DK173186B1 - Gærpromotor, vektor indeholdende en sådan promotor, gær transformeret med en sådan vektor og fremgangsmåde til fremstilling - Google Patents

Description

i i DK 173186 B1

Den foreliggende opfindelse angår rekombinant DNA teknologi. Den angår specielt en hidtil ukendt gærpromotor, en vektor indeholdende en sådan promotor, gær transformeret med en sådan vektor og fremgangsmåde til 5 fremstilling af et peptid eller protein ved hjælp af en sådan gær.

Rekombinant DNA teknologi gør det muligt at udtrykke heterologe genprodukter i Saccharomyces cerevisiae. Dette 10 opnås ved at konstruere genfusioner mellem passende ikke-kodende regulatoriske DNA-sekvenser og den DNA-sekvens, der indkoder det strukturelle protein, der skal udtrykkes. I denne henseende er de 5'- og 3’- ikke-kodende regioner af phosphoglyceratkinasegenet (PGK) af S.

15 cerevisiae blevet anvendt til at konstruere ekspressionsvektorer, der er i stand til at syntetisere i handelen vigtige polypeptider i gær (Tuite et al., 1982, Kingsman & Kingsman, 1982, Mellor et al., 1983). Skønt disse vektorer er i stand til at dirigere syntesen af be-20 tydelige mængder heterologe polypeptider i gær, er de imidlertid underlagt samme fysiologiske faktorer, som påvirker ekspressionen af det native gærprotein.

Når således f.eks. celler dyrkes i et medium suppleret 25 med en fermenterbar carbonkilde, såsom glucose, er PGK-promotor-dirigeret ekspression 20 til 30 gange højere end den ekspression, der iagttages, når celler dyrkes i et medium indeholdende en ikke-fermenterbar carbonkilde (Tuite et al., 1982). Denne regulering af genekspression 30 medieres med mængden af DNA-transkription (Holland &

Holland, 1978) og kan tilskrives egenskaberne af den 5’- : ikke-kodende region af PGK-genet. Denne 5' ikke-kodende i region kan deles i funktionelle domæner, som har lignende egenskaber som dem, der iagttages i andre 5' ikke-kodende 35 regioner i gærgener. Især er en DNA-sekvens blevet identificeret mellem nucleotider -324 og -445, som har : i 2 DK 173186 B1 evnen til at aktivere DNA-transkription, når den findes over en 5' ikke-kodende region (Kingsman & Kingsman, 1984). Denne DNA-sekvens, der refereres til som PGK upstream aktiveringssekvensen (UAS) er væsentlig for den 5 transkriptionelle aktivering af PGK-genet (Kingsman & Kingsman, 1984).

En analog situation eksisterer for aktiveringen af andre gærgener. For eksempel aktiveres GAL1 og GAL10 af S. ce-10 revisiae af en UAS, som giver galactoseregulering af gen-transkription (Guarente et al., 1982, Johnston & Davis, 1984) . Denne UAS kaldes GAL10 UAS. GAL10 UAS kan også lokaliseres over andre gærgen 5’ ikke-kodende regioner, hvor den giver galactoseregulering af DNA transkription 15 (Guarente et al., 1982).

Den PGK 5' ikke-kodende region betragtes almindeligvis som værende en yderst stærk gærpromotor, der er i stand til at mediere høj genekspression under optimale 20 fysiologiske betingelser, dvs. når celler dyrkes i nærværelse af en fermenterbar carbonkilde. Skønt PGK-eks-pression kan reguleres ved et passende valg af carbonkilde, er ekspression ikke genstand for absolut kontrol, da gentranskription foregår i betydelig grad i nærværelse 25 af ikke-fermenterbare substrater. Følgelig kan PGK-promotoren ikke anvendes til effektiv regulering af heterolog genekspression i gær.

Endvidere er PGK-promotoren ikke passende til anvendelse 30 i forbindelse med europæisk patentansøgning nr.

863030 39.1, der blev offentliggjort under nr. 0201239.

