NO175103B - Fremgangsmåte for ekspresjon av gener i gjær, samt DNA-fragmenter og plasmider som omfatter DNA-fragmentene, for anvendelse ved utövelsen av fremgangsmåten - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører en ny fremgangsmåte for ekspresjon av gener i gjær, samt DNA-fragmenter og plasmider som . omfatter DNA-fragmentene, for anvendelse ved utøvelsen av fremgangsmåten.

I beskrivelsen er blant annet de følgende uttrykk brukt: Promoterområde: Et DNA-fragment som inneholder en promoter og målsekvenser for RNA-polymerase, samt eventuelle aktiveringsområder som omfatter målsekvenser for transkrip-sjonseffektorstoffer.

Effektorstoff: Stoffer som utøver eller formidler en regulerende funksjon. Således omfatter effektorstoffene også stoffer som påvirker konsentrasjonen av stoffer som utøver eller formidler en regulerende funksjon.

Ledersekvens: Generelt en DNA-sekvens som transkriberes til en mRNA, men som ikke translateres videre til protein. Ledersekvensen omfatter således DNA-fragmentet fra transkrip-sjonsstarten til ATG-kodonet for translasjonsstart.

Ledersekvens: I forbindelse med foreliggende oppfinnelse/et kort DNA-fragment som vanligvis har 40-70 basepar og omfatter målsekvenser for en posttranskripsjonell regulering utøvd eller formidlet av intracellulært hem.

Dessuten anvendes følgende uttrykk som er alminnelig

kjent for fagfolk innen molekylærbiologi.

CAP-addisjonspunkt: Det sted hvor 7-methyl-GTP adderes

til den tilsvarende mRNA.

DNA-sekvens eller DNA-segment: En rettkjedet rekke av nukleotider som er bundet sammen med hverandre gjennom fosfor-diesterbindinger mellom 3'- og 5<1->carbonatomene i nabopen-toser.

Ekspresjon: Den prosess som et strukturelt gen gjennom-går for å fremstille et polypeptid. Den er en kombinasjon av transkripsjon og translasjon, samt eventuelle posttransla-sjonelle modifikasjoner.

Flankeområder: DNA-sekvenser som omkranser kodeområder. 5<1->flankerende områder inneholder en promoter. 3<1->flankerende områder kan inneholde transkripsjonsterminatorsignaler etc.

Gen: En DNA-sekvens som består av 3 eller 4 deler,

(1) den kodende sekvensen for genproduktet, (2) sekvensene i promoterområdet som bestemmer hvorvidt genet vil bli uttrykt, (3) de sekvenser i 3'-enden som betinger transkripsjonster-mineringen og eventuelt polyadenyleringen, samt eventuelt

(4) mellomliggende sekvenser.

Mellomliggende sekvenser: DNA-sekvenser i et gen som ikke koder for noe peptidfragment. De ellomliggende sekvenser transkriberes til pre-mRNA og fjernes ved omdannelse av pre-mRNA til mRNA.

Kloning: Fremgangsmåte for oppnåelse av en populasjon av organismer eller DNA-sekvenser som fåes fra en slik organisme eller sekvens ved aseksuell reproduksjon, eller nærmere bestemt: fremgangsmåte for isolering av en bestemt organisme eller del derav, og oppformeringen av denne underfraksjon som en homogen populasjon.

Kodende sekvens: DNA-sekvens som bestemmer et polypeptids aminosyresekvens.

Budbringer-RNA (mRNA): RNA-molekyl fremstilt ved transkripsjon av et gen og eventuell omdannelse av pre-mRNA. mRNA-molekylet formidler det genetiske budskap som bestemmer et polypeptids aminosyresekvens ved at en del av mRNA-molekylet translateres til peptidet.

Nukleotid: En monomer enhet av DNA eller RNA bestående av en sukkerdel (pentose), fosfat og en nitrogenholdig hetero-cyklisk base. Basen er bundet til sukkerdelen via en gluco-sidbinding (l'-carbon i pentosen), og denne kombinasjon av base og sukker er et nukleosid. Basen karakteriserer nukleo-tidet. De fire DNA-basene er adenin (A), guanin (G), cytosin (C) og thymin (T). De fire RNA-basene er A, G, C og urasil (U). Plasmid: En ekstrakromosomal, dobbelt-kjedet DNA-sekvens som omfatter et intakt replikon, slik at plasmidet replikeres i en vertcelle. Når plasmidet plasseres i en én-cellet organisme, endres eller transformeres organismens egenskaper som et resultat av plasmidets DNA. F.eks. transformeres et plasmid som bærer genet for tetracyklinresistens (Tc ), en celle som tidligere var sensitiv overfor tetra-cyklin, til en celle som er resistent overfor det. En celle som er transformert ved hjelp av et plasmid kalles en transformant.

Polypeptid: En rettkjedet serie av aminosyrer som er bundet sammen ved hjelp av peptidbindinger mellom cc-amino-

og carboxygrupper i naboaminosyrer.

Rekombinasjon: Dannelsen av et nytt DNA-molekyl ved kombinasjon av DNA-fragmenter av forskjellig opprinnelse.

Replikasjon: En fremgangsmåte som reproduserer DNA-molekyler.

Replikon: Et selvreplikerende genetisk element med et punkt for initieringen av DNA-replikasjon og gener som bestemmer de funksjoner som er nødvendige for å styre replika-sjonen.

Restriksjonsfragment: Et DNA-fragment som skriver seg fra dobbeltkjedet spalting ved hjelp av et enzym som gjen-kjenner en bestemt mål-DNA-sekvens.

RNA-polymerase: Enzym som bevirker transkripsjonen

av DNA til RNA.

Transformasjon: Fremgangsmåten hvorved en celle tar opp et plasmid.

Translasjon: Fremgangsmåten for fremstilling av et polypeptid ut fra mRNA, eller: fremgangsmåten hvorved den genetiske informasjon som er tilstede i et mRNA-molekyl, styrer rekkefølgen av bestemte aminosyrer under syntesen av et polypeptid.

