JPS62181787A - 遺伝子の発現方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵母における遺伝子の新規な発現方法、およ
び該方法を行う場合に使用されるＤＮＡ断゛片並びに該
ＤＮＡ断片を有するプラスミドに関するものである。

以下の記載において、次の用語を使用する：プロモータ
ー領域：ＲＮ＾ポリマラーゼに関する標的配列（ｔａｒ
Ｖ、ｅｔ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）とプロモーターとを有
するＤＮＡ断片、並びに場合によっては転写エフェクタ
ー物質に関する標的配列を有する活性化領域。

エフェクター物質：調節機能を発現または媒介（ｅｘｅ
ｒｔｉｎｇ　ｏｒ　ｍｅｄｉａｔｉｎｇ）する物質。従
って、エフェクター物質もまた、調節機能を発現または
媒介する物質の濃度に影響を及ぼす物質を含んでいる。

リーグ配列（Ｌｅａｄｅｒ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）　　ニ
ー酸に、ｍＰＮ八に転写されるが、更に蛋白質にまでは
転写されることのないＤＮＡ配列を意味する。従って、
リーグ配列は転写開始からＡＴＧ翻訳開始コドンまでの
Ｄ昌断片を有する。

リーグ配列二本発明においては、代表的には４０〜７０
ｂρを有し、かつ細胞内ヘムにより発現または媒介され
る転写後調節（ｐｏｓｔ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）　に関する標的配列を有す
る短いＤＮＡ断片を意味する。

また、分子生物学の当業者に一般に知られている次の用
語を用いる。

ＣへＰ付加部位＝７〜メチル−ＧＴＰが、対応するｍＲ
ＮＡ上に付加する部位。

ＤＮＡ配列またはＤＮＡ断片；隣接するペントース３′
および５′の炭素原子間のホスホジエステル結合を介し
て結合したヌクレオチドの直線的配列。

発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）　：ポリペプチドを生成
するために構造逓伝子によりもたらされるプロセス。こ
れは転写と翻訳および場合によっては翻訳後の修飾（ｐ
ｏｓｔｔｒａｎｓｌａｊｉｏｎａｌ　ｍｏｄｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎｓ）　との組み合わせである。

末端領域（Ｆｌａｎｋｉｎｇ　ｒ＋４ｉｏｎｓ）　：暗
号づけ領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎｓ）に対応す
るＤＮＡ配列。５′末端領域はプロモータを含む。３′
末端領域は転写終了暗号シグナル等を含むことができる
。

遺１云子：（１）遺伝子生成に関する暗号づけ配列、（
２）遺伝子が発現されるかまたはされないよう制御する
プロモータ領域における配列、（３）転写終了および任
意ポリアゾニレ−ジョン（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉ
ｏｎ）を条件付けする３′末端におけるこれら配列、並
びに必要に応じて（４）介在配列の３または４０部分か
ら成るＤＮＡ配列。

介在配列：任意ペプチド断片に対し暗号付けを行わない
遺伝子内のＤＮＡ配列。介在配列は前、ＲＮＡ（ｐｒｅ
−、ＲＮＡ）に転写され、前駆体ＲＡＭの、ＲＮＡ　ヘ
の修飾により除かれる。

クローニング：生物の固体群、若しくはかかる１の生物
から誘導されるＤＮＡ配列または無性生殖による配列を
得るプロセス。

あるいは更に特に、特別な生物まかはこの一部分を分離
するプロセス、および均質な固体群としてのこのザブフ
ラクションの増殖。

暗号づけ配列（Ｃｏｄｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）　　
：ポリペプチドのアミノ酸配列を決定するＤＮＡ配列。

伝令ＲＮＡ（、ＲＮＡ）　：遺伝子の転写により、また
場合によってはＲＮ＾前駆体の修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ）により生成されるＲＮＡ分子。、ＲＮＡ分子
は１．ＲＮＡ分子の一部がポリペプチドに翻訳されるこ
とにより、該ペプチドのアミノ酸配列を決定する遺伝的
伝達暗号を媒介（ｍｅｄｉａｔｅ）する。

ヌクレオチド：糖の一部（ペントース）、ホスフェート
および窒素系複素環式塩基から成るＤＮＡまたはＲＮＡ
のモノマ一単位。この塩基はグルコシドの結合を介して
糖の一部（ペントースの１′炭素）に結合されており、
この塩基と糖の組み合わせはヌクレオシドである。この
塩基はヌクレオシドを特徴づけるものである。４個のＤ
ＮＡ塩基はアデニン（＾）、グアニン（Ｇ）　、シトシ
ン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）である。４個のＲＮ＾塩基
はＡ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（［１）である。

プラスミド：プラスミドが宿主細胞において複製される
ような無傷（ｉｎｔａｃｔ）のレプリコンを有する非染
色体性の二重らせん構造ＤＮＡ　０このプラスミドを単
細胞生物内に入れた場合、′この生物の特徴はプラスミ
ドのＤＮＡの結果として変化し、あるいは形質転換を起
こす。例えば、テトラサイクリン耐性（Ｔｃ”）に関す
る遺伝子を担持するプラスミドは、初めはテトラサイク
リンに対し感受性である細胞を、テトラサイクリンに耐
性である細胞に形質転換させる。プラスミドにより形質
転換された細胞は形質転換細胞（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａ
ｎｔ）と称する。

ポリペプチド：隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカル
ボキシ基との間でペプチド結合することにより結合され
たアミノ酸の直線的配列。

組み換え：異なる起源（ｏｒｉｇｉｎ）のＤＮＡ断片を
組み合わせることにより新しいＤＮＡ分子を創作するこ
と。

複製＋　ＤＮＡ分子を再生するプロセス。

レプリコン：ＤＮＡ？Ｊｆ製の開始に関する起源を支配
する自己複製遺伝的要素（ｓｅｌｆ−ｒｅｐｌｉｃａｔ
ｉｎｇｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｌｅｍｅｎｔ）および複製を
制御するのに必要な機能を特定化する遺伝子。