Denne ansøgning angår produktionen af ethanol og et heterologt protein eller peptid ved fermentering af et vandigt kulhydratholdigt medium med en gær, såsom 35 bryggerigær, som er blevet genetisk modificeret til at være i stand til at udtrykke et heterologt protein eller » 3 DK 173186 B1 peptid under betingelser, så at gæren formerer sig, uden at der foregår ekspression af proteinet eller peptidet, udvinding af den således dannede ethanol, iværksættelse eller induktion af ekspression af proteinet eller 5 peptidet med gæren og opnåelse af proteinet eller peptidet derfra. Galactoseregulering af ekspression af det heterologe gen er særlig nyttig her, da det medium, i hvilket gæren dyrkes, bryggeriurt, normalt ikke har en tilstrækkelig mængde galactose til at bevirke eller 10 inducere den transkriptionale aktivering og således eks pression eller udtrykkelse af galactose-regulerede gener. Endvidere udviser gener, som normalt reguleres af galactose, en høj grad af inducerbar kontrol. Når således f.eks. celler enten resuspenderes og/eller dyrkes i et 15 medium suppleret med galactose, er den galactose-regu lerede transkription ca. 1000 gange højere end den, der iagttages i fravær af galactose (Hopper et al., 1978, St.

John & Davis, 1979). Dette høje induktionsniveau er i modsætning til, hvad der er beskrevet tidligere for PGK-20 promotor dirigeret ekspression, som kun inducerer 20 til 30 gange. Mens Imidlertid galactose-reguleret genekspression muliggør en høj grad af inducerbar genregulering, resulterer dette ikke nødvendigvis i et tilsvarende højt niveau af genekspression under fuldt in-25 ducerede betingelser.

Der tilvejebringes nu en hybrid gærpromotor omfattende komponenter af den 5’ ikke-kodende region af PGK-genet og regulatoriske komponenter fra GAL10 UAS. Dette har den 30 fordel, at man opnår galactoseregulering af gentranskrip-tion på en modificeret 5' ikke-kodende region af det iboende effektivt udtrykte PGK gærgen. Dette resulterer i dannelsen af en hybridpromotor, som giver høj transkrip-tionsaktivitet i nærværelse af galactose, dvs. under 35 fuldt inducerede betingelser, men ringe grad af (næppe detekterbar) aktivitet i fravær af galactose. Den hybride 4 DK 173186 B1 promotor har således den transkriptionale aktivitet for PGK-genet og de regulatoriske egenskaber for det ga-lactoseregulerede gen.

5 Den hidtil ukendte hybridpromotor omfatter GAL10 kondenseret til en modificeret 5' ikke-kodende regionssekvens af PGK-genet og indeholder ikke det endogene PGK UAS, der findes i den naturlige PGK-promotor, mellem nucleotidkoordinaterne -423 og -470. Det foretrækkes, at 10 GAL10 UAS tilvejebringes ved udsletningsstedet for PGK UAS. GAL10 UAS kan være til stede i enhver orientering.

Den hybride promotor kan fremstilles ved at indsætte GAL10 UAS i et egnet sted i den 5' ikke-kodende region 15 for PGK-genet. Det 144 basepar store Rsa I-Alu I DNA fragment, der kan afledes fra GAL1-GAL10 promotoren, kan indsættes.

Gærekspressionvektorer, typisk plasmider, indeholder hy-20 bridpromotoren til kontrol af ekspressionen af heterologe eller homologe proteiner eller peptider. En lang række heterologe proteiner eller peptider kan udtrykkes. Som eksempel kan nævnes enzymer, såsom β-lactamase, β-glucanase og β-galactosidase. Andre nyttige heterologe 25 proteiner og peptider omfatter materialer af human oprindelse og/eller nyttige i terapien, såsom human serumalbumin og immunoglobuliner.

