine 1000 Jahre alte experimentelle Erfahrung für die Verwendung von Hefe als Kulturorganismus.

Absolut entscheidende Faktoren für eine biologische Synthese eines gewünschten Genprodukts sind die Möglichkeit und die Verbesserung der Transkriptions-Initiation sowieder transkriptionellen undposttranskriptionellen Regulation der Genexpression. 25 Diese Funktionen werden hauptsächlich durch die 5-Flanken vermittelt Eine Vielzahl von 5'-Flanken prokaryontischer und eukaryontischer Gene wurde bereits sequenziert Unter anderem auf die so erhaltenen Sequenzdaten stützt sich ein umfassendes Wissen über die Regulation der Genexpression und die über die für die Regulation der Genexpression wichtigen Subregionen und Sequenzen. Zwischen den Regulationsmechanismen prokaryontischer und eukaryontischer Organismen bestehen große Unterschiede. Andererseits gibt es zwischen 30 diesen Gruppen von Organismen viele gemeinsame Merkmale.

Die Regulation der Genexpression kann im Stadium der Transkription stattfinden. Dabei wird sie vorzugsweise durch die Steuerung der Häufigkeit der Transkription ausgeübt. Diese Steuerung ist gut bekannt (vgl. n. a. Benjamin Lewin, Gene Expression, John Wiley & Sons, Bd. I (1974), Bd. Π, 2. Aufl. 1980, Bd. III (1977)). Andererseits kann die Regulation auch auf posttranskriptioneller Ebene stattfinden, beispielsweise durch die Steuerung der Translations-35 Initiations-Häufigkeit, die Geschwindigkeit der Translation und durch die Beendigung der Translation.

Leghämoglobine sind monomere Hämoproteine, die ausschließlich in Wurzelknöllchen synthetisiert werden. Wurzelknöllchen entwickeln sich durch die Symbiose zwischen Rhizobien und Leguminosen. Eine logische Effektor-Substanz, die die Leghämoglobin-Gene aktiviert, sind die in Rhizobien gebildeten Häm-Gruppen. Sie stellen prosthetische Gruppen des Leghämoglobins dar. Die Synthese verschiedener Hämoproteine in der Hefe-Art 40 Saccharomyces cerevisiae wird ebenfalls durch den Pegel intracellulärer Häm-Gruppen gesteuert. Die Häm-Gruppen sind auch prosthetische Gruppen dieser Proteine. Beispielsweise ist die Transkription des Isocytochrom c-Gens von Häm-Gruppen abhängig während die Steuerung des Katalase Tj-Gens durch die Häm-Gruppe sowohl auf transkritpioneller als auch auf posttranskriptioneller Ebene erfolgt.

Mit der vorliegenden Erfindung werden die Sequenzen der 5’-Flanken der 4 Sojabohnen-Leghämoglobin-Gene 45 Lba, Lbcl, Lbc2 und Lbc3 bereitgestellt. Die Sequenzen sind in Figur I dargestellt Dabei sind sie so angeordnet, daß

Homologien zwischen den Sequenzen klar ersichtlich sind.

Aus der Darstellung der Sequenzen ist erkennbar, daß zwischen den 4 verschiedenen 5-Flanken deutliche Homologien bestehen und, daß alle Sequenzen an der Position 23 bis 24 bp stromaufwärts von der CAP-Additions-Stelle die Sequenz TATATAAA aufweisen, die der „TATA“-Box eukaryontischer Zellen entspricht, die sich 50 üblicherweise in einem Abstand ähnlich vieler Basenpaare stromaufwärts von der CAP-Additions-Stelle befindet.

Außerdem befindet sich an der Position 64 bis 72 bp stromaufwärts von der CAP-Additions-Stelle die Sequenz CCAAG. Diese entspricht der „CCAAT“-Box, die sich üblicherweise in einem Abstand von 70 bis 90 Basenpaaren stromaufwärts von der CAP-Additions-Stelle befindet. Ausgehend von der CAP-Additions-Stelle in Richtung des Translations-Startcodon (ATG) befinden sich Signal-Sequenzen von 52 bis 59 Basenpaaren. Auch diese weisen eine 55 besonders hohe Homologie von etwa 75 bis 80 % auf.

Erfindungsgemäß wurde außerdem am Beispiel des Lbc3-Gens gezeigt, daß die 5'-Flanken der Sojabohnen-Leghämoglobin-Gene funktionell in Hefe aktiv sind. Dies wurde durch Fusion des E. -3-

AT 396 249 B coli-Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-Gens mit den 5'- und 3-Flanken des Sojabohnen Lbc3-Gens gezeigt Die Fusion wurde dabei so ausgeführt, daß der Lb-Promotor die Expression des CAT-Gens steuert Das Fragment wurde für die Fusion in das Hefeplasmid YEP 24 inseriert das als Selektionsmarker das URA-3-Gen der Hefe trägt Der Hefestamm S. cerevisiae TM 1 wurde sodann mit dem erhaltenen Konstrukt transformiert. Er hat den 5 Genotyp URA-3* und ist wegen einer Mutation in δ-Aminolävulinsäure-Synthetase-Gen (δ-ALA) nichtin der Lage, Häm-Gruppen zu synthetisieren. Die transformierten Hefezellen zeigten bei allen untersuchten Wachstumsbedingungen eine CAT-Aktivität. Daraus folgt daß die S'-Flanken der Sojabohnen-Hämoglobin-Gene in Hefe aktiv sind.

Außerdem wurde erfindungsgemäß gezeigt daß die S'-Flanken Ziel der durch intracelluläre Häm-Gruppen 10 ausgeübten oder vermittelten Regulation sind. Deshalb ist die CAT-Aktivität in in Gegenwart von δ-ALA gezüchtete S. cerevisiae TMl-Zellen 20- bis 40fach höher als in Zellen, die ohne diesen Häm-Vorläufer im Wachstumsmedium gezüchtet wurden. Ähnlich hohe CAT-Aktivitäten wurden in S. cerevisiae TMl-Zellen angetroffen, die in Gegenwart von Häm-Gruppen, Protoporphyrin IX oder des Häm-Analogons Deuteroporphyrin IX gezüchtet wurden. Die Auswirkung der Häm-Gruppe auf die CAT-Aktivität ist spezifisch, da die Menge des IS URA-3-Genproduktes bei allen getesteten Bedingungen konstant bleibt Außerdem verändert sich das Ausmaß der

Transkription nicht merklich, da nämlich in Gegenwart der Häm-Gruppen der CAT-mRNA-Spiegel unabhängig von der intracellulären Häm-Gruppen-Konzentration konstant bleibt Daraus folgt, daß die durch Häm-Gruppen ausgeübten oder vermittelten Regulationsmechanismen auf posttranskriptioneller Ebene eingreifen.

Der beobachtete Anstieg der CAT-Aktivität ist Proteinsynthese-äbhängig. Die Halbwertszeit des Enzyms CAT 20 ist außerdem unabhängig von der Gegenwart von Häm-Gruppen. Die CAT-Aktivität wird in vitro nicht durch Häm-

Gruppen stimuliert Deshalb ist davon auszugehen, daß die Häm-Gruppen die Genexpression auf der Ebene der Translation regulieren. Eine Fusion der 5-Flanke des Lbc3-Gens mit der codierenden Region des Neomycin-Phosphotransferase (neo)-Gens wird sehr ähnlich gesteuert wie das mit der 5-Flanke desLbc3-Gens fusionierte C AT-Gen. Somit wird die Wirkung der Häm-Gruppen nicht durch Wechselwirkungen mit der codierenden Sequenz 2S ausgelöst sondern durch Wechselwirkungen mit Sequenzen der 5'- oder 3'-Flanken des Lbc3-Gens, die in der CATmRNA vorliegen. Die Expression eines Gens, das nur Bereiche der 5-Flanke des Lbc3-Gens aufweist, mitdem neo-Gen wird auf ähnliche Weise durch Häm-Gruppen gesteuert. Die Wirkung intracellulär»' Häm-Gruppen auf die Gen-Expression kann somit durch eine Wechselwirkung mit den Signal-Sequenzen vermittelt w»den.

Die kurzen Signal-Sequenzen enthalten keine Translations-Startcodons. Die durch intracelluläre Häm-Gruppen 30 ausgeübtenod»vermitteltenRegulationsmechanismensinddeshalbnichtvergleichbarmitRegulationsmechanismen, die mit falschen Startcodons Zusammenhängen (vgl. T. Hunt Nature 316 (1985), 580-581). Die erfindungsgemäß beschriebenenRegulationsmechanismen werden durch Häm-Gruppen ausgeübtodervermitteltdiemitein»Signal-Sequenz wechselwirken. Somit handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Regulationsmechanismen um neue Regulationsmechanismen. 35 Das Vorliegen von Plasmiden in einer in natürlicher Umgebung auftretenden Zelle vermittelt ihr Eigenschaften, die nur unter bestimmten Umständen vorteilhaft sind. Beispielsweise handelt es sich bei solchen Plasmid-codierten Eigenschaften um die Resistenz gegen ein in der Umgebung vorkommendes Antibiotikum. Ein Plasmid und die Synthese von Genprodukten, die durch das Plasmid codiert werden, belasten jedoch auch den Energiestoffwechsel d» Zelle und ihren Proteinsynthese-Apparat. Deshalb werden Zellen, die ein Plasmid tragen unter Umwelt-40 bedingungen, bei denen die vom Plasmid codierten Eigenschaften nicht erford»lich sind, v»drängt und sie gehen v»loien.