Transkripsjon: Fremgangsmåten for syntetisering av en komplementær RNA-sekvens ut fra en DNA-sekvens.

Vektor: Et plasmid, fag-DNA eller andre DNA-sekvenser som er i stand til å replikere i en vertcelle, og som har ett eller et lite antall endonukleasegjenkjenningspunkter hvor DNA-sekvenser kan spaltes på en måte som lar seg bestemme, uten ledsagende tap av en vesentlig biologisk funksjon av DNA-et, f.eks. replikasjon, produksjon av kappeproteiner eller tap av promoter eller bindingspunkter, og som inneholder en markør som er egnet for bruk ved identifikasjonen av transformerte celler i form av f.eks. tetracyklinresistens eller ampicillinresistens. En vektor kalles ofte for en klonings-bærer.

Fremstillingen av et biologisk aktivt produkt ved hjelp av rekombinant DNA-teknikk er en kompleks affære som omfatter mange fremgangsmåtetrinn, fra initieringen av transkripsjonen til den endelige oppnåelse av det biologiske aktive molekyl.

Mange av disse fremgangsmåtetrinn forekommer ikke i prokaryote organismer og dette er grunnen til at eukaryote produksjonsorganismer må brukes i mange tilfeller.

Gjær er en eukaryot organisme med et synteseapparat som omfatter mange av fremgangsmåtene og reguleringsmekanismene som er karakteristiske for høyere organismer. I tillegg har gjærceller en kort generasjonstid og det foreligger et tusen-årig erfaringsgrunnlag for bruken av gjær som kulturorganisme.

Helt avgjørende faktorer for en biologisk syntese av et ønsket genprodukt er en mulighet for og en forbedring av transkripsjonsinitiering samt transkripsjonen og post-tran-skripsjonell regulering av genekspresjonen.

Disse funksjonene utføres hovedsakelig ved hjelp av 5<1->flankerende områder. En lang rekke 5'-flankerende områder fra prokaryote og eukaryote gener er blitt sekvensbestemt, og blant annet på bakgrunn av dette er det tilveiebragt en omfattende viten vedrørende reguleringen av genekspresjon og om hvilke underområder og sekvenser som er av betydning for reguleringen av genets ekspresjon. Det er store forskjeller for reguleringsmekanismen i prokaryote og eukaryote organismer, men innenfor disse to gruppene er det mange felles trekk.

Reguleringen av genekspresjonen kan finne sted på transkripsjonsnivå og der skjer det fortrinnsvis ved regulering av transkripsjonens initieringssekvens. Denne er velkjent og beskrevet blant annet av Benjamin Lewin, Gene Expression, John Wiley & Sons, vol. I, 1974, vol. II, andre utgave 1980, vol. III, 1977. Alternativt kan reguleringen skje på det post-transkripsjonelle nivåff.eks. regulering av frekvensen for translasjonsinitieringen, av translasjonshastigheten samt av translasjonstermineringen.

Leghemoglobiner er monomere hemoproteiner som utelukkende syntetiseres i de rotknollene som utvikles ved den symbiotiske forbindelse mellom Rhizobia og belgplanter. Et logisk emne som et effektorstoff som aktiverer leghemoglobingenene, er hem produsert i Rhizobia og som utgjør den prostetiske gruppe i leghemoglobinene. Syntesen av flere hemoproteiner i gjæren Saccharomyces cerevisiae reguleres også ved hjelp av nivået av intracellulært hem, som også utgjør den prostetiske gruppe i disse proteinene. Således er transkripsjonen av isocytokrom c-genet avhengig av hem, mens hem-kontrollen i tilfellet med katalase T1utføres både på transkripsjons- og post-transkripsjonsnivået.

I henhold til foreliggende oppfinnelse angis sekvensen til 5'-flankerende områder hos de fire soyabønneleghemoglobin-genene Lba, Lbcl, Lbc2 og Lbc3. Sekvensene er angitt i det vedlagte sekvensskjema, skjema 1, hvor sekvensene er stilt opp på en slik måte at homologien tydelig fremgår.

I sekvensskjemaet betyr "-" at det ikke er noen- base tilstede i den angjeldende posisjon. Genenes navn og base-posisjonen telt oppstrøms fra .ATG-startkodonet er angitt til høyre i sekvensskjemaet. Videre er de viktige sekvenser under-streket.

Som det fremgår av sekvensskjemaet, foreligger det en klar homologigrad mellom de fire 5'-flankerende områder, og i posisjonen 23-24 basepar oppstrøms fra CAP-addisjonspunktet inneholder de alle en TATATAAA-sekvens svarende til "TATA"-boksen som i eukaryote celler vanligvis befinner seg et tilsvarende antall basepar oppstrøms fra CAP-addisjonspunktet. Videre er en CCAAG-sekvens tilstede 64-72 basepar oppstrøms fra CAP-addisjonspunktet idet denne sekvens svarer til "CCAAT"-boksen som vanligvis befinner seg 70-90 basepar opp-strøms fra CAP-addisjonspunktet. Fra CAP-addisjonspunktet og til translasjonsstartkodonet, ATG, finnes det ledersekvenser med 52-59 basepar som oppviser en klar grad av homologi på omtrent 75-80%.

I henhold til foreliggende oppfinnelse er det dessuten blitt påvist, eksemplifisert ved Lbc3, at de 5'-flankerende områder fra soyabønneleghemoglobingenene er funk-sjonelt aktive i gjær. Dette er blitt påvist ved å fusjonere genet for kloramfenicol-acetyl-transferase (CAT) fra E. coli med de 5'- og 3<1->flankerende områder fra soyabønne-Lbc3-genet på en slik måte at ekspresjonen av CAT-genet kontrolleres av Lb-promoteren. Fusjonsfragmentet ble innført i gjær- plasmidvektoren YEP 24 som inneholder gjær-URA-3-genet som en selekterbar markør. Gjærstammen S. cerevisiae TMl som er URA-3 og ute av stand til å syntetisere hem på grunn av en mutasjon i ^-aminolevulinsyre-synthetase-genet, Æ<*->ALA, ble deretter transformert med den resulterende konstruksjon. De transformerte gjærceller oppviste en CAT-aktivitet under alle vekstbetingelser som ble testet. Det kan derfor konkluderes med at de 5<1->flankerende områder fra soyabønnehemoglo-bingener er funksjonelle i gjær.