制限断片：特異標的ＤＮＡ配列を認識する酵素による二
重らせん構造の開裂に起因するＤＮＡ断片。

ＲＮＡボリマラーゼ：口〜へのＲＮＡへの転写を発現す
る酵素。

形質転換：細胞がプラスミドをとり込むプロセス。

翻訳：　、ＲＮＡからポリペプチドを生成するプロセス
。

あるいはまた１、ＲＮＡ分子内に存する遺伝情報により
、ポリペプドの合成中に特殊なアミノ酸の順序が指示さ
れるプロセス。

転写：　ＤＮＡ配列から相補ＲＮ＾配列を合成する方法
。

ベクター：宿主細胞において複製することのでき、かつ
ｌまたは少数のエンドヌクレアーゼ認識部位を有すプラ
スミド、フアージＤＮＡまたは他のＤＮＡ配列であって
、該認識部位においてＤＮＡ配列が、ＤＮへの不可欠な
生物学的機能、例えは、外殻蛋白質の生成、複製の付随
的喪失や、あるいはプロモーターまたは結合部位の喪失
を生ずることなく、決定可能な方法で開裂することがで
き、また該認識部位は、例えばテトラサイクリン耐性ま
たはアンピシリン耐性の形態に形質転換された細胞の同
定に使用するのに適当な標識を含んでいる。

ベクターは、しばしばクローニングベヒクルと呼ばれて
いる。

組み換え型ＤＮＡのテクノロジーにより生物学的に活性
な生成物を生成することは複雑であり、よって転写の開
始から、生物学的に活性な分子を最終的に得るまでには
多くのプロセス段階が含まれる。

これらプロセス段階の多くは原核生物においては明らか
でなく、この理由は、多くの場合真核生成生物を使用し
なければならないからである。

酵母は真核生物であり、この合成機構 （ａｐｐａｒａｔｕｓ）は、高等生物の特性を示す多く
のプロセスおよび調節メカニズムの多（を含んでいる。

また、酵母細胞は短いｌＬ１代時開時間するが、培昼生
物としての酵母の使用については１千年に及ぶ経験に基
づくものがある。

所望遺伝子生成物の生物学的合成に関し十分に決め手と
なる要因は、転写開始の可能性および改善並びに転写お
よび遺伝子の発現の転写後調節である。

これらの機能は、５′末端領域により主に行われる。原
核生物および真核生物の遺伝子の広範な５′末端領域は
配列しており、この配列に基づき、遺伝子の発現の調節
や、サブ領域（ｓｕｂｒｅｇｉｏｎｓ）や、遺伝子の発
現の調節に重要でる配列の包括的な知見が得られた。原
核生物と真核生物とは調節メカニズムに大きな違いがあ
るが、これら２つの群には多（の共通の特徴がある。

遺伝子の発現の調節は転写レベルで起こり、次いで転写
の開始頻度の調節により好ましく行われる。後者につい
てはよく知られており、特にベンジャミン・レビンシ氏
著のジェーン・エクスプレッションや、ジョン・ライレ
イ氏およびサンズ氏著の１９７４年出版０第１巻、１９
８０年出版０第２版の第２巻、１９７７年出版０第３巻
に記載されている。

あるいはまたかかる調節は転写後レベルで、例えば翻訳
の割合（ｒａｔｅ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）で
の翻訳の開始と翻訳の終了との頻度調節で行われ得る。

レグヘモグロビンは、マメ科の植物の場合にリゾビア（
Ｒｈｉｚｏｂｉａ）の共生の群集により発有する根粒に
おいてもっばら合成されるモノマーヘム蛋白質である。

レグヘモグロビンの遺伝子を活性化するエフェクター物
質にいずれ理論的になるものは、リゾビアにおいて生成
されかつレグヘモグロビンの補欠分子族（ｐｒｏｓｔｅ
ｔｉｃ　ｇｒｏｕｐ）を構成するヘムである。酵母のサ
ツカロミセス　セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における幾つかのヘム蛋
白質の合成もまた、これら蛋白質の補欠分子族をやはり
生成する細胞内のヘムのレベルにより調節される。従っ
て、イソシトクロム（ｉｓｏｃｙｔｏｃｈ−ｒｏｍｅ）
　　ｃ遺伝子の転写はヘムに依存し、一方力タラーゼＴ
、の場合には、ヘムの制御は転写および転写後のレベル
の双方で行われる。

本発明においては、４つの大豆レグヘモグロビン遺伝子
Ｌｂａ、　Ｌｂｃｌ、　Ｌｂｃ２およびＬｂｃ３の５′
末端領域の配列が存在する。これら配列を第１表に配列
の図式として示すが、この表においては相同（ｈｏｒｎ
ｏｌｏｇｙ）が明確となるように配列を一列にした。

この配列の図式において、０．”は当該位置には塩基が
存在していないことを示す。遺伝子の名称およびＡＴＧ
開始コドンから上流に位置する塩基の数を配列図式の右
側に示す。更に、重要な配列には下線を引いた。

この配列の図式から明らかな如く、４つの５′末端領域
の間には顕著な程度の相同が存在し、また島Ｐ付加部位
から２３〜２４ｂｐ上流の位置においては、これらすべ
てが“ＴＡＴＡ”ボックスに対応するＴへＴＡＴへ人＾
配列を有している。尚、この“ＴＡＴ八″八ツボックス
核細胞において、ＣＡＰ付加部位から対応する数のｂｐ
の上流に位置するのが一般的である。更に、ＣＣＡＡＧ
配列はＣＡＰ付加部位から６４〜？２ｂｐ上流に存在し
、この配列はＣへＰ付加部位から一般に７０〜９０ｂｐ
上流に位置する゛’ＣＣＡＡＴ″″ボックスに対応する
ものである。ＣＡＰ付加部位から翻訳開始コドン、ＡＴ
Ｇまで、５２〜６９ｂｐのリーダー配列が存在し、これ
は約７５〜８０％の顕著な程度の相同を示す。

本発明においては更に、Ｌｂｃ３による例により、大豆
レグヘモグロビンの逍１云子の５′末端領域が酵母にお
いて機能的に作用することが証明された。

これは、イー・コリイ（Ｂ、ｃｏｉｌ）クロロアンフェ
ニコール　アセチル　トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）　
遺伝子を、該ＣＡＴ遺伝子がＬｂプロモーターによって
制御されるように大豆のＬｂｃ３遺伝子の５′および３
′末端領域と融合（ｆｕｓｉｏｎ）させることにより証
明された。融合断片を、選択可能な標識として酵母のｔ
ｌＲＡ−３遺伝子を有する酵母プラスミドベクタ＋、Ｙ
ＢＰ２４に挿入した。この結果、δ−アミノレブリン酸
シンセターゼを遺伝子、δ−ＡＬＡにおける突然変異（
ｍｕｔａｔｉｏｎ）のためにヘムを合成することをでき
ずかつＵＲＡ−３である酵母菌株ニス・セレビジアｘ　
（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＭＩは、得られた構造
体で形質転換を起こした。形態転換した酵母細胞は、試
験したすべての増殖条件下でＣＡＴ活性を示した。