Die vorstehend erwähnte Instabilität wird zusätzlich gesteig»t durch die Verwendung von Plasmiden als Vektoren zur Synthese eines gewünschten Genproduktes, das von d» betreffenden Zelle übliclterweise nicht h»gestelltwircL Dies impliziert, daß derartige Produkte synthetisierende Zellen einem Selektionsdruck unterworfen 45 werden müssen, um sicherzustellen, daß das gewünschte Genprodukt noch synthetisiert wird. Mit dem vorstehend beschrieben»! Verfahren wird die hohe Expressionsrate eines bestimmten Genprodukts dadurch erreicht, daß die Expression durch einen starken Promotor gesteuert wird. Dadurch entsteht eine hohe Konzentration der mRNA, die zum Genprodukt translatiert wird.

Eine höhere Konzentration des Genprodukts kann jedoch ebenso durch eine wirkungsvollere Translation der 50 mRNA »zielt werden. Dies impliziert, daß die Synthese des Genprodukts sowohl auf transkriptioneller Ebene, als auch auf Ebene der Translation gesteuert wird, d. h. daß die genetische Belastung einer ein bestimmtes Genprodukt synthetisi»ende Zelle auf zwei Aktivitäten verteilt werden kann anstatt, wie üblich, nur auf eine.

Die beiden Aktivitäten lassen sich daher so beeinflussen, daß sich dieselben Ergebnisse bezüglich der Genprodukte erhalten lassen, obwohl der Promotor nicht ebenso stark ist, wie die üblicherweise verwendeten 55 Promotoren. Eine derartige Verteilung der beiden Aktivitäten bedeutet, daß die Zelle genetisch nicht so stark belastet ist, wie bei einer nur durch einen starken Promotor gesteuerten Synthese des Genprodukts. Damit kann d» Selektionsdruckfür derartigeZellen vermindert werden. Außerdem ist es wichtig, denEnergiestoffwechsel der Zelle -4-

AT 396 249 B und ihren Proteinsynthese-Apparat so gut wie möglich in der Phase auszunutzen, in der das gewünschte Genprodukt auf tritt Vorzugsweise wild die Ausnutzung des Energiestoffwechsels und des Proteinsynthese-Apparates durch Optimierung später Schritte der Synthese eines Genprodukts verbessert und nicht durch Optimierung früher Schritte.

Ein wichtiges Merkmal eines Gen-Expressionssystems ist daher, daß sich die Expression des gewünschten S Produkts ausgehend von einer anfangs niedrigen Expression durch Beeinflussen der Umgebungsbedingungen der

Zelle bis zu einer Überproduktion steigern läßt Ein solches System wird erfmdungsgemäß beschrieben. Außerdem ist eine induzierbare Optimierung der posttranskriptioneilen Syntheseschritte, wie sie erfmdungsgemäß durchge-fiihrt wird, vorteilhaft gegenüber einer induzierten Optimierung der Transkription. Bekannte Verfahren von Genen in Hefe bedienen sich einer Reihe von Promotoren und Expressionsvektoren. Ein Beispiel dafür gibt die EP-A2-10 120 5S1, die die Verwendung von GAPDH- oder PyK-Hefepromotoren und diese Hromotoren enthaltende

Expressions-Vektoren beschreibt.

Die GB-A-2 137 208 beschreibt darüber hinaus die Verwendung des Promotors GAL1 in verschiedenen Expressionsvektoren.

Bei der Verwendung dieser bereits bekannten Promotoren läßt sich die Expression nur durch eine Steigerung der 15 Transkriptions-Initiations-Häufigkeit steigern. Die Verwendung dieser Promotoren bringt dementsprechend eine starke genetische Belastung der Zelle mit sich, führt zu einem unrationellen Ausnutzen des Energie-Stoffwechsels und des Synthese-Apparates sowie zu einer sich daraus ergebenden Instabilität, da bei der Verwendung dieser Promotoren ein hoher Selektionsdruck für die Wirtsorganismen erforderlich ist.

Daher liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu schaffen, bei dem inHefe aktive 20 Promotoren sowie Signal-Sequenzen verwendet werden, die die Expression des nachfolgenden Gens in bisher nicht bekannter Weise der Regulation in einem posttranskriptioneilen Stadium zugänglich machen. Ferner liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, neue Kombinationen aus Promotor- und Signal-Sequenzen zu schaffen, die aus den 5-Flanken von Pflanzen-Leghämoglobin-Genen erhalten wurden undauch in Hefe funktionell sind. Schließlichliegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, Plasmide bereitzustellen, die die vorstehende Kombination aus Promotor- und 25 Signal-Sequenzen enthalten.

Die Aufgabe wird erfmdungsgemäß durch Bereitstellung eines Verfahrens zur Expression von Genen in Hefe gelöst, bei dm man Hefezellen mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert, das sowohl das zu exprimierende Gen als auch die 5'-Flanke mit einer Promotor-Sequenz enthält, und die transformierten Hefezellen in einem Kulturmedium züchtet. Das erfindungsgemäße Verfahren weist die Besonderheit auf, daß die 5'-Flanke ein 30 erstes, eine Promotor-Sequenz enthaltendes DNA-Fragment aufweist, das mit einem zweiten DN verbunden ist, das eine Signal-Sequenz codiert, die im posttranskriptionellen Stadium durch eine Häm-Gruppe, Häm-Gruppen-Analoga oder durch Häm-Gruppen-Vorläufer reguliert wird. Auf diese Weise isteserfmdungsgemäß möglich,durch Insertion eines Gens stromabwärts von der Kombination in einem geeigneten Vektor, der in Hefe replizierbar ist, Synthese eines biologisch aktiven Produkts zu bewirken. Das Verfahren gestattet eine Erhöhung derExpression eines 35 gewünschten Gens mit Hilfe eines neuen Regulationsmechanismus, der im posttranskriptionellen Stadium eingreift.

Besondere Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens sind eine verminderte genetische Belastung der Wirtszelle und eine optimale Ausnutzung des Protein-Synthese-Apparates sowie des Energiestoffwechsels der Wirtszelle. Daraus ergibt sich nämlich eine erhöhte Stabilität des Expressions-Vektors in der Wirtszelle.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird als erstes DNA-Fragment eine isolierte oder 40 synthetisierte Promotor-Sequenz zur Kombination mit der zweiten isolierten oder synthetisierten Signal-Sequenz verwendet. Dementsprechend ist es möglich, beliebige Signal-Sequenzen aus Hefe, Pflanzen oder Tieren, die unter natürlichen Bedingungen einer posttranskriptionellen Regulation nach dem vorstehend erläuterten Verfahren unterworfen sind, mit beliebigen geeigneten Hefe-Promotoren, Pflanzen-Promotoren oder anderen, in Hefe funktionellen Promotoren, zu kombinieren. 45 IneinerbevorzugtenAusführungsformdeserfindungsgemäßenVerfahrenswiiddieintracelluläreKonzentration der Häm-Gruppe durch Versetzen des Kulturmediums mit Kohlenstoffquellen »höht, vorzugsweise mit nicht vergärbaren Kohlenstoffquellen, die eine Erhöhung der intracellulären Konzentration der Häm-Gruppe bewirken. Durch Versetzen des Kulturmediums mit der Kohlenstoffquelle wird die Induktion der Expression des gewünschten Gens erzielt Beispiele solcher Kohlenstoffquellen sind Glycerin und Succinat Sie werden besonders bevorzugt, da 50 sie billige und leicht erhältliche Kohlenstoffquellen darstellen. Vorzugsweise ist die Kohlenstoffquelle Äthanol. Unter bestimmten Bedingungen kann die Hefe das Äthanol während des Wachstums selbst bilden. Nach Beendigung des Wachstums wird das Äthanol von der Hefe verwertet und dadurch wird die Translation erhöht

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird dieselbe Wirkung dadurch erzielt daß man die intrazelluläre Konzentration der Häm-Gruppe durch V »setzen des Kulturmediums mit mindestens ein» der Verbindungen Häm-55 Gruppe,Häm-Gruppen-AnalogaoderHäm-Gruppen-VorläufemerhöhtBes(Hidersbevorzugtwirddie Verwendung des Häm-Analogons Deuteroporphyrin IX und des Häm-Gruppen-Vorläufers δ-Amino-Lävulinsäure.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform d» Erfindung wird ein DNA-Fragment verwendet, das eine -5-

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Promotor-Sequenz und eine Signal-Sequenz enthält, und das entweder identisch mit 5-Flanken von Pflanzen-Leghämoglobingenen,Hefe-Genenoderanderen Genen ist,diebeinatürlichenBedingungeneinerdurch intrazelluläre Häm-Gruppen ausgeübten oder vermittelten Expressions-Regulation unterliegen, oder das von diesen 5-Flanken abgeleitet ist oder sie enthält Damit ist eine Kombination einer Signal-Sequenz mit einer Promotor-Sequenz leicht zugänglich. Die Funktionsfähigkeit dieser Kombination wurde erfindungsgemäß nachgewiesen. Beispiele solcher DNA-Fragmente sind die vier 5-Flanken der Sojabohnen-Leghämoglobingene Lba, Lbcl, Lbc2 undLbc3.

