DK162399B - Fremgangsmaade til ekspression af gener i baelgplanteceller, dna-fragment, rekombineret dna-fragment samt plasmid til brug ved udoevelsen af fremgangsmaaden - Google Patents

Description

DK 162399 B

i

Opfindelsens tekniske område.

Opfindelsen angår en særlig fremgangsmåde til ekspression af gener i bælgplanteceller ved transformer ing af cellerne med et 5 rekombineret DNA-fragment, der indeholder dels det gen, der ønskes udtrykt, dels en 5'-flankerende region, hvori indgår en promotor, og eventuelt en 3'-flankerende region, og dyrkning af de transformerede celler i et egnet vækstmedium; et Defragment til brug i et rekombineret DNA-f ragment ved frem-10 gangsmåden; et rekombineret DNA-fragment til brug ved fremgangsmåden; samt et plasmid til brug ved fremgangsmåden.

Med begrebet "rodknoldspecifikke gener" menes i forbindelse med den foreliggende opfindelse plantegener, som kun er aktive 15 i bælgplanters rodknolde, eller gener, hvis udtryk er forøget i rodknolde. Rodknoldsspecifikke plantegener udtrykkes på bestemte udviklingstrin og aktiveres koordineret som led i den symbiose, hvorved der sker en nitrogenfiksering og optagelse af det fikserede nitrogen i plantens metabolisme.

20

Med begrebet "inducerbar piantepromotor" forstås generelt en promotorakt iv 5'-flankerende region fra plantegener, som kan induceres fra en lav aktivitet til en høj aktivitet. I forbindelse med den foreliggende opfindelse skal der ved "inducerbar 25 piantepromotor" forstås en sådan promotor, som er afledt af, indeholdt i eller identisk med en 5'-f1 ankerende region med en ledersekvens fra rodknoldspecifikke gener og som kan fremme og regulere ekspressionen af et gen, som karakter i seret i forbindelse med den foreliggende opfindelse.

30

Med begrebet "ledersekvens" forstås generelt en DNA-sekvens, som transskriberes til en mRNA, men ikke yderligere translate-res til protein. Leder-sekvensen består således af DNA-frag-mentet fra transskriptionsstart til ATG-koden, som udgør 35 translationsstart. Ved en "leder-sekvens" forstås i forbindelse med den foreliggende opfindelse et kort DNA-fragment, som er indeholdt i den ovenfor beskrevne inducerbare plantepromo- 2

DK 162399 B

tor, og som typisk har 40-70 basepar, og som kan indeholde sekvenser, der er mål for en posttransskriptionel regulering.

Med begrebet "promotorregion" forstås i forbindelse med den 5 foreliggende opfindelse et DNA-fragment, som indeholder en promotor, som omfatter målsekvenser for RNA-polymerase samt eventuelle aktiveringsområder, som indeholder målsekvenser for transskriptionseffektorstoffer. I den foreliggende opfindelse kan målsekvenser for transskriptionseffektorer også være belt) liggende 3' for promotoren, dvs. i et rodknoldsspecifikt gens kodesekvenser, intervenerende sekvenser eller på genets 3'-flankerende region.

Desuden anvendes en række for fagfolk almindeligt kendte mole-15 kylærbiologiske begreber, herunder de nedenfor anførte.

CAP-addi tionspunkt; Det nucleotid, hvor 7-methyl-GTP adderes på den tilsvarende mRNA.

20 DNA-sekvens eller DNA-seqment: En lineær række af nucleoti- der, som er forbundet til hinanden via phosphordiesterbindin-ger mellem 3'- og 5'-carbonatomer i nabopentoser.

Ekspressi on: Den proces, et strukturelt gen undergår til frem-25 stilling af et polypeptid. I processen indgår transskription og translation samt eventuelle posttranslatoriske modifikationer.

Flankerende regioner·; DNA-sekvenser, som omkranser kodende re-30 gioner. 5'-f1 ankerende regioner indeholder en promotor. 3'-flankerende regioner kan indeholde en transskriptionstermina-tor m.m.

Gen: En DNA-sekvens bestående af tre eller fire dele, nemlig 35 (i) den kodende sekvens for genproduktet, (2) de sekvenser i promotorregionen, som styrer, hvorvidt genet vil blive udtrykt, (3) de sekvenser i 3'-enden, som betinger transskrip-

DK 162399 B

3 tionsterminering og eventuelt polyadenylen’ng, samt evt. (4) intervenerende sekvenser.

Homolog rekombination; En rekombination mellem sekvenser, som 5 viser en høj grad af homologi.

Intervenerende sekvenser: DNA-sekvenser, som optræder i et gen, og som ikke koder for noget peptidfragment. De intervenerende sekvenser transskriberes til præ-mRNA og elimineres ved modi-10 fikation af præ-mRNA til mRNA. De kaldes også introns.

Kimærisk gen; Gen, der er sammensat af dele fra forskellige gener. F.eks. er det kimæriske LbC3~5'-3'-CAT sammensat af en chloramfenicol-acetyl transferase-kodesekvens stammende fra 15 E.coli og 5'- og 3'-flankerende regulerende regioner fra sojabønnes LbC3~gen.

Kloning: Proces til opnåelse af en population af organismer eller DNA-sekvenser, der hidrører fra en sådan organisme eller 20 sekvens ved ukønnet reproduktion eller nærmere bestemt en proces til isolering af en bestemt organisme eller del heraf og opformering af denne underfrakt i on som en homogen population.

25 Kodende sekvenser: DNA-sekvenser, der bestemmer et polypeptids aminosyresekvens.

Krydsinokuleringsgruppe: Gruppe af bælgplantearter, der kan danne funktionelt aktive rodknolde med Rhizobium-bakterier, 30 som er isoleret fra rodknolde af gruppens andre arter.

Leqhæmoglobin (Lb): Et oxygenbindende protein, der udelukken de syntetiseres i rodknolde. Lb-proteinerne regulerer oxygenpar ial trykket i rodknoldvævet og transporterer oxygen til bac-35 teroiderne. Herved beskyttes det oxygenfølsomme nitrogenaseen-zym. Lb-generne er rodknoldspecifikke gener.

4

DK 162399 B

Messenger-RNA (mRNA): RNA-molekyle, der er dannet ved trans skription af et gen og evt. modifikation af mRNA. mRNA-moleky-let viderebringer det genetiske budskab, som bestemmer amino-syresekvensen i et polypeptid, ved at en del af mRNA-molekylet 5 translateres til dette peptid.

Nedstrøms: Stedsangivelse i en DNA-sekvens. Defineres i for hold til transskriptionsretningen 5^31 for det gen, i forhold til hvilket stedsangivelsen finder sted. Den 3'-f1 ankerende 10 region findes således nedstrøms for genet.

Nucleotid: En monomer enhed af DNA eller RNA, som består af en sukkerdel (pentose), phosphat og en nitrogenholdig heterocy-klisk base. Basen er bundet til sukkerdelen gennem en glycosi-15 disk binding (l'-carbon i pentose), og denne kombination af base og sukker er et nucleosid. Basen karakteriserer nucleo-tidet. De fire DNA-baser er adenin (A), guanin (G), cytosin (C) og thymin (T). De fire RNA-baser er A, G, C og uracil (U).

20 Opstrøms Stedsangivelse i en DNA-sekvens. Defineres i forhold til transskriptionsretningen for det gen, i forhold til hvilket stedsangivelsen finder sted. Den 51-f1 ankerende region findes således opstrøms for dette gen.

25 Plantetransformation: Processer, der fører til indbygning af gener i plantecellers genom således, at disse gener nedarves stabilt gennem mitose og meiose eller således, at disse gener kun vedligeholdes for kortere perioder.

30 Plasmid: En ekstra-kromosomal, dobbeltstrenget DNA-sekvens, der omfatter et intakt replikon således, at plasmidet replike-res i en værtscelle. Når plasmidet er placeret inde i en encellet organisme, ændres eller transformeres denne organismes egenskaber som et resultat af plasmidets DNA. F.eks. transfor-35 merer et plasmid, som bærer genet for tetracyklinresistens (TcR), en tidligere tetracykli nføl som celle til en celle, som er resistent over for tetracyklin. En celle, som er transformeret af et plasmid, kaldes en transformant.

DK 162399 B

5

Polypeptid; En lineær række af aminosyrer, som er forbundet til hinanden ved hjælp af peptidbindinger mellem α-amino- og carboxygrupper i naboaminosyrer.

5 Rekomb i nat i on: Dannelse af et nyt DNA-molekyle ved kombination af DNA-fragmenter med forskellig oprindelse.

Rep 1 i kat i on: Proces, hvorved DNA-mo1eky1 er reproduceres.

10 Repli kon: Et selvrepli kerende genetisk element med et origin til initiering af DNA-repli kat i on og gener, der specificerer de funktioner, som er nødvendige for replikation og reguleringen heraf.

15 Restriktionsfragment; Et DNA-fragment, som er resultatet af dobbeltstrenget kløvning med et enzym, som genkender en specifik mål-DNA-sekvens.

RNA-polymerase; Enzym, der bevirker transskription af DNA til 20 RNA.

Rodknold; Specialiseret væv, der dannes efter infektion af fortrinsvis bælgplanterødder med Rhi zobi um-bakteri er. Selve vævet dannes af værtsplanten og består derfor af planteceller, 25 mens Rhizobium-bakterierne efter infektionen bliver omgivet af en plantecellemembran og differentierer til bacteroider. Rodknolde dannes på andre plantearter efter infektion af nitrogenbindende bakterier, der ikke tilhører Rhizobium-slægten. I disse knolde udtrykkes også rodknoldspecifikke plantegener.

30

Southern-hybridisering: Denatureret DNA overføres efter størrelsesseparering i agarosegel til en nitrocellulosemembran. Overført DNA analyseres for en given DNA-sekvens eller et givet gen ved hybridisering. Denne proces tillader enkeltstreng-35 ede, radioaktivt mærkede DNA-sekvenser (sonder) at bindes til komplementære, enkeltstrengede DNA-sekvenser, der er bundet på membranen. Beliggenheden af DNA-fragmenter på membranen, der binder sonden, kan derefter påvises på røntgenfilm.

6

DK 162399 B

Symbiotisk nitrogen-fiksering: Det samlivsforhold, hvorunder bacteroider i rodknolde omdanner luftens nitrogen (dinitrogen) til ammonium, som optages af planten, mens planten forsyner bacteroiderne med carbonforbindelser som en carbonkilde.

5

Symbiont·. Den ene deltager i et symbiot i sk forhold, specielt kaldes Rhizobium for microsymbionten.

T ransformation: Den proces, hvorved en celle bringes til at 10 optageret DNA-mo.lekyle.

T ransi at i on: Den proces, hvorved der produceres et polypeptid ud fra mRNA, eller den proces, hvorved den genetiske information, som er til stede i et mRNA-molekyle, dirigerer rækkeføl-15 gen af specifikke aminosyrer under syntesen af et polypeptid.

Transskription: Den proces, hvorved der med udgangspunkt i en DNA-sekvens syntetiseres en komplementær RNA-sekvens.

20 Vektor: Et plasmid, phag-DNA eller andre DNA-sekvenser, som er i stand til at replikere i en værtscelle, og som har et eller et lille antal endonucleasegenkendelsespunkter, på hvilke sådanne DNA-sekvenser kan kløves på en bestemmelig måde uden medfølgende tab af en essentiel biologisk funktion .

25

Grundlaget for opfindelsen

Traditionel planteforædling bygger på gentagne sammenkrydsninger af pianteli nier, der hver især bærer ønskede egenskaber.

30 Identifikation af afkomstiinier, der bærer alle de ønskede egenskaber, er en særdeles tidskrævende proces, da den biokemiske og genetiske baggrund for egenskaberne som oftest er ukendt. Nye linier vælges derfor efter deres fænotype, som oftest efter screening af mange linier i markforsøg.

35

Gennem tiderne har der været en direkte sammenhæng mellem befolkningens ernæringstilstand og dermed sundhed og landbrugets

DK 162399 B

7 mulighed for at sikre en tilstrækkelig tilførsel af assimiler-bart nitrogen til opnåelse af tilfredsstillende afgrødeudbytter. Allerede i 1600 tallet blev man opmærksom på, at planter af ærteblomstfamilien, hvortil foruden ærter bl.a. hører bøn-5 ner, lupiner, sojabønne, kællingetand, vikker, lucerne, espar-gette og kløver, var i stand til at forbedre afgrøder, som blev dyrket, hvor disse planter havde stået. I dag ved man, at dette skyldes, at ærteblomstfamiliens medlemmer er i stand til selv at opbygge nitrogenreserver. De har på deres rødder bak-10 terier, med hvilke de lever i symbiose.

Infektion af disse bælgplanters rødder med Rhizobium-bakterier fører til dannelse af rodknolde, som er i stand til at omdanne atmosfærisk nitrogen til bundet nitrogen, en proces, der kal-15 des nitrogen f iksering.

Atmosfærisk nitrogen omsættes herved til former, der kan udnyttes af værtsplanten samt af de planter, der senere vokser på samme sted.

20 I 1800-tallet udnyttedes denne mulighed for nitrogenti1førsel til at opnå en ikke tidligere set forøgelse af afgrødeudbyttet .

25 De senere, yderligere afgrødeforøgelser er imidlertid især opnået ved hjælp af naturgødning og nitrogenholdig kunstgødning. Den heraf følgende forurening af miljøet gør det ønskeligt at anvise andre muligheder for at sikre den til opnåelse af de bedst mulige afgrødeudbytter nødvendige nitrogenti1før-30 se 1.

Det ville således være værdifuldt at kunne forbedre de eksisterende nitrogenfikserende systemer i bælgplanter samt at indføre nitrogenfikserende systemer også i andre planter.

35

Ved hjælp af rekombinant DNA-teknik og de udviklede plantetransformationssystemer er det nu muligt at tilføre planter

DK 162399 B

8 nye egenskaber på velkontrolleret måde. Disse egenskaber kan stamme ikke blot fra samme planteart, men fra alle andre prokaryote eller eukaryote organismer. DNA-teknikkerne tillader ligeledes hurtig og specifik identifikation af afkomstiinier, 5 der bærer de ønskede egenskaber. En given plantelinie kan på denne måde tilføres en eller flere ønskede egenskaber på en hurtig og veldefineret måde.

Planteceller kan på samme måde tilføres veldefinerede egenska-10 ber. og derefter ve.d.1 igeholdes. som plantecellel inier ved hjælp af kendte vævskulturmetoder. Sådanne planteceller vil kunne udnyttes til produktion af biologiske produkter af særlig interesse, såsom farvestoffer, aromastoffer, piantehormoner, farmaceutiske produkter, primære og sekundære metabolitter 15 samt polypeptider (enzymer).

En række faktorer og funktioner, som er nødvendige for biologisk produktion af et givet genprodukt, er kendte. Både initiering og regulering af transskription såvel som initiering 20 og regulering af posttransskriptionelle processer kan karakteriseres. ( På genniveau vides det, at disse funktioner hovedsageligt udføres af 5'-flankerende regioner. En lang række 5 1-f1 ankerende 25 regioner fra prokaryote og eukaryote gener er sekvensbestemte, og på baggrund blandt andet heraf er tilvejebragt en omfattende viden om reguleringen af genekspression og om hvilke sub-regioner og sekvenser, der er af betydning for regulering af ekspression af genet. Der er store forskelle på regule-30 ringsmekanismen i prokaryote og eukaryote organismer, men inden for de to grupper er der mange fælles træk.

