JP2902118B2 - 微量無機質による転写後の遺伝子の調節 - Google Patents
微量無機質による転写後の遺伝子の調節Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、異種遺伝子の発現の転写後の制御に関す
る。
る。
バイオテクノロジーの主要な目標の１つは、医学的お
よび商業的に価値があるタンパク質をエンコードする遺
伝子を、トランスフェクションされた遺伝子の発現の制
御を可能とする条件下に、細胞および動物の系の中に安
定にトランスフェクションすることである。今日まで、
最も広く使用されている方法は、誘導性プロモーターの
制御下に問題の遺伝子を配置することによって、転写レ
ベルにおける遺伝子の発現を制御することを包含する。
しかしながら、現在入手できる誘導性プロモーターの大
部分は非誘導条件下に有意なバックグラウンドのレベル
の遺伝子の生成を可能とし、こうしてこれらの方法の有
用性を低いレベルのトランスフェクションされた遺伝子
生成物が細胞に有意な作用をもたない応用にのみ制限す
る。さらに、最も誘導性のプロモーターは誘導条件下に
遺伝子の発現を制限された増加（通常約３倍）のみを生
成することができる。
よび商業的に価値があるタンパク質をエンコードする遺
伝子を、トランスフェクションされた遺伝子の発現の制
御を可能とする条件下に、細胞および動物の系の中に安
定にトランスフェクションすることである。今日まで、
最も広く使用されている方法は、誘導性プロモーターの
制御下に問題の遺伝子を配置することによって、転写レ
ベルにおける遺伝子の発現を制御することを包含する。
しかしながら、現在入手できる誘導性プロモーターの大
部分は非誘導条件下に有意なバックグラウンドのレベル
の遺伝子の生成を可能とし、こうしてこれらの方法の有
用性を低いレベルのトランスフェクションされた遺伝子
生成物が細胞に有意な作用をもたない応用にのみ制限す
る。さらに、最も誘導性のプロモーターは誘導条件下に
遺伝子の発現を制限された増加（通常約３倍）のみを生
成することができる。
さらに、現在の方法は遺伝子生成物を欠如する細胞の
中に問題の遺伝子をトランスフェクションすることを通
常必要とする。なぜなら、天然の遺伝子生成物の存在は
評価が困難であるSN比をしばしば生じ、そしてトランス
フェクションされた遺伝子生成物を検査する機能的アッ
セイの使用を妨害するからである。ある場合において、
遺伝子生成物を欠如する細胞が入手可能でないとき、ト
ランスフェクションされた遺伝子から誘導されたタンパ
ク質は、「エピトープの標識」または「ペプチドのフラ
ッグ」と呼ぶ、小さいアミノ酸配列の付加により天然の
細胞から示差的に同定することができる。しかしなが
ら、このアプローチは機能的タンパク質を必要としない
応用にしばしば制限される。なぜなら、付加されたペプ
チドの配列は、タンパク質の機能的活性のために必須で
ある。タンパク質のフォルディング、および転写後のプ
ロセシングを包含する、ある数のプロセスを妨害するこ
とがあるからである。
中に問題の遺伝子をトランスフェクションすることを通
常必要とする。なぜなら、天然の遺伝子生成物の存在は
評価が困難であるSN比をしばしば生じ、そしてトランス
フェクションされた遺伝子生成物を検査する機能的アッ
セイの使用を妨害するからである。ある場合において、
遺伝子生成物を欠如する細胞が入手可能でないとき、ト
ランスフェクションされた遺伝子から誘導されたタンパ
ク質は、「エピトープの標識」または「ペプチドのフラ
ッグ」と呼ぶ、小さいアミノ酸配列の付加により天然の
細胞から示差的に同定することができる。しかしなが
ら、このアプローチは機能的タンパク質を必要としない
応用にしばしば制限される。なぜなら、付加されたペプ
チドの配列は、タンパク質の機能的活性のために必須で
ある。タンパク質のフォルディング、および転写後のプ
ロセシングを包含する、ある数のプロセスを妨害するこ
とがあるからである。
発明の要約 われわれは、ポリペプチドの中の１または２以上のア
ミノ酸の新規なアミノ酸、セレノシステイン（SeCys）
による置換を生ずるポリヌクレオチド配列の変更が、翻
訳のレベルにおける遺伝子の発現を制御する方法を提供
すること発見した。したがって、１つの面において、本
発明は、（ａ）異種ポリペプチドをエンコードする第１
核酸、ここで第１核酸から転写されたmRNAの少なくとも
１つのコドンはコドンUGAで置換されている、および第
１配列に操作可能に連鎖された第２核酸、第２核酸はセ
レノシステインとしてUGAコドンの翻訳を指令すること
ができる、を含有する細胞を準備し；そして（ｂ）異種
ポリペプチドの生産が細胞に対して利用可能なセレンの
レベルにより制御される条件下に、細胞を増殖させる、
ステップを包含する、真核細胞の中の異種ポリペプチド
の生産を制御する方法に関する。
ミノ酸の新規なアミノ酸、セレノシステイン（SeCys）
による置換を生ずるポリヌクレオチド配列の変更が、翻
訳のレベルにおける遺伝子の発現を制御する方法を提供
すること発見した。したがって、１つの面において、本
発明は、（ａ）異種ポリペプチドをエンコードする第１
核酸、ここで第１核酸から転写されたmRNAの少なくとも
１つのコドンはコドンUGAで置換されている、および第
１配列に操作可能に連鎖された第２核酸、第２核酸はセ
レノシステインとしてUGAコドンの翻訳を指令すること
ができる、を含有する細胞を準備し；そして（ｂ）異種
ポリペプチドの生産が細胞に対して利用可能なセレンの
レベルにより制御される条件下に、細胞を増殖させる、
ステップを包含する、真核細胞の中の異種ポリペプチド
の生産を制御する方法に関する。
本発明の方法は、細胞培養において維持することがで
きる任意のタイプの真核細胞においてin vitroで実施で
きる。好ましくは、細胞は真核細胞、例えば、哺乳動物
の組織培養細胞（例えば、COS−１、HL−60、CV−１、
Ｃ−６、LLC/PK−１、3T3L1またはCHO細胞）または酵母
細胞、例えば、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccha
romyces cerevisiae）である。１つの好ましい態様に
おいて、使用する細胞は組換えポリペプチドに対して実
質的に相同性である天然のタンパク質を含有しない。し
かしながら、このような細胞が入手可能でないか、ある
いは相同性の天然のタンパク質を含有する細胞に比較し
て実質的に欠点を有する場合において、組換えポリペプ
チドは、セレノシステイン残基の存在による親核試薬に
対する組換えポリペプチドの反応性の増加によるか、あ
るいは放射性同位元素75Seを使用する放射性標識化によ
り、天然のタンパク質と区別することができる。
きる任意のタイプの真核細胞においてin vitroで実施で
きる。好ましくは、細胞は真核細胞、例えば、哺乳動物
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細胞、例えば、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccha
romyces cerevisiae）である。１つの好ましい態様に
おいて、使用する細胞は組換えポリペプチドに対して実
質的に相同性である天然のタンパク質を含有しない。し
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いは相同性の天然のタンパク質を含有する細胞に比較し
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チドは、セレノシステイン残基の存在による親核試薬に
対する組換えポリペプチドの反応性の増加によるか、あ
るいは放射性同位元素75Seを使用する放射性標識化によ
り、天然のタンパク質と区別することができる。
記第１核酸および第２核酸は、細胞の中で自律的に複製
することができる組換えベクターの中に細胞において導
入しそして維持することができるか、あるいは標準の技
術に従い細胞のゲノムの中に安定に組込むことができ
る。異種ポリペプチドの生成は、細胞を培養する培地の
中の微量の無機質、セレンの量により制御される。ポリ
ペプチドの発現を阻害することが望ましい場合、利用可
能なセレンを実質的に欠如する、すなわち、培地の中の
セレンの濃度が1ng/mlより低い、好ましくは0.1ng/mlよ
り低い培地の中で細胞は維持される。異種ポリペプチド
の発現を誘導するためには、細胞培地は典型的には１〜
50ng/ml、好ましくは２〜40ng/ml、最も好ましくは５〜
25ng/mlを含有する。
することができる組換えベクターの中に細胞において導
入しそして維持することができるか、あるいは標準の技
術に従い細胞のゲノムの中に安定に組込むことができ
る。異種ポリペプチドの生成は、細胞を培養する培地の
中の微量の無機質、セレンの量により制御される。ポリ
ペプチドの発現を阻害することが望ましい場合、利用可
能なセレンを実質的に欠如する、すなわち、培地の中の
セレンの濃度が1ng/mlより低い、好ましくは0.1ng/mlよ
り低い培地の中で細胞は維持される。異種ポリペプチド
の発現を誘導するためには、細胞培地は典型的には１〜
50ng/ml、好ましくは２〜40ng/ml、最も好ましくは５〜
25ng/mlを含有する。
あるいは、本発明の方法は、第１核酸および第２核酸
を非ヒト哺乳動物から誘導された胚細胞のゲノムの中に
安定に組込み、そして非ヒト哺乳動物のトランスジェニ
ック子孫を得ることによって、in vivoで実施すること
ができる。「トランスジェニック」は、ここにおいて使
用するとき、人工的に細胞の中に挿入され、そしてその
細胞から発育する動物のゲノムの一部分となるDNA配列
を含む哺乳動物を意味する。このようなトランスジーン
はトランスジェニック動物に対して部分的にまたは完全
に異種であることができる。トランスジェニック技術に
より生産できる非ヒト哺乳動物は本発明に包含される；
好ましい哺乳動物は、マウスに加えて、ラット、雌牛、
ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、ハムスタ
ー、およびウマを包含する。「胚細胞」は、ここにおい
て使用するとき、胚の幹（ES）細胞および受精した卵母
細胞を包含する。受精した卵母細胞の場合において、ト
ランスジェニック誘導の好ましい方法はマイクロインジ
ェクションによるが、ES細胞について、好ましい方法は
エレクトロポレーションである。しかしながら、ウイル
スの送り出し系、例えば、レトロウイルスの感染、また
はリポソームの融合を包含する他の方法を使用すること
ができる。胚細胞の中へのトランスジーンの導入後、細
胞を偽妊娠の雌の中に導入し、そしてトランスジーンに
ついてヘテロ接合である子孫を得る。次いで、ヘテロ接
合の動物の安定な系統はもとの動物系統への適当な戻し
交雑により維持することができるか、あるいはヘテロ接
合の子孫を交配させてホモ接合の動物を得ることができ
る。異種ポリペプチドの発現を阻害しようとするとき、
トランスジェニック動物を0.02mg/kgの食物より少なく
を含有する食事で維持し、そして発現の誘導は0.1mg/kg
またはそれより高い濃度にセレンを食事に補充すること
によって開始される。
を非ヒト哺乳動物から誘導された胚細胞のゲノムの中に
安定に組込み、そして非ヒト哺乳動物のトランスジェニ
ック子孫を得ることによって、in vivoで実施すること
ができる。「トランスジェニック」は、ここにおいて使
用するとき、人工的に細胞の中に挿入され、そしてその
細胞から発育する動物のゲノムの一部分となるDNA配列
を含む哺乳動物を意味する。このようなトランスジーン
はトランスジェニック動物に対して部分的にまたは完全
に異種であることができる。トランスジェニック技術に
より生産できる非ヒト哺乳動物は本発明に包含される；
好ましい哺乳動物は、マウスに加えて、ラット、雌牛、
ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、ハムスタ
ー、およびウマを包含する。「胚細胞」は、ここにおい
て使用するとき、胚の幹（ES）細胞および受精した卵母
細胞を包含する。受精した卵母細胞の場合において、ト
ランスジェニック誘導の好ましい方法はマイクロインジ
ェクションによるが、ES細胞について、好ましい方法は
エレクトロポレーションである。しかしながら、ウイル
スの送り出し系、例えば、レトロウイルスの感染、また
はリポソームの融合を包含する他の方法を使用すること
ができる。胚細胞の中へのトランスジーンの導入後、細
胞を偽妊娠の雌の中に導入し、そしてトランスジーンに
ついてヘテロ接合である子孫を得る。次いで、ヘテロ接
合の動物の安定な系統はもとの動物系統への適当な戻し
交雑により維持することができるか、あるいはヘテロ接
合の子孫を交配させてホモ接合の動物を得ることができ
る。異種ポリペプチドの発現を阻害しようとするとき、
トランスジェニック動物を0.02mg/kgの食物より少なく
を含有する食事で維持し、そして発現の誘導は0.1mg/kg
またはそれより高い濃度にセレンを食事に補充すること
によって開始される。
第１核酸によりエンコードされるポリペプチドは、ヌ
クレオチド配列が知られている任意の所望のポリペプチ
ドであることができる。ポリペプチドを修飾してセレノ
システインのアミノ酸残基を組込む方法はよく知られて
おり、そしてここに記載する。好ましくは、セレノシス
テイン残基は、天然に見出されるタンパク質の通常の生
物学的活性を壊減しないポリペプチドの中の位置におけ
るアミノ酸、例えば、非必須アミノ酸と置換される。こ
のようなアミノ酸は当業者によく知られている手段によ
り同定することができ、そしてタンパク質の触媒または
結合の活性に関係しない位置（例えば、突然変異の分析
により決定する）、あるいはポリペプチドの構造的完全
性のために重要であると考えられる位置（例えば、コン
ピューターの分析または結晶学により予測される）にお
いて通常存在するであろう。最も頻繁には、セレノシス
テインは通常システイン残基を有するポリペプチドの中
の位置に挿入されるであろう。
クレオチド配列が知られている任意の所望のポリペプチ
ドであることができる。ポリペプチドを修飾してセレノ
システインのアミノ酸残基を組込む方法はよく知られて
おり、そしてここに記載する。好ましくは、セレノシス
テイン残基は、天然に見出されるタンパク質の通常の生
物学的活性を壊減しないポリペプチドの中の位置におけ
るアミノ酸、例えば、非必須アミノ酸と置換される。こ
のようなアミノ酸は当業者によく知られている手段によ
り同定することができ、そしてタンパク質の触媒または
結合の活性に関係しない位置（例えば、突然変異の分析
により決定する）、あるいはポリペプチドの構造的完全
性のために重要であると考えられる位置（例えば、コン
ピューターの分析または結晶学により予測される）にお
いて通常存在するであろう。最も頻繁には、セレノシス
テインは通常システイン残基を有するポリペプチドの中
の位置に挿入されるであろう。
好ましい態様において、第２核酸はそれから転写され
たmRNAの中でステム−ループ二次構造を形成することが
できるヌクレオチドの隣接する配列を含み、ここでmRNA
により形成されたステム−ループはセレノシステインと
して前記UGAの翻訳を指令することができる。１つの好
ましい態様において、第２核酸は天然に見出される哺乳
動物のセレノシステインをエンコードする遺伝子の３′
−非翻訳領域からほぼ90の隣接するヌクレオチドから誘
導される。例えば、第２核酸は、第８図に示すヒトセレ
ノシステイン、グルタチオンペルオキシダーゼのヌクレ