I henhold til foreliggende oppfinnelse er det dessuten blitt vist at de 5<1->flankerende områder virker som mål for en regulering som utøves eller formidles av intracellulært hem. CAT-aktiviteten er således 20-40 ganger større i gjæren S. cerevisiae TMlfdyrket i nærvær av £ -ALA, enn CAT-aktiviteten i gjær dyrket uten denne hemforløper i vekstmediet. Lignende høye CAT-aktiviteter var tilstede i gjæren S. cerevisiae TMl dyrket i nærvær av hem, protoporfyrin IX, eller hemanalogen deuteroporfyrin IX. Virkningen av hem på CAT-aktiviten er spesifikk ettersom mengden av URA-3-genproduktet forblir konstant under alle de testede betingelser. Videre endrer transkripsjonsnivået seg tilsynelatende ikke på grunn av nærværet av hem ettersom CAT-mRNA-nivået forblir konstant"uavhengig av endringer i den intracellulære hemkonsentrasjon. Det kan derfor konkluderes med at reguleringsmekansimen som utøves eller formidles av hemet, opptrer på det post-transkripsjonelle nivå.

Den iakttatte økning av CAT-aktivitet er avhengig av proteinsyntese. Dessuten er halveringstiden for CAT-enzymet uavhengig av tilstedeværelsen av hem, og in vitro CAT-aktivitet stimuleres ikke av hem. Det er derfor sannsynlig at hem regulerer genekspresjonen på translasjonsnivået. Fusjo-nering av det 5<1->flankerende område fra Lbc3 med kodende områder fra genet for neomycinfosfotranferase (NEO) kontrolleres av hem på en fullstendig tilsvarende måte som CAT-genet som er fusjonert med et 5<1->flankerende område fra Lbc3-genet. Virkningen av hem formidles således ikke ved at hem virker inn på den kodende sekvens, men heller ved at hem virker inn på de 5'- eller 3'-flankerende Lbc3-sekvenser som er tilstede i CATmRNA. Ekspresjon av et gen som bare inneholder det 5'-flankerende Lbc3-område og neogenet, kontrolleres på en tilsvarende måte av hem. Virkningen av intracellulært hem på genekspresjonen kan således formidles ved hjelp av en innvirkning på ledersekvensen.

De korte ledersekvenser inneholder ikke translasjons-startkodoner. Den reguleringsmekanisme som utøves eller formidles ved hjelp av intracellulært hem, er derfor ikke be-slektet med reguleringsmekanismer som omfatter falske start-kodoner, jfr. det som er beskrevet av Hunt, T, Nature, vol. 316, 580-581 (1985). Den reguleringsmekanisme som er beskrevet i forbindelse med foreliggende oppfinnelse, utøves eller formidles ved hjelp av heminnvirkning på en ledersekvens, og er derfor en hittil ukjent reguleringsmekanisme.

Tilstedeværelsen av plasmider i en celle som befinner seg i et naturlig miljø, gir cellen en egenskap som er for-delaktig for cellen bare under visse omstendigheter. Plasmidkodede egenskaper kan f.eks. være resistent mot et antibio-tikum som er tilstede i det omgivende miljø. Tilstedeværelsen av et plasmid og syntese av de plasmidkodede genprodukter belaster imidlertid også cellens energimetabolisme og proteinsynteseapparatet, og en celle som inneholder et plasmid, vil derfor utkonkurreres og gå til grunne i et miljø hvor det ikke er behov for de plasmidkodede egenskaper.

Den ovenfor nevnte ustabilitet økes ytterligere ved

å bruke plasmider som vektorer for syntese av et ønsket genprodukt som ikke vanligvis produseres av den aktuelle celle. Dette medfører at celler som syntetiserer slike produkter,

må utsettes for et seleksjonstrykk for å sikre at det ønskede genprodukt fortsatt kan bli syntetisert. Den metode som hittil har vært brukt for å oppnå høy ekspresjon av et bestemt genprodukt, er at ekspresjonen styres av en sterk promoter som forårsaker at en høy konsentrasjon av mRNA translateres til det aktuelle genprodukt.

En høy konsentrasjon av genprodukt kan imidlertid også oppnåes ved en mer effektiv translasjon av den aktuelle mRNA. Dette medfører at genproduktsyntesen styres både på transkripsjons- og translasjonsnivået, noe som betyr at den genetiske belastning på en celle som syntetiserer et bestemt genprodukt, kan fordeles på to funksjoner i stedet for som normalt på en.

De to funksjonene kan derfor manipuleres på en slik måte at det samme resultat vedrørende konsentrasjon av genproduktet kan oppnåes selv om promoteren ikke er så sterk som promoterne som vanligvis anvendes. En slik fordeling av de to funksjonene medfører at cellen ikke er så genetisk belastet som når genproduktsyntesen bare styres ved hjelp av én sterk promoter. Som et resultat av dette, kan seleksjonstrykket på den aktuelle celle reduseres.

Det er videre av betydning å oppnå den for cellen mest rasjonelle utnyttelse av energimetabolismen og av proteinsynteseapparatet i den fase hvor syntesen av det ønskede genprodukt finner sted. En slik rasjonell utnyttelse av energimetabolismen og av proteinsynteseapparatet forbedres fortrinnsvis ved å optimere de sene trinnene i syntesen av et genprodukt fremfor å optimere de tidlige trinnene.

