KR100227405B1

KR100227405B1 - 효모 응집 유전자 및 이를 함유하는 효모

Info

Publication number: KR100227405B1
Application number: KR1019940703820A
Authority: KR
Inventors: 준지 와따리; 요시히로 다까따; 마사히로 오가와; 펜틸라 메르자; 오넬라 마이자-리나; 케라넨 시르카
Original assignee: .; 오이 파니모라보라토리오-브리게리라보라토리엄 에이비; 에다모토 켄조; 삿뽀로 비루 가부시키가이샤
Priority date: 1993-02-26
Filing date: 1994-02-24
Publication date: 1999-12-01
Also published as: AU6115394A; FI944999A0; RU94046052A; CN1107640A; EP0640140A1; US5585271A; BR9404246A; KR950701388A; AU679208B2; JPH07509372A; RU2159807C2; WO1994019475A2; WO1994019475A3; TW396208B; FI944999A; CN1070533C; ZA941324B; CA2134354A1

Abstract

응집 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코팅하는 효모는 효모의 4.7 ± 0.2kb 의 응집 유전자.

Description

[발명의 명칭]

효모 응집 유전자 및 이를 함유하는 효모

[발명의 상세한 설명]

[기술분야]

본 발명은 응집성 효모의 응집 유전자, 및 이를 함유하는 효모에 관한 것이다.

[배경기술]

발효공업에 있어서, 효모 응집은 공업적으로 중요한 현상이며, 응집성 효모의 응집 원인을 밝히기 위한 많은 연구가 수행되면서 응집성 효모의 이용이 연구되어오고 있다. 효모 응집은 많은 수의 유전자에 의해 조절되는 것으로 공지되어 있으며, 비교적 잘 연구되어 있는 그의 예는 FL01 이라고 불리우는 유전자이고, 이는 효모 염색체 I 의 라이트 암 상에서 맵핑된다.

사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 응집 유전자 FL01 의 구조에 대하여는, 완전히 비공지였으나, 1989 년에 최초로 본 발명자들에 의해 클로닝되었으며, 그의 제한효소 분해 지도도 결정되었다(Watari 등, Agricultural and Biological Chemistry. Vol. 53, No. 3, p.901-903, 1989). (그러나, 이의 염기 서열은 아직 공지되어 있지 않다).

본 발명자들은 응집 유전자 FL01을 여러 공업적인 효모에 도입함으로써 비-응집성 공업 효모를 실제이용을 위한 응집성 효모로 전환시킬 수 있다는 것을 보고하였다 (Watari 등, Agricultural and Biological Chemistry. Vol. 55, No. 6, p. 1547-1552, 1991); 그러나, 모든 공업 효모에 강하고 안정된 응집성을 항상 부여할 수 있는 것은 아니다.

본 발명자들은 그후에 FL01 유전자에 대하여 연구를 계속한 결과, 본 발명자들이 FL01 유전자인 것으로 보고 (Watari 등, Agricultural and Biological Chemistry, Vol. 53, No. 3, p.901-903, 1989) 한 유전자가 효모 사카로마이세스 세레비지아 균주 ABXL - 1D 의 염색체 I 에 존재하는 본래대로의 FL01 유전자가 아니라, 본래대로의 FL01 유전자를 함유하는 플라스미드를 에스케리키아 콜리 (Escherichia coli) 균주 K12 에 유지하는 동안 그의 일부가 결실된 유전자 (하기에, 이 유전자를 FL01S 라 칭한다) 라는 것을 발견하였다.

[발명의 공개]

본 발명의 목적은 본래대로의 FL01 유전자 (하기에, 이 유전자를 FL01L 이라 칭한다) 의 구조를 확립하기 위한 것이며, 여러 공업 효모에 보다 강하고 보다 안정한 응집성을 부여하기 위한 기술을 제공하는 것이다.

이제, 본 발명자들은 FL01 유전자에 관한 다양한 연구의 결과, 본래대로의 FL01 유전자, 또는 FL01L 유전자를 분리하는데 성공하였으며, 이 유전자의 완전한 염기 서열을 결정하였고, 또한 FL01L 유전자를 사용하여 FL01S 유전자를 사용하는 것에 비교하여 보다 강하고 보다 안정한 응집성을 갖는 실제 이용을 위한 각종 효모를 번식시키는데 성공하여 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 응집 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 효모의 4.7 ± 0.2kb 의 응집유전자에 관한 것이며, 특히 효모 사카로마이세스 세레비지아로부터 유래하고 제1도에 나타낸 제한 효소분해 지도에 의해 정의되는 상기 응집 유전자에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 서열 번호1로 나타낸 아미노산 서열을 실질적으로 코딩하는 상기 응집 유전자에 관한 것이다.

본 발명은 또한 응집 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 효모의 2.6 ± 0.2kb 의 응집 유전자에 관한 것이며, 특히 효모 사카로마이세스 세레비지아로부터 유래하고 제2도에 나타낸 제한 효소 분해 지도로 정의되는 응집 유전자 및 보다 구체적으로는, 서열 번호2로 나타낸 아미노산 서열을 실질적으로 코딩하는 응집 유전자에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 유전자중 하나를 함유하며 응집성을 갖는 효모에 관한 것이다.

본 발명 명세서에 언급된 “응집 유전자”는 효모의 응집을 조절하는 유전자를 의미한다.

[발명의 효과]

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 응집 유전자는 비 응집성 효모 사카로마이세스 세레비지아에 응집성을 부여할 수 있다. 여기에서, 발효공업에서 응집성 효모를 사용하는 취지는 1) 세포가 발효의 완결후에 발효물로부터 빠르게 분리되어, 공정이 단순화될 수 있어서 원심분리기등을 사용하여 발효물로부터 효모를 분리하는 다른 공정이 필요하지 않다; 2) 발효물의 투명도가 높아서, 배양물의 최종 여과시의 부담이 경감되어, 생산성이 증가된다; 3) 고정화된 세포를 사용하는 경우와 마찬가지로 연속 배양이 가능하며, 반응기 또는 기타 특수 장치가 필요하지 않다는 것이다. 또한, 응집성 효모의 번식이 과거에는 천연 또는 인공 돌연변이를 위한 유도방법, 크로스-브로딩 방법, 세포 융합 방법 등을 사용하여 시도되었으나, 이들 방법은 번식시키고자하는 원래 균주의 유전적 성질의 변경, 또한 통상적으로 원래 균주의 바람직한 특성의 파괴가 반드시 수반된다는 것이 종종 보고되었다. 그러나, 본 발명에 따르면, 성장시키고자하는 균주의 응집성을 단순히 본 발명에 따른 유전자를 그안으로 도입함으로써 개선할 수 있으며, 원래 균주의 기타 바람직한 특성에 손상을 입히지 않는다는 것도 중요한 잇점이다.

[도면의 간단한 설명]

제1도

본 발명에 따른 FL01L 유전자의 제한 효소 분해 지도.

도면에서, 각각의 제한 효소의 분해 부위는 AccI에 대하여는 Ac, BgIII에 대하여는 Bg, EcoRV 에 대하여는 RV, KpnI 에 대하여는 K 및 PvuII 에 대하여는 Pv 으로 나타낸다.

제2도

본 발명에 따른 FL01S 유전자의 제한 효소 분해 지도.

제3도

효모의 직접 선택을 위한, 응집 유전자 FL01S 및 FL01L을 함유하는 플라스미드 YRpGLF14S 및 YRpGLF8L 의 제조를 위한 플라스미드 제조 흐름도.

제4도

YCpHF19S (20.00kb).

제5도

YIpHF19S (15.80kb).

제6도

FL01S 유전자를 함유하는 YCpHF19S 의 5.8kb BamHI - XhoI 단편.

제7도

YCpHF19L (22.10kb).

제8도

FL01L 유전자를 함유하는 YCpHF19L 의 7.9kb BamHI - XhoI 단편.

제9도

YRpGL10 (9.70kb).

제10도

YRpGLF14S (15.50kb).

제11도

YRpGLF8L (17.66kb).