この結果、大豆のヘモグロビン遺伝子５′末端領域は酵
母において機能的であることが結論づけられた。

本発明においては更に、５′末端領域が、細胞内ヘムに
より発現または媒介される調節に関し標的として作用す
ることが証明された。従って、δ−肌への存在下で増殖
した酵母のニス・セレビジアエＴＭＩ　におけるＣＡＴ
活性は、増殖培地においてこのヘム前駆体が存在せずに
増殖した酵母におけるＣＡＴ活性よりも２０〜４０倍高
い。同様の高いＣＡＴ活性は、ヘム、プロトポルフィリ
ン■またはヘム類似体、デュテロボルフィリン（ｄｅｕ
ｔｅｒｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）■の存在下で増殖した酵
母のニス・セレビジアエＴＭＩにおいても見られた。Ｃ
へＴ活性に対するヘムの作用は、ＵＲ八−３遺伝子生成
物の量が試験したすべての条件下で一定のままであるた
め明らかである。更に、ＣＡＴ−、ＲＮＡ　レベルが細
胞内のヘム濃度の変化に１！■関係で一定のままである
ため、転写レベルはヘムの存在により変化することがな
いのは明らかである。このため、ヘムにより発現または
媒介される調節メカニズムは転写後レベルで起こると結
論づけることができる。

観察されたＣＡＴ活性の増加は蛋白質合成に依存する。

更に、ＣＡＴ酵素の半減期はヘムの存在に依存せず、ま
た生体外におけるＣＡＴ活性はヘムにより刺激されるこ
とはない。このためヘムにより、翻訳レベルにおいて遺
伝子発現が調節されるであろうことはまちがいないこと
である。Ｌｂｃ３の５′末端領域とネオマイシン　ホス
ホ　トランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子の暗号づけ領
域との融合は、ＣＡＴ遺伝子がＬｂｃ３遺伝子の５′末
端領域と融合したのとまったく同様にしてヘムにより制
御される。

従って、ヘムの作用は、暗号づけ配列と相互作用するヘ
ムにより媒介されるよりはむしろ、ＣＡＴ−、ＲＮＡに
存する５′または３′末端Ｌｂｃ３配列と相互作用する
ヘムにより媒介される。Ｌｂｃ３の５′末端領域および
ｎｅｏ遺伝子のみを有する遺伝子の発現は、ヘムにより
同様に制御される。従って、遺伝子発現に対する細胞内
ヘムの作用は、リーダー配列との相互作用により媒介さ
れ得るものである。

短いリーダー配列は翻訳開始コドンを含んでいない。こ
のため、細胞内ヘムにより発現または媒介される調節メ
カニズムは、偽開始コドン（ｆａｌｓｅｓｔａｒｔ　ｃ
ｏｄｏｎｓ）を伴う調節メカニズム（ネーチャー第３１
６巻　第５８０〜５８１頁（１９８５）フント・ティー
代著参照）とは関係がない。本発明における調節メカニ
ズムは、リーダー配列と相互作用するヘムにより発現ま
たは媒介され、このため新規な調節メカニズムである。

自然の環境において存する細胞におけるプラスミドの存
在は、ある環境下でその細胞に対してのみ有利である特
徴を有する細胞をもたらす。例えば、プラスミドの暗号
づけ特性（Ｐｌａｓｍｉｄ　ｅｎｃｏｄｅｄｐｒｏｐｅ
ｒｔ　１ｅｓ）は、周囲環境に存する抗生物質に対し耐
性であることができる。しかし、プラスミドの存在およ
び暗号づけしたプラスミド遺伝子生成物の合成は、細胞
のエネルギー代謝および蛋白質合成機構に負担を負わせ
、このためプラスミド含有細胞は、プラスミドの暗号づ
け特性を必要としない環境において放出され失われる。

上述の不安定性は、一般に当該細胞により生成されるこ
とのない所望遺伝子生成物の合成に関しベクターとして
プラスミドを使用することにより更に高められる。この
ことは、所望遺伝子生成物が尚確実に合成され得るよう
にするためには、かかる生成物を合成する細胞を選択圧
に従わせなければならないことを意味するものである。

ある遺伝子生成物の高い発現を達成する従来の方法は、
当該遺伝子生成物に翻訳される。ＲＮＡの高濃度を生せ
しめる強いプロモーターに　って発現を制御するもので
ある。

しかし、遺伝子生成物の高濃度は、当該、ＲＮＡのより
有効な翻訳により得ることもできる。このことは、遺伝
子生成物の合成が転写および翻訳レベルの双方で制御さ
れることを意味し、これは、ある遺伝子生成物を合成す
る細胞に対する遺伝荷重が一般に１つではなく２つの活
動’（ａｃｔ　ｉｖ　ｉ　ｔｙ）に寄与し得ることを意
味するものである。

このため、２つの活動を、プロモーターが一般に使用さ
れるプロモーターはど強くないプロモーターであっても
遺伝子生成物の濃度に関して同様の結果を得ることがで
きるように操作することができる。かかる２活動の寄与
は、細胞が、遺伝子生成物合成が１の強いプロモーター
によってのみ制御される場合はど遺伝荷重されないこと
を意味する。結果として、当該細胞にだいする選択圧を
減少させることができる。

更に、所望の遺伝子生成物の合成が起こる相における細
胞のエネルギー代謝や蛋白質合成機構に対し最も合理的
な利用（ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を達成することが重
要なことである。エネルギー代謝や蛋白質合成機構のか
かる合理的利用は、遺伝子生成物の合成の早い段階を最
適化（ｏｐｔｉｍａｔｉｎｇ）するよりもむしろ遅い段
階を最適化することにより改善するのが好ましい。

このため、遺伝子発現系の重要な特徴は、所望生成物の
発現を初期の低発現から過剰生成まで、本発明の如く細
胞の外部環境を操作することにより高めることができる
。更に本発明における転写後合成段階の誘発可能な最適
化は、転写の誘発最適化よりも有利である。

酵母における遺伝子の発現に関する従来の方法では、一
連のプロモーターと発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ　ｖｅｃｔｏｒ）　（例えば、ＧＡＰＤＨ−またはｐ
ｙにイースト（Ｐｙにｙｅａｓｔ）プロモーターを使用
することが開示されている欧州特許出願公開明細書第１
２０５５１号参照）ならびにこれらプロモーターを有す
る一連の発現ベクターを使用している。