Das Lba-Gen hat die Sequenz GAGATACATT ATAATAATCT CTCTAGTGTC TATTTATTAT TTTATCTGGT GATATATACC TTCTCGTATA CTGTTATTTT TTCAATCTTG TAGATTTACT TCTTTTATTT TTATAAAAAA GACTTTATTT TTTTAAAAAA AATAAAGTGA ATTTTGAAAA CATGCTCTTT GACAATTTTC TGTTTCCTTT TTCATCATTG GGTTAAATCT CATAGTGCCT CTATTCAATA ATTTGGGCTC AATTTAATTA GTAGAGTCTA CATAAAATTT ACCTTAATAG TAGAGAATAG AGAGTCTTGG AAAGTTGGTT TTTCTCGAGG AAGAAAGGAA ATGTTAAAAA CTGTGATATT TTTTTTTTGG ATTAATAGTT ATGTTTATAT GAAAACTGAA AATAAATAAA CTAACCATAT TAAATTTAGA ACAACACTTC AATTATTTTT TTAATTTGAT TAATTAAAAA ATTATTTGAT TAAATTTTTT AAAAGÄTCGT TGTTTCTTCT TCATCATGCT GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC ACATAAGCTT TGGTTTTCTC ACTCTCCAAG CCCTCTATAT AAACAAATAT TGGAGTGAAG TTGTTGCATA ACTTGCATCG AACAATTAAT AGAAATAACA GAAAATTAAA AAAGAAATAT G, das Lbcl-Gen hat die Sequenz:

TTCTCTTAAT ACAATGGAGT TTTTGTTGAA CATACATACA TTTAAAAAAA

AATCTCTAGT GTCTATTTAC CCGGTGAGAA GCCTTCTCGT GTTTTACACA

CTTTAATATT ATTATATCCT CAACCCCACA AAAAAGAATA CTGTTATATC

TTTCCAAACC TGTAGATTTA TTTATTTATT TATTTATTTT TACAAAGGAG

ACTTCAGAAA AGTAATTACA TAAAGATAGT GAACATCATT TTATTTATTA

TAATAAACTT TAAAATCAAA CTTTTTTATA TTTTTTGTTA CCCTTTTCAT TATTGGGTGA AATCTOATAG TGAAGCCATT AAATAATTTG GGCTCAAGTT TTATTAGTAA AGTCTGCATG AAATTTAACT TAACAATAGA GAGAGTTTTC GAAAGGGAGC GAATGTTAAA AAGTGTGATA TTATATTTTA TTTCGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA CATACAAAAA AATACTTTTA AATTCAGAAT AATACTTAAA ATATTTATTT GCTTAATTGA TTAACTGAAA ATTATTTGAT TAGGATTTTG AAAAGATCAT TGGCTCTTCG TCATGCCGAT TGACACCCTC CACAAGCCAA GAGAAACTTA AGTTGTAAAC TTTCTCACTC CAAGCCTTCT ATATAAACAT GTATTGGATG TGAAGTTATT GCATAACTTG CATTGAACAÄ TAGAAAATAA CAAAAAAAAG TAAAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG, das Lbc2-Gen hat die Sequenz:

TCGAGTTTTT ACTGAACATA CATTTATTAA AAAAAACTCT CTAGTGTCCA TTTATTCGGC GAGAAGCCTT CTCGTGCTTT ACACACTTTA ATATTATTAT ATCCCCACCC CCACCAAAAA AAAAAAAACT GTTATATCTT TCCAGTACAT TTATTTCTTA TTTTTACAAA GGAAACTTCA CGAAAGTAAT TACAAAAAAG ATAGTGAACA TCATTTTTTT AGTTAAGATG AATTTTAAAA TCACACTTTT TTATATTTTT TTGTTACCCT TTTCATTATT GGGTGAAATC TCATAGTGAA ACTATTAAAT AGTTTGGGCT CAAGTTTTAT TAGTAAAGTC TGCATGAAAT TTAACTTAAT AATAGAGAGA GTTTTGGAAA GGTAACGäAT GTTAGAAAGT GTGATATTAT TATAGTTTTA TTTAGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA TTGACAATTT ATTTTTAAAA TTCAGAGTAA TACTTAAATT ACTTATTTAC TTTAAGATTT TGAAAAGATC ATTTGGCTCT TCATCATGCC GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC TTAAGTTGTA ATTTTTCTAA CTCCAAGCCT TCTATATAAÄ CACGTATTGG ATGTGAAGTT GTTGCATAAC TTGCATTGAA CAATAGAAAT AACAACAAAG AAAATAAGTG AAAAAAGAAA TATG, -6-

AT 396 249 B und das Lbc3-Gen bat die Sequenz: TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT GTAGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA CAGAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG .

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird erfindungsgemäß ein DNA-Fragment verwendet, das mit Bereichen der 5-Flanke des YEP Lb CAT-Gens mit der Sequenz

TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT GTAGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT TTGTTTAAAT TGGATÄAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA CAGAAAAGTA GAATTCTAAA ATG identisch oder davon abgeleitet ist oder sie enthält

In einer weiteren Ausführungsform wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides durch Transformation einer Hefezelle mit einem rekombinanten Plasmid, beschrieben, welches dadurch gekennzeichnet ist - daß das rekombinante Plasmid eine Promotor-Sequenz und eine Signal-Sequenz in einem DNA-Fragment enthält das die 5-Flanke eines Pflanzen-Leghämoglobingens aufweist, und eine das Polypeptid kodierende Sequenz enthält - das Polypeptid in der Hefezelle exprimiert wird, und - das rekombinante Polypeptid durch bekannte Reinigungsverfahren präpariert wild.

In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens wird erfindungsgemäß ein rekombinantes Plasmid verwendet das eine Promotor-Sequenz und eine Signal-Sequenz in einem DNA-Fragment enthält das sowohl die 5-Flanke als auch die 3-Flanke eines Pflanzen-Leghämoglobingens aufweist, und eine das Polypeptid kodierende Sequenz enthält

Außerdem betrifft die Erfindung ein DNA-Fragment zur Verwendung als zweites DNA-Fragment bei den -7-

AT 396 249 B erfindungsgemäßen Verfahren, das ein kurzes DNA-Fragment ist, das in einen mRNA-Strang transkribiert wird, der Ziel für eine durch intracelluläre Häm-Gruppen ausgeübte oder vermittelte Regulation ist

Erfindungsgemäß werden DNA-Fragmente bevorzugt, die mit einer Signal-Sequenz von Pflanzen-Leghämoglobingenen, Hefegenen oder anderen Genen identisch sind, in denen die Signal-Sequenz bei natürlichen 5 Bedingungen Ziel für eine durch intracelluläre Häm-Gruppen ausgeübte oder vermittelteRegulation ist, oder die von diesen Sequenzen abgeleitet sind oder sie enthalten. Erfindungsgemäße Beispiele dieser DNA-Fragmente sind mit einer Signal-Sequenz der Sojabohnen-Leghämoglobingene Lba, Lbcl, Lbc2 oder Lbc3 identisch oder davon abgeleitet oder enthalten sie. 10 Das Lba-Gen hat die Signal-Sequenz: AACTTGCATC GAACAATTAA TAGAAATAAC AGAAAATTAA AAAAGAAATA TG, das Lbcl-Gen hat die Signal-Sequenz: 15 AACTTGCATT GAACAATAGA AAATAACAAA AAAAAGTAAA AAAGTAGAAA AGAAATATG, das Lbc2-Gen hat die Signal-Sequenz: 20 AACTTGCATT GAACAATAGA AATAACAACA AAGAAAATAA GTGAAAAAAG AAATATG, und das Lbc3-Gen hat die Signal-Sequenz: AACTTGCATT GAACAATTAA TAGAAATAAC AGAAAAGTAG AAAAGAAATA TG. 25

Ein weiteres Beispiel eines derartigen erfindungsgemäßen DNA-Fragments ist mit der Signal-Sequenz

AACTTGCATT GAACAATTAA TAGAAATAAC AGAAAAGTAG AATTCTAAAA TG 30 des YEP Lb CAT-Gens identisch oder davon abgeleitet oder es enthält diese Sequenz.

Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung DNA-Fragmente, die eine Kombination eines eisten DNA-Fragments mit einem zweiten DNA-Fragment aufweisen und bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. 35 Diese erfindungsgemäßen DNA-Fragmente sind dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Promotor-Sequenz und eine Signal-Sequenz enthalten und mit Bereichen der 5-Flanke von Pflanzen-Leghämoglobingenen identisch oder davon abgeleitet sind oder sie enthalten.

Erfindungsgemäß bevorzugte Beispiele solcher DNA-Fragmente sind DNA-Fragmente, die eine Promotor-Sequenz und eine Signal-Sequenz enthalten und mit Bereichen der 5'-Flanken der Sojabohnen-Leghämoglobingene 40 Lba, Lbcl, Lbc2 und Lbc3 identisch oder von ihnen abgeleitet sind oder sie enthalten.