제12도

효모 염색체상으로 통합하기 위한, 응집 유전자 FL01S 및 FL01L을 함유하는 플라스미드 pBR - ADH1- FL01S 및 pBR - ADH1 - FL01L 의 제조를 위한 흐름도.

제13도

pAAH5 (12.60kb).

제14도

BamHI - 소화 pAAH5 (12.60kb).

제15도

pBR 322 (4.30kb).

제16도

pBR322 - dH (4.30kb).

제17도

pBR - dEP1 (2.50kb).

제18도

PCR 에의해 제조된 FL01S 의 오픈 리딩 프레임.

제19도

pBR - dEP1 - FL01S (5.10kb).

제20도

FL01S 의 오픈 리딩 프레임.

제21도

pBR - dH - ADH1 (6.20kb).

제22도

pBR - ADH1 - FL01S (8.80kb).

제23도

YCpHF19L (22.10kb).

제24도

EcoRV + BgIII - 절단된 YCpHF19L.

제25도

pBR - dEP1 - FL01L (7.20kb).

제26도

FL01L 의 오픈 리딩 프레임.

제27도

pBR - ADH1 - FL01L (10.80kb).

[본 발명을 수행하기 위한 최선의 방법]

본 발명의 보다 상세한 설명은 하기와 같다.

[응집 유전자]

효모 사카로마이세스 세레비지아에 응집성을 부여하는 본 발명에 따른 유전자는 응집 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 효모의 4.7 ± 0.2kb 의 유전자 및 상기 응집 유전자로부터 유도된 2.6 ± 0.2kb 의 응집 유전자를 포함하며, 이들 유전자 각각은 상기 효모 사카로마이세스 세레비지아의 응집 유전자 FL01 로부터 유도된 FL01L 유전자 (또한 FL01L 으로 약칭) 및 FL01S 유전자 (또한 FL01S 으로 약칭) 에 각각 대응한다. FL01S 는 FL01L 의 염기서열의 일부가 결실된 것이다. 또한, 하기 하는 바와 같이 FL01 유전자는 오픈 리딩 프레임의 길이가 다를지라도 FL01L 유전자의 인공 또는 천연 유도체이며 응집 활성을 갖는 유전자를 또한 포함한다. 여기에서, FL01L 유전자는 효모 사카로마이세스 세레비지아의 염색체 I 의 본래 그대로의 FL01 유전자이며, FL01S 는 오픈 리딩 프레임의 일부가 인-프레임 결실된 FL01L 유전자이다. 여기에서, 특징적으로 FL01L 는 도입되는 숙주 효모에 비교적 강한 응집성을 부여하는 반면에, FL01S 는 FL01L 에 비하여 보다 약한 응집성을 숙주 효모에 부여한다.

본 발명에 따른 응집 유전자는 효모 사카로마이세스 세레비지아에의 구성성분으로서의 유전자를 함유하는 플라스미드형태, 및 숙주의 게놈내 삽입물 형태로 효모 사카로마이세스 세레비지아에 내에 존재한다. 또한, 효모에서 응집 유전자의 안정한 발현을 위해서, 본 발명에 따른 응집 유전자는 적절한 프로모터 및 터미네이터의 조절하에 위치될 수 있으며, 플라스미드 또는 게놈내로의 삽입물 형태로 존재할 수 있다. 사용되는 프로모터 및 터미네이터는 공지된 것들, 예컨데 알콜 데히드로게나제 유전자 (ADH1), 포스포글리세레이트 키나제 유전자 (PGK), 등과 적절하게 조합될 수 있다.

[유전자에의해 코딩되는 폴리펩티드]

본 발명에 따른 FL01L 유전자는 이것이 코딩하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 의해 특정된다. 이 폴리펩티드는 응집 활성을 가지며 그의 아미노산 서열이 실질적으로 서열 번호1에 의해 나타내어지는 것이다. 여기에서, “아미노산 서열이 실질적으로 서열 번호1에 의해 나타내어지는”이란 표현은 폴리펩티드가 응집 활성을 갖는 한 아미노산의 일부가 결실되거나 치환될 수 있거나, 또는 아미노산의 일부가 거기에 첨가될 수 있다는 것을 의미한다.

응집 활성을 나타내는 본 발명에 따른 전형적인 폴리펩티드는 서열 번호1에 나타낸 아미노선 서열을 가지며, 1,537 아미노산으로 구성되고, 그의 아미노산 서열이 과거에는 공지되어 있지 않았던 것이다.

본 발명에 따르면, “아미노산 사열이 실질적으로 서열 번호1에 의해 나타내어지는”이란 표현은 폴리펩티드가 응집 활성을 갖는 한 아미노산의 일부가 결실되거나 치환될 수 있거나, 또는 아미노산의 일부가 거기에 첨가될 수 있다는 것을 의미한다는 것은 상기 언급한 바와 같으며; 아미노산 서열에 관련하여 상기와 같이 변경된 폴리펩티드의 예는 서열 번호1로 나타낸 아미노산 서열 (FL01L 서열) 의 329 번째 내지 1,003 번째 아미노산이 결실된 것 (FL01S 서열, 서열 번호2 참조) 인데, 이 펩티드는 약간은 약하긴 하지만 응집 활성을 갖는다. 발효중의 효모의 응집성이 너무 강하면, 현탁된 효모 세포의 수가 감소되며 이는 일반적으로 발효속도를 느리게하는 경향이 있으므로, 각각의 발효 시스템에 적당한 강도의 응집성을 부여하는 방식으로 효모를 번식시키는 것이 바람직하다. FL01L 유전자를 도입하면 응집성이 너무 강해질 수 있으므로, FL01S 유전자를 도입하는 것이 때때로 바람직하다. 이러한 의미에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 길이가 기본적으로는 서열 번호1에 나타낸 것이나, 수 개의 아미노산이 결실, 치환, 첨가등이 된 것은 여러 효모에 원하는 강도의 응집 활성을 구축하는 데 매우 중요하다. 즉, 상기와 같이 변경된 폴리펩티드는 응집 활성을 갖는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 범위에 속하는 것이다.

[응집 유전자의 염기 서열]

FL01L 유전자의 DNA 사슬은 서열 리스트의 서열 번호1로 나타낸 염기 서열, 또는 그의 변성 이성체를 가지며, 서열 번호1로서 나타낸 아미노산 서열에 상응하는 염기서열, 또는 그의 변성 이성체를 갖는 것이다. 여기에서, “변성 이성체 (degenerate isomer)”는 변성 코돈만이 상이한 DNA 사슬을 의미하는 것으로, 아직 동일한 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 것들을 의미한다.

서열 번호1로 나타낸 DNA 사슬의 염기 서열은 디데옥시 방법을 사용하여 사카로마이세스 세레비지아 균주 ABXL-1D (Yeast Genetic Stock Center, University of California, USA)로부터 수득한 FL01 유전자에 대해 측정한다.

[응집 유전자의 DNA 사슬의 수집]

현재의 응집활성을 갖는 FL01 유전자의 생성물 (FL01 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열) 에 관한 정보를 전혀 입수할 수가 없으므로, 아미노산 서열을 기초로 하여 화학적으로 합성된 적절한 DNA 프로브를 사용하는 통상적으로 사용되는 하이브리다이제이션법을 이용하여 FL01 유전자를 클로닝하는 것은 불가능하다. 그 결과, 본 발명자들은 효모/ 이. 콜리 셔틀 벡터 플라스미드를 사용하여 사카로마이세스 세레비지아 균주 ABXL - 1D 의 전체 DNA 의 유전자 라이브러리를 구축하였으며, 비응집성 효모를 이것으로 형질전환하여 응집성 클론을 수득하였고, 플라스미드를 형질전환된 균주로부터 회수하였다(상세한 내용은 하기 실시예 참조).

[응집 유전자의 효모내로의 도입]

상기한 방법에 의해 수득된 본 발명에 따른 응집 유전자의 DNA 사슬을 발효 공업에서 사용되는 효모, 예를 들면, 맥주 효모, 와인 효모, 위스키 효모, 일본 사케 효모, 소주 효모, 알콜 제조 효모 등 (모두 사카로마이세스 세레비지아 임) 에 생물공학 방법에 따라서 도입함에 의해, 비응집성 균주는 응집성 균주로 전환시킬 수 있고, 또한 응집성 균주라면 그들의 응집성을 강화할 수 있다.