En ekspressionsvektor kan konstrueres ved i en vektor in-30 deholdende den hybride promotor at indsætte et gen kodende for det protein eller det peptid, som det er ønsket at udtrykke. Genet kan indsættes ved et restriktionssted, som tilvejebringes efter (downstream for) den translationale startkodon kontrolleret af den hybride 35 promotor. Genet må indsættes i den korrekte translationale læseramme. Et fusionsprodukt indeholdende * 5 DK 173186 B1 proteinet eller peptidet af interesse vil derpå blive udtrykt. Alternativt kan genet selv tilvejebringes med en translational startkodon efterfulgt direkte af en DNA-sekvens indkodende proteinet eller peptidet af interesse.

5 Et sådant gen kan indsættes i en vektor indeholdende den hybride promotor, men som ikke indeholder en translational startkodon. I en sådan vektor tilvejebringes et restriktionssted således, at genet i stedet kan indsættes i korrekt læseramme, og så at dets 10 translationale startkodon er korrekt anbragt i forhold til den hybride promotor. Ekspressionsvektoreren tilvejebringes med en transkriptionsterminatorsekvens.

Dette kan være PGK-terminatorsekvensen.

15 Ekspressionsvektorerne kan anvendes til at dirigere ga-lactosereguleret høj ekspression af gener i en transformant gær. Vektorerne kan anvendes til at transformere la-boratoriestammer af Saccharomyces cerevisiae. De kan anvendes til at transformere industrielle stammer af 20 Saccharomyces cerevisiae, såsom overfermenteringsølgær (S. cerevisiae) og underfermenteringsølgær (S. uvarum eller S. carlsbergensis). Ekspressionsvektorerne er særligt nyttige til at transformere bryggerigær og kan anvendes til at tilvejebringe galactoseregulering af pro-25 cessen til fremstilling af heterologe proteiner og pep tider ifølge europæisk ansøgning nr. 86303039 som beskrevet i det foregående.

Et peptid eller protein kan opnås fra den transformerede 30 gær ved at dyrke og/eller placere gæren i et galactose-holdigt medium til igangsætning af ekspression på højt niveau af peptidet eller proteinet. Således kan et peptid eller protein fremstilles ved dyrkning og/eller placering i et galactoseholdigt medium af en gær, som er blevet 35 transformeret med en gærekspressionsvektor, i hvilken ekspressionen af peptidet eller proteinet er kontrolleret 6 DK 173186 B1 af en hybridpromotor ifølge opfindelsen, og opnåelse af peptidet eller proteinet fremstillet på denne måde.

Det efterfølgende eksempel forklarer opfindelsen nærmere.

5 På den medfølgende tegning viser: fig. 1 lokaliseringen af GAL10 UAS indsætninger i den 5' ikke-kodende region af PGK-genet, 10 fig. 2 viser skematisk den afvigende GAL1-GAL10 promotorregion af S. cerevisiae, fig. 3 viser konstruktionen af plasmider pDBl og pDB2, 15 fig. 4 viser Bal 31 udsletningsserierne af pDB4. Den understregede region repræsenterer DNA-sekvensen af den Bglll syntetiske oligonucleotidlinker, og fig. 5 viser den 5' ikke-kodende region af pDB4 og de 20 hybride PGK-GAL UAS promotorkonstruktioner.

fig. 6 viser dannelsen af plasmider pKV59 og pKV60, fig. 7 viser DNA-sekvensen ved 5'-samlingen af HSA-genet 25 og PGK-galhybridpromotoren i plasmider pKV59 og pKV60, fig. 8 viser en autoradiograf af Northern blottet totalgær RNA isoleret fra dBY745 (pKV59 og pKV60). RNA blev prøvet med HSA og ribosomal (R) specifikke DNA-prober, 30 hvor sidstnævnte er en international belastningsstandard.

RNA blev fremstillet ud fra galactosedyrket gær (GAL) og galactose + glucosedyrket gær (G/G)

Tal indikerer den relative position i den 5' ikke-kodende 35 region for PGK-genet.

7 DK 173186 B1

Regionen forbundet af pile repræsenterer GAL-UAS DNA-sekvensen (Johnston & Davis, 1984).