Regulering af genekspression kan finde sted på transskriptionsniveau og sker da fortrinsvis ved regulering af transs-35 kriptionens initieringsfrekvens. Dette er velkendt og beskrevet af bl.a. Benjamin Lewin, Gene Expression, John Wiley &

Sons, vol I, 1974, vol. II, Second Edition 1980, vol. III,

DK 162399 B

g 1977. Alternativt kan reguleringen finde sted på posttransskriptionsniveau, herunder ved regulering af frekvensen for trans lat i ons i ni ti er i ngen,af translationshastigheden samt af translationstermineringen.

5

Den foreliggende opfindelse er baseret på den overraskende kendsgerning, at 5'-f1 ankerende regioner fra rodknoldspecifikke gener, eksemplificeret med den 5'-flankerende region fra sojabønneleghæmoglobin-LbC3-genet, kan anvendes til inducerbar 10 ekspression af et fremmed gen i en artsfremmed bælgplante. Promotorens induktion og regulering udøves fortrinsvis i form af regulering og induktion på transskriptionsniveau og adskiller sig derved fra den i patentansøgning nr. 4889/85 angivne inducerbarhed, som fortrinsvis finder sted på transla-15 tionsniveau.

Transskriptionen af såvel sojabønnens LbC3-gen som et til kællingetand overført kimærisk LbC3-gen starter på et lavt niveau lige efter rodknoldene bliver synlige på pianterødder-20 ne. Derefter er der en kraftig forøgelse af transskriptionen, lige før rodknoldene bliver røde. Transskriptionen af en række andre rodknoldspecifikke gener påbegyndes på netop dette tidspunkt. Denne samtidige induktion af transskriptionen af Lb-generne og andre rodknoldspecifikke gener betyder, at der må 25 findes en fælles DNA-sekvens/sekvenser for de forskellige gener, der styrer dette udtryksmønster. Leghæmoglobin-C3-genet er således en repræsentant for én klasse af gener, og LbC3~genets promotor og ledersekvens, målområder for aktivering samt kontrolelementer for organspecificitet er således repræsentanter 30 for en hel genklasses kontrolelementer.

Promotoren fra de 51-f1 ankerende regioner i Lb-generne fungerer i sojabønner og er ansvarlig for transskriptionen af Lb-generne i rodknolde. Det er endvidere kendt, at effektiviteten 35 af både transskripti ons ini ter ing og efterfølgende translationsinitiering på Lb-genernes ledersekvens er høj, idet Lb-pro-teinerne udgør ca. 20¾ af det totale proteinindhold i rodknolde .

DK 162399 B

10

Sekvensen af 51-flankerende regioner fra de fire sojabønneleg-hæmoglobingener, Lba, Lbc^, Lbc2 og LbC37 er angivet i det vedlagte sekvensskema, fig. 1, hvor sekvenserne er angivet således, at det tydeligt fremgår, at der er homologi imellem de 5 fire 5'-flankerende regioner.

I dette sekvensskema betyder at der ikke er nogen base i pågældende position. Til højre i sekvensskemaet er angivet genernes navne og baseposition talt opstrøms for ATG-startkoden.

10 .. DesudjMJUJWlJte· betydende, sekvenser understregede.

Som.det fremgår af sekvensskemaet, er der en udtalt grad af homologi imellem de fire 51-flankerende regioner, og i positionen 23-24 basepar opstrøms for CAP-additionspunktet inde-15 holder de alle en TATATAAA-sekvens, som svarer til "TATA"- boksen, som normalt i eukaryote celler er lokaliseret et tilsvarende antal basepar opstrøms for CAP-additionspunktet, Desuden findes en CCAAQ-sekvens 64-72 basepar opstrøms for CAP-additionspunktet, hvilken sekvens svarer til "CCAAT"-boksen, 20 som normalt er lokaliseret 70-90 basepar opstrøms for CAP- additionspunktet. Fra CAP-additionspunktet til translationsstartkoden, ATG, findes 1 edersekvenser på 52-59 basepar, som udviser en udstrakt grad af homologi af størrelsesordenen ca. 75-80%.

25

Det er i forbindelse med den foreliggende opfindelse blevet vist, eksemplificeret med Lbc3~genet, at de 5'-flankerende regioner fra sojabønneleghæmoglobingenerne er funktionelt aktive i andre plantearter. Dette er blevet vist ved at fusionere E.

30 co1 i chloramphenicol-acetyl-transferase-(CAT)-genet med de 5'-og 3'-flankerende regioner fra sojabønne-Lb3~genet således, at ekspressionen af.CAT-genet kontrolleres af Lb-promotoren. Dette fusionsfragment blev klonet ind i integrationsvektorerne pARl og pAR22. Herved dannedes plasmiderne pAR29 og pAR30.

35 Sidstnævnte plasmider blev via homolog rekombination integreret ind i Agrobacterium rhizogenes T-DNA-regionen. Transformation af Lotus corniculatus(kællinqetand)p1anter (dvs. overfør-

DK 162399 B

11 sel af T-DNA-regionen) blev opnået ved sårinfektion på kimstængelen. Rødder, der var udviklet fra de transformerede planteceller, blev dyrket _τ_η vitro og befriet for A.^ rhi zo-genes-bakterier ved brug af antibiotika. Fuldstændigt regene-5 rerede planter blev dannet af disse rodkulturer på konventio nel måde gennem somatisk embryogenese eller organogenese.

Regenererede planter blev derefter inokuleret med Rhi zobi um loti-bakterier, og der blev høstet rodknolde til analyse.

10 Transskription og translation af det kimæriske LbC3-CAT-gen kunne herefter påvises i rodknolde på transformerede planter som aktiviteten af det dannede chloramphenicolacetyl-transfe-raseenzym.

15 Det kan således konkluderes, at de promotorholdige 5'-flanke-rende regioner fra rodknoldspecifikke gener, eksemplificeret med sojabønne-Lbc3~promoteren, er funktionelt aktive i artsfremmede planter. Dette er en overaskende observation, idet rodknolde kun udvikles som følge af en meget specifik reaktion 20 mellem bælgplanten og dens tilsvarende Rhizobiuro-mikrosyro-b i o n t.

Sojabønner danner kun knolde efter infektion af arten Rhi zobi um japonicum og Lotus corniculatus kun efter infektion af 25 arten Rhizobium Toti. Sojabønne og Lotus corniculatus tilhører derfor to forskellige kryds inoku1 er ingsgrupper , der hver især danner rodknolde med to forskellige Rhizobium-arter. Ekspression af et kimærisk sojabønnegen i Lotus corniculatus påviser derfor et uventet universelt reguleringssystem, der gælder for 30 rodknoldspecifikke geners udtryk. De involverede regulerende DNA-sekvenser kan placeres på genernes 5'- og 3'- flankerende regioner, her eksemplificeret ved de 2.0 Kb 5'- og 0.9 Kb 3'-flankerende regioner af LbC3~genet. Denne overraskende observation vil muliggøre brugen af rodknoldspecifikke promotorer 35 og regulerende sekvenser i enhver anden planteart og enhver anden plantecellelinie.

DK 162399 B

12 I andre eksperimenter blev den 5 *-f1 ankerende region af det knoldspecifikke N23-gen sammensluttet med CAT-genet og den 3 *-flankerende LbC3~region på en sådan måde, at ekspressionen af CAT-genet kontrolleres af N23-promotoren. Dette fusions-5 fragment blev klonet ind i integrationsvektoren pAR22 til fremstilling af plasmidet N23-CAT, der derefter blev rekombi-neret ind i A^ rhizogenes og overført til Lotus corniculatus og Trifolium repens {hvid kløver) ved den ovenfor beskrevne metode. Den rodknoldspecifikke ekspression af det overførte 10 N2.3-_CAT.rgeD/ opnået i L. corniculatus, som var inficeret med

Rhizobium loti og i T. repens, som var inficeret med Rhizobium tri fol i i, viste yderligere, at ekspression af rodknoldspecifikke gener er uafhængig af plantearten og Rhi zobi um-arten.

Et universelt regulatorisk system regulerer derfor ekspres-15 sionen af rodknoldspecifikke gener i de forskellige symbiotiske systemer, der dannes mellem bælgplanter og Rh i zobi um-arterne fra de forskellige krydsinokuleringsgrupper.

Det er kendt fra EP-patentansøgning nr. 122.791.Al, at plan-20 tegener fra én art ved Agrobacterium-formidlet transformation kan overføres til en anden planteart. Det er også kendt fra EP 122.791.Al, at et overført gen, som koder for frølagringsproteinet "Phased in", kan udtrykkes i tobak og lucerne. Fra litteraturen er det også kendt, at denne ekspression er frøspeci-25 fik (Sengupta-Gopalan et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 3320-3324).

Den foreliggende opfindelse angår derfor en hidtil ukendt fremgangsmåde til ekspression af overførte gener på en rod-30 knoldspecifik måde under anvendelse af DNA-regulatorsekvenser fra 5'-promotorregionen, den kodende region eller den 3'-flankerende region fra rodknoldspecifikke gener, her eksemplificeret med leghæmoglobin-LbC3-genet og N23-genet. Denne metode adskiller sig både fra den Aqrobacterium-formidiede 35 transformationsmetode og ekspression af genet for frølagrinqs-proteinet phaseolin, som er karakteriseret i EP 122.791.Al. Ekspression af det overførte phaseolingen i EP 122.791.Al vi- i

DK 162399 B

13 ser kun, at phaseolingenfami 1 i en med sine sari i ge regulato-riske krav kan udtrykkes i tobak og lucerne. Den hverken viser eller antyder, at noget andet gen med dets særlige regulato-riske krav kan udtrykkes i nogen anden plante eller plantevæv.

5

Formål med opfindelsen

Et formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en mulighed for at udtrykke ønskede gener i bælgplanter, bælg-10 plantedele og bælgplantecellekulturer.

Det er desuden et formål med opfindelsen at kunne udtrykke gener af enhver oprindelse under kontrol af en inducerbar rodknoldspecifik promotor.

15

Yderligere formål med opfindelsen er at forbedre de eksisterende nitrogenfikserende systemer i bælgplanter.

Et yderligere formål med opfindelsen er at tilvejebringe en 20 mulighed for i visse tilfælde at kunne anvende specifikke sekvenser fra den 31-f1 ankerende region fra kodesekvensen og fra intervenerende sekvenser til indvirkning på rodknoldspecifikke promotorers regulering.

25 Det er desuden et formål med opfindelsen at tilvejebringe plas-mider, der indeholder den ovennævnte inducerbare plantepromo-tor.

Yderligere formål med opfindelsen fremgår umiddelbart af den 30 følgende beskrivelse.

Beskrivelse af opfindelsen *

Disse formål opnås ved udøvelse af fremgangsmåden ifølge op-35 findelsen til ekspression af gener i bælgplanter ved transformering af cellerne med et rekombineret DNA-fragment, der indeholder dels det gen, der ønskes udtrykt, dels en 5’-f1 ankeren- 11

DK 162399 B

de region, hvori indgår en promotorsekvens og eventuelt en 3'-flankerende region, og dyrkning af de transformerede celler i et egnet vækstmedium, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der anvendes 5'- eller i givet fald 5'- og 3'-flanke-5 rende regioner fra et rodknoldspecifikt plantegen, og at promotoren er en inducerbar piantepromotor, som regulerer, at ekspressionen sker i rodknoldene på bestemt udviklingstrin og som led i den symbiotiske nitrogenfiksering. Om ønsket regenereres de transformede celler til planter.

10

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er det muligt på veldefineret måde at udtrykke fremmede gener i bælgplanter, bælgplantedele og bælgplantecellekulturer. Her tænkes især på gener, som vil tilføre planter ønskede egenskaber, som f.eks.

15 resistens mod plantesygdomme og forøget indhold af værdifulde polypeptider.

En anden anvendelse vil være fremstillingen af værdifulde produkter som f.eks. farvestoffer,, aromastoffer, piantehormoner, 20 farmaceutiske produkter, primære og sekundære metabolitter og polypeptider ved brug af fremgangsmåden ifølge opfindelsen i plantecellekulturer og planter.

Ved anvendelse af :fremgangsmåden ifølge opfindelen til eks-25 pression af rodknoldspecifikke gener bliver det muligt at udtrykke rodknoldspecifikke gener, der er nødvendige for dannelse af et aktivt nitrogenfikserende system i både bælgplanter og andre planter. Den korrekte udviklingsmæssige kontrol (eksempel 8) muliggør etablering af et symbiotisk nitrogenfik-30 serende system i ikke-bælgp1anter. Herved bliver det overraskende muligt at forbedre de eksisterende nitrogenfikserende systemer i bælgplanter samt at indføre nitrogenfikserende systemer i andre planter.

35 Ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen til ekspression af fremmede gener i rodknolde er det muligt at bibringe bælgplanter forbedrede egenskaber, såsom herbicidresistens og resistens mod sygdomme og skadedyr.

DK 162399 8 15

Ved en særlig udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes et DNA-fragment, der indeholder en inducerbar piantepromotor, og som er identisk med, afledt af eller indeholder 5 '-flankerende regioner fra 1 eghæmog1 obi ngener. Herved 5 opnås udtryk af et hvilket som helst gen.

Eksempler på sådanne DNA-fragmenter er DNA-fragmenter fra de fire 5 '-f1 ankerende regioner fra sojabønne-1eghæmog1obin-generne, nemlig 10

Lba med sekvensen: GAGA7ACAT7 A7AA7AA7CT CTCTAGTGTC TATTTATTAT TT7A7C7GGT! GATATATACC TTCTCGTATA CTGTTATTTT TTCAATCTTG TAGATTTACT! TCTTTTATTT TTATAAAAAA GACTTTATTT TTTTAAAAAA AATAAAGTGAi ATTTTGAAAA CA7GCTCTTT GACAATTTTC TGTTTCCTTT TTCATCATTG! 15 GGTTAAATCT CATAGTGCCT CTATTCAATA A777GGGC7C AATTTAATTA! G7AGAG7C7A CATAAAATT7 ACCTTAA7AG TAGAGAATAG AGAG7CTTGG! AAAG77GG77 777CTCGAGG AAGAAAGGAA ATG77AAAAA CTGTGATATT.1 T7777777GG A77AA7AG7T ATGTT7A7A7 GAAAACTGAA AATAAATAAAi CTAACCATAT TAAAT77AGA ACAACACTTC AATTATTTTT TTAA77TGAT! TAA7TAAAAA A77A777GA7 TAAA7TTTTT AAAAGATCG7 TGT7TCTTCT' TCATCATGC7 GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC ACA7AAGCTT! 20 TGGTTTTC7C AC7CTCCAAG CCC7CTATAT AAACAAA7A7 7GGAGTGAAG' TTGTTGCATA AC77GCATCG AACAATTAAT AGAAATAACA GAAAAT7AAA. AAAGAAATA7 G. . _ ............................... . .