[효모]

본 발명에 따라 형질전환된 효모는 The Yeasts : A Taxonomic Study, 3rd Ed. (Yarrow, D., ed. N. J. W. Kreger - Van Rij. Blesevier Science Publishers B. V., Amsterdam, 1984, p. 379) 에 기재된 속 사카로마이세스 세레비지아에 속하는 효모, 또는 그의 유사물 또는 그의 돌연변이이다; 그러나, 본 발명의 목적을 위해서는, 속 사카로마이세스 세레비지아에 속하는 여러 공업 효모, 예를 들면, 맥주 효모, 와인 효모, 위스키 효모, 일본 사케 효모, 소주 효모, 알콜 제조 효모등이 바람직하다.

이의 특정예는 하면 맥주 효모 : W164 (Munich Institute of Technology, 독일), W204 (Munich Institute of Technology, 독일), SMA - S (Berlin Institute of Technology), H. H. (Berlin Institute of Technology), 상면 맥주 효모 : obg. 160 (Berlin Institute of Technology, 독일), 와인 효모 : IAM 4175 (Tokyo University), 위스키 효모 : AHU 3200 (Hokkaido University), 일본 사케 효모 : 협회6호 (Japan Brewing Association), 소주 효모 : IFO 0282 (Fermentation Research Institute Foundation), 알콜 제조 효모 : IFO 0216 (Property of Fermentation Research Institute) 등을 포함한다. 이들 공업적인 효모는 장시간에 걸쳐 발효 공업에 적절한 형태, 즉 발효원을 효율적으로 발효할 수 있는 형태로 선택되고 순수하게 배양되어 왔는데, 이들은 향이 좋은 알콜을 생산할 수 있으며, 그의 유전적 성질은 안정하다.

[형질전환]

형질전환체를 제조하기 위한 방법은 통상적으로는 분자생물학 및 유전공학 분야에서 사용되는 것들일 수 있으며, 이들은 통상적인 기술을 사용하여 수행되는 한 본 발명에 따른 하기 언급하는 방법이외의 방법을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 응집 유전자를 효모내에서 발현하기 위해서는, 먼저 유전자를 효모내에 안정하게 존재하는 플라스미드 벡터내로 삽입하는 것이 필요하다. 여기에 사용되는 플라스미드 벡터는 공지의 것들, YRp, YEp, YCp, YIp 등중 임의의 것일 수 있다. 이들 플라스미드 벡터는 문헌에 의해 공지된 것들일 뿐만 아니라, 제조하기 용이한 것들일 수 있다.

본 발명에 따른 목적하는 형질전환체를 선택하기 위해 사용되는 마커는, 공업적인 효모의 경우에는, 아미노산 또는 핵산을 필요로 하는 특별하게 적절한 고유의 유전자 마커가 없기 때문에, G418 등과 같은 약품에 대하여 내성을 갖는 유전자일 수 있다. 그러나, 본 응집 유전자가 우성 유전자로서 발현된다는 사실을 이용하면, 응집 유전자 자체로 표시된 형질전환체를 수득할 수 있다.

본 발명에 따른 응집 유전자의 DNA 사슬의 플라스미드내로의 도입 및 이 플라스미드의 효모내로의 도입은 용이하게 수행될 수 있으나, 한편, 이런 유형의 플라스미드는 통상적으로는 세포내에 안정하게 유지될 수 없고 종종 형질전환된 세포로부터 빠질 수 있다.

본 발명에 따른 응집 유전자의 DNA 사슬을 효모내에 보다 안정하게 유지하기 위해서는 효모의 게놈내로 삽입할 수 있다. 특히, 식품 공업 분야에 사용되는 효모의 경우에는 최종 재조합체내에 존재하는 이. 콜리로부터의 비 - 효모 DNA 단편 (플라스미드가 이. 콜리내에서 성장한다면 플라스미드 벡터내에 함유된다)을 갖지않는 효모 유전자만을 갖는 효모를 개선하는 것이 보다 바람직하다. 여기에서, 본 발명자들은 Penttila 등의 공형질전환 방법 및 유전자 치환 방법 (Current Genetics, Vol. 12, p. 413 - 420, 1987)을 사용하여 효모 유전자만을 도입하는 것을 선택하였으며, 이에 의해 단지 효모 유전자만이 게놈 DNA 로 도입된다. 또한, 형질전환은 여기에서, 예를 들면, Hinnen 등의 프로토플라스트 방법 (Proceedings of National Academy of Science of the United States of America, Vol. 75, p. 1929 - 1933, 1978), Itoh 등의 리튬 아세테이트 방법(Journal of Bacteriology, Vol. 153, p. 163 - 168, 1983) 등과 같은 분자생물학 또는 유전 공학분야에서 통상적으로 사용되는 임의의 적절한 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방법으로 수득된 본 발명의 효모는 도입된 외인성 DNA를 제외하고는 도입전의 원래의 균주와 정확히 동일한 유전적인 특성을 가지며, 또한 본 발명에 따른 응집 유전자의 DNA 사슬만이 상기 공형질전환방법 및 유전자 치환 방법에 의해 도입되는 염색체 도입 방법을 사용함으로써, 불필요한 벡터 서열이 그 안에 함유되지 않아서, 수득된 재조합체는 사용되는 벡터의 특성을 갖지 않는다. 그 결과, 원래 균주의 우수한 특성이 전혀 손상되지 않고 응집성이 특정 방식으로 개선된 공업적인 효모를 번식시킬 수가 있다.

[알콜주의 제조]

상기한 바와 같은 본 발명에 따른 응집유전자에 의해 형질전환된 효모를 사용하는 발효원의 발효는 상기한 바와 같은 효과를 달성하기 위해 수행될 수 있다. 명백한 바와 같이, 발효원은 발효의 목적에 따라서 선택되는데; 예를 들면, 맥주 및 위스키의 제조에는 맥아즙이 사용되고; 와인의 제조에는 과일 쥬스가 사용되고, 일본 사케의 경우에는 국이 사용되고, 소주의 제조에는 전분 또는 탄수화물 원료가 사용되고, 알콜제조의 경우에는 당밀, 전분 또는 탄수화물원료가 사용된다. 또한, 발효의 조건은 통상적으로 사용되는 조건과 동일할 수 있으며, 본 발명에 사용될 때 현존하는 발효방법 또는 장치는 변형시킬 필요가 없다.

사용되는 효모가 이렇게하여 제조된 알콜 리쿼중에서 응집을 나타내기 때문에, 발효의 완결후에 빠르게 응집되고 발효 배트의 바닥에 침강되며 효모세포는 발효물로부터 용이하게 분리가능하다.

[실시예]

본 발명은 실시예를 참조로 하여 보다 상세하게 설명된다.

[실시예 1]

[효모의 응집을 조절하는 유전자의 수합]

하기 실험을 수행하여 본 발명에 따른 응집 유전자중 하나로서의 FL01S 유전자를 수득한다 (Watari 등, Agricultural and Biological Chemistry, Vol. 53, No. 3, p. 901 - 903, 1989), 사카로마이세스 세리비지아 균주 ABXL - 1D 의 염색체 DNA (유전자 형 : MATa FL01, Yeast Genetic Stock Center, University of California, USA)을 Cryer 등의 방법 (Methods of Cell Biology, Vol. 12, p. 39 - 44, 1975) 에 따라서 제조한다. 수득된 염색제 DNA를 제한 효소 Sau3AI 로 부분 절단시키고, 5kb 이상의 DNA 단편을 수크로스 농도 구배 원심분리에 의해 회수하고, DNA 단편을 선별 마커로서 히스티딘 합성 유전자 HIS4를 함유하는 클로닝 벡터 YCpH4 (Watari 등, Agricultural and Biological Chemistry, Vol. 53, N. 3, p. 901 - 903, 1989) 의 BamHI 영역에 결찰 반응에 의해 시험관내에서 삽입시킨다. 에스케리키아 콜리 (이. 콜리) 균주 MC1061 (유전자형 : hsdR mcrB araD139^ (araABC - leu) 7679^lacX74 galU glaK rpsL thi)를 결찰 혼합물로 형질전환시키고, 플라스미드를 형질전환체로부터 추출하여 균주 ABXL - 1D 에 대한 유전자 라이브러리를 제조한다. 이. 콜리 균주 MC1061 는 재조합 DNA 기술의 분야에 사용되는 균주이다.