Den understregede region indikerer DNA-sekvensen svarende 5 . til den syntetiske Bglll oligonucleotidlinker. DNA-sekvensen understreget med en stiplet linie indikerer nucleotider afledt fra den syntetiske BamHI oligonucleotidlinker i pDB4.

10 Eksempel

Materialer og metoder 15 Stammer, medier og transformationer

De anvendte stammer var E. coli AKEC 28 (C600, thrC, leuB6, thyA, trpCH7, hsdR*, hsdM*) og S. cerevisiae DBY745 (a, ura3-52, adel-100, leu2-3, leu2-112) .

20 E. coli kulturer blev dyrket på LB-medium (Miller, 1972) suppleret efter behov med antibiotiket ampicillin (Sigma Chemical Co., Ltd., Poole, Dorset, England) i en slutkon-centration på 50 pg/ml. Gær blev dyrket ved 30 eC på et 25 syntetisk komplet medium (SC) (0,67 % efter vægt/volumen gaernitrogenbase uden aminosyrer) suppleret med car-bonkilde og aminosyrer efter behov.

E. coli blev transformeret under anvendelse af standard-30 metoder (Maniatis, et al., 1982). Gær blev transformeret som beskrevet af Hinnen et al., (1978).

Rekombinant DNA-teknik

35 Standardprocedurer blev anvendt for restriktionsendonu-clease-nedbrydning og -konstruktion af plasmid DNA

8 DK 173186 B1 (Maniatis et al., 1982). Alle enzymer blev opnået fra Bethesda Research Laboratories (Paisley, Scotland) og blev anvendt efter fabrikantens anbefalinger. Exonuclease Bal31 blev anvendt til in vitro udsletning af DNA-se-5 kvenser som beskrevet af Dobson et al., (1982). Udslet-ningsendepunkter blev bestemt ved DNA-sekvensering (Sanger et al., 1977, Maxam & Gilbert, 1980). Bglll syntetiske oligonucleotidlinkere blev opnået fra Collaborative Research Inc. (Lexington, Massachusetts, 10 USA) .

DNA- og RNA-isolerlng

Plasmid DNA blev isoleret fra E. coli ved metoderne af 15 Chinault og Carbon (1979) og Birnboim og Doly (1979) . Metoderne af Holmes & Quigley (1981) blev anvendt til hurtig analyse af plasmid DNA. Total gær DNA blev fremstillet efter Cryer et al., (1975). Total RNA blev fremstillet ud fra gærceller dyrket til en massefylde på 4 x 20 106 celler/ml som beskrevet tidligere (Dobson et al., 1982) .

Hybridisering og DNA-prober 25 Northern og Southern blots blev foretaget under anvendelse af standardprocedurer (Manaitis et al., 1982). Hybridisering af 3ZPdTTP (Amersham International Ltd., Amersham) nick-translaterede (Rigby et al., 1977) DNA-prober blev foretaget efter Thomas (1980). PGK (Mellor et 30 al., 1983), Ty (Dobson et al., 1984) og rDNA (Petes et al., 1978) DNA-prober blev mærket til en specifik aktivitet på 4 til 6 x 107 cpm/pg DNA efter rensning fra agarosegeler (Tabak fi> Flavell, 1978).

35 9 DK 173186 B1

Bestemmelse af plasmidkopiantal og RNA-analyse

Total gær DNA blev nedbrudt med restriktionsendonuclease EcoRI og separeret ved elektrophorese i 1 % efter 5 vægt/volumen agarosegel. DNA-fragmenter blev overført til nitrocellulose og hybridiseret til radioaktivt mærket PGK og rDNA specifikke DNA-prober for at skønne plasmidkopiantallet. Regioner med DNA-homologi blev fremhævet ved autoradiografi. Ved at sammenligne den 10 relative intensitet af de rDNA- og PGK-specifikke regioner for homologi var det muligt at bedømme antallet af kopier af den PGK-specifikke DNA-sekvens. Dette blev lettet ved kendskabet til, at der er ca. 100 til 140 gentagelser af den genome rDNA pr. haploid genom (Petes 15 et al., 1978). Denne metode til plasmidkopiantals-bestemmelse er generelt anvendelig forudsat, at der anvendes en passende plasmid DNA-probe i prøven.

