FI91083B - Menetelmä geenien ilmentämiseksi hiivassa, ja DNA-sekvenssejä sekä plasmideja, jotka käsittävät kyseisiä DNA-sekvenssejä käytettäviksi menetelmän toteuttamiseksi - Google Patents

Description

91083

Menetelmä geenien ilmentämiseksi hiivassa, ja DNA-sekvenssejä sekä plasmideja, jotka käsittävät kyseisiä DNA-sekvenssejä käytettäviksi menetelmän toteuttamiseksi

Keksintö koskee uutta menetelmää geenien ilmentämiseksi hiivassa, ja DNA-sekvenssejä kuin myös plasmideja, jotka sisältävät mainittuja DNA-sekvenssejä käytettäviksi menetelmän toteuttamiseksi .

Kuvauksessa käytetään muun muassa seuraavia ilmaisuja:

Promoottorialue: DNA-sekvenssi, joka sisältää promoottorin ja kohdesekvenssejä RNA-polymeraasia varten sekä mahdollisia ak-tivointialueita, jotka sisältävät kohdesekvenssejä transkriptionasi isiä säätelyaineita varten.

Säätelyaine: Aineita, jotka toteuttavat tai välittävät sääte-lytoimintaa. Näin ollen säätelyaineet sisältävät myös aineita, jotka vaikuttavat säätelytoimintaa toteuttavien tai välittävien aineiden konsentraatioon.

Esisekvenssi (signaalisekvenssi): Yleensä tarkoitetaan DNA-sekvenssiä, joka kopioidaan mRNA:han, mutta jota sekvenssiä ei edelleen siirretä (lueta) proteiiniin. Esisekvenssi käsittää näin ollen DNA-sekvenssin kopioinnin aloituksesta ATG-luennan aloituskodoniin. Esillä olevan keksinnön suhteen tällä tarkoitetaan lyhyttä DNA-sekvenssiä, jossa tyypillisesti on 40-70 emäsparia, ja joka käsittää kohdesekvenssejä posttranskripttonaaliselle säätelylle, jota toteuttaa tai välittää solunsisäi-nen hemi.

Lisäksi käytetään seuraavia ilmaisuja, jotka yleensä ovat tunnettuja henkilöille, jotka tuntevat molekyylibiologian alaa.

2 CAP-liitospaikka: Paikka, jossa 7-metyyli-GTP lisätään vastaavaan mRNA:han.

DNA-sekvenssi: Lineaarinen nukleotidien joukko, joita yhdistävät toisiinsa fosfodiesterisidokset vierekkäisten pentoosien 3' - ja 5' -hiiliatomien välillä.

Ilmeneminen: Prosessi, jonka rakennegeeni läpikäy polypeptidin tuottamiseksi. Se on transkription (kopioinnin) ja translaation (luennan) kuin myös mahdollisten posttranskriptionaalis-ten modifikaatioiden yhdistelmä.

Edeltävät alueet: DNA-sekvenssejä, jotka edeltävät koodaavia alueita. Edeltävät 5'-alueet sisältävät promoottorin. Edeltävät 3' -alueet voivat sisältää transkriptionaalisia lopetta-missignaaleja jne.

Geeni: DNA-sekvenssi, joka koostuu kolmesta tai neljästä osasta, (1) geenituotetta koodaava sekvenssi, (2) promoottorialueen sekvenssit, jotka säätelevät sitä ilmeneekö geeni vai ei, (3) ne sekvenssit 3'-päässä, jotka säätelevät transkriptionaa-lista lopettamista ja valinnaista polyadenylaatiota sekä mah-dillisesti (4) välissä olevat sekvenssit.

Välisekvenssit: DNA-sekvenssit geenin sisällä, jotka eivät koodaa mitään peptidikappaletta. Välisekvenssit kopioidaan esi-mRNA:han ja ne eliminoituvat prekursori-RNA:n modifikaation kautta mRNA:han.

Kloonaus: Prosessi, jossa saadaan organismien tai DNA-sekvenssien populaatio, joka on lähtöisin yhdestä sellaisesta organismista tai sekvenssistä suvuttoman lisääntymisen kautta, tai erityisemmin:

Prosessi, jossa eristetään tietty organismi tai osa siitä, ja tämän alafraktion lisääminen (kasvattaminen) homogeenisena populaationa.

Il 91083 3

Koodaava sekvenssi: DNA-sekvenssi, joka määrää polypeptidin aminohapposekvenssin.

Lähetti-RNA (mRNA): RNA-molekyyli, joka muodostetaan geenin kopioinnin tai prekursori-RNA:n mahdollisen modifikaation kautta. mRNA-molekyyli välittää geneettisen viestin määräämällä polypeptidin aminohapposekvenssin mRNA-molekyylin tullessa osittain siirretyksi (luetuksi) mainittuun peptidiin.

Nukleotidi: DNA:n tai RNA:n monomeerinen yksikkö, joka käsit tää sokeriosan (pentoosi), fosfaatin, ja typellisen hetero-syklisen emäksen. Emäs on kytkeytyneenä sokeriosaan glykosidi-sella sidoksella (pentoosin l’-hiili), ja tämä emäksen ja sokerin yhdistelmä on nukleosidi. Emäs tekee nukleotidistä tunnusomaisen. Neljä DNA-emästä ovat adeniini (A)f guaniini (G), sytosiini (C), ja tyrniini (T). Neljä RNA-emästä ovat A, G, C ja urasiili (U).

plasmidi: Ei-kromosomaalinen, kaksijuosteinen DNA-sekvenssi, joka käsittää käsittelemättömän replikonin, sellaisen, että plasmidi replikoituu isäntäsolussa. Kun plasmidi saatetaan yksisoluisen organismin sisään, muuttuvat tai transformoituvat sen organismin ominaisuudet plasmidin DNA:sta johtuen. Esimerkiksi plasmidi, jossa on tetrasykliinin resistenssin geeni (Te ), transformoi solun, joka aikaisemmin oli herkkä tetra-sykliinille, sellaiseksi, joka on sille resistentti. Plasmidin transformoimaa solua kutsutaan transformantiksi.

Polypeptidi: Aminohappojen lineaarinen joukko, jotka ovat kytkeytyneet toisiinsa peptidisidosten välityksellä vierekkäisten aminohappojen a-amino- ja karboksiryhmien välillä.

Rekombinaatio: Uuden DNA-molekyy1 in syntyminen eri alkuperää olevien DNA-sekvenssien yhdistymisen kautta.

Replikointi: DNA-molekyylien kopiointiprosessi.

4

Replikoni: Itse-replikoiva geneettinen elementti, jossa on lähtökohta DNA-replikoinnin käyntiinpanolle, ja geenit, jotka spesifioivat toimintoja, jotka ovat välttämättömiä replikoinnin ohjaamiseksi.

Restriktiokappale: DNA-sekvenssi, joka muodostuu kaksijuostei-sesta katkaisemisesta entsyymillä, joka tunnistaa spesifisen kohde-DNA:n sekvenssin.

RNA-polymeraasi: Entsyymi, joka toteuttaa DNA:n kopioinnin RNA:ksi.

Transformaatio: Prosessi, jossa solu ottaa vastaan plasmidin.

Translaatio (luenta): Prosessi polypeptidin tuottamiseksi mRNA:sta tai prosessi, jossa mRNA-molekyylissä läsnä oleva geneettinen informaatio määrää spesifisten aminohappojen järjestyksen polypeptidin synteesin aikana.

Transkriptio (kopiointi): Menetelmä vastaavan RNA-sekvenssin syntetisoimiseksi DNA-sekvenssistä.

Vektori: Plasmidi, faagi-DNA tai muut DNA-sekvenssit, jotka pystyvät replikointiin isäntäsolussa, ja joilla on yksi tai pieni määrä endonukleaasin tunnistuspaikkoja, joissa DNA-sekvenssit voidaan katkaista määritettävissä olevalla tavalla ilman siihen liittyvää DNA:n biologisen toiminnan oleellista menetystä, esim. replikaation, kuoriproteiinin tuottamisen tai promoottorin tai sidospaikkojen menetystä, ja jotka sisältävät markkerin, joka on sopiva käytettäväksi transformoitujen solujen identifioinnissa, esimerkiksi tetrasykliiniresistenssin tai ampisilliiniresistenssin muodossa. Vektoria nimitetään usein kloonausvälineeksi.

Biologisesti aktiivisen tuotteen tuottaminen yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla on monimutkainen asia, johon kuuluu monia

II

91083 5 prosessivaiheita kopioinnin käyntiinpanemisesta biologisesti aktiivisen molekyylin lopulliseen toteuttamiseen.

Monia näistä prosessivaiheista ei esiinny prokarioottisilla organismeilla, mikä on syy siihen, miksi eukarioottisia tuotanto-organismeja täytyy käyttää monissa tapauksissa. Hiiva on eukarioottinen organismi, jonka synteesiaparaatti käsittää monia prosesseja ja säätelymekanismeja, jotka ovat ominaisia korkeammille organismeille. Hiivasoluilla on lisäksi lyhyt generaatioaika ja hiivan käytölle on olemassa tuhatvuotinen kokemuspohja viljeltävänä organismina.

