DK162900B

DK162900B - Fremgangsmaade til ekspression af gener i gaer samt dna-fragment, rekombineret dna-segment og plasmider, hvor disse indgaar til brug ved udoevelse af fremgangsmaaden

Info

Publication number: DK162900B
Application number: DK488985A
Authority: DK
Inventors: Kjeld Adrian Marcker; Erik Oestergaard Jensen
Original assignee: Danisco
Priority date: 1985-10-24
Filing date: 1985-10-24
Publication date: 1991-12-23
Also published as: EP0220679A2; SE8604517L; NO864250L; US4849348A; DE3636117A1; AU593296B2; IE862793L; NO175103C; FR2598432A1; NO175103B; DK488985D0; ATE90386T1; AT396249B; NO864250D0; FR2598432B1; DE3688549T2; ES2054608T3; CA1333162C; DK162900C; NL8602657A

Description

i

DK 162900 B

Opfindelsen angår en hidtil ukendt fremgangsmåde til ekspression af gener i gær ved, at der i en gærcelle indføres et re-kombineret DNA-segment, der indeholder dels det gen, der ønskes udtrykt, dels en 5'-f1 ankerende region, hvori indgår en 5 promotorsekvens, og at de transformerede gærceller dyrkes i et egnet vækstmedium, et DNA-fragment, et rekombineret DNA-seg-ment og plasmider til anvendelse ved udøvelse af fremgangsmåden .

4 10 Med begrebet "promotorregion" forstås i forbindelse med den foreliggende opfindelse et DNA-fragment, som indeholder en promotor, og som omfatter målsekvenser for RNA-polymerase samt eventuelle aktiveringsområder, som indeholder målsekvenser for transskriptionseffektorstoffer.

15

Med begrebet "effektorstof" menes i forbindelse med den foreliggende opfindelse stoffer, som udøver eller formidler en regulerende funktion. Ved effektorstof forstås således også stoffer, som påvirker koncentrationen af stoffer, som udøver 20 eller formidler en regulerende funktion.

Med begrebet "leder-sekvens" forstås generelt en DNA-sekvens, som transskriberes til en mRNA, men ikke yderligere translate-res til protein. Leder-sekvensen består således af DNA-frag-25 mentet fra transskriptionsstart til ATG-koden, som udgør translationsstart. Ved en "leder-sekvens" forstås i forbindelse med den foreliggende opfindelse et kort DNA-fragment, som typisk har 40-70 basepar, og som indeholder sekvenser, der er mål for en posttransskriptionel regulering, der udøves eller 30 formidles af intracellulært hæm.

Desuden anvendes en række for fagfolk almindeligt kendte molekylærbiologiske begreber, herunder de nedenfor anførte.

35 CAP-additionspunkt: Det sted, hvor 7-methyl-GTP adderes på den tilsvarende mRNA.

2

DK 162900 B

DNA-sekvens eller DNA-segment: En lineær række af nucleotider, som er forbundet til hinanden via phosphordiesterbindinger mellem 3'- og 5'-carbonatomer i nabopentoser.

5 Ekspression (udtrykkelse): Den proces, et strukturelt gen undergår til fremstilling af et polypeptid. Det er en kombination af transskription og translation samt eventuelle post-translatoriske modifikationer.

10 Flankerende regioner: DNA-sekvenser, som omkranser kodende regioner. 5'-flankerende regioner indeholder en promotor. 3'-flankerende regioner kan indeholde transskriptionsterminator m. m.

15 Gen: En DNA-sekvens, bestående af tre eller fire dele, (1) den kodende sekvens for genproduktet, (2) de sekvenser i promotorregionen, som styrer, hvorvidt genet vil blive udtrykt, (3) de sekvenser i 3'-enden, som betinger transskriptionsterminering og eventuelt polyadenylering, samt eventuelt (4) interveneren-20 de sekvenser.

Intervenerende sekvenser: DNA-sekvenser, som optræder i et gen, og som ikke koder for noget peptidfragment. De intervenerende sekvenser transskriberes til præ-mRNA, og elimineres ved 25 modifikation af præ-mRNA til mRNA.

Kloning: Proces til opnåelse af en population af organismer eller DNA-sekvenser, der hidrører fra en sådan organisme eller sekvens ved aseksuel reproduktion, eller nærmere bestemt: 30 proces til isolering af en bestemt organisme eller del deraf og opformeringen af denne underfraktion som en homogen population.

35 Kodende sekvens: DNA-sekvens, der bestemmer et polypeptids aminosyresekvens.

3

DK 162900 B

Messenger-RNA(mRNA): RNA-molekyle, der er dannet ved trans skription af et gen og eventuel modifikation af præ-mRNA. mRNA-molekylet viderebringer det genetiske budskab, som bestemmer aminosyreskevensen i et polypeptid ved, at en del af 5 mRNA-molekylet translateres til dette peptid.

Nucleotid: En monomer enhed af DNA eller RNA bestående af en sukkerdel (pentose), phosphat og en nitrogenholdig, heterocyk-lisk base. Basen er bundt til sukkerdelen via en glukosidisk 10 binding (l'-carbon i pentose), og denne kombination af base og sukker er et nucleosid. Basen karakteriserer nucleotidet. De fire DNA-baser er adenin (A), guanin (G), cytosin (C) og thy-min (T). De fire RNA-baser er A, G, C og uracil (U).

15 Plasmid: En ekstra-kromosomal, dobbeltstrenget DNA-sekvens, der omfatter et intakt replikon, således at plasmidet replike-res i en værtcelle. Når plasmidet er placeret inde i en encellet organisme, ændres eller transformeres denne organismes egenskaber som et resultat af plasmidets DNA. F.eks. transfor-20 merer et plasmid, som bærer genet for tetracykli nresistens (TcR), en celle, som tidligere var sensitiv over for tetracyk-lin, til én, som er resistent over for dette. En celle, som er transformeret af et plasmid, kaldes en transformant.

25 Polypeptid: En lineær serie af aminosyrer, som er forbundet til hinanden ved hjælp af peptidbindinger mellem α-amino- og carboxy-grupper i naboaminosyrer.

Rekombination: Dannelse af et nyt DNA-molekyle ved kombination 30 af DNA-fragmenter af forskellig oprindelse.

Repli kat ion: Proces, hvorved DNA-molekyler reproduceres.

Replikon: Et selvreplikerende genetisk element med et punkt 35 til initiering af DNA-replikation og gener, der specificerer de funktioner, som er nødvendige til at styre replikation.

DK 162900B

4

Restriktionsfragment: Et DNA-fragment, som er resultatet af dobbeltstrenget kløvning med et enzym, som genkender en specifik mål-DNA-sekvens.

5 RNA-polymerase: Enzym, der bevirker transskription af DNA til RNA.

Transformation: Den proces, hvorved en celle bringes til at optage et plasmid.

10

Translation: Den proces, hvorved der produceres et polypeptid ud fra mRNA eller: den proces, hvorved den genetiske information, som er til ste-15 de i et mRNA-molekyle, dirigerer rækkefølgen af specifikke aminosyrer under syntesen af et polypeptid.

Transskription: Den proces, hvorved der med udgangspunkt i en DNA-sekvens syntetiseres en komplementær RNA-sekvens.

20

Vektor: Et plasmid, fag-DNA eller andre DNA-sekvenser, som er i stand til at replikere i en værtscelle, og som har et eller et lille antal endonucleasegenkendelsessteder, på hvilke sådanne DNA-sekvenser kan kløves og på en bestemme!ig måde uden 25 medfølgende tab af en essentiel biologisk funktion af DNA'et, f.eks. replikation, produktion af overtræksproteiner eller tab af promotor- eller bindingssteder, og som indeholder en markør, der er egnet til anvendelse ved identifikation af transformerede celler, i form af f.eks. tetracyklinresistens eller 30 ampici11inresistens. En vektor kaldes ofte kloningsbærer.

Problematikken ved fremstilling af et biologisk aktivt produkt ved hjælp af rekombinant DNA-teknologi er kompleks, da fremstillingen involverer mange procestrin fra initiering af tans-35 skription til opnåelse af det endelige, biologisk aktive molekyle.

5

DK 162900 B

Mange af disse procestrin forekommer ikke i procaryote organismer, hvorfor der i mange tilfælde må anvendes eucaryote produktionsorganismer.

5 Gær er en eucaryot organisme, hvis synteseapparat indbefatter mange af de processer og reguleringsmekanismer, som er karakteristiske for højere organismer. I tilgift har gærceller en kort generationstid, og der eksisterer et tusindårigt erfaringsgrundlag for anvendelsen af gær som kulturorganisme.