Total RNA blev separeret ved elektrophorese i 1 % efter 20 vægt/volumen agarose indeholdende 6 % efter vægt/volumen formaldehyd. RNA blev overført til nitrocellulosefiltre som beskrevet tidligere og hybridiseret med nick-trans-laterede DNA-prober. En transposon Ty mRNA art med 5700 nucleotider eller en ribosomal DNA probe med 1800 nucleo-25 tider blev anvendt som en indre ladningskontrol i hy-bridiseringer for at muliggøre en direkte sammenligning mellem forskellige transformanter.

Resultater 30

Analyse af den 5' ikke-kodende region af PGK-genet

En række udsletningsvinduer er blevet konstrueret i den 5’ ikke-kodende region i gær PGK-genet (fig. 1). Der blev . 35 ved ligering opnået en kombination af DNA-fragmenter med udsletninger i den 5' ikke-kodende region af PGK-genet 10 DK 173186 B1 udsletninger i den 5' ikke-kodende region af PGK-genet fra såvel 5'- som 3?-retningen. 5'- til 3'- ud-sletningerne blev opnået i et derivat af plasmid pMA27 (Mellor et al., 1983), hvori Clal stedet i stilling -800 5 i den PGK 5’ ikke-kodende region først var blevet kon verteret til et unikt Xhol restriktionssted under anvendelse af en syntetisk oligonucleotidlinker. Dette pMA27 derivat blev derpå kløvet med Xhol og nedbrudt med Bal31 exonuclease. Plasmider blev recirkuleret ved lige-10 ring i nærværelse af BamHI syntetiske oligonucleotidlin-kere og transformeret ind i E. coli. Plasmid DNA blev isoleret, og stillingerne for 3’-udsletningsendepunkterne blev karakteriseret ved DNA-sekvensering. 3'- til 5'-udsletninger blev opnået i plasmid pMA22a (Dobson et al., 15 1982), efterfulgt af spaltning ved et unikt BamHI sted og

Bal31 exonuclease nedbrydning. Plasmider blev re-cirkulariseret ved ligering i nærværelse af BamHI syntetiske oligonucleotidlinkere og transformeret ind i E. coli. Plasmid DNA blev isoleret og stillingerne for 5'-20 udsletningsendepunkterne blev tilsvarende karakteriseret ved DNA-sekvensering. Plasmider pDB3, pDB4 og pDB5 (fig.

1) blev derpå konstrueret ved ligering af BamHI-PstI fragmenter indeholdende passende kombinationer af 5'- og 1 3'-udsletningsderivaterne. Således opnåedes DNA-sekvenser 25 efter 3' endepunkterne ud fra 5'-udsletningsderivaterne, hvorimod DNA-sekvenser over 5'-endepunkterne blev opnået ud fra 3'-udsletningsderivater.

Plasmid pDB3 og pDB5 har udsletninger eller deleteringer, 30 som er lokaliseret 5' og 3' for PGK UAS, hvorimod pDB4 har en udsletning mellem koordinaterne -423 og -470, som omfatter selve PGK UAS (se fig. 1 og 5) . Hver af de nævnte plasmider blev konstrueret, så at et unikt BamHI restriktionssted begrænsede udsletningsendepunkterne.

35 Dette letter efterfølgende DNA indsætninger.

DK 173186 B1 11 j Gær transformeret med plasmider pMA27, pDB3 og pDB5 producerer sammenlignelige høje mængder PGK mRNA, når de dyrkes på SC suppleret med forskellige carbonkilder, hvorimod gær husende plasmid pDB4 producerer mængder af 5 PGK mRNA svarende til de mængder, der produceres af utrans formeret gær. Dette indikerer, at PGK UAS er væsentligt for PGK mRNA syntese.