Täysin ratkaisevia tekijöitä halutun geenituotteen biologisen synteesin kannalta ovat transkriptionaalisen käyntiinpanon mahdollisuus ja parantaminen sekä transkriptionaalinen ja posttranskriptionaalinen säätely geenin ilmentämisessä.

Näitä toimintoja toteuttavat pääasiassa edeltävät 5'-alueet. Suuri joukko prokarioottisten ja eukarioottisten geenien 5'-alueista on sekventoitu, ja muun muassa siihen perustuen on hankittu laaja tietämys geenin ilmenemisen säätelystä ja ala-alueista ja sekvensseistä, jotka ovat tärkeitä geenin ilmenemisen säätelylle. Säätelymekanismissa on suuria eroja prokari-oottisissä ja eukarioottisissa organismeissa, mutta näiden kahden ryhmän sisällä esiintyy monia yhteisiä piirteitä.

Geenin ilmenemisen säätely voi tapahtua transkriptionaalisella tasolla, ja silloin se tulee edullisesti näkyviin transkription käyntiinpanofrekvenssin säätelyn kautta. Viimeksi mainittu on hyvin tunnettua, ja sitä kuvailee muun muassa Benjamin Lewin, Gene Expression, John Wiley & Sons, voi. I, 1974, voi.

II, toinen painos 1980, voi. Ill, 1977. Vaihtoehtoisesti säätelyä voi tapahtua posttranskriptionaalisella tasolla, esimer-, . kiksi translaation käyntiinpanon frekvenssin säätelyssä trans-laationopeudessa ja translaation lopettamisen säätelyssä.

6

Leghemoglobiinit ovat monomeerisiä hemoproteiineja, joita yksinomaan syntetisoituu juurinystyröissä, joita kehittyy Rhizo-biabakteerien ja hernekasvien symbioottisen yhteyden kautta. Looginen kandidaatti säätelyaineeksi, joka aktivoi leghemoglo-biinigeenejä, on Rhizobiassa tuotettu hemi, joka muodostaa leghemoglobiinien prosteettisen ryhmän. Useiden hemoproteiini-en synteesiä Saccharomyces cerevisiae-hiivassa säätelee myös solunsisäisen hemin taso, joka hemi muodostaa myös näiden proteiinien prosteettisen ryhmän. Näin ollen isosytokromi c-geenin transkriptio on hemistä riippuvainen, kun taas katalaasi T,:n tapauksessa hemisäätelyä tapahtuu sekä transkriptionaali-sella että posttranskriptionaalisella tasolla.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti tuodaan esille soijapavun neljän leghemoglobiinigeenin, Lba, Lbcl, Lbc2 ja Lbc3 edeltävien 5'-alueiden sekvenssit. Sekvenssit esitetään oheisessa sekvenssikaaviossa, kaavio 1, jossa sekvenssit on asetettu riviin siihen tapaan, että homologia näkyy selvästi.

Sekvenssikaaviossa osoittaa, että mikään emäs ei ole läsnä kyseessä olevassa paikassa. Geenien nimet ja emäksen aseina laskettuna vastavirtaan ATG-lähtökodonista ovat esitettyinä sekvenssikaavion oikealla puolella. Lisäksi tärkeät sekvenssit on alleviivattu.

Kuten käy ilmi sekvenssikaaviosta, on olemassa selvä homologi-an aste neljän edeltävän 5'-alueen välillä, ja asemassa 23-24 emäsparia vastavirtaan CAP-liitospaikasta ne kaikki sisältävät TATATAAA sekvenssin, joka vastaa "TATA" kehystä, joka eukari-oottisissa soluissa sijaitsee tavallisesti vastaavan määrän emäspareja vastavirtaan CAP-liitospaikasta kohdalla. Edelleen CCAAG-sekvenssi on läsnä kohdalla 64-72 emäsparia vastavirtaan CAP-liitospaikasta mainitun sekvenssin vastatessa "CCAAT" kehystä, joka tavallisesti sijaitsee 70-90 emäsparia vastavirtaan CAP-liitospaikasta. CAP-liitospaikasta translaation läh-tökodoniin, ATG:hen, on läsnä esisekvenssejä, joissa on 52-59 emäsparia, ja niillä on selvä homologia-aste noin 75-80 %.

I) 91083 7

Esillä olevan keksinnön mukaisesti on edelleen osoitettu Lbc3:n ollessa esimerkkinä, että soijapavun leghemoglobiini-geenien edeltävät 5'-alueet ovat toiminnallisesti aktiivisia hiivassa. Viimeksi mainittu on osoitettu yhdistämällä E. Colin kloramfenikoliasetyylitransferaasi (CAT)-geeni soijapavun Lbc3-geenin edeltäviin 5'ja 3'-alueisiin sellaisella tavalla, että CAT-geenin ilmenemistä ohjaa Lb-promoottori. Yhteensulau-tettu sekvenssi sijoitettiin hiivan plasmidivektoriin, YEP 24, joka sisälsi hiivan URA-3-geenin valintamarkkerina. Hiivakanta S. cerevisiae TMI, joka on URA-3 ja kykenemätön syntetisoimaan hemiä mutaation johdosta δ-aminolevuliinihapposyntetaasi geenissä, δ-ALA, transformoitiin myöhemmin muodostuneella konstruktiolla. Transformoiduissa hiivasoluissa ilmeni CAT-aktiivisuutta kaikissa testatuissa kasvuolosuhteissa. Sen tähden voidaan tehdä johtopäätös, että soijapavun leghemoglobiinigeenien edeltävät 5'-alueet ovat toimivia hiivassa.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti on lisäksi osoitettu, että edeltävät 5'-alueet toimivat kohteena säätelylle, jota intra-sellulaarinen hemi toteuttaa tai välittää. CAT-aktiivisuus on näin ollen 20-40 kertaa korkeampi hiivassa S. cerevisiae TMI, joka on kasvanut δ-ALA:n läsnä ollessa, kuin CAT-aktiivisuus hiivassa, joka on kasvanut ilman tätä hemiprekursoria kasvualustassa. Samanlaisia korkeita CAT-aktiivisuuksia oli läsnä hiivassa S. cerevisiae TMI, joka oli kasvanut hemin, protopor-fyriini IX, tai hemianalogin, deuteroporfyriini IX, läsnä ollessa. Hemin vaikutus CAT-aktiivisuuteen on spesifistä, koska URA-3-geenituotteen määrä pysyy vakiona kaikissa testatuissa olosuhteissa. Edelleen transkriptionaalinen taso ei ilmeisesti muutu hemin läsnäolon johdosta, koska CAT-mRNA-taso pysyy vakiona riippumatta muutoksista solunsisäisen hemin konsentraa-tiossa. Sen vuoksi voidaan päätellä, että hemin toteuttamaa tai välittämää säätelymekanismia esiintyy posttranskriptionaa-lisella tasolla.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

8 CAT-aktiivisuuden havaittu lisääntyminen riippuu proteiinisynteesistä. CAT-entsyymin puoliintumisaika on lisäksi riippumaton hemin läsnäolosta, eikä hemi stimuloi CAT-aktiivisuutta in vitro. Sen vuoksi hemi mitä todennäköisemmin säätelee geenin ilmenemistä translaationaalisella tasolla. Lbc3:n edeltävän 5'-alueen yhtymistä neomysiinifosfotransferääsi (neo) geenin koodaa-vaan alueeseen ohjaa hemi täysin samalla tavalla kuin CAT-gee-niä, joka yhtyi Lbc3-geenin edeltävään 5'-alueeseen. Hemin vaikutusta ei näin ollen välitä hemi, joka vuorovaikuttaa koodaa-van sekvenssin kanssa, vaan pikemminkin hemi, joka vuorovaikuttaa edeltävien 5'- ja 3'-Lbc3-sekvenssien kanssa, jotka ovat läsnä CATmENA:ssa. Geenin ilmenemistä, joka geeni sisältää vain edeltävän 5'-alueen ja neo-geenin, ohjaa hemi samalla tavalla Solunsisäisen hemin vaikutus geenin ilmenemiseen voidaan näin ollen saada välillisesti aikaan vuorovaikutuksella esisekvens-sin kanssa.

Lyhyet esisekvenssit eivät sisällä translaation lähtökodoneja. Solunsisäisen hemin toteuttama tai välittämä säätelymekanismi ei sen vuoksi liity läheisesti säätelymekanismeihin, jotka koskevat vääriä lähtökodoneja, vrt. julkaisua Hunt, T., Nature, voi. 316, 580-581 (1985). Säätelymekanismia, jota kuvaillaan esillä olevan keksinnön yhteydessä, toteuttaa tai välittää hemi, joka vuorovaikuttaa esisekvenssin kanssa, ja se on sen vuoksi uusi säätelymekanismi.

Plasmidien läsnäolo solussa, joka on läsnä luonnollisessa ympäristössä, antaa solun käyttöön ominaisuuden, joka on solulle edullinen vain tietyissä olosuhteissa. Plasmidin koodaamia ominaisuuksia voi esimerkiksi olla resistenssi antibiootille, jota on läsnä ympäröivässä ympäristössä. Plasmidin läsnäolo ja plasmidin koodaamien geenituotteiden synteesi kuormittavat kuitenkin solun energia-aineenvaihduntaa ja proteiinisynteesiäpä-raattia, ja solu, joka sisältää plasmidin, syrjäytyy pois ja häviää ympäristössä, jossa ei tarvita plasmidin koodaamia ominaisuuksia.