10

Helt afgørende faktorer for biologisk syntese af et ønsket genprodukt er en muliggørelse og fremme af transskriptionsinitiering samt transskriptionel og post-transskriptionel regulering af genekspression.

15

Disse funktioner udføres hovedsageligt af 5'-flankerende regioner. En lang række 5'-flankerende regioner fra procaryote og eucaryote gener er sekvensbestemte, og på baggrund blandt andet heraf er tilvejebragt en omfattende viden om reguleringen 20 af genekspression og om hvilke sub-regioner og sekvenser, der er af betydning for regulering af ekspression af genet. Der er store forskelle på reguleringsmekanismen i procaryote og eucaryote organismer, men inden for de to grupper er der mange fælles træk.

25

Regulering af genekspression kan finde sted på transskriptionsniveau og sker da fortrinsvis ved regulering af transskriptionens initieringsfrekvens. Dette er velkendt og beskrevet af bl.a. Benjamin Lewin, Gene Expression, John Wiley & Sons, vol.

30 I, 1974, vol. II, Second Edition 1980, vol. III, 1977. Alternativt kan reguleringen finde sted på posttransskriptionsniveauer, herunder ved regulering af frekvensen for translationsinitieringen, af translationshastigheden samt af translati ons term i ner i ngen.

Leghæmoglobiner er monomere hæmoproteiner, der udelukkende syntetiseres i de rodknolde, som udvikles ved den symbiotiske 35 6

DK 162900 B

forbindelse imellem Rhizobium og bælgplanter. En logisk mulighed for et effektorstof, som aktiverer leghæmoglobingenerne, er hæm, som produceres af Rhizobium, og som udgør leghæmoglobinernes prostetiske gruppe. Syntesen af adskillige hæmoprote-5 iner i gæren, Saccharomyces cerevisiae, reguleres ligeledes af niveauet af intracellulært hæm, som ligeledes udgør den prostetiske gruppe i disse proteiner. Således er transskriptionen af isocytokrom C-genet afhængigt af hæm, hvorimod hæmkon-trollen i tilfældet catalase TI udføres både på transskripti-10 ons- og posttransskriptionsniveau.

I forbindelse med den foreliggende opfindelse angives sekvensen af 5'-flankerende regioner fra de fire sojabønneleghæmo-globingener Lba, Lbcl, Lbc2 og Lbc3. Sekvenserne er angivet i 15 figur 1 på tegningen, hvor sekvenserne er angivet således, at homologien fremgår tydeligt.

I sekvensskemaet betyder at der ikke er nogen base i på gældende position. Til højre i sekvensskemaet er angivet ge-20 nernes navne og baseposition talt opstrøms for ATG-startkoden. Desuden er de betydende sekvenser understregede.

Som det fremgår af sekvensskemaet, er der en udtalt grad af homologi imellem de fire 5'-flankerende regioner, og i posi-25 tionen 23-24 basepar opstrøms for CAP-additionsproduktet indeholder de alle en TATATAAA-sekvens, som svarer til "TATA,,-bok-sen, som normalt i eucaryote celler er lokaliseret et tilsvarende antal basepar opstrøms for CAP-additionspunktet. Desuden findes en CCAAG-sekvens 64-72 basepar opstrøms for CAP-addi-30 tionspunktet, hvilken sekvens svarer til "CCAAT"-boksen, som normalt er lokaliseret 70-90 basepar opstrøms for CAP-additi-onspunktet. Fra CAP-additionspunktet til translationsstartkoden, ATG, findes ledersekvenser på 52-59 basepar, som udviser en udstrakt grad af homologi af størrelsesordenen ca. 75-80%.

Det er desuden i forbindelse med den foreliggende opfindelse blevet vist, eksemplificeret med Lbc3, at de 5'-flankerende 35 7

DK 162900 B

regioner fra sojabønneleghæmoglobigenerne er funktionelle i gær. Dette er blevet vist ved at fusionere E. coli chloramphe-nicol-acetyl-transferase-(CAT)-genet med de 5'- og 3'-flanke-rende regioner fra sojabønne-Lbc3-genet således, at ekspres-5 sionen af CAT-genet kontrolleres af Lb-promotoren. Fusions-fragmentet blev indsat i gærplasmidvektoren, YEP 24, som indeholder gør-URA-3-genet som en selekterbar markør. Gærstammen, S. cerevisiae TMI, som er URA-3 og ude af stand til at syntetisere hæm på grund af en mutation i δ-aminolevulinsyresynte-10 tasegenet, α-ALA, blev dernæst transformeret med den resulterende konstruktion. De transformerede gærceller udviste CAT-aktivitet under alle afprøvede vækstbestingelser. Det kan derfor konkluderes, at de 51-f1 ankerende regioner fra sojabønne-leghæmoglobingenerne ef funktionelle i gær.

15

Det er desuden i forbindelse med den foreliggende opfindelse vist, at de 5'-flankerende regioner er mål for en regulering, som udøves eller formidles af intracellulært hæm. CAT-aktivi-teten forøges således 20-40 gange i gæren, S. cerevisiae TMI, 20 som dyrkes i nærværelse af δ-ALA, i forhold til CAT-aktivite-ter i gær, som dyrkes uden denne hæmbyggesten i vækstmediet. Tilsvarende høje CAT-aktiviteter var til stede i gæren, S. cerevisiae TMI, der blev dyrket i nærværelse af hæm, protopor-hyrin IX, eller hæm-analogen, deuteroporphyrin IX. Effekten af 25 hæm på CAT-aktiviteten er specifik, eftersom mængden af URA-3-genproduktet forbliver konstant under alle de afprøvede vækstbetingelser. Desuden ændres transskriptionsniveauet øjensynligt ikke på grund af tilstedeværelsen af hæm, eftersom CAT-mRNA-niveauet uafhængigt af ændringer i den intracellulære 30 hæmkoncentration forbliver konstant. Det kan derfor konkluderes, at den reguleringsmekanisme, som udøves eller formidles af hæm, foregår på posttransskriptionsniveau.

Den observerede forøgelse af CAT-aktivitet er afhængig af pro-35 teinsyntese. Desuden er halveringstiden for CAT-enzymet uafhængigt af tilstedeværelsen af hæm, og in vitro CAT-aktivitet stimuleres ikke af hæm. Det er derfor sandsynligt, at hæm re- 8

DK 162900 B

gulerer genekspresseionen på translationsniveau. Fusionering af den 5'-flankerende region fra Lbc3 med neomycin-resistens-genet, neomycinphosphattransferase (neo), kontrolleres af hæm på en fuldstændig tilsvarende måde som CAT-genet, der er fusi-5 oneret med en 51-flankerende region af Lbc3-genet. Effekten af hæm udøves således ikke ved indvirkning af hæm på den kodende sekvens, men derimod ved indvirkning af hæm på den 5'- eller 3'-flankerende region fra den Lbc3-sekvens, som er til stede i CAT-mRNA. Ekspressionen af et gen, som kun indeholder den 5'-10 flankerende Lbc3-region og neogenet, kontrolleres på en tilsvarende måde af hæm. Effekten af intracel lulært hæm på genekspressionen må således udøves ved en påvirkning af ledersekvensen .

15 De korte ledersekvenser indeholder ikke translationsstartkoder. Den reguleringsmekanisme, som udøves eller formidles af intracellulært hæm, er derfor ikke beslægtet med reguleringsmekanismer, som involverer falske startkoder, jvf. som beskrevet af Hunt, T. Nature, Vol. 316, 580-581, (1985). Den her be-20 skrevne posttransskriptionelle reguleringsmekanisme, som udøves eller formidles ved indvirkning af hæm på en ledersekvens, er derfor en hidtil ukendt reguleringsmekanisme.

Tilstedeværelsen af plasmider i en i et naturligt miljø fore-25 kommende celle bibringer cellen en egenskab, som kun er fordelagtig for cellen under visse omstændigheder. Plasmidkodede egenskaber kan f.eks. være resistens imod et antibiotikum, som er til stede i det omgivende miljø. Tilstedeværelse af et plasmid og syntese af de plasmidkodede genprodukter belaster 30 imidlertid også cellens energimetabolisme og proteinsynteseap-parat, og en celle, som indeholder et plasmid, vil derfor udkonkurreres og gå til grunde i et miljø, hvor der ikke er behov for de plasmidkodede egenskaber.