オチド654−740に対して実質的に相同性のヌクレオチド
配列を含む。他の好ましい態様において、第２核酸は合
成的に誘導され、そしてステム−ループの先端において
ループの中に配列５′−NAAAUNNUAAAN−３′を含有する
ステム−ループを形成することができ、そしてステムは
バブルを形成する少なくとも12、好ましくは少なくとも
14の非相補的ヌクレオチドを含有し、ここでバブルはそ
の各半分に対して対称的に対向する配列５′−NUAGUN−
３′を含有する；好ましくは、ステム−ループはほぼ80
のヌクレオチドを含有し、バブルはステムの塩基からほ
ぼ17ヌクレオチドに配置されており、そしてループはス
テム−ループ構造の先端においてバブルからほぼ11ヌク
レオチドに配置されている。
たmRNAの中でステム−ループ二次構造を形成することが
できるヌクレオチドの隣接する配列を含み、ここでmRNA
により形成されたステム−ループはセレノシステインと
して前記UGAの翻訳を指令することができる。１つの好
ましい態様において、第２核酸は天然に見出される哺乳
動物のセレノシステインをエンコードする遺伝子の３′
−非翻訳領域からほぼ90の隣接するヌクレオチドから誘
導される。例えば、第２核酸は、第８図に示すヒトセレ
ノシステイン、グルタチオンペルオキシダーゼのヌクレ
オチド654−740に対して実質的に相同性のヌクレオチド
配列を含む。他の好ましい態様において、第２核酸は合
成的に誘導され、そしてステム−ループの先端において
ループの中に配列５′−NAAAUNNUAAAN−３′を含有する
ステム−ループを形成することができ、そしてステムは
バブルを形成する少なくとも12、好ましくは少なくとも
14の非相補的ヌクレオチドを含有し、ここでバブルはそ
の各半分に対して対称的に対向する配列５′−NUAGUN−
３′を含有する；好ましくは、ステム−ループはほぼ80
のヌクレオチドを含有し、バブルはステムの塩基からほ
ぼ17ヌクレオチドに配置されており、そしてループはス
テム−ループ構造の先端においてバブルからほぼ11ヌク
レオチドに配置されている。
したがって、本発明は、また、ステム−ループ二次構
造を形成できるヌクレオチドの隣接する伸張を含んでな
る一本鎖核酸に関し、ステム−ループのループは配列
５′−NAAAUNNUAAAN−３′を含み、そしてステムはバブ
ルを形成する少なくとも12、好ましくは少なくとも14の
非相補的ヌクレオチドを含み、ここでバブルはその各半
分に対して対称的に対向する配列５′−NUAGUN−３′を
含有する。核酸はUGAコドンを含有するmRNA分子に操作
的に連鎖されているとき、セレノシステインとしてコド
ン、UGAの翻訳を指令することができる。好ましくは、
ステム−ループの核酸はほぼ90のヌクレオチドを含有
し、バブルはステムの塩基からほぼ17ヌクレオチドに位
置し、そしてループはステム−ループ構造の先端におい
てバブルからほぼ11ヌクレオチドに位置する。また、好
ましくは、バブルの各半分はほぼ７ヌクレオチドであ
り、そしてループはほぼ12ヌクレオチドを含有する。
造を形成できるヌクレオチドの隣接する伸張を含んでな
る一本鎖核酸に関し、ステム−ループのループは配列
５′−NAAAUNNUAAAN−３′を含み、そしてステムはバブ
ルを形成する少なくとも12、好ましくは少なくとも14の
非相補的ヌクレオチドを含み、ここでバブルはその各半
分に対して対称的に対向する配列５′−NUAGUN−３′を
含有する。核酸はUGAコドンを含有するmRNA分子に操作
的に連鎖されているとき、セレノシステインとしてコド
ン、UGAの翻訳を指令することができる。好ましくは、
ステム−ループの核酸はほぼ90のヌクレオチドを含有
し、バブルはステムの塩基からほぼ17ヌクレオチドに位
置し、そしてループはステム−ループ構造の先端におい
てバブルからほぼ11ヌクレオチドに位置する。また、好
ましくは、バブルの各半分はほぼ７ヌクレオチドであ
り、そしてループはほぼ12ヌクレオチドを含有する。
また、本発明は本発明の一本鎖核酸をエンコードする
DNAを含有する二本鎖核酸に関する。
DNAを含有する二本鎖核酸に関する。
「異種」核酸とは、それを導入する細胞または動物に
対して部分的または完全に外来である核酸を意味する
か、あるいは異種タンパク質が少なくとも１つのアミノ
酸において置換されたセレノシステインを含有する以
外、細胞または動物の内因性遺伝子に対して相同性であ
る核酸を意味する。
対して部分的または完全に外来である核酸を意味する
か、あるいは異種タンパク質が少なくとも１つのアミノ
酸において置換されたセレノシステインを含有する以
外、細胞または動物の内因性遺伝子に対して相同性であ
る核酸を意味する。
用語「操作的に連鎖された」は、ここにおいて使用す
るとき、ステム−ループ二次構造を形成するヌクレオチ
ドの隣接する伸張がタンパク質をエンコードする核酸と
十分に近位に存在して、セレノシステインとして翻訳さ
れるべきタンパク質の中のUGAコドンの翻訳を可能とす
ることを意味する。好ましくは、ステム−ループはポリ
ペプチドをエンコードするmRNA分子の３′−非翻訳領域
の中に；好ましくはUGAコドンの2000ヌクレオチド内
に、より好ましくは、400〜1500ヌクレオチド内に、最
も好ましくは500〜1200ヌクレオチド内に挿入される。
るとき、ステム−ループ二次構造を形成するヌクレオチ
ドの隣接する伸張がタンパク質をエンコードする核酸と
十分に近位に存在して、セレノシステインとして翻訳さ
れるべきタンパク質の中のUGAコドンの翻訳を可能とす
ることを意味する。好ましくは、ステム−ループはポリ
ペプチドをエンコードするmRNA分子の３′−非翻訳領域
の中に；好ましくはUGAコドンの2000ヌクレオチド内
に、より好ましくは、400〜1500ヌクレオチド内に、最
も好ましくは500〜1200ヌクレオチド内に挿入される。
「機能的に活性」は、天然に見出されるタンパク質の
特徴を示す、任意のin vivoまたはin vitroの活性のプ
ロセシングを意味する。
特徴を示す、任意のin vivoまたはin vitroの活性のプ
ロセシングを意味する。
「相同性」とは、ここにおいて使用するとき、２つの
ポリペプチド分子または２つの核酸分子の間の配列の類
似性を意味する。２つの比較した配列の両方の中の位置
が同一のヌクレオチド塩基またはアミノ酸のサブユニッ
トにより占有されているとき、分子はその位置として相
同性である。こうして、「実質的に相同性」とは、完全
にではないが、ほとんど相同性であるヌクレオチドまた
はアミノ酸の配列を意味する。
ポリペプチド分子または２つの核酸分子の間の配列の類
似性を意味する。２つの比較した配列の両方の中の位置
が同一のヌクレオチド塩基またはアミノ酸のサブユニッ
トにより占有されているとき、分子はその位置として相
同性である。こうして、「実質的に相同性」とは、完全
にではないが、ほとんど相同性であるヌクレオチドまた
はアミノ酸の配列を意味する。
「異種」核酸とは、それがトランスフェクションされ
る動物に対して部分的または完全に外来である核酸を意
味するか、あるいはトランスジェニック動物の内因性遺
伝子に対して相同性であるが、天然の遺伝子のそれと異
なる位置において動物のゲノムの中に挿入される核酸を
意味する。
る動物に対して部分的または完全に外来である核酸を意
味するか、あるいはトランスジェニック動物の内因性遺
伝子に対して相同性であるが、天然の遺伝子のそれと異
なる位置において動物のゲノムの中に挿入される核酸を
意味する。
特記しない限り、ここにおいて使用するすべての技術
用語および科学用語は、本発明が属する当業者の１人に
より普通に理解されるとの同一の意味を有する。ここに
記載するものに類似するか、あるいはそれらに等しい方
法および物質を本発明の実施および試験において使用で
きるが、好ましい方法および物質をここで記載する。後
述するすべての刊行物はここに引用によって加える。さ
らに、物質、方法および実施例は例示のみでありそして
限定的であることを意図しない。
用語および科学用語は、本発明が属する当業者の１人に
より普通に理解されるとの同一の意味を有する。ここに
記載するものに類似するか、あるいはそれらに等しい方
法および物質を本発明の実施および試験において使用で
きるが、好ましい方法および物質をここで記載する。後
述するすべての刊行物はここに引用によって加える。さ
らに、物質、方法および実施例は例示のみでありそして
限定的であることを意図しない。
本発明の方法は、遺伝子の発現の現在使用されている
方法を越えたいくつかの利点を提供する。第１に、ポリ
ペプチド配列の中へのSeCysの置換は絶対的にセレンの
供給に依存し、こうして翻訳のレベルにおいてトランス
フェクションされた遺伝子生成物の量の事実上絶対的制
御を可能とする。第２に、SeCysはアミノ酸残基Cysの生
物学的性質のすべてを有し、こうしてCysとのSeCysの置
換は、トランスフェクションされた遺伝子生成物の通常
の生物学的活性を有意に変更しない。第３に、SeCysを
含有するトランスフェクションされた遺伝子生成物は、
その親核試薬に向かう増強された反応性によるか、ある
いは75Seの取り込みにより、天然の細胞タンパク質と容
易に区別することができる。
方法を越えたいくつかの利点を提供する。第１に、ポリ
ペプチド配列の中へのSeCysの置換は絶対的にセレンの
供給に依存し、こうして翻訳のレベルにおいてトランス
フェクションされた遺伝子生成物の量の事実上絶対的制
御を可能とする。第２に、SeCysはアミノ酸残基Cysの生
物学的性質のすべてを有し、こうしてCysとのSeCysの置
換は、トランスフェクションされた遺伝子生成物の通常
の生物学的活性を有意に変更しない。第３に、SeCysを
含有するトランスフェクションされた遺伝子生成物は、
その親核試薬に向かう増強された反応性によるか、ある
いは75Seの取り込みにより、天然の細胞タンパク質と容
易に区別することができる。
本発明の他の特徴および利点は、次の詳細な説明およ
び請求の範囲から明らかであろう。
び請求の範囲から明らかであろう。
詳細な説明 図面を最初に簡単に説明する。
図面 第1A図は、ヒト細胞のグルタチオンペルオキシダーゼ
cDNA構成体の略線図である。オープンリーディングフレ
ーム（ORF）および３′UTRは幅広のバーにより示されて
いる；プラスミドおよび５′UTRはフランキング線によ
り示されている。ヌクレオチドの番号はオープンリーデ
ィングフレームの開始において出発する;ATG開始コドン
はntl−３に存在し、TGAセレノシステインコドンはnt14
2−144に存在し、そしてTAG終止コドンはnt607−609に
存在する。矢印は制限エンドヌクレアーゼ部位の位置を
示す。線図の下の線は示した欠失の位置を表す。線図の
下のハッチングを施したバーは、エピトープの標識化配
列が挿入された位置、および置換されたcDNAの領域を示
す。
cDNA構成体の略線図である。オープンリーディングフレ
ーム（ORF）および３′UTRは幅広のバーにより示されて
いる；プラスミドおよび５′UTRはフランキング線によ
り示されている。ヌクレオチドの番号はオープンリーデ
ィングフレームの開始において出発する;ATG開始コドン
はntl−３に存在し、TGAセレノシステインコドンはnt14
2−144に存在し、そしてTAG終止コドンはnt607−609に
存在する。矢印は制限エンドヌクレアーゼ部位の位置を
示す。線図の下の線は示した欠失の位置を表す。線図の
下のハッチングを施したバーは、エピトープの標識化配
列が挿入された位置、および置換されたcDNAの領域を示
す。
第1B図は、ヒトGpx mRNAのコーディング領域における
UGA142セレノシステインコドンの直ぐ下流の潜在的二次
構造の略線図であり、そして欠失ORF−D1、ORF−D2、OR
F−D3、およびORF−D4の位置を図解する。
UGA142セレノシステインコドンの直ぐ下流の潜在的二次
構造の略線図であり、そして欠失ORF−D1、ORF−D2、OR
F−D3、およびORF−D4の位置を図解する。
第1C図は、ヒトGpx mRNAのコーディング領域における
別の潜在的二次構造の略線図であり、ここでUGA142セレ
ノシステインコドンはヘアピン構造内に存在する。欠失
ORF−D5が、また、示されている。
別の潜在的二次構造の略線図であり、ここでUGA142セレ
ノシステインコドンはヘアピン構造内に存在する。欠失
ORF−D5が、また、示されている。
第2A図は、pCMV4（レーン１）、天然のGPx（レーン
２）、または欠失突然変異体ORF−D1〜ORF−D4（それぞ
れ、レーン３〜６）を使用するトランスフェクション後
の、免疫沈澱した75Se標識化COS−１細胞抽出物のSDS−
ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフである。
２）、または欠失突然変異体ORF−D1〜ORF−D4（それぞ
れ、レーン３〜６）を使用するトランスフェクション後
の、免疫沈澱した75Se標識化COS−１細胞抽出物のSDS−
ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフである。
第2B図は、pCMV4ベクター（レーン１）、天然のGPx
（レーン２）、または欠失突然変異体ORF−D5（レーン
３）を使用するトランスフェクション後の、免疫沈澱し
た75Se標識化COS−１細胞抽出物のSDS−ポリアクリルア
ミドゲルのオートラジオグラフである。
（レーン２）、または欠失突然変異体ORF−D5（レーン
３）を使用するトランスフェクション後の、免疫沈澱し
た75Se標識化COS−１細胞抽出物のSDS−ポリアクリルア
ミドゲルのオートラジオグラフである。
第３図は、pCMV4ベクター（レーン１）、エピトープ
標識化GPx（レーン２）、または欠失突然変異体UTR−D1
〜UTR−D3（それぞれ、レーン３〜５）を使用するトラ
ンスフェクション後の、免疫沈澱した75Se標識化COS−
１細胞抽出物のSDS−ポリアクリルアミドゲルのオート
ラジオグラフである。
標識化GPx（レーン２）、または欠失突然変異体UTR−D1
〜UTR−D3（それぞれ、レーン３〜５）を使用するトラ
ンスフェクション後の、免疫沈澱した75Se標識化COS−
１細胞抽出物のSDS−ポリアクリルアミドゲルのオート
ラジオグラフである。
第４図は、pCMV4ベクター（レーン１）、エピトープ
標識化GPx（レーン２）、欠失突然変異体UTR−D4（レー
ン３）、または欠失突然変異体UTR−D5（レーン４）を
使用するトランスフェクション後の、免疫沈澱した75Se
標識化COS−１細胞抽出物のSDS−ポリアクリルアミドゲ
ルのオートラジオグラフである。
標識化GPx（レーン２）、欠失突然変異体UTR−D4（レー
ン３）、または欠失突然変異体UTR−D5（レーン４）を
使用するトランスフェクション後の、免疫沈澱した75Se
標識化COS−１細胞抽出物のSDS−ポリアクリルアミドゲ
ルのオートラジオグラフである。
第５図は、ヒトGpx mRNAの３′UTRの潜在的二次構造
の略線図である。
の略線図である。
第６図は、標識化リボプローブを使用するRNアーゼ保
護アッセイの生成物のポリアクリルアミドゲルのオート
オラジオグラフである。レーン１、未消化のプローブ；
レーン２、未トランスフェクションのCOS−１細胞から
のRNAとハイブリダイゼーションしたプローブ；レーン
３、エピトープ標識化GPx COS−１トランスフェクショ
ン体とハイブリダイゼーションしたプローブ；レーン
４、UTR−D4 COS−１トランスフェクション体とハイブ
リダイゼーションしたプローブ；レーン５、UTR−D5 CO
S−１トランスフェクション体とハイブリダイゼーショ