Edellä mainittu epästabiilisuus lisääntyy lisäksi käyttämällä plasmideja vektoreina halutun geenituotteen synteesiä varten,

II

91083 9 jota kyseinen solu ei tavallisesti tuota. Viimeksi mainittu merkitsee sitä, että solut, jotka syntetisoivat sellaisia tuotteita, on saatettava selektiopaineeseen, sen varmistamiseksi, että haluttua geenituotetta voidaan silti syntetisoida. Aikaisempi menetelmä tietyn geenituotteen suuren ilmenemisen saavuttamiseksi on se, että ilmenemistä säätelee voimakas promoottori, joka aiheuttaa suuren mRNA-konsentraation luetuksi tulemisen kyseiseksi geenituotteeksi.

Geenituotteen suuri konsentraatio voidaan kuitenkin saavuttaa myös kyseisen mRNA:n tehokkaammalla translaatiolla. Viimeksi mainittu merkitsee sitä, että geenituotteen synteesiä ohjataan sekä transkriptionaalisella että translaationaalisella tasolla, mikä merkitsee sitä, että soluun kohdistuva geneettinen kuormitus, joka solu syntetisoi tiettyä geeni tuotetta, voidaan jakaa kahden aktiviteetin osalle yhden sijasta kuten tavallisesti.

Mainittuja kahta aktiviteettia voidaan sen vuoksi manipuloida sellaisella tavalla, että sama tulos geenituotteen konsentraation suhteen voidaan saavuttaa, vaikka promoottori ei ole niin voimakas kuin tavallisesti käytetyt promoottorit. Sellainen kahden aktiviteetin jakautuminen merkitsee sitä, että solu ei ole niin geneettisesti kuormitettu kuin silloin, kun geenituotteen synteesiä ohjaa vain yksi voimakas promoottori. Tämän seurauksena voidaan kyseiseen soluun kohdistuvaa selektiopainetta vähentää.

On lisäksi tärkeää saada energia-aineenvaihdunnan ja proteiini-synteesiaparaatin käyttö solun kannalta järkevimmäksi siinä vaiheessa, jossa halutun geenituotteen synteesiä tapahtuu. Sellainen rationaalinen energia-aineenvaihdunnan ja proteiini-synteesiaparaatin käyttäminen saatetaan edullisesti paremmaksi optimoimalla geenituotteen synteesin myöhempiä vaiheita mieluummin kuin optimoimalla varhaisia vaiheita.

Tärkeä geenin ilmenemissysteemin piirre on sen vuoksi se, että halutun tuotteen ilmenemistä voidaan lisätä, alkujaan alhaisesta 10 ilmenemisestä ylituotantoon, manipuloimalla solun ulkoista elinympäristöä, kuten esillä olevassa keksinnössä tuodaan julki. Edelleen, posttranskriptionaalisten synteesivaiheiden indusoiva optimointi - mikä on tuotu julki esillä olevassa keksinnössä - on edullisempaa kuin transkription indusoitu optimointi.

Aikaisemmissa menetelmissä geenien ilmentämiseksi hiivassa käytetään joukkoa promoottoreja ja ekspressiovektoreita, vrt. esimerkiksi EP 120 551 A2, jossa tuodaan julki GAPDH- tai PyK-hiivapromoottorien käyttö kuin myös ekspressiovektorien käyttäminen, jotka sisältävät näitä promoottoreita.

GB-patentti 2 137 208 A julkaisee edelleen promoottorin GAL1 käyttämisen useissa ekspressiovektoreissa.

Käytettäessä näitä aikaisemmin tunnettuja promoottoreja, voidaan ilmenemistä lisätä vain lisäämällä transkriptio-käyntiinpanon frekvenssiä. Näiden promoottorien käyttäminen aiheuttaa niin muodoin suuren geneettisen kuorman solulle, energia-aineenvaihdunnan ja synteesiaparaatin irrationaalisen käytön kuin myös syntyvän epästabiilisuuden, tehden välttämättömäksi suuren selektiopaineen kohdistumisen isäntäorganismiin käytettäessä näitä promoottoreita.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on sen vuoksi tuoda esille menetelmä promoottorien käyttämiseksi, jotka ovat aktiivisia hiivassa, kuin myös esisekvenssejä, jotka saattavat niitä seu-raavan geenin ilmenemisen uudella tavalla säätelyn alaiseksi posttranskriptionaalisella tasolla. Keksinnön tarkoituksena on lisäksi antaa käyttöön promoottori- ja esisekvenssin yhdistelmiä, missä yhteydessä nämä yhdistelmät on saatu kasvin leghemoglobii-nigeenien edeltävistä 5’-alueista, ja ovat osoittautuneet toiminnallisiksi hiivassa, kuin myös keksinnön tarkoituksena on antaa käyttöön plasmideja, jotka sisältävät edellä olevan promoottori-ja esisekvenssien yhdistelmän.

Il 91083 11

Esillä olevan keksinnön mukaista menetelmää geenien ilmentämiseksi hiivassa viemällä hiivasoluun yhdistelmä-DNA-sekvenssi, joka sisältää sekä ilmennettävän geenin että edeltävän 5'-alueen, joka käsittää promoottorisekvenssin, ja kasvattamalla transformoituja hiivasoluja kasvualustassa, kuvataan käyttämällä yhdistelmä-DNA-sekvenssinä sekvenssiä, jonka edeltävä 5'-alue käsittää ensimmäisen DNA-sekvenssin, joka sisältää promoottorisekvenssin yhdistyneenä toiseen DNA-sekvenssiin, joka sisältää esisekvenssin, jota säätelevät posttranskriptionaali-sella tasolla hemi, hemianalogit ja hemiprekursorit. Tällä tavalla on mahdollista liittämällä geeni myötävirtaan yhdistelmästä ja sopivassa vektorissa, joka kykenee replikoituinaan hiivassa, saada aikaan biologisesti aktiivisen tuotteen synteesi. Tämä menetelmä tekee mahdolliseksi lisätä halutun geenin ilmenemistä uudella säätelymekanismilla, joka toimii posttran-skriptionaalisella tasolla. Erityisenä seurauksena saadaan isäntäsolun geneettisesti pelkistynyt kanta, ja isäntäsolun proteiinisynteesiaparaatin ja energia-aineenvaihdunnan optimaalinen käyttö ja niin muodoin ekspressiovektorin lisääntynyt stabiilisuus isäntäsolussa.

Menetelmän erityinen suoritusmuoto keksinnön mukaisesti käyttää ensimmäisenä DNA-sekvenssinä eristettyä tai syntetisoitua pro-moottorisekvenssiä liitettäväksi toiseen eristettyyn tai syntetisoituun esisekvenssiin. Tällä tavalla on mahdollista yhdistää mikä tahansa hiivan, kasvien tai eläinten esisekvenssi, joka luonnollisissa olosuhteissa on alttiina posttranskripttonaaliseen säätelyyn patenttivaatimuksen 1 mukaisesti, minkä tahansa sopivan hiivan promoottorin, kasvipromoottorin tai muun promoottorin kanssa, joka on toiminnallinen hiivassa.

Keksinnön mukaisen menetelmän erityisen suoritusmuodon mukaisesti lisääntyy hemin solunsisäinen konsentraatio lisäämällä kasvualustaan sellaisia hiilenlähteitä, erityisesti ei-fermen-toituvia hiilenlähteitä, jotka saavat aikaan kohonneita hemin solunsisäisiä konsentraatioita. Tällä tavalla saadaan aikaan halutun geenin ilmenemisen induktio lisäämällä hiilenlähde kasvualustaan. Esimerkkejä sellaisista hiilenlähteistä ovat 12 glyseroli ja sukkinaatti, jotka ovat erityisen edullisia, koska ne ovat huokeita ja helposti saatavissa olevia hiilenlähteitä. Lisäksi etanolia voidaan käyttää. Tietyissä olosuhteissa voi hiiva itse tuottaa tämän etanolin kasvaessaan. Kasvun päättymisen jälkeen etanoli käytetään, minkä seurauksena translaatio lisääntyy.

Erityisen suoritusmuodon mukaisesti voidaan saavuttaa sama vaikutus hemin solunsisäisen konsentraation lisääntymisen avulla lisäämällä kasvualustaan yhtä tai useampaa ainetta, jotka on valikoitu ryhmästä, johon kuuluvat hemi, hemianalogit ja hemi-prekursorit. Esimerkkinä hemianalogista on deuteroporfyriini IX, ja esimerkkinä hemiprekursorista on δ-aminolevuliinihappo.