Konstruktion af et galactose inducibelt PGK baseret gen 10

Opbygningen af den GAL1-GAL10 divergente promotor for gær er vist skematisk i fig. 2. Det funktionelle område for UAS er blevet lokaliseret {West et al., 1984), og dets position er indikeret med de flankerende restrik-15 tionssteder (fig. 2) . Et 365 basepar stort DNA-fragment findes også på plasmid pLGSD5 (Guarente et al., 1982), som bærer GAL10 UAS. Det 144 basepar store Rsal-Alul DNA fragment fra GAL1-GAL10 promotorregionen på pLGSD5 blev renset fra en polyacrylamidgel og blunt-end ligeret ind i 20 det unikke Smal sted af pUC8 (fig. 3). Derefter blev det unikke EcoRI sted af pDBl (fig. 3) konverteret til et Bglll sted ved indsætning af en syntetisk Bglll oli-gonucleotidlinker. Det 144 basepar store GAL10 UAS kunne således isoleres på et unikt Bglll-BamHII DNA fragment 25 båret af plasmid pDB2 (fig. 3). Dette fragment blev derefter klonet ind i det unikke BamHI sted i hver af de tre PGK udsletningsvektorer pDB3, pDB4 og pDB5; GAL10 UAS indsatse blev opnået i hver orientering til afledning af plasmider betegnet pKV41-pKV46 (fig. 1).

30

Plasmider pKV43, pKV44, pMA27 og pDB4 blev transformeret ind i stamme DBY745, og mængderne af PGK specifik mRNA blev bestemt under eksponentiel vækst på medier indeholdende enten glucose eller galactose som carbonkilde. Re-35 sultaterne indikerede i tilfælde af pKV43 og pKV44, at PGK specifik mRNA kunne induceres eller indføres i store 12 DK 173186 B1 mængder i nærværelse af galactose, hvorimod vækst på glucose resulterede i kromosomale mængder af PGK specifik mRNA. Transformanter husende plasmid pMA27 udviste store mængder PGK specifik mRNA, når de blev dyrket på glucose-5 og galactose-medium; men pDB4 udviste ingen aktivitet på nogen carbonkilde. Disse resultater viser klart, at erstatningen af PGK UAS med GAL 10 UAS i hver orientering giver høj koncentration af galactose reguleret DNA-transkription på PGK-promotoren. Transformanter husende 10 plasmider pDB3 og pDB5 opretholdt høje koncentrationer af PGK specifik mRNA på såvel glucose- som galactosemedium, sammenlignelig med den fra plasmid pMA27. I tilfælde af plasmider pKV41, pKV42, pKV45 og pKV46 holdes høje koncentrationer af PGK specifik mRNA på begge car-15 bonkilder. Disse resultater viser, at det er ikke tilstrækkeligt at indsætte GAL UAS på et vilkårligt sted 5' af transkriptionsinitieringssekvensen af PGK for at give galactoseregulering efter transkription, men det er snarere nødvendigt både at indsætte GAL UAS og at fjerne PGK 20 UAS. I tilfælde af pKV43 og pKV44 er PGK UAS blevet slettet og erstattet med GAL UAS.

Konstruktion af en galactosereguleret PGK expressions-vektor 25

Plasmid pDB4 blev nedbrudt ved et unikt Bglll sted lokaliseret i 3’-regionen af det PGK strukturelle gen, og det lineære molekyle blev nedbrudt med Bal31 exonuclease (fig. 4). DNA-fragmenter blev ifyldt og re-ligeret i nær-30 værelse af overskud af Bglll syntetiske oligonucleotid-linkere; plasmider dannet på denne måde blev screenet ved gelelektrophorese og DNA-sekvensering til bestemmelse af det nøjagtige endepunkt for udsletningen. En række udsletningsderivater blev opnået forskellige i nucleotid-35 sekvens umiddelbart 5' fra Bglll linkeren. Udsletnings- 13 DK 173186 B1 derivater med endepunkter ved stillinger -8 (pKV47), +4 (pKV51), +5 (pKV52) og +6 (pKV53) blev opnået (fig. 4).