Lbcj med sekvensen:

25 TTC7CTTAA7 ACAA7GGAG7 TTT7GTTGAA CATACA7ACA TT7AAAAAAA

AA7CTC7AG7 G7C7AT77AC CCGGTGAGAA GCC77C7CG7 G7777ACACA C77TAA7A77 A77A7A7CC7 CAACCCCACA AAAAAGAATA C7GTTA7A7C TT7CCAAACC TGTAGATT7A 7T7ATTTATT TATTTATTTT TACAAAGGAG ACTTCAGAAA AGTAATTACA TAAAGATAGT GAACATCATT 77A777A77A TAATAAACTT TAAAA7CAAA CT7T7TTATA TTTTTTGTTA CCCTTTTCAT TA7TGGG7GA AATCTCATAG TGAAGCCATT AAATAATTTG GGCTCAAGTT TTATTAGTAA AGTCTGCATG AAATTTAACT TAACAATAGA GAGAGTT7TC

30 GAAAGGGAGC GAATG7TAAA AAGTGTGA7A TTA7ATTTTA TTTCGATTAA

TAA7TA7GTT TACATGAAAA CATACAAAAA AATACTTTTA AATTCAGAAT AATAC77AAA ATAT7TATT7 GCTTAATTGA TTAACTGAAA ATTATTTGAT TAGGATTT7G AAAAGATCAT TGGCTC77CG TCATGCCGAT TGACACCCTC CACAAGCCAA GAGAAACT7A AG77GTAAAC TTTCTCACTC CAAGCCTTCT ATATAAACAT GTATTGGATG TGAAGTTATT GCATAACTTG CATTGAACAA TAGAAAATAA CAAAAAAAAG TAAAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG.

35 lbc2 med sekvensen:

DK 162399 B

16 TCGAGTTTTT ACTGAACATA CATTTATTAA AAAAAACTCT CTAGTGTCCA. TTTATTCGGC GAGAAGCCTT CTCGTGCTTT ACACACTTTA ATATTATTAT ATCCCCACCC CCACCAAAAA AAAAAAAACT GTTATATCTT TCCAGTACAT TTATTTCTTA TTTTTACAAA GGAAACTTCA CGAAAGTAAT TACAAAAAAG: 5 ATAGTGAACA TCATTTTTTT AGTTAAGATG AATTTTAAAA TCACACTTTT:

TTATATTTTT TTGTTACCCT TTTCATTATT GGGTGAAATC TCATAGTGAA-ACTATTAAAT AG7TTGGGC7 CAAG7TTTAT TAGTAAAGTC TGCATGAAAT TTAACTTAAT AATAGAGAGA GTTTTGGAAA GGTAACGAAT GTTAGAAAG? GTGATATTAT TATAGTTTTA TTTAGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA TTGACAATTT ATTTTTAAAA TTCAGAGTAA TACTTAAATT ACT7A7T7AC' TTTAAGATTT TGAAAAGATC ATTTGGCTCT TCATCATGCC GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC TTAAGTTGTA ATTTTTCTAA CTCCAAGCCT 10 TCTATATAAA CACGTATTGG ATGTGAAGTT GTTGCATAAC TTGCATTGAA

CAATAGAAAT AACAACAAAG AAAATAAGTG AAAAAAGAAA TATG.

og LbC3 med sekvensen:

TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCA7AAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT G7AGA7T7A7 TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA 15 ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA

AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCG7AG7GA CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AG7TTGCATA AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT] GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAAI C7AAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT 20 TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA 7GA7TGTC7C

TTCACCATAC CAATTGn7CA CCCTCC7CCA ACAAGCCAAG AGrt<jAC.i7AA GTTT7ATTAG TTATTC7GA7 CAC7C77CAA GCCTTCTA7A 7AAATAAG7A TTGGA7G7GA AG7TG7TGCA TAAC7TGCA7 7GAACAA7TA A7AGAAATAA CAGAAAAG7A GAAAAGnAAT ATo·

Ved en yderligere udførelsesform for fremgangsmåden ifølge 25 opfindelsen anvendes et DNA-fragment, som er identisk med, afledt af eller indeholder 51-flankerende regioner fra LbC3-51-3'-CAT-genet med sekvensen: 30 35 /

DK 162399 B

17

TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCA7AAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT GTAGAT.TTAT TTCTTTTAT7 TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT TTGTTTAAAT TG G AT A AG AT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA 5 CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA

AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGnCT GTTAAAAAGT GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTG7CTC TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA ζ/ηφΦΦΛTTAT^C^GA^ CAC*”C**MTTCAA ^'ri ti CAGAAAAGTA GAATTCTAAA AT G*

Ved en særlig foretrukket udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes der yderligere en 3’-f1 ankerende region fra rodknoldspecifikke gener, især sekvenser fra den 15 3'-flankerende region, som kan indvirke på styrken eller regu leringen hos en promotor fra rodknoldspecifikke gener eller på transskriptionsterm i ner i ng, eller som på anden måde kan påvirke udbyttet af det ønskede genprodukt.

20 Eksempler på sådanne 3'-flankerende regioner er de fire 3'-flankerende regioner fra sojabønneleghæmoglobingenerne, nemlig Lba med sekvensen: 1590 1620

TAA TTA GTA TCT ATT GCA GTA AAG TGT AAT AAA TAA ATC TIG

25 1650 1680

TTT CAC TAT AAA AC? TGT TAC TAT TAG ACA AGG GCC TGA TAC AAA ATG TTG GTT AAA ATA

1710 1740

ATG GAA TTA TAT AGT ATT GCA TAA AAA TCT TAA GGT TAA TAT TCT ATA TTT GCG TAG GTT

1770 1800

g g TAT GCT TGT GAA TCA TTA TCG GTA TTT TTT TTC CTT TCT GAT AAT TAA TCG GTA AAT TA

1830 I860

ACA AAT AAG TTC AAA ATG ATT TAT ATG TTT CAA AAT TAT TTT AAC AGC AGG TAA AAT GTT

ATT TGG TAC GAA AGC TAA TTC GTC OA

35

DK 162399 B

18 1320

Lbc^ med sekvensen: taa/tt agg atc tac tgc att gcc gta 1350 13S0 AAG TGT AAT ΑΑΑ ΤΑΑ ATC TTG TTT CAA CTA AAA CTT GTT ATT AAA CAA GXT CCC TAT ΑΤΑ c 1410 1440 ° AAT GTT GTT TAA AAT AAG TAA ATT TCA TTG TAT TGG ATA AAC ACT TTT AAG TTA TAT ATT · 1470 1500

TCC ATA TAT TTA CGT TTG TGA ATC ATA ATC GAT ACT TTA TAA AAA TAA ATT CCA AAT AAT

TTA TAC GTT TTA AAA ATT ATT TT

10 ......LbC2· med sekvensen:...........

TAG/GAT CTA CTA TTG CCG TCA AGT

1140

GTA ATA AAT AAA TTT TGT TTC ACT AAA ACT TGT TAT TAA ACA AGT CCC CGA TAT ATA AAT

1170 1200 GTT GGT TAA AAT AAG TAA ATT ATA CGG TAT TGA TAA ACA ATC TTA AGT TTT ATA TAT AGT 2 5 1230 1260

TCC ATA TAC TAA AGT TTG TGA ATC ATA ATC GA

1290 20 og LbC3 med sekvensen: TAG/GAT CTA CAA TTG CCT TAA AGT GTA ATA AAT AAA 990 1020 TAT TAT TTC ACT AAA ACT TGT TAT TAA ACC AAG TTC TCG ATA TAA ATG TTG GTT AAA CTA 2 5 1050 1080

AGT AAA TTA TAT GGT ATT GGA TAA ACA ATC TTA AGC TT

1110 30

Denne sekvens er beliggende på den ifølge opfindelsen anvendte 0,9 kb 3'-flankerende region. En særlig udførelsesform for opfindelsen er derfor anvendelse af sekvenser fra denne region, 35 der udøver eller formidler den ifølge opfindelsen karakteriserede regulering af rodknoldspecifikke promotorregi oner.

DK 162399 B

19

Ved en særlig udføre 1 sesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes en region fra rodknoldspecifikke geners kodesekvens eller intervenerende sekvens, især sekvenser fra kodesekvensen eller den intervenerende sekvens, som kan indvirke 5 på den knoldspecifikke promotors styrke eller regulering, eller som på anden måde kan påvirke udbyttet af det ønskede genprodukt .

Eksempler på sådanne kodesekvenser og intervenerende sekvenser 10 er de fire leghæmoglobingener fra sojabønne, nemlig Lba med sekvensen: 15 20 25 30 35

DK 162399 B

20 12* val

1TC/6TT

150 ---“ ^ 1·· AL« *HC TH* C LU LTS CLM ASP *1* LEU V*. SE* SEP S™ P-E ZW AU *~Z LYS AL» ASN _

GCT TIC »CT GAG AAG CAA CåT GCT TTG CTC »CT åc-c TCi irc &*A tCl »ft AcTdcå AAC

210 *48

Ile pro cln ty* se* vil vil phe ty* tm* se*

ATT CCT MA TAC ACC CTT GTG TTC TAC ACT TC\C TAA CTT TTC TCT CTA ACC ATC TGT CTT

270 3··

CCA TTC TAT CTT TTT CTT TTC GAI ATT TCT TCT CTT TC· AAA AAG ATå TaT TCT TAA 7GT

338 368 ILE LEU CLU LYS ALA P*0 ALA ALA LYS »S*

CAC T6S TTT TCG TTT CAT TAA AAA TCA ATAG/G ΑΓΑ CTG CAS AAA GCA CCT CCA CCA AAG GAC

SV· All

LEU PIC SE* PHE LEU ALA ASM CLY VAL ASP P*3 TH* ASM P*3 LYS LEO TM* CLT HIS ALA

TT6 TTC TCA TTT CTA GCA AAT CCA CTA CAC CCC ACT AAT CCT AAS CTC ACG CCC CAT GCT

491 4··

CUI LYS LEU PHE AU LEU

CAA AAC CTT TTT GCA TTG/CTAA GT A TCA CCC AAC TAA AAT TAT AAC TAT TTT ATC TCA

SIS 54*

TTA ATT TTA ACA TTI ACC ATC ATC TAT TTT AAC ACT CTT AAA ACA TCA ATG AAC ATT AAT

578 688

TCT TTC AAT TCT ATT TTA TAT TTT TCC CAT ATC TTC AAC TAC CAA TAG TAT ATA AAT TTC

618 6C8

TAT TAC TAT TTC TTC ATA ATT ATT TTT CTT TCA TAA CTA TCT TCT CAC ATå TTA TAT ATT

690 720

V1L_A*C ASP SE* ALA G.Y CLM LEU LYS ALA SE* CLT Th* VAL VAL ALA

TTT TCA ATT CTAC/CTC CCT CAC TCA CCT GCT Må’cTT ΑΛΑ GCA AGT CG A ACA** CTG CTC GCT

758 781

ASP ALA ALA LEU CLY SE* VAL HIS ALA CLM LYS ALA VAL TH* ASP PPQ CLM P>€ VAL

CAT CCC CCA CTT CGT TCT CTT CAT CCC CAA AAA GCA CTC ACT GAT CCT CAC TTC GTG/GT

•18

ATC ATA AAT AAT G AA ATC TTA TAA TAA ATT ATG CAT ACT TCA ATT TTT CAT CCA GU CTA

*78 111

TAA TCA TCA ACA CAC ACT TCT TTT CTT TU TCC ATT TCA TAA CTA CAA TCT TAA AAT CTT

038 068

SU ATC TTA AAA ΑΤΑ CTA TTA AAA ATA TAA UT TTA ATT ACC TU TU ATA TTT TTC TCT

858 1128 TCC 88T TTT TTA TCA AAA AAT TAT AAT TAT C AA TTC TTT’CAC UA TCT TTA ATT AAA Al«

Iltt 1188

TTC ATT TAA TAA TM AAT AAC TAA CCT ACC TCT CTC TCC TTT TTC ATT TAA ACT ATC ACA

U18 Ί148

TAA AU ATC AAT AAA CTA AAC TAA ACC ATS ACA TCT TTA TTT TTC AAT CAC CTT ATT AAT

117· 1288

AAT TTT TTT TM CTA TCT ATT CM ATC TIC ATT CAT TAT MA TTA TCT TCC TTC MT TCA

1230 1288'

TTC TCT CCA TTT TTT TCT TCA CCT TAA CCT TCA CTT MA TAT ATA TTC ATT TTT TCA TAA

132*

AAA AAA ATå CTA CAA TAT ATT TTC ATT TAC CTC ATC ATA TTT ATT TU CTT CAA CTT AAA

13U 13sa

ATT TTA TAC ATC TTA ATT GAT ATA ATT TCT TCA CåT CAT CAC AAC ACC AAT ACC ATT ACC

lt,l° 1448

TAC TCT TTT CAA ACT CTT ATå TCC ATT TTA ATT ATA ACC AAA AAT STA ACA GCT AAA CCA

1478

VAL VAL LYS CLU AU LEU LEU LYS THR tLE LTS ALA »LA VAL

TTC CTC ATC ATT TTC AAC/CTC CTT AAA CAA CCA CTC CTC AAA ACå ATå AAC CCA GU CTT

1530 .-5..

CLT ASP LTS T*P SE* ASP CLU LEU SE* ABC ALA TfiP GLU VAL ALA TY* AS* CLU LEU ALA

CCC CIC AA« TCC AGT CAC CAC TTC ACC CCT CCT TCC CAA CTA CCC TAC GAT GU TTC CCA

AU ALA ILE LTS LTS ALA .

GCA GCT ATT AAC AAG CCA J/f/j f

Lba-proteinets aminosyresekvens er angivet over den kodende sekvens.