De viktige trekk ved et genekspresjonssystem er derfor at ekspresjonen av det ønskede produkt kan økes fra en i begynnelsen lav ekspresjon til en overproduksjon ved hjelp av en manipulering av cellens ytre miljø, slik som åpenbaret ved hjelp av foreliggende oppfinnelse. Videre er det mer for-delaktig med en induserbar optimering av de post-transkripsjonelle syntestrinn, som er blitt åpenbaret ved hjelp av foreliggende oppfinnelse, enn en indusert optimering av transkripsjonen.

Ved tidligere kjente metoder for ekspresjon av gener

i gjær anvendes det en rekke promoterer og ekspresjonsvektorer, jfr. f.eks. EP 120 551 A2, hvor bruken av GAPDH- eller PyK-gjær-promotere er beskrevet, samt ekspresjonsvektorer omfattende disse promoterer.

I GB 2 137 208A beskrives videre bruken av promoteren GALI i flere ekspresjonsvektorer.

Når disse tidligere kjente promoterer brukes, kan ekspresjonen økes bare ved å øke transkripsjonsinitierings-frekvensen. Bruken av disse promoterer medfører følgelig en høy genetisk belastning på cellen, en irrasjonell utnyttelse av energimetabolismen og synteseapparatet, samt en derav følgende ustabilitet som nødvendiggjør et høyt seleksjonstrykk på vertsorganismen når disse promoterer brukes.

Formålet ved foreliggende oppfinnelse er derfor å

angi en fremgangsmåte for anvendelse av promoterer som er aktive i gjær, samt ledersekvenser som på en hittil ukjent måte gjør ekspresjonen av det etterfølgende gen til gjenstand for en regulering på det post-transkripsjonelle nivå. Ytterligere formål ved oppfinnelsen er å tilveiebringe kombina-sjoner av promoteren og ledersekvensen, hvor disse kombina-sjoner er tilveiebragt fra 5'-flankerende områder av plante-leghemoglobingener og har vist seg å være funksjonelle i gjær, likeledes som det er formål ved oppfinnelsen å tilveiebringe plasmider som omfatter den ovenfor nevnte kombinasjon av promoter- og ledersekvenser.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse for ekspresjon av gener i gjær ved at det i en gjærcelle innføres et rekombinant DNA-segment som inneholder både genet som skal uttrykkes og et 5'-flankerende område omfattende en promotersekvens, og at de transformerte gjærceller dyrkes i et egnet dyrkningsmedium, er kjennetegnet ved at det anvendes et 5'-flankerende område fra et planteleghemoglobingen, som omfatter et første DNA-fragment inneholdende promotersekvensen og et andre DNA-fragment som inneholder en ledersekvens, som på posttransskripsjonsnivået reguleres av hem, hemanaloger, hem-forløpere eller hembyggestener, og at den intracellulære konsentrasjon av hem økes ved at det tilsettes slike carbonkilder til vekstmediet som gir en økt intracellulær konsentrasjon av hem. På denne måte er det mulig ved innføring av et gen ned-strøms for kombinasjonen og i en egnet vektor som kan replikere i gjær, å oppnå syntese av et biologisk aktivt produkt. Ved denne fremgangsmåte er det mulig å øke ekspresjonen av et ønsket gen ved hjelp av en hittil ukjent reguleringsmekanisme som virker på posttranskripsjonsnivået. Som et særlig resultat oppnåes det en redusert genetisk belastning på vertcellen og en optimal utnyttelse av proteinsynteseapparatet og energimetabolismen hos vertcellen, og følgelig en økt stabilitet for ekspresjonsvektoren i vertcellen.

En bestemt utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved at det som det første DNA-fragment anvendes et DNA-fragment isolert fra en bakterie, DNA som er syntetisert in vltro ut fra plantens DNA, eller et kjemisk syntetisert DNA-molekyl, som inneholder en promotersekvens, for kombinasjon med det andre DNA-fragment. En annen bestemt utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved at det som det andre DNA-fragment anvendes et DNA-fragment som er isolert fra en bakterie, DNA som er syntetisert in vltro ut fra plantens DNA, eller et kjemisk syntetisert DNA-molekyl, som inneholder en ledersekvens, for kombinasjon med det første DNA-fragment. På denne måte er det mulig å kombinere enhver ledersekvens fra gjær, planter eller dyr som under naturlige forhold er gjenstand for en post-transkripsjonsregulering ifølge krav 1, med enhver egnet gjær-promoter, plantepromoter eller en annen promoter som er funksjonell i gjær.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen økes den intracellulære konsentrasjon av hem ved at det til vekstmediet tilsettes slike carbonkilder, særlig ikke-fermenterbare carbonkilder, som forårsaker økte intracellulære konsentrasjoner av hem. På denne måte oppnåes en induksjon av ekspresjon av det ønskede gen ved å tilsette en carbonkilde til vekstmediet. Eksempler på slike carbonkilder er glycerol og succinat som er særlig foretrukne fordi de er billige og lett tilgjengelige carbonkilder. Videre kan ethanol brukes. Under visse betingelser kan gjæren selv produsere denne ethanol mens den vokser. Etter avslutning av veksten utnyttes ethanolen slik at trans-lasjonen økes.

Ifølge en spesiell utførelsesform kan den samme effekt oppnåes ved at den intracellulære konsentrasjon av hem økes ved å tilsette ett eller flere stoffer valgt fra gruppen bestående av hem, hemanaloger, hemforløpere og hembyggestener til vekstmediet.

Et eksempel på en hemanalog er deuteroporfyrin IX, og et eksempel på en hembyggesten er 6-aminolevulinsyre.