ンしたプローブ。
護アッセイの生成物のポリアクリルアミドゲルのオート
オラジオグラフである。レーン１、未消化のプローブ；
レーン２、未トランスフェクションのCOS−１細胞から
のRNAとハイブリダイゼーションしたプローブ；レーン
３、エピトープ標識化GPx COS−１トランスフェクショ
ン体とハイブリダイゼーションしたプローブ；レーン
４、UTR−D4 COS−１トランスフェクション体とハイブ
リダイゼーションしたプローブ；レーン５、UTR−D5 CO
S−１トランスフェクション体とハイブリダイゼーショ
ンしたプローブ。
第７図は、rab5bオパール突然変異体および融合構成
体でトランスフェクションした免疫沈澱した35S標識化
（レーン１〜４）および75Se標識化（レーン５〜８）CO
S−１細胞のSDS−ポリアクリルアミドゲルのオートラジ
オグラフである。レーン１および５、pCMV4ベクター；
レーン２および６、rab5b（オパール）GPx3′UTR;レー
ン３および７、rab5b（オパール）；レーン４および
８、rab5b（wt）GPx5′UTR。
体でトランスフェクションした免疫沈澱した35S標識化
（レーン１〜４）および75Se標識化（レーン５〜８）CO
S−１細胞のSDS−ポリアクリルアミドゲルのオートラジ
オグラフである。レーン１および５、pCMV4ベクター；
レーン２および６、rab5b（オパール）GPx3′UTR;レー
ン３および７、rab5b（オパール）；レーン４および
８、rab5b（wt）GPx5′UTR。
第８図は、３′UTRを含むヒトグルタチオンペルオキ
シダーゼのヌクレオチド配列を描写する。
シダーゼのヌクレオチド配列を描写する。
第９図は、「最適化」セレノシステイン挿入配列（SE
CIS）の配列および二次構造を描写する。
CIS）の配列および二次構造を描写する。
セレノシステイン 細菌のホルメートデヒドロゲナーゼ、哺乳動物グルタ
チオンペルオキシダーゼ（GPx）ファミリー（Mullenbac
hら、Nucleic Acids Res.15:5484、1987;Chambusら、EM
BO J.5:1221、1986;Esworthyら、Arch.Biochem.Biophy
s.286:330、1991;Takahasiら、Blood 68:640、1986）Ｉ
型ヨードチロニン５′脱ヨード酵素（Berryら（1991）N
ature 349:438−440）、およびセレノタンパク質Ｐ（Re
adら（1990）J.Biol.Chem.265、17899−17905）を包含
する、小さい数の真核性および原核性タンパク質は、異
常なセレノシステインを含有する独特な群のポリペプチ
ドに属する。セレノタンパク質の生産は、外因性セレン
のレベルにより厳格に調節されることが報告された。例
えば、Knightら（J.Nutr.117:732、1987）は、グルタチ
オンペルオキシダーゼの活性はセレンが欠如する食事
（≦0.02ppm、0.016mg/kg）を与えたラットにおいて検
出不可能なレベルに減少することを報告した。Chanoine
ら（Endocrinology 131:1787、1992）は、また、セレン
を欠如する食事を６週間を与えたラットがＩ型およびII
型の両方の５′−脱ヨード酵素のレベルの有意な減少を
有する（≦20％の正常）ことを報告した。Speierら（J.
Biol.Chem.260:8951、1985）は、in vitroにおいて、グ
ルタチオンペルオキシダーゼ活性1ng/mlより大きい培地
セレン濃度に依存し、最適な活性は5ng/mlのセレン酸ナ
トリウム（2.6×10-8M）において観察されたが、Seを補
充しない培地の中で増殖した細胞はグルタチオンペルオ
キシダーゼに欠如するようになり、Se補充細胞の活性の
わずかに１〜３％をもつことを証明した。Chadaら（Blo
od 74:2535、1989）およびChuら（Nucleic Acids Res.1
8:1531、1990）は、また、セレン欠如細胞とセレン充満
細胞との間のグルタチオンペルオキシダーゼ活性の30〜
50倍の差を報告した。
チオンペルオキシダーゼ（GPx）ファミリー（Mullenbac
hら、Nucleic Acids Res.15:5484、1987;Chambusら、EM
BO J.5:1221、1986;Esworthyら、Arch.Biochem.Biophy
s.286:330、1991;Takahasiら、Blood 68:640、1986）Ｉ
型ヨードチロニン５′脱ヨード酵素（Berryら（1991）N
ature 349:438−440）、およびセレノタンパク質Ｐ（Re
adら（1990）J.Biol.Chem.265、17899−17905）を包含
する、小さい数の真核性および原核性タンパク質は、異
常なセレノシステインを含有する独特な群のポリペプチ
ドに属する。セレノタンパク質の生産は、外因性セレン
のレベルにより厳格に調節されることが報告された。例
えば、Knightら（J.Nutr.117:732、1987）は、グルタチ
オンペルオキシダーゼの活性はセレンが欠如する食事
（≦0.02ppm、0.016mg/kg）を与えたラットにおいて検
出不可能なレベルに減少することを報告した。Chanoine
ら（Endocrinology 131:1787、1992）は、また、セレン
を欠如する食事を６週間を与えたラットがＩ型およびII
型の両方の５′−脱ヨード酵素のレベルの有意な減少を
有する（≦20％の正常）ことを報告した。Speierら（J.
Biol.Chem.260:8951、1985）は、in vitroにおいて、グ
ルタチオンペルオキシダーゼ活性1ng/mlより大きい培地
セレン濃度に依存し、最適な活性は5ng/mlのセレン酸ナ
トリウム（2.6×10-8M）において観察されたが、Seを補
充しない培地の中で増殖した細胞はグルタチオンペルオ
キシダーゼに欠如するようになり、Se補充細胞の活性の
わずかに１〜３％をもつことを証明した。Chadaら（Blo
od 74:2535、1989）およびChuら（Nucleic Acids Res.1
8:1531、1990）は、また、セレン欠如細胞とセレン充満
細胞との間のグルタチオンペルオキシダーゼ活性の30〜
50倍の差を報告した。
外因性セレンによるセレノタンパク質の生産の制御
は、UGAコドンにおける反翻訳的なセレノシステインの
取り込みによる転写後の調節により起こると信じられ
（Ｂckら（1991）Trends Biochem.Sci.16、463−46
7）、このUGAコドンは通常適当なUCAアンチコドンを含
有する独特なセレノシステイン供給tRNAの利用を通し
て、転写停止コドンとして作用する（Hawkesら（1982）
Biochim.Biophys.Acta 699、183−191;Leeら（1989）J.
Biol.Chem.264、9724−9727）。こうして、セレノタン
パク質の調節は、mRNA UGAコドンにおける翻訳プロセス
の制御により進行する可能性が最も強い。セレノシステ
イル−tRNAの中に取り込まれたセレンは翻訳の読み過ご
しを可能とするであろうが、セレンの不存在下には、セ
レノシステインtRNAはアシル化されないままであり、次
いでUGAコドンは翻訳を停止する機能をするであろう。
は、UGAコドンにおける反翻訳的なセレノシステインの
取り込みによる転写後の調節により起こると信じられ
（Ｂckら（1991）Trends Biochem.Sci.16、463−46
7）、このUGAコドンは通常適当なUCAアンチコドンを含
有する独特なセレノシステイン供給tRNAの利用を通し
て、転写停止コドンとして作用する（Hawkesら（1982）
Biochim.Biophys.Acta 699、183−191;Leeら（1989）J.
Biol.Chem.264、9724−9727）。こうして、セレノタン
パク質の調節は、mRNA UGAコドンにおける翻訳プロセス
の制御により進行する可能性が最も強い。セレノシステ
イル−tRNAの中に取り込まれたセレンは翻訳の読み過ご
しを可能とするであろうが、セレンの不存在下には、セ
レノシステインtRNAはアシル化されないままであり、次
いでUGAコドンは翻訳を停止する機能をするであろう。
セレノシステインの取り込みのためのUGAコドンの使
用の最初の同定以来、この「延長された遺伝暗号」の解
釈における重要問題は、リボソーム翻訳集合が他のmRNA
種における終止UGAコドンからのセレノシステインmRNA
のオープンリーディングフレームにおける特別のUGAコ
ドンをどのように識別するかである。
用の最初の同定以来、この「延長された遺伝暗号」の解
釈における重要問題は、リボソーム翻訳集合が他のmRNA
種における終止UGAコドンからのセレノシステインmRNA
のオープンリーディングフレームにおける特別のUGAコ
ドンをどのように識別するかである。
セレノシステインとしてUGAの翻訳をシグナルするた
めに必要かつ十分な要素のすべてを同定するために、わ
れわれはヒトセレノシステイン、グルタチオンペルオキ
シダーゼをエンコードする遺伝子のオープンリーディン
グフレームおよび３′−非翻訳領域（３′UTR）の両方
からの配列の機能的重要性を、グルタチオンペルオキシ
ダーゼおよび無関係の非セレノタンパク質の両方におけ
るセレノシステインの取り込みについて分析した。
めに必要かつ十分な要素のすべてを同定するために、わ
れわれはヒトセレノシステイン、グルタチオンペルオキ
シダーゼをエンコードする遺伝子のオープンリーディン
グフレームおよび３′−非翻訳領域（３′UTR）の両方
からの配列の機能的重要性を、グルタチオンペルオキシ
ダーゼおよび無関係の非セレノタンパク質の両方におけ
るセレノシステインの取り込みについて分析した。
GPxおよびrab5bサブクローンの構成 ベクターpBluescript KS（ストラタジーン［Stratage
ne］）におけるGPxサブクローンGPxRを、すべてのGPx欠
失サブクローンを構成するための共通の鋳型として使用
した。それは同一ベクターの中のGPX1 cDNA（Chuら（19
90）Nucleic Acids Res.18、1531−1539）の向きの逆転
により誘導された。このクローンのDNAの配列決定
（「シクエナーゼ（Sequenase）」キット［US Biochemi
cal］を使用する標準のジデオキシ配列決定技術によ
る）は、従来報告されたコドン11（GCC）（Mullenbach
（1987）Nucleic Acids Res.15、5484:Chadaら（1990）
Genomics 6、268−271）、およびわれわれが報告したコ
ドン92 CTG（Chadaら（1990）Genomics 6、268−271）
の直ぐ上流に、Mullenbachらが観察したCAG（Mullenbac
h（1987）Nucleic Acids Res.15、5484）（遺伝子バン
ク受け入れ番号Y00369およびM21304）の代わりに、１つ
の追加のGCGコドンを示した。後者の挿入は、われわれ
が他の通常のGPX1配列において観察した多形性である。
ne］）におけるGPxサブクローンGPxRを、すべてのGPx欠
失サブクローンを構成するための共通の鋳型として使用
した。それは同一ベクターの中のGPX1 cDNA（Chuら（19
90）Nucleic Acids Res.18、1531−1539）の向きの逆転
により誘導された。このクローンのDNAの配列決定
（「シクエナーゼ（Sequenase）」キット［US Biochemi
cal］を使用する標準のジデオキシ配列決定技術によ
る）は、従来報告されたコドン11（GCC）（Mullenbach
（1987）Nucleic Acids Res.15、5484:Chadaら（1990）
Genomics 6、268−271）、およびわれわれが報告したコ
ドン92 CTG（Chadaら（1990）Genomics 6、268−271）
の直ぐ上流に、Mullenbachらが観察したCAG（Mullenbac
h（1987）Nucleic Acids Res.15、5484）（遺伝子バン
ク受け入れ番号Y00369およびM21304）の代わりに、１つ
の追加のGCGコドンを示した。後者の挿入は、われわれ
が他の通常のGPX1配列において観察した多形性である。
特記しない限り、GPx欠失サブクローンは標準の方法
（Hoら（1989）Gene 77、51−59）に従いオーバーラッ
プ延長ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、パーキン
−エルマー・セツス（Perkin−Elmer Cetus）サーマル
・サイクラー（thermal cycler）および試薬を使用して
構成した。このPCR法は、最終生成物の大きさを定める
２つのフランキングプライマーおよび標的配列の中の所
望の突然変異を指令する２つの相互に相補性のプライマ
ーを必要とした。フランキングプライマーおよび相補性
の突然変異誘発プライマーの各対の１つの配列を表１に
列挙する。最終のPCR生成物をpBluescript KSの中に挿
入し戻し、そして配列を標準の方法により確証した。次
いで、各突然変異GPx配列を真核性発現ベクターpCMV4
（Andersonら（1989）J.Biol.Chem.264、8222−8229）
の中に、後述するようにCOS−１細胞の中へのトランス
フェクションのために、サブクローニングした。
（Hoら（1989）Gene 77、51−59）に従いオーバーラッ
プ延長ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、パーキン
−エルマー・セツス（Perkin−Elmer Cetus）サーマル
・サイクラー（thermal cycler）および試薬を使用して
構成した。このPCR法は、最終生成物の大きさを定める
２つのフランキングプライマーおよび標的配列の中の所
望の突然変異を指令する２つの相互に相補性のプライマ
ーを必要とした。フランキングプライマーおよび相補性
の突然変異誘発プライマーの各対の１つの配列を表１に
列挙する。最終のPCR生成物をpBluescript KSの中に挿
入し戻し、そして配列を標準の方法により確証した。次
いで、各突然変異GPx配列を真核性発現ベクターpCMV4
（Andersonら（1989）J.Biol.Chem.264、8222−8229）
の中に、後述するようにCOS−１細胞の中へのトランス
フェクションのために、サブクローニングした。
GPxの「エピトープの標識化」は、GPxのオープンリー
ディングフレームの最初の12ヌクレオチド（nt）をATG
開始コドンをエンコードする30nt配列および引き続くヒ
トインフルエンザ血球凝集素タンパク質の９アミノ酸の
エピトープをエンコードする27塩基（Chadaら（1989）B
lood 74、2535−2541）と置換することによって実施し
た（第１図に図解するように）。表１に列挙する２つの
オリゴヌクレオチドをアニーリングし、次いで生ずる短
い二本鎖の断片をGPx野生型またはpBluescript KSおよ
び／またはpCMV4の中の突然変異サブクローンの中にCla
IおよびNheI制限部位を介して挿入した。この方法にお
いて、GPxのアミノ酸２〜４が欠失され、野生型GPxより
６アミノ酸残基の正味の増加を有するエピトープ標識化
「GPxEPI」を生成した。このエピトープに対するウサギ
抗血清は入手可能であったが、標識化GPx分子へのその
結合はGPxペプチド配列に対する抗血清よりも非常に低
かったので、後者を標識化GPx分子の検出のためになお
使用した。
ディングフレームの最初の12ヌクレオチド（nt）をATG