35 Denne instabilitet forøges yderligere ved anvendelse af plasmider som vektorer for syntese af et ønsket genprodukt, som den pågældende celle ikke normalt laver. Dette medfører, at 9

DK 162900 B

celler, der syntetiserer sådanne produkter, må udsættes for et selektionspres for, at det ønskede genprodukt vedblivende kan syntetiseres. Den hidtil anvendte metode til at opnå høj ekspression af et givet genprodukt er, at ekspressionen styres af 5 en kraftig promotor, som bevirker en høj koncentration af det mRNA, der translateres til det pågældende genprodukt.

Imidlertid kan en høj genproduktkoncentration også opnås ved en mere effektiv translation af den pågældende mRNA. Dette vil 10 indebære, at genproduktsyntesen styres både på transskriptions- og translationsniveau. Det betyder, at den genetiske belastning for en celle, der syntetiserer et givet genprodukt, kan fordeles på to funktioner i stedet for som normalt på en.

15 Manipulation af de to funktioner kan derfor udføres på en sådan måde, at det samme resultat med hensyn til koncentration af genprodukt vil kunne opnås, selv om promotoren ikke er så kraftig som de almindeligt anvendte. En sådan fordeling af de to funktioner vil medføre, at cellen ikke er så genetisk be-20 lastet, som når genproduktsyntesen kun styres af en kraftig promotor. Herved kan selektionspresset på den pågældende celle sænkes.

Det er endvidere af betydning at opnå den for cellen mest ra-25 tionelle udnyttelse af energimetabolismen og proteinsynteseap-paratet i den fase, hvor syntesen af det ønskede genprodukt finder sted. En sådan rationel udnyttelse af energimetabolismen og proteinsynteseapparatet fremmes ved fortrinsvis at optimere de sene trin i syntesen af et genprodukt frem for at 30 optimere de tidlige trin i syntesen af et genprodukt.

Det er derfor af betydning i et genekspressionssystem, at ekspressionen af det ønskede produkt kan øges fra en i begyndelsen lav ekspression til en overproduktion ved en manipulation 35 af cellens ydre miljø, således som der gives mulighed for ifølge den foreliggende opfindelse. Desuden vil en inducerbar optimering af de posttransskriptionelle syntesetrin, således 10

DK 162900 B

som der ifølge den foreliggende opfindelse gives mulighed for, være mere fordelagtig end en induceret optimering af transskriptionen.

5 Ved hidtil kendte metoder til ekspression af gener i gær er anvendt en række promotorer og ekspressionsvektorer, se f.eks.

EP 120 551 A2, hvori angives anvendelse af GAPDH- eller PyK-gærpromotorer samt af ekspressionsvektorer, hvori disse promotorer indgår.

10

Fra GB 2.137.208 A kendes yderligere anvendelsen af promotoren, GAL1, i flere ekspressionsvektorer.

Ved anvendelse af disse hidtil anvendte promotorer kan eks-15 pressionen kun øges ved en forøgelse af transskriptionsinitieringsfrekvensen. Anvendelsen af disse promotorer medfører dermed en stor genetisk belastning for cellen, en irrationel udnyttelse af energimetabolismen og synteseapparatet samt en deraf følgende instabilitet, som nødvendiggør et stort selek-20 tionspres på værtsorganismen ved anvendelse af disse promotorer.

Formålet med den foreliggende opfindelse er at angive en fremgangsmåde til anvendelse af promotorer, som er funktionelle i 25 gær, samt ledersekvenser, som på en hidtil ukendt måde gør ekspressionen af det efterfølgende gen til genstand for en regulering på posttransskriptionsniveau. Yderligere formål medopfindelsen er at tilvejebringe kombinationer af promotor-og ledersekvens, hvor disse kombinationer er tilvejebragt fra 30 5'-flankerende regioner fra planteleghæmoglobingener og har vist sig at være funktionelle i gær, ligesom det er et formål med opfindelsen at tilvejebringe plasmider, der indeholder de ovennævnte promotor- og ledersekvenser.

35 Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse til ekspression af gener i gær er ejendommelig ved, at der anvendes en 5'-flankerende region fra et planteleghæmoglobin, som omfatter 11

DK 162900 B

et første DNA-fragment indeholdende promotorsekvensen og et andet DNA-fragment indeholdende en ledersekvens, hvilken ledersekvens på post-transskriptionsniveau reguleres af hæm, hæmanaloger, hæmforstadier eller hæmbyggesten, og at den in-5 tracellulære koncentration af hæm øges ved, at der til vækstmediet sættes sådanne carbonkiIder, som medfører forøget in-tracellulær koncentration af hæm. Herved opnås mulighed for, ved indsættelse af et gen nedstrøms for kombinationen og i en egnet vektor, som kan replikere i gær, at opnå en syntese af 10 et biologisk aktivt produkt. Med denne fremgangsmåde er det muligt at øge ekspressionen af et ønsket gen ved en hidtil ukendt reguleringsmekanisme, som virker på posttransskriptionsniveau. Herved opnås en reduceret genetisk belastning på værtscellen og en mere optimal udnyttelse af værtscellens pro-15 teinsynteseapparat og energimetabolisme og en heraf følgende forøget stabilitet af ekspressionsvektoren i værtscellen.

Ved en særlig udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes som et første DNA-fragment en isoleret eller 20 syntetiseret promotorsekvens til kombination med det andet DNA-fragment som angivet i krav 2's kendetegnende del. Ved endnu en særlig udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes der som andet DNA-fragment en isoleret eller syntetiseret ledersekvens til kombination med det første 25 DNA-fragment som angivet i krav 3's kendetegnende del. Herved opnås mulighed for at kombinere enhver ledersekvens fra gær, planter eller dyr, hvilke ledersekvenser under naturlige forhold er genstand for en posttransskriptionel regulering ifølge krav 1, med enhver egnet gærpromotor, piantepromotor 30 eller anden promotor, der er funktionel i gær.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen øges den intracellulære koncentration af hæm ved, at der til vækstmediet sættes sådanne carbonkilder, specielt ikke-fermenterbare carbonkiIder, som 35 medfører forøget intracellulær koncentration af hæm. Herved opnås en induktion af ekspressionen af det ønskede gen ved tilsætning af en carbonkilde til vækstmediet. Eksempler på 12

DK 162900 B

sådanne carbonkilder er glycerol og succinat, som er specielt foretrukne, fordi de er billige og let tilgængelige carbonkilder. Endvidere kan anvendes ethanol, som gæren under visse omstændigheder kan bringes til at producere selv, mens den 5 vokser. Ethanolen vil udnyttes efter ophør af væksten, hvorved translationen øges.

Ved en speciel udførelsesform kan samme effekt opnås ved, at den intracel 1 ulære koncentration af hæm øges ved, at der til 10 vækstmediet sættes et eller flere stoffer valgt fra gruppen . bestående af hæm, hæmanaloger, hæmforstadier og hæmbyggesten.

Et eksempel på en hæmanalog er deuteroporphyr in IX, og et eksempel på hæmbyggesten er δ-aminolevulinsyre.

15 Ved en særlig udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes et DNA-fragment, der omfatter en promotorse-.kvens og en ledersekvens, og som er identisk med, afledt af eller indeholder 5'-flankerende regioner fra planteleghæmo-globingener, gærgener eller andre gener, som under naturlige 20 forhold er genstand for en ekspressionsregulering, som udøves eller formidles af intracellulært hæm. Herved opnås en enkel adgang til en kombination af ledersekvens og promotorsekvens, hvilken kombination i forbindelse med den foreliggende opfindelse er påvist at være funktionel i gær. Eksempler på sådanne 25 DNA-fragmentér er de fire 5'-flankerende regioner fra sojabøn- neleghæmoglobingenerne, nemlig

Lba, med sekvensen:

30 GAGATACATT ATAATAATCT CTCTAGTGTC TATTTATTAT TTTATCTGGT · GATATATACC TTCTCGTATA CTGTTATTTT TTCAATCTTG TAGATTTACT TCTTTTATTT TTATAAAAAA GACTTTATTT TTTTAAAAAA AATAAAGTGA ATTTTGAAAA CATGCTCTTT GACAATTTTC TGTTTCCTTT TTCATCATTG GGTTAAATCT CATAGTGCCT CTATTCAATA ATTTGGGCTC AATTTAATTA GTAGAGTCTA CATAAAATTT ACCTTAATAG TAGAGAATAG AGAGTCTTGG AAAGTTGGTT TTTCTCGAGG AAGAAAGGAA ATGTTAAAAA CTGTGATATT TTTTTTTTGG ATTAATAGTT ATGTTTATAT GAAAACTGAA AATAAATAAA 35 CTAACCATAT TAAATTTAGA ACAACACTTC AATTATTTTT TTAATTTGAT