이 유전자 라이브러리를 사용하여, 히스티딘 - 요구 비응집성 빵 효모 사카로마이세스 세리비지아 균주 YJW6 (유전자형 : MAT - adel ural his4 canl karl) (Agricultural and Biological Chemistry, Vol. 53, No. 3, p. 901 - 903)를 형질전환시킨다. 사카로마이세스 세레비지아 균주 YJW6 의 형질전환은 Itoh 등의 리튬 아세테이트 방법 (Journal of Bacteriology, Vol. 153, p. 163 - 168, 1983) 에 따라서 기본적으로 수행된다. 즉, 100ml 의 YPD 액체 배양 배지 (1% 효모 추출물, 2% 박토펩톤, 2% 글루코스) 에 1백금이의 YJW6 의 균주를 접종하고 세포를 30℃에서 하룻밤 배양하고, 다음날 아침에 원심분리하고, 동일한 조성의 새로운 배지에 접종하고 30℃에서 3 시간 더 배양한다. 수합된 세포를 40ml 의 멸균수로 세척하고, 최종적으로 20ml 의 TE 용액 (1 mM EDTA를 함유하는 10 mM Tris - HCl 완충용액, pH 7.5) 에 현탁시킨다. 이들중에서, 5ml를 L - 형 시험관 (Monod 시험관) 으로 이동시키고, 5ml 의 0.2 M 의 리튬 아세테이트 용액을 거기에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1 시간동안 100 회전/분으로 진탕한다. 혼합물로부터 0.1ml를 취하고 미리 50㎍ 의 재조합 플라스미드 (에탄올 침전후, 공기 건조됨)를 함유하는 1.5ml 에펜도르프 튜브에 첨가하고 혼합물을 잘 교반하고 30℃에서 30 분간 방치한다. 이 에펜도르프 튜브를 잘 교반하고, 0.1ml 의 70% 폴리에틸렌 글리콜 #4,000을 거기에 첨가하고 혼합물을 더 잘 교반한 다음 30℃에서 1 시간 방치한다. 이를 42℃에서 5 분간 가열 (열 쇼크 처리) 하고, 실온으로 냉각한 다음 세포를 멸균수로 세척한다. 최종적으로, 세포를 0.5ml 의 멸균수로 현탁시키고, 용액을 히스티딘을 함유하지 않는 최소 배지 (아미노산이 없는 0.67% Difco 효모 질소 염기, 2% 글루코오즈, 40㎍/ml 의 아데닌 술페이트, 40㎍/ml 의 우라실, 2% 의 Difco 박토 아가) 에 한번에 0.1ml을 도포하여, 비 히스티딘 요구 형질전환체를 수득한다. 이 형질전환 실험을 10 회 반복하여 대략 10,000 클론의 비-히스티딘-요구 형질전환체를 수득한다.

다음에, 응집성 클론을 형질전환체로부터 스크리닝한다. 이 형질전환체를 플레이트로부터 이쑤시개로 한번에 하나씩 취하고, 96 - 웰 마이크로플레이트 [각각의 웰은 200 μl 의 최소 액제 배양 배지 ( 상기 최소 배지에서 아가가 제거된 것)을 함유] 에 접종하고, 25℃ 에서 3 일간 배양한다. 배양후의 마이크로플레이트를 마이크로플레이트 믹서 (Titech 마이크로믹서)를 사용하여 60 초간 격렬하게 교반하고 응집성 클론을 가시적으로 찾아내어 응집을 조사한다. 비교적 강한 응집성의 클론 하나가 대략 6,000 개의 비-히스티딘-요구 형질전환체중에서 수득된다. 이 균주를 비 선택성 YPD 배양 배지에서 배양하고, 여기에서, 히스티딘 요구성으로된, 즉 플라스미드를 잃은 클론을 수득한다. 히스티딘 요구성으로된 이 클론은 또한 그의 응집성을 잃는다. 또한, DNA 가 원래 수득된 응집성 형질전환체로부터 회수될 때, 이 플라스미드는 이. 콜리 균주 MC1061 로부터 회수되고, 비-히스티딘-요구 형질전환체는 균주 YJW6를 이것으로 형질전환하여 수득되며, 모두 응집성이다. 이들 결과로 형질전환된 균주에 의해 나타나는 응집은 숙주 세포내의 임의의 유전 돌연변이에 의한 것이 아니라, 형질전환된 균주내의 플라스미드에의해 야기된 것이라는 결론을 유도할 수 있다. 여기에서, 본 발명자들은 응집을 조절하는 유전자 서열을 함유하는 플라스미드를 YCpHF19S 로 칭한다. 이의 제한 효소 지도를 제4도에 나타낸다.

마이크로플레이트를 사용하는 응집성 효모의 스크리닝 시험에서 예측할 수 있는 바와 같이, 응집 유전자를 함유하는 상기 플라스미드는 마커를 갖지 않는 효모로부터 응집을 선별하기 위한 마커로서 사용될 수 있으므로, 형질전환체를 수득한다. 이 실험에서는 또한, 본 플라스미드가 도입된 형질전환체가 실제로 비응집성 효모로부터 수득되었다. 즉, 이런 유형의 응집 유전자는 명백하게 임의의 유전자 마커 없이 사카로마이세스 세레비지아에 속하는 효모의 형질전환체를 수득하는데 사용될 수 있다. 또한, 스크리닝 공정 도중에, 기본적으로 형질전환체를 스크리닝하기위한 특정 배양배지 (최소 배지 또는 항생제를 함유하는 배지)를 제조를 필요로 하지 않으며, 보통의 배양 배지에 배양할 수 있다는 장점을 갖는다. 또한, 효모 형질전환체를 수득하기 위한 수 개의 효모-유래 유전자 마커가 존재하며, 이들은 효모 자체 클로닝 실험에 매우 유용하다.

[실시예 2]

실시예 1에서 클로닝된 응집 유전자가 효모 염색체I의 FL01 유전자인지 아니지를 결정하기 위하여, 하기 물리적 맵핑 실험을 본 응집 유전자로 수행한다 (Watari 등, Agricultural and Biological Chemistry, Vol. 53, No. 3, p. 901 - 903, 1989).

응집을 조절하는 유전자를 함유하는 플라스미드 YCpHF19S 내의 DNA 영역으로부터 취한 2.6kb 의 EcoRV 단편을 프로브로 사용하고, 염색체 상의 본 유전자 단편의 물리적 맵핑을 염색체 DNA 전기영동에의해 수행한다 (펄스장 전기영동). 즉, 사카로마이세스 세레비지아 균주 ABXL - 1D 의 염색체 전기영동을 Carle 등의 방법 (Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, Vol. 82, p. 3756 - 3760, 1985) 에 의해 Biorad CHEF 전기영동 장치를 사용하여 수행하므로써 샘플을 제조한다. 전기영동의 완결후에, 전기영동겔상의 DNA 밴드를 Maniatis 등의 방법 (Molecular Cloning, p. 382 - 389, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) 에 따라서 서던 블롯팅 및 하이브리다이제이션 한다. 그 결과, 상기 언급된 2.6kb 의 EcoRV 단편이 균주 ABXL - 1D 의 염색체 I 에 하이브리다이제이션된다는 것은 본 실험에서 클로닝된 응집 유전자가 염색체 I 상의 유전자라는 것을 나타낸다.