開始コドンをエンコードする30nt配列および引き続くヒ
トインフルエンザ血球凝集素タンパク質の９アミノ酸の
エピトープをエンコードする27塩基（Chadaら（1989）B
lood 74、2535−2541）と置換することによって実施し
た（第１図に図解するように）。表１に列挙する２つの
オリゴヌクレオチドをアニーリングし、次いで生ずる短
い二本鎖の断片をGPx野生型またはpBluescript KSおよ
び／またはpCMV4の中の突然変異サブクローンの中にCla
IおよびNheI制限部位を介して挿入した。この方法にお
いて、GPxのアミノ酸２〜４が欠失され、野生型GPxより
６アミノ酸残基の正味の増加を有するエピトープ標識化
「GPxEPI」を生成した。このエピトープに対するウサギ
抗血清は入手可能であったが、標識化GPx分子へのその
結合はGPxペプチド配列に対する抗血清よりも非常に低
かったので、後者を標識化GPx分子の検出のためになお
使用した。
３′UTR配列が部分的または完全に欠失されたGPxサブ
クローンを普通のDNA組換え技術により構成した。簡単
に述べると、pBluescript KSの中のエピトープ標識化GP
xサブクローンGPxEPIからの250ntのAvrII−SpeI断片の
除去および引き続く残りの大きい断片の再結合により、
全体のGPx3′UTRが欠失された、サブクローンUTR−D3を
構成した。AvrII−XhoI断片の除去および引き続く、プ
ラスミドXhoI部位が排除されたGPxEPI含有pBluescript
KSからのGPx3′UTRの中の残りの大きい断片の再結合に
より、サブクローンUTR−D2を構成した。pBluescript K
Sの中の構成体GPxEPIから除去した。粘着ClaIおよび末
端充填XhoIの末端をもつGPxEPI含有断片を、ClaIおよび
SmaIポリリンカー制限部位を介して発現ベクターpCMV4
の中に挿入することによって、サブクローンUTR−D1を
得た。
クローンを普通のDNA組換え技術により構成した。簡単
に述べると、pBluescript KSの中のエピトープ標識化GP
xサブクローンGPxEPIからの250ntのAvrII−SpeI断片の
除去および引き続く残りの大きい断片の再結合により、
全体のGPx3′UTRが欠失された、サブクローンUTR−D3を
構成した。AvrII−XhoI断片の除去および引き続く、プ
ラスミドXhoI部位が排除されたGPxEPI含有pBluescript
KSからのGPx3′UTRの中の残りの大きい断片の再結合に
より、サブクローンUTR−D2を構成した。pBluescript K
Sの中の構成体GPxEPIから除去した。粘着ClaIおよび末
端充填XhoIの末端をもつGPxEPI含有断片を、ClaIおよび
SmaIポリリンカー制限部位を介して発現ベクターpCMV4
の中に挿入することによって、サブクローンUTR−D1を
得た。
オーバーラップ伸長PCR法を、また、使用してRas関係
GTPアーゼ上科の１構成員をエンコードする、rab5b遺伝
子の突然変異および融合サブクローンを構成した（Wils
onら（1992）J.Clin.Invest.89、996−1005）。1.6Kbの
rab5b cDNAクローンを有するプラスミドpMT2をD.B.Wils
on（ハーバード医学学校（Hervard Medical School）、
マサチュセッツ州ボストン）から入手した。構成体rab5
b（オパール）GPx3′UTRは、GPx3′UTR配列と融合し
た、コドン63におけるオパール（UGA）突然変異をもつr
ab5bコーティング領域の融合生成物を含有した。フラン
キングおよび突然変異誘発プライマーのオリゴヌクレオ
チド配列を表１に列挙する。３′PCRフランキングプラ
イマーは、天然のrab5bTGA終止コドンの除去、およびそ
のTAG停止コドンを含む、GPxオープンリーディングフレ
ームの少なくとも３コドンの置換を生じた。pBluescrip
t KSの中の天然のGPxRクローンのClaI−AvrII二重消化
から誘導された全体のGPx3′UTRを含有するpBluescript
KS構成体の中に、生ずるrab5b（オパール）突然変異体
を挿入した。次いで、遺伝子融合生成物を前述したよう
にpCMV4の中にサブクローニングした。また、同一の戦
略を使用してrab5b（WT）GPx3′UTR構成したが、ただ
し、この場合において、フランキングプライマーのみを
使用して普通のPCRを適用し、そして融合生成物（WT、
すなわち、オパール突然変異を含まない野生型）をpCMV
4の中に挿入した。GPx3′UTRがAvrII−EcoRI断片として
欠失した。rab5b（オパール）GPx3′UTRサブクローンと
rab5b3′UTR配列のほぼ900ntのNheI−EcoRI断片を融合
することによって、天然のrab5b3′UTRを除いてコーデ
ィング領域のオパール突然変異を含有する構成体rab5b
（オパール）を構成した。次いで、生ずるrab5b（オパ
ール）配列を上のようにしてpCMV4の中に挿入した。
GTPアーゼ上科の１構成員をエンコードする、rab5b遺伝
子の突然変異および融合サブクローンを構成した（Wils
onら（1992）J.Clin.Invest.89、996−1005）。1.6Kbの
rab5b cDNAクローンを有するプラスミドpMT2をD.B.Wils
on（ハーバード医学学校（Hervard Medical School）、
マサチュセッツ州ボストン）から入手した。構成体rab5
b（オパール）GPx3′UTRは、GPx3′UTR配列と融合し
た、コドン63におけるオパール（UGA）突然変異をもつr
ab5bコーティング領域の融合生成物を含有した。フラン
キングおよび突然変異誘発プライマーのオリゴヌクレオ
チド配列を表１に列挙する。３′PCRフランキングプラ
イマーは、天然のrab5bTGA終止コドンの除去、およびそ
のTAG停止コドンを含む、GPxオープンリーディングフレ
ームの少なくとも３コドンの置換を生じた。pBluescrip
t KSの中の天然のGPxRクローンのClaI−AvrII二重消化
から誘導された全体のGPx3′UTRを含有するpBluescript
KS構成体の中に、生ずるrab5b（オパール）突然変異体
を挿入した。次いで、遺伝子融合生成物を前述したよう
にpCMV4の中にサブクローニングした。また、同一の戦
略を使用してrab5b（WT）GPx3′UTR構成したが、ただ
し、この場合において、フランキングプライマーのみを
使用して普通のPCRを適用し、そして融合生成物（WT、
すなわち、オパール突然変異を含まない野生型）をpCMV
4の中に挿入した。GPx3′UTRがAvrII−EcoRI断片として
欠失した。rab5b（オパール）GPx3′UTRサブクローンと
rab5b3′UTR配列のほぼ900ntのNheI−EcoRI断片を融合
することによって、天然のrab5b3′UTRを除いてコーデ
ィング領域のオパール突然変異を含有する構成体rab5b
（オパール）を構成した。次いで、生ずるrab5b（オパ
ール）配列を上のようにしてpCMV4の中に挿入した。
COS−１細胞のトランスフェクション、標識化、および
溶解 変更されたリン酸カルシウム仲介またはエレクトロポ
レーション法（Maniatisら（1990）Molecular Cloning:
A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laborator
y、コールド・スプリング・ハーバー）により、GPxまた
はrab5b構成体の一時的発現のためにCOS−１細胞をトラ
ンスフェクションし、次いで10％の胎仔ウシ血清、5ng/
mlのセレン酸ナトリウム、25mMのHEPES pH7.4、および
１×ペニシン−ストレプトマイシン−ファンジゾーン
（Gibco−BRL）を補充したDMEM培地の中で培養した。す
べての実験は２〜４回実施した。
溶解 変更されたリン酸カルシウム仲介またはエレクトロポ
レーション法（Maniatisら（1990）Molecular Cloning:
A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laborator
y、コールド・スプリング・ハーバー）により、GPxまた
はrab5b構成体の一時的発現のためにCOS−１細胞をトラ
ンスフェクションし、次いで10％の胎仔ウシ血清、5ng/
mlのセレン酸ナトリウム、25mMのHEPES pH7.4、および
１×ペニシン−ストレプトマイシン−ファンジゾーン
（Gibco−BRL）を補充したDMEM培地の中で培養した。す
べての実験は２〜４回実施した。
トランスフェクションの効率のための対照として、CO
S−１細胞をニコルス・インスチチュート（Nichols Ins
titute）により供給されるヒト成長ホルモンの一時的発
現アッセイ系の中に含めた２μｇのプラスミドpXGH5と
共トランスフェクションした。結晶マルチ検出器RIAシ
ステム（ユナイテッド・テックノロジーズ・パッカード
［United Technologies Packard］）を使用するラジオ
イムノアッセイにより、培地の中に分泌されたヒト成長
ホルモンを検出した。
S−１細胞をニコルス・インスチチュート（Nichols Ins
titute）により供給されるヒト成長ホルモンの一時的発
現アッセイ系の中に含めた２μｇのプラスミドpXGH5と
共トランスフェクションした。結晶マルチ検出器RIAシ
ステム（ユナイテッド・テックノロジーズ・パッカード
［United Technologies Packard］）を使用するラジオ
イムノアッセイにより、培地の中に分泌されたヒト成長
ホルモンを検出した。
75Seの標識化のために、750〜1000Ci/gのもとの比活
性をもつ、硝酸の中に希釈した亜セレン酸として10μCi
の75Se（ミゾーリ研究リアクター設備の大学［Universi
ty of Missouri Research Reactor Facility］）を各プ
レートの中のトランスフェクションされた細胞に添加
し、そして細胞を37℃においてさらに３時間インキュベ
ートした。
性をもつ、硝酸の中に希釈した亜セレン酸として10μCi
の75Se（ミゾーリ研究リアクター設備の大学［Universi
ty of Missouri Research Reactor Facility］）を各プ
レートの中のトランスフェクションされた細胞に添加
し、そして細胞を37℃においてさらに３時間インキュベ
ートした。
35Sの標識化のために、各プレートの中のトランスフ
ェクションされた細胞をまず10％の透析した仔ウシ血
清、１×グルタミン（ギブコ［Gibco］）、および25mM
のHEPESを補充した、メチオニン不含およびグルタミン
不含DMEM培地（ギブコ［Gibco］）の中で30分間インキ
ュベートした。次いで、メチオニンについて1140Ci/mmo
leの比活性をもつ、250μCiのエクスプレス（Express）
35Sタンパク質標識化混合物（NENデュポン［Dupont］）
をプレートに添加し、そして細胞を37℃においてさらに
２時間インキュベートした。
ェクションされた細胞をまず10％の透析した仔ウシ血
清、１×グルタミン（ギブコ［Gibco］）、および25mM
のHEPESを補充した、メチオニン不含およびグルタミン
不含DMEM培地（ギブコ［Gibco］）の中で30分間インキ
ュベートした。次いで、メチオニンについて1140Ci/mmo
leの比活性をもつ、250μCiのエクスプレス（Express）
35Sタンパク質標識化混合物（NENデュポン［Dupont］）
をプレートに添加し、そして細胞を37℃においてさらに
２時間インキュベートした。
75Seまたは35Sの標識化後、５または１μｌ（それぞ
れ）のジイソプロピルフルオロホスフェートをCOS−１
細胞のプレートの中の氷冷標識化混合物に添加した。５
分後、この混合物を吸引しそして1.5mlのCOS細胞溶解緩
衝液（50mMのHEPES pH7.8、１％のトリトンＸ−100、10
mMのEDTA、1mMの塩化フェニルメチルスルホニル）を各
プレートに添加した。４℃において20分間震盪した後、
溶解した細胞の懸濁液をマイクロフージ（micrfuge）管
に移し、そして14,000×ｇで10分間遠心して細胞の破片
を除去した。ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を上澄み
液に0.5％の最終濃度に添加し、５分間沸騰水の中で加
熱し、次いで氷上で冷却した。
れ）のジイソプロピルフルオロホスフェートをCOS−１
細胞のプレートの中の氷冷標識化混合物に添加した。５
分後、この混合物を吸引しそして1.5mlのCOS細胞溶解緩
衝液（50mMのHEPES pH7.8、１％のトリトンＸ−100、10
mMのEDTA、1mMの塩化フェニルメチルスルホニル）を各
プレートに添加した。４℃において20分間震盪した後、
溶解した細胞の懸濁液をマイクロフージ（micrfuge）管
に移し、そして14,000×ｇで10分間遠心して細胞の破片
を除去した。ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を上澄み
液に0.5％の最終濃度に添加し、５分間沸騰水の中で加
熱し、次いで氷上で冷却した。
免疫沈澱およびタンパク質の電気泳動 GPxポリペプチド鎖からの合成ペプチド配列、残基26
−46からの一方、および残基174−残基192からの他方に
対してレイズされた２つのウサギ抗血清（バーケレイ・
アンチボディ・カンパニー［Berkeley Antibody Co.］
カリフォルニア州リッチモンド）を免疫沈澱において使
用した。15μｌの各抗血清、＋20μｌのプロテインＡ−
セファローズ（Sepharose）CL−4Bビーズ（シグマ［Sig
ma］）を各プレートに添加し、そしてこの混合物を４℃
において一定にタンブリングしながら一夜インキュベー
トした。引き続いてビーズを沈降させ、洗浄緩衝液（50
mMのHEPES pH7.8、150mMのNaCl、１％のトリトンＸ−10
0、0.5％のデオキシコレート、0.1％のSDS）で２回洗浄
し、そして50mMのHEPES pH7.8で１回洗浄し、30μｌのS
DS−ゲル負荷緩衝液（50mMのTris−HCl、pH6.8、100mM
のジチオスレイトール、２％のSDS、0.1％のブロモフェ
ノールブルー、10％のグリセロール）と混合し、沸騰水
の中で３分間加熱し、次いでマイクロフージの中で沈降
させた。次いで、上澄み液をSDS−ポリアクリルアミド
ゲルの電気泳動（SDS−PAGE）のために集めた。
−46からの一方、および残基174−残基192からの他方に
対してレイズされた２つのウサギ抗血清（バーケレイ・
アンチボディ・カンパニー［Berkeley Antibody Co.］
カリフォルニア州リッチモンド）を免疫沈澱において使
用した。15μｌの各抗血清、＋20μｌのプロテインＡ−
セファローズ（Sepharose）CL−4Bビーズ（シグマ［Sig
ma］）を各プレートに添加し、そしてこの混合物を４℃
において一定にタンブリングしながら一夜インキュベー
トした。引き続いてビーズを沈降させ、洗浄緩衝液（50
mMのHEPES pH7.8、150mMのNaCl、１％のトリトンＸ−10
0、0.5％のデオキシコレート、0.1％のSDS）で２回洗浄
し、そして50mMのHEPES pH7.8で１回洗浄し、30μｌのS
DS−ゲル負荷緩衝液（50mMのTris−HCl、pH6.8、100mM
のジチオスレイトール、２％のSDS、0.1％のブロモフェ
