NL8700207A - Werkwijze voor de expressie van genen in planten, delen van planten, en plantecelculturen, en dna-fragmenten, plasmiden en getransformeerde microorganismen voor gebruik bij het uitvoeren van de werkwijze, alsmede het gebruik daarvan voor de expressie van genen in planten, delen van planten en plantecelculturen. - Google Patents

Description

, r··^ - WsfcwLjze voor de expressie van genen in planten, delen van planten, en plantecelculturen, en DNA-fragmenten, plasmiden en getransformeerde microorganismen voor gebruik bij het uitvoeren van de werkwijze, alsmede het gebruik daarvan voor de expressie van genen in planten, delen van planten en plantecelculturen -

De uitvinding heeft betrekking op een nieuwe werkwijze voor de expressie van genen in planten, delen van planten en plantecelculturen , en op DNA-fragmenten en plasmiden. welke de DNA-fragmenten bevatten voor gebruik bij het uitvoeren 5 van de werkwijze.

De uitvinding heeft betrekking op deze werkwijze voor de expressie van genen van welke oorsprong ook onder controle van een induceerbare, voor wortelknolletjes specifieke promotor.

10 De uitvinding heeft in het bijzonder betrekking op deze werkwijze voor de expressie van voor wortelknolletjes specifieke genen in getransformeerde planten, zowel in vlinderbloemigen als in andere planten.

De uitvinding heeft voorts betrekking op 15 DNA-fragmenten die een induceerbare plantepromotor omvatten voor gebruik bij het uitvoeren van de werkwijze , en op plasmiden die deze DNA-fragmenten omvatten.

In de beschrijving worden onder andere de volgende uitdrukkingen gebruikt: 20 Voor wortelknolletjes specifieke genen: plantegenen die slechts aktief zijn in de wortelknolletjes van vlinderbloemigen , of genen met een verhoogde expressie in wortelknolletjes. Voor wortelknolletjes specifieke plantegenen komen tot expressie in bepaalde ontwikkelingsstadia en worden op een 25 gecoördineerde wijze geaktiveerdtijdens de symbiose waardoor stikstof gefixeerd wordt, welke in het metabolisme van de plant gebruikt wordt.

8700207 - 2 -

Indueeerbare plantepromotor: in het algemeen wordt een als promotor aktief 5’-flankerend gebied van plantegenen bedoeld, dat geïnduceerd kan worden van een lage tot een hoge aktiviteit. Met betrekking tot de onderhavige uitvinding 5 wordt met "induceerbare plantepromotor " een promotor bedoeld die afgeleid is van , aanwezig is in of identiek is aan een 5’-flankerend gebied, een aanloopsequentie van voor wortelknolletjes specifieke genen omvat , en de expressie van een gen kan bevorderen en reguleren.

10 Aanloopsequentie: in het algemeen wordt een DNA-sequentie bedoeld die in een mRNA overgeschreven wordt , maar niet verder in proteïne vertaald wordt. De aanloopsequentie omvat derhalve het DNA-fragment vanaf de start van de transcriptie tot het ATG-codon dat de start van de translatie vormt. Met 15 betrekking tot de onderhavige uitvinding wordt met "aanloopsequentie" een kort DNA-fragment bedoeld, dat in de boven genoemde induceerbare plantepromotor aanwezig is, en kenmerkend 40-70 bp omvat en dat sequenties kan omvatten welke een doelwit zijn voor een post-transcriptionele regulering.

20 Promotorgebied: een DNA-fragment dat een promotor bevat en dat doelwitsequenties voor RNA-polymerase omvat als ook mogelijke aktiveringsgebieden die doelwitsequenties voor transcriptionele effectorstoffen omvatten. In de onderhavige uitvinding, kunnen doelwitsequenties voor transcriptionele effektor-25 stoffen ook aan de 3’-kant van de promotor aanwezig zijn, d.w.z. in de coderende sequenties , de tussenliggende sequenties of in het 3’-flankerende gebied van een voor wortelknolletjes specifiek gen. Voorts worden een aantal voor deskundigen bekende moleculair- biologische uitdrukkingen gebruikt, waaronder de 30 volgende: CAP-additieplaats: het nucleotide waaraan 7-methyl-GTP geaddeerd wordt.

DNA-sequentie of DNA-segment: een lineaire reeks nucleotiden die onderling via fosfodiesterbindingen 35 tussen de 3’- en 5’-koolstofatomen van aangrenzende pentoses verbonden zijn.

8*7 η λ λ ·** 3 i Ö / - 3 - i -i «

Expressie: het proces dat ondergaan wordt door een structureel gen voor het verkrijgen van een polypeptide.

Het is een combinatie van transcriptie en translatie alsmede mogelijke post-translationele modificaties.

5 Flankerende gebieden: DNA-sequenties die coderende gebieden omgeven. 5’-Flankerende gebieden bevatten een promotor . 3’-Flankerende gebieden kunnen een transcriptionele terminator enz. bevatten.

Gen: een DNA-sequentie die samengesteld 10 is uit 3 of 4 delen, te weten (1) de coderende sequentie voor het genprodukt , (2) de sequenties in het promotorgebied die regelen of het gen al dan niet tot expressie komt, (3) die sequenties in het 3’-uiteinde die de transcriptionele terminatie en eventueel de polyadenylering conditioneren, alsmede (4) eventuele 15 tussenliggende sequenties.

Tussenliggende sequenties: DNA-sequenties in een gen die niet voor een peptidefragment coderen. De tussenliggende sequenties worden overgeschreven in pre-mRNA en geelimineerd door modificatie van pre-mRNA tot mRNA.

20 Chimaer gen: een gen dat samengesteld is uit delen van verschillende genen . Zo is bijvoorbeeld het dimaere Lbc^-S r-3'-CAT samengesteld uit een voor chlooramfenicölacetyl-transferase coderende sequentie van E.coli en 5’- en 3'-flankerende regulatorgebieden van het Lbc^-gen van de sojaboon.

25 doneren: de werkwijze voor het verkrijgen van een populatie van organismen of DNA-sequenties die afkomstig zijn van een dergelijk organisme of sequentie door asexuele reproductie, of in het bijzonder een werkwijze voor het isoleren van een bepaald organisme of een gedeelte daarvan, en de vermenigvuldiging 30 van deze subfraktie als een homogene populatie.

Coderende sequenties: DNA-sequenties die de aminozuursequentie van een polypeptide bepalen.

Krui sbes tuivingsgroep: een groep vlinderbloemige plantesoorten die geschikt wortelknolletjes kunnen 35 vormen met Rhizobium-bacteriën welke uit wortelknolletjes van andere soorten van de groep geïsoleerd zijn.

8700207 t t - 4 -

Leehemoglobine (Lb): een zuurstofbindend proteïne dat uitsluitend in wortelknolletjes gesynthetiseerd wordt.

De Lb-proteïnen reguleren de zuurstofspanning in het weefsel van de wortelknolletjes en transporteren zuurstof naar de bacteroïden.

5 Op deze wijze wordt het zuurstofgevoelige nitrogenase-enzym beschermd. De Lb-genen zijn voor wortelknolletjes specifieke genen.

Messenger-RNA (mRNA): RNA-molecuul dat door transcriptie van een gen en mogelijk modificatie van mRNA gevormd * 10 wordt. Het mRNA-molecuul treedt als middelaar op van de genetische boodschap, welke de aminozuursequentie van een polypeptide bepaalt., doordat een gedeelte van het mRNA-molecuul in het peptide vertaald wordt.

Stroomafwaarts: een plaats in een DNA-15 sequentie. De plaats wordt gedefinieerd ten opzichte van de transcriptionele richting 5'-3’ van het gen. Het 3’-flankerende gebied ligt derhalve stroomafwaarts van het gen.

Nucleotide: een monomere eenheid van DNA of RNA die uit een suikerrest (pentose), een fosfaat en een 20 heterocyclische stikstofbase bestaat. De base is via een glycosidische binding gebonden aan de suikerrest ( 1’-koolstof van het pentose ) , en deze combinatie van base en suiker is een nucleoside. De base kenmerkt het nucleotide. De vier DNA-basen zijn adenine (A), guanine (G), cytosine (C) en 25 thymine (T). De vier RNA-basen zijn A, G, C en uracil (U).

Stroomopwaarts: een plaats in een DNA- sequentie. De plaats wordt gedefinieerd t.o.v. de transcriptionele richting 5’-3' van het gen. Het 5’-flankerende gebied ligt derhalve stroomopwaarts van dit gen.

· Plantetransformatie: werkwijzen die leiden tot het opnemen van genen in het genoom van plantecellen op een zodanige wijze dat deze genen op betrouwbare wijze overgeërfd worden via mitose en meïose , of op zodanige wijze dat deze genen slechts gedurende korte perioden gehandhaafd blijven.

Oe J Plasmide: een niet-chromosomale dubbel- strengige DNA-sequentie die een intakt replicon omvat , zodat -i Λ 8700207 i - * - 5 - het plasmide in een gastheercel gerepliceerd wordt. Wanneer het plasmide in een eencellig organisme geplaatst wordt, worden de kenmerken van dat organisme veranderd of getransformeerd als 5 een resultaat van het DNA van het plasmide. Zo transformeert

bijvoorbeeld een plasmide dat het gen voor tetracyclineresistentie R

(Tc ) draagt, een cel welke eerst gevoelig was voor tetracycline in een cel die er resistent voor is. Een door een plasmide getransformeerde cel wordt een transformant genoemd.

10 Polypeptide: een lineaire reeks aminozuren die onderling door middel van peptidebindingen tussen de °C-amino-en carboxygroepen van aangrenzende aminozuren verbonden zijn.

Recombinatie: de vorming van een nieuw DNA-molecuul door DNA-fragmenten van verschillende oorsprong te 15 combineren.

Replicatie: een proces waarbij DNA-moleculen gereproduceerd worden.

Replicon: een zelf-replicerend genetisch element met een oorsprong voor de initiatie van DNA-replicatie en 20 met genen die de funkties specificeren welke noodzakelijk zijn voor een regeling en een replicatie daarvan.

Restrictiefragment: een DNA-fragment verkregen door dubbelstrengige splitsing door een enzym dat een specifieke doelwit-DNA-sequentie herkent.

25 RNA-ροlymerase: enzym dat de transcriptie van DNA- in RNA bewerkstelligt .

Wortelknolletje: gespecialiseerd weefsel verkregen door infektie van voornamelijk wortels van vlinderbloemigen met Rhizobium-bacteriën. Het weefsel wordt gevormd door de 30 gastheerplant en bestaat dan ook uit plantecellen,terwijl de

Rhizobium-bacteriën na infektie omgeven worden door een plantecel-membraan en differentiëren tot bacteroiden. Wortelknolletjes worden op andere soorten planten gevormd na infektie van stikstof-fixerende bacteriën die niet tot het genus Rhizobium behoren. Voor 35 wortelknolletjes specifieke plantegenen komen ook in deze knolletjes tot expressie.

8700207 - 6 - ? ï

Southern-hybridisatie: gedenatureerd DNA wordt na scheiding op grootte in agarosegel overgebracht op een nitrocellulosemembraan. Overgebracht DNA wordt door middel van hybridisatie ^geanalyseerd op een tevoren bepaalde DNA-sequentie 5 of een tevoren bepaald gen. Bij deze werkwijze wordt een binding mogelijk gemaakt van enkelstrengige, radioaktief gemerkte DNA-sequenties ( monsters) aan complementaire enkelstrengige DNA-sequenties die op het membraan gebonden zijn. De plaats van DNA-fragmenten op het membraan die het monster binden kan vervolgens 10 op een röntgenfilm gedetecteerd worden.

Symbiotische stikstoffixatie: het samen levingsverband waarbij bacteroiden van wortelknolletjes de stikstof (N2) van de lucht omzetten in ammonium, dat door de plant gebruikt wordt, terwijl de plant de bacteroiden voorziet van koolstofverbindingen. 1-5 Symbiont: een deel van een symbiotisch samenlevingsverband; Rhizobium wordt in het bijzonder de microsymbiont genoemd.

Transformatie: het proces waardoor een cel een DNA-molecuul opneemt.

20 Translatie: het proces waarbij een polypeptide vanaf mKNA gevormd wordt, of: het proces waardoor de in een mRNA-molecuul aanwezige genetische informatie de volgorde van specifieke aminozuren tijdens de synthese van een polypeptide stuurt.

25 Transcriptie: het proces waarbij een complementaire RNA-sequentie vanaf een DNA-sequentie gesynthetiseerd wordt .

Vector: een plasmide, faag-DNA of andere DNA-sequenties die in een gastheercel gerepliceerd kunnen worden 50 en die één of een klein aantal endonuclease herkenningsplaatsen hebben waar dergelijke DNA-sequenties op een bepaalbare wijze gesplitst kunnen worden zonder verlies van een essentiele biologische funktie.

Traditioneel is het kweken van planten 35 gebaseerd op herhaald kruisen van plantlijnen die afzonderlijk gewenste eigenschappen hebben. De identificatie van nageslachtlijnen die 6 7 0 ö ? 0 7 * itt«| "ijü g • S. ir * - 7 - alle de gewenste eigenschappen, hebben, is een bijzonder tijdrovend proces daar de biochemische en genetische basis van de eigenschappen gewoonlijk onbekend is. Nieuwe lijnen worden dan ook gekozen naar hun fenotype, gewoonlijk na een nauwkeurig onderzoek van 5 vele lijnen in veldexperimenten.

Door de eeuwen heen heeft er een direkt verband bestaan tussen de voedingstoestand,,dat wil zeggen de gezondheid,van de populatie en de landbouwkundige mogelijkheid voor een voldoende stikstoftoevoer te zorgen om bevredigende 10 opbrengsten te verkrijgen. Reeds in de 17e eeuw werd ontdekt, dat planten van de familie leguminosae, met naast erwten ook bonen, lupines , sojaboon , gewone rolklaver, , wikkesoorten, alfalfa, espareette en klaver, gewassen die op de groeiplaats van deze planten verbouwd werden, 15 konden verbeteren. Tegenwoordig is het bekend dat dit te danken is aan het feit dat de leden van de familie leguminosae zelf stikstofreserves kunnen vormen. Op de wortels dragen zij bacteriën waarmee zij in symbiose leven.

Een infektie van de wortels van deze 20 vlinderbloemigen met Rhizobium-bacterien veroorzaakt de vorming van wortelknolletjes die atmosferische stikstof kunnen omzetten tot gebonden stikstof, welk proces stikstoffixatie genoemd wordt.

Atmosferische stikstof wordt daarbij omgezet tot vormen die gebruikt kunnen worden door de gastheerplant 25 als ook door de planten die later op dezelfde groeiplaats groeien.

In de 19e eeuw werd de bovengenoemde mogelijkheid gebruikt voor de levering van stikstof teneinde een nieuwe toeneming van de gewasopbrengst te bereiken.

De latere verdere toenemingen van de 30 opbrengst zijn echter vooral verkregen door middel van natuurlijke meststoffen en stikstof-bevattende kunstmeststoffen. Door de als gevolg daarvan optredende vervuiling van het milieu wil men gaarne alternatieven verschaffen om te zorgen voor de levering van stikstof die nodig is voor de best mogelijke opbrengsten.

35 Het zou derhalve waardevol zijn als men de bestaande stikstoffixatie-systemen in vlinderbloemigen kon verbeteren , en als men stikstoffixatie-systemen in andere planten 8700207

* I

- 8 - tl kon inbouwen.

Door de recombinant-DNA-techniek en de ontwikkelde plantetransformatiesysternen kan men nu op een goed gecontroleerde wijze planten met nieuwe eigenschappen 5 verschaffen. Deze eigenschappen kunnen niet alleen afkomstig zijn van dezelfde plantesoort, maar ook van alle andere procaryote of eucaryote organismen. Door de DNA-technieken kan men voorts nageslachtlijnen die de gewenste eigenschappen hebben snel en specifiek identificeren. Op deze wijze kan een specifieke 10 plantelijn op een snelle en goed gedefinieerde wijze voorzien worden van één of meer gewenste eigenschappen.

Dienovereenkomstig kunnen plantecellen voorzien worden van goed-gedefinieerde eigenschappen en vervolgens door middel van bekende weefselkweekmethoden als plantecellijnen 15 gehandhaafd worden. Dergelijke plantecellen kunnen gebruikt worden voor de bereiding van qhemische en biologische produkten van bijzonder belang zoals kleurstoffen, smaakstoffen, aroma-componenten, plantehormonen, farmaceutische produkten, primaire en secundaire metabolieten en polypeptiden ( enzymen).

20 Een reeks faktoren en funkties die nodig zijn voor de biologische bereiding van een bepaald genprodukt zijn bekend. Zowel de initiatie als de regulering van de transcriptie als ook de initiatie en de regulering van post-transcriptionele processen kunnen gekarakteriseerd worden.

25 Het is bekend dat deze funkties op het genniveau voornamelijk uitgeoefend worden door 5'-flankerende gebieden. Van een groot aantal verschillende 5'-flankerende gebieden van procaryote en eucaryote genen is de sequentie opgehel-derd, en onder andere met het oog daarop is een uitgebreide — 30 kennis verkregen van de regulering van de genexpressie en van de subgebieden en sequenties die van belang zijn voor de regulering van de genexpressie. Er bestaan grote verschillen in het reguleringsmechanisme van procaryote en eucaryote organismen, maar de twee groepen hebben veel gemeenschappelijke kenmerken.

35 De regulering van de genexpressie kan op het transeriptionele niveau plaats hebben, en wordt dan bij 87 0 0 20 ; - I Jr - 9 - voorkeur uitgeoefend door de initiatiefrequentie van de transcriptie te reguleren. Het laatste is algemeen bekend en onder andere beschreven door Benjamin Lewin, Gene Expression, John Wiley & Sons,

Vol. I, 1974, vol. II , Second Edition 1980, vol.Ill, 1977.

5 In plaats daarvan kan de regulering teweeg gebracht worden op het post-transcriptionele niveau, bijvoorbeeld door de regulering van de frequentie van de translatie-initiatie, de translatiesnelheid en de translatie-terminatie.