Lbc} med sekvensen: 21

DK 162399 B

5 19·

GIT

ATGXGGT

210 2*0

UA PPE THR GLU ITS GIN GLU ALI LEU VAL SER SER SER PHE G LU ALA PHE LYS ALA ASN

GCT TtC ACT GAG AAG CAA GAG GCT TTG GTG AGT AGC TCA TTC GAA GCA TIC AAG GCA AAC

270 38·

ILE PRO GLN TYR SER VAL VAL PHE TYR ASN SER

ATT CCT CAA TAC AGC GTT GTG TTC TAC AAT TC/GTIA GTT TTC TCT ATA AGC ATC TGT CTT

4 λ 330 368

X U TCA TTC TAT GTT TTT CTT CTG GAA ATT TTT TCT GTT TGA AAA AAG ATA TAT ATA TAT ATA

sqe *2*

TAT ATA TAT ATA TAT ΑΤΑ ΤΑΤ ΑΤΑ ΤΑΓ ΑΤΑ ΤΑΥ ΑΤΑ TAT TTT GTT AAT GTG AGT GGT TTT

«50 «0·

ILE LEU GLU LYS ALA PRO ALA ALA LYS ASP LEM PH£ SER

GGT TTG ATT AAA AAT AAA TAG/GATT CTG GAG AAA GCA CCT GCA GCA AAG GAC TTG TTC TCA

510 5«R ·

PHE LEU ALA ASN GLY VAL ASP PRO THR ASN PRO LYS LEU THR GLY HIS ALA GLU LYS LEU

TTT CTA GCA AAT GCA GTA GAC CCC ACT AAT CCT AAC CTC 4CG GGC CAT GCT GAA AAG CTT

15 570 &0>

PK ALA LEU

TTT GCA TTGNGT AAC TAT CAC CCA ACT AAA ATT ATA ACT ATT TTA TCT GAT TAA TTT TAA

630 660

GAT T«å ACA TCA TGT ATT TTA ACA CTC TTA AAA TAT CAA TGA ACA TTA ATT TTT TGA ATT

650 729

GTA TTT TAT ATT TTT ACC ATA TCT TGA ACT AGG AAT AAT ATA TAA ATT TCT ATT AGT ATT

750 700

TGT TCG TAA TTA CAT ATA TAT ATA TAT ATA TAA TCC TTG TGA TAA TTA TTT TTC GAA TTT

O f) 010 8*9 ** v VAL ARG ASP SER ALA GLY GLN LEU LYS THR ASH GLY THR VAL VAL »LA ASP »LA Al*

CTAG/GTG CG I GAC TCA GOT GGT CAA CTT AAA ACA AAT GGA ACA GTG GTG GCT GAT GCT GCA

970 999

LEU VAL SER ILE KIS ALA GLN LYS ALA VAL THR ASP PRO GLN PHE VAL

CTT GTT TCT ATC CAT GCC CAA AAA GCA GTC ACT GAT CCT CAG TTC GTG/GT ATG ATA AAT

930 961

JIT ACT AGT AAA ATG TTA CAA TAA ATG CAA ACT TAA GTT TTA CGT ACA TAG TCA TCA TGA

990 1020

CTT CAT GCA TCC CTA TTA TTT TTT CAT ATT TAT TCA AGT CAA CTT AAA ATT TTG TAA ATA

25 10 50 1 0 9 9

CAG ATC CAT GCT AGT AAT TTG TTG AGA TCA TGA GAA AAC CTA CCA CTA CTC CAA TAG CAT

tilø 11*0

TAC TCA TTT TGA AAA TTG TAT AAC TGT GAT CTA ATT ATA AGG AAA AAG TGT AU TAA GAG

u*0 1200

VAL VAL LYS GLU ALA LEU LEU LYS THR CTA ATC CAT TAT TAA TGT TTT ΓΤΑ TAT TTT GTAG/GTG GTT AAA SAA GCA CTC CTG AAA ACA

1230 1260

ILE LTS GLU »LA VAL GLY CLT ASN TRP SER ASP GLU LEU SER SER ALA TRP GLU VAL AlA

øQ ATI AAG GAA GCT GTT GGC GGC AAT TGG AGT GAC GAA TTG AGC AGT GCT TGG GAA GTA GCC

1290 TYR ASP GLU LEU ALA ALA ALA ILE LYS LYS ALA rf TAT GAT GAA TTG GCA GCA GCA ATT AAA AAG GCA / IT/J 9 ' Lbc-^-proteinets aminosyresekvens er angivet over den kodende sekvens.

35

LbC2 med sekvensen:

DK 162399 B

22 5

GUT

G/GGT

ISO

ALA PHE THR GLU LTS GLN GLU ALA LEU VAL SER SER SER PHE GLU ALA PHE LYS ALA ASN

GCT TTC ACT GAG AAG CAA GAG GCT TTG GTG AGT AGC TCA TTC GAA GCA TTC AAG GCA AAC

210 200

ILE PRO GLN TYR SER VAL VAL PHE TYR THR SER

ATT CCT CAA TAC AGC GTT GTG TTC TAC ACT TC/GTA AGT TTT CTC TTA AAG CAT GTA TCT

10 270 500

TTC ATT CTC TGT TTT TCC TTT CGA CAT ITT TTG TGT TTG AAA AGA GAT AGT GTC AAT GTG

230 360

ILE LEU GLU LYS ALA PRO ALA ALA LYS AGT GGG TAT TTT TTT TTA TTA AAA ATT AAC AG/G ATA CTG GAG AAA GCA CCC GCA GCA AAG

]90 020

ASP LEU PHE SER PHE LEU SER ASN GLY VAL ASP PRO SER ASN PRO LYS LEU THR GLY HIS

GAC TTG TTC TCG TTT CTA TCT AAT GGA GTA GAT CCT AGT AAI CCT AAG CTC ACG GCC CAT

050 OBO

15

ALA GLU LYS LEU PHE GLY LEU

GCT GAA AAG CTT TTT GGA TTG/GTA AGT ATC ATC CAA CTA AAA TTA TAC CTA TTT TAT GTG

SIO SOO

ATT AAT TTT AAG ATT AAA CAT GTA TTT AAC ACT CTT AAA CAT GTA TTT AAC ACT CTT AAG

570 600

ATT AAA CAT GTA TTT AAC TAA AAC ATG TAT TTG CTG ATT ATT TTT TTT TTA IAA TTA TCT

630 660

20 VAL ARG ASP SER ALA GLY GLN LEU LYS ALA

TGT CAC ATA TTA TAT ATT TTT TGA ATT GTA G/GTG CGT GAC TCA GCT GGT CAA CTT AAA GCA

690 720

ASN GLY THR VAL VAL ALA ASP ALA ALA LEU GLY SER ILE HIS ALA GLN LYS ALA ILE THR

AAT GGA ACA GTA GTG GCT GAT GCC GCA CTT GGT TCT ATC CAT GCC CAA AAA GCA ATC ACT

7S0 780

ASP PRO GLN PHE VAL

GAT CCT CAG TTC GTG/GT ATG ATA AAT AAT AAA ATG TTA C*A TAA ATC CAC ATA TAC TTA

810 840 25

AAT TTT ACA TGG TGC AGT GTT ATG ATC ATC ATT TTT GTT TAG TAA TGA ATT TAC TTA AAA

870 900

TCT TAA ATT ATG TAC TTT TTG AAA GTT TTA TAT CGA ATT TTA ATT ATA GGG AAA AAT GTA

930 960

VAL VAL LYS GLU ALA LEU LEU LYS THR AGA GCT AAT CCA TTA GTG ATG TTT TGT CTG TAG/GTG GTT AAA GAA GCA CTG CTG AAA ACA

990 1020

30 ILE LYS GLU ALA VAL GLY ASP LYS TRP SER ASP GLU LEU SER SER ALA TRP GLU VAL ALA

ATA AAG GAG GCA GTT GGG GAC AAA TGG AGT GAT GAA TTG AGC AGT GCT TGG GAA GTA GCC

10S0 1080 i TYR ASP GLU LEU ALA ALA ALA ILE LYS LYS ALA PHE1.

TAT GAT GAA TTG GCA GCA GCT ATT AAG AAG GCA TTT'T/"i(f 1110

Lbc2_proteinets aminosyr es elevens ex angivet ovet den 35 kodende sekvens.

i

Lbc3 med sekvensen·.

DK 162399 B

23

GLY ALA PHE THR ASP

_ G/GGI GCT TIC ACT GAT

5 120

LYS GLh GLU ALA LEU VAL SER SER SER PHE GLU ALA PHE LYS THR ASK ILE PRO CLN TYR AAG CAA GAG GCT TTG GIG AGT AGC TCA TTT GAA GCA TTC AAG ACA AAC AT? CCT CAA TAC

150 »*®

AGT GTT GTG TTC TAC ACC TC/GTA AGT ATT CTA TCT AAA TTA TGT GTC TTA TTG TAT GTT

210 2«®

TAA CTT TCG TGG TTT GTT GTG TTT GAA AAA AAG ATA TAT ATT GTT AAT GTG AGT GCT TTT

10 270 JO®

ILE LEU GLU LYS ALA PRO VAL ALA LYS ASP LEO PHE SER GCT TTG ACT AAA AAT GAA TAG/G ATA CTG GAG AAA GCA CCT CTA GCA AAG GAC TTG TTC !CA

130 300

PHE LEU ALA ASN GLY VAL ASP PRO THR ASN PRO LYS LEU THR GLT HIS ALA GLU LYS LEU

TTT CTA GCT AAT GGA GTA GAC CCC ACT AAT CCT AAG CTC ACG GGC CAT GCT CAA AAA CTT

390 «20

PHE GLY LEU

TTT GGA TTG/GT AAG TAT CCA GCC TAC TAA AAT TAA AAT CCT ATT AGT ATT TTT TAT TAT 15 450 «00

VAL ARG ASP SER

TTT TCT TCC ATG ATT GTC TTG TCA CAT ATT ATA TAT TTT TTG AAT TAT AG/CTA CCT GAT TCA

510 540

ALA GLY GLN LEU LYS ALA SER GLY THR VAL VAL ILE ASP ALA ALA CEO GLT SER ILE HIS

GCT GGT CAA CTT AAA GCA AGT GGA ACA CTG GTG ATT GAT GCC GCA CTT GGT TCT ATC CAT

570 «,00

ALA GLN LYS ALA ILE THH ASP PRO GLN PHE VAL

GCC CAA AAA GCA ATC ACT GAT CCT CAA TTT GTG/G TAT GAT AAA TAA TGA AAA GCT ACA

20 630

ATA AAT GCA CAA ATA CTT AAT TTT ACA TAG TGC AGT GCT ATA TGA TCA TCA CTT TTG CTT

b90 720

AGT AAT GAA TTT ACT TTT TTT TTT TAC AGA AGT AAT GGA ITT ACT TAA AAT CTT AAA TTA

750 780

TCT ACT TCT TTA AAG AGT TTT GTA TGG AAT TTT AAT TAT AGG AAA AAT GTA AGA GCT AAA

81° 840 25

VAL VAL LYS GLU ALA LEU LEU LYS THR ILE L*S GLU ALA

CCA TTG CTG ATG ATT ICC AAG/GTG GTT AAA GAA GCA CTG CTG AAA *CA ATA AAG GAG GCA

870 ,00

VAL GLY ASP LYS TRP SER ASP GLU LEU SER SER ALA TRP GLU VAL ALA TYR ASP GLU LEU

GTT GGG GAC AAA TGG AGT GAC GAG TTG AGC AGT GCT TGG GAA GTA GCC TAT GAT GAA TTG

9J0 960

ALA ALA ALA ILE LYS LYS ALA PHEI

GCA GCA GCI ATT AAG AAG GCA TTT ‘7”/?<3.

30

LbOj-proteinets aminosyresekvens er angivet over den kodende sekvens.

35

DK 162399 B

24

Den foreliggende opfindelse angår endvidere et hidtil ukendt DNA-fragment til brug ved udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hvilket DNA-fragment er ejendommeligt ved, at det omfatter en inducerbar piantepromotor, som regulerer, at eks-5 pressionen sker i rodknoldene på bestemte udviklingstrin og som led i den symboistiske nitrogenfiksering, og er identisk med, afledt af eller indeholder en 5'-f1 ankerende region fra rodknoldspecifikke gener. Eksempler på sådanne DNA-fragmenter er DNA-fragmenter, som er identiske med, afledt af eller inde- 10.. Jh.ol.de r*_e.n„,.SA-lla nker ende region .fra pi ante1eghæmog lob i ngener.

Foretrukne eksempler herpå er ifølge opfindelsen DNA-fragmen-ter, som er identiske med, afledt af eller indeholder en 5' flankerende region fra de fire sojabønneleghæmog1 obi ngener, nemlig: 15 Lba med sekvensen:

GAGA7ACA77 ATAATAATCT CTCTAGTGTC TATTTATTAT TTTATCTGGT GATATATACC TTCTCGTATA CTGTTATTTT TTCAATCTTG TAGATTTACT TCTTTTATTT TTATAAAAAA GACTTTATTT TTTTAAAAAA AA7AAAG7GA ATTTTGAAAA CATGCTCTTT GACAATTTTC TGTTTCCTTT TTCATCATTG GGTTAAATCT CATAGTGCCT CTAT.TCAATA ATTTGGGCTC AATTTAATTA 20 GTAGAGTCTA CATAAAATTT ACCTTAATAG TAGAGAATAG AGAGTCTTGG

AAAGTTGGTT TTTCTCGAGG AAGAAAGGAA ATGTTAAAAA CTGTGATATT TTTTTTTTGG ATTAATAGTT ATGTTTATAT GAAAAC7GAA AATAAATAAA C7AACCA7A7 TAAATTTAGA ACAACACTTC AATTATTTTT TTAATTTGAT TAATTAAAAA ATTATTTGAT TAAATTTTTT AAAAGATCGT 7G777C77C7 TCATCATGCT GATTGACACC CTCCAGAAGC CAAGAGAAAC ACATAAGCTT TGGTTTTCTC ACTC7CCAAG CCCTCTATAT AAACAAATAT TGGAGTGAAG 25 TTGTTGCATA ACTTGCATCG AACAATTAAT AGAAATAACA GAAAATTAAA

AAAGAAATAT G._______ .....

Lbci med sekvensen:

30 T7C7C7TAAT ACAATGGAGT TTTTGTTGAA CA7ACA7ACA TT?AAAAAAAI

AATCTCTAGT G7CTATTTAC CCGGTGAGAA GCCTTCTCGT G7TT7ACACAI CTTTAATAT? ATTATATCCT CAACCCCACA AAAAAGAATA CTGTTATATC' T77CCAAACC TGTAGATTTA TTTATTTATT TATTTATTTT TACAAAGGAG ! ACT7CAGAAA AGTAATTACA TAAAGATAGT GAACATCATT TTATTTATTA j TAATAAAC7T TAAAATCAAA CTTTTTTATA 777777G77A CCC7TTTCATj TATTGGGTGA AA7CTCATAG TGAAGCCATT AAATAATTTG GGC7CAAGT? TTATTAG7AA AG7C7GCATG AAA777AAC7 7AACAATAGA GAGAG7T77C 35 GAAAGGGAGC GAA7G77AAA AAG7G7GATA 77A7A7777A 7T7CGA77AA

TAA77A7G77 7ACATGAAAA CATACAAAAA AA7AC7T7TA AAT7CAGAA7 AA7ACT7AAA ATATT7ATT7 GC77AA77GA 77AAC7GAAA ATTAT7TGA7 7AGGA7777G AAAAGA7CAT 7GGC7C7TCG 7CA7GCCGA7 TGACACCC7C CACAAGCCAA GAGAAACTTA AGT7G7AAAC 77TC7CAC7C CAAGCC77C7| A7A7AAACAT G7AT7GGA7G 7GAAG77A77 GCA7AAC7TG CA77GAACAAI 7AGAAAATAA CAAAAAAAAG TAAAAAAGTA GAAAAGAAA7 ATG, I

LbC2 med sekvensen:

DK 162399 B

25

TCGAGTTTTT ACTGAACATA CATTTATTAA AAAAAACTCT CTAGTGTCCA 5 TTTATTCGGC GAGAAGCCTT CTCGTGCTTT ACACACTTTA ATATTATTAT

ATCCCCACCC CCACCAAAAA AAAAAAAACT GTTATATCTT TCCAGTACAT TTATTTCTTA TTTTTACAAA GGAAACTTCA CGAAAGTAAT TACAAAAAAG ATAGTGAACA TCATTTTTTT AGTTAAGATG AATTTTAAAA TCACACTTT7 TTATATTTTT TTGTTACCCT TTTCATTATT GGG7GAAATC TCATAGTGAA ACTATTAAAT AGTTTGGGCT CAAGTTTTAT TAGTAAAGTC TGCATGAAAT TTAACTTAAT AATAGAGAGA GTTTTGGAAA GGTAACGAAT GTTAGAAAGT 10 GTGATATTAT TATAGTTTTA TTTAGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA

TTGACAATTT ΑΤΊΤΤΤΑΑΑΑ TTCAGAGTAA TACTTAAATT ACTTAT?TAC TTTAAGATTT TGAAAAGATC ATTTGGCTCT TCATCATGCC GATTGACACC 'CTCCACAAGC CAAGAGAAAC TTAAGTTGTA ATTTTTCTAA CTCCAAGCCT TCTATATAAA CACG7ATTGG ATGTGAAG7T GTTGCATAAC TTGCATTGAA CAATAGAAAT AACAACAAAG AAAATAAGTG AAAAAAGAAA TATG. S

15 og LbC3 med sekvensen:

TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA G7ACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAA7CTT G7AGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA 20 TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA

CATTA7ATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AG7TTGCATA AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA 25 TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA

CAGAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG._ -

Et andet eksempel på et foretrukket DNA-fragment ifølge opfindelsen er et DNA-fragment, som er identisk med, afledt af eller indeholder 51-f1 ankerende regioner fra LbC3-5’-3'-CAT-genet 30 med sekvensen: 35

DK 162399 B

26

TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT GTAGAT.TTAT TTCTTTTAT? TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA ATAAAAATAG TGAACATCG? CTAAGCATTT TTA7ATAAGA TGAATTTTAA ' AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATG7 ATCTTGTCTT AGAGCCATTT 5 TTGTTTAAA7 TGGATAAGAT CACAC7ATAA AGT7CTTCCT CCGAG7TTGA

TATAAAAAAA ATTG7TTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTCA CATTATATTA AAAAAATTAG GGC7CAATTT TTATTAGTAT AG7TTGCATA

AA il·. ,-mL i ΙλΛλλλΙλ^λ uruwuL*,vju aaaaUwvjau ^ GTGA7ATTAG AAATTTGTCG GATAT ATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTA7 11Å· · AAw«V ΓΙΛΛΛ i. VJrtVJ i i iTil.