Die DNA-Sequenzen dieser 5-Flanken der Sojabohnen-Leghämoglobingene sind vorstehend abgebildet.

Ein weiteres Beispiel eines erfindungsgemäß bevorzugten DNA-Fragments ist ein DNA-Fragment, das mit Bereichen der 5-Flanke des YEP Lb CAT-Gens identisch oder davon abgeleitet ist oder sie enthält Die DNA-Sequenz der 5-Flanke des YEP Lb CAT-Gens ist ebenfalls vorstehend abgebildet 45 In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Plasmide zur Verwendung bei der Durchführung der vorstehend genannten erfindungsgemäßen Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie ein wie vorstehend definiertes erstes DNA-Fragment oder eine Kombination eines solchen ersten DNA-Fragments mit einem wie vorstehend beschriebenen zweiten DNA-Fragment enthalten. Erfindungsgemäß bevorzugte Beispiele solcher Plasmide sind die Plasmide YEPLb CAT und YEP 5 Lb Km. Die erfindungsgemäßen Plasmide gestatten eine hohe 50 ExptessioneiiiesgewünschtenGenproduktsdurchEinbauderfürdieseGenproduktecodierendenDNA-Sequenzen.

Was die Reproduzierbarkeit bzw. Nacharbeitbarkeit der vorliegenden Erfindung anlangt, ist festzuhalten, daß während der Knöllchenentwicklung rund 30 verschiedene pflanzenkodierte Polypeptide (Noduline) spezifisch synthetisiert weiden. Abgesehen von den Leghämoglobinen enthalten Noduline knöllchenspezifische Formen von Uricase(Bergmann etal.(1983),EMBO.J.2,2333-2339), Glutaminsynthetase(Cullimoreetal. (1984), J.MoLAppl. 55 Genetics 2,589-599) und Saccharosesynthase (Morell und Copeland (1985), Plant. Physiol. 78, 149-154). Die Funktionen der meisten Noduline sind jedoch gegenwärtig noch unbekannt.

Nichtsdestoweniger sind während der letzten fünf Jahre eine Vielzahl von Nodulingenen isoliert und charakte- -8-

AT 396 249 B risiert worden. Diese schließen Noduline von mehreren verschiedenen Leguminosen ein. Beispiele solcher Isolierungen und Charakterisierungen sind in der Literatur weit verbreitet, wie in Füller et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sei. 80,2594-2598, Sengupta-Gopalan et al. (1986), Molec. Gen. Genet, 203,410-420, Bisseling et al. (1985) in Proceedings of the 6th Int. Symp. on Nitrogen Fixation, Martinus Nijhoff Publishers, Seiten 5359, Gebhardt et al. 5 (1986), EMBOJ.5,1429-1435. Alle diese Gene enthalten knöllchenspezifische Regulationssequenzen. Kennt man nun die DNS-Sequenzen für die Gene, welche in der vorliegend«! Anmeldung angegeben sind, können solche Sequenzen und in der Tat die vollständigen 5'- und 3'-Flankenregionen mittels automatisierter Oligonucleotid-Synthese hergestellt werden. Vollständige knöllchenspezifische Gene können auch nach bekannten Rekombinationstechniken, wie sie in den voranstehend genannten Literaturstellen und von Maniatis et al. (1982), 10 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbour Laboratory, New York, beschrieben sind, isoliert weiden.

Das beschriebene Verfahren zur knöllchenspezifischen Genexprcssion kann somit von jedem Fachmann auf dem Gebiet der molekularen Genetik ausgeführt werden.

Die Figuren zeigen: 15

Fie. 1: DNA-Sequenzen der vier Sojabohnen-Leghämoglobingene Lba, Lbcl, Lbc2 und Lbc3.

Die Sequenzen sind so untereinander geschrieben, daß zwischen ihnen bestehende Homologien ersichtlich sind.

Das Zeichen weist darauf hin, daß sich an der fraglichen Position keine Base befindet. Die Namen 20 der Gene und die Basenpositionen, die Bezeichnung der Gene und der stromaufwärts vom Startcodon ATG gezählten Basenpositionen sind auf der rechten Seite der Sequenzen angegeben. Außerdem sind die wichtigen Bereiche der Sequenzen unterstrichen.

Fie. 2: Restriktionskarte des 12 kb Eco RI-Restriktionsfragments, das das Lbc3-Gen enthält Dargestellt ist außerdem ein Konstruktionsschema der Plasmide pLpHH und pLpHX. 25 Fie. 3: Konstruktionsschema des Plasmids p213-5'-Lb.

Fig. 4: Konstruktionsschema des Plasmids pEJLb5'-3'-l.

Fig. 5: Konstruktionsschema des Plasmids pEJLb5'-3'-CAT15.

Fig. 6: Restriktionskarte des Plasmids YEP Lb CAT.

Fig. 7: Konstruktionsschema des Plasmids pEJLb5'-3’-Kml. 30 Fig. 8: Restriktionskarte des Plasmids YEP 5Lb Km.

Fig. 9: Sequenzvergleich von Teilbereichen der Plasmide pEJLb5'-3'-CATl 5 und pEJLb5'-3'-CAT101.

Fig. 10: Sequenzvergleich von Teilbereichen der Plasmide PEJ CAT-KN und FEJ CAT-BD.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. 35 Neben den beispielhaft genannten Vektoren und Mikroorganismen sind dem Fachmann weitere Vektoren bekannt, die in Verbindung mit ihm ebenfalls bekannten Wirtsorganismen erfmdungsgemäß verwendet werden können.

Beispiell 40 Bestimmung der DNA-Seauenz von Bereichen der 5'-Flanke von Soiabohnen-Leghämoglobinpenen

Aus einer Sojabohnen-Glycin max. var. Evans Genbank wurden die vier Sojabohnen-Leghämoglobingene Lba, Lbcl,Lbc2 undLbc3 nach E.0. Jensen etal. isoliert (Nature 291 (1981), 677-679). Die genetisch stabile, invariable Sojabohnen-Inzuchtart „Glycine max. var. Evans“ wurde als Ausgangsmaterial für die Isolierung der DNA verwendet, die bei der Konstruktion der vorstehend genannten Genkank eingesetzt wurde. Die 5-Flanken der vier 45 Sojabohnen-Leghämoglobingene wurden nach E.0. Jensen isoliert (Doktorarbeit, Institut für Molekularbiologie, Arhus Universität (1985)). Schließlich wurden die Sequenzen der vier 5'-Flanken nach der Kettenabbruchmethode von F. Sänger bestimmt (J. Mol. Biol. 143 (1980), 161). Die einzelnen Sequenzen sind in Fig. 1 abgebildet.

Beispiel 2

50 Konstruktion des Plasmids YEP Lb CAT

Die Konstruktion des Plasmids wurde in den im folgenden beschriebenen Schritten durchgeführt.

Subclonierung des Lbc3-Gens

Das Lbc3-Gen wurde aus der vorstehend genannten Sojabohnen-Genbank in Form eines 12kb EcoRI-55 Restriktionsfragments isoliert. Die Genbank wurde von Wiborg et al. beschrieben (Nucl. AcidsRes. 10(1982) 3487).

Ein Teil des Fragments ist in Fig. 2 dargestellt. Dieses Fragment wurde mit den in Fig. 2 angegebenen Enzymen gespalten und anschließend in das Plasmid pBR322eingebaut (vgl. Fig. 2). Die auf diese Weise erhaltenen Plasmide -9-

AT 396 249 B

Lbc3HH und Lbc3HX wurden anschließend mit PvuII gespalten und religierL Es wurden die Plasmide pLpHH und pLpHX erhalten.

Subclonierung von Sequenzen aus der 5'-Flanke des Lbc3-Gens

Als Ausgangsmaterial wurde das Plasmid pLpHH verwendet (vgl. Fig. 3). Das Plasmid wurde mit dem Restriktionsenzym PvuII gespalten und anschließend mit der Exonuclease Bal31 behandelt Die Reaktion wurde zu verschiedenen Zeitpunkten gestoppt. Die verkürzten Plasmide wurden in pBR322-Fragmente ligiert Diese Fragmente waren zuvor wie in Fig. 3 angegeben behandelt worden, so daß sie an einem Ende die DNA-Sequenz ITC — aufwiesen. AAG —

Nach der Ligierung wurde eine Spaltung mit dem Restriktionsenzym EcoRI durchgeführt. Fragmente, die Sequenzen der 5-Flanke enthielten, wurden in mit EcoRI gespaltenes pBR322ligiert Mit den Ligierungsprodukten wurde E. coli K803 transformiert Die von den Transformanten getragenen Plasmide wurden durch eine Sequenz-Analyse untersucht Aus einer der Transformanten wurde das Plasmidp213 5Lb isoliert Dieses Plasmid enthält eine 5-Flanke, die 7 bp vor dem Startcodon ATG des Lbc3-Gens endet und damit folgende Sequenz aufweist: 2kb

-5'-Flanke - - - AAAGTAGAATTCTAAAATG

Subclonierung von Bereichen der 3'-Flanke des Lhc3-Gens

Als Ausgangsmaterial wurde das Plasmid pLpHX verwendet Es wurde mit dem Restriktionsenzym XhoII gespalten. Die Enden wurden teilweise aufgefüllt und überschüssige DNA wurde entfernt (vgl. Fig. 4). Das in Fig. 4 dargestellte Fragment wurde in das Plasmid pBR322 ligiert, das zuvor wie in Fig. 4 beschrieben behandelt wurde. Anschließend wurde E. coli K803 mit den Ligierungsprodukten transformiert Eine der Transformanten enthielt das Plasmid Xho2a-3*Lb. Da sich die XhoII-Spaltstelle direkt hinter dem Lb-Stopcodon befindet (vgl. Fig. 2), enthält das Plasmid etwa 900 bp der 3'-Flanke, deren Sequenz mit GAATTCTACAA- - - beginnt.