Keksinnön mukaisen menetelmän erityinen suoritusmuoto käyttää DNA-sekvenssiä, joka sisältää promoottorisekvenssin ja esisek-venssin, joka mainittu DNA-sekvenssi on identtinen kasvin leg-hemoglobiinigeenien, hiivageenien tai muiden geenien edeltävien 5'-alueiden kanssa, on niistä peräisin tai sisältää niitä, jotka geenit ovat alttiina ekspressiosäätelylle luonnollisissa olosuhteissa, mainitun ekspressiosäätelyn ollessa solunsisäisen hemin toteuttamaa tai välittämää. Tällä tavalla päästään yksinkertaisesti käsiksi esisekvenssin ja promoottorisekvenssin yhdistelmään, mainitun yhdistelmän ollen osoitettu esillä olevan keksinnön mukaisesti toiminnalliseksi hiivassa. Esimerkkejä sellaisista DNA-sekvensseistä ovat soijapavun leghemoglobiini-geenien neljä edeltävää 5'-aluetta, nimittäin Lba sekvenssillä

GAGATACATT ATAATAATCT CTCTAGTGTC TATTTATTAT TTTATCTGGT GATATATACC TTCTCGTATA CTGTTATTTT TTCAATCTTG TAGATTTACT TCTTTTATTT TTATAAAAAA GACTTTATTT TTTTAAAAAA AATAAAGTGA ATTTTGAAAA CATGCTCTTT GACAATTTTC TGTTTCCTTT TTCATCATTG GGTTAAATCT CATAGTGCCT CTATTCAATA ATTTGGGCTC AATTTAATTA GTAGAGTCTA CATAAAATTT ACCTTAATAG TAGAGAATAG AGAGTCTTGG AAAGTTGGTT TTTCTCGAGG AAGAAAGGAA ATGTTAAAAA CTGTGATATT TTTTTTTTGG ATTAATAGTT ATGTTTATAT GAAAACTGAA AATAAATAAA CTAACCATAT TAAATTTAGA ACAACACTTC AATTATTTTT TTAATTTGAT TAATTAAAAA ATTATTTGAT TAAATTTTTT AAAAGATCGT TGTTTCTTCT TCATCATGCT GATTGACACC CTCCACAAG£ CAAGAGAAAC ACATAAGCTT TGGTTTTCTC ACTCTCCAAG CCCTCTATAT AAACAAATAT TGGAGTGAAG TTGTTGCATA ACTTGCATCG AACAATTAAT AGAAATAACA GAAAATTAAA AAAGAAATAT G

II

91083 13

Lbcl sekvenssillä: TTCTCTTAAT ACAATGGAGT TTTTGTTGAA CATACATACA TTTAAAAAAA AATCTCTAGT GTCTATTTAC CCGGTGAGAA GCCTTCTCGT GTTTTACACA CTTTAATATT ATTATATCCT CAACCCCACA AAAAAGAATA CTGTTATATC TTTCCAAACC TGTAGATTTA TTTATTTATT TATTTATTTT TACAAAGGAG ACTTCAGAAA AGTAATTACA TAAAGATAGT GAACATCATT TTATTTATTA TAATAAACTT TAAAATCAAA CTTTTTTATA TTTTTTGTTA CCCTTTTCAT TATTGGGTGA AATCTCATAG TGAAGCCATT AAATAATTTG GGCTCAAGTT TTATTAGTAA AGTCTGCATG AAATTTAACT TAACAATAGA GAGAGTTTTC GAAAGGGAGC GAATGTTAAA AAGTGTGATA TTATATTTTA TTTCGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA CATACAAAAA AATACTTTTA AATTCAGAAT AATACTTAAA ATATTTATTT GCTTAATTGA TTAACTGAAA ATTATTTGAT TAGGATTTTG AAAAGATCAT TGGCTCTTCG TCATGCCGAT TGACACCCTC CACAAGCCAA GAGAAACTTA AGTTGTAAAC TTTCTCACTC CAAGCCTTCT ATATAAACAT GTATTGGATG TGAAGTTATT GCATAACTTG CATTGAACAA TAGAAAATAA CAAAAAAAAG TAAAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG,

Lbc2 sekvenssillä:

TCGAGTTTTT ACTGAACATA CATTTATTAA AAAAAACTCT CTAGTGTCCA TTTATTCGGC GAGAAGCCTT CTCGTGCTTT ACACACTTTA ATATTATTAT ATCCCCACCC CCACCAAAAA AAAAAAAACT GTTATATCTT TCCAGTACAT TTATTTCTTA TTTTTACAAA GGAAACTTCA CGAAAGTAAT TACAAAAAAG ATAGTGAACA TCATTTTTTT AGTTAAGATG AATTTTAAAA TCACACTTTT TTATATTTTT TTGTTACCCT TTTCATTATT GGGTGAAATC TCATAGTGAA

ACTATTAAAT AGTTTGGGCT CAAGTTTTAT TAGTAAAGTC TGCATGAAAT TTAACTTAAT AATAGAGAGA GTTTTGGAAA GGTAACGAAT GTTAGAAAGT GTGATATTAT TATAGTTTTA TTTAGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA TTGACAATTT ATTTTTAAAA TTCAGAGTAA TACTTAAATT ACTTATTTAC TTTAAGATTT TGAAAAGATC ATTTGGCTCT TCATCATGCC GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC TTAAGTTGTA ATTTTTCTAA CTCCAAGCCT TCTATATAAA CACGTATTGG ATGTGAAGTT GTTGCATAAC TTCCATTGAA CAATAGAAAT AACAACAAAG AAAATAAGTG AAAAAAGAAA TATG, 14

Lbc3 sekvenssillä: TATCAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT GTAGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA CAGAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG.

Keksinnön mukaisen menetelmän lisäsuoritusmuodossa käytetään DNA-sekvenssiä, joka on identtinen YEP Lb CAT-geenin edeltävien 5'-alueiden kanssa, on niistä peräisin tai sisältää niitä, jolla geenillä on sekvenssi:

TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT GTAGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT

TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA CAGAAAAGTA GAATTCTAAA ATG

II

91083 15

Keksinnön mukaisen menetelmän lisäsuoritusmuodossa tuodaan vielä esille menetelmä valmistaa polypeptidiä viemällä hiivasolun sisään rekombinanttiplasmidi, joka menetelmä on tunnettu siitä, että käytetään rekombinanttiplasmidina plasmidia, joka sisältää promoottorisekvenssin ja esisekvenssin DNA-sekvenssissä, jossa on kasvin leghemoglobiinigeenin edeltävä 5'-alue.

Keksinnön mukaisen menetelmän toisessa suoritusmuodossa tuodaan esille menetelmä, jossa käytetään rekombinanttiplasmidina plasmidia, joka sisältää promoottorisekvenssin ja esisekvenssin DNA-sekvenssissä, jossa on kasvin leghemoglobiinigeenin edeltävä 5'-alue sekä edeltävä 3'-alue.

Esillä oleva keksintö käsittelee lisäksi DNA-sekvenssiä, jota on tarkoitus käyttää toisena DNA-sekvenssinä toteutettaessa keksinnön mukaista menetelmää, mainitun sekvenssin ollessa tunnettu siitä, että se on lyhyt DNA-sekvenssi, joka kopioidaan lähetti-RNA-juosteeksi, joka on kohteena säätelylle, jota so-lunsisäinen hemi toteuttaa tai välittää. Esimerkkejä sellaisista DNA-sekvensseistä ovat DNA-sekvenssit, jotka ovat identtisiä kasvin leghemoglobiinigeenien, hiivan geenien tai muiden geenien esisekvenssin kanssa, on siitä peräisin tai sisältävät sen, joissa geeneissä mainittu esisekvenssi luonnollisissa olosuhteissa on kohteena säätelylle, jota solunsisäinen hemi toteuttaa tai välittää. Esimerkkejä niistä ovat keksinnön mukaisesti DNA-sekvenssit, jotka ovat identtisiä soijapavun leghemoglobiinigeenien esisekvenssin kanssa, ovat siitä peräisin tai jotka sisältävät sen, nimittäin Lba sekvenssillä: AACTTGCATC GAACAATTAA TAGAAATAAC AGAAAATTAA AAAAGAAATA TG;

Lbcl sekvenssillä: AACTTGCATT GAACAATAGA AAATAACAAA AAAAAGTAAA AAAGTAGAAA AGAAATATG;

Lbc2 sekvenssillä: AACTTGCATT GAACAATAGA AATAACAACA AAGAAAATAA GTGAAAAAAG AAATATG; 16 ja Lbc3 sekvenssillä: AACTTG CATT GAACAATTAA TAGAAATAAC AGAAAAGTAG AAAAGAAATA .

TG.

Toinen esimerkki sellaisesta DNA-sekvenssistä on sekvenssi, joka on identtinen YEP Lb CAT-geenin esisekvenssin kanssa, on siitä peräisin tai sisältää sen, jolla geenillä on sekvenssi AACTTGCATT GAACAATTAA TAGAAATAAC AGAAAAGTAG AATTCTAAAA TG.

Esillä oleva keksintö käsittelee edelleen DNA-sekvenssejä, jotka sisältävät ensimmäisen DNA-sekvenssin ja toisen DNA-sekvenssin yhdistelmän, ja joita on tarkoitus käyttää toteutettaessa menetelmää keksinnön mukaisesti.

Nämä DNA-sekvenssit ovat tunnettuja siitä, että ne sisältävät promoottorisekvenssin ja esisekvenssin, ja ovat identtisiä kasvin leghemogloniinigeenien edeltävien 5'-alueiden kanssa, ovat niistä peräisin tai sisältävät niitä.