In verband met de onderhavige uitvinding is aangetoond, dat 5'-flankerende gebieden van voor wortelknolletjes specifieke genen, bijvoorbeeld het 5'-flankerende gebied van het sojaboon-leghemoglobinegen Lbc^, gebruikt kunnen worden voor induceerbare expressie van een vreemd gen in een vreemde vlinderbloemige. De promotor wordt bij voorkeur geïnduceerd en gereguleerd ^ op het transcriptionele niveau, en dit verschilt daardoor van de in de Deense octrooiaanvrage no. 4889/85 vermelde induceerbaarheid, welke bij voorkeur op het translatieniveau uitgeoefend wordt,

De transcriptie van zowel het Lbc^~ gen van de sojaboon en van het in gewone rolklaver 20 overgebrachte chimaere Lbc^- gen begint op een laag niveau onmiddellijk na het verschijnen van de wortelknolletjes op de plantewortels.

Vervolgens neemt de transcriptie sterk toe onmiddellijk voor de wortelknolletjes rood worden. De transcriptie van een reeks andere voor wortelknolletjes specifieke genen wordt precies op dit 25 tijdstip gestart. De gelijktijdige inductie van de transcriptie van de Lb-genen en andere voor wortelknolletjes specifieke genen betekent dat ( een) gemeenschappelijke DNA-sequentie(s) aanwezig moet(en) zijn voor de verschillende genen die dit expressie-patroon regelen. Het leghemoglobine-c^-gen is derhalve een vertegen-woordiger van een klasse genen, en de promotor en de aanloopsequentie, doelwit gebieden voor aktivering alsmede da regelelementen van de weefselspecificiteit van het Lbc^-gen zijn vertegenwoordigers van de regelelementen van een volledige genklasse.

De promotor van de 5*-flankerende gebieden 35 van de Lb-genen funktioneert in sojabonen en is verantwoordelijk voor 87 0 3 20 7 - 10 - de transcriptie^an de Lb-genen in wortelknolletjes. Voorts is bekend, dat het rendement van zowel de transcriptie-initiatie als de erop volgende translatie-initiatie op de aanloopsequentie van de Lb-genen groot is , daar de Lb-proteïnen ongeveer 20% van 5 het totale proteïnegehalte in wortelknolletjes vormen.

De sequentie van 5'-flankerende gebieden van de vier sojaboon-leghemoglobinegenen Lba, Lbc^, LbG^ -en Lbc^ blijkt uit het bijgevoegde sequentieschema, schema 1, waarin de sequenties op een zodanige wijze vermeld worden, dat de homologie 10 tussen de vier 5'-flankerende gebieden duidelijk blijkt.

In het sequentieschema geeft aan, dat op de betreffende positie geen base aanwezig is . De namen van de genen en de base-positie, geteld stroomopwaarts vanaf het ATG-startcodon,worden aan de rechterkant van het sequentieschema 15 aangegeven. Bovendien zijn de belangrijke sequenties onderstreept.

Zoals uit het sequentieschema blijkt, bestaat er een duidelijke mate van homologie tussen de vier 5'-flankerende gebieden, en op de positie 23-24 bp stroomopwaarts vanaf de CAP-additieplaats bevatten zij alle een TATATAAA-sequentie, 20 welke overeenkomt met de "TATA" box, die in eucaryote cellen gewoonlijk een overeenkomstig aantal bp stroomopwaarts vanaf de CAP~additieplaats gelegen zijn. Bovendien is een CCAAG-sequentie 64-72 bp stroomopwaarts vanaf de CAP-additieplaats aanwezig, welke sequentie overeenkomt met de "CCAAT" box welke gewoonlijk 70-90 25 bp stroomopwaarts vanaf de CAP-additieplaats gelegen is .

Vanaf de CAP-additieplaats naar het translatiestartcodon, ATG, zijn aanloopsequenties van 52-69 bp aanwezig, en deze vertonen een duidelijke mate van homologie van ongeveer 75-80%.

Volgens de onderhavige uitvinding is daar-30 naast bewezen , toegelicht door Lbc^ , dat de 5'-flankerende gebieden van de sojaboon-leghemoglobinegenen funktioneel werkzaam zijn in andere plantesoorten. Dit laatste is bewezen door het E.coli chlooramfenicol-acetyltransferase (CAT) gen op een zodanige wijze te fuseren met de 5'- en 3'-flankerende gebieden van het sojaboon Lbc^-35 gen , dat de expressie van het CAT- gen door de Lb-promotor geregeld wordt . Dit fusiefragment werd gekloneerd in de integratie- 87 0 0 20 7 ï i - 11 - vectoren pARl en pAR22, waardoor de plasmiden pAR29 en pAR30 gevormd werden . Door middel van homologe recombinatie werden de laatst genoemde plasmiden geïntegreerd in het Agrobacterium rhizogenes T DNA-gebied . De transformatie van Lotus comiculatus (gsuErolklaver) planten, d.w.z. . de overdracht van het T DNA-gebied, werd verkregen door wondinfektie op het hypocotyl. Wortels die zich uit de getransformeerde plantecellen ontwikkelden, werden in in vitro-cultuur genomen en door middel van antibiotica bevrijd van A.rhizogenes-bacteriën . Volledig geregenereerde 10 planten werden door somatische embryogenese of organogenese door deze wortelkweken gevormd.

Geregenereerde planten werden vervolgens geinoculeerd met Ehizobium loti-bacteriën en wortelknolletjes werden geoogst voor analyse. Transcriptie en translatie van het diimaere Lbc^-CAT-gen konden vervolgens in wortelknolletjes op getransformeerde planten gedetecteerd worden als de aktiviteit van het gevormde chlooramfenicol-acetyltransferaseenzym.

De conclusie kan vervolgens getrokken worden, dat de promotor-bevattende 5'-flankerende gebieden-van voor 20 wortelknolletjes specifieke genen, met als voorbeeld de sojaboon Lbc^-promotor,funktioneel werkzaam zijn in vreemde planten. Dit is een verrassende waarneming daar wortelknolletjes slechts ontwikkeld worden als een gevolg van een zeer specifieke wisselwerking tussen de vlinderbloemige en zijn bijbehorende Rhizobium-microsymbiont.

25

Sojabonen vormen slechts knolletjes na infektie door de soort Rhizobium japonicum en Lotus comiculatus slechts na infektie door de soort Rhizobium loti. Sojaboon en

Lotus comiculatus behoren dan ook tot twee verschillende kruis- bestuivingsgroepen , waarbij elke groep wortelknolletjes vormt 30 door middel van twee verschillende Rhizobium-soorten. De expressie van een chimaersojaboongen in Lotus comiculatus is derhalve een bewijs voor een onverwacht universeel regelsysteem dat van toepassing is op de expressie van voor wortelknolletjes specifieke ^ genen. De betreffende regulerende DNA-sequenties kunnen op de 5'- en 3'-flankerende gebieden van de genen geplaatst worden, hier bijvoorbeeld de 2,0 Kb 5'- en 0,9 Kb3’-flankerende gebieden van het 870 0 20 7 -i ï - 12 -

LbCg-gen. Deze waarneming maakt het gebruik van voor wortelknolletjes specifieke promotors en regulerende sequenties mogelijk in elke andere plantesoort en elke andere plantecellijn.

In andere experimenten werd het 5'- 3 flankerende gebied van het voor wortelknolletjes specifieke N23- gen op een zodanige wijze gefuseerd met het CAT-gen en het LbCg 3'-flankerende gebied, dat de expressie van het CAT-gen door de N23-promotor geregeld wordt. Dit fusiefragnent werd gekloneerd in de integratievector pAR22, waarbij het plasmide N23-CAT gevormd werd, dat vervolgens gerecombineerd werd in A.rhizogenes en overgebracht werd in Lotus corniculatus en Trifolium repens (jiitte klaver ) met behulp van de hiervoor beschreven werkwijze. De voor wortelknolletjes specifieke expressie van het verkregen overgebrachte N23-CAT-gen in met Khizobium loti geïnfecteerde L.comiculatus en in met Rhizobium trifolii geïnfecteerde T.repens toonde verder aan dat expressie van voor wortelknolletjes specifieke genen onafhankelijk is van de plantesoort en de Rhizobium-soort. Een universeel regelsysteem reguleert derhalve de expressie.

van voor wortelknolletjes specifieke genen in de verschillende 90 ...

symbiotische systemen van vlinderbloemigen en de Rhizobium-soorten van de verschillende kruisbestuivingsgroepen.

Het is uit de Europese octrooiaanvrage EP 122.791.Al bekend, dat plantegenen uit een soort , door transformatie met Agrobacterium als middelaar, in een andere plantesoort overgebracht kunnen worden. Ook is uit EP 122.791.Al bekend , dat een overgebracht gen dat codeert voor het zaadopslagproteïne "faseoline" in tabak en alfalfa tot expressie kan komen. Uit de literatuur is eveneens bekend dat deze expressie zaadspecifiek is (Sengupta- Gopalan et al. 1985, 30 Proc. Natl. Acad. Sci. 82 , 332-3324).

De onderhavige uitvinding omvat een nieuwe werkwijze voor de expressie van overgebrachte genen op een voor wortelknolletjes specifieke wijze , onder toepassing van regulerende DNA-sequenties uit het 5'-promotorgebied, het coderende

OC

J gebied of het 3'-flankerende gebied van voor wortelknolletjes spe- 870 020 7·' J * - 13 - cifieke genen , hier toegelicht aan de hand van het leghemoglobine Lbc^-gen en het N23-gen . Deze werkwijze verschilt zowel van de transformatiewerkwij ze door middel van Agrobacterium als ook van de expressie van het gen dat codeert voor het zaadopslagproteine 5 faseoline , beschreven in EP 122.791 .A1 . De expressie van het overgebrachte faseolinegen in EP 122.701.Al toont slechts aan dat de faseolinegenfamilie met haar bepaalde regulerende vereisten in tabak en alfalfa tot expressie kan komen. De genoemde expressie bewijst noch voorspelt dat welke andere genen ook met hun ^ bepaalde regulerende vereisten in andere planten of plantenweefsel tot expressie kunnen komen.

De onderhavige uitvinding beoogt een mogelijkheid te verschaffen om gewenste genen in planten, delen van planten en plantecelculturen tot expressie te brengen.

*5 De uitvinding beoogt voorts het mogelijk te maken om genen van welke oorsprong ook onder controle van een i-nduceerbare voor wortelknol let j es specifieke promotor tot expressie te brengen.

De uitvinding beoogt in het bijzonder een 20 mogelijkheid te verschaffen om gewenste genen in vlinderbloemigen tot expressie te brengen.

De uitvinding beoogt voorts in het bijzonder een mogelijkheid te verschaffen om voor wortelknolletjes specifieke genen in niet-vlinderbloemigen tot expressie te brengen.

25 De uitvinding beoogt voorts de bestaande stikstofbindende systemen in vlinderbloemigen te verbeteren en stikstofbindende systemen in andere planten in te bouwen.

De uitvinding beoogt voorts een mogelijkheid te verschaffen om in bepaalde gevallen het gebruik van specifieke sequenties van het 3*-flankerende gebied , van de coderende sequentie en van tussenliggende sequenties mogelijk te maken teneinde de reguleerbaarheid van de voor wortelknolletjes specifieke promotor te beïnvloeden.

De uitvinding beoogt bovendien plasmiden 35 te verschaffen welke de boven vermelde induceerbare plantepromotor omvatten.

870020 7 -14 -

Verdere oogmerken, van de uitvinding blijken onmiddellijk uit de volgende beschrijving.

Deze doeleinden worden bereikt door het uitvoeren van de werkwijze volgens de uitvinding voor de expressie 5 van genen in planten, delen van planten en plantecelculturen, waarbij men in een cel daarvan een recombinant-DNA-segment invoert dat zowel het tot expressie te brengen gen bevat als ook een 5’-flankerend gebied dat een promotorsequentie omvat, en eventueel een 3’-flankerend gebied, en de getransformeerde cellen in een 10 groeimedium kweekt, welke werkwijze gekenmerkt wordt doordat men als het recombinant-DNA -segment een DNA-fragment gebruikt dat een induceerbare plantepromotor ( zoals gedefinieerd) van voor wortelknolletjes specifieke genei omvat .

Door de werkwijze volgens de uitvinding 15 kunnen op een goed gedefinieerde wijze vreemde genen in planten, delen van planten en plantecelculturen tot expressie gebracht worden, in dit verband in het bijzonder genen die de planten van gewenste eigenschappen voorzien, zoals bijvoorbeeld een resistentie voor planteziekten en een groter gehalte aan waardevolle polypeptiden.

20 Een verdere toepassing is de bereiding van waardevolle produkten zoals bijvoorbeeld kleurstoffen, smaakstoffen, plantehormonen , farmaceutische produkten, primaire en secundaire metabolieten en polypeptiden door middel van de werkwijze volgens de uitvinding in plantecelculturen en planten.

25 Door toepassing van de werkwijze volgens de uitvinding voor de expressie van voor wortelknolletjes specifieke genen is het mogelijk voor wortelknolletjes specifieke genen, die nodig zijn voor de vorming van een werkzaam stikstof-fixerend systeem,zowel in vlinderbloemigen als in andere planten tot 3° expressie te brengen.Doorcbt de ontwikkeling op de juiste wijze geregeld wordt, vergelijk voorbeeld 8, kan men een symbiotisch stikstofbindend systeem in niet-vlinderbloemigen tot stand brengen.

Op deze wijze is het verrassenderwijs mogelijk de bestaande stikstof-bindende systemen in vlinderbloemigen te verbeteren en stikstof-35 bindende systemen in andere planten in te bouwen.

De toepassing van de werkwijze volgens de uitvinding voor de expressie van vreemde genen in wortelknolletjes 87 0 0 20 7 * i - 15 - maakt het mogelijk vlinderbloemigen te verschaffen met verbeterde eigenschappen zoals resistentie voor herbiciden en resistentie voor ziekten en ongedierte.

Volgens een bijzondere uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding wordt een DNA-fragment gebruikt, dat een induceerbare plantepromotor omvat en dat identiek is aan , afgeleid is van, of omvat 5' -flankerende gebieden van leghemoglQbinegprHi.Op deze wijze wordt de expressie van elk willekeurig gen verkregen.

^ Voorbeelden van dergelijke DNA-fragmenten zijn DNA-fragmenten van de vier 5’-flankerende gebieden van de sojaboon-leghemoglobinegenen, te weten 15 * 570 0 20 7 ' - 16 - V i

Lba met de sequentie: GAGATACATT ATAATAATCT CTCTAGTGTC TATTTATTAT TTTATCTGGTf GATATATACC TTCTCGTATA CTGTTATTTT TTCAATCTTG TAGATTTACTi 5 TCTTTTATTT TTATAAAAAA GACTTTATTT TTTTAAAAAA AATAAAGTGAl ATTTTGAAAA CATGCTCTTT GACAATTTTC TGTTTCCTTT TTCATCATTGt GG7TAAATCT CATAGTGCCT CTATTCAATA ATTTGGGCTC AATTTAATTA! GTAGAGTCTA CATAAAATTT ACCTTAATAG TAGAGAATAG AGAGTCTTGG! AAAGTTGGTT TTTCTCGAGG AAGAAAGGAA ATGTTAAAAA CTGTGATATT!

10 TTTTTTTTGG ATTAATAGTT ATGTTTATAT GAAAACTGAA AATAAATAAA

CTAACCATAT TAAATTTAGA ACAACACTTC AATTATTTTT TTAATTTGAT

TAATTAAAAA ATTATTTGAT TAAATTTTTT AAAAGATCGT TG7TTC7TCT

TCATCATGCT GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC ACATAAGCTT

TGGTTTTCTC ACTCTCCAAG CCCTCTATAT AAACAAATAT TGGAG7GAAG

15 TTGTTGCATA ACTTGCATCG AACAATTAAT AGAAATAACA GAAAATTAAAl AAAGAAATAT G, 1

Lbc^ met de sequentie:

TTCTCTTAAT ACAATGGAGT TTTTGTTGAA CATACATACA TTTAAAAAAA

AATCTCTAGT GTCTATTTAC CCGGTGAGAA GCCTTCTCGT GTTTTACACA

20 CTTTAATATT ATTATATCCT CAACCCCACA AAAAAGAATA CTGTTATATC

TTTCCAAACC TGTAGATTTA TTTATTTATT TATTTATTTT TACAAAGGAGi

ACTTCAGAAA AGTAATTACA TAAAGATAGT GAACATCATT TTATT7ATTAI

TAATAAACT7 TAAAATCAAA CTTTTTTATA TTTTTTGTTA CCCTTTTCATi TATTGGGTGA AATCTCATAG TGAAGCCATT AAATAATTTG GGCTCAAGT7Ï 25 TTATTAGTAA AGTCTGCATG AAATTTAACT TSACAATAGA GAGAGTTTTC1 GAAAGGGAGC GAATGTTAAA AAGTGTGATA TTATATTTTA TTTCGATTAA!