TTCACCATAG CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA 10 ... _ ,sr GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA 7AAATAAGTA

J* * vjvjr\ x vj x \jrt Abi.u**cv#A ·*«<..%! Tbnnw\A4 ·η A«avmwUAÅ CAGAAAAGTA GAATTCTAAA AT G-

Opfindelsen angår desuden et rekombineret DNA-fragment til 15 brug ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen karakteriseret ved det i krav 21's kendetegnende del anførte, samt et plasmid, til brug ved udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, som er ejendommeligt ved det i krav 22's kendetegnende del anførte. Egnede plasmider ifølge opfindelsen er pARll, pAR29, 20 og pAR30 (eksempel 3 og 4). Disse plasmider tillader rekombination ind i A. rhizogenes-T-DNA-reqionen.

Til udøvelse af opfindelsen anvendes f.eks. en Aqrobakteri urostamme, som er karakteriseret ved at have et DN'A-fragment in-25 deholdende en inducerbar piantepromotor fra rodknoldspecifikke gener indbygget i T-DNA-regionen og som derfor er i stand til at transformere den inducerbare promotor ind i planter. Egnede bakteriestammer er f.eks. A. rhizogenes-stammerne AR1127, som bærer pAR29, AR1134, som bærer pAR30, og AR1000, 30 som bærer pARll.

Det er velkendt, at leghæmoglobingenerne i alle bælgplanter har samme funktion, jvf. Appleby (1974) i The Biology of Nitrogen Fixation, Quispel. A. Ed. North-Hol1 and Publishing Com-35 pany, Amsterdam, Oxford, side 499-554, og det er desuden for havebønne-PvLbl-genet vist, at der er en udstrakt grad af ho-mologi med sekvenserne af sojabønne-LbC3-genet. Det er ligele-

DK 162399 B

27 des velkendt, at ekspressionen af andre rodknoldspecifikke gener reguleres på lignende måde som leghæmoglobingenerne. Opfindelsen omfatter således anvendelsen af 5'-flankerende regioner fra leghæmoglobingener eller andre rodknoldspecifikke 5 gener fra alle planter, såfremt anvendelsen af sådanne DNA-fragmenter gør ekspressionen af et ønsket genprodukt til genstand for den i forbindelse med den foreliggende opfindelse karakteriserede regulering.

10 Det er velkendt, at det er muligt at ændre nueleotidsekvenser i ikke-betydende subregioner i 5'-f1 ankerende regioner uden, at dette indebærer ændret promotorakt ivitet og -regulering.

Det er også velkendt, at det, ved at ændre sekvenser i betydende subregioner i 5'-f1 ankerende regioner, er muligt at ændre 15 bindingsaffiniteter imellem nueleotidsekvenser og de til transskriptionsinitiering og trans1 at i ons initi er ing nødvendige eller ansvarlige faktorer eller effektorstoffer og dermed muligt at forbedre promotoraktivitet og/eller -regulering. Den foreliggende opfindelse omfatter selvsagt også anvendelsen af DNA-20 fragmenter, der indeholder sådanne ændrede sekvenser fra 5'-flankerende regioner, og specielt kan nævnes DNA-fragmenter, der er frembragt ved at rekombinere sekvenser fra B'-flan-kerende regioner fra vilkårlige gener med 5'-flankerende regioner fra rodknoldspecifikke gener, såfremt anvendelsen af 25 sådanne DNA~fragmenter gør ekspressionen af et ønsket genprodukt til genstand for den i forbindelse med den foreliggende opfindelse karakteriserede regulering.

Det skal bemærkes, at transformat ion af mikroorganismer fore-30 tages på i og for sig kendt måde, jf. f.eks. Mam’atis et al., (1982), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory.

Transformation af planteceller, dvs. introduktion af plasmid-35 DNA i planteceller, sker ligeledes på i og for sig kendt måde, jf. Zambryski et al., (1983), EMBO J. 2, 2143-2150.

DK 162399 B

28

Kløvning med restriktionsendonucleaser og digestion med øvrige DNA-modificerende enzymer er velkendt teknik og udføres som anbefalet af 1everandørerne.

5 Den i forbindelse med den foreliggende opfindelse anvendte Agrobacterium rhizogenes 15834-rif R anvendtes som en typisk repræsentant for A.rhizogenes, se White et al., J. Bact. Vol. 141 (1980), 1134-1141, og er isoleret af J.A. Lippincott, Department of Biological Sciences, Northwest University, Evan-10 s ton,.-Illinois G0201, USA. .

På tegningen viser fig. 1 nukleotidsekvenserne for 5'-f1 ankerende regioner fra 15 generne Lba, Lbc^, LbC2 og Lbcø, fig. 2 skema for subkloning af LbC3-genet, fig. 3 skema for subkloning af. 5 ’-f 1 ankerende sekvenser fra 20 LbC3~genet, fig. 4 skema for subkloning af 3'-flankerende region fra LbC3~ genet, og konstruktion af Lb-promotorkassette, 25 fig. 5 skema for konstruktion af LbC3~5'-3'-CAT-genet, fig. 6 skema for kloning og integrering af sojabønne-Lbc3-5'-31-CAT-genet, 30 fig. 7 skema for kloning og integrering af sojabønne-LbC3~ge- net, fig. 8 påvisning af sojabønne-LbC3~5'-3'-CAT-genet i transformerede kæl 1ingetandplanter, som beskrevet i eksempel 35 4a), fig. 9 påvisning af sojabønne-LbC3~genet i transformerede kæl-1 ingetandplanter som beskrevet i eksempel 4b), i

DK 162399 B

29 fig. 10 ekspression af LbC3-5'-3'-CAT-genet i forskellige væv fra kællingetand som beskrevet i eksempel 5a), f ig. 11 transskriptionsanalyse på væv fra LbC3~5'-3'-CAT-5 transformerede og Lbc3~transformerede Lotus-planteli - nier, som beskrevet i eksempel 6, fig. 12 bestemmelse af transskriptionsinitieringssted for so-jabønne-LbC3-promotoren i transformerede kællingetand-10 rodknolde som beskrevet i eksempel 7, fig. 13 påvisning af LbC3-protein i kæl 1 ingetandplanter med en transformeret sojabønne-LbC3~gen som beskrevet i eksempel 9, og 15 fig. 14 viser den N-terminale aminosyresekvens fra Lbc3~trans-formerede planter sammenlignet med tilsvarende fra Lotus cornicu1atus-leghæmoglobiner.

20 Opfindelsen belyses af de efterfølgende eksempler.

I eksemplerne gennemførtes transformat ion af Lotus cornicula-tus(kællingetand)planter som tidligere beskrevet ved sårinfektion på kimstængelen. Rødder, der var udviklet fra de trans-25 formerede planteceller, blev dyrket in vitro på Gamborg-B-5-medeium fra Sigma, St. Louis, Missouri, USA, og befriet for A. rhizoqenes-bakterier ved brug af antibiotika. Fuldstændigt regenererede planter blev dannet af disse rodkulturer på konventionel måde spontant gennem somatisk embryogenese eller orga-30 nogenese under lys og uden brug af piantehormoner.

Transformation af planteceller gennemførtes som beskrevet af Zambryski et al., (1983) EMBO J. 2. 2143-2150.

35 Mobilisering af plasmider ind i A. rhizogenes-bakteri er gennemførtes under anvendelse af et piasmidhjælpersystem, se E.

Van Haute et al., (1983), EMBO J., 3, 411-417. 1 5

Eksempel 1.

DK 162399 B

30

Sekvensbestemmelse af 51-flankerende regioner fra sojabønne-leg hæmoq lob i nq ener .

Fra en sojabønne-genbank er, som beskrevet af E. 0. Jensen et al., Nature Vol. 291, nr. 3817, 677-679 (1981) tilvejebragt de fire sojabønneleghæmoglobingener, Lba, Lbc^, LbC2 og LbC3. Den genetisk stabile, indavlede, invariable sojabønneart "Glycine 10 max. var. Evans" anvendtes som udgangsmateriale for det DNA, der anvendtes til opbygningen af denne genbank. De 5'-flan-kerende regioner fra de fire sojabønneleghæmoglobingener er isoleret, som beskrevet af E. 0. Jensen, Licentiatafhandling, Institut for Molekylær Biologi, Århus Universitet (1985), og 15 DNA-sekvenserne er bestemt ved anvendelse af didesoxymetoden, som beskrevet af F. Sanger, J. Mol. Bio. 143, 161-178 (1980), og angivet i sekvensskemaet, fig. 1.

Eksempel 2.

20

Konstruktion af LbC3~5'-3'-CAT.

Konstruktionen er foregået i en række delprocesser, som er beskrevet i det følgende: 25

Subkloning af LbC3-genet.

LbC3~genet blev isoleret på et 12 kb EcoRI-restriktionsfragment fra et sojabønne-DNA-bib1 iotek, hvilket er beskrevet i 30 Wiborg et al., Nucl. Acids. Res. (1982) 10, 3487. Et udsnit af dette fragment er vist øverst i vedlagte fig. 2. Dette fragment blev fordøjet med de opgivne enzymer for derefter at blive ligeret til pBR322, som vist på figuren. De resulterende plasmider, LbC3HH og LbC3HX, blev derefter fordøjet med PvuII 35 og religeret, hvilket resulterede i to plasmider, der benævnes som pLpHH og pLpHX.

31

DK 16239? B

Subkloning af 51-flankerende sekvenser fra LbC3~genet.

Til dette anvendtes pLpHH, som vist i vedlagte fig. 3. Dette plasmid blev åbnet med PvuII og behandlet med exonuklease 5 Bal31. Reaktionen blev stoppet på forskellige tidspunkter, og de afkortede plasmider blev ligeret til fragmenter fra pBR322. Disse var i forvejen blevet behandlet, som vist i fig. 3, således at de i den ene ende havde en DNA-sekvens TTC - 10 AAG -

Efter ligeringen blev der fordøjet med EcoRI, og de fragmenter, der, indeholdt 5'-f1 ankerende sekvenser, blev ligeret til EcoRI-fordøjet pBR322. Disse plasmider blev transformeret ind 15 1 E. c o 1 i K803 (som er en typisk repræsentent for E. coli K12-recipientstammerne), og plasmiderne i transformanterne blev undersøgt ved sekvensanalyse. Et plasmid, p213 5'Lb, isoleret fra en af transformanterne, indeholdt en 5’-flankerende sekvens, der slutter 7 basepar før Lb ATG-startkoden, 20 således at sekvensen er som følger: 2kb

- 5'-f1 ankerende---AAAGTAGAATTC

LbC3-sekvens 25

Subkloning af 3'-flankerende region fra LbC3-genet.

Til dette anvendtes pLpHX, der blev fordøjet med XhoII. Enderne blev delvis udfyldt, og overskydende enkeltstrenget DNA 30 blev fjernet med Sl-nuklease som vist i vedlagte fig. 4. Det viste fragment blev ligeret til pBR322, der var forbehandlet som angivet på figuren. Konstruktionen blev transformeret ind i E. coli K803. En af transformanterne indeholdt et plasmid, der blev benævnt Xho2a-3'Lb. Da XholI-genkendelsessekvensen er 35 beliggende umiddelbart efter Lb-stopkoden (se fig. 2), indeholdt plasmidet ca. 900 af den 3'-flankerende regions basepar, og sekvensen startede med GAATTCTACAA---.

DK 162399 B

32

Konstruktion af Lb-promotorkassette.

Et EcoRI/SphI-fragment fra Xho2a-3’Lb blev blandet med et BamHI/EcoRI-fragment fra p213-5'Lb. Disse to fragmenter lige-5 redes via BamHI/Sphl-kløvningspunkterne til et pBR322-derivat, hvor EcoRI-genkendelsessekvensen var blevet fjernet (fig. 4).

De ligerede plasmider blev transformeret ind i E. col i K803.

Et plasmid i en af transformanterne indeholdt de korrekte fragmenter, og det blev benævnt pEJLb 5’-3'-l.

10_________________ . .......................

Konstruktion af LbC3~51-3'-CAT-genet.

CAT-genet fra pBR322 blev isoleret på flere mindre restriktionsfragmenter, som angivet på vedlagte fig. 5. Den 5'-kod-15 ende region blev isoleret som et Alul-fragment, der efterfølgende blev ligeret til pBR322, der er behandlet som angivet på figuren. Dette blev transformeret ind i E. coli K803. Adskillelige transformanter indeholdt det korrekte plasmid. Der blev udtaget et, som blev benævnt Alull. Den 3'-kodende region blev 20 isoleret på et Taql-fragment. Dette fragment blev behandlet med exonuklease Bal31, hvorefter der blev adderet EcoRI-kob-lere. Dernæst blev det fordøjet med EcoRI og ligeret til EcoRI-fordøjet pBR322. Dette blev transformeret ind i E. coli K803, og transformanterne blev analyseret. Et plasmid (Taq 12) 25 indeholdt den 3'-kodende region fra CAT-genet plus 23 basepar 3'-f1 ankerende sekvenser for derefter at slutte i følgende sekvens __ CCCCGAATTC. Herefter blev følgende frag menter ligeret samlet til EcoRI-fordøjet pEJLb 5 * -3'—1: EcoRI/ PvuII-fragment fra Alul, PvuII/Ddel-fragment fra pBR322 og 30 Ddel/EcoRI-fragment fra Taq 12. Denne 1 i ger ingsb1 and ing blev transformeret ind i E. coli K803. Adskillelige transformanter indeholdt det korrekte plasmid. Der blev udtaget et, som blev kaldt pEJLb 5'-3' CAT 15.

i 35

DK 162399 B

33

Eksempel 3. a.