다음에, 클로닝된 응집 유전자의 유전학적 맵핑을 시도한다 (Watari 등, Agricultural and Biological Chemistry, Vol. 55, No. 6, p. 1547 - 1552, 1992). YCpHF19S를 부분적으로 제한 효소 Xbal 으로 절단시키고, 효모 동원체 유전자 (CEN4) 및 효모 복제 오리진 ARS1을 제거하여 통합된 YIp 플라스미드 YIpHF19S를 제조한다 (제5도 참조). 이 플라스미드를 제한 효소 BamHI 로 절단하여 클로닝된 응집 유전자 부분의 효모내로의 도입 효율을 상승시키고, 사카로마이세스 세레비지아 균주 YJW2A (유전자형 : MATa FL01 his4)를 이것으로 상기 방법에 의해 형질전환하여 비-히스티딘-요구 형질전환체를 수득한다. 수득된 균주를 사카로마이세스 세레비지아 균주 YJW6 (유전자형 : MAT - adel ural his4 canl karl) 과 크로싱하여 배수체를 수득하고, 이를 포자형성을 시키고 유전자 분석을 한다 (tetrad 분석). 그결과, 유전학적 결합 (친 디타입 : 비친 디타입 : 테트라타입 = 22 : 0 : 7) 이 크로모좀 I 상의 His+ 특성 (비-히스티딘-요구) 및 ADE1 사이에서 수행되는데, 이는 YIpHF19S 플라스미드의 클로닝된 응집 유전자부분이 균주 YJW2A 의 염색체 I 상에 통합되었음을 명확히 나타낸다.

상기 물리적 및 유전학적 맵핑의 결과로부터, 본 발명자들은 클로닝된 응집 유전자가 효모 염색체 I 의 FL01 유전자이라는 것을 결론지었다. 그러나, 이러한 점에서, 여기에서 수득된 FL01 유전자는 효모 염색체상에 존재하는 본래의 유전자 FL01 (또는, FL01L 유전자) 가 아니라, 하기하는 바와 같이 FL01L 의 DNA 서열의 일부가 결실된 FL01S 유전자라는 것은 공지되어 있지 않다.

[실시예 3]

[FL01S 의 염기 서열의 분석]

본 발명자들은 상기에서 수득한 FL01 유전자 (실제로는 FL01S 유전자) 의 염기 서열을 측정하기 위한 실험을 수행하였다.

서브클로닝의 결과, FL01S 유전자에 의한 응집의 발현에 필수적인 영역은 플라스미드 YCpHF19S 의 BamHI - (BamHI/ Sau3AI) 사이의 4.1kb 의 DNA 단편으로 구성된다는 것이 발견되었다. 여기에서, 이 DNA 단편을 함유하는 영역은 서열화 벡터 pUC118 및 pUC119 (둘다 Takara Brewing Co. 의 제품이다) 의 멀티 - 링커 부위에서 서브클로닝된다. 다음에, 각각의 서브클론을 Hinikoff 등의 방법 (Gene Vol. 28, p.351 - 359, 1984) 및 Yanisch - Perron 등의 방법 (Gene, Vol. 33, p. 103, 119, 1985) 에 적용시키는데, 그들의 플라스미드의 삽입 부위를 엑소뉴클레아제 III 및 망빈 뉴클레아제로 처리하고, 삽입된 단편이 부분적으로 손실된 여러 클론의 짧은 길이를 갖는 것들을 제조하여 사슬 길이를 구별한다. 이 공정중에, 킬로시퀀싱 결실 키트 (Takara Brewing Co.)를 사용한다. 생성된 여러 클론의 삽입 단편에 관하여는, Sanger 등의 디데옥시 방법 (Science, Vol. 214, p. 1205 - 1210, 1981)을 따르고, Applied Biosystems Japan, Inc. 의 자동 DNA 시퀀서를 사용하여 상기 4.1kb 의 DNA 단편의 염기 서열을 측정한다. 그의 분석의 결과, 2,586 bp 의 오픈 리딩 프레임 (서열번호2) 이 존재하며 이는 분자량이 대략 89,368 인 862 개 아미노산의 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

[실시예 4]

[서던 하이브리다이제이션 실험]

상기한 바와 같이, 실시예 1에서 수득된 응집 유전자는 정확히 효모 염색체 I 상의 FL01 위치이나, 이것이 본래의 FL01 유전자이냐 아니냐를 결정하기 위해서는, 하기와 같은 서던 하이브리다이제이션 실험을 수행한다. 먼저, DNA 모두를 응집유전자가 클로닝된 효모 사카로마이세스 세레비지아 균주 ABXL - 1D 로부터 추출하고, 제한 효소 EcoRV 로 완전히 절단시키고 전기영동한다음, 실시예 2에서 상기 언급한 오픈 리딩 프레임을 함유하는 2.6kb 의 EcoRV DNA 단편을 프로브로 사용하여 게놈 서던 분석을 한다. 여기에서, 서던 블롯팅 및 하이브리다이제이션을 Manistis 등의 방법 (Molecular Cloning, p. 382 - 389, Cold Spring Harbor Labaratory, 1982) 에 따라서 수행한다.

결과는 놀랍게도, 대략 2.6kb 에 상응하는 위치에서 하이브리다이제이션 시그날이 검출되지 않으나, 하이브리다이제이션 시그날이 대략 4.7kb 에 상응하는 위치에서 수득되었다. 이로 인하여 본 발명자들은 클로닝된 응집 유전자가 균주 ABXL - 1D 의 FL01 유전자와 동일하지는 않으나, 오히려 클로닝 공정시에 어떠한 이유로 DNA 서열의 일부가 결실된 본래의 FL01 유전자 일수 있다는 것을 상상하였다.

[실시예 5]

[PCR (폴리머라제 사슬 반응) 실험]

여기에서, 본 발명자들은 PCR (폴리머라제 사슬 반응) 방법에 의해 ABXL - 1D 의 FL01 유전자의 구조를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저, DNA 사슬을 상기 실시예 3에 언급된 염기 서열을 사용하여 화학적으로 합성한다. 즉, 본 유전자의 오픈 리딩 프레임의 개시 코돈 영역을 포함하는 33 개 염기의 DNA 서열을 DNA 합성기 (ABI Co. 의 제품) 로 화학적으로 합성하고 PCR 5′프로브로서 사용한다 (서열번호3).

(상기 서열의 5′말단으로부터 14 번째 염기에서 출발하는 ATG - 는 FL01S 의 5′말단 서열이다).

또한, 33 개 염기의 DNA 서열은 동일한 방법으로 화학적으로 합성되고, 이는 본 응집 유전자의 오픈 리딩 프레임의 종결 코돈을 함유하는 영역의 상보적인 스트랜드 (리버스 스트랜드)를 포함하며, PCR 3′프로브로브로서 사용된다 (서열번호 4).

(상기 서열의 5′말단으로부터 10 번째 염기에서 출발하는 TTA - 는 FL01S 의 3′말단 서열이다 (리버스 스트랜드)).

다음에, 이들 5′ 및 3′프로브를 사용하여, PCR 실험을 주형으로서 사카로마이세스 세레비지아 균주 ABXL - 1D 의 전체 DNA를 사용하여 PCR 실험을 수행한다.

찌모리액터 모델 AB - 1800 (Ato Co. 의 제품)을 PCR 실험에 사용하고, Pfu DNA 폴리머라제 (Stratagene Co.)를 DNA 폴리머라제로서 사용한다. 또한, PCR 실험의 조건은 Inis 등의 방법 (PCR Technology, p. 3 - 12, Srockton press, ed, Henry A. Erlich, 1989) 에 따라서 수행한다. 아가로오즈 겔상에서의 전기영동에의한 PCR 실험의 결과로 증폭된 DNA 밴드의 확인시, 단일 밴드가 대략 4.7kb 의 영역에서 발견되며, 이는 균주 ABXL - 1D 의 FL01 의 오픈 리딩 프레임이 대략 4.7kb 임을 암시한다. 또한, 본 발명자들에 의해 클로닝된 응집 유전자를 함유하는 플라스미드 YCpHF19 가 템플레이트로서 사용되는 대조용 실험에서, 대략 2.6kb 의 영역에서 밴드가 수득된다. 이들 결과로부터 본 발명자들은 효모 사카로마이세스 세레비지아 균주 ABXL - 1D 에 존재하는 FL01 유전자의 본래의 오픈 리딩 프레임이 대략 2.6kb 가 아니라, 대략 4.7kb 임을 결론지었다.