TAATTATGTT TACATGAAAA CATACAAAAA AATACTTTTA AATTCAGAAT

AATACTTAAA ATATTTATTT GCTTAATTGA TTAACTGAAA ATTATTTGAT

TAGGATTTTG AAAAGATCAT TGGCTCTTCG TCATGCCGAT TGACACCCTC

30 CACAAGCCAA GAGAAACTTA AGTTGTAAAC TTTCTCACTC CAAGCCTTCT

ATATAAACAT GTATTGGATG TGAAGTTATT GCATAACTTG CATTGAACAA ,

TAGAAAATAA CAAAAAAAAG TAAAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG, I

Lbc met de sequentie: 2

TCGAGTTTTT ACTGAACATA CATTTATTAA AAAAAACTCT CTAGTGTCCA

35 TTTATTCGGC GAGAAGCCTT CTCGTGCTTT ACACACTTTA ATATTATTAT

ATCCCCACCC CCACCAAAAA AAAAAAAACT GTTATATGTT TCCAGTACAT

TTATTTCTTA TTTTTACAAA GGAAACTTCA CGAAAGTAAT TACAAAAAAG

ATAGTGAACA TCATTTTTTT AGTTAAGATG AATTTTAAAA TCACACTTTT

TTATATTTTT TTGTTACCCT TTTCATTATT GGGTGAAATC TCATAGTGAAi 40 ACTATTAAAT AGTTTGGGCT CAAGTTTTAT TAGTAAAGTC TGCATGAAAT' 870 0 20 7 * * - 17 - TTAACTTAAT AATAGAGAGA GTTTTGGAAA GGTAACGAAT GTTAGAAAGT' GTGATATTAT TATAGTTTTA TTTAGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA TTGACAATTT ATTTTTAAAA TTCAGAGTAA TACTTAAATT ACTTATTTAC TTTAAGATTT TGAAAAGATC ATTTGGCTCT TCATCATGCC GATTGACACC 5 CTCCACAAGC CAAGAGAAAC TTAAGTTGTA ATTTTTCTAA CTCCAAGCCT TCTATATAAA CACGTATTGG ATGTGAAGTT GTTGCATAAC TTGCATTGAA CAATAGAAAT AACAACAAAG AAAATAAGTG AAAAAAGAAA TATG, en Lbc^ met de sequentie:

TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA. ACCAACAAAAl 10 GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT GTAGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA 15 TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGAl CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATAl AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGAC? GTTAAAAAGTj GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAAi CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTATJ 2o TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTG7CTC TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA! CAGAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG. _____ J

25 Bij een andere uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding wordt gebruik gemaakt van een DNA-fragment dat identiek is aan, afgeleid is van of omvat 5'-flankerende.gebieden van het Lbc^-5'-3’-CAT-gen _met de sequentie: .

TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA

30 GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT

GTAGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA

ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA

AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT

TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA

35 TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA

CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA

AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT

GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA

CTAAAAAAAT ATATATTAAA' ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT

40 TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC

TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA

GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA

TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA

CAGAAAAGTA GAATTCTAAA ATG

8700207 - 18 -

Bij nog een andere uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding wordt gebruik gemaakt van een DNA-fragment dat identiek is aan, afgeleid is van of omvat 5’-flanke” rende gebieden van het N23-gen met de sequentie: 10 20 30 *+0 50 60 70 5 RArtTTC^A.'Sr.TT.Rr.rrPiftf^f^aTrB^TrrTrTacittiSTrisorrTBraa.-rr.afcKr TTGSATCAATCA ATT Ah

TcoRl" Sail 30 90 100 110 120 130 140

Tl CTATTBaBACACGATTTGAACAATTTTT ACAAT ATSA5ACT ATTTTTGG7TTTTTA TTTBATCCAhhA

150 160 170 180 190 200 210

AAATTT AAAGCTTT AGATGATGATGAATTGAANMAAT ATTGT ATT AATNMTGAAaaGTTNNNNNSGTTT A

250 230 240 250 2S0 270 £30 ATGAAT GCTAT ΒΑΤΑ Γ rGATGBTCTTGATMTATTCWCAGAATTGAAABTAl TaaGaBAAB ΓΒ TTAhGAhh 250 300 310 320 330 340 350 A&AAGTTAGC ACACCAATAGAAGTATTSAGTTATATTAAAhCTTTAGh TTCT TTTChAaTGTTTAC attg 3£0 370 330 350 A 00 AIO 420 10 CA r ATABAhTTTTATTBACAATCCTTATAACAGTTBCTACTGTTGahAGaCG TTCTTCAAhATTAAAA ΓΤ A 30 44 O 450 460 470 m-90 490 ACTTAAa rCATATCTAAAATCAAC AATGT TAuAAGa Γ A6AT TB A A fS«G TTA*s Γ TA ï TTTATCTATTGAh 500 510 520 530 540 550 560 AB ΓΑΑηΒ 1G fTAGAAT t G i TTGA i TATAhAACTCT GA ι ΑΑη ΓΒη i TTTGCAG ΓΤμΑηαηαΑΟΤαΒμΑΒαΙ 570 530 590 600 610 620 530 .

T AATAT A A4AATTGAT ATTTTATAT AAT ATATT AAG TCT CTTT Ah Ar, T TC TTGTAAAaAAAG AC ATTTTT i 640 650 660 670 630 690 700

AAATAATAAAATAAAGCAAGTCTTAATTTTAATGAhhCATCCCTTTGTTAAkCCGAATCTTCCATAATGT

710 720 730 740 750 760 770

15 AAAAATTAATGCTTGATGGhAGTTTTTAATTTG TTCTATCCAaTACTCAAAGGBTTGTAAATaTTTTT TT

780 790 SOO BI O 820 Β30 3-0

TATCATTT ATATBTTBT AA ATATGAATBCACT AGT AATT ASTTT AATBAT AAAATAT ATTCT AC AB ATAT

850 860 870 BSO 890 900 910

ATTTCTG fCTCTTGGCAACT CGT BAGAATT GAAT AT ATT AT AA AGAT BAAAGBTCGT Γ ACAATTTTTTTT

920 930 940 950 960 970 530

AGAAT AAAYATT TATATACAA TTCCT AGATTTTGT TATAAhATTCACATATTG i AT GAtó ΓΑΤΑΑΑ Γ ACAT

990 1000 1010 1020 1030 1040 1050 GAGCACACACCAAACTAG Γ CTCAA A TT AAGT AfiGir FGCThATTATT AGüG'jl ï AGOTAaG TA AC CahGïh

Ddel

20 ATTAATG

870 0 20 7 - 19 -

Volgens een bijzondere uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding wordt bovendien een 3’-flankerend gebied van voor wortelknolletjes specifieke genen gebruikt. Men kan het 3'-flankerende gebied op deze wijze gebruiken, ** wanneer het 3’-flankerende gebied sequenties omvat die de aktiviteit of de regelmatigheid van de wortelkno1letjespromotor of de transcriptieterminatie kunnen beïnvloeden, of die de opbrengst van het gewenste genprodukt op een andere wijze kunnen beïnvloeden.

Voorbeelden van dergelijke 3'-flankerende gebieden zijn de vier 3’-flankerende gebieden van de sojaboon-leghemoglobinegenen , te weten: I5 870 0 20 7

Lba met de sequentie: * ι - 20 - 5* <4 *- mm Ë 2 m »»U m*- «1» •4 M ·* ·* *« u m ü »· ► · £ m m * + ««!»«« 3 6 Ö 2 2 I· ftt U 4» ► ► υ u « μ » i> <

km u m m U

5 n ·· « » 6< >- ► u ► * ►· m m i| O ► ► « « « « *- « ► ► ώ ? a * « « u *- ►“ ►* ►* « o ^ ^ f* g U il h « tf U U Ü « km is m u m C 3 m p· m

« « »> »· U

9 t rs st c? "t tr* ^ «« n ► ►» ►· · >* «( *«·*·*·«

« 4» « ►* U

G m m · »- ► «

»· « ^ - m O

- t. « · m »· u

*. ► ►. *· iS k* O

• m O « ’. }» ► if • »· ►* ö T* m ► km km m «3 m S ►* t t 2 u 5 ö m 8 m m * m m < »t « U 4 ¢14 4^4 m *· o ·» o 5 3 6 2« a 3.6 5 3 g U 4 ► g «9 (» 4 »· Ë £ - u £ *. « ·» «* «· .

870 0 20 7

Lbc.j met de sequentie: - 21 - * a Oh» β *· # a at· ·* * o a m ti «< «· a u*a a o *« *t ··.

a *· t- * υ a a a u t· t· a o O a a t> U ti o t· u t· υ * I» ^ U t· a i· -- o a a * a t a u a U a a o »- *" a ·» a O a o a a a a a * ►· υ a is ►» a a t® a a ►* ' ** t* a a *· . o a ►· • a a u> *- • « f ο υ • ►» o a a a f * a a a a t- o

a a α Ο ο O

»>H H t· m ο i >· a a a * ** a a a a U »- u t> a a t- u »» it· a >· t- a a >- ο a a *· a a ο κι- >» a a U i) ϋ ► a a t- t- a a a a a t- t- a a a o a t» a u a a a a a a a ►- t- a t· ►· ►»

a ·- *- H

a a a ►* a o »· o H t· a u vj ►« »- a tm u a a t- o a a a u a a a *-> * 870 0 20 7

Lbc2 met de sequentie: - 22 - ►- O H- O »- o 0 9 9 0 O -ύ 9 m* 9 ΛΙ 9 ΛΙ M ·< ^ 9 9*- U *· 9 ►· 9 *- O >- 9 U 9 *- U »- 9 O 9 t- H O *- *- O *- 9 0»- *· u o O ““U 9 ( 9 *- 9 *- O *- .

O 9 »- .

*-9 0 9 0*- 0 9 9

"V

«O 9 9 *990 * H* *- 9 ►- 9 9 9 *- *- ►» 9 0 0 9

*- *- O

*— o *— O o o o f*» < rt *· ff· 9-4 *- Λί 9 Λί 9 O 9 9 0*- 9 0 9 *-9 0 O *- *“ 9 9 9 O 9

*- r- O

*- 9 *-

*- 9 O

0 9*— *—*—►— *- O *-

*- ~9 O

l- 9-9 9 *- 9 9 9 9 9.9 *- »-9 0 9<9 9 ►- *- 9 *- 9 *- O *- 9 0 9

9 *- O

*- *- O

O O *- 870 0 20 7 en Lbc^ met de sequentie: - 23 - 4 O u o m* 3 2

2 C

2 2 8 5 22

- J

u 5 u ^ 2 U ►· U *“ .

- u u Z *- «- - G - « < o <' Z<>- u < - O u o u o < β». υ ιλ ►- ·* 3 X. < o < -* ^ *4 —« • ς> < <

« < < U

e >— < *· < < < »- ·- ►- < O o »- o *- ία *- < < < ►- < o < o H* * U < <« ' »- O < Η- t- *· *- H < < < *- I- < o ►- < 8700207 y ξ - 24 -

Deze sequentie ligt op het 0,9 Kb 3'-flankerende gebied dat volgens de uitvinding gebruikt wordt. Een bijzondere uitvoeringsvorm van de uitvinding is derhalve het gebruik van sequenties van dit gebied die de regulering volgens de uitvinding 5' van voor wortelknolletjes specifieke promotorgebieden uitoefenen, of daarbij als middelaar optreden.

Volgens een'bijzondere uitvoeringsvorm van de werkwijze volgens de uitvinding wordt een gebied gebruikt van de coderende sequentie of tussenliggende sequentie van voor wortel-knolletjes specifieke genen. Men kan de coderende sequentie of de tussenliggende sequentie op deze wijze gebruiken, wanneer zij sequenties omvatten die de sterkte of regelmatigheid van de voor wortelknolletjes specifieke promotor kunnen beïnvloeden, of die de opbrengst van het gewenste genprodukt op een andere wijze kunnen 15 beïnvloeden.

Voorbeelden van dergelijke coderende sequenties en tussenliggende sequenties zijn de vier leghemoglobine-genen van de sojaboon, te weten: 20 870 0 20 7

Hl —25— «tc/cti

Lba met de sequentie: »- ^ 15» «··

HtKIW cut ITS CU· *S* *1« Ito *»t St* 5« ï£R fHt ftu» «I* me in *1* «* _ CCT TIC «CT UC IK Cll UT CCT TTC CIC «Ct «cc TU TTC anti m 4*4 »u **c :u **· UI MO SLM TO St* **L ML MC TT* TK ff* in cct e** t*c «cc crr crc ttc t*c *ci tc\c n* ctt ttc tct ét* «cc »tc tct ctt

IH UI

Cu tic tst crr ttt ctt ttc gu »tt »cr tct ctt tc* *** **c «τ* τ·τ tct η» tct >M **

lU l'V CIO lts *1« «WO *L« *L« LTS »SH

tic Ttc ttt tcc ttt ut t«« ·«« tct mc/c *τ· etc c«s *«« cc* et cc* cc* **c c«c m ♦»

LEW nc SI W Utt *L* IS* CLT ML IV MO TH* «S* MO LTS LTV TM* 6LT MIS ttl TTC TTC TU TTT CU CU UT CC* CTt UC CCS «CT **» CCT «*C CTC «CC CCC e«T CCT

*M *·· tu tn uv m ui uv CU «IC CTT TTT CU TTC/CT** CT* TC· CCC UC tt* «*T T*T UC T*T TTT «TC TC*

Slt u« tt* «tt tt* «c* tt* *cc «tc «tc ut ttt uc *ct en u« 10 TC* *tc mc «tt ut ttl *· tct ttc **t tct an n* ut m tcc c*t *tc tic *«c t*c c«« t«c t«t «t* ut ttc

«1* UI

UT TIC T*T ttc ttc *T* «TT «TT m CTT tu t«* ct* tct tct c«c »t» tt* ut «tt

Ml TM

ML a*C It* SC* «LI (LT CL* ie» LTS «L* SC* B.T T** ML V«L »L* m tu *tt ctac/crclsT c*c tc* cct cct c** ctt «u cct «ST cc« «u~crc ctc cct rs* m

«ST *1* *L« LCU CLT SC* IU MR «L« Cm LTS «Lt ML TM* «SM MO Cl* MC ML C«T CU CU CTT CCT TCT CTT C*T CCC CU *U CU CTC «Cl C»T CCT C*C TTC CTS/CT

•I* Hl «tc au ut «ar cu «tc tt* tu tu an atc ut acr tc» «n ttt c*t cc* cu ct*

Itl Ut tu tu tc* *c* e*c «er τβτ ttt ctt tu tcc «tt tcl tu en cu tct tu ut ctt __ TJI Ttt su *tc na aaa au st* na au «τ* tu ut tt* «tt ace tu tu ct* ttt ttc tct M tu* tcc »*T ttt tu Ttt au ut t*t ut t*t cu ttc m c*c cu ter m an au aaa tt» tttt ttc an TU tu tu ut aac tu cct «cc tct ctc tcc ttt ttc an tu «ct aic aca tilt sul

TU au atc ut au ct* uc tu ace atc au tct tt* ttt ttc **t cac ctt an a*T

u« nu aar τη m τα cu tct an cu «t ttc an ut t*t cia na tct tcc tic ut tu tISt 12S1'

Ttt m cc* m m TCT tc* cct na cct tu ctt ua t*t au ttc an ttt tu na 1IM «tv· au au *t* ct* eu ui *tt ttc an t«c ctc aic au ttt *tt tu en eu en au II» ....

an τη t«c arc tu *n ut »t« *tt tct tu ctr ut c*c **c «ee *«t «cc *n «cc uu

Tae tct ttt c«* «ct ctt «r« ree «tt tt« «tt «r* «cc *«« «*r st« «c« cct ui cc* .

i‘» ....

ML **L LTS CLU *L* ICO UU LTS TM* ILC LTS IL* *L* UL

ttc ctc «TC «TT TTC ««c/ctc CTT **« CU cc* CTC ctc ut «e* In i*c cc* «I cn II» ....

CCT «ST CTS t·* ST* «S* CIO ICO ff* IK «lt TM CLU ML «L* TM lt. e». ......

CCC uc ... TCC «cr c«c c*c TTC «ce cct cct tcc uï uk l\c ΪΠ uf S2 m «I

87 0 0 20 7' «L* «1* ILC LTS LTS «L* . . I

CU CCT «TT «*C »«C CU TfjH

De aminozuursequentie van het Lba-proteïne is boven de coderende - sequentie aangegeven.f ~ / - 26 -

Lbc^ met de sequentie: ι·» 61*

ATC\CGT

218 268 UA 8« TH* GLU LTS CLH CLU *1» LEU VIL SE* SE* SE* 8HE 6LU UI 8HE LTS UI AS*

6CT TTC ICT 616 116 CU 616 6CT TTC 6TS I6T ICC TCI TTC CU CC· TIC *·6 CC· *IC

278 388 ILE 8*0 GLN TT* SE* VIL VIL 8HE TT* Ai* SE* •it eer ci* tic «cc crr ere ttc tic **t tc/sti* stt ttc tct ·τ· «sc «tc tct ctt 331 368 TC* ttc tat cït ttt ctt CT6 6«· «TT TTT TCT CTT TC· ··· «IC *T* τ·τ *τ· tit ·τ· 348 »28 TIT ΑΤΑ Τ·τ IT· TAT ·Τ· Τ·Τ «Τλ ΤΙΤ ·Τ· Τ·Τ ·Τ· TIT TTT CTT Α·Τ CT6 *61 G6T τττ «Η *88 ILE LEU CLU LTS ILA 8*0 *L* II» LTS IS8 l£U 8Η6 SE* SCT TTC «TT ··· UT Al* TIC/CATT CIC CA6 *»· 6CA CCT CC* CC· IA6 CIC TTC TTC TC* 818 »8 *

81« LEU *L* *SN CLT VIL IS8 8*0 TH* «SN 8*0 LTS LEU TH* CLT HIS «LA CLU LTS LEU

TIT CTA SC* AAT CCA STA GAC CCC ICT UT CCT 116 CTC ACC CCC CAT CCT CA* IAC CTT

f 878 688

8« ALA LEU

TTT 6CA TTCNGT A«6 TAT CIC CC· ACT UA ATT ATA ACT ATT TT· T6T CAT TA· TTT TM

638 M8

CAT 1·· IC* TC» TCT ATT TT* AC» CTC TT» ft»· UT C»A T6A »C* TT» ATT TTT T6A ATT

688 728

CTA TTT TAT ATT TTT ACC ATA TCT TCA ACT ACC AAT AAT ATA TAA ATT TCT ATT ACT ATT

788 78*

TCT ICC TAA TTA C»T ATA TAT ATA TAT ATA TAA TCC TTC TCA TAA TTt TTT TTC CM TTT

818 8*8

VAL 1*6 AS* SE* ALA CLT 6LN LEU LTS TH* ASM CLT TH* VAL VAL AL* AS8 ALA «LA

6TAC/CT6 CGI CAC TCA CCT C5T CU CTT AAA IC* AAT CCA ACA CTC CTC CCT CAT CCT CCA

878 888

LfU VIL SE* ILE HTS ALA CLH LTS *1« VIL TH* IS8 8*0 GLM 8HC VIL

CTT CTT TCT AtC CAT CCC CAA UI CCA CTC ACT CAT CCT CAC TTC 6TC/6T AT6 ATA AAT

838 868

UT ACT ICT ··· ATC TTA CAA TAA ATC CAA «CT TAA CTT TTA CCT ACA TA6 TCA TCA TCA

888 1178

CTT CAT CC» TCC CTA TTA TTT TTT CAT ATT TAT TCA ACT CAA CTT UA ATT TTC TAA ATA

18» 1*88

CIC «TC GIT CCT ACT UT TTC TTC IGA TC* TGA Gil MC CTI CCA CIA CTC CIA TIG CAT

til· 11*8

TIC TC* TTT TC* UA TIG TIT AIC TGT GIT CTA ATT ATA ACC AAA «AG TGT ATA TAA GAG

1178 1288 VAL VIL LTS GLU ILA LEU LEU LTS TH*

CTA «IC CIT TIT T*« TGT TTT TTA TIT TTT 6TA6/GTC CTT «Al GAA CCA CTC CTC AAA ACA

*238 IMS

ILE LTS GLU ALA VIL CLT CLT «SH TR8 SE* IS* GtU LEU SE* SE* «LI T*8 CLU VIL «LI

ATA 116 CAA CCT CTT GCC G6C UT TG6 «61 GAC 61« TTC «CC ACT CCT TGC CAA CTA 6CC

1288 TT* IS* GLU LEU II* At* »1* UE LTS LTS ILA - /} ,ή TAT CAT CIA TTC CCA CC» CCA «TT III MG GCI / (T/1 ψ

De aminozuursequentie van het Lbc^proteïne 3 *7 0 Q 2 koven de coderende sequentie aangegeven.