5 Kloning og integrering af sojabønne-LbC3~51-3'-CAT-genet.

To EcoRI-fragmenter (nr. 36 og nr. 40) fra TL-DNA-regionen af A. rhizogenes 15834 pRi-pi asmi det anvendtes som "integrations-steder". LbC3-5'-3'-CAT-genet blev derfor underklonet (som 3,6 10 kb BamHI/SalI-fragment) i to vektorer pARl og pAR22, som bærer ovenstående EcoRI-fragmenter. De resulterende plasmider, pAR29 og pAR30, mobiliseredes separat ind i A. rhizogenes 15834-rif R under anvendelse af et plasmidhjælpersystem, se E. Van Haute et al., (1983), EMBO J., 3, 411-417. Hverken pAR29 eller pAR30 15 kan repliceres i Aqrobakte-ri uro. Selektion med rifampicin 100 pg/ml og piasmidmarkørerne spectinomycin 100 pg/ml, streptomycin 100 pg/ml eller kanamycin 300 pg/ml vil derfor selektere A. rhizoqenes-bakteri er, der har integreret plasmiderne via homolog rekombination gennem EcoRI-fragmenterne 36 eller 40.

20 Strukturen af de herved dannede T|_-DNA-regioner - overført til de transformerede plantelinier L5-9 og L6-23 - er angivet ned-erst på vedlagte fig. 6. Der er tillige for L6-231inien vist de EcoRI- og Hi ndiII-fragmenter, der bærer LbC3-5'-3'-CAT-gen-et og derfor hybridiserer til radioaktivt mærket LbC3-5'-3'-25 CAT-DNA, der anvendes som en sonde, jf. eksempel 4a.

Kloning og integrering af sojabønne-LbC3~genet.

30

EcoRI-fragmentet nr. 40 er her brugt som "integrationssted". LbC3~genet blev derfor underklonet (som 3,6 kb BamHI-fragment) i pARl-vektoren under dannelse af plasmidet pARll, som blev overført til TL-DNA-regionen, som anført i a.. Strukturen af 35 TL-DNA-regionen, overført til den transformerede plante!inie L8-35, er vist nederst på vedlagte fig. 7. Der er tillige vist de EcoRI- og Hindlll-fragmenter, der bærer LbC3~genet og

DK 162399 B

31 derfor hybridiserer til radioaktivt mærket LbC3-DNA, der anvendes som en sonde, jf. eksempel 4b.

Eksempel 4.

5 a.

Påvisning af sojabønne-lbC3~5'-31-CAT-genet i transformerede kæl!inqetandplanter (Fig. 8) 10- DNA, der-var ekstraheret fra transformerede linier (L6-23) eller utransformerede kontrol pianter, og som er skåret med restriktionsenzymerne EcoRI og Hindlll, blev analyseret ved Southern-hybridi sering. Resultatet ses på fig. 8. Radioaktivt mærket LbC3~5'-3'-CAT-gen blev anvendt som en sonde til at 15 påvise tilsvarende sekvenser i de transformerede linier. De med tal markerede bånd svarer til restriktionsfragmenter, som udgør dele af LbC3-5'-3'-CATgenet, som angivet i eksempel 3a's restriktionskort (fig. 6).

20 b.

Påvisning af sojabønne-Lbc3-genet i transformerede kællinge-tandplanter (Fig. 9) 25 DNA, der var ekstraheret fra transformerede linier (L8-35) eller utransformerede kontrol pianter, og som var skåret med restriktionsenzymerne EcoRI og Hindlll, blev analyseret ved Southern-hybridi ser ing . Resultatet ses på fig. 9. Radioaktivt LbC3~gen blev anvendt som en sonde til at påvise tilsvarende 30 sekvenser i de transformerede linier. De med tal markerede bånd svarer til restriktionsfragmenter, som udgør dele af LbC3-genet, som angivet i eksempel 3b's restriktionskort (fig.

7).

35 i 5

Eksempel 5.

DK 162399 B

35 a. Ekspression af LbC3~51-31-CAT-genet i forskellige væv fra kællinqetand (Fiq. 10)

Aktiviteten af ch1oramphenicol-acetyltransferase (CAT)-enzymet måltes som mængden af acetyleret chloramphenicol (AcCm), dannet fra l^C-chloramphenicol. p§ fig. 10 ses de acetylerede former lAcCm og 3AcCm, der blev adskilt fra Cm ved tyndtlags-10 kromatografi i chloroform/methanol (95:5). Kolonne 1-3 viser, at der ikke er CAT-akti vitet i rod (R), knold (N) samt blad + stængel (LS) af utransformerede kæl!ingetandplanter. Kolonne 4-6 og 7-9 viser CAT-aktiviteten i tilsvarende væv af LbC3-5'-3'-CAT-transformerede L6-23- og L5-9-planter. Omdannelse af 15 chloramphenicol i kolonne 5 og 8 viser den organspecifikke ekspression af LbC3-5'-3'-CAT-genet i rodknolde. Kolonne 10-12 viser manglen på CAT-akti vitet i planter, der er transformeret med LbC3~genet.

20 b.

Tabel L6-23 L5-9 CAT-aktivitet CAT-akti Vitet 25

Rod 0 0

Knold 68830 cpm/pg 154.000 c p m/μ g protein'time protein-time

Blade + stængel 0 0 30 I tabellen (b) er CAT-aktiviteten i LbC3-5'-3'-CAT-transformerede L5-9- og L6-23-planter opgjort som den mængde af l4C-chloramphenicol, der er omsat til acetylerede derivater. Mængden af radioaktivitet i de acetylerede derivater er optalt 35 ved væskescintillation og angivet i cpm/pg protein.ti me.

Ekspression af 1 eghæmog1 obin-LbC3~5'-3'-CAT-genet i Trifolium repens (hvidkløver) viser den bevarede mekanisme, som regule-

DK 162399 B

36 rer ekspressionen af rodknoIdspecifikke gener.

CAT-aktivitet i transformeret T. repens cpm/pg protein/time.

5

Rod 0

Knold 50.000

Eksempel 6.

10

Transskriptionsundersøgelse (Northern-analyse) på væv fra LbC3~5'-31-CAT-transformerede og Lbc3-transformerede Lotus-plantelinier (Fig. 11) 15 5 pg totalt RNA, der var ekstraheret fra rod (R), knold (N) eller blad + stængel (LS), og adskilt i formaldehydagarosege-ler, overførtes til nitrocellulose. Resultaterne ses på fig.

11. Kolonne 1 indeholder 5 μ g totalt RNA fra 20 dage gamle sojabønneknolde som kontrolplanter. Kolonne 2-4 og 5-7 inde-20 holder totalt RNA fra henholdsvis rod, knold eller blad + stængel fra de LbC3*5*-3 *-CAT-transformerede linier L5-9 og L6-23. Kolonnerne 8-10 indeholder RNA fra tilsvarende væv af kæl 1 ingetand, der var transformeret med A. rhizoqenes bærende Lbc3-genet i T[_-DNA. I (a) er radioaktivt DNA fra CAT-kodese-25 kvensen anvendt som en sonde til hybridisering. Den organspecifikke transkription af Lbc3-5'-31-CAT-genet i rodknolde fra L5-9- og L6-23-1 i nierne ses i kolonne 3 og 6. I (b) er vist transskriptet for konstitutive under anvendelse af en cDNA-sonde for det humane ubiquitingen til hybridiseringen. I (c) 30 er vist den organspecifikke transskription af kællingetands egne leghæmoglobingener. En cDNA-sonde fra sojabønnens Lba-gen er brugt til denne hybridisering.

35

DK 162399 B

37

Eksempel 7.

Bestemmelse af transkriptionsinitieringssted (CAP site) for sojabønne-Lbc3-promotoren i transformerede kæl 1 ingetandrodknol-de (Fig. 12_) 5

Beliggenheden af "CAP site" bestemmes på nucleotidniveau ved hjælp af primer-forlængelse. Et syntetisk o 1 igonuc1eotid,5' CAACGGTGGTATATCCAGTG 3', som er komplementær til nuc1eoti derne 15 - 34 i CAT-genets kodesekvens, anvendtes som primer for en-10 zymet omvendt transskriptase. Herved dannes et enkeltstrenget DNA, hvis længde svarer til afstanden mellem primerens 5'-ende og det primede mRNA's 5'-ende. En 83 nucleotider lang DNA-streng ville forventes ud fra kendskab til sojabønne-LbC3~gen-ets transskriptions initieringssted. Resultaterne ses på fig.

15 12. I kolonne 2, 3 og 4 - talt fra venstre mod højre - er vist de dannede DNA-strenge, når primer-forlængelsen er kørt på polyA+oprenset mRNA fra henholdsvis transformerede kællinge-tandrodknolde, transformerede kæl 1 ingetandb1ade + stængel og utransformerede kæl 1ingetandrodknolde. De i kolonne 2 viste 20 85, 86, 87, 88 og 90 nucleotider lange cDNA-strenge påviste korrekt Lbc3-promotorfunkti on i kæl 1 ingetand. CAP-stederne ("CAP sites"), svarende til de dannede cDNA-sekvenser, er angivet med * på den givne delsekvens af LbC3~5'3'-CAT-regionen.

I sekvensen er LbC3-promotorens TATA-box og den tilsvarende 25 translationsinitieringskode for CAT-kodesekvensen markeret ved understregning.

30 35 5

Eksempel 8.

DK 162399 B

38 Påvisning af korrekt udviklingsmæssig kontrol af Lt>C3-5'-3'-CAT-qenet i transformerede kæl 1 inqetandplanter (L6-23).

Φ <1) μ Ό M <—i

C O

•H C <D

•μ μ ή

W I—I

*5 ζϋ » ' o

·· ·· i-l ·· Ό ·« ·· C

<-* > G) m dj rr -S. m v;

ιη ΛΌ (!) V U

1 u G_ C iH C Ό i—i c C<D

•Η Ό *HI *0 O ·Η O iH «d -Η *Π μ o μ g c μ > c μ s μ-s es e* cn .* e* = eh w eh « CAT-akt i v i tet i cpm/μg protein-time 0 0 32,6 342,3 1255* 15

Nitrogenaseaktivitet nmol ethylen/pg protein 000 0,5 2,7 • time.

2o * Substratbegrænset reaktion, faktisk aktivitet ca. 68000 cpm/pg protein *time.

Chloramphenico1-acetyltransferase- og nitrogenaseaktivitet måltes på afskårne rodstykker med knolde i de angivne forske 1-25 lige udviklingstrin. CAT-aktivitet kan påvises i de hvide, distinkte knolde, mens nitrogenaseaktivitet først kan påvises i små røde knolde. Dette forløb svarer til det udviklingsforløb, der er kendt fra sojabønnekontrolplanter og beskrevet af Marcker et al. EMBO. J. 1984, 3, 1691-95. CAT-aktivi teten be-30 stemtes som i eksempel 5. Nitrogenaseaktiviteten måltes som knoldenes acetylenreduktionsevne med påfølgende gaskromatografisk bestemmelse af ethylen.

35

Eksempel 9.

5

DK 162399 B

39 Påvisning af LbC3~protein i kæl!ingetandplanter med indtransformeret sojabønne-Lbc3-gen (Fig. 13)

Proteiner, der var ekstraheret fra rodknolde af Lbc3-trans-formerede (L8-35), Lbc3-51-31-CAT-transformerede og utransfor-merede planter adskiltes ved isoelektrisk fokusering ved en pH-gradient på 4 til 5. Resultaterne ses på fig. 13. Kolonne 10 1, 3, 5, 7 og 9 viser Lbc^-, LbC2~, LbC3~ og Lba-proteiner, der er syntetiseret i sojabønnekontrolrodknolde. Kolonne 2 viser proteiner fra rodknolde af LbC3~5'-3'-CAT-transformerede L6-23-kæl 1 i ngetandpl anter, mens kolonnerne 6 og 8 viser proteiner fra utransformerede planter. I kolonnerne 4 og 10 ses 15 sojabønne-LbC3-protein, der er syntetiseret i rodknolde af kæl 1 ingetandp1anter, (L8-35), der er transformeret med Lbc3~ genet. LbC3~protei nbåndet er markeret med pil.

Det protein, som vandrer som LbC3, markeret med pile i spalte 20 4 og 10, blev elueret fra gelen til isoelektrisk fokusering og analyseret ved automatisk aminosyreanalyse. Den N-terminale am inosyresekvens af proteinet blev sammenlignet med den N-ter-minale aminosyresekvens for totalt leghæmoglobin, der var ekstraheret fra rodknolde fra utransformeret Lotus corniculatus.

25 Fig. 14 viser overensstemmelsen mellem de to opnåede sekvenser. Den øverste sekvens, der er opnået fra Lbc3~transformede planter, svarer nøjagtigt til den kendte am inosyresekvens for sojabønne-LbC3-proteinet og er klart forskellig fra Lotus corniculatus-1eghæmog1 obi nerne.

30 35 5

DK 162399 B

40

Eksempel 10.

Ekspression af Lbc3~5'-3'-CAT-genet kræver 5'-Lb03~promotor-reqionen.

LbC3~5'-3'-CAT-genkonstruktionen bærer en 2 kb 5'-LbC3-promo-torregion. Trinvis fjernelse af sekvenser fra 5'-enden af denne region viste, at denne promotorregion kræves til den karakteristiske ekspression af LbC3-51-3'-CAT-genet.

10 5'Lbc, 3'Lbc, ,_ 3 ,— -, 3

Sall ' Xbal 1—“-! Sall I--2^-__f 15

Lbc3~5'-3'-CAT-genkonstruktionen blev åbnet i det ovenfor viste unikke Xbal-sted og fordøjet med eksonuclease Bal31. Et SalI-koblerfragment blev ligeret til de dannede stumpe ender, 20 og de forkortede SalI-fragmenter bærende LbC3~5'-3·-CAT-genet blev overført til L. corniculatus. Virkningen af at fjerne promotorsekvenser blev målt som CAT-aktivitet. Slutpunkter på den fjernede 5'-region gives som afstanden fra CAP-stedet i nucleotider.

25 - CAT-aktivitet 5'Lbc, 3'Lbc, cP”/^g proteln/time 3 3 Rod · Knold Blad . 2000 .__ _, ‘ ~~t--CAT—1 0 80000 0 -950 1- ^-1 0 10000 0 30 _474 i-; ------.-H 0 3000 0 -230 £ZZZU i o 3000 o 35 . -7a -=-— 0 0 0

DK 162399 B

41

Det drastisk reducerede niveau af CAT-aktivitet, udtrykt fra LbC3-promotoren, som var fjernet til nucleotid -230 og aktiviteten på nul fra promotoren, som var fjernet til nucleotid -78 viser, at LbC3-promotorregionen kræves til den rodknold-5 specifikke ekspression af LbC3~5'-3·-CAT-genet.

Eksempel 11.

Konstruktion af N23-CAT-qenet.

10 N23-genet blev isoleret fra en sojabønne-DNA-bank, som beskrevet i et fortryk til en artikel i Nucleic Acids Research, kopi vedi agt. N23-CAT-genet blev konstrueret ud fra det modificerede LbC3~5'-3'-CAT-gen, der bæres på plasmid pEJ-5'-3'-15 CAT101, som beskrevet i ansøgernes ligeledes verserende pa tentansøgning nr. 4889/85, og et 1 kb EcoRI-, Ddel-fragment indeholdende N23-5'-promotorregionen. Beliggenheden af EcoRI-og Ddel-stederne i N23-promotorregionen er angivet på den nedenfor viste DNA-sekvens. Den anvendte klon ingsprocedure er 20 vist nedenfor.