Ved en spesiell utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendes et DNA-fragment som omfatter en pro motersekvens og en ledersekvens, hvor DNA-fragmentet er identisk med, avledet fra eller omfatter 5'-flankerende områder fra soyabønneleghemoglobingener. På denne måte oppnåes det en enkel adgang til en kombinasjon av ledersekvens og promotersekvens, og denne kombinasjon er ifølge foreliggende oppfinnelse påvist å være funksjonell i gjær. Eksempler på slike DNA-fragmenter er de fire 5'-flankerende områder fra soya-bønneleghemoglobingenene, nemlig Lba med sekvensen:

Lbc2 med sekvensen:

TCGAGTTTTT ACTGAACATA CATTTATTAA AAAAAACTCT CTAGTGTCCA TTTATTCGGC GAGAAGCCTT CTCGTGCTTT ACACACTTTA ATATTATTAT ATCCCCACCC CCACCAAAAA AAAAAAAACT GTTATATCTT TCCAGTACAT TTATTTCTTA TTTTTACAAA GGAAACTTCA CGAAAGTAAT TACAAAAAAG ATAGTGAACA TCATTTTTTT AGTTAAGATG AATTTTAAAA TCACACTTTT TTATATTTTT TTGTTACCCT TTTCATTATT GGGTGAAATC TCATAGTGAA ACTATTAAAT AGTTTGGGCT CAAGTTTTAT TAGTAAAGTC TGCATGAAAT TTAACTTAAT AATAGAGAGA GTTTTGGAAA GGTAACGAAT GTTAGAAAGT GTGATATTAT TATAGTTTTA TTTAGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA TTGACAATTT ATTTTTAAAA TTCAGAGTAA TACTTAAATT ACTTATTTAC TTTAAGATTT TGAAAAGATC ATTTGGCTCT TCATCATGCC GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC TTAAGTTGTA ATTTTTCTAA CTCCAAGCCT TC TATATAAA CACGTATTGG ATGTGAAGTT GTTGCATAAC TTGCATTGAA CAATAGAAAT AACAACAAAG AAAATAAGTG AAAAAAGAAA TATG,

og Lbc3 med sekvensen:

TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT GTAGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTC TATA TAAATAAGTA TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA CAGAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG.

Nok en ytterligere utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen angir en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid ved ekspresjon av gjærceller som inneholder et rekombinant DNA-segment som omfatter både et gen som koder for polypeptidet, og et 5'-flankerende område som inneholder en promotersekvens, ved dyrkning i et egnet dyrkningsmedium, kjennetegnet ved at det anvendes et 5'-flankerende område fra et planteleghemoglobingen, som omfatter et første DNA-fragment inneholdende promotersekvensen og et andre DNA-fragment inne holdende en ledersekvens, idet ledersekvensen på posttran-skripsj-onsnivå reguleres av hem, hemanaloger, hemf or stadier eller hembyggestener, og at den intracellulære konsentrasjon av hem økes ved at det til dyrkningsmediet tilsettes slike carbonkilder som gir en økt intracellulær konsentrasjon av hem.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre et DNA-fragment for anvendelse i et rekombinant DNA-segment ved utøvelse av fremgangsmåten ifølge kravene 1-12, som er kjennetegnet ved at det omfatter et første DNA-fragment som inneholder en promotersekvens, og et andre DNA-fragment som inneholder en ledersekvens som på posttranskripsjonsnivå reguleres av hem, hemanaloger, hemforstadier eller hembyggestener, og er identisk med, avledet fra eller inneholder et 5'-flankerende område fra et planteleghemoglobingen. Videre vedrører oppfinnelsen et DNA-fragment ifølge krav 13, som inneholder en leder-sekvens for anvendelse ved utøvelse av fremgangsmåten ifølge kravene 1-6, hvor dette fragmentet er kjennetegnet ved at det er et kort DNA-fragment som transkriberes til en mRNA-tråd, som er mål for en regulering som utøves eller formidles av intracellulært hem.

Oppfinnelsen vedrører videre en rekombinant DNA-sekvens for anvendelse ved fremgangsmåten ifølge kravene 1-12, som er kjennetegnet ved at den omfatter det gen som ønskes uttrykt, samt et DNA-fragment ifølge hvilket som helst av kravene 13-14.

I tillegg vedrører oppfinnelsen et plasmid for anvendelse ved fremgangsmåten ifølge krav 1 for fremstilling av kloramfenikol-acetyltransferase (CAT), som er kjennetegnet ved at det har betegnelsen YEP Lb CAT og inneholder i tillegg til CAT-genet en promotersekvens og en ledersekvens i et DNA-fragment som inneholder et 5<1->flankerende område fra soyabønneleg-hemoglobingenet Lbc3, og er vist i skjema 6. Endelig vedrører oppfinnelsen et plasmid for anvendelse ved fremgangsmåten ifølge krav 1 for fremstilling av neomycinfosfotransferase (NPT) II, som er kjennetegnet ved at det har betegnelsen YEP 5 Lb Km og inneholder i tillegg til NPT II-genet en promotersekvens og en ledersekvens i et DNA-fragment som inneholder et 5'-flankerende område fra soyabønneleghemoglobingenet Lbc3, og er vist i skjema 8. Plasmidene ifølge oppfinnelsen muliggjør en høy ekspresjon av et ønsket genprodukt ved innføring av kodende sekvenser for disse genproduktene.

Eksempel 1

Sekvensbestemmelse av 5'- flankerende områder fra soyabønne-leghemoglobingener

Fra en soyabønne- (glycin max. var. Evans) genbank ble de fire soyabønneleghemoglobingenene Lba, Lbcl, Lbc2 og Lbc3 tilveiebragt som beskrevet av Jensen, E.Ø. et al., Nature, vol. 291. nr. 3817, 677-679 (1981). De 5'-flankerende områder fra de fire soyabønneleghemoglobingenene ble isolert som beskrevet av Jensen, E.Ø., Ph D Thesis, Institut for Molekylær Biologi, Århus Universitet (1985) og sekvensene til de fire 5<1->flankerende områder ble bestemt ved anvendelse av dideoxy -kjedetermineringsmetoden som beskrevet av Sanger,

F., J. Mol. Bio. 143, 161 (1981) og angitt i sekvensskjemaet.