TAATTAAAAA ATTATTTGAT TAAATTTTTT AAAAGATCGT TGTTTCTTCT TCATCATGCT GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAÅC ACATAAGCTT TGGTTTTCTC ACTCTCCAAG CCCTCTATAT AAACAAATAT TGGAGTGAAG TTGTTGCATA ACTTGCATCG AACAATTAAT AGAAATAACA GAAAATTAAA AAAGAAATAT G,

DK 162900 B

13

Lbcl med sekvensen: 5

TTCTCTTAAT ACAATGGAGT TTTTGTTGAA CATACATACA TTTAAAAAAA AATCTCTAGT GTCTATTTAC CCGGTGAGAA GCCTTCTCGT GTTTTACACA CTTTAATATT ATTATATCCT CAACCCCACA AAAAAGAATA CTGTTATATC TTTCCAAACC TGTAGATTTA TTTATTTATT TATTTATTTT TACAAAGGAG ACTTCAGAAA AGTAATTACA TAAAGATAGT GAACATCATT TTATTTATTA 10 TAATAAACTT TAAAATCAAA CTTTTTTATA TTTTTTGTTA CCCTTTTCAT TATTGGGTGA AATCTCATAG TGAAGCCATT AAATAATTTG GGCTCAAGTT TTATTAGTAA AGTCTGCATG AAATTTAACT· TAACAATAGA GAGAGTTTTC GAAAGGGAGC GAATGTTAAA AAGTGTGATA TTATATTTTA TTTCGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA CATACAAAAA AATACTTTTA AATTCAGAAT AATACTTAAA ATATTTATTT GCTTAATTGA TTAACTGAAA ATTATTTGAT TAGGATTTTG AAAAGATCAT TGGCTCTTCG TCATGCCGAT TGACACCCTC CACAAGCCAA GAGAAACTTA AGTTGTAAAC TTTCTCACTC CAAGCCTTCT 15 ATATAAACAT GTATTGGATG TGAAGTTATT GCATAACTTG CATTGAACAA

TAGAAAATAA CAAAAAAAAG TAAAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG, 20

Lbc2 med sekvensen:

'TCGAGTTTTT ACTGAACATA CATTTATTAA AAAAAACTCT CTAGTGTCCA TTTATTCGGC GAGAAGCCTT CTCGTGCTTT ACACACTTTA ATATTATTAT 25 ATCCCCACCC CCACCAAAAA AAAAAAAACT GTTATATCTT TCCAGTACAT

TTATTTCTTA TTTTTACAAA GGAAACTTCA CGAAAGTAAT TACAAAAAAG ATAGTGAACA TCATTTTTTT AGTTAAGATG AATTTTAAAA TCACACTTTT TTATATTTTT TTGTTACCCT TTTCATTATT GGGTGAAATC TCATAGTGAA ACTATTAAAT AGTTTGGGCT CAAGTTTTAT TAGTAAAGTC TGCATGAAAT TTAACTTAAT AATAGAGAGA GTTTTGGAAA GGTAACGAAT GTTAGAAAGT GTGATATTAT TATAGTTTTA TTTAGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA 30 TTGACAATTT ATTTTTAAAA TTCAGAGTAA TACTTAAATT ACTTATTTAC

TTTAAGATTT TGAAAAGATC ATTTGGCTCT TCATCATGCC GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC TTAAGTTGTA ATTTTTCTAA CTCCAAGCCT TCTATATAAA CACGTATTGG ATGTGAAGTT GTTGCATAAC TTGCATTGAA CAATAGAAAT AACAACAAAG AAAATAAGTG AAAAAAGAAA TATG, 35 og Lbc3 med sekvensen: 14

DK 162900 B

TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT GTAGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA 5 AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT

TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT 10 TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC

TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA CAGÅAAAGTA GAAAAGAAAT ATG- i

Ved endnu en særlig udførelsesform for fremgangsmåden ifølge 15 opfindelsen anvendes et DNA-fragment, som er identisk med, afledt af eller indeholder 5'-flankerende regioner fra YEP Lb .CAT-genet med sekvensen:

20 TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA

GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT GTAGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA 25 CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA

AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA 3D TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA

CAGAAAAGTA GAATTCTAAA ATG

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid ved ekspression i en gærcelle, hvilken frem-35 gangsmåde er ejendommelig ved, det i krav 12's kendetegnende del anførte.

15

DK 162900 B

Ved en særlig udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes der som rekombineret plasmid et plasmid, som indeholder en promotorsekvens og en ledersekvens i et DNA-fragment med såvel en 5'-flankerende som en 31-flankerende 5 region fra et planteleghæmoglobingen.

Den foreliggende opfindelse angår endvidere hidtil ukendte DNA-f ragmenter af den i krav 13's indledning angivne art, hvilke fragmenter er ejendommelig ved det i krav 13*s kende-10 tegnende del anførte.

Ved en særlig udførelsesform er DNA-fragmentet et kort Defragment, som transskriberes til en messenger-RNA-streng, som er mål for en regulering, der udøves eller formidles af intra-15 cellulært hæm. Eksempler på sådanne DNA-fragmenter er DNA-fragmenter, som er identiske med, afledt af eller indeholder en. ledersekvens fra planteleghæmoglobingener, gærgener eller andre gener, i hvilke gener denne ledersekvens under naturlige forhold er mål for en regulering, der udøves eller formid-20 les af intercellulært hæm.

Eksempler på sådanne DNA-fragmenter ifølge opfindelsen er DNA-fragmenter, som omfatter en promotorsekvens og en ledersekvens, og som er identisk med, afledt af eller indeholder 5'-25 flankerende regioner fra sojabønneleghæmoglobingenerne, nemlig

Lba med sekvensen:

30 GAGATACATT ATAATAATCT CTCTAGTGTC TATTTATTAT TTTATCTGGT

GATATATACC TTCTCGTATA CTGTTATTTT TTCAATCTTG TAGATTTACT TCTTTTATTT TTATAAAAAA GACTTTATTT TTTTAAAAAA AATAAAGTGA

attttgaaaa catgctcttt gacaattttc tgtttccttt ttcatcattg

GGTTAAATCT CATAGTGCCT CTATTCAATA ATTTGGGCTC AATTTAATTA GTAGAGTCTA CATAAAATTT ACCTTAATAG TAGAGAATAG AGAGTCTTGG AAAGTTGGTT TTTCTCGAGG AAGAAAGGAA ATGTTAAAAA CTGTGATATT 35 TTTTTTTTGG ATTAATAGTT ATGTTTATAT GAAAACTGAA AATAAATAAA

CTAACCATAT TAAATTTAGA ACAACACTTC AATTATTTTT TTAATTTGAT TAATTAAAAA ATTATTTGAT TAAATTTTTT AAAAGATCGT TGTTTCTTCT TCATCATGCT GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC ACATAAGCTT TGGTTTTCTC ACTCTCCAAG CCCTCTATAT AAACAAATAT TGGAGTGAAG TTGTTGCATA ACTTGCATCG AACAATTAAT AGAAATAACA GAAAATTAAA AAAGAAATAT G,

Lbcl med sekvensen: 16

DK 162900 B

TTCTCTTAAT ACAATGGAGT TTTTGTTGAA CATACATACA TTTAAAAAAA AATCTCTAGT GTCTATTTAC CCGGTGAGAA GCCTTCTCGT GTTTTACACA CTTTAATATT ATTATATCCT CAACCCCACA„AAAAAGAATA CTGTTATATC 5 TTTCCAAACC TGTAGATTTA TTTATTTATT TATTTATTTT TACAAAGGAG

ACTTCAGAAA AGTAATTACA TAAAGATAGT GAACATCATT TTATTTATTA TAATAAACTT TAAAATCAAA CTTTTTTATA TTTTTTGTTA CCCTTTTCAT TATTGGGTGA AATCTCATAG TGAAGCCATT AAATAATTTG GGCTCAAGTT TTATTAGTAA AGTCTGCATG AAATTTAACT TAACAATAGA GAGAGTTTTC GAAAGGGAGC GAATGTTAAA AAGTGTGATA TTATATTTTA TTTCGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA CATACAAAAA AATACTTTTA AATTCAGAAT 1Q AATACTTAAA ATATTTATTT GCTTAATTGA TTAACTGAAA ATTATTTGAT