ノールブルー、10％のグリセロール）と混合し、沸騰水
の中で３分間加熱し、次いでマイクロフージの中で沈降
させた。次いで、上澄み液をSDS−ポリアクリルアミド
ゲルの電気泳動（SDS−PAGE）のために集めた。
rab5b構成体でトランスフェクションされたCOS−１細
胞について、手順は上と同一であったが、ただし細胞の
溶解のために0.2％のSDSを使用しそしてrab5bの超可変
性ドメインからの合成ペプチドに対してレイズされた、
８μｌのアフィニティー精製ウサギ抗体（D.B.Wilsonか
ら入手した）を添加した。
胞について、手順は上と同一であったが、ただし細胞の
溶解のために0.2％のSDSを使用しそしてrab5bの超可変
性ドメインからの合成ペプチドに対してレイズされた、
８μｌのアフィニティー精製ウサギ抗体（D.B.Wilsonか
ら入手した）を添加した。
タンパク質の電気泳動は標準の技術（Maniatisら（19
90）Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Sp
ring Harbor Laboratory、コールド・スプリング・ハー
バー）により12％のSDS−ポリアクリルアミドゲル上で
実施した。
90）Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Sp
ring Harbor Laboratory、コールド・スプリング・ハー
バー）により12％のSDS−ポリアクリルアミドゲル上で
実施した。
RNアーゼ保護アッセイ 全体の細胞のRNAをグアニジン−HCl法（Ginsburgら
（1985）Science 228、1401−1406）により単離した。T
7プロモーターからRNA転写キット（ストラタジーン［St
ratagene］）を使用して、GPxEPI転写体の５′−非翻訳
領域のClaI部位において出発する179ntのセグメントに
対して相補性の224ntの32P標識化RNA転写体を合成する
ことによって、リボプローブを発生させた。鋳型はGPxE
PIの末端充填SpeI−RsrIIの大きい断片の再循環により
形成された構成体のClaI断片であった。３μｇの全体の
細胞RNA、10μｇの酵母tRNA、および６μｌのリボプロ
ーブ（400,000TCA−沈澱性cpm/μｌ）のハイブリダイゼ
ーション混合物のRNアーゼ保護アッセイを、標準の技術
（Maniatisら（1990）Molecular Cloning:A Laboratory
Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、コールド・
スプリング・ハーバー）により実施した。
（1985）Science 228、1401−1406）により単離した。T
7プロモーターからRNA転写キット（ストラタジーン［St
ratagene］）を使用して、GPxEPI転写体の５′−非翻訳
領域のClaI部位において出発する179ntのセグメントに
対して相補性の224ntの32P標識化RNA転写体を合成する
ことによって、リボプローブを発生させた。鋳型はGPxE
PIの末端充填SpeI−RsrIIの大きい断片の再循環により
形成された構成体のClaI断片であった。３μｇの全体の
細胞RNA、10μｇの酵母tRNA、および６μｌのリボプロ
ーブ（400,000TCA−沈澱性cpm/μｌ）のハイブリダイゼ
ーション混合物のRNアーゼ保護アッセイを、標準の技術
（Maniatisら（1990）Molecular Cloning:A Laboratory
Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、コールド・
スプリング・ハーバー）により実施した。
UGAコドンの回りのヌクレオチド配列の役割 われわれは、まず、GPx mRNAのオープンリーディング
フレーム内のヌクレオチド配列がセレノシステインの挿
入のためのシグナルとして働く可能性を探査した。GPx
MRNAの配列の分析は、原核性および真核性の両方のセレ
ノシステインmRNAと共通である保存された配列を明らか
にしなかったが、UGA142コドンの回りの２つの可能なル
ープ構造を予測した。（UGA142はGPxのcDNA配列のヌク
レオチド142において出発するコドンを呼ぶ;GPxのため
のすべてのヌクレオチドの番号は、第1A図に示すよう
に、オープンリーディングフレームの第１塩基において
開始する）。UGA142の直ぐ下流の、１つの推定上のステ
ム−ループ構造は、大腸菌（E.coli）ホルメートデヒド
ロゲナーゼのmRNAおよび関係する原核性セレノ酵素遺伝
子の中に見出されるものに類似するステム−ループ構造
（第１図、パネルＢに示す）をつくる（Zinoniら（199
0）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87、4660−4664）。「ヘア
ピン」の先端にUGA142コドンを取り込む他のもの（第1C
図に示す）は、いくつかの哺乳動物のGPx mRNA、ならび
に大腸菌（E.coli）ホルメートデヒドロゲナーゼmRNA配
列の間に保存される（Chadaら（1988）Oxy−Radicals i
n Molecular Biology and Pathology（Cerutti、P.、Fr
idovich、I.、およびMcCord、J.、編）pp.273−288、Al
an R.、Liss Inc.、ニューヨーク）。セレノシステイン
の取り込みの方向においてこれらの潜在的二次構造の各
々の役割を試験するために、われわれはGPxのオープン
リーディングフレームの中に１系列の５つの順次の欠失
を構成し、第１図に示すORF−D1〜ORF−D5を設計した。
フレーム内のヌクレオチド配列がセレノシステインの挿
入のためのシグナルとして働く可能性を探査した。GPx
MRNAの配列の分析は、原核性および真核性の両方のセレ
ノシステインmRNAと共通である保存された配列を明らか
にしなかったが、UGA142コドンの回りの２つの可能なル
ープ構造を予測した。（UGA142はGPxのcDNA配列のヌク
レオチド142において出発するコドンを呼ぶ;GPxのため
のすべてのヌクレオチドの番号は、第1A図に示すよう
に、オープンリーディングフレームの第１塩基において
開始する）。UGA142の直ぐ下流の、１つの推定上のステ
ム−ループ構造は、大腸菌（E.coli）ホルメートデヒド
ロゲナーゼのmRNAおよび関係する原核性セレノ酵素遺伝
子の中に見出されるものに類似するステム−ループ構造
（第１図、パネルＢに示す）をつくる（Zinoniら（199
0）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87、4660−4664）。「ヘア
ピン」の先端にUGA142コドンを取り込む他のもの（第1C
図に示す）は、いくつかの哺乳動物のGPx mRNA、ならび
に大腸菌（E.coli）ホルメートデヒドロゲナーゼmRNA配
列の間に保存される（Chadaら（1988）Oxy−Radicals i
n Molecular Biology and Pathology（Cerutti、P.、Fr
idovich、I.、およびMcCord、J.、編）pp.273−288、Al
an R.、Liss Inc.、ニューヨーク）。セレノシステイン
の取り込みの方向においてこれらの潜在的二次構造の各
々の役割を試験するために、われわれはGPxのオープン
リーディングフレームの中に１系列の５つの順次の欠失
を構成し、第１図に示すORF−D1〜ORF−D5を設計した。
最初の４つの欠失のサブクローンは、UGA142コドンの
直ぐ下流の推定上のステム−ループ領域内に位置する。
ORF−D1はコドン49〜コドン53からの配列を欠如する;OR
F−D2はコドン65〜69を欠如する;ORF−D3はコドン54〜6
3を欠如する；そしてORF−D4はコドン71〜74を欠如す
る。ORF−D1、ORF−D2、およびORF−D3から欠失された
配列は、それぞれ、ステムの５′部分、ステムの３′部
分、およびGpx mRNAのオープンリーディングフレーム領
域における推定上のステム−ループ構造（Zinoniら（19
90）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87、4660−4664）のルー
プの大部分（31ntのうちの29）に相当する。ORF−D4
は、大腸菌（E.coli）ホルメートデヒドロゲナーゼにお
けるセレノシステイン翻訳に対して重要であると報告さ
れた配列に相当する、推定上のステム−ループ構造の直
ぐ下流の12ntの配列を表す（Zinoniら（1990）Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 87、4660−4664）。GPxサブクローンOR
F−D5は、別の推定上のヘアピンループ構造のステムの
一部分を形成する、GPx mRNAのUGA142コドンの直ぐ上流
に位置する、コドン47の欠失を含有する（Chadaら（198
8）Oxy−Radicals in Molecular Biology and Patholog
y（Cerutti、P.、Fridovich、I.、およびMcCord、J.、
編）pp.273−288、Alan R.、Liss Inc.、ニューヨー
ク）。これらの欠失サブクローンは、真核性発現ベクタ
ーpCMV4により支持され、COS−１細胞の中に個々にトラ
ンスフェクションされ、そしてGPXの発現を75Se標識
化、免疫沈澱、SDS−ポリアクリルアミドゲルの電気泳
動、およびオートラジオグラフィーにより検出した。
直ぐ下流の推定上のステム−ループ領域内に位置する。
ORF−D1はコドン49〜コドン53からの配列を欠如する;OR
F−D2はコドン65〜69を欠如する;ORF−D3はコドン54〜6
3を欠如する；そしてORF−D4はコドン71〜74を欠如す
る。ORF−D1、ORF−D2、およびORF−D3から欠失された
配列は、それぞれ、ステムの５′部分、ステムの３′部
分、およびGpx mRNAのオープンリーディングフレーム領
域における推定上のステム−ループ構造（Zinoniら（19
90）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87、4660−4664）のルー
プの大部分（31ntのうちの29）に相当する。ORF−D4
は、大腸菌（E.coli）ホルメートデヒドロゲナーゼにお
けるセレノシステイン翻訳に対して重要であると報告さ
れた配列に相当する、推定上のステム−ループ構造の直
ぐ下流の12ntの配列を表す（Zinoniら（1990）Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 87、4660−4664）。GPxサブクローンOR
F−D5は、別の推定上のヘアピンループ構造のステムの
一部分を形成する、GPx mRNAのUGA142コドンの直ぐ上流
に位置する、コドン47の欠失を含有する（Chadaら（198
8）Oxy−Radicals in Molecular Biology and Patholog
y（Cerutti、P.、Fridovich、I.、およびMcCord、J.、
編）pp.273−288、Alan R.、Liss Inc.、ニューヨー
ク）。これらの欠失サブクローンは、真核性発現ベクタ
ーpCMV4により支持され、COS−１細胞の中に個々にトラ
ンスフェクションされ、そしてGPXの発現を75Se標識
化、免疫沈澱、SDS−ポリアクリルアミドゲルの電気泳
動、およびオートラジオグラフィーにより検出した。
第２図のパネルＡに示すように、ベクター単独（レー
ン１）によりトランスフェクションされたCOS−１細胞
は、ヒトGPxのそれに類似する23kDの大きさをもつ75Se
含有ポリペプチド（天然のサル細胞GPxに最も似る）の
低いバックグラウンドのレベルを証明する。天然のヒト
GPx cDNAおよび欠失ORF−D1〜ORF−D4の一時的発現（そ
れぞれ、レーン２およびレーン３〜６）のすべては、GP
xタンパク質の中への高いレベルの75Seの組込みを示
す。これらの欠失はわずかであるが、実質的ではない、
GPxの発現の減少を示すように思われる。反復した実験
（エピトープ標識化構成体の同定の欠失の発生を含む）
は、また、わずかに減少した発現を示した。同様に、第
2B図に示すように、欠失ORF−D5はGPxの中へのセレノシ
ステインの挿入のわずの減少を生成するか、あるいは生
成しない。こうして、Gpx mRNAのオープンリーディング
フレームの中の推定上のループ構造は、GPxの発現をわ
ずかに変調し、いずれもヒトGPxにおけるセレノシステ
インとしてUGA142コドンの翻訳のために絶対的に必要で
はない。
ン１）によりトランスフェクションされたCOS−１細胞
は、ヒトGPxのそれに類似する23kDの大きさをもつ75Se
含有ポリペプチド（天然のサル細胞GPxに最も似る）の
低いバックグラウンドのレベルを証明する。天然のヒト
GPx cDNAおよび欠失ORF−D1〜ORF−D4の一時的発現（そ
れぞれ、レーン２およびレーン３〜６）のすべては、GP
xタンパク質の中への高いレベルの75Seの組込みを示
す。これらの欠失はわずかであるが、実質的ではない、
GPxの発現の減少を示すように思われる。反復した実験
（エピトープ標識化構成体の同定の欠失の発生を含む）
は、また、わずかに減少した発現を示した。同様に、第
2B図に示すように、欠失ORF−D5はGPxの中へのセレノシ
ステインの挿入のわずの減少を生成するか、あるいは生
成しない。こうして、Gpx mRNAのオープンリーディング
フレームの中の推定上のループ構造は、GPxの発現をわ
ずかに変調し、いずれもヒトGPxにおけるセレノシステ
インとしてUGA142コドンの翻訳のために絶対的に必要で
はない。
３′UTRの役割 セレノシステインの挿入における３′UTRの役割を試
験するために、われわれは前述したようにその領域の中
に種々の長さの欠失を含有するGPxサブクローンを構成
した。COS−１バックグラウンドからの一時的に発現さ
れたヒトGPx生成物の分離度を改良するために、エピト
ープの標識（Chadaら（1989）Blood 74、2535−2541）
をこれらのサブクローンの中に組込んだ。第1A図に図解
するように、われわれはヒトインフルエンザ血球凝集素
タンパク質（Chadaら（1989）Blood 74、2535−2541）
のATG開始コドンおよび９アミノ酸のエピトープをエン
コードする30ntの配列と最初の４コドンを置換した。一
時的発現された、エピトープ標識化GPxの明瞭な識別は
可能であった。なぜなら、標識化GPxは、そのバンドが
非標識化GPxのバンドより検出可能に高い位置において
分離するために十分にゆっくり移動したからである。こ
の移動度の差は、前述のコーディング領域欠失構成体の
評価のために必要な実質的に過度の発現を必要としない
で、トランスフェクションされた構成体の一時的発現の
評価を可能とした。また、エピトープの配列を野生型GP
xサブクローンGPxRの中に挿入して、新しいGPxサブクロ
ーンGPxEPIを生成し、これはGPx3′UTR欠失構成体の一
時的発現のための陽性の対照として働いた。これらの欠
失は、また、第1A図に示されている。
験するために、われわれは前述したようにその領域の中
に種々の長さの欠失を含有するGPxサブクローンを構成
した。COS−１バックグラウンドからの一時的に発現さ
れたヒトGPx生成物の分離度を改良するために、エピト
ープの標識（Chadaら（1989）Blood 74、2535−2541）