Eksempel 2

Konstruksjon av YEP- Lb- CAT

Konstruksjonen ble utført i en rekke delprosesser som beskrevet nedenunder:

Sub- kloning av Lbc3- genet

Lbc3-genet ble isolert på et 12kb EcoRI-restriksjonsfragment fra en soyabønne-DNA-bank, som er blitt beskrevet av Wiborg et al., i Nucl. Acids Res. 10, 3487. Et utsnitt av fragmentet er vist øverst i skjema 2. Dette fragmentet ble oppløst ved hjelp av de angitte enzymer for deretter å bli ligert til pBR322 som vist i skjemaet. De resulterende plasmider Lbc3HH og Lbc3HX ble deretter oppløst med PvuII og religert, noe som resulterte i to plasmider betegnet pLpHH og pLpHX.

Sub- kloning av 5'- flankerende sekvenser fra Lbc3- genet

For dette formål ble pLpHH brukt som vist i skjema 3. Dette plasmid ble åpnet ved hjelp av PvuII og behandlet med exonuklease Bal31. Denne reaksjonen ble stanset på forskjel-lige tidspunkter og de avkortede plasmider ble ligert til fragmenter fra pBR322. Disse fragmentene var på forhånd blitt behandlet som vist i skjema 3 på en slik måte at de i én ende hadde en DNA-sekvens TTC

AAG

Etter ligeringen fant det sted en oppløsning med EcoRI og fragmentene som inneholdt 5'-flankerende sekvenser, ble ligert til EcoRI-oppløst pBR322. Disse plasmidene ble transformert til E« coli K803 og plasmidene i transformantene ble testet ved hjelp av sekvensanalyse. Et plasmid, p213 5'Lb, isolert fra en av transformantene inneholdt en 5'-flankerende sekvens som terminerte 7 basepar før Lb-ATG-startkodonet på en slik måte at sekvensen er som følger:

2 kb

-5'-flankerende AAAGTAGAATTCTAAAATG

Lbc3 sekvens

Sub- kloning av 3'- flankerende område fra Lbc3- genet

For dette formål ble det anvendt pLpHX som var blitt oppløst ved hjelp av XhoII. Endene ble delvis utfylt og overskudd DNA ble fjernet som vist i skjema 4. Det viste fragment ble ligert til pBR322 som var blitt forbehandlet som vist i skjemaet. Konstruksjonen ble transformert inn i E. coli K803. En av transformantene inneholdt et plasmid som ble betegnet Xho2a-3'Lb. Ettersom XhoII-gjenkjennelsessekvensen befinner seg umiddelbart etter Lb-stoppkodonet, jfr. skjema 2, inneholdt plasmidet ca. 900 basepar av det 3<1->flankerende område, og sekvensen startet med GAATTCTACAA Konstruksjon av Lb- promoterkasett

Et EcoRI/Sphl-fragment fra Xho2a-3<*>Lb ble blandet med et BamHI/EcoRI-fragment fra p 213-5'Lb. Disse to fragmentene ble ligert via BamHI/Sphl-spaltingspunktene til et pBR322-derivat hvor EcoRI-gjenkjenningssekvensen var fjernet, jfr. skjema 4. De ligerte plasmider ble transformert inn i E. coli K803. Et plasmid i en av transformantene inneholdt de korrekte fragmenter og den ble betegnet pEJLb 5'-3'-l'-.

Konstruksjon av kimærisk Lb/ CAT- gen

CAT-genet fra pBR322 ble isolert på flere mindre re-striksjonsfragmenter som vist i skjema 5. Det 5'-kodende om råde ble isolert på et Alul-fragment som deretter ble ligert til pBR322 og behandlet som angitt i skjemaet. Dette ble transformert inn i E. coli K803, og en utvalgt transformant inneholdt et plasmid som ble betegnet Alull. Det 3'-kodende område ble isolert på et Taql-fragment. Dette fragmentet ble behandlet med exonuklease Bal31, hvoretter EcoRI-koblere ble tilsatt. Deretter fulgte en oppløsning med EcoRI og en ligering til EcoRI-oppløst pBR322. Dette ble transformert inn i E. coli K803 og transformantene ble analysert. Et plasmid,Taq 12, inneholdt det 3<1->kodende område fra CAT-genet pluss 23 basepar 3<1->flankerende sekvenser for deretter å terminere i følgende sekvens CCCCGAATTC. Deretter ble følgende fragmenter ligert samlet til EcoRI-oppløst pEJLb5'-3<1->1': EcoRI/PvuII-fragment fra Alull, PvuII/Ddel-fragment fra pBR322 og Ddel/EcoRI-fragment fra Taq 12. Dette: ble transformert inn i E. Coli K803. En utvalgt transformant inneholdt det korrekte plasmid som ble betegnet pEJLb5'-3' CAT 15.

Kloning av kimærisk Lb/ CAT- gen i gjærplasmid

Dette kimæriske gen ble isolert på et BamHI/Sphl-fragment fra pEJLb 5'-3' CAT 15 og ligert til gjærplasmidet iYEP24 som var kuttet med de samme enzymer. Etter trans-formasjonen inn i E. coli K803 ble en utvalgt transformant undersøkt. Den inneholdt plasmidet YEP Lb CAT som er vist i skjema 6. Dette plasmid ble videretransformert inn i gjær-stammene Saccharomyces cerevisiae DBY747 og TMl.

Eksempel 3

Konstruksjon av YEP 5Lb Km

Neomycinfosfotransferase (NPTII) genet ble isolert fra pKM2 (Beck et al., Gene 19, 327). Det 5 *-kodende område fra dette gen ble isolert på et Sau3A-fragment som vist i skjema 7 og deretter ligert til pBR322, hvilket resulterte i et plasmid betegnet Saul3. Det 3'-kodende og flankerende område fra NPTII-genet ble isolert på et PvuII-fragment. Det sistnevnte ble sammen med et EcoRI/PvuII-fragment fra Saul3

ligert til EcoRI/PvuII-oppiøst pEJLb 5'-3'-1<1>. Etter trans-

'0.

formasjon inn i E. coli K803 ble en transformant med det korrekte plasmid, pEJLb 5<1>Km 1, valgt ut. Dette plasmid ble senere .oppløst;; ved hjelp av BamHI og partielt ved hjelp av PvuII på en slik måte at hele den 5'-flankerende Lb-se^- - kvens pluss den kodende NPTII-sekvens var tilstede på et BamHI/PvuII-fragment. Dette fragment ble ligert til BamHI/ PvuII-qppT.øst+- YEP24, hvilket resulterte i plasmidet YEP

5Lb Km som er vist i skjema 8. Dette plasmid ble transformert inn i gjærstammen Saccharomyces cerevisiae Tml.