- 27 -

Lbc2 met de sequentie: cu M0

IM

«

ui PM€ TM GLU LTS SLM 6LU AL* LEU *AL SC* SC* SE* P"€ CLU SLA PHE LTS ALA ASM

6CT TTC ACT CAC A AC CAA CAC GCT TIC CTC ACT ACC TCA ITC CAA CC A TTC AA6 CCA A4C

21» 2*· ILE PRO GLM TT* SE* VAL VAL PHE TT* TM SE* _

ATT CCT CAA TAC ACC 6TT CTC TTC I»C ACT VC/GTA ACT TTT CTC TTA AAC CAT CTA TCT

279 SH

e Tte ATT CTC TCT m TCC TTT CCA CAT TTT TTC TCT TTC AAA ACA CAI act CTC aat «ts

5 330 . 3M

ILE LEU GLU LTS ALA P*0 ALA AL* LTS ACT 666 T*T TTT TTT TTA TT» AA* ATT A»e AG/C ATA CT6 6A6 AAA 6CA CCC CCA CC* A*C

3*· ·» ASP tEU PHE SE* PHE LEU SE* AS* 6LT VAL ASP PM SE* AS* PM LTS LEU TH* CLT *13

CAC TÏC TTC TC6 TTT CTA TCT AAT 66A CTA CAI CCT A6T AAT CCT A*6 CTC AC8 CCC CAI

«59 «· AL* GLU LTS LEU P«€ GLT LEU „ T__ __

ςςί CAA AAC CTT TTT 66A TTG/6TA A6T ATC ATC CA* CTA *»* TTA TAC CTA TTT TAf S7S

519 5*· ATT AAT TTT A AC ATT AAA CAI 6TA TTT A AC ACT CTT AAA CAT 6TA TTT A AC ACT CTf ·1*β 570 **·

ATT AAA CAt CTA TTT AAC TAA AAC ATC TAT TTC CT6 ATT ATT TTT TTT TT* IA* TT* »LS

10 *39 M· VAL ABC ASP SE* ALA CLT CL* LEU LTS «CL» TCT CAC AT* TT* TAÏ ATT TTT TCA ATT CTA C/CT6 CCT CAC TCA CCT CCT CAA CTT AA» SE» »*· 32® ASM CLT TH* VAL VAL AL* ASP *LA ALA LEU GLT SE* ILE HtS AL* CL* LTS ALA ILE 3**

AAT CCA ACA CTA 6T6 GCI GAT GCC GCA CTT GCT TCT ATC CAT GCC CAA AAA GCA ATC *CT

ISO 3®· 04T CCT CAC TTC GÏG/GI ΛΪ6 ATA AAT AAT AAA AlC TT* CAA TA* AT6 CAC ATA TAC TI» SIS ®** UT TTT AC* T6C TCC ACT CTT ATC ATC ATC ATT ITT 6TT TA6 TAA TCA ATT TAC TT» AM*

7« «M

TC ter TA« ATT AT6 TAC TTT TT6 AAA CTT TTA TAT CCA ATT TTA ATT At* GG6 AAA AA* SS» *··* *30 ®0®

VAL VAL LTS CLU ALA LEU LEU LTS ffl* ACA CCT AAT CC* TTA CIC ATC TTT TCT CTC TA6/6TG 6TT AAA GAA CCA CTC CT6 AA» «CA

W M2X

ILE LTS GLU ALA VAL CLT ASP LTS T*P SE* ASP GLU LEU SE* SE* ALA !»P CLU WA. Mt*

ATA A AC CAC CCA 6TT GCC CAC AAA TGG ACT CAT CAA TTC A CC ACT GCT TCC CAA CS» èiJ

195» tOH

TT* A$p GLU LEU »L* *LA »LA ILE LTS LTS AL* Wil . .

TAT GAT CAA TTG GCA CCA CCT ATT A»6 AAC CC* ITT‘Tfid,

_ IIH

De aminozuursequentie van het Lbc2“ proteïne is boven de coderende sequentie aangegeven 20 v 8700207 • “ - 28 - en lïc3 met de sequentie:

CLT ALA PH* THR «3P

• C/GGT 6CT TTC aci sar

IH

LTS GLM GLU *L* LEU V*t SE» SER SER PHE GLU ALA PHE LTS THR ASM ILE PRO CLH TTR

aac caa cac gct its gtg act acc tca ttt gaa gca ttc aag aca aac aii cct caa tac ise *·· SER.VAL VAL PHE TTR THR SER ...

ACT CTT GTC TTC TAC ACC TC/6TA ACT ATT CTA TCT AAA TTA TCT CTC TTA TIC TAT CTT

2IR 20

C TAA CTT TCC TCC TTT CTT CTC TTT CAA AAA AAC ATA TAT ATT CTT ΑΑΓ CTC ACT CCT TTT J 270 MR

ILE LEU GLU LTS ala PRO VAL ALA LTS A5P LEU PHE SER CCT TTC ACT AAA AAT GAA TAC/C ATA CTC GAG AAA CCA CCT CTA CCA AAC CAC TTC TTC ICA

ISO 3*0

RHE LEU ALA asm GLY VAL ASP PRO THR ASM PRO LTS LEU THR GLT HTS ALA GLU LTS LEU

TTT CTA Gcr AAT GGA GTA CAC CCC ACT AAT CCT AAC CTC ACC GCC CAI CCT CAA AAA CTT

390 020

PHE CLT LEU

TTT GGA TTC/CI AAC TAT CCA GCC TAC TAA AAT TAA AAT CCT ATT ACT ATT TTT TAT TAT

•SO «00

• - VAL ARC ASP SER

TTT TCT TCC ATC ATT CTC TTC TCA CAT ATT ATA TAT TTT TTC AAT TAT AC/CTA CCT CAI TCA

SIO SA*

ALA GLT GLM LEU LTS ALA SER GLT THR VAL VAL ILE ASP ALA ALA LEU GLT SER ILE HTS

-'-U CCT GGT CAA CTT AAA GCA AGT GGA ACA GTC GTC ATT GAT GCC CCA CTT CCT TCT ATC CAT

S70 MO

ALA GLM LTS ALA ILE THR ASP PRO GLM PHE VAL

GCC CAA AAA GCA ATC ACT GAT CCT CAA TTT GTG/6 TAT GAT AAA TAA ICA AAA CCT ACA

A30 Ut

ATA AAT GCA CAA ATA CTT AAT TTT ACA TAG TGC ACT GCT ATA ICA TCA TCA CTT TTC CTT

•90 720

ACT AAT GAA TTT ACT TTT TTT TTT TAC ACA ACT AAI CCA ITT ACT TAA AAT CTT AAA TTA

750 700

TCT ACT TCT TTA AAC ACT TTT CTA TCC AAT TTT AAI TAT ACC AAA AAT CTA ACA CCT AAA

•10 ···

, „ VAL VAL LTS GLU ALA LEU LEU LTS THR jlE LTS CLU ALA

15 CCA TTC CTG ATC ATT ICC AAC/CIG CTT AAA GAA GCA CTC CTC AAA ACA ATA AAC CAC GCA

#70 99·

VAL GLT ASP LTS THP SER »SP CLU LEU SER SER ALA TRP GLU VAL ALA TT» ASP CLU LEU

CTT CGG CAC AAA 1GC ACT GAC GAG lit ACC »GT CCT TCC GAA CTA CCC TAT CAI CAA TTC

#30 VM

ALA ALA ALA ILE LTS LTS ALA PHE I

GCA GCA GCT ATT AAC AAC GCA ITT'7/?<S.

Λ

De aminozuur sequent ie van het Lbc^-protelne ie boven de coderende sequentie aangegeven.

8700207 » " ί ï f - 29 -

De uitvinding heeft bovendien betrek- . king op een nieuw DNA-fragment dat een induceerbare plantepromo- tor omvat voor gebruik bij het uitvoeren van de werkwijze volgens de uitvinding, welk DNA-fragment gekenmerkt wordt doordat het identiek is met , afgeleid is van of omvat een 5*-flankerend gebied van voor wortelknolletjes specifieke genen.Voorbeelden van dergelijke DNA-fragmenten zijn DNA-fragmenten die identiek zijn met , afgeleid zijn van of omvatten een 5’-flankerend gebied van planteleghemoglo-binegenen. Voorbeelden daarvan zijn volgens de uitvinding DNA-fragmenten die identiek zijn met , afgeleid zijn van of omvatten een 5'-flankerend gebied van de vier sojaboon-leghemoglobinegenen, te weten:

Lba met de sequentie: GAGATACATT ATAATAATCT CTCTAGTGTC TATTTATTAT TTTATCTGGTj

GATATATACC TTCTCGTATA CTGTTATTTT TTCAATCTTG TAGATTTACT

TCTTTTATTT TTATAAAAAA GACTTTATTT TTTTAAAAAA AATAAAGTGA

ATTTTGAAAA CATGCTCTTT GACAATTTTC TGTTTCCTTT TTCATCATTG

20 ggttaaatct catagtgcct ctattcaata atttgggctc AATTTAATTA

GTAGAGTCTA CATAAAATTT ACCTTAATAG TAGAGAATAG AGAGTCTTGGj AAAGTTGGTT TTTCTCGAGG AAGAAAGGAA ATGTTAAAAA CTGTGATATT j

TTTTTTTTGG ATTAATAGTT ATGTTTATAT GAAAACTGAA AATAAATAAAI I

CTAACCATAT TAAATTTAGA ACAACACTTC AATTATTTTT TTAATTTGAT j

25 TAATTAAAAA ATTATTTGAT TAAATTTTTT AAAAGATCGT TGTTTCTTCT I

TCATCATGCT GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC ACATAAGCT?

TGGTTTTCTC ACTCTCCAAG CCCTCTATAT AAACAAATAT TGGAGTGAAG

TTGTTGCATA ACTTGCATCG AACAATTAAT AGAAATAACA GAAAATTAAA

AAAGAAATAT G»__*------------- j

Lbc1 met de sequentie: 30 1 - TTCTCTTAAT ACAATGGAGT TTTTGTTGAA CATACATACA TTTAAAAAAA AATCTCTAGT GTCTATTTAC CCGGTGAGAA GCCTTCTCGT G7TTTACACA CTTTAATATT ATTATATCCT CAACCCCACA AAAAAGAATA CTGTTATATC TTTCCAAACC TGTAGATTTA TTTATTTATT TATTTATTTT TACAAAGGAGj 35 ACTTCAGAAA AGTAATTACA TAAAGATAGT GAACATCATT TTATTTATTAj TAATAAACTT TAAAATCAAA CTTTTTTATA TTTTTTGTTA CCCTTTTCAT1 -ï m 8700207 λ r .-30- TAT7GGGTGA AATC7CA7AG TGAAGCCATT AAATAATTTG GGCTCAAGTT TTATTAG7AA AGTCTGCATG AAATTTAACT TAACAATAGA GAGAGTTTTC GAAAGGGAGC GAATGTTAAA AAGTGTGATA TTATATTTTA TT7CGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA CATACAAAAA AATACTTTTA AATTCAGAAT 5 AA7AC77AAA ATAT77ATTT GC77AA77GA TTAACTGAAA ATTATTTGAT TAGGA7777G AAAAGATCAT TGGCTCTTCG TCATGCCGAT TGACACCCTC CACAAGCCAA GAGAAACTTA AGTTGTAAAC TT7C7CACTC CAAGCC77C7 ATATAAACAT GTATTGGATG TGAAGTTATT GCA7AAC77G CA7TGAACAA TAGAAAATAA CAAAAAAAAG TAAAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG,

Lbc2 met de sequentie: 10 TCGAGTTTTT ACTGAACATA CATTTATTAA'AAAAAACTCT CTAGTGTCCA! TTTATTCGGC GAGAAGCCTT CTCGTGCTTT ACACACTTTA ATATTATTATI ATCCCCACCC CCACCAAAAA AAAAAAAACT GTTATATCTT TCCAGTACATt TTATTTCTTA TTTTTACAAA GGAAACTTCA CGAAAGTAAT TACAAAAAAGl 15 ATAGTGAACA TCATTTTTTT AGTTAAGATG AATTTTAAAA TCACACTTT7! TTATATTTTT TTG7TACCCT TTTCATTATT GGGTGAAATC TCATAGTGAAj AC7ATTAAAT AGTTTGGGCT CAAGTTTTAT TAGTAAAGTC TGCATGAAATl TTAACTTAAT AATAGAGAGA GTTTTGGAAA GG7AACGAAT GTTAGAAAG7! G7GA7A7TA7 7A7AG7777A T7TAGA77AA 7AA77ATG77 TACA7GAAAA! 20 T7GACAATT7 A7T777AAAA T7CAGAG7AA TAC77AAAT7 AC77ATT7AC TT7AAGAT77 7GAAAAGA7C A7TTGGCTCT TCA7CATGCC GAT7GACACC! 'C7CCACAAGC CAAGAGAAAC "T7AAG77G7A ATT7TTCTAA CTCCAAGCC7' TC7ATATAAA CACG7ATTGG A7G7GAAG77 G77GCA7AAC T7GCA77GAA • CAATAGAAAT AACAACAAAG AAAATAAG7G AAAAAAGAAA 7A7G, en Lbc^ met de sequentie : 25 TATGAAGA77 AAAAAA7ACA C7CATA7ATA 7GCCA7AAGA ACCAACAAAA-G7AC7A777A AGAAAAGAAA AAAAAAACC7 GC7ACA7AA7 TTCCAATC77 G7AGA777A7 T7C77T7A77 TT7A7AAAGG AGAG77AAAA AAAT7ACAAA A7AAAAA7AG 7GAACA7CG7 C7AAGCATT7 T7A7A7AAGA 7GAA77T7AA 30 AAATATAAT7 T7T77G7C7A AA7CG7A7G7 A7C77G7C77 AGAGCCA777 TTGT77AAAT 7GGATAAGA7 CACAC7A7AA AG77C77CC7 CCGAG777GA TATAAAAAAA AT7G777CCC 7777GA77A7 TGGA7AAAA7 C7CG7AG7GA CA77A7A7TA AAAAAA77AG GGC7CAA777 T7A77AG7A7 AG777GCA7A AAT777AAC7 7AAAAA7AGA GAAAATC7GG AAAAGGGAC7 G77AAAAAG7 35 :G7GA7A77AG AAATTTGTCG GATA7A77AA TAT777ATT7 TA7A7GGAAA C7AAAAAAA7 ATA7AT7AAA A777TAAAT7 CAGAA7AATA CTTAAA77A7 TTAT77ACTG AAAA7GAGT7 GA777AAG77 T77GAAAAGA TGA77G7CTC TTCACCA7AC CAA77GATCA CCCTCC7CCA ACAAGCCAAG AGAGACA7AA.