更に英国特許公開明細書第２．１３７．２０８号には、
数種の発現ベクターにおいてプロモーフ著ＧＡＬＩを使
用することが開示されている。

これら従来の既知プロモーターを使用する場合には、発
現を転写開始頻度を高めることによりのみ高めることが
できる。この結果これらプロモーターの使用は、細胞に
対し高い遺伝荷重、エネルギー代謝および合成機構の非
合理的な利用を伴い、また、これらプロモーターを使用
した場合には、宿主生物に対し高い選択圧を余儀なくさ
れる不安定性がもたらされる。

このため本発明の目的は、酵母において活性であるプロ
モーターの使用方法、並びに以下の遺伝子の発現が新規
な方法で転写後レベルにて調節を受けるリーダー配列を
提供することにある。

更に本発明の目的は、プロモーターとリーダー配列との
組み合わせを提供す、ることにある。尚、かかる組み合
わせは植物レグヘモグロビン遺伝子の５′末端領域から
得られ、また酵母において機能的であることが証明され
た。

更にまた本発明の目的は、プロモーターとリーダー配列
との前記組み合わせを有するプラスミドを提供すること
にある。

本発明は、発現されるべき遺伝子とプロモーター配列を
有する５′末端領域との双方を含有する組み倹えＤＮＡ
断片を酵母細胞に導入し、形質転換した酵母細胞を増殖
培地において培養する遺伝子の発現方法において、５′
末端領域がプロモーター配列を有する第１ＤＮＡ断片を
、ヘム、ヘム類似体またはヘム前駆体により転写後レベ
ルで調節されるリーダー配列を有する第２　ＤＮＡ断片
と組み合わせて有する断片を組み換えＤＮＡ断片として
使用することを使用する遺伝子の発現方法に関するもの
である。

本発明においては、酵母で複製可能である適当なベクタ
ーでかつ該組み合わせの下流に遺伝子を挿入することに
より、生物学的に活性な生成物の合成を達成することが
できる。また、本発明の方法では、転写後レベルで作用
力る新規な調節メカニズムにより所望遺伝子の発現を高
めることができる。特別の結果として、宿主細胞の遺伝
子菌株（ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｒａｉｎ）の減少や、宿
主細胞のエネルギー代謝および蛋白質合成機構の最適利
用が達せられ、これにより宿主細胞において発現ベクタ
ーの安定性が高められる。

本発明の方法の特別なる例においては、分離まりは合成
された第２リーダー断片と結合される、分離または合成
されたプロモーター配列を第１ＯＮ＾断片として使用す
る。この方法によれば、本発明における転写後調節を自
然条件下で受ける酵母、植物または動物からの任意リー
ダー配列を、酵母にて機能的である任意適当なる酵母プ
ロモーター、植物プロモーターまたは別のプロモーター
と組み合わせることができる。

本発明の方法の特別なる例においては、ヘムの細胞内濃
度が、ヘムの細胞内濃度を高める炭禦源、特に非発酵性
炭素源を増殖培地へ添加することにより高められる。こ
れによれば、炭素源を増殖培地へ添加することにより、
所望遺伝子の発現の誘発がなされる。かかる炭素源の例
としてはグリセロールおよびスクシネートがあり、これ
らは特に好適である。この理由は、これらが安価であり
かつ容易に人手可能な炭素源だからである。またエタノ
ールを使用することもできる。ある条件下では、酵母自
身が増殖し乍らエタノールを生成することができる。増
殖の停止後、エタノールを利用することにより翻訳が高
められる。

更に特別なる例においては、細胞内ヘム濃度が、ヘム、
ヘム類似体およびヘム前駆体から成る群から選ばれたｌ
または複数の物質を増殖培地へ添加することにより高め
られることによって、同様の効果を得ることができる。

ヘム類似体の一例としてはデュウテロポルフィリン■が
あり、またヘム前駆体の一例としてはδ−ｎアミルプリ
ン酸がある。

更にまた、本発明の方法の特別なる例においては、プロ
モーター配列とリーダー配列とを有するＤＮＡ　断片を
使用するものであって、該Ｄ＼＾断片が、自然の環境下
で発現調節を受けた植物レグヘモグロビン遺伝子、酵母
遺伝子または他の遺伝子の５′末端領域と一致するか、
これから誘導されるか若しくはこれを有するものであり
、該発現調節が細胞内ヘムにより発現または媒介される
。この方法によれば、リーダー配列とブロモ−クー配列
との組み合わせの簡単な方法が得られ、本発明において
は該組み合わせが酵母において機能的であることが証明
された。かかるＤＮＡ断面の例としては、大豆レグヘモ
グロビン遺伝子の４種の５′末端領域、すなわち以下に
示すものがある。

次の配列を有するＬｂａ　　： ＡＡＡＧＡＡＡＴＡＴ　に 次の配列を有するＬｂｃｌ　： 次の配列を有するＬｂｃ２　： 次の配列を有するＬｂｃ３　： 本発明の方法の他の例においては、次の配列、を有する
ＹＩＥＰ　Ｌｂ　ＣＡＴ遺伝子の５′末端領域と−・孜
するか、これから誘導されるか若しくはこれを有するＤ
ＮＡ断片を使用する。

更に本発明の他の例においては、組み換えプラスミドを
酵母細胞に導入することによりポリペプチドを製造する
にあたり、植物レグヘモグロビン遺伝子の５′末端領域
を有するＤＮＡ断片においてプロモーター配列とリーダ
ー配列を有するプラスミドを組み換えプラスミドとして
使用することを使用するポリペプチドの製造方法を開示
する。

本発明の方法の更に他の例においては、植物レグヘモグ
ロビン遺伝子の５′末端領域並びに３′末端領域を有す
るＤＮＡ断片においてブロモ−クー配列とリーダー配列
とを有するプラスミドを組み換えプラスミドとして使用
する方法を開示する。

更に本発明においては、本発明の方法を実施する場合に
第２　ＤＮＡ断片として使用するＤＮＡ断片を扱うにあ
たり、これは、細胞内ヘムにより発現または媒介される
調節に関して標的であるメツセンジャーＲＮＡストラン
ドに転写される短いＤＮＡ断片であることを使用する。