N23-CAT-genet blev overført til planter ved hjælp af samme metode som LbC3~5'-3'-CAT-genet.

25 30 35 DK 162399 B.

42 *~4 C£ . BamHI S % Jj ØLU/V> O / H--* ΚρηΙ N23-5-promotor

Sglll - > . Kl enow-endeudfyldt -bc3 v ‘1! \

BamHI/Bgl II-fordøiet Kl enow-endeudfyldrv ^

Sall //* ^N^23 I pN231ol r l ^ 7Kb i \ / 3'<-bc3 /sail \SalI -fordøjet ___Sall

f/f U

( EA52?v ball Sall- N23-CAT 'n \ 7’δ Γ f*—--^ if Π \ fordøjet [=.

\ f IU 10,3 Kb. γ m \ /z'Lbc·, 36 S \ /Sall o 2 N. /

Ikke i korrekt målestoksforhold. £35 S

o Ξ3 73 *—

DK 162399 B

43 DNA -sekvens af 5'ΐ-promotorregion fra N23-genet

prN23 1057 BASER

10 20 30 AO 50 60 70

jSJii’.rTr^^t-TCgrCCGGSigATCGATCCTCTAGfilTTr'i-'^CTGCAGCCCAfiGCTTSGATCAATCfiATTAA

TcoRI Sall eo go loo no iso 120 iao

TTCTATTGASACACGATTTGAACAATTTTTACAATATGASACTATTTTTGGTTTTTTATTTGATCCAAmA

iso iso · 170 iao 190 aoo 210

AAATTTAAAGCTTTAGATGATGATGAATTGAAM''iAATATTGTA7TAA7MM7GAAAAGTTN>MNWHGGTTTA

220 230 240 250 260 270 290

ATGAATGCTA7 GriTATTGATGGTCTTGATNTATTKi'lCAGAftTTGAAAGTATTAfiGAGAAG TG TTAAGAfiA

2S0 300 310 320 330 340 350

A&Ai-iGTTAcOACACCAA TASAAGTATTGAirTTA ι ATTammmL. i i i hbnTTL 111 TCnnA 11; i iTnUntTG

3SO 370 330 330 400 410 420

CATATAGAhTTTTATT&ACAATCCTTATAACAGTTGCTACTGTTGAAAGaCGTTCTTCAAAATTAAAATT

A 30 440 450 460 470 480 4S0 AG i TAAm i CH7ATCTAAriA i CAmuAATGT ΓΑ6Αμ:γΑΤΑ6μΤ itMATGMtTTAtrTAi t iTmTl.TmTTGAm 500 510 520 530 540 550 560

At 7AAntTt 7ΤAGAA77G7TTSA fTATAMAACTCT Ga i AAm TtA i 71 TGuAG ι TAAAaAAmCTmG.mmGAT

570 530 530 SOO SiO S20 S30

7 f-AT AT AA AA A 7 i tA Γ ΛΤ777A 7 A7AA7 A7A i i At At 75 i CT77 AmAm i Tw » Tt i MMnririr-ti-tMC AT »T ι T

640 650 660 570 580 690 70v AA.-iTAA rAAAA7AAAGCAA*.7C7TAA7TTTAfi7GAAACA7CCC7TTG7TAAACCGAM7C77CvA7AATt i 710 ’ 720 730 740 750 760 770

AAmAmT Γ AATGCTTGATGGmmGTTTTTAA TTTG TTCTATCCAATACTCAAAGtG i T:_«7mAm7 ATTTT 77T

730 780 800 SiO 320 830 S4>J

TA rCA7TTA T mTGT TG i AAA TATGAm TGCAC7AG ΓAATTmGTTTAATGm i hhApi i A i m i i ^TACAGm ^ 850 550 870 330 830 9oO 910

ATTTCTG i'C7CT7GGC»',AL:rCG7GAGAA7TGAA7ATA77ATAAAGA7GAAAGG TCG-TTACAmTTTTTTTT

920 920 840 350 960 970 930 AGah ΓΑΠΑίΑιΤΤί-τΓ AT mCAA TTCLT At A TT7TG7 TA t AA A a TTCAGmT mi i t1 A TG»-*t ·. AT Am A i Mt A · 990 100'j 1010 1‘.'20 1030 104».· l05* ‘

GaGCACACACCAiAACTAG f c TCAAATTAAGTAAEGTGCTAm rTATTAt-.ttCTAt! :TAAiA Γ aaccaaG γ a

OcJei ATI v· «*·*

Eksempel 12.

5

DK 162399 B

44

Organspecifik ekspression af sojabønne N23-CAT-qenet i rodknolde fra L. corniculatus og Trifolium repens.

Aktiviteten af chloramphenicolacetyltransferase (CAT) blev målt som i eksempel 5 og er givet i Cpm/pg protein/timer.

Tabel a.

10 CAT-aktivitet N23-CAT— transforneret Utransforneret ø L.corniculatus .L.corniculacus 1C Rodknold 86150 0 10 _

Rod . 0 0

Tabel b. CAT-aktivitet N23-CAT-cransformeret Utransforneret 20 T.reoens T.repejis

Rodknold. 148000 0

Rod 0 0 25 Tabel (a) og (b) viser den organspecifikke ekspression af N23-CAT-genet i rodknolde fra L. corniculatus og T. repens. L. corniculatus blev podet med Rh i zob i um 1 ot i, mens T. repens blev podet med Rhi zobi um trifoli i .

30 Eksempel 13

Ekspression af N23-CAT-qenet kræver 5'-N23-promotorreqionen N23-CAT-genkonstruktionen bærer ca. 1 kb af N23-5'-promotorre-35 gionen. Trinvis fjernelse af sekvenser fra 5'-enden af denne region viste, at promotorregionen er nødvendig for den karakteriserede ekspression af N23-CAT-genet. Exonukleasen Bal 31

DK 162399 B

45 artvendtes til f rembr i ngel se af afkortede 5'-regioner, som angivet i eksempel 10. Slutpunkter for N23-51-regionerne er givet som afstanden fra CAP-stedet i nukleotider.

5 CAT-aktivitet cpm/pg protein/timer

Rod Knold -913)-5' N23--CAT -3'Lbc3-1 0 97#000 10 -347 I-' -i 0 80*000 -294 1-r 1-i 0 7*000 -166 j—i 1---/ 0 0 15

Eksempel 14 5'-promotorregionen er tilstrækkelig til rodknoldspecifik eks-pression i stor mængde af N23-genet.

20

Leghæmog1obin-LbC3~31-regionen af N23-CAT-konstruktionen blev erstattet med 3'-regionen fra det T-DNA-afledte Octopinsyntase (OCS)-gen. 900 bp LbC3-3'-Ecorl/SalI-restriktionsfragment af N23-CAT-genet blev udskiftet med et 320 bp PvuII/AhalII-re-25 striktionsfragment indeholdende 31-OCS-polyadenylenstedet (Gielen et al. 1984 EMBO J. 3. 835-846). Det resulterende gen blev stadigt udtrykt specifikt i rodknolde.

CAT-akt i v i tet 30 cpm/pg protein/timer

Rod Knold (-5*N23- cat -3'OCS- 0 60.000 I forbindelse med opfindelsen er det således blevet påvist, at rodknoldspecifikke gener kan udtrykkes organspecifikt efter 35

DK 162399 B

46 overførsel til andre planter, her Lotus corniculatus og Trifo-lium repens. Endvidere er det påvist, at de 5'-flankerende regioner, der omfatter promoteren, er under kontrol af den organspecifikke reguleringsmekanisme, idet den organspecifikke 5 kontrol af LbC3-5'-3'-CAT-genet i Lotus corniculatus foregik på transskriptionsniveau. Det overførte Lbc3-5'-3'-CAT-gen blev således kun transskriberet i rodknolde fra transformerede planter og ikke i andre organer, såsom rødder, stængler og blade.

10

Udtrykket af LbC3~5'-3'-CAT-genet i rodknolde af transformerede planter fulgte også det fra sojabønnerodknolde kendte udviklingsmæssige forløb. Ingen CAT-aktivitet kunne påvises i rødder eller små hvide rodknolde (eksempel 8). Lav aktivitet 15 var til stede i de mere udviklede hvide distinkte knolde, medens høj aktivitet kunne måles i de senere udviklede små røde knolde og modne knolde.

Den organspecifikke ekspression og korrekte udviklingsmæssige 20 ekspression af overførte rodknoldspecifikke gener, her eksemplificeret med LbC3~5'-3’-CAT-genet, vil som speciel anvendelse muliggøre funktionel ekspression af rodknoldspecifikke gener også i andre planter end bælgplanter. Overføres alle de rodknoldspecifikke plantegener, som er nødvendige for rod-25 knolddannelse, fra en bælgplante til en ikke-rodknolddannende planteart, vil den korrekte organspecifikke ekspression, som er påvist ovenfor, muliggøre dannelse af funktionelt aktive, ni trogen fikserende rodknolde på denne plante efter infektion med Rhizobium. Disse planter vil på denne måde kunne vokse ud-30 en tilførsel af eksterne uorganiske eller organiske nitrogen forbindelser. Rodknoldspecifikke promotorer, her eksemplificeret med LbC3~promotoren, må i dette tilfælde bruges til at regulere udtrykket af de overførte gener.

35 Ifølge den foreliggende opfindelse anvendes en rodknoldspeci fik promotor til at udtrykke gener. Genproduktet eller funktionen af genproduktet forbedrer rodknoldens funktion, f.eks.

DK 162399 B

47 ved at ændre oxygentransport, metabolisme, nitrogenfiksering eller nitrogenoptagelse.

Rodknolde anvendes således til syntese af biologiske produk-5 ter, der forbedrer planten selv, eller som senere kan udvindes af planten. En rodknoldspecifik promotor kan bruges til at udtrykke et gen. Genproduktet selv eller en forbindelse dannet af genproduktet udgør den/de ønskede produkter.

10 Det er i forbindelse med den foreliggende opfindelse ligeledes blevet vist, at sojabønne-LbC3-leghæmoglobinproteinet selv (LbC3~genproduktet) findes i stor koncentration i rodknolde af kæl 1ingetandplanter, der udtrykker Lbc3~kodesekvensen under kontrol af LbC3-promotoren. Dette er påvist ved at klone soja-15 bønnens genomiske LbC3~gen - indeholdende kodesekvens, intervenerende sekvenser og 5'- og 31-f1 ankerende sekvenser - ind i integrationsvektoren pARl. Et 3,6 kb BamHI-fragment, LbC3HH, som vist i eksempel 2, klonedes i pARI-pi asmi det og overførtes til kællingetand, som tidligere angivet.

20

Det i transformerede rodknolde af kællingetand fundne høje niveau af LbC3~protein (eksempel 9), svarende til niveauet i sojabønnerodknolde, påviser en effektiv transskription af LbC3~ promotoren og en effektiv bearbejdning og translation af LbC3~ 25 mRNA i kællingetand.

Det høje niveau af CAT-aktivitet, der findes i transformerede rodknolde, er ligeledes et resultat af en effektiv translation af mRNA, som er dannet ud fra det kimæriske LbC3~gen. Leder-30 sekvensen på LbC3~genet er bestemmende for translationsinitieringen og må bestemme den endelige translationseffektivitet. Denne effektivitet er af betydning for effektiv syntese af genprodukter i planter eller planteceller. LbC3- eller en anden leghæmoglobin-ledersekvens kan således bruges til at for-35 øge det endelige ekspressionsniveau for en given plantepromo-tor. Konstruktion af et DNA-f ragment, der består af en Lb-ledersekvens som første sekvens og en vilkårlig promotor som

Claims (27)

1. Fremgangsmåde til ekspression af gener i bælgplanteceller ved transformering af cellerne med et rekombineret DNA-frag-ment, der indeholder dels det gen, der ønskes udtrykt, dels en 10 5'-flankerende region, hvori indgår en promotor, og eventuelt en 3'-flankerende region, og dyrkning af de transformerede celler i et egnet vækstmedium, kendetegnet ved, at der anvendes 5'- eller i givet fald 5'- og 3'-f1 ankerende regioner fra et rodknoldspecifikt plantegen, og at promotoren er 15 en inducerbar piantepromotor, som regulerer, at ekspressionen sker i rodknoldene på bestemte udviklingstrin og som led i den symbiotiske nitrogenfiksering.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 20 at den 51-f1 ankerende region er indentisk med, afledt af eller indeholder 5'-f1 ankerende regioner fra rodknoldspecifikke gener.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, 25 at den 51-f1 ankerende region er identisk med, afledt af eller indeholder 5'-flankerende regioner fra planteleghæmoglobinge-ner.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at 30 den 5 *-f1 ankerende region er identisk med, afledt af eller indeholder 5'-flankerende regioner fra sojabønneleghæmoglobin-gener.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at 35 den 5'-f1 ankerende region er identisk med, afledt af eller indeholder 51-flankerende regioner fra Lba-genet med sekvensen : DK 162399 B 49 GAGATACATT ATAATAATCT CTCTAGTGTC TATTTAT7AT TTTATCTGGT GATATATACC TTCTCGTATA C7GTTATTTT TTCAATC7TG TAGATTTACT TCTTTTA7TT TTATAAAAAA GACTTTATTT TTTTAAAAAA AATAAAGTGA ATTTTGAAAA CATGC7C7TT GACAATTTTC TGTTTCCTTT TTCATCAT7G GGTTAAATCT CATAGTGCCT CTATTCAATA ATTTGGGCTC AATTTAATTÅ GTAGAG7CTA CATAAAATTT ACCTTAATAG TAGAGAATAG AGAGTCTTGG 5 AAAGTTGGTT TTTCTCGAGG AAGAAAGGAA ATGTTAAAAA C7GTGATATT TTTTTTTTGG ATTAATAGTT ATGTTTATAT GAAAACTGAA AATAAATAAA CTAACCATAT TAAATTTAGA ACAACACTTC AATTATTTTT 7TAA7TTGAT TAATTAAAAA ATTATTTGAT TAAATTTTTT AAAAGATCG7 TGTTTCTTC7 TCATCATGCT GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC ACATAAGC77 TGGTTTTCTC ACTCTCCAAG CCCTCTATAT AAACAAATAT TGGAGTGAAG TTG7TGCATA AC7TGCATCG AACAATTAAT AGAAATAACA GAAAATTAAA hAhCjrtAft X Λ A (j* ..... 10