をこれらのサブクローンの中に組込んだ。第1A図に図解
するように、われわれはヒトインフルエンザ血球凝集素
タンパク質（Chadaら（1989）Blood 74、2535−2541）
のATG開始コドンおよび９アミノ酸のエピトープをエン
コードする30ntの配列と最初の４コドンを置換した。一
時的発現された、エピトープ標識化GPxの明瞭な識別は
可能であった。なぜなら、標識化GPxは、そのバンドが
非標識化GPxのバンドより検出可能に高い位置において
分離するために十分にゆっくり移動したからである。こ
の移動度の差は、前述のコーディング領域欠失構成体の
評価のために必要な実質的に過度の発現を必要としない
で、トランスフェクションされた構成体の一時的発現の
評価を可能とした。また、エピトープの配列を野生型GP
xサブクローンGPxRの中に挿入して、新しいGPxサブクロ
ーンGPxEPIを生成し、これはGPx3′UTR欠失構成体の一
時的発現のための陽性の対照として働いた。これらの欠
失は、また、第1A図に示されている。
トランスフェクションされたCOS−１細胞におけるGPx
の中への［75Se］−セレノシステインの取り込みに対す
る３′UTRの３つの大きい欠失の作用は、第３図に示さ
れている。レーン１は、ベクター単独でトランスフェク
ションされた細胞におけるバックグラウンドのGPxシグ
ナルを証明する。わずかにより大きいエピトープ標識化
GPxは、その３′UTRが無傷であるGPxEPI構成体により発
現され（レーン２）、そして内因性COS−１のバックグ
ラウンドと容易に区別される。遠位の100ntの３′UTRの
欠失（UTR−D1、レーン３）は、トランスフェクション
されたGPxの発現を減少しなかった。しかしながら、近
位の129nt（構成体UTR−D2、レーン４）または全体の
３′UTR（構成体UTR−D3、レーン５）はGPxの中への検
出可能な75Seの取り込みを完全に排除した。遠位のかつ
全体の３′UTRの欠失は３′UTRをもたないGPx mRNAを生
じなかった。なぜなら、ヒト成長ホルモンの遺伝子の
３′UTR配列は、挿入された配列に融合するために、pCM
V4ベクターの中に構築されるからである（他のGPx構成
体におけるように、転写停止部位により分離されなかっ
た場合）。
の中への［75Se］−セレノシステインの取り込みに対す
る３′UTRの３つの大きい欠失の作用は、第３図に示さ
れている。レーン１は、ベクター単独でトランスフェク
ションされた細胞におけるバックグラウンドのGPxシグ
ナルを証明する。わずかにより大きいエピトープ標識化
GPxは、その３′UTRが無傷であるGPxEPI構成体により発
現され（レーン２）、そして内因性COS−１のバックグ
ラウンドと容易に区別される。遠位の100ntの３′UTRの
欠失（UTR−D1、レーン３）は、トランスフェクション
されたGPxの発現を減少しなかった。しかしながら、近
位の129nt（構成体UTR−D2、レーン４）または全体の
３′UTR（構成体UTR−D3、レーン５）はGPxの中への検
出可能な75Seの取り込みを完全に排除した。遠位のかつ
全体の３′UTRの欠失は３′UTRをもたないGPx mRNAを生
じなかった。なぜなら、ヒト成長ホルモンの遺伝子の
３′UTR配列は、挿入された配列に融合するために、pCM
V4ベクターの中に構築されるからである（他のGPx構成
体におけるように、転写停止部位により分離されなかっ
た場合）。
ウィスコンシン・コンピューター・グループ・ソフト
ウェア大学（University of Wisconsin Computer、Grou
p software）のFOLDプログラムを使用する全体のGpx mR
NAまたはその３′UTR配列のコンピュータ分析（Devereu
xら（1984）Nucleic Acids Res.12、387−395）は、ラ
ットおよびヒト５′脱ヨード酵素およびラットGPx遺伝
子の３′UTRにおいて見出されるもの（Berryら（1991）
Nature 353、273−276）に類似する、２つの小さいルー
プをもつ長いステムから成る潜在的二次構造を明らかに
した。そのうえ、ループ内の２つの４−ntの配列（第１
におけるUAAAおよび第２におけるUGAU:第４図に示す）
は、５′脱ヨード酵素遺伝子の報告された「セレノシス
テイン挿入配列」のモチーフ（Berryら（1991）Nature
353、273−276）内の同一位置におけるものと同一であ
った。
ウェア大学（University of Wisconsin Computer、Grou
p software）のFOLDプログラムを使用する全体のGpx mR
NAまたはその３′UTR配列のコンピュータ分析（Devereu
xら（1984）Nucleic Acids Res.12、387−395）は、ラ
ットおよびヒト５′脱ヨード酵素およびラットGPx遺伝
子の３′UTRにおいて見出されるもの（Berryら（1991）
Nature 353、273−276）に類似する、２つの小さいルー
プをもつ長いステムから成る潜在的二次構造を明らかに
した。そのうえ、ループ内の２つの４−ntの配列（第１
におけるUAAAおよび第２におけるUGAU:第４図に示す）
は、５′脱ヨード酵素遺伝子の報告された「セレノシス
テイン挿入配列」のモチーフ（Berryら（1991）Nature
353、273−276）内の同一位置におけるものと同一であ
った。
これらの２つの短い配列がGPxの中へのセレノシステ
インの挿入のために必要であるかを試験するために、わ
れわれはこれらの配列の各々を特別に排除した、２つの
小さい欠失突然変異体、UTR−D4およびUTR−D5を構成し
た。第５図に示す結果は、これらの短い欠失（レーン３
および４）のいずれもトランスフェクションされたCOS
−１細胞の中のエピトープ標識化GPxの中への検出可能
なセレノシステインの取り込みを完全に壊滅したことを
証明する。
インの挿入のために必要であるかを試験するために、わ
れわれはこれらの配列の各々を特別に排除した、２つの
小さい欠失突然変異体、UTR−D4およびUTR−D5を構成し
た。第５図に示す結果は、これらの短い欠失（レーン３
および４）のいずれもトランスフェクションされたCOS
−１細胞の中のエピトープ標識化GPxの中への検出可能
なセレノシステインの取り込みを完全に壊滅したことを
証明する。
欠失突然変異体がGPx転写体のレベルに影響を与える
可能性を除外するために、われわれはトランスフェクシ
ョンされたCOS−１細胞におけるGPx mRNAのレベルをRN
アーゼ保護アッセイにより測定した。第６図に示すよう
に、未トランスフェクションのCOS−１細胞（レーン
２）はエピトープ標識化GPx転写体に対して特異的なリ
ボプローブにより検出可能なmRNAをを含有せず、そして
エピトープ標識化野生型GPxでトランスフェクションさ
れたCOS−１細胞（レーン３）はUTR−D4およびUTR−D5
欠失体でトランスフェクションされたもの（レーン４お
よび５）と同一量の転写体を含有する。また、オープン
リーディングフレームにおける欠失（ORF−D1、−D2、
および−D3）は、GPx転写体のレベルの検出可能な変化
を生成しなかった（データは示されていない）。トラン
スフェクション効率は、ヒト成長ホルモンをエンコード
するベクターとの共トランスフェクションによりアッセ
イして、また、これらの実験においてグループ毎に類似
した（データは示されていない）。
可能性を除外するために、われわれはトランスフェクシ
ョンされたCOS−１細胞におけるGPx mRNAのレベルをRN
アーゼ保護アッセイにより測定した。第６図に示すよう
に、未トランスフェクションのCOS−１細胞（レーン
２）はエピトープ標識化GPx転写体に対して特異的なリ
ボプローブにより検出可能なmRNAをを含有せず、そして
エピトープ標識化野生型GPxでトランスフェクションさ
れたCOS−１細胞（レーン３）はUTR−D4およびUTR−D5
欠失体でトランスフェクションされたもの（レーン４お
よび５）と同一量の転写体を含有する。また、オープン
リーディングフレームにおける欠失（ORF−D1、−D2、
および−D3）は、GPx転写体のレベルの検出可能な変化
を生成しなかった（データは示されていない）。トラン
スフェクション効率は、ヒト成長ホルモンをエンコード
するベクターとの共トランスフェクションによりアッセ
イして、また、これらの実験においてグループ毎に類似
した（データは示されていない）。
GPx3′UTRはセレノシステインの挿入のために十分であ
る GPx mRNAの３′UTRの中の配列がセレノシステインの
翻訳挿入のために必要であることが証明されたので、わ
れわれは次にこの３′UTRが無関係のコーディング配列
の中のUGAコドンに同一プロセスを向けるために十分で
あるかどうかを研究した。選択した標的遺伝子のrab5b
は、Ras関係GTPアーゼ上科の構成員である25kDのGTP結
合タンパク質をエンコードする（Wilsonら（1992）J.Cl
in.Invest.89、996−1005）。この遺伝子を３つの構成
体のために使用した：rab5b（オパール）は、天然のrab
5b3′UTRをもつ、UGA（オパール）突然変異体に変更さ
れたコドン63UGU（システイン）を有した；rab5b（オパ
ール）Gpx3′UTRは、その停止コドン（UAG）、および全
体のGPx3′UTRを含む、GPxコーディング領域の最後の３
コドンを取り込んだGPx cDNAの３′部分に融合したrab5
b（オパール）コーディング配列から成っていた；およ
びrab5b(wt)Gpx3′UTRは、また、rab5b−GPx融合生成物
であったが、オパール突然変異よりむしろ野生型コドン
63を有した。融合構成体は、UGU（システイン）またはU
GA（潜在的セレノシステイン）コドンを、天然のGPx転
写体におけるのとGPx3′UTRから同一の数のnt上流に配
置した。
る GPx mRNAの３′UTRの中の配列がセレノシステインの
翻訳挿入のために必要であることが証明されたので、わ
れわれは次にこの３′UTRが無関係のコーディング配列
の中のUGAコドンに同一プロセスを向けるために十分で
あるかどうかを研究した。選択した標的遺伝子のrab5b
は、Ras関係GTPアーゼ上科の構成員である25kDのGTP結
合タンパク質をエンコードする（Wilsonら（1992）J.Cl
in.Invest.89、996−1005）。この遺伝子を３つの構成
体のために使用した：rab5b（オパール）は、天然のrab
5b3′UTRをもつ、UGA（オパール）突然変異体に変更さ
れたコドン63UGU（システイン）を有した；rab5b（オパ
ール）Gpx3′UTRは、その停止コドン（UAG）、および全
体のGPx3′UTRを含む、GPxコーディング領域の最後の３
コドンを取り込んだGPx cDNAの３′部分に融合したrab5
b（オパール）コーディング配列から成っていた；およ
びrab5b(wt)Gpx3′UTRは、また、rab5b−GPx融合生成物
であったが、オパール突然変異よりむしろ野生型コドン
63を有した。融合構成体は、UGU（システイン）またはU
GA（潜在的セレノシステイン）コドンを、天然のGPx転
写体におけるのとGPx3′UTRから同一の数のnt上流に配
置した。
第７図は、COS−１細胞におけるこれらの構成体の代
表的な一時的発現の実験の結果を表す。rab5bの発現
は、35S（レーン１〜４）または75Se（レーン５〜８）
の放射性同位元素の標識化後、合成ペプチドの配列に対
するアフィニティー精製したウサギ抗体により検出され
た。ベクター単独でトランスフェクションされたCOS−
１細胞（レーン１および５）は、rab5bのために適当な2
5kDの分子質量において検出可能な免疫反応性タンパク
質を示さなかった。すべての３つの構成体は、検出可能
であるが、広く異なるレベルにおいて、ほぼ25kDの35S
標識化ポリペプチドの合成を指示するが、rab5b（オパ
ール）GPx3′UTR、すなわち、オパール突然変異とのrab
5bの融合生成物のみは、75Seを取り込んだGPx3′UTRと
結合した（レーン６）。rab5b（オパール）トランスフ
ェクション体は非常に低いレベルの35S標識化タンパク
質を発現し、多分COS−１細胞の中の別のオパールナン
センス抑制機構の存在を反映する（Hatfield、D.（198
5）Trends Biochem.Sci.10、201−204）。75Seは非常に
長い暴露後でさえ検出可能ではなく、rab5b3′UTRの存
在下にUGAコドンにおいてセレノシステインの挿入は起
こらなかったことを示す。切形ポリペプチドは35S標識
化免疫沈澱物上で検出不可能であり、短いポリペプチド
の生成物が不安定であるか、あるいは抗血清と免疫反応
性でないことを示唆した。rab5b（wt）GPx3′UTR融合構
成体を使用するトランスフェクションは、野生型rab5b
コーディング領域について期待されるように、検出可能
な75Seの取り込みをもたない免疫反応性タンパク質の発
現を生じた。これらの実験について、ヒト成長ホルモン
をエンコードするベクターとの共トランスフェクション
および分泌された成長ホルモンの測定により、トランス
フェクション効率は再び確証された。
表的な一時的発現の実験の結果を表す。rab5bの発現
は、35S（レーン１〜４）または75Se（レーン５〜８）
の放射性同位元素の標識化後、合成ペプチドの配列に対
するアフィニティー精製したウサギ抗体により検出され
た。ベクター単独でトランスフェクションされたCOS−
１細胞（レーン１および５）は、rab5bのために適当な2
5kDの分子質量において検出可能な免疫反応性タンパク
質を示さなかった。すべての３つの構成体は、検出可能
であるが、広く異なるレベルにおいて、ほぼ25kDの35S
標識化ポリペプチドの合成を指示するが、rab5b（オパ
ール）GPx3′UTR、すなわち、オパール突然変異とのrab
5bの融合生成物のみは、75Seを取り込んだGPx3′UTRと
結合した（レーン６）。rab5b（オパール）トランスフ
ェクション体は非常に低いレベルの35S標識化タンパク
質を発現し、多分COS−１細胞の中の別のオパールナン
センス抑制機構の存在を反映する（Hatfield、D.（198
5）Trends Biochem.Sci.10、201−204）。75Seは非常に
長い暴露後でさえ検出可能ではなく、rab5b3′UTRの存
在下にUGAコドンにおいてセレノシステインの挿入は起
こらなかったことを示す。切形ポリペプチドは35S標識
化免疫沈澱物上で検出不可能であり、短いポリペプチド
の生成物が不安定であるか、あるいは抗血清と免疫反応
性でないことを示唆した。rab5b（wt）GPx3′UTR融合構
成体を使用するトランスフェクションは、野生型rab5b
コーディング領域について期待されるように、検出可能
な75Seの取り込みをもたない免疫反応性タンパク質の発
現を生じた。これらの実験について、ヒト成長ホルモン
をエンコードするベクターとの共トランスフェクション
および分泌された成長ホルモンの測定により、トランス
フェクション効率は再び確証された。
UGAコドンとセレノシステイン挿入配列との間の距離
の重要性は未知のままである。誘導されたセレノシステ
インの取り込みについてのわれわれの標的であるrab5b
はアミノ酸数がGPxに類似し、そしてUGAに突然変異した
コドンはGPxにおけるUGA142と３′UTRからの距離（550n
t）が類似する。しかしながら、５′脱ヨード酵素にお
いて、スパンはほぼ1200ntであるので、セレノシステイ
ンの取り込みのために必要なこれらの要素の間の正確な
距離は多分臨界的でない。
の重要性は未知のままである。誘導されたセレノシステ