Esimerkkejä sellaisista DNA-sekvensseistä ovat keksinnön mukaisesti DNA-sekvenssit, jotka sisältävät promoottorisekvenssin ja esisekvenssin, ja jotka ovat identtisiä soijapavun leghemoglo-biinigeenien edeltävien 5'-alueiden kanssa, ovat niistä peräisin tai sisältävät niitä, nimittäin Lba sekvenssillä: GAGATACATT ATAATAATCT CTCTAGTGTC TATTTATTAT TTTATCTGGT GATATATACC TTCTCGTATA CTGTTATTTT TTCAATCTTG TAGATTTACT TCTTTTATTT TTATAAAAAA GACTTTATTT TTTTAAAAAA AATAAAGTGA ATTTTGAAAA CATGCTCTTT GACAATTTTC TGTTTCCTTT TTCATCATTG GGTTAAATCT CATAGTGCCT CTATTCAATA ATTTGGGCTC AATTTAATTA GTAGAGTCTA CATAAAATTT ACCTTAATAG TAGAGAATAG AGAGTCTTGG AAAGTTGGTT TTTCTCGAGG AAGAAAGGAA ATGTTAAAAA CTGTGATATT TTTTTTTTGG ATTAATAGTT ATGTTTATAT GAAAACTGAA AATAAATAAA CTAACCATAT TAAATTTAGA ACAACACTTC AATTATTTTT TTAATTTGAT TAATTAAAAA ATTATTTGAT TAAATTTTTT AAAAGATCGT TGTTTCTTCT TCATCATGCT GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC ACATAAGCTT TGGTTTTCTC ACTCTCCAAG CCCTCTATAT AAACAAATAT TGGAGTGAAG TTGTTGCATA ACTTGCATCG AACAATTAAT AGAAATAACA GAAAATTAAA AAAGAAATAT G, li

Lbcl sekvenssillä: 17 91083 TTCTCTTAAT ACAATGGAGT TTTTGTTGAA CATACATACA TTTAAAAAAA AATCTCTAGT GTCTATTTAC CCGGTGAGAA GCCTTCTCGT GTTTTACACA CTTTAATATT ATTATATCCT CAACCCCACA AAAAAGAATA CTGTTATATC TTTCCAAACC TGTAGATTTA TTTATTTATT TATTTATTTT TACAAAGGAG ACTTCAGAAA AGTAATTACA TAAAGATAGT GAACATCATT TTATTTATTA TAATAAACTT TAAAATCAAA CTTTTTTATA TTTTTTGTTA CCCTTTTCAT TATTGGGTGA AATCTCATAG TGAAGCCATT AAATAATTTG GGCTCAAGTT TTATTAGTAA AGTCTGCATG AAATTTAACT TAACAATAGA GAGAGTTTTC GAAAGGGAGC GAATGTTAAA AAGTGTGATA TTATATTTTA TTTCGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA CATACAAAAA AATACTTTTA AATTCAGAAT AATACTTAAA ATATTTATTT GCTTAATTGA TTAACTGAAA ATTATTTGAT TAGGATTTTG AAAAGATCAT TGGCTCTTCG TCATGCCGAT TGACACCCTC CACAAGCCAA GAGAAACTTA AGTTGTAAAC TTTCTCACTC CAAGCCTTCT ATATAAACAT GTATTGGATG TGAAGTTATT GCATAACTTG CATTGAACAA TAGAAAATAA CAAAAAAAAG TAAAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG,

Lbc2 sekvenssillä: TCGAGTTTTT ACTGAACATA CATTTATTAA AAAAAACTCT CTAGTGTCCA TTTATTCGGC GAGAAGCCTT CTCGTGCTTT ACACACTTTA ATATTATTAT ATCCCCACCC CCACCAAAAA AAAAAAAACT gttatatctt TCCAGTACAT TTATTTCTTA TTTTTACAAA GGAAACTTCA CGAAAGTAAT TACAAAAAAG ATAGTGAACA TCATTTTTTT AGTTAAGATG AATTTTAAAA TCACACTTTT TTATATTTTT TTGTTACCCT TTTCATTATT GGGTGAAATC TCATAGTGAA ACTATTAAAT AGTTTGGGCT CAAGTTTTAT TAGTAAAGTC TGCATGAAAT TTAACTTAAT AATAGAGAGA GTTTTGGAAA GGTAACGAAT GTTAGAAAGT GTGATATTAT TATAGTTTTA TTTAGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA TTGACAATTT ATTTTTAAAA TTCAGAGTAA TACTTAAATT ACTTATTTAC TTTAAGATTT TGAAAAGATC ATTTGGCTCT TCATCATGCC GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC TTAAGTTGTA ATTTTTCTAA CTCCAAGCCT TCTATATAAA CACGTATTGG ATGTGAAGTT GTTGCATAAC TTGCATTGAA CAATAGAAAT AACAACAAAG AAAATAAGTG AAAAAAGAAA TATG,

Lbc3 sekvenssillä: 18 TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT GTAGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA CAGAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG.

Toinen esimerkki sellaisesta DNA-sekvenssistä on sekvenssi/ joka on identtinen YEP Lb CAT-geenin esisek-venssin kanssa/ on siitä peräisin tai sisältää sen, jolla geenillä on sekvenssi:

TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT GTAGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA CAGAAAAGTA GAATTCTAAA ATG

II

91083 19

Keksintö koskee lisäksi mitä tahansa plasmidia, jota on tarkoitus käyttää keksinnön mukaisen menetelmän suorituksessa, ja jolle on ominaista se, että se sisältää ensimmäisen DNA-sekvenssin kuten aikaisemmin määriteltiin, tai toisen DNA-sekvens-sin ja toisen DNA-sekvenssin yhdistelmän, myös kuten aikaisemmin määriteltiin. Sopivia keksinnön mukaisia plasmideja ovat YEP Lb CAT ja YEP 5 Lb Km. Keksinnön mukaiset plasmidit mahdollistavat halutun geenituotteen suuren ilmenemisen liittämällä koodaavia sekvenssejä näitä geenituotteita varten.

Esimerkki 1

Soijapavun leghemoglobiinigeenien edeltävien 5'-alueiden sek- venssimääritys_

Soijapapu (glysiini maks. var. evans)-geenikokoelmasta annetaan käyttöön neljä soijapavun leghemoglobiinigeeniä Lba, Lbcl, Lbc2 ja Lbc3, kuten kuvailivat Jensen, E. 0. et ai., Nature Voi.

291, no 3817, 677-679 (1981). Neljän soijapavun leghemoglo-biinigeenin edeltävät 5'-alueet eristetään, kuten kuvaili Jensen, E. 0., Ph D-väitöskirja, Institut for Molekylaer Biologi, Ärhus Universitet (1985), ja neljän edeltävän 5'-alueen sekvenssit määritetään käyttämällä dideoksiketjuterminaa-tiomenetelmää kuten kuvaili Sanger, F., J.Mol. Bio. 143, 161 (1980) ja ilmaistaan sekvenssikaaviossa.

Esimerkki 2 YEP Lb CAT:n konstruointi

Konstruoiminen on suoritettu prosessijaksojen järjestyksessä kuten jäljempänä on kuvailtu:

Lbc3-geenin alakloonaus

Lbc3-geeni eristettiin soijapapu-DNA-kokoelman 12 kb:n EcoRI-restriktiokappaleena, jota ovat kuvailleet Wiborg et ai., Nucl. Acids. Res. 10, 3487. Osa kappaleesta on esitettynä kaavion 2 yläosassa. Tämä kappale liuotettiin entsyymien avulla ilmaisten myöhempi liittäminen pBR322:een kuten on esitetty kaaviossa. Muodostuneet plasmidit Lbc3HH ja Lbc3HX liuotettiin myöhemmin PvuIIilla ja liitettiin uudelleen, josta oli tuloksena kaksi plasmidia nimettynä pLpHH ja pLpHX.

20

Lbc3-geenin edeltävien 51-sekvenssien alakloonaus Tätä tarkoitusta varten käytettiin plasmidia pLpHH, kuten esitetään kaaviossa 3. Plasmidi avattiin PvuII:n avulla, ja sitä käsiteltiin eksonukleaasilla Bal31. Reaktio pysäytettiin eri aikoina, ja lyhennetyt plasmidit liitettiin pBR322:n sekvens-seihin. Näitä sekvenssejä on käsitelty etukäteen kuten on esitetty kaaviossa 3, siten, että niiden toisessa päässä oli DNA- , . TTC --- sekvenssi

Liittämisen jälkeen tapahtui liuottamisen EcoRI:llä, ja sekvenssit, jotka sisälsivät edeltäviä 5'-sekvenssejä, liitettiin EcoRI:llä liuotettuun pBR322:een. Nämä plasmidit transformoitiin E. coliin K803, ja plasmidit transformanteissa testattiin sekvenssianalyysin avulla. Yksi plasmidi, p213 5'Lb, eristettynä yhdestä transformantista, sisälsi edeltävän 5'-sekvenssin, joka päättyi 7 emäsparia ennen Lb ATG-lähtökodonia sillä tavalla, että sekvenssi on seuraava: 2 kb -5' edeltävä --- AAAGTAGAATTCTAAAATG Lbc3- sekvenssi.