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den 5 *-flankerende region er identisk med, afledt af eller indeholder 51-f1 ankerende regioner fra Lbcl-genet med sekven- 15 sen: TTCTCTTAAT ACAATGGAGT TTTTGTTGAA CATACATACA TT7AAAAAAA AATC7C7AGT GTCTATTTAC CCGGTGAGAA GCCTTCTCG7 GT777ACACA C77TAATATT ATTATATCC7 CAACCCCACA AAAAAGAATA C7G7TA7A7C T77CCAAACC TG7AGATTTA TTTATTTATT TATT7A7TT7 TACAAAGGAG AC77CAGAAA AG7AAT7ACA TAAAGATAG7 GAACATCATT TTATT7AT7A 20 TAATAAACTT TAAAATCAAA CTTTTTTATA TTTTTTGTTA CCC7777CAT TATTGGGTGA AATCTCATAG TGAAGCCATT AAATAATTTG GGCTCAAGTT TTATTAGTAA AGTCTGCATG AAATTTAACT TAACAATAGA GAGAGTTTTC GAAAGGGAGC GAATGTTAAA AAGTGTGATA TTATATTTTA TTTCGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA CATACAAAAA AATACTTTTA AATTCAGAAT AATACTTAAA ATATTTATTT GCTTAATTGA TTAACTGAAA ATTATTTGAT TAGGATTTTG AAAAGATCAT TGGCTCTTCG TCATGCCGAT TGACACCCTC CACAAGCCAA GAGAAACTTA AGTTGTAAAC TTTCTCACTC CAAGCCTTCT 25 ATATAAACAT GTATTGGATG TGAAGTTATT GCATAACTTG CATTGAACAA TAGAAAATAA CAAAAAAAAG TAAAAAAGTA GAAAAGAAAT ATC.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at 30 den 5'-f1 ankerende region er identisk med, afledt af eller indeholder 5’-flankerende regioner fra Lbc2-genet med sekvensen : 35 DK 162399B 50 TCGAGTTTT?!ACTGAACATA CATTTATTAA AAAAAACTC? CTAGTGTCCA TTTATTCGGC GAGAAGCCTT CTCGTGCTTT ACACACTTTA ATATTATTAT ATCCCCACCC CCACCAAAAA AAAAAAAACT GTTATATCTT TCCAGTACAT TTATTTCTTA TTTTTACAAA GGAAACTTCA CGAAAGTAAT TACAAAAAAG ATAGTGAACA TCATTTTTTT AGTTAAGATG AATTTTAAAA TCACACTTTT TTATATTTTT TTGTTACCCT TTTCATTATT GGGTGAAATC TCATAGTGAA ACTATTAAAT AGTTTGGGCT CAAGTTTTAT TAGTAAAGTC TGCATGAAAT 5 TTAACTTAAT AATAGAGAGA GTTTTGGAAA GGTAACGAAT GTTAGAAAGT GTGATATTAT TATAGTTTTA TTTAGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA TTGACAATTT ATTTTTAAAA TTCAGAGTAA TACTTAAATT ACTTATTTAC TTTAAGATTT TGAAAAGATC ATTTGGCTCT TCATCATGCC GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC TTAAGTTGTA ATTTTTCTAA CTCCAAGCCT TCTATATAAA CACGTATTGG ATGTGAAGTT GTTGCATAAC TTGCATTGAA CAATAGAAAT AACAACAAAG AAAATAAGTG AAAAAAGAAA TATG. 10

8, Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den 5'-flankerende region er identisk med, afledt af eller indeholder 5'-flankerende regioner fra LbC3~genet med sekven-15 sen: TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAA7CTT G7AGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT 20 TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCC7 CCGAG7TTGA TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC TTCACCA7AC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA 25 GTTTTATTAG TTATTCTGAT CAC7CTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA CAGAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG. ^ fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-8, kende tegnet ved, at der anvendes en 3'-f1 ankerende region fra rodknoldspecifikke gener.

10· Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, 35 at der anvendes en 3'-flankerende region fra leghæmoglobinge- ner. DK 162399 B 51

11. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at der anvendes en 3'-f1 ankerende region fra sojabønneleghæmo-globingener.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at der anvendes en 3'-flankerende region fra Lba-, Lbc^-, LbC2~ eller LbC3-genet med de respektive sekvenser: Lba 10 1590 1620 TAA TTA GTA TCT ATT GCA GTA AAG TGT AAT AAA TAA ATC TTG 1650 1680 TTT CAC TAT AAA ACT TGT TAC TAT TAG ACA AGG GCC TGA TAC AAA ATC TTG GTT AAA ATA 1 r 1710 1740

1. ATG GAA TTA TAT AGT ATT GGA TAA AAA TCT TAA GGT TAA TAT TCT ATA TTT GCC TAG GTT 1770 1800

1 TAT GCT TGT GAA TCA TTA TCG GTA TTT TTT TTC CTT TCT GAT AAT TAA TCG GTA AAT TA 1830 1860 ACA AAT AAG TTC AAA ATG ATT TAT ATG TTT CAA AAT TAT TTT AAC AGC AGG TAA AAT GTT 20 ATT TGG TAC GAA AGC, TAA TTC GTC GA Lbcl 25 1320 TAA/TT AGG ATC TAC TGC ATT GCC GTA 1350 1380 AAG TGT AAT AAA TAA ATC TTG TTT CAA CTA AAA CTT GTT ATT AAA CAA GTT CCC TAT ATA 1410 1440 AAT GTT GTT TAA AAT AAG TAA ATT TCA TTG TAT TGG ATA AAC ACT TTT AAG TTA TAT ATT V U 1470 1500 TCC ATA TAT TTA C GT TTG TGA ATC ATA ATC GAT ACT TTA TAA AAA TAA ATT CCA AAT AAT TTA TAC GTT TTA AAA ATT ATT TT 35 DK 162399 B 52 Lbc2 TAG/GAT CTA CIA TTG CCG TCA AGT 1140 GTA ATA AAT AAA TTT TGT TTC ACT AAA ACT TGT TAT TAA ACA AGT CCC CGA TAT ATA AAT 1170 1200 K GTT GGT TAA AAT AAG TAA ATT ATA CGG TAT TGA TAA ACA ATC TTA AGT TTT ATA TAT AGT 1230 1260 TCC ATA TAC TAA AGT TTG TGA ATC ATA ATC GA 1290 Lbc3 10 TAG/GAT CTA CAA TTG CCT TAA AGT GTA ATA AAT AAA 990 10 TAT TAT TTC ACT AAA ACT TGT TAT TAA^ACC AAG TTC TCG ATA TAA ATG TTG GTT AAA^CTA AGT AAA TTA TAT GGT ATT GGA TAA ACA ATC TTA AGC TT 15 1110

13. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til fremstilling af et poly-peptid ved transformering af bælgplanteceller med et rekom-bineret plasmid, kendetegnet ved, at der som det 20 rekombinerede plasmid anvendes et plasmid der indeholder 5'- eller 5'- og 3'-f1 ankerende regioner fra et rodknoldspecifikt plantegen, og at der i den 5'-flankerende region indgår en inducerbar piantepromotor, som regulerer, at ekspressionen sker i rodknoldene på bestemte udviklingstrin og som led i den 25 symbiotiske nitrogenfiksering.

14. DNA-fragment til brug i et rekombineret DNA-fragment ved fremgangsmåden ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det omfatter en inducerbar piantepromotor, som regulerer, at 30 ekspressionen sker i rodknoldene på bestemte udviklingstrin og som led i den symboistiske nitrogenfiksering, og er identisk med, afledt af eller indeholder en 5'-flankerende region fra rodknoldspecifikke gener.

15. DNA-fragment ifølge krav 14, kendetegnet vedr at det er identisk med, afledt af eller indeholder en 51-flankerende region fra planteleghæmoglobingener. DK 162399 B 53

16. DNA-fragment ifølge krav 15, kendetegnet ved, at det er identisk med, afledt af eller indeholder en 5 '-flankerende region fra sojabønneleghæinoglobingener .

17. DNA-fragment ifølge krav 16, kendetegnet ved, at det er identisk med, afledt af eller indeholder en 5'-flan-kerende region fra Lba-genet med sekvensen: GAGATACATT ATAATAATC7 CTCTAGTGTC TATTTATTAT TTTA7CTGGT GATATATACC TTCTCG7ATA CTGTTATTTT TTCAATCTTG TAGATTTACT TC7TTTATTT TTATAAAAAA GACTTTATTT TTTTAAAAAA AATAAAG7GA 10 ATTTTGAAAA CATGCTCTTT GACAATTTTC TGT7TCC7TT TTCATCATTG GGTTAAATC7 CATAGTGCCT CTATTCAATA ATTTGGGCTC AATTTAA7TA G7AGAGTCTA CATAAAATTT ACCTTAATAG TAGAGAA7AG AGAG7C7TGG AAAGTTGG7T TTTCTCGAGG AAGAAAGGAA ATG7TAAAAA C7GTGA7AT7 TTTTTT7TGG ATTAATAGTT ATG7T7ATAT GAAAACTGAA AATAAATAAA CTAACCATAT TAAA7T7AGA ACAACACT7C AATTATTTTT TTAAT77GA7 TAATTAAAAA ATTATTTGAT TAAATTTTTT AAAAGATCG7 TG777C77C7 15 TCA7CA7GC7 GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC ACATAAGC7T TGG7TTTC7C ACTCTCCAAG CCC7CTATAT AAACAAATAT TGGAG7GAAG T7G7TGCATA AC77GCATCG AACAATTAAT AGAAA7AACA GAAAATTAAA AAAGAAATA7 G.

18. DNA-fragment ifølge krav 16, kendetegnet ved, 20 at det er identisk med, afledt af eller indeholder en 5'-flan-kerende region fra Lbc^-genet med sekvensen: TTC7CTTAAT ACAATGGAGT TTTTG7TGAA CATACATACA TTTAAAAAAA AATCTCTAGT GTCTATTTAC CCGGTGAGAA GCCTTCTCGT GTTT7ACACA CTTTAATATT AT7ATATCCT CAACCCCACA AAAAAGAATA CTG7TATATC T77CCAAACC TGTAGATTTA TTTATTTATT TATTTATTT7 TACAAAGGAG 2 5 AC7TCAGAAA AGTAATTACA TAAAGA7AGT GAACATCATT TTAT7TAT7A TAATAAACTT TAAAATCAAA CTTTTT7ATA TTTTTTGTTA CCC7TTTCAT TATTGGG7GA AA7C7CATAG TGAAGCCATT AAATAATTTG GGCTCAAGTT TTATTAG7AA AG7C7GCATG AAATT7AACT TAACAATAGA GAGAG7777C GAAAGGGAGC GAATG77AAA AAGTGTGATA TTATATTTTA TT7CGAT7AA TAATTATGTT TACATGAAAA CATACAAAAA AATAC7TTTA AAT7CAGAAT AATAC7TAAA ATATTTATTT GC7TAATTGA TTAACTGAAA ATTATTTGAT 30 TAGGATTTTG ÅAAAGATCAT TGGCTCTTCG TCATGCCGA7 TGACACCC7C CACAAGCCAA GAGAAACTTA AGTTGTAAAC TTTCTCACTC CAAGCCTTCT ATATAAACAT GTATTGGATG TGAAGTTATT GCATAACTTG CATTGAACAA TAGAAAATAA CAAAAAAAAG TAAAAAAGTA GAAAAGAAAT A7G.

35 I9· DNA-fragment ifølge krav 16, kendetegnet ved, at det er identisk med, afledt af eller indeholder en 5 '-f 1 ankerende region fra LbC2_geriet med sekvensen·. DK 162399 B 54 7CGAGTT7TT ACTGAACATA CATTTATTAA AAAAAACTCT CTAG7G7CCA TTTATTCGGC GAGAAGCCTT CTCGTGCTTT ACACACTTTA ATATTATTAT ATCCCCACCC CCACCAAAAA AAAAAAAACT GTTATA7CT7 TCCAGTACAT TTA77TCT7A TTTTTACAAA GGAAACT7CA CGAAAGTAAT TACAAAAAAG 5 ATAGTGAACA TCATTTTTTT AGTTAAGATG AA77TTAAAA TCACACTTTTJ 77A7A77T7? 7TGTTACCCT TTTCATTATT GGGTGAAATC TCATAGTGAAj ACTATTAAAT AGT7TGGGC7 CAAGTTTTAT TAGTAAAGTC 7GCATGAAAT! TTAACTTAAT AATAGAGAGA GTTTTGGAAA GGTAACGAAT GTTAGAAAGT GTGATATTAT TATAGTTTTA 777AGATTAA 7AA7TÅTGTT TACATGAAAA T7GACAAT7T A7TTT7AAAA TTCAGAGTAA TACTTAAATT ACTTATTTAC TTTAAGATTT TGAAAAGATC A77TGGCTC7 TCATCATGCC GAT7GACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC TTAAGTTGTA A7T77TCTAA CTCCAAGCCT 10 TCTATATAAA CACGTAT7GG ATGTGAAGTT GTTGCATAAC TTGCATTGAA CAATAGAAAT AACAACAAAG AAAATAAGTG AAAAAAGAAA TA7G.

20. DNA-fragment ifølge krav 16, kendetegnet ved, ^ er identisk med, afledt af eller indeholder en 5'-flankerende region fra Lbc3-genet med sekvensen: TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAA7CTT GTAGATTTAT 7TCT777A7T 7TTA7AAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA

20 ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT 77A7ATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT 77777G7C7A AATCGTATGT A7CTTGTC7T AGAGCCAT7T 7TGT77AAA? TGGATAAGA7 CACACTATAA AGTTCT7CC7 CCGAGTTTGA TÅTAAAAAAA ATTGTTTCCC 77T7GA77A7 7GGA7AAAA7 CTCGTAGTGA CA7TATA77A AAAAAA77AG GGCTCAA77T TTATTAGTAT AG777GCA7A AA7777AAC7 TAAAAATAGA GAAAATC7GG AAAAGGGAC7 GTTAAAAAG7 GTGATA77AG AAAT7TG7CG GATA7A77AA TA7T7TATTT TATATGGAAA - . C7AAAAAAAT A7A7A77AAA A7T7TAAA77 CAGAATAA7A CTTAAAT7A7 77A7T7ACTG AAAATGAGT7 GATT7AAGT7 TTTGAAAAGA 7GA77G7C7C i iLnV.wi.nL '—Λ.η* .uni'.n nLnn'j^.^.nnu nunnnuiinn G*«n/7^rpm « mm * m rpm ^ ^ m m ^ ^ > m n-ι * ^ ^ m ^ * m m X i · » -» λ . .H\j iwiurt* C.nL. * C ♦ * oLv« . . L . A » M ^ A .-λ λ . A. ηοιη mrnm m x mmm,^ « * m ^n^m '’'m/·"· ^ λ m x > z-»mmm * m mm * * m * * mm h % m » m * * * m % * 1 *vjxjrv a.O ♦ un Λυ* 1 rViA\— * ♦ gv.A 1 iVJrtnCoAi ΛιΛυηηηιΛΛ m % ^ x » /·* m % m * ' ^ « m * ^ ^ m * mm nbflAnnU * n vjrtrt/ΐΛυΛΛΛ Aib« 30

21. Rekombineret DNA-fragment til brug ved fremgangsmåden ifølge krav l - 13, kendetegnet ved, at det omfatter dels det gen, der ønskes udtrykt, og dels et DNA-fragment ^ ^ hvilket som helst af kravene 14 - 20, og eventuelt 35 en 31-f1 ankerende region fra et rodknoldspecifikt gen.

22. Plasmid til brug ved fremgangsmåden ifølge krav 1 - 13, ndetegnet ved, at det indeholder et rekombineret DK 162399 B 55 DNA-fragment ifølge krav 21.

23. Plasmid ifølge krav 22, kendetegnet ved, at det er pAR29 og er fremstillet som beskrevet i eksempel 3a. 5

24. Plasmid ifølge krav 22, kendetegnet ved, at det er pAR30 og er fremstillet som beskrevet i eksempel 3a.

25. Plasmid ifølge krav 22, kendetegnet ved, at 10 det er pARll og er fremstillet som beskrevet i eksempel 3b. 15 20 25 30 35