그러므로, 본 발명자들은 본 발명자들에 의해 수득된 응집 유전자는 대부분 이. 콜리 균주 MC1061 균주에 YCpHF19를 유지하는 방법도중에 분자간 재조합의 결과로, 어떤 이유에서 그의 일부가 손실된 FL01 유전자임을 결론지었다.

[실시예 6]

[FL01L 유전자의 수합]

여기에서, 본 발명자들은 본래의 FL01 유전자를 함유하는 플라스미드가 FL01 의 클로닝 도중에 이. 콜리 로부터 최초로 회수된 YCpHF19S 플라스미드 용액에 오염되어있을 지도 모르다는 본 발명자들의 예견을 기초로하여 재시험을 수행하였다. 먼저, 플라스미드 용액의 일부를 취하고, 제한효소 EcoRV 로 절단시키고 아가로오스 겔상에서 전기영동하며, YCpHF19S 에 대하여 수득된 2.6kb 밴드와 더불어, 극도로 희미하나 명확하게 볼 수 있는 밴드가 4.7kb 상에서 발견된다. 이는 플라스미드 용액이 두 유형의 플라스미드의 혼합물임을 암시한다. 여기에서, 본 발명자들은 이 플라스미드 용액을 사용하여 이. 콜리 균주 JA221 (유전자 유형 : recAl, lacY leuB trp^E5 속 thi hsdR hsdM)을 형질전환하였으며, 수득된 형질전환체로부터 플라스미드를 추출하고 시험할 때, YCpHF19S 와 더불어 첨가하여 또다른 유형의 플라스미드가 분리되며, 이는 YCpHF19S 보다 대략 2.1kb 가 크다. 여기에서, 최초로 클로닝된 플라스미드는 YCpHF19S 로 명명되며, 2.1kb 더 긴 YCpHF19S 플라스미드 용액으로부터 분리된 플라스미드는 YCpHF19L 로 명명된다. 또한, YCpHF19S 및 YCpHF19L 의 각각의 제한 효소 분해 패턴의 분석결과로서, 플라스미드는 응집 유전자의 오픈 리딩 프레임을 함유하는 DNA 영역 이외의 임의의 DNA 영역에서 차이점을 나타내지 않는 것으로 밝혀졌다 (제4도 및 제7도 참조). 즉, YCpHF19L 의 응집 유전자의 오픈 리딩 프레임은 YCpHF19S 의 것보다 2.1kb 더 긴 것으로 나타났다. 이는 본래의 FL01 유전자 (즉, FL01L) 의 최초의 클로닝은 성공적이나, YCpHF19L 플라스미드를 이. 콜리 균주 MC1061 내에서 유지시키는 공중 도중에, 생체내 분자간 재조합으로 인하여 FL01L 의 오픈 리딩 프레임이 일부 결실되어, FL01L 이 FL01S 로, 또는 YCpHF19L 이 YCpHF19S 로 전환되었다는 결론을 유도한다. 여기에서, 결실이 프레임내에서 발생되기 때문에, FL01S 는 아직도 응집성을 나타내는 폴리펩티들 코딩할 수 있을 것으로 생각된다.

YCpHF19S 상의 응집 유전자로서 FL01S 및 YCpHF19L 상의 응집 유전자로서의 FL01L 의 차이를 하기에 기술한다.

또한, 결실의 발생빈도는 YCpHF19L 플라스미드를 유지하는 이. 콜리의 유형에 의해 상당히 영향받는데, 본 발명자들은 균주 JA221 (유전자 유형 : recAl lacY leuB trp^B5 속 thi hsdR hsdM) 에 대하여는 비교적 적은 전환이 발생되는 반면에, 예를 들면, 균주 MC1061 (유전자 유형 : hsdR mcrB araD139^ (araABC - leu) 7679^lacX74 galU galK rpsL thi) 및 균주 DH5 - (유전자형 : supE44 ^lacU169 (-80lacZ^M15) hsdR17 - recAl endAl gryA96 thi - 1relAl) 에 대하여는 높은 비율로 전환이 발생된다. 그러므로 본 발명자들은 주로 플라스미드가 이. 콜리에 유지될 때 균주 JA221을 사용한다. 그러나, 이러한 전환에 대한 이유는 명확하지 않다.

[실시예 7]

[FL01L 의 염기 서열의 분석]

FL01L을 함유하는 DNA 단편을 상기한 YCpHF19L 플라스미드로부터 절단하고, 그의 전체 염기 서열을 실시예 3과 동일한 방법으로 결정한다. 그 결과, FL01L 의 오픈 리딩 프레임이 분자량이 대략 160,692 인 1,537 개의 아미노산의 폴리펩티드를 코딩하는 4,611 bp 의 염기서열임을 확인한다 (서열 번호1). 또한, FL01S 는 오픈 리딩 프레임의 개시코돈으로부터 985 번째 내지 3,009 번째 염기 (아미노산 서열의 329 번째 내지 1.003 번째 아미노산에 상응) 로 구성된 DNA 사슬이 인프레임 결실된 FL01L 인 것으로 보여진다 (서열 번호1 및 2 참조).

또한, FL01L 의 아미노산 서열의 분석의 결과로부터 판단할 때, 45 개 아미노산의 반복된 서열 (직접 반복) 은 서열의 278 번째 내지 1,087 번째 아미노산인 것으로 밝혀졌다 [기본적으로 하기 서열로 나타냄, 괄호안의 “/ ”로 분리되어 있는 아미노산은 또다른 후보 아미노산을 나타낸다.

Thr Thr Thr (Glu/ Glu) Pro Trp (Asn/ Thr/ Asp) (Gly/ Asp/ Ser) Thr Phe Thr Ser Thr Ser (Thr/ Ala) Glu (Met/ Leu/ Val) (Thr/ Ser) Thr (Val/ Ile) Thr Gly Thr Asn Gly (Leu/ Val/ Gln) (Pro/ Arg) Thr Asp Glu Thr (Val/ Ile) Ile Val (Ile/ Val) (Arg/ Lys) Thr Pro Thr (Thr/ Ser) (Ala/ Glu) ( Thr/ Gly/ Ser/ Ile) (Thr/ Leu/ Ser) (Als/ Ile/ Val/ Ser) (Met/ Ser/ Ile/ Thr)]. 그리고 FL01L에서 이 반복된 서열이 18 개 있다. 한편, FL01S에서, 이 반복 서열의 주요 부분이 결실되며 (FL01S 는 FL01L 의 아미노산 서열의 329 번째 내지 1,003 번째 아미노산이 결실된 아미노산 서열을 갖는다). 반복 서열의 단지 3 복제물만이 존재한다. 본 발명자들은 현재의 FL01L 및 FL01S 의 응집성에 있어서의 차이 (전자가 후자보다 숙주세포에 보다 강한 응집성을 부여한다) 는 이들 직접 반복물의 수에 연관되어 있는 것으로 믿고 있다. 본 발명자들은 미래에는 세포에 대하여 원하는 응집 능력을 달성할 수 있을 것으로, 즉 직접 반복물의 개수를 조절함으로써 응집성을 조절할 수 있을 것으로 예상하고 있다.

[실시예 8]

[실제 이용을 위한 여러 효모 균주내로의 FL01L 유전자의 도입 (1 : 플라스미드 벡터 사용)]

상기 수득된 응집 유전자 FL01S 및 FL01L을 여러 공업 효모 (모두 비응집성) 내로 도입하여 이들이 실제이용을 위한 응집성 효모 균주를 번식시키는데 실제로 효율적인지 아닌지를 측정한다. 먼저, 공업적 효모를 형질전환시키기위하여, 직접 선별가능한 FL01S 및 FL01L 유전자를 함유하는 플라스미드를 제조한다 (흐름도를 제3도에 나타낸다. 흐름도에 있어서, 각각의 플라스미드 및 오픈 리딩 프레임 (ORF) 옆의 숫자는 제4 - 11도에 상세하게 나타낸 플라스미드 및 오픈 리딩 프레임의 숫자와 일치한다). YCpHF19S 의 FL01S 유전자를 함유하는 5.8kb 의 BamHI - XhoI 단편 (제6도)을 직접 선별을 위해 사용되는 플라미드 YRpGL10 (직접 선별을 위한 마커 유전자로서 G418-내성 Tn 903 유전자 및 효모내 복제 오리진으로서 ARS1 서열을 갖는다. 제9도 참조) 의 BamHI - SalI 의 사이의 틈에 삽입하여, YRpGLF14S 플라스미드를 제조한다 (제10도). 또한 YCpHF19L 로부터의 7.9kb BamHI - XhoI 단편 (제8도)을 YRpGL10 의 BamHI - SalI 사이의 틈에 삽입하여 FL01L 유전자를 함유하는 유사한 플라스미드로서 YRpGLF8L을 제조한다 (제11도).