8700207 - 31 - GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCT7CAA GCCTTCTATA TAAA7AAGTAI TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAAI CAGAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG. ~________________ __

Een ander voorbeeld van een dergelijk DNA-2 fragment volgens de uitvinding is een DNA-fragment dat identiek is aan, afgeleid is van of omvat 5'-flankerende gebieden van bet libels *-3'CAT-gen met de sequentie

TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA

GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT

10 GTAGAT-TTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA

ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA

‘ AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT

TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA

TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA

15 CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA

AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT

» GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA

CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT

TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC

on TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA

GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA

ï TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA

CAGAAAAGTA GAATTCTAAA ATG

Nog een ander voorbeeld van een dergelijk DNA—fragment volgens de uitvinding is een DNArfragment dat iden-tiek is aan, afgeleid is van of omvat 5'-flankerende gebieder van het N23 —gen met de sequentie - 87 O O 20 7 32 Ή * Λ1 * <3

10 SO 30 40 50 SO ?Q

BéA^SAGCTCGCCCGGGGATCGATCCTCTABAEXCG&CCTGCAGCCCAAGCTTSGATCAATCAATTAh

IcoRI Sal I

SO 30 100 110 120 130 140

TTCTATTGAGACACGATTTGAACAATTTTTACAATATBASACTATTTTTGGTTTTTTATTTGATCCAhAA

150 ISO 170 180 130 200 210 AAATTT aaagctttagatgatgatgaattgaannaat attgtatt aatnntgaaaasttnmmnhggttt a HSO 230 240 . 250 260 270 230 atgaatgctatgatattgatggtcttgatntattnncagaattgaaagtattaagagaagtgttaagama 230 300 310 320 330 340 350

5 AGAAGTT A6CACACCAAT AGAAGT ATTGAGTT AT ATT AAAACTTT AGATTCTTTTCAAATGTTT ACATTG

360 370 380 330 400 410 420

CA T AT AGAATTTTATTGACAATCCTTAT AACAGTTGCTACTGTTGAAAGACGTTCTTCAAAATTAAAATT

430 440 450 460 470 480 490

ACTTAAATCATATCTAAAATCAACAATGT TfiCAAGATAGATTGAATGAG TTASTTATTTTATCTATTGAA

500 510 520 530 540 550 560

AG Γ AAAGTGTTAGAATTGTTTGATTATAAAACTCTGATAAATGATTTTGCAGTTAAAAAAACTAGAhGAT

570 580 530 600 610 620 630

TAATATAAAAATTGATATTTTATATAATATATTAAGTCTCTTTAAAATTCTTGTAAAAAAAGACATTTTT

640 650 660 670 680 690 700

10 AAATAATAAAATAAAGCAACTCTTAATTTTAATGAAACATCCCTTTGTTAAftCCGAATCTTCCATAATBT

710 720 730 740 750 760 770

AAAAATTAATGCTTGATGGaAGTTTTTAATTTGTTCTATCCAATACTCAAAGGGTTGTAAATATTTTTTT

730 790 800 810 820 830 840 TATCATTTATATGTTGTAAATATGAATBCACTAGTAATTAGTTTAATGATAAAATATATTCTACASATAT ; 850 B60 870 8S0 890 900 910 atttctgïctcttggcaactcgtgagaattgaatatattataaagatgaaaggtcgttacaatttttttt 920 930 940 950 960 970 980

AGAAT AAA f Α ΓΤΤ AT AT ACAATT CCl AGATTTTGTTATAAAATTCACATATTGT ATGAÜTATAAA f ACAT

990 1000 1010 1020 1030 1040 1050

1 c GASCACACACCAAACTAGTCTCAAATTAAGTAABGT8CTAATT ATTAGCGGCTAGOTAAGTAACCAAGT A

Ddel

ATTAA1G

8700207 - 33 -

De uitvinding heeft voorts betrekking op elk plasmide voor gebruik bij het uitvoeren van de werkwijze volgens de uitvinding en gekenmerkt doordat het een DNA-fragment omvat dat een induceerbare plantepromotor zoals 5 hierin gedefinieerd,bevat, Geschikte plasmiden volgens de uitvinding zijn pARl 1, pAR29, pAR30 en N23-CAT , vergelijk de voorbeelden III,IV en XI, waardoor bovendien recombinatie in het A.rhizogenes T DNA-gebied mogelijk is.

De uitvinding heeft voorts betrekking op 10 elke Agrobacterium-stam voor gebruik in verband met de uitvinding en gekenmerkt doordat deze een DNA-fragment omvat dat een induceerbare plantepromotor van voor wortelknolletjes specifieke genen, ingebouwd in het T DNA-gebied , bevat , en derhalve in staat is de induceerbare promotor in planten 15 te transformeren. Bacteriestammen volgens de uitvinding zijn de A.rhizoeenes-stammen AR1Ï27 dat pAR29 bevat, AR1134 dat pAR30 bevat, AR1000 dat pAR11 bevat, en AR204-N23-CAT dat N23-CAT bevat.

De uitvinding is niet tot de bovenvermelde 20 uitvoeringsvormen beperkt. De uitvinding maakt derhalve niet uitsluitend gebruik van 5'-flankerende gebieden van sojaboon-leghemoglobinegenen. Het is algemeen bekend, dat de leghemoglobinegenen van alle vlinderbloemigen dezelfde funktie hebben, zie Appleby (1974) in The Biology of Nitrogen 25 Fixation, Quispel. A. Ed. North-Holland Publishing Company,

Amsterdam, Oxford, biz. 499-554 , en voor wat het PvLbl-gen van de witte boon betreft, is voorts bewezen,dat er een grote mate van homologie bestaat met de sequenties van het Lbc^'gen van de sojaboon. Het is ook bekend, dat de expressie 30 van andere voor wortelknolletjes specifieke genen op een soort gelijke wijze als de leghemoglobine-genen gereguleerd wordt.

De uitvinding omvat derhalve het gebruik van 5’-flankerende gebieden van leghemoglobinegenen of andere voor wortelknolletjes specifieke genen van alle planten, ingeval het gebruik 55 van dergelijke DNA-fragmenten de expressie van een gewenst genprodukt tot het voorwerp van de. regulering volgens de uit- 8700207 34 - vinding maakt.

De uitvinding maakt ook het gebruik mogelijk van der gelijke fragmenten van welke oorsprong ook die onder natuurlijke omstandigheden de regulering volgens de uitvinding uit-2 oefenen of daarbij als. middelaar optreden. Dit laatste is vooral van toepassing op dergelijke fragmenten die geïsoleerd kunnen worden uit DNA-fragmenten van genbibliotheken of genomen door hybridisatie met gemerkte sequenties van 5'-flankerende gebieden van sojaboon leghemoglobinegenen.

^ Het is algemeen bekend, dat het mogelijk is nucleotidesequenties van niet-belangrijke subgebieden van 5'-flankerende gebieden te veranderen zonder een verandering te veroorzaken van de aktiviteit en de regelmatigheid van de promotor. Het is ook algemeen bekend dat een verandering van ^ sequenties van belangrijke subgebieden van 5'-flankerende gebieden het mogelijk maakt de bindingsaffiniteiten te veranderen tussen nucleotidesequenties en de faktoren of effectorstoffen welke noodzakelijk zijn voor de transcriptie-initiatie en de translatie-initiatie, en bijgevolg de aktiviteit en/of de regelmatigheid 20 van de promotor te verbeteren. De uitvinding behelst uiteraard ook het gebruik van DNA-fragmenten die dergelijke veranderde sequenties van 5'-flankerende gebieden bevatten, en in het bijzonder kunnen DNA-fragmenten genoemd worden die gevormd zijn door recombinatie van gebieden van 5'-flankerende gebieden van 22 een willekeurig gen met 5'-flankerende gebieden van voor wortel- knolletjes specifieke genen , mits het gebruik van dergelijke DNA-fragmenten de expressie van een gewenst genprodukt onderwerpt aan de regulering volgens de uitvinding.

Opgemerkt dient te worden, dat de trans-20 formatie van microorganismen volgens op zichzelf bekende wijze uitgevoerd wordt, zie bijvoorbeeld Maniatis et al., (1982) , Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory.

De transformatie van plantecellen, dat wil zeggen de introduktie van plasmide DNA in plantecellen , 22 wordt eveneens volgens op zichzelf bekende wijze uitgevoerd, zie 8700207 - 35 -

Zambryski et al., (1983) , EMBO J. 2, 2143-2150.

Splitsing met restrictie-endonucleases en digestie met andere DNA-modificerende enzymen zijn algemeen bekende technieken en worden volgens de aanbevelingen van de 5 leveranciers uitgevoerd.

De in verband met de uitvinding gebruikte s

Agrobacterium rbizogenes 15834 rif is geïsoleerd door J.A. Lippincott, Department of Biological Sciences, Northwest University, Evanston, Illinois 60201, USA.

10

Voorbeeld I

Sequentiebepaling van 5'-flankerende gebieden van sojaboon-leghemoglobinegenen

Uit een sojaboon-genenbibliotheek worden 15 de vier sojaboon-leghemoglobinegenen Lba, Lbc^, en Lbc^ verschaft, zoals beschreven wordt door Jensen, E. 0. et al.,

Nature Vol . 291, No. 3817, 677-679 (1981) . De genetisch stabiele onveranderlijke sojaboonsoort "Glycine max. var. Evans" werd gebruikt als een uitgangsmateriaal voor de isolatie van het DNA dat voor de 20 constructie van de genoemde genenbibliotheek gebruikt werd. De 5’—flankerende gebieden van de vier sojaboon-leghemoglobinegenen worden geïsoleerd, zoals beschreven wordt door Jensen, E.0., Ph D Thesis, Institut^or Molekylser Biologi, Arhus Universitet (1985), en de sequenties van de 5'-flankerende gebieden van de 25 vier genen worden bepaald met behulp van de dideoxy- .....

methode, zoals beschreven door Sanger, F., J. Mol. Bio. 143, 161 (1980), en in het sequentieschema weergegeven.

Voorbeeld II

30 Constructie van Lbc^-5 *-3 r-CAT

De constructie is uitgevoerd in een aantal opeenvolgende processtappen:

Het subkloneren van het Lbc -gen ~ ' — --J-

Het Lbc^gen werd geïsoleerd op een 12Kb EcoRI restrictiefragment 35 uit een sojaboon-DNA-bibliotheek, beschreven door Wiborg et al., in Nucl. Acids Res. (1982) 10, 3487. Een gedeelte van het fragment wordt bovenaan schema 2 getoond. Dit fragment werd gedigereerd 3700207 - 36 - door de vermelde enzymen , en daarna aan pBR322 geligeerd, zoals in het schema aangegeven wordt. De verkregen plasmiden LbCgHH en Lbc^HX werden vervolgens door PvuII gedigereerd en opnieuw geligeerd, wat leidde tot twee plasmiden genaamd ^ pLpHH en plpHX.

Het sub-kloneren van 5*-flankerende sequenties van het Lbc^-gen

Voor dit doel werd pLpHH gebruikt zoals aangegeven in schema 3. Dit plasmide werd met behulp van PvuII geopend en met exonuclease Ba131 behandeld . De reaktie werd 10 op verschillende tijdstippen gestopt en de ingekorte plasmiden werden geligeerd in fragmenten van pBR322. Deze fragmenten waren, zoals getoond in schema 3, op een zodanige wijze tevoren behandeld, dat zij aan een uiteinde een DNA-sequentie TTC --- 15 448 ~ hadden. Na het ligeren had een digestie met ËcoRI plaats , en de fragmenten die 5'-flankerende sequenties bevatten, werden geligeerd in door EcoRI gedigereerd pBR322. Deze plasmiden werden getransformeerd in E.coli K803 , en de plasmiden in de transformanten 20 werden met behulp van sequentieanalyse onderzocht . Een plasmide, p213 5'Lb , geïsoleerd uit één van de transformanten, bevatte een 5'-flankerende sequentie die 7 bp voor het Lb ATG startcodon op een zodanige wijze eindigde, dat de sequentie als volgt is: 2Kb

25 “5’ flankerende --- AAAGTAGAATTC

LbCg sequentie

Het sub-kloneren van het 3'-flankerende gebied van het Lbc^~gen

Voor dit doel werd pLpHX gebruikt 30 dat door Xholl gedigereerd werd. De uiteinden werden gedeeltelijk opgevuld en overmaat DNA werd verwijderd , zoals aangegeven in schema 4. Het getoonde fragment werd geligeerd in pBR322 dat tevoren behandeld was, zoals in het schema aangegeven. De constructie werd getransformeerd in E.coli K803. Eén van de transformanten 35 bevatte een plasmide genaamd Xho2a-3'Lb . Daar de Xholl her- kenningssequentie onmiddellijk na het Lb stopcodon gelegen is , zie schema 2, bevatte het plasmide ongeveer 900 bp van het 3'- 8700207 - 37 - flankerende gebied, en de sequentie begon met GAATTCTACAA---.

De constructie van Lb promotorcassette

Een EcoRI/Sphl fragment van Xho2a-3'-Lb 5 werd gemengd met een BamHI/EcoRI fragment van p213-5'Lb.

Deze twee fragmenten werden geligeerd via de BamHI/Sphl slitsings-plaatsen in een pBR322-derivaat waarvan de EcoRI herkennings-sequentie verwijderd was, zie schema 4. De geligeerde plasmiden werden getransformeerd in E.coli K803. Een plasmide in één van 10 de transformanten bevatte de corecte fragmenten en werd pEJLb 5 *—3 *—-1 genoemd.

Constructie van ehimaer Lb/CAT-gen

Het CAT-gen van pBR322 werd geïsoleerd op verscheidene kleinere restrictiefragmentai, zoals getoond in 15 schema 5. Het 5* coderende gebied werd geïsoleerd op een Alul-fragment dat vervolgens geligeerd werd in pBR322 , dat behandeld was zoals vermeld in het schema. Dit werd getransformeerd in E.coli K803 , en een geselecteerde transformant bevatte een plasmide genaamd Alul. Het 3r-coderende gebied werd geïsoleerd op 20 een Taql-fragment. Dit fragment werd behandeld met exonuclease

Bal31 , waarna E coRI-binders toegevoegd werden. Daarna volgde een digestie met EcoRI en een ligering in door E coRI gedigereerd pBR322. Dit laatste werd getransformeerd in E.coli K083 en de transformanten werden geanalyseerd. Een plasmide, Taq 12, 25 bevatte het 3*-coderende gebied van het CAT-gen plus 23 bp 3’- flankerende sequenties en eindigde vervolgens in de sequentie CCCCGAATTC. Vervolgens werden de volgende fragmenten met elkaar geligeerd in door E coRI gedigereerd pEJLb5?-3'-1: EeoRI/PvuII- fragment van Alul, PvuII/Ddel-fragment van pBR322 en Ddel/EcoRI-30 fragment van Taq 12. Dit ligeringsmengsel werd getransformeerd in E.coli K 803 . Een geselecteerde transformant bevatte het juiste plasmide en werd pEJLb 5*-3’ CAT 15 genoemd .

Voorbeeld III 35 a.

Het kloneren en integreren van het sojaboon Lbc^-5'-3'-CAT-gen

Twee EcoRI-fragmenten (no. 36 en no.40 ) 6700207 - 38 - van het Ττ DNA-gebied van A-rhizogenes 15834 pRi plasmide werden

Li 1 " 1 als "integratieplaatsen" gebruikt. Zo werd het Lbc^-S’-S-CAT-gen gesubkloneerd ( als 3,6 Kb BamHl/SalI-fragment) in twee vectoren pAR1 en pAB.22 die de bovengenoemde EcoRI-fragmenten bevat-5 ten. De verkregen plasmiden pAR 29 on pAR30 werden vervolgens gemobiliseerd in A.rhizogenes 15834 rif . Noch pAR29 noch pAR30 kunnen in Agrobacterium repliceren. De selectie door middel van rifampicine 100 pg/ml en de plasmidemarkers spectinomycine 100 pg/ml, streptomycine 100 jig/ml of kanamycine 300pg/ml zal dan · ook A.rhizogenes-bacteriën selecteren waarin de plasmiden geïntegreerd zijn via homologe recombinatie door de EcoRI-fragmenten 36 of 40. De structuur van de verkregen T DNA-gebieden - overge-

Li bracht in de getransformeerde plantelijnen L5-9 en L6-23 -is onder in schema 6 aangegeven. In dit schema worden bovendien voor 15 de L6-23-lijn de EcoRI- en HindlII-fragmenten getoond die het

LbCg^’-S’-CAT-gën bevatten en dan ook hybridiseren met radio-aktief gemerkt Lbc^^’-S'-CAT DNA, zie voorbeeld IVa.

b.

20 Het kloneren en integreren van het sojaboon Lbcjgen,

Het EcoRI-fragment No. 40 is hier gebruikt als "integratieplaats" . Het Lbc^-gen werd derhalve gesubkloneerd (als een 3,6 KbBamHI-f ragment) in de pAR1-vector en over gebracht in het T_ DNA-gebied zoals vermeld in a. De structuur van het TT 25 DNA-gebied , dat overgebracht is in de getransformeerde plantelijn L8-35, is onder in schema 7 getoond. Dit schema laat bovendien de EcoRI- en HindlII-fragmenten zien die het Lbc^-gen bevatten en derhalve met radioaktief gemerkt Lbc^-DNA hybridiseren , zie voorbeeld IVb.

30

Voorbeeld IV

a_.

Het aantonen van het sojaboon Lbc^-5'-S’-CAT-gen in getransformeerde gewone rolklaver ( zie fig, 1) 25 DNA werd geextraheerd uit getransformeerde lijnen (L6-23) of niet-getransformeerde controleplanten, gesplitst door de restrictieenzymen EcoRI en HindlII en vervolgens geanalyseerd 87 0 0 2 0 7 "· - 39 - door Southern-hybridisatie. Radioaktief Lbc^-S’-3 f-CAT-gen werd gebruikt voor het aantonen van overeenkomstige sequenties in de getransformeerde lijnen. De met getallen aangegeven banden komen overeen met restrictiefragmenten die delen van het Lbc^-5 5 3’-CAT-gen vormen , zoals vermeld in de restrictiemap (schema 6) van voorbeeld lila.

b.

Het aantonen van het sojaboon Lbc^gen van getransformeerde gewone 10 rolklaver (zie fig. 2) DNA werd geextraheerd uit getransformeerde lijnen ( L8-35) of niet-getransformeerde controleplanten, gesplitst door de restrictieenzymen EcoRI en HindlII en vervolgens geanalyseerd door Southern-hybridisatie. Radioaktief Lbc^-gen 15 werd gebruikt voor het aantonen van overeenkomstige sequenties in de getransformeerde lijnen. De met getallen aangegeven banden komen overeen met restrictiefragmenten die delen van het Lbc^-gen vormen, zoals vermeld in de restrictiemap (schema 7) van voorbeeld Illb.

20

Voorbeeld V

a.

Weefselspecifieke expressie van het sojaboon Lbc^-51-3’-CAI-gen in wortelknolletjes van de gewone rolklaver ( zie fig. 3) 25 De aktiviteit van . het chlooramfenicol- acetyltransferase(CAT)enzym wordt gemeten als de hoeveelheid geacetyleerd chlooramfenycol (AcCm) dat uit ^C-chlooramfenycol gevormd wordt. In (a) verschijnen de geacetyleerde vormen 1AcCm en 3AcCm , die van Cm gescheiden zijn door middel van dunne-30 laagchromatografie in chloroform/methanol ( 95:5) . De kolommen 1-3 laten zien dat er geen CAT-aktiviteit optreedt in wortels (R), wortelknolletjes (N) en bladeren plus stengel (LS) van niet-getransformeerde gewone rolklaver. De kolommen 4-6 en 7-9 laten de CAT-aktiviteit zien in overeenkomstige weefsels van met 35 Lbc2~5’~3’-CAT getransformeerde L6-23- en L5-9-planten. De omzetting van chlooramfenicol in de kolommen 5 en 8 laat de weefselspecifieke expressie zien van het Lbc^'S’-3'-CAT-gen in . wortelknolletj es.

8700 20 7 - 40 -

De kolommen 10-12 laten zien dat er geen CAT-aktiviteit optreedt in planten die door middel van wild-type A. rhizogenes getransformeerd zijn.