かかるＤＮＡ断片の例としては、植物レグヘモグロビン
遺伝子、酵母遺伝子または他の遺伝子からのリーダー配
列と一致するか、これから誘導されるか若しくはこれを
有するＤＮＡ断片がある。尚、これら遺伝子においては
、自然の環境下におけるかかるリーダー配列が１１０胞
内ヘムにより発現または媒介される調節に関する標的で
ある。本発明においては、これらの例として、大豆レグ
ヘモグロビン遺伝子からのリーダー配列、すなわち以下
に示すものと一致するか、これから誘導されるか若しく
はこれを有するＤＮＡ断片がある。

次の配列を有するＬｂａ　　： ＡＡＣＴＴＧＣＡＴＣＧＡＡＣＡＡＴＴＡＡ　　ＴＡＧ
ＡＡＡＴＡＡＣＡＧへへ人へＴＴ八へ八へへへへＡＡＡ
ＴＡＴＧ 次の配列を有するＬｂｃｌ　： ＡへＣＴＴＧ［：ＡＴＴ　　ＧＡＡＣＡＡＴＡＧＡ　　
ＡＡＡＴＡＡＣ八八Ａ　＾＾へ人ＡへＴＡ八Ａへ八八へ
人＾６＾ＡＡ　　ＡＧ＾＾ＡＴＡＴＧ次の配列を有する
Ｌｂｃ２　： ＡＡＣＴＴＧＣＡＴＴ　　ＧＡＡＣＡＡＴＡＧＡ　　Ａ
へＴへ人〇へへ〇へ　八人〇へ人へへＴへへＧＴＧＡへ
＾ＡへＡＧ　　ＡＡＡＴＡＴＧ次の配列を有するＬｂＣ
３： ＡＡＣＴＴＧＣＡＴＴ　　ＧＡＡＣＡＡＴＴＡＡ　　Ｔ
ＡＧＡＡＡＴＡＡＣＡＧＡ八＾へＧＴＡＧ＾＾＾ＡＧ＾
＾＾ＴＡＴＧ かかるＤＮＡ断片の他の例として、次の配列、ＡＡＣＴ
ＴＧＣＡＴＴ　　ＧＡＡＣＡＡＴＴＡＡ　　ＴＡＧＡＡ
ＡＴＡＡＣＡＧＡＡＡＡＧＴＡＧ＾＾ＴＴＣＴＡＡＡＡ
ＴＧ を有するＹ［ｉＰ　ＬｂＣＡＴからのリーダー配列と一
致するか、これから誘導されるか若しくはこれを有する
断片がある。

更に本発明では、本発明の方法を実施する場合に使用す
る、第１　ＤＮＡ断片と第２　ＤＮＡ断片との組み合わ
せを有するＤＮＡ断片を扱う。

これらＤＮＡ断片は、プロモーター配列とリーダー配列
とを有すること、および植物レグヘモグロビン遺伝子の
５′末端領域と一致するか、これから誘導されるか若し
くはこれを有することに特徴がある。

本発明におけるかかるＤＮＡ断片の例としては、プロモ
ーター配列とリーダー配列とを有するＤＮＡ断片であっ
て、大豆レグヘモグロビン遺伝子の５′末端領域、すな
わち以下に示す配列と一致するか、これから誘導される
か若しくはこれを有するものがある。

次の配列を有するＬｂａ　　： 次の配列を有するＬｈｃｌ　： ＴＴＣＴＣＴＴＡＡＴ　　ＡＣＡＡＴＧＧＡＧＴ　　Ｔ
ＴＴＴＧＴＴＧＡＡ　　ＣＡＴＡＣＡＴＡＣＡ　ＴＴＴ
ＡＡＡＡＡＡＡ次の配列を有するＬｂｃ２　＋ 次の配列を有すりるＬｂｃ３二 本発明のかかるＤＮＡ断片の池の例としては、次の配列
、 ＣＡＧＡＡＡＡＧＴＡ　　ＩＪＡＡ五１−五ＡＡＡＡ↓
−を有するＹＨＰ　Ｌｂ　ＣＡＴＪ伝子の５′末端領域
と一致するか、これから誘導されるか若しくはこれを有
するＤＮＡ断片がある。

更に本発明は、本発明の方法を実施する場合ｊご使用さ
れる任意プラスミドであって、既に規定した如き第１　
ＤＮＡ断片か、あるいは既に規定した如き第２ＯＮＡｌ
ｌＪｒ片と第２０＼八断片との組み合わせを有すること
を使用するプラスミドに関するものである。本発明にお
いて適当なるプラスミドはＹＥＰ　Ｌｂ　ＣＡＴおよび
ＹＥＴ　５Ｌｂ　Ｋｍである。本発明におけるプラスミ
ドは、遺伝子生成物に関し暗号づけ配列を挿入すること
により所望遺伝子の発現を高めることができる。

次に本発明を以下の例より説明する。

例１ 大豆レグヘモグロビン遺１云子の５′末端領域の配列決
定 大豆のグリシン最大の腫々のエバンス遺伝子ライブラリ
ー（ｓｏｙｂｅａｎ　ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ、ｖａｒ
、ｅｖａｎｓｇｅｎｅｌ　＋ｂｒａｒｙ）から、ネーチ
、・−第２９１　巻、第３８１７号、１６７７〜６７９
　頁（１９８１）においてイエンセン・ニー・ウー（ｊ
ｅｎｓｅｎ、　Ｅ、　　φ）氏等によって述べられてい
る如く、４つの大豆レグヘモグロビン遺伝子Ｌｂａ。

Ｌｂｃｌ、　Ｌｂｃ２およびＬｂｃ３が得られる。これ
ら４つの大豆レグヘモグロビン遺伝子の５′末端領域は
、モレキラー・バイオロジー、アルフスユニバーサイテ
ト（λＩｏｌｅｋｙｌａｅｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉ、八ｒｈ
ｕｓ　Ｌ！ｎ１ｖｅｒｓｉｔｅｔ）（１９８５）に関す
る学術集会でイエンセン・ニー・ウー氏により述べられ
ている如く分離され、また４つの５′末端領域の配列は
エフ、ジエー・モル・バイオ、　（Ｆ、　Ｊ、　Ｍｏ１
．Ｂｉｏ、）１４３．１６１　（１９８０）においてサ
ンガー（Ｓａｎｇｅｒ）氏によって述べられている如き
ジデオキシ槓停止法（ｄｉｄｅｏｘｙ　ｃｈａｉｎ−ｔ
ｒｃｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ）の使用により決
定され、配列式で示されている。