TAGGATTTTG AAAAGATCAT TGGCTCTTCG TCATGCCGAT TGACACCCTC CACAAGCCAA GAGAAACTTA AGTTGTAAAC TTTCTCACTC CAAGCCTTCT ATATAAACAT GTATTGGATG TGAAGTTATT GCATAACTTG CATTGAACAA TAGAAAATAA CAAAAAAAAG TAAAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG, i 15 Lbc2 med sekvensen:

TCGAGTTTTT ACTGAACATA CATTTATTAA AAAAAACTCT CTAGTGTCCA

TTTATTCGGC GAGAAGCCTT CTCGTGCTTT ACACACTTTA ATATTATTAT

ATCCCCACCC CCACCAAAAA AAAAAAAACT GTTATATCTT TCCAGTACAT

2o TTATTTCTTA TTTTTACAAA GGAAACTTCA CGAAAGTAAT TACAAAAAAG

ATAGTGAACA TCATTTTTTT AGTTAAGATG AATTTTAAAA TCACACTTTT

TTATATTTTT TTGTTACCCT TTTCATTATT GGGTGAAATC TCATAGTGAA

ACTATTAAAT AGTTTGGGCT CAAGTTTTAT TAGTAAAGTC TGCATGAAAT ‘ TTAACTTAAT AATAGAGAGA GTTTTGGAAA GGTAACGAAT GTTAGAAAGT .

GTGATATTAT TATAGTTTTA TTTAGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA

TTGACAATTT ATTTTTAAAA TTCAGAGTAA TACTTAAATT ACTTATTTAC

TTTAAGATTT TGAAAAGATC ATTTGGCTCT TCATCATGCC GATTGACACC

25 CTCCACAAGC CAAGAGAAAC TTAAGTTGTA ATTTTTCTAA CTCCAAGCCT

TCTATATAAA CACGTATTGG ATGTGAAGTT GTTGCATAAC TTGCATTGAA

CAATAGAAAT AACAACAAAG AAAATAAGTG AAAAAAGAAA TATG/ 30 35 og Lbc3 med sekvensen: 17

DK 162900 B

TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA CAGAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG.

Et andet eksempel på et sådant DNA-fragment ifølge opfindelsen 15 er et DNA-fragment, som er identisk med, afledt af eller indeholder 5'-flankerende regioner fra YEP Lb CAT-genet med se-.kvensen:

TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT 20 GTAGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA

ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT

25 GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA

CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA CAGAAAAGTA GAATTCTAAA ATG

30

Opfindelsen angår desuden et rekombineret DNA-segment til brug ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hvilket DNA-segment er ejendommelig ved det i krav 20's kendetegnende del angivne.

35 Endelig angår opfindelsen plasmiderne YEB Lb CAT og YEP 5 Lb Km til brug ved fremgangsmåden ifølge krav 1 til fremstilling af henholdsvis CAT eller ΝΤΡ II, hvilke plasmider er ejendom-

DK 162900B

18 melig ved det i den kendtegnende del til henholdsvis krav 21 og 22 anførte. Plasmiderne ifølge opfindelsen muliggør en høj ekspression af et ønsket genprodukt ved indsættelse af kodende sekvenser for disse genprodukter.

5

Opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af tegningen og de efterfølgende eksempler. På tegningen viser fig. 1 nucleotidsekvensen for regionerne i sojabønnehæmoglo-10 bingenerne Lbal, Lbcl, Lbc2 og Lbc3, fig. 2 subkloning af Lbc3-genet, fig. 3 konstruktion af p213-5'-Lb, 15 fig. 4 konstruktion af PEJLb5'-3’-1, fig. 5 konstruktion af PEJLbe'-S'-CATlB, 20 fig. 6 plasmidet YEB Lb CAT, fig. 7 konstruktionen af PEJLb5'-3'-Kml, fig. 8 peptidet YEB 5 Lb Km, 25 fig. 9 en sammenligning af sekvenser for pEJ5'-31-CAT101 og den oprindelig, jvf. eksempel 6, og fig. 10 en sekvenssammenligning mellem CAT-bd og CAT-kn, jvf.

30 eksempel 7.

35

DK 162900 B

19

Eksempel 1

Sekvensbestemmelse af 51-flankerende regioner fra sojabønne-leg hæmoglob i ngener 5

Fra en sojabønne-genbank er, som beskrevet af Jensen E. 0. et al., Nature Vol. 291, nr. 3817, 677-679 (1981) tilvejebragt de fire sojabønneleghæmoglobingener, Lba, Lbcl, Lbc2 og Lbc3. De 5'-flankerende regioner fra de fire sojabønneleghæmoglobinge-10 ner er isoleret, som beskrevet af Jensen, E. 0. licentiatafhandling, Institut for Molekylær Biologi, Arhus Universitet (1985), og sekvenserne af de fire 5'-flankerende regioner er bestemt ved anvendelse af didesoxymetoden, som beskrevet af Sanger, F., J. Mol. Bio. 143, 161 (1980), og angivet i 15 sekvensskemaet.

Eksempel 2

Konstruktion af YEB Lb CAT

20

Konstruktionen er foregået i en række delprocesser, som er beskrevet i det følgende:

Subkloning af Lbc3-genet 25

Lbc3-genet blev isoleret på et 12 kb EcoRI restriktionsfragment fra et sojabønne-DNA-bibliotek, hvilket er beskrevet i Wiborg et al., Nucl. Acids. Res. 10, 3487. Et udsnit af dette fragment er vist øverst i figur 2 på tegningen. Dette fragment 30 blev fordøjet med de opgivne enzymer, for derefter at blive ligeret til pBR322 som vist på figuren. De resulterende plas-mider, Lbc3HH og Lbc3HX, blev derefter fordøjet med PvuII og religeret, hvilket resulterede i to plasmider, der benævnes som pLpHH og pLpHX.

35 20-

DK 162900 B

Subkloning af 51-f1 ankerende sekvenser fra Lbc3-aenet

Til dette anvendtes pLpHH, som vist i fig. 3. Dette plasmid blev åbnet med PvuII og behandlet med exonuklease Bal31. Reak-5 tionen blev stoppet på forskellige tidspunkter, og de afkortede plasmider blev ligeret til fragmenter fra pBR322. Disse var i forvejen blevet behandlet, som vist i fig. 3, således at de i den ene ende havde en DNA-sekvens TTC * AAG- jq Efter ligeringen blev der fordøjet med EcoRI, og de fragmenter, der indeholdt 5'-flankerende sekvenser, blev ligeret til EcoRI-fordøjet pBR322. Disse plasmider blev transformeret ind i E. coli K803, og plasmiderne i transformanterne blev undersøgt ved sekvensanalyse. Et plasmid, p213 5'Lb, isoleret fra en af transformanterne, indeholdt en 5'-flankerende sekvens, 1 o der terminerer 7 basepar før Lb ATG-startkoden, således at sekvensen er som følger: 2kb - 5'-flankerende --- AAAGTAGAATTCTAAAATG.

20 Lbc3-sekvens

Subkloninq af 3 *-flankerende region fra Lbc3-genet oc Til dette anvendtes pLpHX, der blev fordøjet med XhoII. Ender- 69 ne blev delvis udfyldt, og overskydende DNA blev fjernet som vist i fig. 4. Det viste fragment blev ligeret til pBR322, der var forbehandlet som angivet på figuren. Konstruktionen blev transformeret ind i E. coli K803. En af transformanterne inde-30 holdt et plasmid, der blev benævnt Xho2a-3'Lb. Da XhoII genkendelsessekvensen er beliggende umiddelbart efter Lb-stopko-den (se fig. 2) indeholdt plasmidet ca. 900 basepar af den 3'-flankerende region, og sekvensen startede med GAATTCTACAA----.

35 21

DK 162900 B

Kontruktion af Lb-promotorkassette.