5 b.

Tabel L6-23 L5-9 CAT-aktiviteit GAT-aktiviteit IQ Wortels 0 0

Wortelknolletjes 68.830 cpm/pg proteïne 154.000 cpm/pg proteïne .uur .uur

Bladeren + stengel 0 0 15

In tabel (b) is de CAT-aktiviteit in met Lbc^-S'-S’-CAT getransformeerde L5-9- en L6-23-planten vermeld als de hoeveelheid C-chlooramfenicol dat omgezet is m geacety- leerde derivaten. De hoeveelheid radioaktiviteit in de geacetyleer- 20 , ...

de derivaten is geteld door vloeistofscintillatie en vermeld in cpm/pg proteïne.uur.

Voorbeeld VI ·

Transcriptieproef op weefsels van met Lbcn-5'-3'- 25 ; -d en met wild-type A.rhizogenes getransformeerde gewone rolklaver (zie fig. 4) 5 pg Compleet MA dat uit wortels (R) , wortelknolletjes (N) of bladeren plus stengel (LS) geextraheerd en in formaldehyde-agarosegels gescheiden was , werd op hitro-30 cellulose overgebracht. Kolom 1 bevat 5 pg compleet MA uit soja-booncontroleplanten. De kolommen 2-4 en 5-7 bevatten compleet MA uit respectievelijk de wortels, wortelknolletjes of bladeren plus stengel van de met Lbc^-5'-3'-CAT getransformeerde lijnen L5-9 en L6-23. De kolommen 8-10 bevatten MA uit overeenkomstige 35 ...

weefsels van door middel van wild-type A. rhizogenes getransformeerde gewone rolklaver. In (a) is radioaktief DNA van de voor 870 010 7’" - 41 - CAT coderende sequentie gebruikt voor hybridisatie. De weefsel-specifieke transcriptie van het LbCg-5!-3’-CAT-gen in wortel-knolletjes van de L5-9- en L6-23-lijnen blijkt uit de kolommen 3 en 6. In (b) blijkt de constitutieve expressie van de alom 5 aanwezige genen. Een humaan cDNA is voor de hybridisatie gebruikt.

In (c) wordt de weefselspecifieke expressie van de eigen leghemoglobinegenen van de gewone rolklaver getoond. Een cDNA van het Lba-gen van de sojaboon is voor deze hybridisatie gebruikt.

^0 Voorbeeld VII

Bepaling van de transcriptie-initiatieplaats (CAP-plaats) van de Lbc^-promotor van de sojaboon in getransformeerde wortelknolletjes van de gewone rolklaver (zie fig. 5)

De positie van de "CAP-plaats" werd bepaald op het nucleotide-niveau door middel van beginstuk (primer) verlenging. Een kort oligonucleotide dat overeenkomt met de nucleotiden 15-34 in de coderende sequentie van het CAT-gen werd als beginstuk voor het enzym reverse transcriptase gebruikt . Als resultaat werd enkelstrengig DNA gevormd waarvan de lengte overeenkomt met de 20 afstand tussen het 5’-uiteinde van het beginstuk en het 5’- uiteinde van het gebruikte mRNA. Een DNA-streng van 83 nucleotiden wordt verwacht met de kennis van de transcriptie-initiatieplaats van het sojaboon-Lbc^-gen . Van links naar rechts tonen de kolommen 2,3 en 4 de gevormde DNA-strengen bij uitvoering van de 25 beginstukverlenging op polyA+-gezuiverd mRNA van respectievelijk getransformeerde wortelknolletjes van de gewone rolklaver , getransformeerde bladeren plus stengel van de gewone rolklaver en niet-getransformeerde wortelknolletjes van de gewone rolklaver.

De 85, 86, 87, 88 en 90 nucleotiden lange DNA-strengen in kolom 30 2 bleken op de juiste wijze Lbc^ promotorfunktie in de gewone rolklaver te hebben. Op de bijgevoegde DNA-sequentie zijn de nucleotiden waaraan het 7-methyl-GTP geaddèerd wordt ( "CAP-plaats") in de gewone rolklaver met een (*) aangegeven . Op het nucleotide in positie +1 wordt het 7-methyl-GTP in de sojaboon geaddeerd.

35 in de sequentie zijn de TATAA-box van de Lbc^-promotor en het overeenkomstige translatie-initiatiecodon door onderstreping aange- 8700207 i J 4 - 42 - geven.

Voorbeeld VIII

Het aantonen van de regelingtyoor'd~ê goéde ontwikkeling van hét 5 Lbc^-5'-3'-CAT-gen in getransformeerde planten van de gewone rolklaver ( L6-23) co |υ CO ·!-!

CU +J

•r-i CU

U r-t CO S

<u th <u 3 I—I co O 'r~> Ή r-t β) 0 JJ Ό O "t-1 CU CÖ

d +J rH 4J

^ lU O Γ-Ι CO

T—I U O CO

CU r-l 4J Ö T)

^1 O *H 5 -H

d d 13 cu

IC rO X <U rC

1 ·· 4J ·· ·· (U · N *· *- ,ώ CM <U CO ,Μ O UO ·!-) o TU •’-l Μ ·Η 6 ·|-Ι Sd S *rl g Sn P N P (U P r-t 3 <u 3 •H -Hg ·Η (U ·Η d ·Η n

P d Tj O P P Ό-Η rö(U

d ci d ·>-ι dcu rt+j 4JCU U p4 +J 3 +J[H 4Jtd

W&O CO o CO P W CO iH

20 CAT-aktiviteit 0 0 32,6 342,3 1255* in cmp/pg proteïne.uur

Nitrogenase-aktiviteit 0 0 0 0,5 2,7 nmol ethyleen/pg proteïne»uur 25 * Beperkte hoeveelheid substraat, feitelijke aktiviteit ongeveer 68000 cpm/pg proteïne.uur

De chlooramfenico1-acetyItrans feras e-30 en nitrogenaseaktiviteit werden gemeten op afgesneden stukken wortel met wortelknolletjes in de aangegeven ontwikkelingsstadia. De CAT-aktiviteit kan in de witte duidelijke wortelknolletjes aangetoond worden , terwijl de nitrogenase-aktiviteit pas optrad zodra de kleine rode knolletjes zich ontwikkeld hadden. De 35 laatst genoemde ontwikkeling komt overeen met de ontwikkeling die bekend is van sojabooncontroleplanten,zie Marcker et al.

ΕΜΒ0 J. 1984 , 3, 1691-95. De CAT-aktiviteit werd bepaald als in 87 ö ö 2φθ(786 112 - 43 - voorbeeld V. De nitrogenase-aktiviteit werd gemeten als acetyleenreduktie gevolgd door gaschromatografische bepaling van ethyleen.

5 Voorbeeld IX

Het aantonen van Lbc^-proteïne in gewone rolklaver die mét het sojaboon-Lbc^-gen getransformeerd is C zie fig. 6)

Proteïnen werden geextraheerd uit wortel-knolletjes van met Lbc^ getransformeerde (L8-35), met Lbc^^ *-3T-CAT ^ getransformeerde en niet-getransformeerde planten, en gescheiden door isoelektrisch focusseren bij een pH-gradient van 4 tot 5.

De kolommen 1,3, 5,.7 en 9 tonen Lbc^, Lbc2, Lbc^ en Lba-proteïnen die in sojabooncontrolewortelknolletjes gesynthetiseerd werden. Kolom 2 toont proteïnen uit wortelknolletjes van Ί5 met LbCg-S’-S’-CAT getransformeerde gewone rolklaver , terwijl de kolommen 6 en 8 proteïnen van niet-getransformeerde planten tonen. De kolommen 4 en 10 tonen sojaboon-Lbc^-proteïne dat gesynthetiseerd werd in wortelknolletjes van de gewone rolklaver (L8-35) die met het Lbc^-gen getransformeerd was.

20 De Lbcg-ptoteïneband is met een pijltje aangegeven.

Voorbeeld X

Expressie van het Lbc^-CAT-gen vereist het 5' Lbc^ promotorgebied.

De Lbc -CAT-gencons tructie draagt een 2 Kb nff 5* Lbc^-promotorgebied. Stapsgewijze verwijdering van sequenties vanaf het 5*-uiteinde van dit gebied toonfe aan, dat dit promotor-gebied nodig is voor de kenmerkende expressie van het Lbc^-CAT-gen.

De Lbc^-CAT-genconstructie werd geopend op de unieke Xbal-plaats , zie fig. 7, en met het exonuclease Bat31 gedigereerd. Een Sail bindfragment werd op de gevormde "blunt ends" geligeerd en de ingekorte Sall-fragmenten,die het Lbc^-CAT-gen dragen , werden overgebracht in L.corniculatus.

Het effekt van het verwijderen van promotor sequenties werd als 35 CAT-aktiviteit gemeten, zie fig. 8. Eindpunten van het ingekorte Eü 00 86 112 6700207 - 44 - 5’-gebied worden als de afstand vanaf de CAP-plaats in nucleotiden gegeven.

De drastisch verminderde CAT-aktiviteit die tot expressie komt met de Lbc^-promotor welke tot nucleotide 5 -230 ingekort is , en het ontbreken van aktiviteit met de promotor welke tot nucleotide -78 ingekort is , toont aan, dat het Lbc^-promotorgebied nodig is voor de voor wortelknol-letjes specifieke expressie van het Lbc^CAT-gen.

10 Voorbeeld XI

Constructie van het N23-CAT-gen ( zie fig, 9)

Het N23-gen werd geïsoleerd uit een soja-boon-DNA-bibliotheek, zoals beschreven in een voorafdruk van een artikel in Nucleic Acids Research, waarvan een kopie 15 beschikbaar is. Het N23-CAT-gen werd geconstrueerd uit het gemodificeerde Lbc^-CAT-gen op plasmide pEJ5'-3'-CAT101, zoals beschreven in aanvraagsters lopende aanvrage no. 86 02657, en een 1 Kb EcoRI , Ddel-fragment dat het N23 5'-promotorgebied bevat. De positie van de EcoRI- en Ddel-plaatsen in het N23- 20 promotorgebied is aangegeven op de hieronder volgende DNA- sequentie. De gebruikte kloneringswerkwijze wordt in fig. 9 geschetst. Het N23-CAT-gen werd volgens dezelfde werkwijze als het LbCg-CAT-gen overgebracht in planten.

25 De DNA-sequentie van het 5'-promotor gebied van het N23-gen is als volgt: 30 8700207 * ~Λ*-,: r . . * ” ' -ν.· ' * % »'<·»» - £5 - ‘ * '?

* V ν »S

. ’ ’* . β __ . .-· ; »··· * Λ-η- ’»·· , : .. ' ; : ; ; λ-' prN23 AOS'? 10 20 30 40 50 60 70

RftflTTrsfi3CTCBCCCS5SSATCGATCCTCTASAfiTfÏStj£.nTGCftSCQCftfiGCTTGSfiTCAATCfi£TTAH ' ïïcoRI Sail SO SO 100 110 120 130 140 5 TlCTATTGAGACACGATTTGAACAATTTTTACAATfiTGAGACTATTTTTGGTTTTTTATTTGATCCAAAA j 150 ISO 170 ISO 190 200 210 '?

AAATTTAAASCTTTAGftTGATGATeAATTGAANiJAATATTGTATTAATNKTGAAAAGTTNWraWNGGTTTA

220 230 240 250 2S0 270 2S0

AT GAAT GCTAT GAT AT TGA TGG TCTTGATNTATTNMCAGArtTTGAAAST ATTArtGAGAAGTGTTAAGAAA

250 300 310 320 330 340 350

AGAAGTTASCACACCAArAGAASTATTGAGTTATATTAHriAGTTTAGATTCmTCAAATGTTTACATTG

3£0 370 3S0 330 400 410 420 catatagaattttattgacaatccttataacasttgctactgttgaaagacgttcttcaaaattaaaatt 430 440 450 460 470 *30 450

IQ ACTTAfiATCATATCTAAAATCAHCAATGTrALAAGATA&ATTGAATGAGnΑ6ΤΤΑ1TTTATCTATTGAA

500 510 520 530 540 550 560 I

AGTAAASTGTTAGAATTGTTTGA TTATAhAACTCIGri i AAA rGATTTTGCAGTTAAAAAAACTAGAABAT

570 5S0 590 600 610 620 630

TAATATAAAAATTGATATTTTATATAATATATTAAGTCTCTTTAAAhTTCTTGTAAAAAAAGACATTTTT

640 650 660 670 680 690 700

AAATAATAAAATAAAGCAAGTCTTAATTTTAATGAAACATCCCTTTGTTAAACCGAATCTTCCATAATGT

J

710 720 730 740 750 760 770 AAAAAT TAATGCTTGATGGriAGTTTTTAATTTG ÏTCT ATCCAATACTCAAASGGTT G T ΑΑΑΤ ΑΤΤΤΤΤΤΤ 790 790 800 BIO 820 830 840

15 TA rCATTTA1ATGT TGTAAA FATGAATGCACTAGTAATTAGTTTAATGATAAaATATATTCTACAGh fAT

850 860 870 9S0 890 900 910 ATTTCTG i'CTCTTGGCAACTC5TGAGAATTGAATATATTATAAAGATGAAAG&TCGTΓΑΟΑΑΤΤΤΤΤΤΤΤ 920 530 940 950 960 970 930

AGAA fAAA ΓΑΤΤΤΑΤATACAATTCCTAGATTTTGTTAT AAAATTCACATATTG«ATGAüTATAAA fACAT

950 1000 1010 1020 1030 1040 1050

GASCACACfiCCfiAACTAS f CT CA AATTA AGTAAGGTGCTAATTATTAGCGGCT AG*. ITAAG Γ AACCAAGTA

Ddel

ATTAATS

8700207 .

Λ f - 46 -

Voorbeeld XII

Orgaan-specifieke expressie van het sojaboon N2-3-CAT-gen in wortel-knolletjes van L. corniculatus en Trifoliumrepens

De aktiviteit van chlooramfenicol-acetyl-transferase ( CAT) enzym werd gemeten als in voorbeeld V en wordt gegeven in Cpm/jig proteïne/uur.

Tabel a.

CAT-aktiviteit

Met N23-CAT getrans- Niet-getransformeerde 10 formeerde L.corniculatus L.comiculatus wortelknolletje 86.150 0 wortel 0 0 15

Tabel b. Met CAT-aktiviteit N23-CAT getransfor- Niet-getransformeerde meerde T.repens T.repens 20 wortelknolletje 148.000 0 wortel 0 0

Tabel (a) en (b) tonen de specifieke expressie van het N23-CAT-gen in wortelknolletjes van L.comiculatus 25 en T.repens. L.corniculatus werd geinoculeerd met Rhizobium loti, terwijl T.repens geinoculeerd werd met Rhizobium trifolii.

In verband met de uitvinding is derhalve bewezen, dat voor wortelknolletjes specifieke genen weefselspecifiek tot expressie gebracht kunnen worden na overdracht in andere 30 planten, hier Lotus corniculatus en Trifolium repens.

Bovendien is bewezen, dat de 5'-flankerende gebieden die de promotor omvatten, gecontroleerd worden door het weefselspecifieke reguleringsmechanisme , terwijl de weefselspecifieke controle van het chimaere Lbc^-gen in Lotus corniculatus op het transcriptie-35 niveau plaats had. Het overgebrachte chimaere Lbc^-gen werd derhalve slechts in wortelknolletjes op getransformeerde planten overgeschreven en niet in andere weefsels zoals wortels, stengels en bladeren.

87 00.207·- - 47 -

De expressie van het chimaere Lbc^-gen in wortelknolletjes van getransformeerde planten volgde ook het verloop van de ontwikkeling , bekend van wortelknolletjes van sojaboon . Er kon geen CAT-aktiviteit waargenomen worden in 5 wortels of kleine witte wortelknolletjes ( voorbeeld VIII).

Een geringe aktiviteit was aanwezig in de verder ontwikkelde witte duidelijke knolletjes, terwijl een grote aktiviteit gemeten kon worden in de kleine rode knolletjes en de rijpe knolletjes die zich later ontwikkelden.

10 Door de weefselspecifieke expressie en de juiste bij de ontwikkeling behorende expressie van overgebrachte voor wortelknolletjes specifieke genen , hier toegelicht aan de hand van het chimaere Lbc^-gen , kunnen als een bijzondere toepassing voor wortelknolletjes specifieke genen ook in andere planten dan vlinderbloemigen funktioneel tot expressie gebracht worden. Wanneer alle voor wortelknolletjes specifieke plantegenen die nodig zijn voor de vorming van wortelknolletjes, overgebracht worden van een vlinderbloemige naar een plantesoort die geen wortelknolletjes vormt, kan door de hierboven aangetoonde 20 juiste weefselspecifieke expressie een werkzaam , funktioneel, stikstofbindend wortelknolletje op deze plant na infektie door Rhlzobium gevormd worden. Op deze wijze kunnen deze planten groeien zonder dat gebonden stikstof verschaft moet worden.

Voor wortelknolletjes specifieke promotors, hier toegelicht 25 aan (je handvat Lbc^" en N23-promotors , moeten in het onderhavige geval gebruikt worden voor het reguleren van de expressie van de overgebrachte genen.

Volgens de bovengenoemde toepassing wordt een voor wortelknolletjes specifieke promotor gebruikt'rvoor het tot 50 expressie brengen van genen , waarvan het genprodukt of de funktie van het genprodukt de funktie van het wortelknolletje verbetert,bijvoorbeeld door het zuurstoftransport, het metabolisme, de stikstofbinding of de stikstofabsorptie te veranderen.