例２ ＹＥＰ　Ｌｂ　ＣＡＴの構造体作成 以下に示す如く、プロセス区分の配列において構造体作
成（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　１ｏｎ）を行った。

Ｌｂｃ３　遺伝子のザブクローニング（ｓｕｂ−ｃｌｏ
ｎｉｎｇ）Ｌｂｃ３遺伝子を１２ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　　
制限断片上で大豆ＤＮＡ　ライブラリーから分離した（
これはヌクル・７　シー）ズ―レス−（Ｎｕｃｌ、　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）１０．３４８７においてウイボル
グ氏等によって述べられている）。

この断片の区分を第１図の上部に示す。この断片は、第
１図に示す如くしかる後にｐＢＲ３２２に連結されるよ
うな状態とする酵素によって切断（ｄｉｇｅＳｔ）した
。次いで、得られたプラスミドＬｂｃ３）ＩＨおよびＬ
ｂｃ３１１ＸはＩ’ｖｕｌｌ　により切断し、再び連結
させた。

この結果、ｐＬｐＨＨおよｐＬｐＨＸと称する２つのプ
ラスミドが得られた。

この目的のため、第２図に示す如きｐＬｐＨＨを用いた
。このプラスミドをｐｖｕ［Ｉ　により開裂し、エキソ
ヌクレアーゼＢａ　１３１で処理した。反応を種々の時
間で停止し、短かくしたプラスミドをρＢＲ３２２から
断片に連結させた。これら断片を第２図に示す如く、一
端においてこれらがＤＮＡ配列、ＴＴＣ・・・ ＡＡＧ・・・ を有するように有利に処理した。

連結反応の後、ＥＣ，ＲＩでの切断が起こり、５′末端
配列を有する断片をε。。Ｒ１で切断したｐＢＲ３２２
に連結させた。これらプラスミドはイー・コリイに８０
３への形質転換をお越し、形質転換細胞におけるプラス
ミドを配列分析により試験した。形質転換細胞の１つか
ら分離したプラスミドｐ２１３５　’　Ｌｂは、配列が
以下に示すようになるように、Ｌｂ　ＡＴＧ開始コドン
の７ｂｐ前で終結する５′末端配列を有する： ｋｂ ５　′　末端・・・ＡＡＡＧＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡ＾八
八ＴＧＬｂｃ３配列 Ｌｂｃ３へ人子の３′末端領域のサブクローニングこの
目的のために、ＸｈｏＩＩ　により切断されたｐｌ、ｐ
ＨＸを使用した。特に端部を満たし、第３図に示す如（
過剰ＤＮＡを除去した。図示する断片を、図示する如く
、予備処理したρＢＲ３２２連結させた。

この構造体は、イー・コリイに８０３への形質転換を起
こした。形質転換細胞の１つはＸｈｏ２ａ−３’　Ｌｂ
と称するプラスミドを含んでいた。Ｘｈｏｌｌ認識配列
はＬｂ停止コドン直後に位置するので（第１図参照）、
このプラスミドは約９００ｂｐの３′末端領域を含んで
おり、またこの配列はＧＡＡＴＴＣＴＡＣＡ＾・・・で
開始した。

Ｌｂ　　プロモーター　カセット（ｃａｓｓｅｔｔ）の
構造体作成 Ｘｈｏ２ａ−３’　ＬｂからのεｃｏＲＩ／ＳｐＨｌ断
片を、ｐ２１３−５　’ＬｂからのＤａｍ旧／εｃｏＲ
Ｉ　断片と混合した。これら２つの断片は、Ｂａｍ旧／
Ｓｐ旧開裂点を介してｐＢＲ３２２誘導体に連結させ、
この際εｃｏＲＩ認識配列は除去される（第３図参照）
。連結したプラスミドは、−イー−、コリイに８０３へ
の形質転換を起こした。形質転換細胞の１つにおけるプ
ラスミドは正確な（ｃｏｒｒｅｃｔ）断片を有し、これ
はｐＵＪＬｂ５　’　−３’−１と称せられる。

キメラＬｂ／ＣＡＴ遺伝子の構造体作成ρＢＲ３２２の
ＣＡＴ遺伝子を第４図に示す如く、幾つかの小さな制限
断片で分離した。５′暗号づけ領域を、Ａｌｕｌ断片で
分離し、次いでこれをｐＢＲ３２２に連結し、図示する
如く処理した。これは、イー・コリイに８０３への形質
転換を起こし、また選択された形質転換細胞はＡｌｕｌ
ｌと称するプラスミドを含んでいた。３′暗号づけ領域
をＴａｑ　Ｉ断片で分離した。この断片をエキソヌクレ
アーゼＢａ１３１で処理し、しかる後にＥｃｏＲＩ　　
リンカ−を加えた。これに引き続いて、εｃｏＲ’ｌ　
による切断および１ＥｃｏＲＩ　による切断ｐＢＲ３２
２への連結反応が起こった。後者はイー・コリイに８０
３への形質転換を起こし、形質転換細胞が分析された。

プラスミド、Ｔａｑ１２は、その後次の配列、 −ＣＣＣＣＧＡＡＴＴＣ で停止するような２３ｂｐｇ’末端配列を加えたＣＡＴ
遺伝子の３′暗号づけ領域を含んでいた。この結果、次
の断片、 ＡｌｕｌｌからのＥｃｏＲＩ／Ｐｖｕ　Ｉ　Ｉ　断片、
ｐＯＲ３２２からのＰｖｕｌｌ／Ｄｄｅｌ断片およびＴ
ａｑ１２からのＤｄｅｌ／ＥｃｏＲＬ断片 をεｃｏ旧での切１ＩＪｒｌ’ＥＪｌｂ５　’　−３’
　−１′に一緒にして連結させた。これは、イー・コリ
イに８０３への形質転換を起こした。選択された形質転
換細胞は、ｐＥＪＬｂ５　’　−３’　ＣＡＴ１５と称
する正確なプラスミドを含んでいた。

酵母プラスミドにおけるキメラＬｂ／ＣＡＴａｌＥ子の
クローニング このキメラ遺伝子をρＩＥＪＬｂ５　’　−３’　ＣＡ
Ｔ１５からＤａｍｌｌ　Ｉ／Ｓｐｈ　１断片で分離し、
同様の酵素で切断される酵母プラスミドＹＥＰ２４に連
結させた。イー・コリイに８０３への形質転換の後、選
択された形質転細胞を調べた。これは第５図に示すプラ
スミドＹＥＰＬｂ　ＣＡＴを含んでいた。更にこのプラ
スミドは、酵母菌株のサツカロミセス・セレビジアより
ＢＹ７４７およびＴＭＩへの形質転換を起こした。