Konstruktion der Lb-Promotor-Kassette

Ein EcoRI/Sphl-Fragment des Plasmids Xho2a-3Lb wurde mit einem BamHI/EcoRI-Fragment des Plasmids p 213-5' Lb vermischt Die beiden Fragmente wurden über die BamHI/Sphl-Enden in ein Derivat des Plasmids pBR322ligiert, dessen EcoRI-Erkennungsstelle entfernt worden war (vgl. Fig. 4). Anschließend wurde E. coli K803 mit den Ligierungsprodukten transformiert. Eine der Transformanten enthielt das gewünschte Ligierungsprodukt. Dieses Plasmid wurde als pEJLb 5'-3'-l bezeichnet.

Konstruktion eines chimeren Lb/CAT-Gens

Das CAT-Gen aus pBR322 wurde in Form von mehreren kleinen Restriktionsfragmenten isoliert (vgl. Fig. 5). Das 5'-Ende des codierenden Bereichs wurde als Alul-Fragment isoliert. Dies wurde nachfolgend in pBR322 ligiert und wie in Fig. 5 beschrieben behandelt Mit dem erhaltenen Plasmid wurde E. coli K803 transformiert Es wurde eine Transformante selektiert, die das Plasmid Alul 1 enthielt. Das 3'-Ende des codierenden Bereiches wurde als Taql-Fragmentisoliert DiesesFragmentwurde mit der Exonuclease Bal31 behandelt Sodann wurden EcoRI-Linker angehängt Nach einer Spaltung mit der Restriktionsendonuclease EcoRI wurde das Fragment in die EcoRI-Spaltstelle von linearisiertem pBR322 ligiert. Mit den Ligierungsprodukten wurde E. coli K803 transformiert und die Transformanten wurden untersucht Ein als Taq 12 bezeichnetes Plasmid enthielt das 3'-Ende des codierenden Bereichs des CAT-Gens und weitere 32 Basenpaare der 3-Flanke: Die Endsequenz war CCCCGAATTC. Anschließend wurden die folgenden Fragmente gemeinsam in EcoRI-gespaltene DNA des Plasmids pEJLb5'-3'-l ligiert: EcoRl/PvuII-Fragmentals Alul l,PvuII/DdeI-FragmentauspBR322 unddasDdel/EcoRI-FragmentausTaq 12. Mit dem Ligierungsprodukt wurde E. coli K803 transformiert Es wurde eine Transformante selektiert, die das gewünschte Konstrukt enthielt Dieses Plasmid wurde als pEJLb5'-3' CAT 15 bezeichnet

Clonierung des chimeren Lb/CAT-Gens in einem Hefeplasmid

Das chimere Gen wurde als BamHI/Sphl-Fragment aus dem Plasmid pEJLb 5'-3' CAT 15 isoliert und mit Hilfe derselben Enzyme in das Hefeplasmid YEP24 eingebaut. Nach der Transformation von E. coli K803 wurde eine selektierte Transformante untersucht. Sie enthielt das in Fig. 6 dargestellte Plasmid YEP LbCAT. Dieses Plasmid wurde anschließend in die Hefestämme Saccharomyces cerevisiae DBY747 und TM1 eingeführt. -10-

AT 396 249 B

Beispiel 3

Konstruktion des Plasmids YEP 5Lb Km

Das Neomycin-Phosphotransferase (NFTO)-Gen wurde aus dem Plasmid pKM2 isoliert (Beck et al., Gene 19 (1982), S. 327). Das 5'-Ende des codierenden Bereichs dieses Gens wurde als Sau3A-Fragment wie in Fig. 7 beschrieben isoliert. Anschließend wurde dieses Fragment in pBR322 ligierL Durch Transformation und Selektion wurde das Plasmid Sau 13 erhalten. Das 3'-£nde und die 3’-Flanke des NPTII-Gens wurden als PvuII-Fragment isoliert. Dieses Fragment wurde zusammen mit einem EcoRI/PvuII-Fragment aus dem Plasmid Sau 13 in das EcoRl/PvuII-gespaltene Plasmid pEJLb 5-3*1 ligiert. Nach der Transformation von E. coli K803 mit den Ugierungsprodukten wurdeeineTransformante mit dem vorgesehenen Konstrukt isoliert. Dieses wurde als Plasmid pEJLb 5* Km 1 bezeichnet. Dieses Plasmid wurde sodann mitBamHI gespalten und anschließend wurde es partiell mit PvuII gespalten. Somit wurde ein BamHI/PvuII-Fragment erhalten, das die gesamte 5-Flanke des Lb-Gens sowie den codierenden Bereich des NPTII-Gens enthielt. Dieses Fragment wurde in das BamHI/PvuII-gespaltene Plasmid YEP24 ligiert. Es wurde das in Fig. 8 dargestellte Plasmid YEP 5Lb Km erhalten. Dieses Plasmid wurde in den Hefestamm Saccharomyces cerevisiae TM1 eingeführt.

Beispiel 4

Auswirkung der Kohlenstoffauelle auf die Expression von CAT

Transformanten von Saccharomyces cerevisiae DBY747, die das Plasmid YEP Lb CAT enthalten, wurden in einem Minimalmedium gezüchtet, das mit 2 % Kohlenstoffquelle angereichert wurde. Die Zellen wurden bei einer Zelldichte von 5 x 10** Zellen pro ml geerntet Die CAT-Aktivität wurde wie von Walker Edlund, Boulet & Rutter beschrieben gemessen (Nature 306 (1983), 557).

In Tabelle I ist die CAT-Aktivität in Abhängigkeit von der Kohlenstoffquelle dargestellt Die höchste Aktivität wurde durch Züchtung der Transformante in Gegenwart von Succinat und Glycerin erhalten. Dieser Wert wird als 100 % angegeben.

Tabelle I

Kohlenstoffauelle Aktivität

Succinat 100

Glycerin 100

Glucose 28

Saccharose 18

Bsispfcl 5

Wirkung von Häm-Grnppen-Vorläufem und Häm-Gruppen-Analoga auf die Induktion der Gen-Exnression Transformanten von Saccharomyces cerevisiae TM1, die das Plasmid YEP Lb CAT tragen, wurden in einem Minimalmedium gezüchtet das mit 2 % Glucose, 0,1 % Tween^, 20 pg/ml Ergosterol, 50 pg/ml Methionin sowie miteinemderHäm-Gruppen-AnalogaoderHäm-Gruppen-VorläuferDeuteroporphyrinIX(dp)bzw.Protoporphyrin (pp) in einer Konzentration ναι 5 pg/ml angereichert war. Hämin wurde in einer Endkonzentration von 5 pg/ml zugesetzt δ-Aminolävulinsäure (δ-ALA) wurde in einer Endkonzentration von 50 pg/ml zugesetzt

In Tabelle II ist die CAT-Aktivität als Aktivität der Häm-Gruppen-Vorläufer bzw. Häm-Gruppen-Analoga angegeben. Die höchste Aktivität wurde durch Zugabe von δ-ALA oder dp erhalten. Dieser Wert wird als 100 % angegeben.

Tabellen

Induktor CAT-Aktivität

Glucose + δ-ALA 100

Glucose + dp 100

Glucose+pp 50

Glucose + Hämin 25

Glucose 5 -11-

AT 396 249 B

Beispiel 6

Einbau der Linker in die Signal-Sequenz

Es wurden zwei synthetische DNA-Linker eingebaut. Der erste wurde unmittelbar über dem eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym Bglll enthaltenden S tartcodon eingebaut und das zweite stromaufwärts von der eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym Kpnl enthaltenden CAP-Additions-Stelle (vgl. Fig. 9). Das neue Konstrukt, d. h. das Plasmid pEJ5-3'-CAT101 wird in Fig. 9 mit dem ursprünglichen Konstrukt verglichen.

Die unterschiedlichen, mit den beiden Konstrukten erzielbaren Expressionsraten wurden wie in Beispiel 5 beschrieben verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.

Tabellen!

Glucose Glucose + Häm Induktion 55x 8x CAT15 0,11 6,01 CAT101 0,22 1,72

Die Zahlen geben umgesetzten Chloramphenicol in nmol/mg Protein/Min. an.

Aus Fig. 3 ist ersichtlich, daß die beiden spezifischen Veränderungen in der 5-Flanke ein Absinken der Induzierbarkeit mit Häm-Gruppen von 55fach auf 8fach bewirkt haben.