Volgens de bovengenoemde toepassing worden 35 wortelknolletjes gebruikt voor de synthese van biologische produkten 87 0 0 20 7 - 48 - die de plant zelf verbeteren of die later uit de plant geextraheerd kunnen worden. Een voor wortelknolletjes specifieke promotor kan gebruiktworden voor het tot expressie brengen van eengpn, waarvan het genprodukt of de verbinding die door het genprodukt 5 gevormd wordt, het (de) gewenste produkt(en) vormt (en). In verband met de uitvinding is bovendien bewezen , dat het sojaboon LbCg-leghemoglobineproteïne zelf , d.w.z. het Lbc^ genprodukt, in een hoge concentratie aanwezig is,in wortelknolletjes van de gewone rolklaver die de Lbc^ codesequentie onder controle van 10 de Lbc^promotor tot expressie brengen. Dit laatste is bewezen door het genomische Lbc^'gen van de sojaboon te kloneren in de integratievector pAR1, waarbij het genomische Lbc^-gen de coderende sequentie, de tussenliggende sequenties en de 5’- en 3’-flankerende sequenties bevat. Een 3,6 Kb BamHI-fragment Lbc^HH, 15 zie voorbeeld II , werd gekloneerd in het pARI-plasmide en overgebracht in gewone rolklaver , zoals eerder vermeld.

Het grote gehalte aan Lbc^-proteïne, zie voorbeeld IX, dat in getransformeerde wortelknolletjes van gewone rolklaver gevonden wordt,en dat overeenkomt met het gehalte 20 in wortelknolletjes van sojaboon duidt op een doelmatige trans criptie van de Lbc^- promotor en een doelmatige bewerking en translatie van Lbc^ mRNA in . gewone rolklaver.

De grote CAT-aktiviteit die in getransformeerde wortelknolletjes aanwezig is, is eveneens een gevolgyan 25 een doelmatige translatie van mRNA dat vanaf het chimaere Lbc^- gen gevormd wordt. De aanloopsequentie op het Lbc^-gen is beslissend voor de translatie-initiatie en moet het uiteindelijke rendement van de translatie bepalen. Dit rendement is van belang voor een doelmatige synthese van genprodukten in planten of 30 plantecellen. Een Lbc^ of een andere leghemoglobine aanloopsequen tie kan derhalve gebruikt worden voor het verhogen van het uiteindelijke expressieniveau van een bepaalde plantepromotor.

De constructie van een DNA-fragment dat een Lb aanloopsequentie als eerste sequentie en een willekeurige promotor als tweede 35 sequentie omvat, is een bijzondere toepassing van de uitvinding wanneer de constructie in planten overgebracht en tot expressie gebracht wordt.

87 0 0 20 7 ..

Claims (57)

1. Werkwijze voor het tot expressie brengen van genen in planten, delen van planten en plantecel-culturen, waarbij men in een cel daarvan èen recombinant-DNA-segment invoert dat zowel het tot expressie te brengen gen bevat 5 als ook een 5’-flankerend gebied dat een promotorsequentie omvat, en eventueel een 3’-flankerend gebied , en de getransformeerde cellen in een groeimedium kweekt, met het kenmerk, dat men als het recombinant-DNA-segment een DNA-fragment gebruikt dat een induceerbare plantepromotor (zoals gedefinieerd) van voor 10 wortelknolletjes specifieke genen omvat»

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men een DNA-fragment gebruikt , dat een induceerbare plantepromotor ( zoals gedefinieerd) omvat en dat identiek is aan , afgeleid is van , of omvat 5'-flankerende gebieden van 15 voor wortelknolletjes specifieke genen.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met.het kenmerk, dat men een DNA -fragment gebruikt , dat een induceerbare plantepromotor ( zoals gedefinieerd ) omvat en dat identiek is aan, afgeleid is van , of omvat 5’-flankerende gebieden van 20 voor wortelknolletjes specifieke genen , waarbij het DNA-fragment een expressie van een gen veroorzaakt , dat in wortelknolletjes in specifieke ontwikkelingsstadia en als een stap van de symbiose geïnduceerd wordt , waardoor stikstof binding plaats heeft.

4. Werkwijze volgens conclusie 1-3 voor de 25 expressie van voor wortelknolletjes specifieke genen, met het ken merk, dat men een DNA-fragment gebruikt, dat een induceerbare plantepromotor ( zoals gedefinieerd ) van voor wortelknolletjes specifieke genen omvat.

5. Werkwijze volgens conclusie 1-3 voor 30 de expressie van genen in vlinderbloemigen, delen van vlinderbloe migen en celculturen van vlinderbloemigen, met het kenmerk, dat men een DNA-fragment gebruikt, dat een induceerbare plantepromotrr 8700207 4 ( - 50 - (zoals gedefinieerd) van voor wortelknolletjes specifieke genen omvat.

6. Werkwijze volgens conclusie 1-5, met het kenmerk, dat men een DNA-fragment gebruikt, dat de induceer- ^ bare plantepromotor omvat en dat identiek is aan ,afgeleid is van, of omvat 5'-flankerende gebieden van leghemoglobinegenen.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat men een DNA-fragment gebruikt , dat de induceer-bare plantepromotor omvat en dat identiek is aan , afgeleid is 10 van, of omvat 5'-flankerende gebieden van sojaboon-leghemoglobine- genen.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat men een DNA-fragment gebruikt, dat de induceerbare plantepromotor omvat en dat identiek is aan, afgeleid is van , of omvat 5'-flankerende gebieden van het Lba-gen met de sequentie : GAGATACATT A7AA7AA7C7 CTCTAGTGTC TATTTATTAT TTTATCTGGT GATATATACC TTCTCGTATA CTGTTATTTT TTCAATCTTG TAGATTTACT n TCTTTTATTT 77A7AAAAAA GACTTTATTT TTTTAAAAAA AATAAAG7GA

20 ATTTTGAAAA CATGCTCTTT GACAA7777C TGTTTCCTTT TTCATCATTG GGTTAAATCT CATAGTGCCT C7A77CAA7A ATTTGGGCTC AATTTAATTA GTAGAGTCTA CATAAAATTT ACCTTAATAG 7AGAGAA7AG AGAGTCTTGG AAAGTTGG7T TTTCTCGAGG AAGAAAGGAA ATGTTAAAAA CTGTGATATT Γ · 777TTTTTGG ATTAATAGTT ATGTTTATAT GAAAACTGAA AATAAATAAA .CTAACCATAT TAAATTTAGA ACAACACTTC AATTATTTTT TTAATTTGA7 TAA77AAAAA ATTATTTGAT TAAATTTTTT AAAAGATCG7 7G7TTCT7C7 TCA7CA7GC7 GA77GACACC C7CCACAAGC CAAGAGAAAC ACA7AAGCT7 25 87 0 0 20 7 : - 51 - ‘ TGG7TTTC7C ACTCTCCAAG CCCTCTATAT AAACAAATAT TGGAGTGAAG TTGTTGCATA AC7TGCATCG AACAATTAAT AGAAATAACA GAAAATTAAA AAAGAAATAT G.

9. Werkwijze volgens conclusie 7, met het ken— 5 metk, dat men een DNA-fragment gebruikt, dat de induceerbare plantepromotor omvat en dat identiek is aan, afgeleid is van, of omvat 5f“flankerende gebieden van het Lbc^~gen met de sequentie: __ TTCTCTTAAT ACAATGGAGT TTTTGTTGAA CATACATACA TTTAAAAAAA 10 AATCTCTAGT GTCTATTTAC CCGGTGAGAA GCCTTCTCGT GTTTTACACA _ CTTTAATATT ATTATATCCT CAACCCCACA AAAAAGAATA CTGTTATATC TTTCCAAACC TGTAGATTTA TTTATTTATT TATTTATTTT TACAAAGGAG ' ACTTCAGAAA AGTAATTACA TAAAGATAGT GAACATCATT TTATTTATTA TAATAAACTT TAAAATCAAA CTTTTTTATA TTTTTTGTTA CCCTTTTCAT 15 TATTGGGTGA AATCTCATAG TGAAGCCATT AAATAATTTG GGCTCAAGTT TTATTAGTAA AGTCTGCATG AAATTTAACT TAACAATAGA GAGAGTTTTC GAAAGGGA'GC GAATGTTAAA AAGTGTGATA TTATATTTTA TTTCGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA CATACAAAAA AATACTTTTA AATTCAGAAT AATACTTAAA ATATTTATTT GCTTAATTGA TTAACTGAAA ATTATTTGAT 20 TAGGATTTTG AAAAGATCAT TGGCTCTTCG TCATGCCGAT TGACACCCTC CACAAGCCAA GAGAAACTTA AGTTGTAAAC TTTCTCACTC CAAGCCTTCT ATATAAACAT GTATTGGATG TGAAGTTATT GCATAACTTG CATTGAACAA TAGAAAATAA CAAAAAAAAG TAAAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG,

10. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, 25 'dat men een DNA-fragment gebruikt, dat de induceerbare plantepromotor omvat en dat identiek is aan, afgeleid is van , of omvat 5‘-flankerende gebieden van het LbC2~gen met de sequentie: TCGAGTTTTT.ACTGAACATA CATTTATTAA AAAAAACTCT CTAGTGTCCA 30 TTTATTCGGC GAGAAGCCTT CTCGTGCTTT ACACACTTTA ATATTATTAT ATCCCCACCC CCACCAAAAA AAAAAAAACT GTTATATCTT TCCAGTACAT TTATTTCTTA tttttacaaa ggaaacttca cgaaagtaat tacaaaaaag atagtgaaca tcattttttt agttaagatg aattttaaaa tcacactttt 8700207 - '52 - TTATATTTTT TTGTTACCCT TTTCATTATT GGG7GAAATC TCA7AG7GAA ACTATTAAAT AGTTTGGGCT CAAGTTTTAT TAGTAAAGTC TGCATGAAAT TTAACTTAAT AATAGAGAGA GTTTTGGAAA GGTAACGAAT GTTAGAAAGT GTGATATTAT TATAGTTTTA TTTAGATTAA TAATTATGTT TACATGAAAA 5 TTGACAATTT ATTTTTAAAA TTCAGAGTAA TACTTAAATT ACTTATTTAC TTTAAGATTT TGAAAAGATC ATTTGGCTCT TCATCATGCC GATTGACACC CTCCACAAGC CAAGAGAAAC TTAAGTTGTA ATTTTTCTAA CTCCAAGCCT TCTATATAAA CACGTATTGG ATGTGAAGTT GTTGCATAAC TTGCATTGAA CAATAGAAAT AACAACAAAG AAAATAAGTG AAAAAAGAAA TATG,

10 H· Werkwijze volgens conclusie 7, met het ken merk, dat men een DNA-fragment gebruikt, dat de induceer— bare plantepromotor omvat en dat identiek is aan , afgeleid is van, of omvat 5'—flankerende gebieden van het Lbc^~gen met de sequentie:

15 TATGAAGATT AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATC7T GTAGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGT7AAAA AAA7TACAAA ATAAAAA7AG TGAACATCGT CTAAGCA777 T7ATATAAGA TGAATTTTAA AAA7A7AATT T7777G7CTA AATCG7A7G7 ATC77G7C77 AGAGCCATTT

20 TTG77TAAAT TGGA7AAGA7 CACACTA7AA AG77C77CC7 CCGAG777GA TATAAAAAAA ATTG7TTCCC TTTTGATTAT TGGA7AAAAT C7CG7AG7GA CA77A7A77A AAAAAA77AG GGCTCAATTT T7A77AG7A7 AG777GCATA AA77T7AAC7 TAAAAATAGA GAAAATC7GG AAAAGGGAC7 GTTAAAAAGT GTGATATTAG AAAT7TG7CG GATA7ATTAA TATTTTATTT TA7A7GGAAA

25 CTAAAAAAAT A7A7A77AAA AT7T7AAA7T CAGAATAA7A C77AAA7TAT TTA7TTACTG AAAATGAGTT GA777AAGTT TTTGAAAAGA TGA7TG7CTC TTCACCA7AC CAATTGA7CA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACA7AA GT7T7AT7AG TTATTC7GAT CACTC77CAA GCCTTCTATA TAAAT^AGTA T7GGA7G7GA AG77G77GCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA

30 CAGAAAAG7A GAAAAGAAAT ATG.

12. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat men een DNA-fragment gebruikt , dat de induceer-bare plantepromotor omvat en dat identiek is aan, afgeleid is van, of omvat 5’-flankerende gebieden van het Lbc^-S’"? -35- CAT-gen met de sequentie: TA7GAAGA77 AAAAAA7ACA C7CA7ATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT GTAGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA 87 0 0 20 7 -»,33 - > * « ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTC7T AGAGCGATTT TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAG7TTGA TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA 5 CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT GTGA7ATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATT7TATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ATATATTAAA ΑΤΓΓΤΑΑΑΤ7 CAGAATAATA CTTAAATTAT TTATT7ACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC 10 TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA TTGGATGTGA AG7TGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA CAGAAAAGTA GAATTCTAAA ATG 13^ Werkwijze volgens conclusie 5, met het ken- 15 merk, dat men een DNA-fragment gebruikt, dat de induceerbare plantepromotor omvat en dat identiek is aan, afgeleid is van, of omvat 5f-flankerende gebieden van bet N23-gen met de sequentie:

10 HO 30 ’ 40 50 60 7v j5HiaXX!l-3A3CTC3CCCSG‘jGi-iTCGr:TCCTCTA&Hl:iTr.l~i'!'.CTG:CASCCCAi-i5CTTgGATCAATr:A^<TTf-t- IcoRI Sail SO 90 100 IJ, O ISO JSO 140

20 TlCTATTSrtöAC—CGATTTSrtACAATTTTTACAATATSAörtCTATTTTTGGTTTTTTATTTBATCCAhhA 150 160 170 ISO 190 HOO Hl O AAATTT AAAeCTTTAeATSATGATlSAATTeAAMWAATATTSTATTAATNNTGAHftrtSTT NNNNNGGTTTft 2HO ' £30 240 550 £60 £70 £30 ATöAAl’-CTAT SATATTGr- T&GTCTTGATK’TATTNMCABAmTTGAAAGT ATTAi-iGi-iGAAGTGTTAAGA^ii·* £50 300 310 3£0 330 340 350 AGAAoTTASCACA3ChA TAtAASTATTGASTI ATATTAAahCTTTAGhTTCT TTTCAAATÖTTTAC ΑΊΓΤ6 360 370 330 390 A 00 AIO h£0 CAT ATASahTTTTATTëMCAATCCTTAT AftCASTTSCTACTGTTSttHASMCGTTCTTCAWAATTAAAH TT 430 440 450 460 470 hSO 490

25 ACTT A A^» Γ CAT ATCT AAriA T CAnCAAT GT Γ ί ü-AAGhT AÖAT TGAATGAG T Γ AG TT AITTTAT CT ATT G AA 500 510 5£0 530 540 550 560 A& TArtl-iG ilrl i nu’r·· i i G ï 1 TG»-! f TA ΐ AHHr->i_TCl &M I HAn F&nTTTT GLHlr ΓΤ nrtHnAAAiT-TAGt-iriG:-i *t 570 5£0 590 600 610 6H0 630 TAATATAAAAATTGATATTTTATATAATATATTAAGTCTCTTTAAAATTCTTGThAAAAAA&wüATTTTT 640 650 660 670 630 690 7» ·<. AAATAA 7 AAAAT AAAGCAAi^TCTT ΑΑΤΤΤ7 AAT GahhCATCCCTTTGTT AAt -CCGAAT CTTGCAT AATGT 710 750 730 740 750 760 770 AAAAa» rAArSCTTSAT6&»AGTTTTTAATTTGrTCTATCCA»«rA'CTCfiAAeÖörTGTAAATΑΤΤΠΤΠ 8700 20 7 - 54 - « 780 790 BOO BIO . 820 B30 S*tO TA rCATTTA1ftTGTTGTAAATATGAATGCfiCTAG'TAATTAGTTTAATGAl AAAATATA7TCTACAGATAT 850 860 870 8S0 890 900 910 ATTTCTG fCTCTTGGCAACTCGTGAGAATTSAATATATTATAAAGATGAAAGGTCGTTACAATTTTTTTT 920 830 9A0 950 960 970 580 AGAA'f AAA'i ATTTATATACAATTCCTAGATTTTGTTATAAAATTCACATATTG i ATGAGTAl AAA f ACAT 990 1000 1010 1020 1030 10AO 1050 GA3CACACAÜCAAACT AGTCTCAAATT AAGT AAGSTGCT AATT ATT AGLGGCTAGt ;7 AAGT AACCAAGTA Ddel

5 ATTAAlG

14. Werkwijze volgens één van de conclusies 1—13, niet tiet kenmerk, dat het 3 -flankerende gebied 10 van de tot expressie te brengen genen een 3’-flankerend gebied van voor wortelknolletjes specifieke genen van elke willekeurige oorsprong is .

15. Werkwijze volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat het 3*-flankerende gebied afkomstig is van leghemoglobine- •j5 genen.

16. Werkwijze volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat het 3*-flankerende gebied afkomstig is van sojaboon-leghemoglobine-genen.