Et EcoRI/SphI-fragment fra Xho2a-3‘Lb, indeholdende den 3'-flankerende sekvens, blev blandet med et BamHI/EcoRI-frag-5 ment fra p 213-5'Lb. Disse to fragmenter ligeredes via BAmHI/-Sphl-kløvningspunkterne til et pBR322-deri vat, hvor EcoRI-genkendelsessekvensen var blevet fjernet (fig. 4). De ligerede plasmider blev transformeret ind i E. coli K803. Et plasmid i en af transformanterne indeholdt de korrekte fragmenter og det 10 blev benævnt pEJLb 51-3'-1 -

Konstruktion af kimarisk Lb/CAT-gen CAT-genet fra pBR322 blev isoleret på flere mindre restrikti-15 onsfragmenter, som angivet på figur 5. Den S'-kodende region blev isoleret på et Alul-fragment, der efterfølgende blev ligeret til pBR322, behandlet som angivet på figuren. Dette blev transformeret ind i E. coli K803, og en udvalgt transformant indeholdt et plasmid, der blev benavnt Alull. Den 3'-kodende 20 region blev isoleret på et Taql-fragment. Dette fragment blev behandlet som exonuklease Bal31, hvorefter der blev adderet EcoRI-koblere. Dernæst blev det fordøjet med EcoRI og ligeret til EcoRI-fordøjet pBR322. Dette blev transformeret ind i E. coli K803, og transformanterne blev analyseret. Et plasmid 25 (Taq 12) indeholdt den 3'-kodende region fra CAT-genet plus 23 basepar 3'-flankerende sekvenser for derefter at terminere i følgende sekvens -CCCCGAATTC. Herefter blev følgende fragmenter ligeret samlet til EcoRI-fordøjet pEJLb 5'-3'-l: EcoRI/PvuII-fragment af Alull, PvulI/Ddel-fragment fra pBR328 30 og Ddel/EcoRI-fragment fra Taq 12. Dette blev transformeret ind i E. coli K803. En udvalgt transformant indeholdt det korrekte plasmid , som blev kaldt pEJLb 5'-3' CAT 15.

Kloning af kimærisk Lb/CAT-gen i qærplasmid 35

Dette kimæriske gen blev isoleret på et BamHI/Sphl-fragment fra pEJLb 5'-3' CAT 15 og ligeret til gærplasmidet YEP24, der .22

DK 162900 B

var skåret med de samme enzymer. Efter transformation ind i E. coli K803 blev en udvalgt transformant undersøgt. Den indeholdt det i figur 6 på tegningen viste plasmid YEP Lb CAT. Dette plasmid blev videretransformeret ind i gærstammerne 5 Saccharomyces cerevisiae DBY747 og TMI.

Eksempel 3

Kontruktion af YEP SLb Km 10

Neomycinphosphotransferase(NPTII)genet blev isoleret fra pKM2 (Beck et al., Gene 19, 327). Den 5'-kodende region fra dette gen blev isoleret på et Sau3A-fragment, som vist i figur 7, og derefter ligeret til pBR322 resulterende i et plasmid benævnt 15 Sau 13. Den 3'-kodende og flankerende region fra NPTII-genet blev isoleret på et PvuII-fragment. Dette blev sammen med et EcoRI/PvuII-fragment fra Sau 13 ligeret til EcoRI/PvuII-fordøjet pEJLb 5 *-31 —1. Efter transformation ind i E. coli K803 blev en transformant med det korrekte plasmid (pEJLb 5' Km 1) 20 udvalgt. Dette plasmid blev senere fordøjet med BamHI og partielt med PvuII, således at hele den 5’-flankerende Lb-sekvens + den kodende NPTII-sekvens befandt sig på et BamHI/PvuII-fragment. Dette fragment blev ligeret til BamHI/PvuII-fordøjet YEP 24 resulterende i det i figur 8 på tegningen viste plasmid 25 YEP 5Lb Km. Dette plasmid blev transformeret ind i gærstammen Saccharomyces cerevisiae TMI.

Eksempel 4 30

Effekt af carbonkilde på ekspression af CAT

Saccharomyces cerevisiae, DBY747, der indeholder plasmidet YEP Lb CAT, dyrkes i minimalmedium plus 2% carbonkilde. Cellerne 35 høstes ved en celletæthed på 5 x 10*> celler pr. ml. CAT-akti-viteten måles som beskrevet af Walker, Edlund, Boulet & Rutter, Nature, 306, 557 (1983).

DK 162900 B

23 CAT-aktiviteten er i tabel 1 angivet som en funktion af car-bonkilden. Den højeste aktivitet, som opnås ved vækst på suc-cinat eller glycerol, er arbitrært sat til 100%.

5 Tabel 1

Carbonki1 de Akt i v i tet succinat 100 glycerol 100 10 glucose 28 saccharose 18

Eksempel 5 15 Effekt af hæmbyggesten og hæmanaloger på induktion af genekspression .

Saccharomyces cerevisiae TMI, der indeholder plasmidet YEP Lb CAT, dyrkes i minimalmedium plus 2% glucose plus 0,1% Tween* 20 plus 20 pg/ml ergosterol plus 50 pg/ml methionin samt en af følgende hæmanaloger eller hæmbyggesten. Deuteroporphyrin IX (dp) henholdsvis protoporphyrin (pp), tilsættes til en endelig koncentration på 5 pg/ml. Hæmin tilsættes til en endelig koncentration på 5 pg/ml. δ-aminolevulinsyre, δ-ALA, tilsættes 25 til en endelig koncentration på 50 pg/ml.

CAT-aktiviteten i tabel 2 er angivet som en funktion af hæmbyggesten hhv. af hæmanalog. Den højeste aktivitet, som opnås ved tilsætning af δ-ALA eller dp, er arbitrært sat til 100% 30 35

DK 162900 B

24

Tabel 2

Inducer CAT-aktivitet

Glucose + δ-ALA 100 5 Glucose + dp 100

Glucose + pp 50

Glucose + hæmin 25

Glucose 5 10 Eksempel 6

Indsætning af linkere i ledersekvensen

To syntetiske DNA-linkere er blevet indsat: Én lige over for 15 startcodon, som indeholder genkendelsessekvensen for enzymet Bglll og én linker opstrøms for CAP-additionsstedet, som indeholder genkendelsessekvensen for Kpnl, jævnfør fig. 9, hvori den nye konstruktion pEJ5'-3'-CAT101 er sammenholdt med den oprinde!ige.

20

En sammenligning af ekspression fra de to konstruktioner viser følgende (forsøg som i eksempel 5): glucose glucose + hæm induktion 25 CAT15 0,11 6,01 55x CAT101 0,22 1,72 8x

Tallene angiver nmol chloramphenicol omsat/mg protein/min.

30

Dette viser, at to specifikke ændringer i 5*-regionen fører til et fald i hæminduktion fra 55x ned til 8x.

35

DK 162900B

5 25

Eksempel 7

Erstatning af Lbc3-51-regionen med en tilsvarende region fra ILVl-genet fra S. cerevisiae.

Hele Lbc3-51-regionen fjernes fra CAT101 ved at skære med BaroHI og Bglll. I stedet indsættes et 765 bp DNA~fragment fra ILVl-genet indeholdende promotor og ledersekvens. Denne konstruktion kaldes PEJ CAT-BD.

10 I en anden konstruktion fjernes Lbc3-promotoren efterladende ledersekvensen. Dette gøres ved at skære CAT101 med BamHI og KpnI. Dette fragment erstattes med et 670 bp fragment fra ILVI, promotoren manglende ledersekvensen. Dette plasmid kal-15 des PEJ CAT-KN.

Konstruktionerne er vist skematisk: - promotor ledersekvens kodende -//r—..........

20 ILVI ^ CAT

CAT-BD

ILVI Lbc3 CAT

-fN-t-Ht-t // i.......—

CAT-KN

25 Sekvenssammenligningen er vist på fig. 10.

Ekspressi onsundersøge Ise glucose glucose + hæm induktion 30 CAT-BD 1089 1162 ingen CAT-KN 789 1580 2x

Samme enheder som i tidligere forsøg.

Den eneste forskel mellem de to konstruktioner er oprindelse af ledersekvensen. Resultatet viser, at Lbc3-ledersekvensen er 35 26

DK 162900 B

nødvendig for induktion. Induktionsniveauet er dog ikke så højt som hos CAT101, der er udgangsmaterialet, hvilket eventuelt kan skyldes, at konstruktionen starter 13 nukleotider tættere på ATG og dermed mangler mRNA 13 nukleotider, der 5 eventuelt har betydning for induktionen.

Alle disse forsøg viser klart, at hæminduktionen er knyttet til Lbc3-ledersekvensen.

10 Ifølge opfindelsen anvendes således ikke udelukkende 5'-flan-kerende regioner fra sojabønneleghæmoglobingener. Det er velkendt, at leghæmoglobingenerne i alle bælgplanter har samme funktion, jvf. Appleby (1974) i The Biology af Nitrogen Fixation, Quispel. A. Ed. North-Hoi land Publishing Company, Am-15 sterdam Oxford, side 499-554, og det er desuden for havebønne PvLbl-genet vist, at der er en udstrakt grad af homologi med sekvenserne af sojabønne Lbc3. Opfindelsen omfatter således anvendelsen af 5'-flankerende regioner fra leghæmoglobingener fra alle planter.