Udsletningsderivaterne blev yderligere modificeret ved 5 tilknytningen af 3'-transkriptionsterminatorsekvensen fra PGK-genet. Dette blev foretaget ved at nedbryde hvert plasmid med restriktionsendonucleaserne Bglll og PstI og ligering af det således dannede store fragment med det lille BamHI-PstI fragment indeholdende 3T-tran-10 skriptionsterminatorsekvensen for PGK-genet afledt fra pMA91 (Mellor et al., 1983). Således dannede plasmider blev derpå yderligere modificeret ved indsætning ved det unikke BamHI sted i den modificerede 5' ikke-kodende region af PGK-genet af Bglll-BamHI fragmentet indeholdende 15 GAL10-UAS fra pDB2 (fig. 3) . Orienteringen af indsætning af GAL10-UAS blev derpå bestemt ved restriktionsenzymnedbrydningsanalyse til fremstilling af plasmider som indikeret i fig. 5.

20 På denne måde blev der opnået en række galactoseregule-rede PGK expressionsvektorer, i hvilke PGK-UAS var blevet erstattet med GAL10-UAS. DNA-sekvensen omgivende stilling 1 i den PGK kodende region for hver af disse vektorer er vist på fig. 4. Hvorimod sekvensen for den modificerede 25 PGK 5' ikke-kodende region, hvori GAL10-UAS er blevet indsat, er vist på fig. 5.

Expressionsvektorer pKV49 og pKV50 (fig. 4 og 5) kan anvendes til at mediere expressionen af heterologe og homo-30 loge gener, hvori 5' translationsinitieringssignalet (ATG) er suppleret med genet af interesse. Under omstæn- i

digheder, ved hvilke genet, der skal udtrykkes, ikke har I

et 5’-translationalt initieringssignal (ATG), kan anven- i des translationale fusionsvektorer. I denne henseende 35 letter udsletninger i PGK-kodesekvensen endende ved stillingerne + 4, +5 og +6 (fig. 4) fusion af det gen, der 14 DK 173186 B1 skal udtrykkes i hver af de tre mulige læserammer. Disse udslettelsesderivater er blevet anvendt ved konstruktionen af expressionsvektorer pKV61-66. Plasmider pKV61 og pKV62, pKV63 og pKV64, pKV65 og pKV66, er 5 analoge med henholdsvis pKV49 og pKV50 i henseende til orienteringen af GAL10 UAS (fig. 5).

Expressionen af human serumalbumin i gær 10 En cDNA klon indkodende det humane serum proteinalburain (HSA) blev isoleret på et 1,84 kb stort BamHI DNA-fragment fra plasmid pEK113 (beskrevet i europæisk patentansøgning nr. 0 201 239A i navnet Delta

Biotechnology Ltd.) og subklonet ind i det unikke Bglll 15 sted i expressionsvektorerne pKV49 og pKV50 (fig. 4 og 5) for at danne plasmider pKV59 og henholdsvis pKV60 (fig.

6) . Denne HSA indkodende DNA-sekvens er tidligere blevet manipuleret til at indeholde et 5'-translationalt initieringssignal umiddelbart nabostillet til den første 20 kodon af den modne HSA kodesekvens (europæisk patentbeskrivelse nr. 0 201 239A) . DNA-sekvensen ved 5'-samlingen af HSA-genet med pKV49 og pKV50 er vist på fig. 7.

Plasmider pKV59 og pKV60 blev transformeret i laborato-25 riegærstammen DBY745 ved standardprocedurer. Transforman-ter blev derefter dyrket på SC suppleret med adenin og uracil plus enten glucose (1 % efter vægt/volumen) og galactose (1 % efter vægt/volumen) eller galactose (1 % efter vægt/volumen), repræsenterende henholdsvis inhibe-30 rende og inducerende carbonkilder. Kulturer blev høstet med en celle-massefylde på 4 til 6 x 106 pr. ml og anvendt til fremstilling af extrakter af total DNA, total RNA og protein. Resultaterne vist på fig. 8 viser klart, at galactose inducerer syntesen af HSA specifik mRNA, 35 hvorimod i tilstedeværelse af glucose kan der detekteres en ringe mængde eller intet HSA specifik mRNA. Celleex- 15 DK 173186 B1 trakter blev også prøvet for HSA protein efter SDSrpoly-acrylamidgelelektrophorese og Western blotting (EP nr.