Lbc3-geenin edeltävän 3'-alueen alakloonaus Tätä tarkoitusta varten käytettiin plasmidia pLpHX, joka liuotettiin XhoII:lla. Päät täytettiin osittain, ja ylimäärä DNA: -sta poistettiin, kuten esitetään kaaviossa 4. Osoitettu sekvenssi liitettiin plasmidiin pBR322, jota oli esikäsitelty, kuten kaaviossa on esitetty. Konstruktio transformoitiin E. coliin K803. Yksi transformanteista sisälsi plasmidin, jota nimitettiin Xho2a-3'Lb:ksi. Koska XhoII tunnistussekvenssi on sijoittunut välittömästi Lp-pysäytyskodonin jälkeen, vrt. kaavio 2, plasmidi sisälsi noin 900 emäsparia edeltävästä 3'-alueesta, ja sekvenssi alkoi GAATTCTACAA---.

Lb-promoottorikasetin konstruointi

EcoRI/Sphl-sekvenssi Xho2a-3'Lbrstä sekoitettiin BamHl/EcoRI-sekvenssin kanssa p 213-5'Lb:stä. Nämä kaksi sekvenssiä liitettiin BamHI/SphI-katkaisupisteiden kautta pBR322-johdannaiseen, 91083 21 josta EcoRI-tunnistussekvenssi oli poistettu, vrt. kaavio 4. Ligatoidut plasmidit transformoitiin E.coliin K803. Yksi plas-midi yhdessä transformantissa sisälsi oikeita sekvenssejä, ja sitä nimitettiin plasmidiksi pEJLb 5'-3'-l.

Kimeerisen Lh/cat-geenin konstruointi pBR322:n CAT-geeni eristettiin useana pienempänä restriktiosek-venssinä kuten esitetään kaaviossa 5. Koodaava 5'-alue eristettiin AluI-sekvenssinä, joka myöhemmin liitettiin plasmidiin pBR322, ja käsiteltiin kuten kaaviossa on ilmaistu. Tämä transformoitiin E. coliin K803, ja valikoitu transformantti sisälsi plasmidin, jota nimitettiin AluIIiksi. Koodaava 3'-alue eristettiin Taql-sekvenssinä. Tätä sekvenssiä käsiteltiin eksonuk-leaasilla Bal31, minkä jälkeen lisättiin EcoRI-linkkereitä. Sitten seurasi liuotus EcoRI:llä ja liittäminen EcoRI:llä liuotettuun plasmidiin pBR322. Jälkimmäinen transformoitiin E. coliin K803, ja transformantit analysoitiin. Yksi plasmidi,

Taql2, sisälsi CAT-geenin koodaavan 3'-alueen plus23 emäsparin edeltäviä 3'-sekvenssejä päättyen siten myöhemmin seuraavaan sekvenssiin - CCCCGAATTC. Myöhemmin seuraavat sekvenssit liitettiin yhdessä EcoRI:llä liuotettuun plasmidiin pEJLb5'-3'-1: EcoRI/PvuII-sekvenssi AluII:sta, PvuII/Ddel-sekvenssi pBR322:sta ja Ddel/EcoRI-sekvenssi Taq 12:sta. Jälkimmäinen transformoitiin E coliin K803. Valikoitu transformantti sisälsi oikean plasmidin, jota nimitettiin pEJLb5'-3'-CATrksi.

Kimeerisen T.h/ CAT -geenin kloonaus hiivan plasmidissa Tämä kimeerinen geeni eristettiin plasmidin pEJLbS'-3'-CAT 15 sekvenssistä BamHI/Sphl ja liitettiin hiivan plasmidiin YEP24, joka oli katkaistu samoilla entsyymeillä. Transformoinnin E coliin K803 jälkeen tutkittiin valikoitua transformanttia. Se sisälsi plasmidin YEP LbCÄT, joka esitetään kaaviossa 6. Tämä plasmidi transformoitiin edelleen hiivakantoihin Saccharomyces cerevisiae DBY747 ja ΊΜ1.

22

Esimerkki 3 YEP 5Lb Km:n konstruointi

Neomysiinifosfotransferaasi (NPTII)-geeni eristettiin pKM2:sta (Beck, et ai., Gene 19, 327). Tämän geenin koodaava 5'-alue eristettiin Sau3A-sekvenssinä, kuten on esitetty kaaviossa 7, ja liitettiin myöhemmin pBR322:een, mistä oli tuloksena plasmi-di, nimettynä SAU 13. Koodaava ja edeltävä 3'-alue geenistä NPTII eristettiin PvuII-sekvenssinä. Jälkimmäinen liitettiin yhdessä plasmidin EcoRI/PvuII-sekvenssin kanssa EcoRI/PvuII:lla liuotettuun plasmidiin pEJLb 5'-3'-l. Transformaation yhteydessä E. coliin K803, valikoitiin transformantti, jossa oli oikea plasmidi, pEJLb 5'Km 1. Tämä plasmidi liuotettiin myöhemmin BamHI:n avulla ja osittain PvuIIrn avulla sellaisella tavalla, että koko edeltävä 5'-Lb-sekvenssi + koodaava NPTII-sekvenssi olivat läsnä BamHI/PvuII-sekvenssissä. Tämä sekvenssi liitettiin BamHl/PvuII:11a liuotettuun YEP24:ään, mistä oli tuloksena plasmidi YEP 5Lb Km, esitettynä kaaviossa 8. Tämä plasmidi transformoitiin hiivakantaan Saccharomyces cerevisiae Tmi.

Esimerkki 4

Hiilenlähteen vaikutus CAT:n ilmenemiseen

Saccharomyces cerevisiaeta DBY747, joka sisälsi plasmidin YEP Lb CAT, kasvatetaan minimialustassa + 2 % hiilenlähdettä. Solut kerätään talteen solutiheydessä 5 x 106 solua per ml. CAT-ak-tiivisuus mitataan kuten kuvailevat Walker, Edlund, Boulet & Rutter, Nature, 306. 557 (1983).

Taulukossa 1 CAT-aktiivisuus on ilmaistu hiilenlähteen funktiona. Korkein aktiivisuus, joka saatiin kasvattamalla sukkinaa-tilla ja glyserolilla, on keinotekoisesti asetettu 100 %:ksi.

Taulukko 1

Hiilenlähde Aktiivisuus

Sukkinaatti 100

Glyseroli 100

Glukoosi 28

Sakkaroosi 18 11 91083 23

Esimerkki 5

Hemiprekursoreiden ja hemianalogien vaikutus geenin ilmenemisen indusoitumiseen_

Saccharomyces cerevisiaeta TMI, joka sisältää plasmidin YEP Lb CAT, kasvatetaan minimaalialustässä + 2 % glukoosia + 0,1 % TweenR:iä + 20 /ug/ml ergosterolia + 50 /ug/ml metioniinia, mukana myös yksi seuraavista hemianalogeista tai hemiprekurso-reista. Deuteroporfyriini IX (dp):ää ja protoporfyriiniä (pp), vastaavasti lisätään loppukonsentraatioksi 5 /ug/ml. Hemiiniä lisätään loppukonsentraatioon 5 /ug/ml. δ-aminolevuliinihappoa, δ-ALA, lisätään loppukonsentraatioon 50 /ug/ml.

Taulukossa 2 on CAT-aktiivisuus osoitettu hemiprekursorin ja hemianalogin aktiivisuutena, vastaavasti. Korkein saatu aktiivisuus lisäämällä δ-ALA:aa tai dp:tä on asetettu keinotekoisesti 100 %:ksi.

Taulukko 2

Induktori CAT-aktiivisuus

Glukoosi + δ-ALA 100

Glukoosi + dp 100

Glukoosi + pp 50

Glukoosi + hemiini 25

Glukoosi 5

Esimerkki 6

Linkkerien liittäminen esisekvenssiin

Kaksi synteettistä DNA-linkkeriä on liitetty; yksi välittömästi lähtökodonin yläpuolelle, joka sisältää entsyymin Bglll tunnis-tussekvenssin, ja yksi vastavirtaan CAP-liitospaikasta, joka sisältää tunnistussekvenssin Kpnl:lle, vrt. kaavio 9, jossa uutta konstruktiota pEJ5'-3'-CAT101 verrataan alkuperäiseen konstruktioon.

Kahden konstruktion ilmenemisen vertailu osoittaa (testi kuten esimerkissä 5): 24 glukoosi glukoosi + hemi induktio CAT15 0,11 6,01 55x CAT101 0,22 1,72 8x

Numerot ilmoittavat nmoolia reagoinutta kloramfenikolia/mg pro-teiinia/min.

Tämä osoittaa sen, että kaksi spesifistä muutosta 5'-alueessa aiheuttaa hemi-induktion putoamisen tasolta 55x tasolle 8x.

Esimerkki 7

Lbc3:n 5'-alueen korvaaminen vastaavalla alueella S. cere- visiaen ILVl-geenistä_

Koko Lbc3 5'-alue poistetaan CAT lOlrstä katkaisemalla BamHI:-llä ja Bglll:lla. Tilalle liitetään 765 emäsparin DNA-sekvenssi ILVl-geenistä, joka sisältää promoottori- ja esisekvenssin.

Tätä konstruktiota nimitetään PEJ CAT-BD.

Toisessa konstruktiossa poistetaan Lbc3-promoottori esisekvenssin jäädessä jäljelle. Tämä tehdään katkaisemalla CAT101 Bam-HI:llä ja Kpnlrllä. Tämä sekvenssi korvataan 670 emäsparin sekvenssillä ILVlistä, promoottori ilman esisekvenssiä. Tätä plas-midia nimitetään PEJ CAT-KN.