Beispiel 7

Ersetzen der 5'-Flanke des Lhc3-Gens durch einen entsprechenden Bereich des ILVl-Gens von S. cerevisiae Mit den Restriktionsenzymen BamHI und Bglll wird die gesamte 5'-Flanke des Lbc3-Gens aus dem Plasmid CAT101 ausgeschnitten. Stattdessen wird ein 765 bp umfassendes DNA-Fragment des ILVl-Gens eingesetzt, das eine Promotor- und eine Signal-Sequenz aufweist. Dieses Konstrukt wird PEJ CAT-BD genannt

In einer weiteren Konstruktion wird der Promotor des Lbc3-Gens entfernt, so daß nur noch die Signal-Sequenz übrig bleibt Dies wird durch eine Spaltung des Plasmids CAT101 mit den Restriktionsenzymen BamHI und Kpnl erzielt Das Fragment wird durch ein 670 bp umfassendes DNA-Fragment des ILVl-Gens ersetzt, das zwar die Promotor-Sequenz, jedoch nicht die Signal-Sequenz enthält Die Konstrukte haben die folgende Struktur: -Promotor Signal-Sequenz codierende Sequenz CAT-BD - ILV1 CAT PAT-ICN ILV1 Lbc3 CAT -1 tfiit t * ^

Ein Vergleich der Sequenzen ist in Fig. 10 dargestellt

Die Expressionsraten wurden nach den in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt

Tabelle IV

Glucose Glucose + Häm Induktion CAT-BD 1089 1162 keine CAT-KN 789 1580 2x -12-

Claims (34)