20

Ifølge opfindelsen kan også anvendes sådanne fragmenter fra planter, dyr eller gær, som under naturlige forhold udøver eller formidler den hidtil ukendte reguleringsfunktion, som er beskrevet i den foreliggende opfindelse. Specielt gælder dette 25 sådanne som kan isoleres fra DNA-fragmenter fra genbanker eller genomer ved hybridisering med mærkede sekvenser fra 5'-flankerende regioner fra sojabønneleghæmoglobingener.

Det er velkendt, at det er muligt at ændre nucleotidsekvenser 30 i ikke-betydende subregioner i 5'-flankerende regioner uden at dette indebærer ændret promotoraktivitet og regulerbarhed. Det er også velkendt, at det, ved at ændre sekvenser 1 betydende subregioner i 51-flankerende regioner, er muligt at ændre bindingsaffiniteter imellem nucleotidsekvenser og de til trans-35 skriptionsinitiering og translationsinitiering nødvendige faktorer eller effektorstoffer og dermed muligt at forbedre promotoraktivitet og/eller regulerbarhed. Den foreliggende opfin-

Claims

1. Fremgangsmåde til ekspression af gener i gær ved, at der i en gærcelle indføres et rekombineret DNA-segment, der indeholder dels det gen, der ønskes udtrykt, dels en 5’-flankerende region, hvori indgår en promotorsekvens, og at de transforme-15 rede gærceller dyrkes i et egnet vækstmedium, kendetegnet ved, at der anvendes en 5'-flankerende region fra et planteleghæmoglobin, som omfatter et første DNA-fragment indeholdende promotorsekvensen og et andet DNA-fragment indeholdende en ledersekvens, hvilken ledersekvens på post-trans-20 skriptionsniveau reguleres af hæm, hæmanaloger, hæmforstadier eller hæmbyggesten, og at den intracellulære koncentration af hæm øges ved, at der til vækstmediet sættes sådanne carbonkil-der, som medfører forøget intracellulær koncentration af hæm.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der som første DNA-fragment anvendes et fra en bakterie isoleret DNA-fragment, et ud fra plantens DNA in vitro syntetiseret DNA eller et kemisk syntetiseret DNA-molekyle indeholdende en promotorsekvens til kombination med det andet DNA-fragment. 30

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der som andet DNA-fragment anvendes et fra en bakterie isoleret DNA-fragment, et ud fra plantens DNA in vitro syntetiseret DNA eller et kemisk syntetiseret DNA-molekyle indeholdende en 35 ledersekvens til kombination med det første DNA-fragment.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at carbonkilden er valgt blandt glycerol, succinat eller ethanol. DK 162900 B 28

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den intracellulære koncentration af hæm øges ved, at der til vækstmediet sættes et eller flere stoffer valgt fra gruppen bestående af hæm, hæmanaloger, hæmforstadier og hæmbyggesten. 5

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at der som hæmanalog anvendes deuteroporphyrin IX og/eller som hæmbyggesten anvendes d-aminolevulinsyre.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den 5'-flankerende region er identisk med, afledt af eller indeholder 5'-flankerende regioner fra sojabønneleghæmoglobinge-ner.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at den 51-flankerende region er identisk med, afledt af eller indeholder 5’-flankerende regioner fra Lba-genet med sekvensen: GAGATACATT ATAATAATCT CTCTAGTGTC TATTTATTAT TTTATCTGGT GATATATACC TTCTCGTATA CTGTTATTTT TTCAATCTTG TAGATTTACT

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at den 5'-flankerende region er identisk med, afledt af eller indeholder 51-f1 ankerende regioner fra Lbcl-genet med sekvensen: 35 -29 DK 162900 B TTCTCTTAAT ACAATGGAGT TTTTGTTGAA CATACATACA TTTAAAAAAA AATCTCTAGT GTCTATTTAC CCGGTGAGAA GCCTTCTCGT GTTTTACACA CTTTAATATT ATTATATCCT CAACCCCACA AAAAAGAATA CTGTTATATC TTTCCAAACC TGTAGATTTA TTTATTTATT TATTTATTTT TACAAAGGAG ACTTCAGAAA AGTAATTACA TAMGATAGT GAACATCATT TTATTTATTA TAATAAACTT TAAAATCAAA CTTTTTTATA TTTTTTGTTA CCCTTTTCAT TATTGGGTGA AATCTCATAG TGAAGCCATT AAATAATTTG GGCTCAAGTT » TTATTAGTAA AGTCTGCATG AAATTTAACT TAACAATAGA GAGAGTTTTC GAAAGGGAGC GAATGTTAAA AAGTGTGATA TTATATTTTA TTTCGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA CATACAAAAA AATACTTTTA AATTCAGAAT AATACTTAAA ATATTTATTT GCTTAATTGA TTAACTGAAA ATTATTTGAT TAGGATTTTG AAAAGATCAT TGGCTCTTCG TCATGCCGAT TGACACCCTC CACAAGCCAA GAGAAACTTA AGTTGTAAAC TTTCTCACTC CAAGCCTTCT ATATAAACÅ.T GTATTGGATG tgaagttatt GCATAACTTG CATTGAACAA 10 TAGAAAATAA CAAAAAAAAG TAAAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at den 51-flankerende region er identisk med, afledt af eller indholder 5'-flankerende regioner fra Lbc2-genet med sekven- 15 sen: TCGAGTTTTT ACTGAACATA CATTTATTAA AAAAAACTCT CTAGTGTCCA TTTATTCGGC GAGAAGCCTT CTCGTGCTTT ACACACTTTA ATATTATTAT ATCCCCACCC CCACCAAAAA AAAAAAAACT GTTATATCTT TCCAGTACAT TTATTTCTTA TTTTTACAAA GGAAACTTCA CGAAAGTAAT TACAAAAAAG ATAGTGAACA TCATTTTTTT AGTTAAGATG AATTTTAAAA TCACACTTTT 20 TTATATTTTT TTGTTACCCT TTTCATTATT GGGTGAAATC TCATAGTGAA ACTATTAAAT AGTTTGGGCT CAAGTTTTAT TAGTAAAGTC TGCATGAAAT TTAACTTAAT AATAGAGAGA GTTTTGGAAA GGTAACGAAT GTTAGAAAGT GTGATATTAT TATAGTTTTA TTTAGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA TTGACAATTT ATTTTTAAAA TTCAGAGTAA TACTTAAATT ACTTATTTAC TTTAAGATTT TGAAAAGATC ATTTGGCTCT TCATCATGCC GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC TTAAGTTGTA ATTTTTCTAA CTCCAAGCCT TCTATATAAA CACGTATTGG ATGTGAAGTT GTTGCATAAC TTGCATTGAA 25 CAATAGAAAT AACAACAAAG AAAATAAGTG AAAAAAGAAA TATG.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, 30 at den 5*-flankerende region er identisk med, afledt af eller indeholder 51-flankerende regioner fra Lbc3-genet med sekvensen: 35 30 DK 162900 B TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT GTAGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA 5 TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA 1 TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA CAGAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til fremstilling af et poly-.15 peptid ved ekspression af gærceller, der indeholder et rekom- bineret DNA-segment, som omfatter dels et gen, der koder for polypeptidet og dels en 5'-flankerende region, hvori der indgår en promotorsekvens, ved dyrkning i et egnet vækstmedium, kendetegnet ved, at der anvendes en 5'-flankerende 20 region fra et planteleghæmoglobin, som omfatter et første Defragment indeholdende promotorsekvensen og et andet DNA-frag-ment indeholdende en ledersekvens, hvilken ledersekvens på post-transskriptionsniveau reguleres af hæm, hæmanaloger, hæm-forstadier eller hsmbyggesten, og at den intracellulære kon-25 centration af hæm øges ved, at der til vækstmediet sættes sådanne carbonkiIder, som medfører forøget intracellulær koncentration af hæm.

13. DNA-fragment til brug i et rekombineret DNA-segment ved 30 udøvelse af fremgangsmåden ifølge krav 1 - 12, kendetegnet ved, at det omfatter et første DNA-fragment indeholdende en promotorsekvens og et andet DNA-fragment indeholdende en ledersekvens, hvilken ledersekvens på posttransskriptionsniveau reguleres af hæm, hæmanaloger, hæm- 35 forstadier eller hæmbyggesten, og er identisk med, afledt eller indeholder en 5’-flankerende region fra et planteleghæmo-globingen. DK 162900 B 31

14. DNA-fragment ifølge krav 13, der indeholder en ledersekvens, til brug ved udøvelse af fremgangsmåden ifølge krav 1-6, kendetegnet ved, at det er et kort DNA-frag-ment, som transskriberes til en mRNA-streng, som er mål for en 5 regulering der udøves eller formidles af intracellulært hæm.