インの取り込みについてのわれわれの標的であるrab5b
はアミノ酸数がGPxに類似し、そしてUGAに突然変異した
コドンはGPxにおけるUGA142と３′UTRからの距離（550n
t）が類似する。しかしながら、５′脱ヨード酵素にお
いて、スパンはほぼ1200ntであるので、セレノシステイ
ンの取り込みのために必要なこれらの要素の間の正確な
距離は多分臨界的でない。
これらのデータが証明するように、ヒトGPx遺伝子の
３′UTRの小さいセグメント、詳しくは潜在的ステム−
ループ構造内の保存されたAAAおよびUGAU配列は、ヒトG
Pxにおけるセレノシステインの翻訳のために必須である
が、コーディング領域における潜在的ステム−ループま
たはヘアピン構造は必須ではない。そのうえ、これらの
データは、また、証明するように、GPx3′UTR単独は、
無関係の非セレノシステイン、rab5b、のオープンリー
ディングフレームにおけるオパール突然変異（UGA）
の、セレノシステインとしての、翻訳をシグナルするた
めに十分である。
３′UTRの小さいセグメント、詳しくは潜在的ステム−
ループ構造内の保存されたAAAおよびUGAU配列は、ヒトG
Pxにおけるセレノシステインの翻訳のために必須である
が、コーディング領域における潜在的ステム−ループま
たはヘアピン構造は必須ではない。そのうえ、これらの
データは、また、証明するように、GPx3′UTR単独は、
無関係の非セレノシステイン、rab5b、のオープンリー
ディングフレームにおけるオパール突然変異（UGA）
の、セレノシステインとしての、翻訳をシグナルするた
めに十分である。
「最適化」セレノシステイン挿入配列の合成 種々の既知の哺乳動物セレノシステインをエンコード
する遺伝子の検査は、３′UTRが一次的配列の類似性を
ほとんどもたず、同様な潜在的ステム−ループ構造を有
することを示す（Hillら、J.Biol.Chem.266:10050、199
1:Zinoniら、Proc.Natl.Acad.Sci.87:4660、1990:Ho
ら、Nucleic Acids Res.16:5207、1988;Berryら、Natur
e 353:273、1991）。これらの遺伝子の３′UTRの間の相
同性の欠如は、推定上のステム−ループ構造の２つの３
〜４ヌクレオチドの伸張がセレノシステインの取り込み
のために必須であるこを証明した、ヒトグルタチオンペ
ルオキシダーゼの３′UTRのわれわれの分析と組み合わ
せると、必須要素を含有しかつ向きに独立であるステム
−ループ構造を形成できる合成ヌクレオチド配列の設計
を可能とした。この「最適化」合成配列は、ステム−ル
ープの塩基から17ヌクレオチドに「バブル」および引き
続く構造の上部における12のヌクレオチドのループ、ま
たはバルーンをもつ追加の11ヌクレオチドのステムを含
有する。「最適化」ステムループを向き非特異的とする
ために、必須の３〜４ヌクレオチドのターゲティング要
素を鏡像で人工的ステム−ループの適当なバブルおよび
バルーン領域の上に位置決めする。この最適化要素の構
造を第９図に示す。この図面において、MRSは適当なク
ローニングベクターの中への要素の挿入を容易とするた
めの多重制限部位を意味し、そしてＮは任意のヌクレオ
チドを示す;Nxは任意の配列の２またはそれ以上のヌク
レオチドの伸長を意味する;N:Nは相補的塩基対を意味す
る。
する遺伝子の検査は、３′UTRが一次的配列の類似性を
ほとんどもたず、同様な潜在的ステム−ループ構造を有
することを示す（Hillら、J.Biol.Chem.266:10050、199
1:Zinoniら、Proc.Natl.Acad.Sci.87:4660、1990:Ho
ら、Nucleic Acids Res.16:5207、1988;Berryら、Natur
e 353:273、1991）。これらの遺伝子の３′UTRの間の相
同性の欠如は、推定上のステム−ループ構造の２つの３
〜４ヌクレオチドの伸張がセレノシステインの取り込み
のために必須であるこを証明した、ヒトグルタチオンペ
ルオキシダーゼの３′UTRのわれわれの分析と組み合わ
せると、必須要素を含有しかつ向きに独立であるステム
−ループ構造を形成できる合成ヌクレオチド配列の設計
を可能とした。この「最適化」合成配列は、ステム−ル
ープの塩基から17ヌクレオチドに「バブル」および引き
続く構造の上部における12のヌクレオチドのループ、ま
たはバルーンをもつ追加の11ヌクレオチドのステムを含
有する。「最適化」ステムループを向き非特異的とする
ために、必須の３〜４ヌクレオチドのターゲティング要
素を鏡像で人工的ステム−ループの適当なバブルおよび
バルーン領域の上に位置決めする。この最適化要素の構
造を第９図に示す。この図面において、MRSは適当なク
ローニングベクターの中への要素の挿入を容易とするた
めの多重制限部位を意味し、そしてＮは任意のヌクレオ
チドを示す;Nxは任意の配列の２またはそれ以上のヌク
レオチドの伸長を意味する;N:Nは相補的塩基対を意味す
る。
この最適化ステム−ループを含有するヌクレオチド配
列は、分子生物学の当業者に知られている標準の技術に
より構成することができる。例えば、われわれはアプラ
イド・バイオシステムス（Applied Biosystems）DNA合
成装置を使用してループ−バブル−バルーンを含む92マ
ーのオリゴヌクレオチドを合成した。ゲル精製後、この
１本鎖オリゴヌクレオチドは12および／または６ヌクレ
オチドのオーバーラッピング配列を含有する22マーのセ
ンスおよびアンチセンスPCRプライマーを使用してPCR増
幅のための鋳型として働いた： PCR反応は、標準の方法に従い0.1μg/μｌの鋳型オリゴ
ヌクレオチド、50pmole/μｌの各PCRプライマーを使用
して、95℃において１分間、50℃において１分間、そし
て70℃において１分間の10サイクルの間実施した。
列は、分子生物学の当業者に知られている標準の技術に
より構成することができる。例えば、われわれはアプラ
イド・バイオシステムス（Applied Biosystems）DNA合
成装置を使用してループ−バブル−バルーンを含む92マ
ーのオリゴヌクレオチドを合成した。ゲル精製後、この
１本鎖オリゴヌクレオチドは12および／または６ヌクレ
オチドのオーバーラッピング配列を含有する22マーのセ
ンスおよびアンチセンスPCRプライマーを使用してPCR増
幅のための鋳型として働いた： PCR反応は、標準の方法に従い0.1μg/μｌの鋳型オリゴ
ヌクレオチド、50pmole/μｌの各PCRプライマーを使用
して、95℃において１分間、50℃において１分間、そし
て70℃において１分間の10サイクルの間実施した。
次いで、二本鎖PCR生成物をpCRIIベクター（インビト
ロゲン［InVitrogen］、カリフォルニア州サイディエ
ゴ）の中にTAクローニング系（インビトロゲン［InVitr
ogen］）を使用して結合し、そしてINVαＦ′細胞の中
に形質転換した。構成体の配列は、プロメガ（Promeg
a）（ウイスコンシン州マディソン）からのfmol PCR配
列決定を使用するヌクレオチドの配列決定により確証さ
れた。
ロゲン［InVitrogen］、カリフォルニア州サイディエ
ゴ）の中にTAクローニング系（インビトロゲン［InVitr
ogen］）を使用して結合し、そしてINVαＦ′細胞の中
に形質転換した。構成体の配列は、プロメガ（Promeg
a）（ウイスコンシン州マディソン）からのfmol PCR配
列決定を使用するヌクレオチドの配列決定により確証さ
れた。
ポリペプチドを含有する組換えセレノシステインの構成 そのDNA配列が既知である任意の所望のポリペプチド
を、本発明の方法において、ポリペプチドの自然の活性
に必須でない任意のアミノ酸をエンコードするコドンの
置換により使用することができる。これらの「TGA」突
然変異体の製造に対するアプローチは、一般に、部位特
異的突然変異誘発またはオリゴヌクレオチドに基づく突
然変異誘発技術により、例えば、商業的に入手可能なキ
ット（プロメガ［Promega］）を使用して、達成するこ
とができる。例えば、ヒト甲状腺ホルモンのレセプター
−β1をエンコードするcDNAをベクター−ｐ−アルター
（alter）（プロメガ［Promega］）の多重クローニング
部位の中にクローニングし、そして最初のシステインコ
ドンをオリゴヌクレオチドに基づく突然変異誘発により
TGAに突然変異させた。次いで、cDNAを標準の実験室の
手法によりレスキューし、そして突然変異をヌクレオチ
ドの配列決定により確証した。
を、本発明の方法において、ポリペプチドの自然の活性
に必須でない任意のアミノ酸をエンコードするコドンの
置換により使用することができる。これらの「TGA」突
然変異体の製造に対するアプローチは、一般に、部位特
異的突然変異誘発またはオリゴヌクレオチドに基づく突
然変異誘発技術により、例えば、商業的に入手可能なキ
ット（プロメガ［Promega］）を使用して、達成するこ
とができる。例えば、ヒト甲状腺ホルモンのレセプター
−β1をエンコードするcDNAをベクター−ｐ−アルター
（alter）（プロメガ［Promega］）の多重クローニング
部位の中にクローニングし、そして最初のシステインコ
ドンをオリゴヌクレオチドに基づく突然変異誘発により
TGAに突然変異させた。次いで、cDNAを標準の実験室の
手法によりレスキューし、そして突然変異をヌクレオチ
ドの配列決定により確証した。
セレノポリペプチドの発現 本発明によるポリペプチドは、任意の適当な発現系を
使用して、セレノシステインの翻訳のために要求される
ステム−ループ構造を含有する組換え核酸に連鎖された
ポリペプチドをエンコードする配列を有する組換え核酸
からの発現により、製造することができる：例えば、適
当な発現ベヒクル、例えば、前述のものの中の組換え核
酸を使用する適当な真核宿主細胞の形質転換。分子生物
学の当業者は理解するように、任意の広範な種類の発現
系を使用して、本発明の組換えタンパク質を含有するセ
レノシステインを提供することができる。使用する正確
な宿主細胞は本発明に対して臨界的でなく、そしてサッ
カロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisia
e）または哺乳動物の細胞（例えば、COS−１、HL−60、
CV−１、LLC/PK−１、Ｃ−６、3T3L1、およびCHO細胞）
を包含する。このような細胞は広い範囲の源（例えば、
アメリカン．タイプ・カルチャー・コレクション［Amer
ican Type Culture Collection］、マリイランド州ロッ
クビレ）から入手可能である。形質転換またはトランス
フェクションの方法、および発現ベヒクルの選択は、発
現すべきポリペプチドの特質および選択した宿主系に依
存するであろう。形質転換およびトランスフェクション
の方法は、例えば、Ausebelら（Current Protocols in
Molecular Biology、John Wiely ＆ Sons、ニューヨー
ク、1989）に記載されている；発現ベヒクルはこの分野
においてよく知られているもの、例えば、Clonig Vecto
rs:A Laboratory Manual（P.H.Pouwelsら、1985、Supp
l.1987）の中のものから選択することができる。
使用して、セレノシステインの翻訳のために要求される
ステム−ループ構造を含有する組換え核酸に連鎖された
ポリペプチドをエンコードする配列を有する組換え核酸
からの発現により、製造することができる：例えば、適
当な発現ベヒクル、例えば、前述のものの中の組換え核
酸を使用する適当な真核宿主細胞の形質転換。分子生物
学の当業者は理解するように、任意の広範な種類の発現
系を使用して、本発明の組換えタンパク質を含有するセ
レノシステインを提供することができる。使用する正確
な宿主細胞は本発明に対して臨界的でなく、そしてサッ
カロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisia
e）または哺乳動物の細胞（例えば、COS−１、HL−60、
CV−１、LLC/PK−１、Ｃ−６、3T3L1、およびCHO細胞）
を包含する。このような細胞は広い範囲の源（例えば、
アメリカン．タイプ・カルチャー・コレクション［Amer
ican Type Culture Collection］、マリイランド州ロッ
クビレ）から入手可能である。形質転換またはトランス
フェクションの方法、および発現ベヒクルの選択は、発
現すべきポリペプチドの特質および選択した宿主系に依
存するであろう。形質転換およびトランスフェクション
の方法は、例えば、Ausebelら（Current Protocols in
Molecular Biology、John Wiely ＆ Sons、ニューヨー
ク、1989）に記載されている；発現ベヒクルはこの分野
においてよく知られているもの、例えば、Clonig Vecto
rs:A Laboratory Manual（P.H.Pouwelsら、1985、Supp
l.1987）の中のものから選択することができる。
例えば、所望のポリペプチドをエンコードするcDNA
は、発現を可能とするように設計された向きにセレノシ
ステイン発現系のために親ベクターとして殊に好まし
い、真核性発現ベクターpcDNA1/neoおよびpRC/CMV（イ
ンビトロゲン［InVitrogen］）の中に挿入する。
は、発現を可能とするように設計された向きにセレノシ
ステイン発現系のために親ベクターとして殊に好まし
い、真核性発現ベクターpcDNA1/neoおよびpRC/CMV（イ
ンビトロゲン［InVitrogen］）の中に挿入する。
あるいは、本発明によるポリペプチドを含有するセレ
ノシステインは、安定にトランスフェクションされた哺
乳動物細胞系により生産することができる。哺乳動物細
胞の安定なトランスフェクションに適当なある数のベク
ターは普通に入手可能である、参照、例えば、Pouwels
ら、前掲；このような細胞系を構成する方法は、また、
普通の入手可能である、例えば、Ausebelら、前掲。
ノシステインは、安定にトランスフェクションされた哺
乳動物細胞系により生産することができる。哺乳動物細
胞の安定なトランスフェクションに適当なある数のベク
ターは普通に入手可能である、参照、例えば、Pouwels
ら、前掲；このような細胞系を構成する方法は、また、
普通の入手可能である、例えば、Ausebelら、前掲。
いったん所望のセレノポリペプチドが宿主系の中に安
定にトランスフェクションされると、ポリペプチドの生
産は培地の中のセレンの含量により調節することができ
る。セレンを欠如する細胞培養系は記載されてきている
（Speirerら、前掲;Chadaら、前掲）。通常、セレノシ
ステインタンパク質の生産は0.1ng/ml培地より下の濃度
において阻害され、そして1ng/ml以上の濃度において誘
発されるであろう。セレノポリペプチドの生産の最適な
誘発はほぼ５〜25ng/ml培地において起こり、50以上〜1
00ng/mlの濃度は、使用する細胞の型に依存して、細胞
障害性である。
定にトランスフェクションされると、ポリペプチドの生
産は培地の中のセレンの含量により調節することができ
る。セレンを欠如する細胞培養系は記載されてきている
（Speirerら、前掲;Chadaら、前掲）。通常、セレノシ
ステインタンパク質の生産は0.1ng/ml培地より下の濃度
において阻害され、そして1ng/ml以上の濃度において誘
発されるであろう。セレノポリペプチドの生産の最適な
誘発はほぼ５〜25ng/ml培地において起こり、50以上〜1