例３ ＹＥＰ　５Ｌｂ　Ｋｍの構造体作成 ネオマイシン　ホスホ　トランスフェラーゼ（ＮＰＴｌ
ｌ）遺伝をｐ　Ｋ　Ｍ　２から分離した（ベック氏等に
よるＧｅｎｅ　１９．３２７参照）。この遺伝子からの
５′暗号づけ領域を第６図に示す如＜５ａｕ３Ａ断片で
分離し、次いでＰ［１Ｒ３２２に連結して、５ａｕ１３
　と弥するプラスミドを得た。ＮＰＴＩＩ遺１云子から
の３′暗号づけ末端領域をＰｖｕｌｌ　断片で分離した
。これを、εｃｏＲ１／Ｐｖｕ［Ｉ　で切断したｐＥＪ
Ｌｂ５　’−３’−１に連結される５ａｕ１３からのＥ
ｃｏＲＩ／Ｐｖｕｌ　ｌ　　と−緒にした。イー・コリ
イに８０３　　への形質転換の際、正確なプラスミドｐ
ＥＪＬｂ５　’　Ｋ＋＋＋１を有する形質転換細胞を選
択した。このプラスミドは、完全な５′末端領域Ｌｂ配
列＋暗号づけＮＰＴＩ＋配列がＢａｍｆｌｌ／Ｐｖｕｌ
ｌ　断片で存するようにＢａｍ１ｌｌ　により、特にｐ
ｖｕｌｌ　により、後になって切断された。この断片を
、［ｌａｍＨＩ／ＰｖｕｒＩで切断したＹＥＰ２４に連
結させ、第７図に示すプラスミドＹＥＰ　５Ｌｂ　Ｋｍ
を得た。このプラスミドは、酵母菌株のサツカロミセス
・セレビジアエＴｍｌへの形質転換を起こした。

氾 ＣＡＴの発現に対する炭素源の作用 プラスミドＹεＰ　Ｌｂ　ＣＡＴを含有するサツカロミ
セス・セレビジアエ０ＢＹ７４７を、２％の炭素源を加
えた最小培地で増殖させた。細胞を、１ｍｆ当り５×１
０６個の細胞密度で採取した。ＣＡＴ活性を、ネーチャ
ー３０６．５５７（１９８３）においてワルカー（ｌν
ａｌｋｅｒ）、エドルンド（Ｅｄｌａｎｄ）、ボウレト
（口ｏｕｌｅｔ）およびルター（Ｒｕｔｔｅｒ）氏によ
って述べられているようにして測定した。

以下の第２表に、ＣＡＴ活性を炭素源の機能として示す
。スクシネートおよびグリセロールで増殖させることに
より得られた最高活性を特に１００％とした。

第２表 炭素源　　　　　　活性 スクシネート　　　　１００ グリセロール　　　　１００ グリコース　　　　　　２８ スクロース　　　　　　１８ 例５ 遺伝子発現の透発に対するヘム前駆体およびヘム類似体
の作用 プラスミドＹεＰ　Ｌｂ　ＣＡＴ含有サツカロミセス　
セレビシエアエＴλ１１を、２％のグルコースと、０．
１％のツイーン（Ｔ＋ｙｅｅｎ　；登録商標）と、２０
μｇ　／　１ｍｅのエルゴステロールと、５０μｇ／ｍ
ｅのメチオニンと、以下に示すヘム類似体またはヘム前
駆体の１つとを加えた最小培地にて増殖させた。デュウ
テロポルフィリンＩＸ（ｄｐ）とプロトポルフィリン（
ｐｐ）とを夫々最終濃度５μｇ／ｍＥに添加した。まて
ヘミンを最終濃度５μｇ／ｍｆに添加した。更にまた、
δ−アミノレブリン酸（δ−糺八へを最、１１．６度５
０μｇ／ｍｇに添加した。

以下の第３表において、ＣＡＴ活性を、夫々ヘム前駆体
およびヘム類似体の活性として示した。δ−ＡＬＡまた
はｄｐを添加することにより得られた最高活性を特に１
００％として示した。

第３表 インデューサー　　　　　ＣＡＴ活性 グルコース＋δ−ＡＬＡ　　　　　１００グルコース＋
ｄｐ　　　　　　　１００グルコース十〇ｐ　　　　　
　　５０ グルコース十ヘミン　　　　２５ グルコース　　　　　　　　　５ 例６ リーダー配列におけるリンカ−の挿入 ２つの合成ＯＮＡ　ＩＪンカーを挿入した。尚、１つは
酵累Ｂｇｌｌｌの認識配列を有する開始コドンの直前で
あり、またもう一つはＫｐｎ　Ｉに関する認識配列を有
するＣＡＴ付加部位の上流である（以下の第４表参照）
。この場合、新しい構造体ｐＥＪ５　’　−３’−ＣＡ
ＴＩＯＩは初期の構造体に匹敵する。

これら２つの構造体からの発現の比較を以下に示す（例
５の如く試験した）。

第５表 グルコース　　グルコース＋ヘム　誘発（ｉｎｄｕｃｔ
ｉｏｎ）ＣへＴ１５　　０．１１　　　　　　　　　６
．０１　　　　　　　　　　　　　５５　　ＸＣＡＴＩ
ＯＩ　Ｏ，２２１，７２８Ｘ この表は、反応したクロロアンフェニコール（ｃｈｌｏ
ｒｏａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）ｎ　ｍｏｌ／蛋白質ｍｇ／
分を示す。

これは、５′領域における２つの特別なる変化によりヘ
ム誘発において５５Ｘから８×までの低下が生じたこと
を示している。

例７ 全Ｌｂｃ３５　’領域を、ＢａｍＨＴおよびＢｇｌ［Ｉ
で切断することによりＣＡＴＩＯＩから除去した。代わ
りに、プロモーターとリーダー配列を有するＩＬＶＩ遺
伝子からの７６５ｂｐのＯＮ＾断片を挿入した。この構
造体をｐＢＪ　ＣへＴ−ＢＤとｆ示する。