15. DNA-fragment til brug ved udøvelse af fremgangsmåden ifølge krav 13, kendetegnet ved, at det er identisk 10 med, afledt af eller indeholder 5'-flankerende regioner fra sojabønnel eghæmog1 obi ngener.

16. DNA-fragment ifølge krav 15, kendetegnet ved, at det er identisk med, afledt af eller indeholder 5'-flanke- 15 rende regioner fra Lba-genet med sekvensen: GAGATACATT ATAATAATCT CTCTAGTGTC TATTTATTAT TTTATCTGGT GATATATACC TTCTCGTATA CTGTTATTTT TTCAATCTTG TAGATTTACT TCTTTTATTT TTATAAAAAA GACTTTATTT TTTTAAAAAA AATAAAGTGA ATTTTGAAAA CATGCTCTTT GACAATTTTC TGTTTCCTTT TTCATCATTG GGTTAAATCT CATAGTGCCT CTATTCAATA ATTTGGGCTC AATTTAATTA 2o GTAGAGTCTA CATAAAATTT ACCTTAATAG TAGAGAATAG AGAGTCTTGG AAAGTTGGTT TTTCTCGAGG AAGAAAGGAA ATGTTAAAAA CTGTGATATT TTTTTTTTGG ATTAATAGTT ATGTTTATAT GAAAACTGAA AATAAATAAA CTAACCATAT TAAATTTAGA ACAACACTTC AATTATTTTT TTAATTTGAT TAATTAAAAA ATTATTTGAT TAAATTTTTT AAAAGATCGT TGTTTCTTCT TCATCATGCT GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC ACATAAGCTT TGGTTTTCTC ACTCTCCAAG CCCTCTATAT AAACAAATÅT TGGAGTGAAG TTGTTGCATA ACTTGCATCG AACAATTAAT AGAAATAACA GAAAATTAAA 25 AAAGAAATAT G.

17. DNA-fragment ifølge krav 15, kendetegnet ved, at det er indentisk med, afledt af eller indeholder 5'-flanke- 30 rende regioner af Lbcl-genet med sekvensen: 35 DK 162900 B 32 TTCTCTTAAT ACAATGGAGT TTTTGTTGAA CATACATACA TTTAAAAAAA AATCTCTAGT GTCTATTTAC CCGGTGAGAA GCCTTCTCGT GTTTTACACA CTTTAATATT ATTATATCCT CAACCCCACA AAAAAGAATA CTGTTATATC TTTCCAAACC TGTAGATTTA TTTATTTATT TATTTATTTT TACAAAGGAG ACTTCAGAAA AGTAATTACA TAAAGATAGT GAACATCATT TTATTTATTA TAATAAACTT TAAAATCAAA CTTTTTTATA TTTTTTGTTA CCCTTTTCAT 5 TATTGGGTGA AATCTCATAG TGAAGCCATT AAATAATTTG GGCTCAAGTT TTATTAGTAA AGTCTGCATG AAATTTAACT TAACAATAGA GAGAGTTTTC GAAAGGGAGC GAATGTTAAA AAGTGTGATA TTATATTTTA TTTCGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA CATACAAAAA AATACTTTTA AATTCAGAAT AATACTTAAA ATATTTATTT GCTTAATTGA TTAACTGAAA ATTATTTGAT ·. TAGGATTTTG AAAAGATCAT TGGCTCTTCG TCATGCCGAT TGACACCCTC CACAAGCCAA GAGAAACTTA AGTTGTAAAC TTTCTCACTC CAAGCCTTCT ATATAAACAT GTATTGGATG TGAAGTTATT GCATAACTTG CATTGAACAA 10 TAGAAAATAA CAAAAAAAAG TAAAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG.

18. DNA-fragment ifølge krav 15, kendetegnet ved, at det er indentisk med, afledt af eller indeholder 5'-flanke-rende regioner fra Lbc2-genet med sekvensen: 15 TCGAGTTTTT ACTGAACATA CATTTATTAA AAAAAACTCT CTAGTGTCCA TTTATTCGGC GAGAAGCCTT CTCGTGCTTT ACACACTTTA ATATTATTAT ATCCCCACCC CCACCAAAAA AAAAAAAACT GTTATATCTT TCCAGTACAT TTATTTCTTA TTTTTACAAA GGAAACTTCA CGAAAGTAAT TACAAAAAAG ATAGTGAACA TCATTTTTTT AGTTAAGATG AATTTTAAAA TCACACTTTT TTATATTTTT TTGTTACCCT TTTCATTATT GGGTGAAATC TCATAGTGAA

19. DNA-fragment ifølge krav 15, kendetegnet ved, at det er identisk med, afledt af eller indeholder 5'-flanke-30 rende regioner fra Lbc3-genet med sekvensen: 35 DK 162900 B 33 TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT GTAGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA 5 CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA 10 TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA CAGAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG.

20. Rekombineret DNA-sekvens til brug ved fremgangsmåden ifølge krav 1 - 12, kendetegnet ved, at det omfatter det gen, der ønskes udtrykt, samt et DNA-fragment ifølge et 15 hvilket som helst af kravene 13 - 19.

20 ACTATTAAAT AGTTTGGGCT CAAGTTTTAT TAGTAAAGTC TGCATGAAAT TTAACTTAAT AATAGAGAGA GTTTTGGAAA GGTAACGAAT GTTAGAAAGT GTGATATTAT TATAGTTTTA TTTAGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA TTGACAATTT ATTTTTAAAA TTCAGAGTAA TACTTAAATT.ACTTATTTAC TTTAAGATTT TGAAAAGATC ATTTGGCTCT TCATCATGCC GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGÅAAC TTAAGTTGTA ATTTTTCTAA CTCCAAGCCT TCTATATAAA CACGTATTGG ATGTGAAGTT GTTGCATAAC TTGCATTGAA

25 CAATAGAAAT AACAACAAAG AAAATAAGTG AAAAAAGAAA TATG.

20 TCTTTTATTT TTATAAAAAA GACTTTATTT TTTTAAAAAA AATAAAGTGA ATTTTGAAAA CATGCTCTTT GACAATTTTC TGTTTCCTTT TTCATCATTG GGTTAAATCT CATAGTGCCT CTATTCAATA ATTTGGGCTC AATTTAATTA GTAGAGTCTA CATAAAATTT ACCTTAATAG TAGAGAATAG AGAGTCTTGG AAAGTTGGTT TTTCTCGAGG AAGAAAGGAA ATGTTAAAAA CTGTGATATT TTTTTTTTGG ATTAATAGTT ATGTTTATAT GAAAACTGAA AATAAATAAA CTAACCATAT TAAATTTAGA ACAACACTTC AATTATTTTT TTAATTTGAT

25 TAATTAAAAA ATTATTTGAT TAAATTTTTT AAAAGATCGT TGTTTCTTCT TCATCATGCT GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC ACATAAGCTT TGGTTTTCTC ACTCTCCAAG CCCTCTATAT AAACAAATAT TGGAGTGAAG TTGTTGCATA ACTTGCATCG AACAATTAAT AGAAATAACA GAAAATTAAA AAAGAAATAT G.

21. Plasmid til brug ved fremgangsmåden ifølge krav 1, til fremstilling af chloramphenicol-acetyl-transferase (CAT), kendetegnet ved, at det har betegnelsen YEP Lb CAT 20 og foruden CAT-genet indeholder en promotorsekvens og en ledersekvens i et DNA-fragment indeholdende en 51-flankerende region fra sojabønneleghæmoglobingenet Lbc3 og er fremstillet som beskrevet i eksempel 2 i beskrivelsen.

22. Plasmid til brug ved fremgangsmåden ifølge krav 1 til fremstilling af neomycinphosphotransferase (NPT) II, kendetegnet ved, at det har betegnelsen YEP 5 Lb Km og foruden NPT Il-genet indeholder en promotorsekvens og en ledersekvens i et DNA-fragment indeholdende en 51-flankerende 30 region fra sojabønneleghæmoglobingenet Lbc3 og er fremstillet som beskrevet i eksempel 3 i beskrivelsen. 35