플라스미드에의해 공업적인 효모를 형질전환시키는 방법을 하기한다. 공업적인 효모의 형질전환을 위한 방법은 기본적으로는 실시예 1에 기재된 실험적인 효모에 대해 사용하는 것과 동일하나, 본 발명자들은 하기한 바와 같이 약간의 변형을 가한다 (Watari 등, Agricultural and Biological Chemistry, Vol. 55, No. 6 p. 1547 - 1552, 1991). 즉, 100ml 의 YPD 액체 배양 배지 (1% 효모 추출물, 2% 박토펩톤, 2% 글루코오즈) 에 1 백금이의 세포를 접종하고, 이를 30℃에서 하룻밤 배양하고, 다음날 아침에 원심분리하고, 동일한 조성의 새로운 배지에 접종하고 30℃에서 3 시간 더 배양한다. 수합된 세포를 40ml 의 멸균수로 세척하고, 최종적으로 20ml 의 TE 용액 (1 mM EDTA를 함유하는 10 mM Tris - HCl 완충용액, pH 7.5) 에 현탁시킨다. (그러나, 헤마토미터는 여기에서 현탁액의 농도를 조정하여 약 2 × 108 세포/ml 의 최종 세포 농도를 달성하는데 사용된다). 이중에서, 5ml를 L - 형 시험관 (Monod 시험관) 으로 이동하여, 5ml 의 0.2 M 의 리튬 아세테이트 용액을 거기에 첨가하고 혼합물을 실온에서 100 회전/분 으로 1 시간 진탕한다. 혼합물로부터 0.1ml를 취하고 미리 50㎍ 의 재조합 플라스미드 (에탄올 침전후, 공기 건조됨)를 함유하는 1.5ml 에펜도르프 튜브에 첨가한 다음 혼합물을 잘 교반하고 30℃에서 30 분간 방치한다. 이 에펜도르프 튜브를 잘 교반하고, 0.1ml 의 70% 폴리에틸렌 글리콜 #4,000 을 거기에 첨가하고 혼합물을 더 잘 교반한다음 30℃에서 1 시간 방치한다. 다음에, 혼합물을 42℃에서 5 분간 가열 (열 쇼크 처리) 하고, 실온으로 냉각한 다음 세포를 멸균수로 세척한다. 최종적으로, 세포를 에펜도르프 튜브중의 1.4ml 의 YPD 용액에 현탁시키고 30℃에서 16 - 20 시간 정치 배양한다. 한번에 배양용액 0.1ml를 200㎍/ml 의 G418을 함유하는 YPD 아가 배지에 도포하고, 30℃에서 2 ~ 3 일간 배양하여 형질전환체를 수득한다.

여러 공업 효모의 형질전환 실험을 이 방법을 사용하여 수행한다. 결과를 표 1에 나타낸다. 또한, 응집을 평가하기위한 방법은 하기와 같다.

각각의 형질전환체를 10ml 의 YPD 액체 배지 (100㎍/ml 의 G418 함유)를 함유하는 L - 형 시험관 내로 접종하고 28℃에서 3 일간 배양을 위한 진탕 (100 회전/ 분) 하고, 응집을 가시 실험에 의하여 평가한다. 응집의 정도에 관한 평가 척도는 Johnston 등의 측정 방법 (Yeast Genetics : Fundamental and Applied Aspects, p. 205 - 224, Springer Verlag, New York, ed. by J. F. T. Spencer, D. M. Spencer, A. R. W. Smith, 1983) 에 따른다.

[표 1]

이들 결과는 응집 유전자 FL01S 및 FL01L을 도입함으로써, 응집에 차이가 있기는 하나, 여러 비 응집성 공업적 효모 모두를 응집성 효모로 전환시킬 수 있음을 나타낸다. 벡터 플라스미드 YRpGL10을 도입하면, 숙주 세포가 비응집성인 상태로 남아 있다는 것은 말할 필요도 없다.

또한, FL01L 유전자의 도입은 숙주세포의 FL01S 유전자를 도입하는 것보 더 강한 응집성을 만들어낼 수 있음이 명백하다.

[실시예 9]

[실제 이용을 위한 여러 효모 균주내로의 FL01L 유전자의 도입 (2 : 효모 염색체내로의 도입)]

일반적으로, 외인성 유전자가 플라스미드 형태로 숙주세포내에 도입될 때, 플라스미드는 비선택성 압력하에서의 연속 배양의 결과로 세포로부터 빠진다. 실제로, 플라스미드는 G418 에 의한 선택적 압력이 적용되지 않을 때 실시예 8에서 수득된 형질전환체로부터 잘 빠진다는 것이 관찰되었다. 여기에서, 효모내에 FL01 유전자를 안정적으로 유지하기 위해서, 본 발명자들은 효모 염색체내로 FL01 유전자를 통합하는 것을 시도하였다.

(i) 통합용의 FL01 발현 카세트의 제조 (흐름도를 제12도에 나타낸다. 흐름도중의 각각의 플라스미드 및 오픈 리딩 프레임 (ORF) 옆의 숫자는 제13 - 27도에 상세하게 나타낸 플라스미드 및 오픈 리딩 프레임 옆의 숫자에 일치한다).

효모내에서 FL01 유전자를 높은 비율로 발현시키기 위해서는, 프로모터를 FL01 유전자의 오픈 리딩 프레임의 5′말단으로부터 상류측으로 통합하고, 터미네이터는 그의 3′말단으로부터 하류쪽으로 효모 알콜 데히드로게나제 유전자의 전사/ 번역을 조절하는 단위로 통합한다. 즉, FL01S 또는 FL01L 의 오픈 리딩 프레임의 서열을 효모 알콜 데히드로게나제 유전자에 대한 프로모터 및 터미네이터 서열을 함유하는 플라스미드 pBR- dH - ADH1 의 HindIII 부위에 삽입하여 pBR - ADH1 - FL01S (제22도) 및 pBR - ADH1 - FL01L (제27도)를 각각 수득한다. 본 발현 카세트는 PCR 방법 (PCR 실험은 실시예 5와 동일하다)을 사용하여 FL01S 오픈 리딩 프레임의 제조시에 제조되며, 본 발명자들은 제한 효소 분석 및 DNA 시퀀싱의 결과에 의해 이 방법으로 제조된 FL01S 유전자의 염기 서열이 실시예 3의 결과로부터 수득된 제2도의 제한 효소 분해 지도에 나타내고 서열번호2로 나타낸 염기 서열과 정확히 일치하는 것을 확인하였다.