1. AT 396 249 B Die Einheiten sind wie in Tabelle III angegeben. Der einzigeUnterschied zwischen den zwei Konstrukten ist die Herkunft der Signal-Sequenz. Das Ergebnis zeigt, daß die Signal-Sequenz des Lbc3-Gens für die Induktion erforderlich ist. Der Induktions-Spiegel ist jedoch nicht so hoch wie der des Plasmids CAT101, das als Ausgangsmaterial verwendet wurde. Dies kann darauf beruhen, daß das Konstrukt 13 Nucleotide näher beim ATG-Codon beginnt und daher der mRNA 13 Nucleotide fehlen. Diese Nucleotide können für die Induktion wichtig sein. Insgesamt zeigen die beschriebenen Testergebnisse, daß die Häm-Induktion mit der Signal-Sequenz des Lbc3-Gens in Verbindung steht. Die Erfindung betrifft nicht ausschließlich 5'-Flanken von Sojabohnen-Leghämoglobingenen. Es ist bekannt, daß die Leghämoglobingene aller Leguminosen dieselbe Aktivität haben (Appleby (1974) in „The Biology of Nitrogen Fixation“, A. Quispel Herausg., North-Holland Publishing Company, Amsterdam, Oxford, S. 499-554). Außerdem wurde gezeigt, daß eine besondere Homologie zwischen den DNA-Sequenzen des PvLbl-Gens der Weißen Bohne und dem Lbc3-Gen der Sojabohne besteht. Daher betrifft die Erfindung die Verwendung von 5'-Flanken der Leghämoglobingene aller Pflanzen. Erfindungsgemäß ist es auch möglich, Fragmente aus Pflanzen, Tieren oder Hefe zu verwenden, die unter natürlichen Bedingungen die erfindungsgemäße Regulation ausüben oder vermitteln. Dies trifft besonders für solche Fragmente zu, die aus DNA-Fragmenten aus Genbanken durch Hybridisierung mit markierten Sequenzen aus Bereichen der 5-Flanken von Sojabohnen-Leghämoglobingenen isoliert werden können. Es ist bekannt, daß Nucleotid-Sequenzen in unwesentlichen Unterbereich«! der 5-Flanke verändert werden können, ohne daß dabei die Aktivität und Regulierbarkeit des Promotors verändert wird. Ebenso ist bekannt, daß bei der Veränderung von Sequenzen wichtiger Teilbereiche der 5'-Flanken die Bindungsaffinitäten zwischen Nucleotid-Sequenzen und den für die Initiation der Transkription und der Translation erforderlichen Faktoren oder Effektor-Substanzen verändert werden können. Dementsprechendistes möglich, die Aktivität und/oder Regulierbarkeit des Promotors zu verbessern. Die Erfindung betrifft auch solche Veränderungen wichtiger Teilbereiche der 5-Flanke. Eine der möglichen Veränderungen ist die Verlängerung der Signal-Sequenzen über ihre natürliche Länge hinaus. PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Expression von Genen in Hefe, bei dem man Hefezellen mit einem iekombinanten DNA-Molekül transformiert, das sowohl das zu exprimierende Gen als auch die 5'-Flanke mit ein«: Promotor-Sequenz enthält, und die transformierten Hefezellen in einem Kulturmedium züchtet, dadurch gekennzeichnet, daß die 5-Flanke ein erstes, eine Promotor-Sequenz enthaltendes DNA-Fragment aufweist, das mit einem zweiten DNA-Fragment verbunden ist, das eine Signal-Sequenz enthält, die im posttranskriptionellen Stadium durch eine Häm-Gruppe, Häm-Gruppen-Analoga oder durch Häm-Gruppen-Vorläufer reguliert wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als erstes DNA-Fragment eine isolierte oder synthetisierte Promotor-Sequenz verwendet
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als zweites DNA-Fragment eine isolierte oder synthetisierte Signal-Sequenz verwendet
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die intrazelluläre Konzentration der Häm-Gruppe durch Versetzen des Kulturmediums mit Kohlenstoffquellen erhöht die eine erhöhte intrazelluläre Konzentration der Häm-Gruppe bewirken.
5. 5. Verfahren nach Anspruch4,dadurch gekennzeichnet,daß als KohlenstoffquelleGlycerin,Succinat oder Äthanol eingesetzt wird.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die intrazelluläre Konzentration der Häm-Gruppe durch Versetzen des Kulturmediums mit mindestens einer der Verbindungen Häm-Gruppe, Häm-Gruppen-Analoga oder Häm-Gruppen-Vorläufer erhöht. -13- AT 396 249 B
7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Häm-Gruppen-Analog Deuteroporphyrin IX und/oder als Häm-Gruppen-Vorläufer δ-Aminolävulinsäure verwendet
8. 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein DNA-Fragment verwendet, das eine Promotor-Sequenz und eine Signal-Sequenz enthält, und das entweder identisch mit Bereichen der 5-Flanke von Pflanzen-Leghämoglobingenen, Hefe-Genen oder anderen Genen ist, die bei natürlichen Bedingungen einer durch intrazelluläre Häm-Gruppen ausgeübten oder vermittelten Expressions-Regulation unterliegen, oder das von diesen 5-Flanken abgeleitet ist oder sie enthält.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Fragment mit Bereichen der 5-Flanke der Sojäbohnen-Leghämoglobingene identisch oder davon abgeleitet ist oder sie enthält.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Fragment mit Bereichen der 5-Flanke des Lba-Gens mit dar DNA-Sequenz GAGATACATT ATAATAATCT CTCTAGTGTC TATTTATTAT TTTATCTGGT GATATATACC TTCTCGTATA CTGTTATTTT TTCAATCTTG TAGATTTACT TCTTTTATTT TTATAAAAAA GACTTTATTT TTTTAAAAAA AATAAAGTGA ATTTTGAAAA CATGCTCTTT GACAATTTTC TGTTTCCTTT TTCATCATTG GGTTAAATCT CATAGTGCCT CTATTCAATA ATTTGGGCTC AATTTAATTA GTAGAGTCTA CATAAAATTT ACCTTAATAG TAGAGAATAG AGAGTCTTGG AAAGTTGGTT TTTCTCGAGG AAGAAAGGAA ATGTTAAAAA CTGTGATATT TTTTTTTTGG ATTAATAGTT ATGTTTATAT GAAAACTGAA AATAAATAAA CTAACCATAT TAAATTTAGA ACAACACTTC AATTATTTTT TTAATTTGAT TAATTAAAAA ATTATTTGAT TAAATTTTTT AAAAGATCGT TGTTTCTTCT TCATCATGCT GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC ACATAAGCTT TGGTTTTCTC ACTCTCCAAG CCCTCTATAT AAACAAATAT TGGAGTGAAG TTGTTGCATA ACTTGCATCG AACAATTAAT AGAAATAACA GAAAATTAAA AAAGAAATAT G identisch oder davon abgeleitet ist oder sie enthält
11. 11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Fragment mit Bereichen der 5-Flanke des Lbcl-Gens mit der DNA-Sequenz TTCTCTTAAT ACAATGGAGT TTTTGTTGAA CATACATACA TTTAAAAAAA AATCTCTAGT GTCTATTTAC CCGGTGAGAA GCCTTCTCGT GTTTTACACA CTTTAATATT ATTATATCCT CAACCCCACA AAAAAGAATA CTGTTATATC TTTCCAAACC TGTAGATTTA TTTATTTATT TATTTATTTT TACAAAGGAG ACTTCAGAAA AGTAATTACA TAAAGATAGT GAACATCATT TTATTTATTA TAATAAACTT TAAAATCAAA CTTTTTTATA TTTTTTGTTA CCCTTTTCAT TATTGGGTGA AATCTCATAG TGAAGCCATT AAATAATTTG GGCTCAAGTT TTATTAGTAA AGTCTGCATG AAATTTAACT TAACAATAGA GAGAGTTTTC GAAAGGGAGC GAATGTTAAA AAGTGTGATA TTATATTTTA TTTCGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA CATACAAAAA AATACTTTTA AATTCAGAAT AATACTTAAA ATATTTATTT GCTTAATTGA TTAACTGAAA ATTATTTGAT TAGGATTTTG AAAAGATCAT TGGCTCTTCG TCATGCCGAT TGACACCCTC CACAAGCCAA GAGAAACTTA AGTTGTAÄAC TTTCTCACTC CAAGCCTTCT ATATAAACAT GTATTGGATG TGAAGTTATT GCATAACTTG CATTGAACAA TAGAAAATAA CAAAAAAAAG TAAAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG- identisch oder davon abgeleitet ist oder sie enthält.
12. 12. Verfahren nach Anbruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Fragment mit Bereichen der 5-Flanke des Lbc2-Gens mit der DNA-Sequenz -14- AT 396 249 B TCGAGTTTTT TTTATTCGGC ATCCCCACCC TTATTTCTTA ATAGTGAACA TTATATTTTT ACTATTAAAT TTAACTTAAT GTGATATTAT TTGACAATTT TTTAAGATTT CTCCACAAGC TCTATATAAÄ CAATAGAAAT ACTGAACATA GAGAAGCCTT CCACCAAAAA TTTTTACAAA TCATTTTTTT TTGTTACCCT AGTTTGGGCT AATAGAGAGA TATAGTTTTA ATTTTTAAAA TGAAAAGATC CAAGAGAAAC CACGTATTGG AACAACAAAG CATTTATTAA CTCGTGCTTT AAAAAAAACT GGAAACTTCA AGTTAAGATG TTTCATTATT CAAGTTTTAT GTTTTGGAAA TTTAGATTAA TTCAGAGTAA ATTTGGCTCT TTAAGTTGTA ATGTGAAGTT AAAATAAGTG AAAAAACTCT ACACACTTTA GTTATATCTT CGAAAGTAAT AATTTTAAAA GGGTGAAATC TAGTAAAGTC GGTAACGAAT TAATTATGTT TACTTAAATT TCATCATGCC ATTTTTCTAA GTTGCATAAC AAAAAAGAAA CTAGTGTCCA ATATTATTAT TCCAGTACAT TACAAAAAAG TCACACTTTT TCATAGTGAA TGCATGAAAT GTTAGAAAGT TACATGAAAA ACTTATTTAC GATTGACACC CTCCAAGCCT TTGCATTGAA TATG identisch oder davon abgeleitet ist oder sie enthält
13. 13. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Fragment mit Bereichen der 5-Flanke des Lbc3-Gens mit der DNA-Sequenz TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT GTAGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA ataaaaatag tgaacatcgt ctaagcattt ttatataaga tgaattttaa ΑΑΑΤΑΤΑΑΤΤ TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT GTGATATTAG aaatttgtcg gatatattaa tattttattt tatatggaaa CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA CAGAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG identisch oder davon abgeleitet ist oder sie enthält.
14. 14. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Fragment mit Bereichen der 5-Ftanke des YEB Lb CAT-Gens mit der DNA-Sequenz TATGAAGATT GTACTATTTA GTAGATTTAT ATAAAAATAG ΑΑΑΤΑΤΑΑΤΤ TTGTTTAAAT TATAAAAAAA CATTATATTA AATTTTAACT X gnl«1;! CTAAAAAAAT TTATTTACTG TTCACCATAC AAAAAATACA AGAAAAGAAA TTCTTTTATT TGAACATCGT TTTTTGTCTA TGGATÄAGAT ATTGTTTCCC AAAAAATTAG TAAAAATAGA AAATTTGTCG ATATATTAAA AAAATGAGTT CAATTGATCA CTCATATATA AAAAAAACCT TTTATAAAGG CTAAGCATTT AATCGTATGT CACACTATAA TTTTGATTAT GGCTCAATTT GAAAATCTGG GATATATTAA ATTTTAAATT GATTTAAGTT CCCTCCTCCA TGCCATAAGA GCTACATAAT AGAGTTAAAA TTATATAAGA ATCTTGTCTT AGTTCTTCCT TGGATAAAAT TTATTAGTAT AAAAGGGACT TATTTTATTT CAGAATAATA TTTGÄAAAC-A ACAAGCCAAG ACCAACAAAA TTCCAATCTT AAATTACAAA TGAATTTTAA AGAGCCATTT CCGAGTTTGA CTCGTAGTGA AGTTTGCATA GTTAAAAAGT TATATGGAAA CTTAAATTAT TGATTGTCTC AGAGACATAA -15- AT 396 249 B GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCC7TC7ATA TAAATAAGTA TTGGATGTGA AG7TGTTGCA TAÄCTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAA7AA CAGAAAAGTA GAATTCTAAA ATG identisch oder davon abgeleitet ist oder sie enthält.