Eksempel 4

Virkningen av carbonkilde på ekspresjon av CAT

Saccharomyces cerevisiae DBY747 som inneholdt plasmidet YEP Lb CAT, ble dyrket i minimalmedium pluss 2% av en carbonkilde. Cellene ble innhøstet ved en celletetthet på 5 x IO<6>celler pr. ml. CAT-aktiviteten ble målt som beskrevet av Walker, Edlund, Boulet&Rutter, Nature, 306, 557 (1983).

I tabell 1 er CAT-aktiviteten angitt som funksjon av carbonkilden. Den største aktivitet som ble erholdt ved dyrking på succinat eller glycerol, er tilfeldig satt til 100%.

Eksempel 5

Virkningen av hemforløpere og hemanaloger på induksjonen av genekspresjon

Saccharomyces cerevisiae TMl som inneholder plasmidet YEP Lb CAT, ble dyrket i et minimalmedium pluss 2% glukose pluss 0,1% Tween® pluss 20 ug/ml ergosterol pluss 50 ug/ml methionin, samt en av de følgende hemanaloger eller hemfor- løpere. Deuteroporfyrin IX (dp) henholdsvis protoporfyrin (pp) ble tilsatt til en endelig konsentrasjon på 5ug/ml. <f-amino-levulinsyre, 6"- ALA, ble tilsatt til en endelig konsentrasjon på 50 ug/ml.

I tabell 2 er CAT-aktiviteten angitt som aktiviteten av hemforløper henholdsvis hemanalog. Den høyeste aktivitet som ble oppnådd ved tilsetning av £- ALA eller dp, ble tilfeldig satt til 100%.

Eksempel 6

Innføring av koblere i ledersekvensen

To syntetiske DNA-koblere er blitt innført: en umiddelbart over startkodonet som inneholder gjenkjenningssekvensen til enzymet Bglll, og en oppstrøms for CAP-addisjonspunktet som inneholder gjenkjenningssekvensen for Kpnl, jfr. skjema 9 hvor den nye konstruksjonen pEJ5'-3'-CAT101 er sammenlignet med den opprinnelige konstruksjon.

En sammenligning av ekspresjonen fra de to konstruksjonene viser (test som i eksempel 5):

Tallene angir nmol kloramfenicol omsatt/mg protein/ minutt.

Dette viser at to spesifikke endringer i 5<1->området resulterer i et fall i heminduksjonen fra 55x ned til 8x.

Eksempel 7

Erstatning av Lbc3 5'- området med et tilsvarende område fra ILVl- genet fra S. cerevisiae

Hele Lbc3 5<1->området ble fjernet fra CAT101 ved kut-ting med BamHI og Bglll. I stedet ble et 7 65 basepar DNA-fragment fra ILVl-genet som inneholder promoter og leder-sekvens, innført. Denne konstruksjonen er betegnet PEJ CAT-BD.

I annen konstruksjon ble Lbc3-promoteren fjernet og etterlot ledersekvensen. Dette ble gjort ved å kutte CAT101 med BamHI og Kpnl. Dette fragmentet ble erstattet med et 67 0 basepar stort fragment fra ILVl, promoteren uten ledersekvensen. Dette plasmid er betegnet PEJ CAT-KN.

Konstruksjonene er illustrert skjematisk:

promoter leder-sekvens kodende sekvens

Sammenligningen av sekvenser er vist i skjema 10.

Ekspresjonstest

Samme enheter som tidligere tester.

Den eneste forskjell mellom de to konstruksjonene er opprinnelsespunktet for ledersekvensen. Resultatet viser at Lbc3-ledersekvensen er nødvendig for induksjon. Induksjons-nivået er imidlertid ikke så høyt som i CAT101, som er ut-gangsmaterialet, dette kan skyldes det faktum at konstruksjonen starter 13 nukleotider nærmere ATG, og således mangler mRNA 13 nukleotider som kan være viktige for induksjonen.

Alle disse testene viser klart at heminduksjon er knyttet til Lbc3-ledersekvensen.

Således anvendes det ved oppfinnelsen ikke utelukkende 5'-flankerende områder fra soyabønneleghemoglobingener. Det er velkjent at leghemoglobingenene i alle belgplanter har den samme funksjon, jfr. Appleby (1974) i The Biology of Nitrogen Fixation, Quispel. A. Ed. North-Holland Publishing Company, Amsterdam Oxford, sider 499 - 554, og dessuten er det blitt påvist for PvLbl-genet fra havebønne at det er en utstrakt grad av homologi med sekvensene til soyabønne-Lbc3. Oppfinnelsen omfatter således bruken av 5<1->flankerende områder fra leghemoglobingener fra alle planter.

Det er velkjent at det er mulig å endre nukleotid-sekvenser i ikke-vesentlige subområder av 5<1->flankerende områder uten at dette forårsaker en endret promoteraktivitet og regulerbarhet. Det er også velkjent at ved å endre sekvensene i vesentlige underområder av 5'-flankerende områder, er det mulig å endre bindingsaffiniteter mellom nukleotid-sekvenser og faktorene eller effektorstoffene som er nødven-dige for transkripsjonsinitieringen og translasjonsinitieringen, og følgelig at det er mulig å forbedre promoterakti-viteten og/eller regulerbarheten. Foreliggende oppfinnelse omfatter selvfølgelig også anvendelsen av slike endrede sekvenser fra 5<1->flankerende områder. Spesielt kan det nevnes anvendelsen av ledersekvenser som er blitt forlenget utover den naturlige lengde, forutsatt at bruken av slike fragmenter gjør ekspresjonen av et ønsket genprodukt til gjenstand for den hittil ukjente regulering ifølge foreliggende oppfinnelse .