0 201 239A). Resultaterne af disse geler var i overensstemmelse med mRNA analyse beskrevet i det 5 foregående, da der kunne detekteres væsentlige mængder HSA i gær dyrket i nærværelse af galactose, hvorimod gær dyrket i nærværelse af glucose gav meget mindre mængder, men dog en detekterbar mængde HSA. Når proteinbånd på SDSrpolyacrylamidgeler blev gjort synlige efter farvning 10 med coomassie-blåt, udgjorde HSA-proteinet en væsentlig del af det totale cellulære protein i de galactoseinducerede kulturer, hvorimod der ikke kunne synliggøres nogen HSA-bånd i kulturer dyrket i nærværelse af glucose.

15 j

Claims (8)

1. Hybrid gærpromotor omfattende, som en upstream 5 aktiveringssekvens, upstream aktiveringssekvensen af GAL10 genet af Saccharomyces cerevisiae og, som en downstream del, en downstream del af en Saccharomyces cerevisiae promotor effektiv til at fremme transkription af en kodende sekvens anbragt downstream derfor, k e n -lOdetegnet ved, at Saccharomyces cerevisiae promotoren er promotoren for PGK genet, og hybridpromotoren indeholder ikke den endogene PGK upstream aktiveringssekvens lokaliseret i den naturlige PGK promotor mellem nucleotidkoordinaterne -423 og -470. 15

2. Hybrid gærpromotor ifølge krav 1, kendetegnet ved, at upstream GAL10 aktiveringssekvensen er tilvejebragt på det sted, hvorfra PGK upstream aktiveringssekvensen er blevet udslettet. 20

3. Gærexpressionsvektor, kendetegnet ved, at den indeholder en hybridpromotor ifølge et vilkårligt af de foregående krav. 25 4. Gærexpressionsvektor ifølge krav 3, kendeteg net ved, at der deri er tilvejebragt et restriktionssted efter den translationale startkodon kontrolleret af hybridgærpromotoren for at gøre det muligt at indsætte et gen, som ønskes udtrykt i den korrekte translationale 30 læseramme. 1 Gærexpressionsvektor ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den DK 173186 B1 20 (a) ikke har nogen translational startkodon ved det translationale startsted kontrolleret af hybridgærpromotoren, men 5 (b) et restriktionssted, hvori et gen, som ønskes ud trykt, og som har en translational startkodon, kan indsættes, således at den translationale startkodon af genet er i den korrekte position i forhold til hybridgærpromotoren. 10

6. Gærexpressionsvektor ifølge krav 3, kendetegne t ved, at der under kontrol af hybridgærpromotoren tilvejebringes et homologt gen deri, hvilket gen ønskes udtrykt. 15

7. Gærexpressionsvektor ifølge krav 3, kendetegnet ved, at der under kontrol af hybridgærpromotoren tilvejebringes et heterologt gen deri, som ønskes udtrykt. 20

8. Gærexpressionsvektor ifølge krav 7, kendetegne t ved, at det heterologe gen indkoder humant serumalbumin. 25 9. Gær transformeret med en vektor ifølge et vilkårligt af kravene 3 til 8.

10. Gær ifølge krav 9, kendetegnet ved, at det er en transformeret ølgær. 30

11. Fremgangsmåde til fremstilling af et peptid eller et protein, kendetegnet ved, at man opretholder en gær i et galactoseholdigt medium, hvilken gær er blevet transformeret med en gærexpressionsvektor, hvori ex- 35 pressionen af peptidet eller proteinet kontrolleres af en 21 DK 173186 B1 hybridpromotor ifølge krav 1 eller 2, og opnåelse af det således producerede peptid eller protein.