15. 15. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Polypeptides durch Transformation einer Hefezelle mit einem rekombinanten Plasmid, dadurch gekennzeichnet, - daß das rekombinante Plasmid eine Promotor-Sequenz und eine Signal-Sequenz in einem DNA-Fragment enthält, das die S'-Flanke eines Pflanzen-Leghämoglobingens aufweist, und eine das Polypeptid kodierende Sequenz enthält, - das Polypeptid in der Hefezelle expiimiert wird, und - das rekombinante Polypeptid durch bekannte Reinigungsverfahren präpariert wird.
16. 16. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Polypeptides durch Transformation einer Hefezelle miteinem rekombinanten Plasmid, dadurch gekennzeichnet, - daß das rekombinante Plasmid eine Promotor-Sequenz und eine Signal-Sequenz in einem DNA-Fragmententhält, das sowohl die S'-Flanke als auch die 3'-Flanke eines Pflanzen-Leghämoglobingens aufweist, und eine das Polypeptid kodierende Sequenz enthält, - das Polypeptid in der Hefezelle expiimiert wird, und - das rekombinante Polypeptid durch bekannte Reinigungsverfahren präpariert wird.
17. 17. DNA-Fragment, enthaltend eine Signal-Sequenz zur Verwendung im Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es ein kurzes DNA-Fragment ist, das in einen mRNA-Strang transkribiert wird, der Ziel für eine durch intrazelluläre Häm-Gruppen ausgeübte oder vermittelte Regulation ist.
18. 18. DNA-Fragment nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einer Signal-Sequenz von Pflanzen-Leghämoglobingenen, Hefe-Genen oder anderen Genen identisch ist, in denen die Signal-Sequenz bei natürlichen Bedingungen Ziel für eine durch intrazelluläre Häm-Gruppen ausgeübte oder vermittelte Regulation ist, oder von diesen Sequenzen abgeleitet ist oder sie enthält.
19. 19. DNA-Fragment nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einer Signal-Sequenz von Sojabohnen-Leghämoglobingenen identisch oder davon abgeleitet ist oder sie enthält.
20. 20. DNA-Fragment nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es mit der Signal-Sequenz AACTTGCATC GAACAATTAA TAGAAATAAC AGAAAATTAA AAAAGAAATA TG, des Lba-Gens identisch oder davon abgeleitet ist oder sie enthält.
21. 21. DNA-Fragment nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es mit der Signal-Sequenz AACTTGCATT GAACAATAGA AAATAACAAA AAAAAGTAAA AAAGTAGAAA AGAAATATG des Lbcl-Gens identisch oder davon abgeleitet ist oder sie enthält.
22. 22. DNA-Fragment nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es mit der Signal-Sequenz AACTTGCATT GAACAATAGA AATAACAACA AAGAAAATAA GTGAAAAAAG AAATATG des Lbc2-Gens identisch oder davon abgeleitet ist oder sie enthält.
23. 23. DNA-Fragment nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es mit der Signal-Sequenz AACTTGCATT GAACAATTAA TAGAAATAAC AGAAAAGTAG AAAAGAAATA TG des Lbc3-Gens identisch oder davon abgeleitet ist oder sie enthält.
24. 24. DNA-Fragment nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es mit der Signal-Sequenz AACTTGCATT GAACAATTAA TAGAAATAAC AGAAAAGTAG AATTCTAAAA TG des YEP Lb CAT-Gens identisch oder davon abgeleitet ist oder sie enthält AT 396 249 B
25. 25. DNA-Fragment zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1,4,5,6,7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Promotor-Sequenz und eine Signal-Sequenz auf weist, die mit Bereichen der 5'-Flanke von Pflanzen-Leghämoglobingenen identisch oder davon abgeleitet ist oder sie enthalt.
26. 26. DNA-Fragment zur Verwendung in einen Verfahren nach einem der Ansprüche 1,4,5,6,7,8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Promotor-Sequenz und eine Signal-Sequenz enthält, die mit Bereichen der 5-Flanke von Sojabohnen-Leghämoglobingenen identisch oder davon abgeleitet ist oder sie enthält
27. 27. DNA-Fragment zur Verwendung in dem Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es mit Bereichen der 5-Flanke des Lba-Gens mit der DNA-Sequenz GAGATACATT ATAATAATCT CTCTAGTGTC TATTTATTAT TTTATCTGGT GATATATACC TTCTCGTATA CTGTTATTTT TTCAATCTTG TAGATTTACT TCTTTTATTT TTATAAAAAA GACTTTATTT TTTTAAAAAA AATAAAGTGA ATTTTGAAAA CATGCTCTTT GACAATTTTC TGTTTCCTTT TTCATCATTG GGTTAAATCT CATAGTGCCT CTATTCAATA ATTTGGGCTC AATTTAATTA GTAGAGTCTA CATAAAATTT ACCTTAATAG TAGAGAATAG AGAGTCTTGG AAAGTTGGTT TTTCTCGAGG AAGAAAGGAA ATGTTAAAAA CTGTGATATT TTTTTTTÜGG ATTAATAGTT ATGTTTATAT GAAAACTGAA AATAAATAAA CTAACCATAT TAAATTTAGA ACAACACTTC AATTATTTTT TTAATTTGAT TAATTAAAAA ATTATTTGAT TAAATTTTTT AAAAGATCGT TGTTTCTTCT TCATCATGCT GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC ACATAAGCTT TGGTTTTCTC ACTCTCCAAG CCCTCTATAT AAACAAATAT TGGAGTGAAG TTGTTGCATA ACTTGCATCG AACAATTAAT AGAAATAACA GAAAATTAAA AAAGAAATAT G, identisch oder davon abgeleitet ist oder sie enthält.
28. 28. DNA-Fragment zur Verwendung im Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es mit Bereichen der 5'-Flanke des Lbcl-Gens mit der DNA-Sequenz TTCTCTTAAT ACAATGGAGT TTTTGTTGAA CATACATACA TTTAAAAAAA AATCTCTAGT GTCTATTTAC CCGGTGAGAA GCCTTCTCGT GTTTTACACA CTTTAATATT ATTATATCCT CAACCCCACA AAAAAGAATA CTGTTATATC TTTCCAAACC TGTAGATTTA TTTATTTATT TATTTATTTT TACAAAGGAG ACTTCAGAAA AGTAATTACA TAAAGATAGT GAACATCATT TTATTTATTA TAATAAACTT TAAAATCAAA CTTTTTTATA TTTTTTGTTA CCCTTTTCAT TATTGGGTGA AATCTC*ATAG TGAAGCCATT AAATAATTTG GGCTCAAGTT TTATTAGTAA AGTCTGCATG AAATTTAACT TAACAATAGA GAGAGTTTTC GAAAGGGAGC GAATGTTAAA AAGTGTGATA TTATATTTTA TTTCGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA CATACAAAAA AATACTTTTA AATTCAGAAT AATACTTAAA ATATTTATTT GCTTAATTGA TTAACTGAAA ATTATTTGAT TAGGATTTTG AAAAGATCAT TGGCTCTTCG TCATGCCGAT TGACACCCTC CACAAGCCAA GAGAAACTTA AGTTGTAAAC TTTCTCACTC CAAGCCTTCT ATATAAACAT GTATTGGATG TGAAGTTATT GCATAACTTG CATTGAACAA TAGAAAATAA CAAAAAAAAG TAAAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG, identisch oder davon abgeleitet ist oder sie enthält
29. 29. DNA-Fragment zur Verwendung im Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es mit Bereichen der 5'-Flanke des Lbc2-Gens mit der DNA-Sequenz -17- AT 396 249 B TCGAGTTTTT TTTATTCGGC ATCCCCACCC TTATTTCTTA ATAGTGAACA TTATATTTTT ACTATTAAAT TTAACTTAAT GTGATATTAT TTGACAATTT TTTAAGATTT C7CCACAAGC TCTATATAAÄ CAATAGAAAT ACTGAACATA GAGAAGCCTT CCACCAAAAA TTTTTACAAA TCATTTTTTT TTGTTACCCT AGTTTGGGCT AATAGAGAGA TATAGTTTTA ATTTTTAAAA TGAAAAGATC CAAGAGAAAC CACGTATTGG AACAACAAAG CATTTATTAA CTCGTGCTTT AAAAAAAACT GGAAACTTCA AGTTAAGATG TTTCATTATT CAAGTTTTAT GTTTTGGAAA TTTAGATTAA TTCAGAGTAA ATTTGGCTCT TTAAGTTGTA ATGTGAAGTT AAAATAAGTG AAAAAACTCT ACACACTTTA GTTATATCTT CGAAAGTAAT AATTTTAAAA GGG7GAAATC TAGTAAAGTC GGTAACGAAT TAATTATGTT TACTTAAATT TCATCATGCC ATTTTTCTAA GTTGCATAAC AAAAAAGAAA CTAGTGTCCA ATATTATTAT TCCAGTACAT TACAAAAAAG TCACACTTTT TCATAGTGAA TGCATGAAAT GTTAGAAAGT TACATGAAAA ACTTATTTAC GATTGACACC CTCCAAGCCT TTGCATTGAA. TATG identisch oder davon abgeleitet ist oder sie enthält.
30. 30. DNA-Fragment zur Verwendung im Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es mit Bereichen der 5'-Flanke des Lbc3-Gens mit der DNA-Sequenz TATGAAGATT GTACTATTTA GTAGÄTTTAT ATAAAAATAG AAÄTATAATT TTGTTTAAAT TATAAAAAAA CATTATATTA AATTTTAACT GTGATATTAG CTAAAAAAAT TTATTTAC7G TTCACCATAC GTTTTATTAG TTGGATGTGA CAGAAAAG7A AAAAAATACA AGAAAAGAAA TTC7T77ATT TGAACATCGT TTTTTGTCTA TGGATÄAGAT ATTGTTTCCC AAAAAATTAG 7AAAAATAGA AAATTTGTCG A7ATA77AAA AAAA7GAGT7 CAA77GATCA TTATTCTGA7 AGTTGTTGCA GAA77C7AAA CTCATATATA AAAAAAACC7 TT7ATAAAGG CTAAGCA77T AATCG7A7GT CACACTATAA TTTTGATTAT GGCTCAATTT GAAAATCTGG GATATATTÄA ATTTTAAATT GATTTAAG7T CCCTCC7CCA CACTCTTCAA 7AAC77GCA7 A7G TGCCATAAGA GCTACATAAT AGAGTTAAAA TTATATAAGA ATCTTGTCTT AG77C77CC7 TGGATAAAAT TTATTAGTAT AAAAGGGACT TATTTTAT7T CAGAATAATA TTTGAAAAC-Ä ACAAGCCAAG GCCTTCTATA 7GAACAA77A ACCAACAAAA TTCCAATCTT AAATTACAAA TGAA7TTTAA AGAGCCATTT CCGAG777GA CTCG7AG7GA AG777GCA7A GT7AAAAAG7 TATATGGAAA CTTAAAT7A7 AGAGACA7AA TAAATAAGTA ΛΑ identisch oder davon abgeleitet ist oder sie enthält
31. 31. DNA-Fragment zur Verwendung im Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es mit Bereichen der 5-Flanke des YEP Lb CAT-Gens mit der DNA-Sequenz TA7GAAGA7T G7ACTATTTA GTAGATTTAT A7AAAAATAG AAATATAA77 77G777AAA7 TATAAAAAAA CATTATATTA AATTTTAACT GTGATATTAG CTAAAAAAAT TTATTTAC7G AAAAAATACA AGAAAAGAAA TTCTTTTATT TGAACATCGT TTTTTGTCTA TGGATAAGAT ATTGTTTCCC AAAAAATTAG TAAAAATAGA AAATTTGTCG ATATATTAAA AAAATGÄGTT CTCATATATA AAAAAAACCT TTTATAAAGG CTAAGCATTT AATCGTATGT CACACTATAA TTTTGATTAT GGCTCAATTT GAAAATCTGG GATATATTÄA ATTTTAAATT GATTTAAGTT TGCCATAAGA GCTACATAAT AGAGTTAAAA TTATATAAGA ATCTTGTCTT AGTTCTTCCT TGGATAAAAT TTATTAGTAT AAAAGGGACT TATTTTATTT CAGAATAATA TTTGAAAAGA ACCAACAAAA TTCCAATCTT AAATTACAAA TGAATTTTAA AGAGCCATTT CCGAGTTTGA CTCGTAGTGA AGTTTGCATA GTTAAAAAGT TATATGGAAA CTTAAATTAT -18- AT 396 249 B TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCÄ ACAAGCCAAG AGAGACATAÄ GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAG7A TTGGATGTGA AG7TGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATÄGAAATÄÄ CAGAAAAGTA GAATTCTAAA ATG identisch oder davon abgeleitet ist oder sie enthält
32. 32. Plasmid zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß es ein erstes DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 17 bis 24 oder ein DNA-Fragmentnach einem der Ansprüche 25 bis 31 enthält
33. 33. Plasmid nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß es das Plasmid YEP Lb CAT ist
34. 34. Plasmid nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß es das Plasmid YEP 5 Lb Km ist Hiezu 10 Blatt Zeichnungen -19-