Claims (17)

1. Fremgangsmåte for ekspresjon av gener i gjær ved at det i en gjærcelle innføres et rekombinant DNA-segment som inneholder både genet som skal uttrykkes og et 5'-flankerende område omfattende en promotersekvens, og at de transformerte gjærceller dyrkes i et egnet dyrkningsmedium,karakterisert vedat det anvendes et 5'-flankerende område fra et planteleghemoglobingen, som omfatter et første DNA-fragment inneholdende promotersekvensen og et andre DNA-fragment som inneholder en ledersekvens, som på posttransskripsjonsnivået reguleres av hem, hemanaloger, hem-forløpere eller hembyggestener, og at den intracellulære konsentrasjon av hem økes ved at det tilsettes slike carbonkilder til vekstmediet som gir en økt intracellulær konsentrasjon av hem.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat det som det første DNA-fragment anvendes et DNA-fragment isolert fra en bakterie, DNA som er syntetisert in vitro ut fra plantens DNA, eller et kjemisk syntetisert DNA-molekyl, som inneholder en promotersekvens, for kombinasjon med det andre DNA-fragment.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat det som det andre DNA-fragment anvendes et DNA-fragment som er isolert fra en bakterie, DNA som er syntetisert in vitro ut fra plantens DNA, eller et kjemisk syntetisert DNA-molekyl, som inneholder en ledersekvens, for kombinasjon med det første DNA-fragment.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat carbonkilden er valgt blant glycerol, succinat og ethanol.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den intracellulære konsentrasjon av hem økes ved å tilsette til dyrkningsmediet ett eller flere stoffer valgt fra gruppen bestående av hem, hemanaloger, hemforløpere og hembyggestener.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5,karakterisert vedat det som hemanalog anvendes deuteroporfyrin IX og/eller som hembyggesten anvendes 6-aminolevulinsyre.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat det anvendes et 5' - flankerende område som er identisk med, avledet fra eller omfatter 5'-flankerende områder fra soyabønneleghemoglobingener.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7,karakterisert vedat det anvendes et 5'-flankerende område som er identisk med, avledet fra eller omfatter 5'-flankerende områder fra Lba-genet med sekvensen:

9. Fremgangsmåte ifølge krav 7,karakterisert vedat det anvendes et 5'-flankerende område som er identisk med, avledet fra eller omfatter 5'-flankerende områder fra Lbcl-genet med sekvensen:

10. Fremgangsmåte ifølge krav 7,karakterisert vedat det anvendes et 5'-flankerende område som er identisk med, avledet fra eller omfatter 5'-flankerende områder fra Lbc2-genet med sekvensen:

11. Fremgangsmåte ifølge krav 7,karakterisert vedat det anvendes et 5'-flankerende område som er identisk med, avledet fra eller omfatter 5'-flankerende områder fra Lbc3-genet med sekvensen:

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av et polypeptid ved ekspresjon av gjærceller som inneholder et rekombinant DNA-segment som omfatter både et gen som koder for polypeptidet, og et 5'-flankerende område som inneholder en promotersekvens, ved dyrkning i et egnet dyrkningsmedium,karakterisert vedat det anvendes et 5'-flankerende område fra et planteleghemoglobingen, som omfatter et første DNA-fragment inneholdende promotersekvensen og et andre DNA-fragment inneholdende en ledersekvens, idet ledersekvensen på posttransskripsjonsnivå reguleres av hem, hemanaloger, hemforstadier eller hembyggestener, og at den intracellulære konsentrasjon av hem økes ved at det til dyrkningsmediet tilsettes slike carbonkilder som gir en økt intracellulær konsentrasjon av hem.

13. DNA-fragment for anvendelse i et rekombinant DNA-segment ved utøvelse av fremgangsmåten ifølge kravene 1-12,karakterisert vedat det omfatter et første DNA-fragment som inneholder en promotersekvens, og et andre DNA-fragment som inneholder en ledersekvens som på posttransskripsjonsnivå reguleres av hem, hemanaloger, hemforstadier eller hembyggestener, og er identisk med, avledet fra eller inneholder et 5'-flankerende område fra et planteleghemoglobingen.

14. DNA-fragment ifølge krav 13, som inneholder en leder-sekvens for anvendelse ved utøvelse av fremgangsmåten ifølge kravene 1-6, karakterisert vedat det er et kort DNA-fragment som transskriberes til en mRNA-tråd, som er mål for en regulering som utøves eller formidles av intracellulært hem.

15. Rekombinant DNA-sekvens for anvendelse ved fremgangsmåten ifølge kravene 1-12, karakterisert vedat den omfatter det gen som ønskes uttrykt, samt et DNA-fragment ifølge hvilket som helst av kravene 13-14.

16. Plasmid for anvendelse ved fremgangsmåten ifølge krav 1 for fremstilling av kloramfenikol-acetyltransferase (CAT),karakterisert vedat det har betegnelsen YEP Lb CAT og inneholder i tillegg til CAT-genet en promotersekvens og en ledersekvens i et DNA-fragment som inneholder et 5'-flankerende område fra soyabønneleghemoglobingenet Lbc3, og er vist i skjema 6.

17. Plasmid for anvendelse ved fremgangsmåten ifølge krav 1 for fremstilling av neomycinfosfotransferase (NPT) II,karakterisert vedat det har betegnelsen YEP 5 Lb Km og inneholder i tillegg til NPT II-genet en promotersekvens og en ledersekvens i et DNA-fragment som inneholder et 5'-flankerende område fra soyabønneleghemoglobingenet Lbc3, og er vist i skjema 8.