00ng/mlの濃度は、使用する細胞の型に依存して、細胞
障害性である。
いったん組換えポリペプチドが発現されると、それは
この分野においてよく知られている方法に従い単離する
ことができ、そして機能的活性は特定のポリペプチドの
ために適当なアッセイ、例えば、酵素活性または結合の
親和性により決定することができる。所望のセレノポリ
ペプチドが同一の機能的活性をもつ天然のタンパク質を
含有する細胞の中で発現される場合、セレノポリペプチ
ドは、記載されるようにセレノシステインのための親核
因子とのより高い反応性をもつことによって（Leonard
ら、Biochim.Biophys.Acta 787:122、1984）、あるい
は、ここに記載するように、75Seを使用する放射性標識
化により、天然のタンパク質と区別される。
この分野においてよく知られている方法に従い単離する
ことができ、そして機能的活性は特定のポリペプチドの
ために適当なアッセイ、例えば、酵素活性または結合の
親和性により決定することができる。所望のセレノポリ
ペプチドが同一の機能的活性をもつ天然のタンパク質を
含有する細胞の中で発現される場合、セレノポリペプチ
ドは、記載されるようにセレノシステインのための親核
因子とのより高い反応性をもつことによって（Leonard
ら、Biochim.Biophys.Acta 787:122、1984）、あるい
は、ここに記載するように、75Seを使用する放射性標識
化により、天然のタンパク質と区別される。
セレノポリペプチドのin vivoの発現 セレノシステインのアミノ酸残基をエンコードするよ
うにここに記載する方法に従い修飾された任意の所望の
ポリペプチドのための遺伝子は、ポリペプチドの生産が
動物の食事の中のセレン含量により調節されるトランス
ジェニック動物を生産するために使用することができ
る。トランスジェニック動物を生産する方法はよく知ら
れている（例えば、参照、Hoganら、Manipulating the
Mouse Embryo:A Laboratory manual、CSH Press、コー
ルド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1986;Led
erら、米国特許第4,736,866号）。典型的には、0.016mg
/kgより少ないセレンを含有する食事をトランスジェニ
ック動物に与えるとき、この動物におけるセレノポリペ
プチドの発現は阻止されるが、0.1mg/kgまたはそれ以上
のセレン（例えば、Na2SeO3、シグマ［Sigma］）を含有
する動物に与えると、タンパク質は高いレベルで生産さ
れるであろう。
うにここに記載する方法に従い修飾された任意の所望の
ポリペプチドのための遺伝子は、ポリペプチドの生産が
動物の食事の中のセレン含量により調節されるトランス
ジェニック動物を生産するために使用することができ
る。トランスジェニック動物を生産する方法はよく知ら
れている（例えば、参照、Hoganら、Manipulating the
Mouse Embryo:A Laboratory manual、CSH Press、コー
ルド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1986;Led
erら、米国特許第4,736,866号）。典型的には、0.016mg
/kgより少ないセレンを含有する食事をトランスジェニ
ック動物に与えるとき、この動物におけるセレノポリペ
プチドの発現は阻止されるが、0.1mg/kgまたはそれ以上
のセレン（例えば、Na2SeO3、シグマ［Sigma］）を含有
する動物に与えると、タンパク質は高いレベルで生産さ
れるであろう。
他の態様 本発明の方法は、また、任意の商業的に入手可能なセ
レノポリペプチドを高いレベルで生産するために使用す
ることができる。上に論じたように、有効なセレンの存
在はセレンが欠如する条件下に生産されるレベルを越え
てセレノポリペプチドの発現の30〜50倍の増加を生成す
る。このレベルは、例えば、セレンが存在するとき、適
当な条件下にtRNAの過度の発現を可能とする発現ベヒク
ルの中で、セレノシステインtRNAをエンコードする遺伝
子で細胞を共トランスフェクションすることによって、
さらに増加することができる。例えば、これはtRNAをエ
ンコードする遺伝子を誘導性プロモーターの制御下に置
き、次いで培地にセレンを供給すると同時に、あるいは
その前に、遺伝子の誘導に要求される因子を供給するこ
とによって、達成することができる。
レノポリペプチドを高いレベルで生産するために使用す
ることができる。上に論じたように、有効なセレンの存
在はセレンが欠如する条件下に生産されるレベルを越え
てセレノポリペプチドの発現の30〜50倍の増加を生成す
る。このレベルは、例えば、セレンが存在するとき、適
当な条件下にtRNAの過度の発現を可能とする発現ベヒク
ルの中で、セレノシステインtRNAをエンコードする遺伝
子で細胞を共トランスフェクションすることによって、
さらに増加することができる。例えば、これはtRNAをエ
ンコードする遺伝子を誘導性プロモーターの制御下に置
き、次いで培地にセレンを供給すると同時に、あるいは
その前に、遺伝子の誘導に要求される因子を供給するこ
とによって、達成することができる。
フロントページの続き (56)参考文献 Ｂｌｏｏｄ，74［７］（15Ｎｏｖ 1989）ｐ．2535−2541 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂ ｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ, 185［１］（29Ｍａｙ 1992）ｐ．260− 263 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏ ｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，1008 （1989）ｐ．301−308 Ｎａｔｕｒｅ ｐ353（19Ｓｅｐ 1991），ｐ．273−276 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏ ｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，500（1977) ｐ．61−70 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (13)
- 【請求項１】その生来の形態においてセレノシステイン
を含有しない異種ポリペプチドの、真核細胞内での製造
を制御する方法であって： （ｉ）上記異種ポリペプチドをコードする第１核酸であ
って、その第１核酸から転写されたmRNAの少なくとも１
のコドンが、UGAコドンにより置換されている第１核
酸、及び（ii）上記第１核酸に作用可能な状態で連結さ
れた第２核酸であって、哺乳類グルタチオン・ペルオキ
シダーゼをコードする遺伝子の３′−非翻訳領域（UT
R）の部分であって、ヒト・グルタチオン・ペルオキシ
ダーゼ遺伝子由来の以下のヌクレオチド配列:TGTCTCGG
GGGGGTTTTC ATCTATGAGG GTGTTTCCTC TAAACCTACG AGGGAG
GAAC ACCTGATCTT ACAGAAAATA CCACCTCGAと実質的に相同
な部分に由来する約90個のヌクレオチドから成り、か
つ、その第２核酸から転写されたmRNAにおいてステム−
ループ２次構造を形成して、細胞が増殖する培地からそ
の細胞がセレンを得ることができるときにだけ、セレノ
システインとしての上記UGAコドンの翻訳を指令する、
前記第２核酸、を用いて細胞をトランスフェクトし；そ
して 上記ポリペプチドの製造が、上記細胞に利用されること
ができるセレンのレベルにより制御される条件下で、上
記細胞を増殖させる、 前記制御方法。 - 【請求項２】前記細胞を、in vitroで増殖させる、請求
項１に記載の制御方法。 - 【請求項３】前記細胞が、哺乳類細胞である、請求項２
に記載の制御方法。 - 【請求項４】前記細胞が、酵母細胞である、請求項１に
記載の制御方法。 - 【請求項５】前記第１核酸及び第２核酸が、前記細胞内
で自律的に複製することができる組換えベクター内に前
記細胞内で維持される、請求項１に記載の制御方法。 - 【請求項６】前記第１核酸及び第２核酸が、前記細胞の
ゲノム内に安定して組み込まれている、請求項１に記載
の制御方法。 - 【請求項７】セレンの濃度が増殖培地1ml当り１〜25ng
であるとき、前記ポリペプチドが前記細胞により製造さ
れる、請求項１に記載の制御方法。 - 【請求項８】前記細胞が、前記異種ポリペプチドに実質
的に類似する生来のタンパク質を包含しない、請求項１
に記載の制御方法。 - 【請求項９】前記細胞が、前記異種ポリペプチドに実質
的に同一な生来のタンパク質を含有し、そしてその異種
ポリペプチドが、求核試薬に対するその異種ポリペプチ
ドの増加した反応性によりその生来のタンパク質と区別
される、請求項１に記載の制御方法。 - 【請求項１０】前記細胞が、前記異種ポリペプチドに実
質的に同一な生来のタンパク質を含有し、そしてその異
種ポリペプチドが、その生来のタンパク質ではなくその
異種ポリペプチドの、放射性同位元素75Seを組込む能力
により、その生来のタンパク質と区別される、請求項１
に記載の制御方法。 - 【請求項１１】その生来の形態においてセレノシステイ
ンを含有しない放射標識された異種ポリペプチドの製造
方法であって： 上記異種ポリペプチドをコードする第１核酸であって、
その第１核酸から転写されたmRNAの少なくとも１のコド
ンが、UGAコドンにより置換されている第１核酸を得
て； 上記第１核酸に作用可能な状態で連結された第２核酸で
あって、その第２核酸から転写されたmRNAにおいてステ
ム−ループ２次構造を形成することができる隣接ヌクレ
オチド配列を包含し、哺乳類グルタチオン・ペルオキシ
ダーゼをコードする遺伝子の３′−非翻訳領域（UTR）
の部分であって、ヒト・グルタチオン・ペルオキシダー
ゼ由来の以下のヌクレオチド配列:TGTCTCGG GGGGGTTTTC
ATCTATGAGG GTGTTTCCTC TAAACCTACG AGGGAGGAAC ACCTG
ATCTT ACAGAAAATA CCACCTCGAと実質的に相同な部分に由
来する約90個のヌクレオチドから成り、かつ、細胞が増
殖する培地からその細胞がセレンを得ることができると
きにだけ、前記ステム−ループが、セレノシステインと
しての上記UGAコドンの翻訳を指令する、前記第２核酸
を得て； 上記第１核酸と上記第２核酸を、細胞に導入し；そして 上記第１核酸と上記第２核酸から翻訳された上記異種ポ
リペプチド中への放射性セレン同位元素の取り込みを許
容するために十分な条件下で、上記同位元素の存在下、
上記細胞を増殖させる、ことを包含する、前記製造方
法。 - 【請求項１２】ステム−ループ２次構造を形成すること
ができ、かつ、ヌクレオチド:TGTCTCGG GGGGGTTTTC ATC
TATGAGG GTGTTTCCTC TAAACCTACG AGGGAGGAAC ACCTGATCT
T ACAGAAAATA CCACCTCGAに実質的に相同なヌクレオチド
配列から成る単離一本鎖核酸。 - 【請求項１３】請求項12に記載の一本鎖核酸をコードす
るDNA及びその相補的配列から成る二本鎖核酸。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US6668093A | 1993-05-24 | 1993-05-24 | |
| US066,680 | 1993-05-24 | ||
| US08/066,680 | 1993-05-24 | ||
| PCT/US1994/005388 WO1994027428A1 (en) | 1993-05-24 | 1994-05-16 | Post-transcriptional gene regulation by trace minerals |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08509381A JPH08509381A (ja) | 1996-10-08 |
| JP2902118B2 true JP2902118B2 (ja) | 1999-06-07 |
Family
ID=22071018
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0871722A1 (ja) |
| JP (1) | JP2902118B2 (ja) |
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Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20180119154A1 (en) * | 2015-03-09 | 2018-05-03 | National University Corporation Nagoya University | Translation enhancer for use in cell-free protein synthesis system and use thereof |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| WO1992013077A1 (en) * | 1991-01-29 | 1992-08-06 | Brigham And Women's Hospital | A cDNA ENCODING THE TYPE I IODOTHYRONINE 5' DEIODINASE |
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-
1994
- 1994-05-16 WO PCT/US1994/005388 patent/WO1994027428A1/en not_active Application Discontinuation
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- 1994-05-16 EP EP94919139A patent/EP0871722A1/en not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (5)
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|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１００８（１９８９）ｐ．３０１−３０８ |
| Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，５００（１９７７）ｐ．６１−７０ |
| Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１８５［１］（２９Ｍａｙ １９９２）ｐ．２６０−２６３ |
| Ｂｌｏｏｄ，７４［７］（１５Ｎｏｖ １９８９）ｐ．２５３５−２５４１ |
| Ｎａｔｕｒｅ ｐ３５３（１９Ｓｅｐ １９９１），ｐ．２７３−２７６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| WO1994027428A1 (en) | 1994-12-08 |
| JPH08509381A (ja) | 1996-10-08 |
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