17. Werkwijze volgens conclusie 16, met 20 hat kemaerk» dat het 3’-flankerende gebied afkomstig is van het Lba, Lbc^, Lbc2 of Lbc^gen met respectievelijk de volgende sequenties: 87 0 0 20 7 - '55 - J * S μ <·> ·*

3 N é< *-»*-·»· ·ü ·· ·* ** ·* H u « 19 *· ► · £ : : : : : c a 2 2 ^ u u u ^ < α k ü S S C S ï s S S 2 S S 5 - £» 2 2 ^ « ►* « - af U ► ► 5 « 4 « *- < ^ ». ΰ I- «««»·**’ 5 α « o «* « u >· f *- S u « * * II if If O « μ. U « O * - 5 5 »·> *· u SC »3 5u RS SC ft μ· #« N*· ·► ^ !*«·«« « 49 « »- α Z « « . ►* « B S 3 »» « 49 - μ. «i « 9- U Z ». 9· '· 19 »- %9 • « O · . 9* * ü • 5' *· a · « 5 t • 9» ^ Ö ► * ► μ 9 « 49 « S S S S s u & 2 S S 4. fr- « « « »- « U « a : : s c s _Q 5 Z 6 2 2 r i- ·- .·- * * 3 5.6 5 8 y Ü U < ► μ 49 ► « »· 87 9 0 20 7 -56- < 6»· αι» «l « at· 4 ki 04« NI- «4 4 4 ΙΛ 4 k* V» -» ·« Ψ* «4 k» k» k» O a « « U Η Ι Ο 0 4 4 k- U k» U t· υ κ u 4 k* <5 >» U I· « M ΰ ϋ « « k- 4 k- 4 υ « E· « 4. k- k» k- 4 k» 4 O « U « k» 4 4 4 4 k· U « O k- «« 4 O 4 4 k· k· « « k» k» k» k· k- <5 4 k» X • «I k- 15 k· • «· — Cl U • k» O k- O

4 M ^ 4 4 4 4 k> O

0. O O OU k· k· «· k- s μ k» O i »- 5 4 •I — *4 4 4 4 4. k- U k> 4 k» k» tl k* k· k» k> k 4 « k 13 4 4 k· ^ 4 O k» k· H k· 4 O O 13 k> k 4 k k 4. k 4 4 fc· k» 4 4 4 0 4 k> 4 O 4 «*44

4. K t- 4 k· k» k» >5- k- k. k. k> ' 4 k» ·« k· 4 13 k» o Λ k- k- 4 U O k· k» ^ . k- O 4 k- --' O k» O 4

4. O k· 4. k» k- 87 0 0 20 7 O HO >· e O* < O O 43 -57- < ^ < rw «* ΛΙ < < *- U H < < H 19 »- < U < *· υ k < o < ·- η* ta h ►· u t— < u ►· *- u o u -χί < < κ ^ H O ►· O < »- *- * u < u ►- o < < v * C9 < < * < < U * >— *— < ►- < < < K *·» Η- K O O < ►- H» O ►“ O >- O u o u r* «* po ►- < t~ AJ <* f\| < o < *< o «4 CJ «4 ►- < u U >· H < < < o ►- < ►- ►- o K- 4 K C? ►- < O O e < *- J3 " { ►- <9 *- —1 »- O »-<·< 4 < < < . < ►» *- «< U 4 < <

4 H

4 H 4 ►- O H- •4 O < 870 0 20 7 -« j- « K» r u O Ü h *· » Λ _ 4 0 < Ο 4 (V _ co _ 40 υο 58 3 3

2 C < Ο «4 « ». ►* ο »- ». (3 Ο *“ < 4 -4 < Ν 4 ΰ 3 2.8 »- ·- . < U U « Η Ο Ο *“ « -4 Ο < ►»4 Η y 4 Η »- ο u ο υ ο < ^ Ο ΙΛ ►- -* ο σ* < ° 4 -* ^ «4 ^ « ο 4 4 «4 4 Ο • *- ►- 4 *· 4 4 *4 ►- *- >- 4 Ο ο ►- ο ►* |Μ U *- <4 -4 4 »~ •4 Ο 4 Ο >- >- υ 4 4 · ►- U 4 h~ Η- Η Η cfi η ►· 4 ϋ 4 4 D <- *« 8700207 —' 5 5 ►· 4 * * - 59 -

18. Werkwijze volgens conclusie 1 voor het bereiden van een polypeptide , waarbij men in een cel van een plant» een deel van een plant of een plantecelcultuur een recombinant-plasmide invoert, met het kenmerk, dat men als het recombinant-plasmide een plasmide gebruikt dat een induceerbare plantepromotor ( zoals gedefinieerd ) van voor wortelknolletjes specifieke genen omvat.

19. DNA-fragment dat een induceerbare plantepromotor ( zoals gedefinieerd ) omvat voor gebruik bij het uitvoeren van de werkwijze volgens conclusie 1-18, met het kenmerk, dat het identiek is aan , afgeleid is van, of omvat een 5'-flankerend gebied van voor wortelknolletjes specifieke genen van elke willekeurige oorsprong.

20. DNA-fragment volgens conclusie 19, ^ met het kenmerk, (it het identiek is aan , afgeleid is van, of omvat een 5’-flankerend gebied van plante-leghemoglobinegenen.

21. DNA-fragment volgens conclusie 20, met het kenmerk, dat het identiek is aan , afgeleid is van of omvat een 5’-flankerend gebied van sojaboon-leghemoglobine-genen. 20 8700207 - 60 - r Χ *

22. DNA-fragment volgens conclusie 21, met het kenmerk, dat het identiek is aan, afgeleid is van, of omvat een 5'- flankerend gebied van het Lba-gen met de sequentie: ' _ *

5 GAGA7ACA7T ATAATAATCT CTCTAGTGTC TATTTATTAT 777A7C7GG7 GATATATACC TTCTCGTATA CTGTTATTTT TTCAATCTTG 7AGA777ACT TCTTTTATTT TTATAAAAAA GACTTTATTT TTTTAAAAAA AATAAAGTGA ATTTTGAAAA CATGCTCTTT GACAATTTTC TGTTTCCTTT 77CA7CA77G ; . GGTTAAATCT CATAGTGGCT CTATTCAATA ATT7GGGC7C AATTTAAT7A GTAGAGTC7A CATAAAATTT ACCTTAATAG TAGAGAATAG AGAGTCTTGG AAAGTTGGTT TTTCTCGAGG AAGAAAGGAA ATGTTAAAAA CTGTGATATT TTTTTTTTGG ATTAATAGTT ATGTTTATAT GAAAACTGAA AATAAATAAA 1U CTAACCATAT TAAATTTAGA ACAACACTTC AATTATTTTT TTAATT7GAT - . TAATTAAAAA ATTATTTGAT TAAATTTTTT AAAAGATCGT TG7TTCTTC7 TCA7CA7GC7 GA77GACACC C7CCACAAGC CAAGAGAAAC ACATAAGC7T TGG7777C7C AC7C7CCAAG CCC7C7A7AT AAACAAA7A7 7GGAG7GAAG TTG77GCA7A ACTTGCATCG AACAATTAAT AGAAATAACA GAAAA77AAA AAAGAAA7AT G,

23. DNA-fragment volgens conclusie 21, met het kenmerk, het identiek is aan, afgeleid is van , of omvat een 5'-flankerend gebied van het Lbc^-gen met de sequentie: 870 0 20 7 .*· TTCTCTTAAT ACAATGGAGT TTTTGTTGAA CATACATACA TTTAAAAAAA AATCTCTAGT GTCTATTTAC CCGGTGAGAA GCCTTCTCGT GT777ACACA CTTTAATATT ATTATATCCT CAACCCCACA AAAAAGAATA CTGTTATATC TTTCCAAACC TGTAGATTTA TTTATTTATT TATTTATTTT TACAAAGGAG 5 ACTTCAGAAA AGTAATTACA TAAAGATAGT GAACATCATT 77A777A77A TAATAAACTT TAAAATCAAA CTTTTTTATA TTTTTTGTTA CCCTTTTCAT TATTGGGTGA AATCTCATAG TGAAGCCATT AAATAATTTG GGCTCAAGT7 TTATTAG7AA AG7CTGCATG AAAT77AACT 7AACAA7AGA GAGAG7T77C GAAAGGGAGC GAATGTTAAA AAGTGTGATA 77A7A7777A 7TTCGA7TAA 10 TAATTATGTT TACA7GAAAA CATACAAAAA AA7ACT7T7A AA77CAGAA7 AATACTTAAA ATATT7ATT7 GCTTAATTGA TTAACTGAAA AT7ATT7GA7 TAGGAT7TTG AAAAGATCA7 TGGCTCTTCG 7CA7GCCGA7 7GACACCC7C CACAAGCCAA GAGAAACT7A AG7TG7AAAC T7TC7CAC7C CAAGCC7TC7 ATATAAACAT GTAT7GGA7G 7GAAG7TA77 GCATAAC77G CATTGAACAA 15 7AGAAAA7AA CAAAAAAAAG 7AAAAAAG7A GAAAAGAAA7 ATG,

24. DNA-fragment volgens conclusie 2t, met het kenmerk, dat het identiek is aan, afgeleid is van , of omvat een 5'-flankerend gebied van het Lbc2~gen met de sequentie:

20 TCGAGTTTTT ACTGAACATA CA777A7TAA .AAAAAAC7C7 C7AG7GTCCA TTTA77CGGC GAGAAGCCTT CTCGTGC77T ACACAC777A ATAT7ATTA7 ATCCCCACCC CCACCAAAAA AAAAAAAACT G77A7A7C77 7CCAG7ACAT TTAT7TCT7A TTTTTACAAA GGAAACTTCA CGAAAGTAAT TACAAAAAAG ATAGTGAACA TCAT7TT77T AG77AAGA7G AA777TAAAA TCACAC777T 25 TTATATT7TT TTGTTACCCT TTTCAT7ATT GGG7GAAATC 7CA7AG7GAA . ACTATTAAAT AGTTTGGGCT CAAGTTTTAT TAGTAAAG7C 7GCATGAAA7 TTAACT7AAT AATAGAGAGA GT77TGGAAA GGTAACGAA7 G7TAGAAAG7 GTGATATTAT.TATAGTTTTA TT7AGA7TAA 7AA77A7G77 7ACA7GAAAA TTGACAAT7T ATTTTTAAAA TTCAGAGTAA TAC77AAAT7 AC77A777AC 30 TTTAAGATT-T TGAAAAGATC AT7TGGCTCT TCATCATGCC GA7TGACACC C7CCACAAGC CAAGAGAAAC 7TAAG77GTA AT7777C7AA CTCCAAGCC7 TCTA7A7AAA CACGTATTGG ATGTGAAGTT G77GCA7AAC 77GCA7TGAA CAATAGAAAT AACAACAAAG AAAATAAGTG AAAAAAGAAA 7ATG, 25^ DNA-fragment volgens conclusie 21, met 22. het kenmerk, dat het identiek is aan, afgeleid is van of omvat een 5*-flankerend gebied van het Lbc^-gen met de sequentie: TATGAAGATT AAAAAATACA C7CA7A7A7A 7GCCA7AAGA ACCAACAAAA GTAC7ATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GC7ACA7AAT 77CCAA7C77 40 GTAGATT7A7 TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAG77AAAA AAA7TACAAA 870020 7 •ή - 62 - ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA 5 CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ATATATTAAA ΑΤΓΤΤΑΑΑΤΤ CAGAATAATA CTTAAATTAT TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGA7TG7CTC 10 TTCACCATAC CAATTGATCA CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACA7AA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAAATAAGTA TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA CAGAAAAGTA GAAAAGAAAT ATG.

26. DNA-fragment volgens conclusie 21, met 15 ijet kenmerk, dat het identiek is aan, afgeleid is van , of omvat 5'-flankerende gebieden van Lbc^~5,-3'-CAT-gen met de sequentie: TATGAAGA^T AAAAAATACA CTCATATATA TGCCATAAGA ACCAACAAAA 20 GTACTATTTA AGAAAAGAAA AAAAAAACCT GCTACATAAT TTCCAATCTT GTAGATTTAT TTCTTTTATT TTTATAAAGG AGAGTTAAAA AAATTACAAA ATAAAAATAG TGAACATCGT CTAAGCATTT TTATATAAGA TGAATTTTAA AAATATAATT TTTTTGTCTA AATCGTATGT ATCTTGTCTT AGAGCCATTT TTGTTTAAAT TGGATAAGAT CACACTATAA AGTTCTTCCT CCGAGTTTGA 25 TATAAAAAAA ATTGTTTCCC TTTTGATTAT TGGATAAAAT CTCGTAGTGA CATTATATTA AAAAAATTAG GGCTCAATTT TTATTAGTAT AGTTTGCATA AATTTTAACT TAAAAATAGA GAAAATCTGG AAAAGGGACT GTTAAAAAGT GTGATATTAG AAATTTGTCG GATATATTAA TATTTTATTT TATATGGAAA CTAAAAAAAT ATATATTAAA ATTTTAAATT CAGAATAATA CTTAAATTAT 30 TTATTTACTG AAAATGAGTT GATTTAAGTT TTTGAAAAGA TGATTGTCTC TTCACCATAC CAATTGATCA 'CCCTCCTCCA ACAAGCCAAG AGAGACATAA GTTTTATTAG TTATTCTGAT CACTCTTCAA GCCTTCTATA TAASTAAGTA TTGGATGTGA AGTTGTTGCA TAACTTGCAT TGAACAATTA ATAGAAATAA CAGAAAAGTA GAATTCTAAA ATG

27. DNA-fragment volgens eonclusie 19 , met 35 het kenmerk, dat bet identiek is aan, afgeleid is van, of omvat 5'-flankerende gebieden van bet N23-gen met de sequentie: 870 0 20 7 r - 63 - Λ t- r % A *> 4 ΙΟ ao 30 40 SO £0 . 70 R&ftTTOSAGCTCSCCCGGGGATCGATCCTCTA&HAJTraUninTGCABCCCrtAGCTTGGATeiAATCAATTAf-; IcoRI Sail ! 1=0 90 1O0 -110 120 130 140 f TTCTATTBAGACACGATTT&AACAATTTTT AGAAT ATGAGACT ATTTTTGSTTTTTTATTTGATCCAhAA [ t 150 160 170 ISO ISO SuO 210 ! AAATTTAAAGCTTTAGATGATGATGAATTGAANïIAATATTGTATThbTNNTGAAAASTTKNNNNGSTTTh I aao 230 240 SSO 260 270 230 \ ATBAA76CT AT GAT A Γ TGA F&GTCTTGaTNT ATTNNCAGAATTGAAAGT ATT AA&AGaaG FG TTAAGAAh.....; 230 300 310 320 330 340 350 :

5 AGAAGTTA&CACAGCAA T AGAAGT ATTSAGTTATATTAAhhCTTTAGATTCT TTTCAAATG 7TTACATTG 360 370 330 330 400 410 420 CATATAG^hTTTTATTGACAATCCTTATAACASTTBCTACTGTTGAhhGACGTTCTTCAAAATTAAAATT 430 440 450 460 470 4SO 490 ACTTAA« TCATATCTAArtA ΓCAalAAT GT ΓAuAAGATAGATTGAATBA3 T ΓAir ΓΤATT77ATCT ATTGAA 500 510 520 530 540 550 560 AG ΓΑΑΑ6 ΓΒΓΤΑΒΑΑΤ i G ί 1TGA f T AT AhhhLvT l»1 Gb i AAbTGATTTTGlAGTT AmAAhOACTAGhAG.oT 570 530 590 600 610 620 630 TAATATAAAAATTGATATTTTATATaATAIATTAAGTCTCTTTAAAATTCTTGTAAAAAAiiSALATTΓΤΤ 640 650 660 670 630 690 700

10 AAATAATAAAATAAAGGAAi. TCTTAATTTTAATGAAACATCCCTTTGTTAAaCCGAATCTTCCATAATGT 710 720 730 740 750 760 770 AAAAAYTAATGCTTGAÏ &l»*AGTTTTT AATTTGTTCT ATCCAATACTCAAA3GG TTGTaAATΑΤΤΤΤΤΤΤ 730 790 300 810 S20 330· 840 TATCAT ΓΤΑIATG i TG ϊ mAA Γ A i BAATGCALTAlr FAbTTi-ïGTTTAATGA"! AahhTATA7TC7AGAi.ru ί r.T 850 660 370 8S0 SSO 900 910 ATTTCTG i*CTCTTG6CAACTCGTGASAATTSAATATATTATAftAGATeAAAö6TÜÊTTACAmTTTTTTTT 920 930 940 950 960 970 990 AGfiA 1 AAA ί ATTTATATAUAAÏ"TCCTAGATTTT GTTATAAaATTCAOATA.TTS i AT GAisTATAMA TACAT 990 1000 1010 1080 1030 1040 1050

15 SftSCACACACCAAACTAeFCFCAAATTAAG7 AAGG fGC7 AATTATTfiG<_GGC- TAG1 -FAA!3 ΐ AACCAAbTA Ddel ATI AAI t’ 8700207 η ..... •1 - 64 -

28. Plasmide dat gebruikt kan worden bij het uitvoeren van de werkwijze volgens conclusie 1-18, met het kenmerk, dat het een DNA-fragment volgens één van de conclusies 19-27 omvat.

29. Plasmide volgens conclusie 28, met het kenmerk, dat het pAR29 is.

30. Plasmide volgens conclusie 28, met het kenmerk, dat het pAR30 is-r

31. Plasmide volgens conclusie 28, met het 10 kenmerk, dat het pAR.1.1 is.

32. Plasmide volgens conclusie 28, met het kenmerk,dat het N23-CAT is.

33. Transformant.Agrobacterium rhizogenes 15834- stam die gebruikt kan worden bij het uitvoeren 15 van de werkwijze volgens één van de conclusies 1-18 , met het kenmerk, dat de bacteriestam getransformeerd is door een plasmide volgens één van de voorgaande conclusies 28-32.

34. Transformant Agrobacterium rhizogenes 15834-stam die gebruikt kan worden bij het uitvoeren van de 20 werkwijze volgens één van de conclusies 1-18 , met het kenmerk, dat de bacteriestam door pAR29 getransformeerd is en AR1127 genoemd wordt.

35. Transformant Agrobacterium rhizogenes 15834-stam die gebruikt kan worden bij het uitvoeren van 25 de werkwijze volgens één van de conclusies 1-18, met het kenmerk, dat de bacteriestam door pAR30 getransformeerd is en AR.1134 genoemd wordt.

36. Transformant Agrobacterium rhizogenes 15834-stam die gebruikt kan worden bij het uitvoeren van de 30 werkwijze volgens één van de conclusies 1-18, met het kenmerk, dat de bacteriestam door pAR11 getransformeerd is en AR1000 genoemd wordt.

37. Transformant Agrobacterium rhizogenes 15834-stam die gebruikt kan worden bij het uitvoeren van de 35 werkwijze volgens één van de conclusies 1-18, met het kenmerk, 8700207 - 65 - dat de bacteriestam door N23-CAT getransformeerd is en AR204-N23-CAT genoemd wordt. -o-o-o-o-o- y j y u d. y / B. v. d. I £ j __^ Verbetering van errata in de beschrijving behorende bij de octrooiaanvrage No. 87 00207, Ned, voorgesteld door Aktieselskabet De Danske Sukkerfabrikker, d.d. 16 maart 1987 blz. 10 regel 27: " 52-69" vervangen door "52-59". blz. 37 regel 19: " Alul" vervangen door "Alu 11" Schema 1 vervangen door bijgevoegd schema 1. Hierop is de juiste positie van de CAP-additieplaats aangegeven ( 2 plaatsen naar rechts opgeschoven). 8700207 ·