Konstruktioita kuvataan kaavamaisesti: -promoottori esisekvenssi koodaava sekvenssi -Hl lii H'· . - - -

CAT-BD ILVl CAT

i — ---- CAT-KN ILVl Lbc3 _CAT_ -Hillin1 -

Sekvenssien vertailua kuvataan kaaviossa 10.

91083 25

Ilmenemistesti glukoosi glukoosi + hemi induktio CAT-BD 1089 1162 CAT-KN 789 1580 2x

Samat yksiköt kuin aikaisemmissa testeissä.

Ainoa ero kahden konstruktion välillä on esisekvenssin alkuperä. Tulos osoittaa, että Lbc3-esisekvenssi on välttämätön induktiolle. Iriduktiotaso ei kuitenkaan ole niin korkea kuin CATlOl:ssä, joka on lähtömateriaali; tämä voi johtua tosiseikasta, että konstruktio alkaa 13 nukleotidia lähempänä ATG:tä, ja siitä puuttuu näin ollen 13 mRNA-nukleotidia, jotka voivat olla tärkeitä induktion kannalta.

Kaikki nämä kokeet osoittavat selvästi, että hemi-induktio liittyy Lbc3-esisekvenssiin.

On selvää, ettei esillä olevan keksinnön patenttisuoja rajoitu tässä ilmaistuihin esimerkkeihin.

Näin ollen ei keksinnön mukaisesti käytetä yksinomaan edeltäviä 5'-alueita soijapavun leghemoglobiinigeeneistä. On hyvin tunnettua, että kaikkien hernekasvien leghemoglobiinigeeneillä on sama aktiivisuus, vrt. Appleby (1974) teoksessa The Biology of Nitrogen Fixation, Quispel. A. Ed. North-Holland Publishing Company, Amsterdam Oxford, sivut 499-554, ja edelleen on osoitettu salkopavun PvLbl-geenin osalta, että selvä homologia-aste on olemassa soijapavun Lbc3:n kanssa. Näin ollen keksintö käsittää leghemoglobiinigeenien 5'-alueiden käyttämisen kaikista kasveista.

Keksinnön mukaisesti on myös mahdollista käyttää sellaisia sekvenssejä kasveista, eläimistä tai hiivasta, jotka luonnollisissa olosuhteissa toteuttavat tai välittävät uutta säätelyakti-viteettia, jota on kuvailtu esillä olevan keksinnön mukaisesti.

26

Viimeksi mainittu soveltuu erityisesti sellaisiin sekvenssei-hin, joita voidaan eristää geenikokoelmien DNA-sekvensseistä hydridisaatiolla soijapavun leghemoglobiinigeenien edeltävien 5'-alueiden merkittyjen sekvenssien kanssa.

On hyvin tunnettua, että on mahdollista muuttaa nukleotidisek-venssejä edeltävien 5'-alueiden ei-välttämättömissä ala-alueissa, ilman, että viimeksi mainittu aiheuttaa muuttuneen promoot-toriaktiivisuuden ja säädeltävyyden. On myös hyvin tunnettua, että muuttamalla edeltävien 5'-alueiden tärkeiden ala-alueiden sekvenssejä, on mahdollista muuttaa sidosaffiniteetteja nukle-otidisekvenssien ja tekijöiden tai säätelyaineiden välillä, jotka ovat välttämättömiä transkriptionaaliselle käyntiinpanol-le ja translationaaliselle käyntiinpanolle, ja että on niin muodoin mahdollista parantaa promoottoriaktiivisuutta ja/tai säädeltävyyttä. Esillä olevan keksinnön piiriin kuuluu myös tietysti edeltävien 5'-alueiden sellaisten muutettujen sekvenssien käyttäminen. Erityisesti voidaan mainita esisekvenssien käyttäminen, joita on laajennettu yli luonnollisen pituuden, edellyttäen että sellaisten sekvenssien käyttäminen tekee halutun geenituotteen ilmenemisestä esillä olevan keksinnön mukaisen uuden säätelyn kohteen.

Il

Claims (20)

27 91083

1. Menetelmä geenien ilmentämiseksi hiivassa saattamalla hiivasoluun yhdistelmä-DNA-sekvenssi, joka sisältää sekä ilmennettävän geenin että edeltävän 5'-alueen, joka käsittää promoottorisekvenssin, ja viljelemällä transformoituja hiivasoluja omassa kasvualustassa, tunnettu siitä, että käytetään edeltävää 5'-aluetta kasvileghemoglobiinista, joka käsittää ensimmäisen DNA-sekvenssin, joka sisältää promoottorisekvenssin ja toisen DNA-sekvenssin, joka sisältää signaa-lisekvenssin, jota säätelevät posttranskriptionaalisella tasolla hemi, hemianalogit tai hemiprekursorit, ja että heinin solunsisäinen konsentraatio kasvaa, ja siitä, että kasvualustaan lisätään sellaisia hiililähteitä, jotka saavat aikaan kasvaneen hemin solunsisäisen konsentraation.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäisenä DNA-sekvenssinä käytetään bakteerista eristettyä DNA-sekvenssiä tai kasvin DNAista in vitro syntetisoitua DNA:ta, joka sisältää promoottorisekvenssin yhdistettäväksi toiseen DNA-sekvenssiin.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toisena DNA-sekvenssinä käytetään bakteerista eristettyä DNA-sekvenssiä tai kasvin DNArsta in vitro syntetisoitua, joka sisältää signaalisekvenssin yhdistettäväksi ensimmäiseen DNA-sekvenssiin.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hiilenlähde valitaan ryhmästä glyseroli, sukkinaat-ti tai etanoli.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohotetaan hemin solunsisäistä konsentraatiota lisäämällä kasvualustaan yksi tai useampia aineita, jotka on valittu ryhmästä, johon kuuluvat hemi, hemianalogit ja hemiprekursorit . 28

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään hemianalogina yhdistettä deuteroporfyrii-ni IX ja/tai hemiprekursorina yhdistettä δ-aminolevuliini-happo.

7. Patenttivaatimuksen l mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään DNA-sekvenssiä, joka on identtinen soija-pavun leghemoglobiinigeenien edeltävien 5'-alueiden kanssa.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että edeltävä 5'-alue on identtinen Lba-geenin edeltävien 5'-alueiden kanssa, jolla geenillä on sekvenssi: GAGATACATT ATAATAATCT CTCTAGTGTC TATTTATTAT TTTATCTGGT GATATATACC TTCTCGTATA CTGTTATTTT TTCAATCTTG TAGATTTACT TCTTTTATTT TT AT AAAAAA GACTTTATTT TTTTAAAAAA AATAAAGTGA ATTTTGAAAA CATGCTCTTT GACAATTTTC TGTTTCCTTT TTCATCATTG GGTTAAATCT CATAGTGCCT CTATTCAATA ATTTGGGCTC AATTTAATTA GTAGAGTCTA CATAAAATTT ACCTTAATAG TAGAGAATAG AGAGTCTTGG AAAGTTGGTT TTTCTCGAGG AAGAAAGGAA ATGTTAAAAA CTGTGATATT TTTTTTTTGG ATTAATAGTT ATGTTTATAT GAAAACTGAA AATAAATÄAA CTAACCATAT TAAATTTAGA ACAACACTTC AATTATTTTT TTAATTTGAT TAATTAAAAA ATTATTTGAT TAAATTTTTT AAAAGATCGT TGTTTCTTCT TCATCATGCT GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC ACATAAGCTT TGGTTTTCTC ACTCTCCAAG CCCTCTATAT AAACAAATAT TGGAGTGAAG TTGTTGCATA ACTTGCATCG AACAATTAAT AGAAATAACA GAAAATTAAA AAAGAAATAT G.

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että edeltävä 5'-alue on identtinen Lbcl-geenin edeltävien 5'-alueiden kanssa, jolla geenillä on sekvenssi: TTCTCTTAAT ACAATGGAGT TTTTGTTGAA CATACATACA TTTAAAAAAA AATCTCTAGT GTCTATTTAC CCGGTGAGAA GCCTTCTCGT GTTTTACACA CTTTAATATT ATTATATCCT CAACCCCACA AAAAAGAATA CTGTTATATC TTTCCAAACC TGTAGATTTA TTTATTTATT TATTTATTTT TACAAAGGAG ACTTCAGAAA AGTAATTACA TAAAGATAGT GAACATCATT TTATTTATTA TAATAAACTT TAAAATCAAA CTTTTTTATA TTTTTTGTTA CCCTTTTCAT TATTGGGTGA AATCTCATAG TGAAGCCATT AAATAATTTG GGCTCAAGTT TTATTAGTAA AGTCTGCATG AAATTTAACT TAACAATAGA GAGAGTTTTC GAAAGGGAGC GAATGTTAAA AAGTGTGATA TTATATTTTA TTTCGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA CATACAAAAA AATACTTTTA AATTCAGAAT AATACTTAAA ATATTTATTT GCTTAATTGA TTAACTGAAA ATTATTTGAT TAGGATTTTG AAAAGATCAT TGGCTCTTCG TCATGCCGAT TGACACCCTC CACÄAGCCAA GAGAAACTTA AGTTGTAAAC TTTCTCACTC CAAGCCTTCT atataaacat gtattggatg tgaagttatt gcataacttg CATTGAACAÄ TAGAAAATAA CAAAAAAAAG TAAAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG. 91083 29