(ii) FL01L 발현 카세트의 맥주 효모 염색체내로의 동시형질전환 방법에 의한 도입의 예

Penttila 등의 동시형질전환 방법 (Current Genetics, Vol. 12, p. 413 - 420, 1987)을 사용하여 벡터 유래 서열 (벡터 플라스미드 pBR322 로부터 유래된 서열)을 함유하지 않는 FL01L 발현 카세트를 효모 (비응집성 하면 맥주 효모 W204) 의 염색체 DNA 내로 통합한다. 즉, 상기 (i)에서 수득된 50㎍ 의 플라스미드 pBR - ADH1 - FL01S 또는 pBR - ADH1 - FL01L을 제한 효소 BamHI 로 절단시키고 페놀/ 클로로포름 처리한 후에, 50㎍ 의 G418 - 내성 플라스미드 YRpGL10를 거기에 첨가하고 이를 에탄올로 침전시킨다. DNA 샘플을 공기 건조시키고, 효모를 실시예 8에 기재된 방법에 따라서 형질전환시킨다. 형질 전환체를 마커로서 G418 - 내성에 대해 선별하고, 수득한 형질 전환체를 마이크로플레이트 분석 방법 (실시예 1 참조) 으로 스크리닝하여 응집성 균주를 수득한다. 여기에서, 마이크로플레이트 분석방법의 상세한 사항은 하기와 같다. 생성 형질전환체를 플레이트로부터 이쑤시개로 한번에 하나씩 취하고, 96 - 웰 마이크로플레이트 (각각의 웰은 200μl 의 YPD 액체 배지 함유)에 접종하고, 25℃에서 3 일간 배양한다. 응집의 측정을 배양후에 마이크로플레이트 믹서 (Titech co. 제품)를 사용하여 마이크로플레이트를 강하게 60 초간 진탕한 다음 응집성 클론을 눈으로 찾아서 수행한다.

이 방법으로 수득한 응집성 균주를 YPD 배지에서 10 - 20 세대 비선택적으로 배양한후에, 세포를 적절하게 희석하고, YPD 아가 배지에 도포하고, 30℃에서 2 - 3일간 배양한다. 플레이트 상에 축적된 콜로니를 200㎍/ml 의 G418을 함유하는 YPD 아가 배지와 G418을 함유하지 않는 또다른 YPD 아가 배지상으로 복제하고 콜로니의 G418 - 내성을 시험하여 G418 - 내성을 나타내지 않는 균주를 회수한다. 이들 균주는 세포로부터 플라스미드 YRpGL10 이 빠졌으나, FL01 발현 카세트 (즉, ADH1 프로모터 및 ADH1 터미네이터의 발현 조절하의 FL01S 및 FL01L 유전자의 오픈 리딩 프레임) 는 ADH1 유전자의 균질한 서열 부분을 사용한 생체내 유전자 치환에 의해 염색체의 ADH1 위치 상으로 통합된 것으로 생각되어진다.

이들중에서, FL01S 발현 카세트가 통합된 균주를 W204 - FL01S 로 명명하였으며, FL01L 발현 카세트가 통합된 균주는 W204 - FL01l 로 명명하였다.

이들 균주를 50 세대간 배양해도, 이들은 배양전과 동일한 수준으로 그들의 응집성을 유지한다. 또한, W204 - FL01S 및 W204 - FL01L 균주를 게놈 서던 분석하여, 본 발명자들은 모든 FL01 발현 카세트가 염색체 DNA 로 통합되었음을 확인하였다.

(iii) 발효 시험

2 리터의 소형 스케일의 맥주 발효 시험을 (ii)에서 수득된 W204 - FL01S 및 W204 - FL01L 균주를 사용하여 수행한다. 즉, 하기 방법은 European Institute of Brewing (Journal of the Institute of Brewing, EBC Analytica Microbiologica, Method 2. 5. 4., Tubes E. B. C., Vol. 83, p. 117 - 118, 1977) 의 표준방법이다. 세포를 50ml 의 맥아즙내에서 20℃에서 3일간 정치 배양하고, 그의 전체량을 1 l 의 맥아즙에 첨가한 다음 15℃에서 1 주간 정치 배양한다. 성장 세포를 원심분리 (5,000 rpm × 10 분) 에의해 수합한다. 수득된 효모 세포를 맥아즙 (미리 산소 농도를 9 ppm 으로 조정한 것) 에 11°P (플라토 디그리)에서 첨가하여 농도를 0.5% (습윤 v/v) 로 한다. 정지상 발효를 10℃에서 10 일간 수행한다. 응집 및 침강의 양을 이 시점에서 비교 할 때, 비응집성인 친주 W204 는 보다 적은 양의 침강 효모를 가지며, 회수된 효모의 양은 최초로 첨가된 효모의 양과 거의 동일하다 (즉, 100% 회수율), 그러나, FL01L 발현 카세트가 통합된 W204 - FL01L 균주는 강한 응집성을 나타내며, 회수된 효모의 양은 최초에 첨가된 효모의 양의 두배 이상이다 (즉, 200% 이상). 그러나, FL01S 발현 카세트가 통합된 W204 - FL01S 균주는 단지 약한 응집성을 나타내며, 회수된 효모의 양도 W204 의 경우보다 많지 않다. 이는 숙주세포의 적절한 응집이 FL01S 의 싱글 카피만을 도입하여서는 맥아즙내에서 유도될 수 없다는 것을 암시하는 것으로 짐작된다 (실시예 8에서 수득된 FL01S 의 멀티플 카피의 도입으로, W204 는 맥아즙에서도 응집을 나타낸다).

그럼에도 불구하고, 싱글 카피의 FL01S 가 염색체 내로 도입된 W204-FL01S 균주는 YPD 배양 배지에서 중간정도의 응집을 나타내나, 이러한 현상이 맥아즙내에서는 발생되지 않는 이유는 현재로서는 명확하지 않다.

또한, 상기한 바와 같은 발효 (예비발효) 의 완결 후에, 이의 상청액 (영비어) 의 숙성 (후발효)을 수행한다. 즉, 5℃에서 2 주간 및 0℃에서 1 주간의 후발효의 공정을 완결한 후에, 발효물을 멤브레인 필터로 여과하고 0℃, 2 대기압하에서 2 일간 탄소화한 후에, 이를 화학적으로 분석하고 테이스트 샘플링한다. 결과는 W204 및 W204 - FL01L 사이에서 어떠한 차이도 보여 주지 않는다. 그러므로, 본 발명에 따른 효모를 사용하여 맥주를 양조하면, 조절 균주의 향미 성분에 어떠한 변화도 일으키지 않으면서 효모의 응집성만이 개선될 수 있다는 것이 명백하다.

[기탁]

본 발명에 따른 DNA 사슬 (FL01L 유전자의 오픈 리딩 프레임)을 함유하는 플라스미드 pBR - dEP1 - FL01L (제25도)를 이. 콜리 균주 JA221 로 도입하여 유도된 형질전환 균주 에스케리키아 콜리 FL01L 은 1993 년 1 월 13 일자로 일본국의 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소에 기탁되었으며, 기탁번호 FERM BP - 4136 으로 지정되었다.

[서열표]

서열 번호 : 1

서열 길이 : 4614

서열의 형 : 핵산

사슬의 수 : 이중 사슬

토폴로지 : 직쇄상

분자 종류 : 게놈 DNA

기원 : 사카로마이세스 세레비지아 ABXL - 1D

[서열 1]

서열 번호 : 2

서열 길이 : 2589

서열의 형 : 핵산

사슬의 수 : 이중 사슬

토폴로지 : 직쇄상

분자 종류 : 게놈 DNA

기원 : 사카로마이세스 세레비지아 ABXL - 1D

[서열 2]

서열 번호 : 3

서열 길이 : 33

서열의 형 : 핵산

사슬의 수 : 단일 사슬

토폴로지 : 직쇄상

분자 종류 : 기타 핵산 / 합성 DNA

[서열 3]

서열 번호 : 4

서열 길이 : 33

서열의 형 : 핵산

사슬의 수 : 단일 사슬

토폴로지 : 직쇄상

분자 종류 : 기타 핵산/ 합성 DNA

[서열 4]

Claims

응집 활성을 나타내는 서열번호1에 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는, 효모의 4.7 × 0.2kb 의 응집 유전자.
응집 활성을 나타내는 서열번호2에 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는, 효모의 2.6 × 0.2kb 의 응집 유전자.
제1항에 있어서, 효모 사카로마이세스 세레비지아로부터 유래하고 제1도에 나타낸 제한 효소 분해 지도로 정의 되는 응집 유전자.
제2항에 있어서, 효모 사카로마이세스 세레비지아로부터 유래하고 제2도에 나타낸 제한 효소 분해 지도로 정의 되는 응집 유전자.
서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 제1항 또는 제3항에 따른 응집 유전자를 함유하는 응집성을 갖는 효모.
서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열을 코딩하는 제2항 또는 제5항에 따른 응집 유전자를 함유하는 응집성을 갖는 효모.