10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että edeltävä 5'-alue on identtinen Lbc2-geenin edeltävien 5'-alueiden kanssa, jolla geenillä on sekvenssi: TCGAGTTTTT ACTGAACATA CATTTATTAA AAAAAACTCT CTAGTGTCCA TTTATTCGGC GAGAAGCCTT CTCGTGCTTT ACACACTTTA ATATTATTAT ATCCCCACCC CCACCAAAAA AAAAAAAACT GTTATATCTT TCCAGTACAT TTATTTCTTA TTTTTACAAA GGAAACTTCA CGAAAGTAAT TACAAAAAAG ATAGTGAACA TCATTTTTTT AGTTAAGATG AATTTTAAAA TCACACTTTT TTATATTTTT TTGTTACCCT TTTCATTATT GGGTGAAATC TCATAGTGAA ACTATTAAAT AGTTTGGGCT CAAGTTTTAT TAGTAAAGTC TGCATGAAAT TTAACTTAAT AATAGAGAGA GTTTTGGAAA GGTAACGAAT GTTAGAAAGT GTGATATTAT TATAGTTTTA TTTAGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA TTGACAATTT ATTTTTAAAA TTCAGAGTAA TACTTAAATT ACTTATTTAC TTTAAGATTT TGAAAAGATC ATTTGGCTCT TCATCATGCC GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC TTAAGTTGTA ATTTTTCTAA CTCCAAGCCT TCTATATAAA CACGTATTGG ATGTGAAGTT GTTGCATAAC TTGCATTGAA CAATAGAAAT AACAACAAAG AAAATAAGTG AAAAAAGAAA TATG.

11. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että edeltävä 5'-alue on identtinen Lbc3-geenin edeltävien 5'-alueiden kanssa, jolla geenillä on sekvenssi: TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT GTAGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATÄA CAGAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG.

12. DNA-sekvenssi, jota voidaan käyttää yhdistelmä-DNA-segmentissä patenttivaatimusten l-ll mukaisten menetelmien suorittamisessa, tunnettu siitä, että se käsittää ensimmäisen DNA-sekvenssin, joka sisältää promoottorisekvenssin, ja toisen DNA-sekvenssin, joka sisältää signaalisekvenssin, jota säätelevät posttranskriptionaalisella tasolla hemi, hemi- 30 analogit tai hemiprekursorit, ja joka on identtinen kasvi -leghemoglobiinin edeltävän 5'-alueen kanssa.

13. DNA-sekvenssi, jota käytetään patenttivaatimuksen 12 mukaisen menetelmän suorittamisessa, tunnettu siitä, että se on identtinen soijapavun leghemoglobiinigeenien signaalisek-venssin kanssa.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se on identtinen Lba-geenin edeltävien 5'-alueiden kanssa, jolla geenillä on sekvenssi: GAGATACATT ATAATAATCT CTCTAGTGTC TATTTATTAT TTTATCTGGT GATATATACC TTCTCGTATA CTGTTATTTT TTCAATCTTG TAGATTTACT TCTTTTATTT TTATAAAAAA GACTTTATTT TTTTAAAAAA AATAAAGTGA ATTTTGAAAA CATGCTCTTT GACAATTTTC TGTTTCCTTT TTCATCATTG GGTTAAATCT CATAGTGCCT CTATTCAATA ATTTGGGCTC AATTTAATTA GTAGAGTCTA CATAAAATTT ACCTTAATAG TAGAGAATAG AGAGTCTTGG AAAGTTGGTT TTTCTCGAGG AAGAAAGGAA ATGTTAAAAA CTGTGATATT TTTTTTTTGG ATTAATAGTT ATGTTTATAT GAAAACTGAA AATAAATAAA CTAACCATAT TAAATTTAGA ACAACACTTC AATTATTTTT TTAATTTGAT TAATTAAAAA ATTATTTGAT TAAATTTTTT AAAAGATCGT TGTTTCTTCT TCATCATGCT GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC ACATAAGCTT TGGTTTTCTC ACTCTCCAAG CCCTCTATAT AAACÄAATAT TGGAGTGAAG TTGTTGCATA ACTTGCATCG AACAATTAAT AGAAATAACA GAAAATTAAA AAAGAAATAT G.

15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se on identtinen Lbcl-geenin edeltävien 5'-alueiden kanssa, jolla geenillä on sekvenssi: TTCTCTTAAT ACAATGGAGT TTTTGTTGAA CATACATACA TTTAAAAAAA AATCTCTAGT GTCTATTTAC CCGGTGAGAA GCCTTCTCG7 G7TTTACACA CTTTAATATT ATTATATCCT CAACCCCACA AAAAAGAATA CTGTTATATC TTTCCAAACC TGTAGATTTA TTTATTTATT TATTTATTTT TACAAAGGAG ACTTCAGAAA AGTAATTACA TAAAGATAGT GAACATCATT T7ATTTAT7A TAATAAACTT TAAAATCAAA CTTTTTTATA TTTTTTGTTA CCCTTTTCAT TATTGGGTGA AATCTCATAG TGAAGCCATT AAATAATTTG GGCTCAAGTT TTATTAGTAA AGTCTGCATG AAATTTAACT TAACAATAGA GAGAGTTTTC GAAAGGGAGC GAATGTTAAA AAGTGTGATA TTATATTTTA TTTCGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA CATACAAAAA AATACTTTTA AATTCAGAAT AATACTTAAA ΑΤΛΤΤΤΑΤΤΤ GCTTAATTGA TTAACTGAAA ATTATTTGAT TAGGATTTTG AAAAGATCAT TGGCTCTTCG TCATGCCGAT TGACACCCTC CACAAGCCAA GAGAAACTTA AGTTGTAAAC TTTCTCACTC CAAGCCTTCT ATATAAACAT GTATTGGATG TGAAGTTATT GCATAACTTG CATTGAACAA TAGAAAATAA CAAAAAAAAG TAAAAAAGTA GAAaAGAAAT ATG. 31 91083

16. Patenttivaatimuksen 13 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se on identtinen Lbc2-geenin edeltävien 5'-alueiden kanssa, jolla geenillä on sekvenssi: TCGAGTTTTT ACTGAACATA CATTTATTAA AAAAAACTCT CTAGTGTCCA TTTATTCGGC GAGAAGCCTT CTCGTGCTTT ACACACTTTA ATATTATTAT ATCCCCACCC CCACCAAAAA AAAAAAAACT GTTATATCTT TCCAGTACAT TTATTTCTTA TTTTTACAAA GGAAACTTCA CGAAAGTAAT TACAAAAAAG ATAGTGAACA TCATTTTTTT AGTTAAGATG AATTTTAAAA TCACACTTTT TTATATTTTT TTGTTACCCT TTTCATTATT GGGTGAAATC TCATAGTGAA ACTATTAAAT AGTTTGGGCT CAAGTTTTAT TAGTAAAGTC TGCATGAAAT TTAACTTAAT AATAGAGAGA GTTTTGGAAA GGTAACGAAT GTTAGAAAGT GTGATATTAT TATAGTTTTA TTTAGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA TTGACAATTT ΑΤΤΤΤΤΑΑΛΑ TTCAGAGTAA TACTTAAATT ACTTATTTAC TTTAAGATTT TGAAAAGATC ATTTGGCTCT TCATCATGCC GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC TTAAGTTGTA ATTTTTCTAA CTCCAAGCCT TCTATATAAA CACGTATTGG ATGTGAAGTT GTTGCATAAC TTGCATTGAA CAATAGAAAT AACAACAAAG AAAATAAGTG AAAAAAGAAA TATG.

17. Patenttivaatimuksen 13 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se on identtinen Lbc3-geenin edeltävien 5'-alueiden kanssa, jolla geenillä on sekvenssi: TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT GTAGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ΑΤΛΤΑΤΤΑΑΑ ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA CAGAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG.

18. Yhdistelmä-DNA-sekvenssi käytettäväksi patenttivaatimusten 1-12 mukaisissa menetelmissä, tunnettu siitä, että se sisältää sen geenin, jota halutaan ilmentää sekä minkä tahansa patenttivaatimuksen 12-17 mukaisen DNA-sekvenssin.

19. Plasmidi, jota voidaan käyttää patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä kloramfenikoli-asetyyli-transferaa-sin (CAT) valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se on nimet- 32 ty YEP Lb CAT:ksi ja ilman CAT-geeniä sisältää promootto-risekvenssin ja signaalisekvenssin DNA-sekvenssissä, joka sisältää edeltävän soijapapuleghemoglobiinigeenin Lbc3 5'-alueen ja jonka rakenne on esitetty kaaviossa 6.

20. Plasmidi, jota voidaan käyttää patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä neomysiinifosfotransferaasi (NPT) II:n valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se on nimetty YEP 5 Lb Km:ksi ja ilman NPT II-geeniä sisältää promoottorisek-venssin ja signaalisekvenssin DNA-sekvenssissä, joka sisältää edeltävän soijapapuleghemoglobiinigeenin Lbc3 5'-alueen ja jonka rakenne on esitetty kaaviossa 8.