別の構造体においては、リーダー配列を残して１、ｂｃ
プロモーターを除去した。これは、Ｂａｍ１ｌ！および
ＫｐｎｌでＣＡＴＩＯＩを切断することにより行った。

この断片を、リーダー配列ではなく、Ｉ　Ｌ　Ｖ　ｌか
らの６７０ｂｐの断片、プロモーターによって置き換え
た。

このプラスミドをＰＩＥＪＣＡＴ−ＫＮと称する。

かかる構造体を図式的に以下に示す。

配列の比較を以下の第６表に示す。

発現試験 グルコース　　　グルコース＋ヘム　　誘発ＣへＴ−ロ
Ｄ　　１０８９　　　　　　　　　　　１１６２　　　
　　　　　　　　なしＣＡＴ−ＫＮ　　、７８９　　　
　　　　　　　　　１５８０　　　　　　　　　　　２
　　Ｘ前記試験と同じユニット ２つの構造体の間の唯一の違いはリーダー配列の起ａ（
ｏｒｉｇｉｎ）である。この結果は、Ｌｂｃ３リーダー
配列が誘発に必要であることを示している。しかし、誘
発レベルは出発材料がＣＡＴＩＯＩにおける場合はど高
（ない。この理由は、構造体がＡＴＧにより近接する１
３のヌクレオチドを起源とし、このため誘発に重要であ
るｍＲＮＡの１３のヌクレオチドが短いからである。

すべての試験は、ヘム誘発がＬｂｃ　ＩＪ−グー配列に
関係していることを明らかに示している。

本発明は、大豆のレグヘモグロビン遺伝子のみを用いる
ものではない。すべてのマメ科の植物のレグヘモグロビ
ン遺伝子が同様の活性を有することは良く知られている
（アムステルダムオックスフォードのノースーホランド
社出版によるザ・バイオロジー・オブ・ニトロジエン・
フィクゼイション、クイスペル・ニー・におけるアブレ
ビイ（１９７４）、第４９９５５４頁参照）。更にまた
、インゲン豆のＰｖＬｂｌの遺伝子に関し、顕著な程度
の相同が大豆のＬｂｃ３の配列との間に存在することが
証明された。従って本発明は、すべての植物からのレグ
ヘモグロビン遺伝子の５′末端領域の使用を包含するも
のである。

また本発明にふいては、本発明における前述の新規な調
節活性を自然の条件下で発現または媒介する、植物、動
物または酵母からのかがる断片をも使用することができ
る。特に本発明は、大豆レグヘモグロビン遺伝子の５′
末端領域からの標識づけした配列でハイブリッド形成す
ることにより遺伝子ライブラリーからのＯＮ八へ片から
分離することのできるかかる遺伝子に適用される。

プロモーターの活性および調節性の変動を生ぜしめる５
′末端領域なしに、該領域の不可欠ではないサブ領域に
おいてヌクレオチド配列を変えることができることは良
（知られていることである。

また、５′末端領域の重要なサブ領域の配列を変えるこ
とにより、ヌクレオチド配列と、転写開始および翻訳開
始に必要なファクターまたはエフアクタ−物質との間の
結合親和性を変えることができ、これによりプロモータ
ーの活性および／または調節性を改善することができる
ことも良く知られていることである。また本発明は、５
′末端領域のかかる変化した配列の使用をカバーするこ
とは勿論のことである。特に、かかる断片の使用により
所望遺伝子生成物の発現が本発明における新規な調節の
主因となす場合には、自然の長さを超えて延びるリーダ
ー配列を使用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｌｂｃ遺伝子のサブクローニングを示す工程
図、 第２図は、Ｌｂｃ３遺伝子からの５′末端領域のサブク
ローニングを示す工程図、 第３図は、Ｌｂｃ３遺伝子からの３′末端領域のサブク
ローニングを示す工程図、 第４図は、キメラＬｂ／ＣＡＴ遺伝子の構造体作成を示
す工程図、 第５図は、プラスミドＹＥＰ　Ｌｂ　（：ＡＴを示す略
図、第６図は、ＹＥＰ　５Ｌｂ　Ｋｍの構造体作成を示
す工程図、 第７図は、プラスミドＹＥＰ　５Ｌｂ　ＣＡＴを示す略
図である。 特許出頼人　　　アクチェセルスカベット・デ・ダンス
ケ・スケルフアプリケール 第３ ３°和蟲Ａｌ族 図 しＢブ’ｏｔ−ダーｎｔ・ント 手　続　補　正　１ｉｉｔ（方式） 昭和６２年　２月２４日 特許庁長官　　黒　　１）　明　　雄　殿１、事件の表
示 昭和６１年特　許　願第２５３５３０号２、発明の名称 遺伝子の発現方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　　７クチエセルスカベツト・デ・ダンスケ・ス
ケルフアプリケール ４、代　理　人 ６、補正の対象 °　　、

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、発現されるべき遺伝子とプロモーター配列を有する
   ５′末端領域との双方を含有する組み換えＤＮＡ断片を
   酵母細胞に導入し、形質転換した酵母細胞を増殖培地に
   おいて培養する遺伝子の発現方法において、５′末端領
   域がプロモーター配列を有する第１ＤＮＡ断片を、ヘム
   、ヘム類似体またはヘム前駆体により転写後レベルで調
   節されるリーダー配列を有する第２ＤＮＡ断片と組み合
   わせて有する断片を組み換えＤＮＡ断片として使用する
   ことを特徴とする遺伝子の発現方法。 ２、第２ＤＮＡ断片との組合せに関し、分離または合成
   されたプロモーター配列を第１ＤＮＡ断片として使用す
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、第１ＤＮＡ断片との組み合わせに関し、分離または
   合成されたリーダー配列を第２ＤＮＡ断片として使用す
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、ヘムの細胞内濃度を高める炭素源を増殖培地に添加
   することにより、ヘムの細胞内濃度を高める特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ５、炭素源をグリセロール、スクシネートおよびエタノ
   ールから成る群から選択する特許請求の範囲第４項記載
   の方法。 ６、ヘム、ヘム類似体およびヘム前駆体から成る群から
   選ばれた１または複数の物質を増殖培地に添加すること
   によりヘムの細胞内濃度を高める特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ７、ヘム類似体としてデュテロポルフィリンIXを使用し
   、かつ／またはヘム前駆体としてδ−アミノレブリン酸
   を使用する特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、プロモーター配列とリーダー配列とを有するＤＮＡ
   断片を使用し、該ＤＮＡ断片が、細胞内ヘムにより発現
   または媒介される発現調節を自然の条件下で受けた植物
   レグヘモグロビン遺伝子、酵母遺伝子または池の遺伝子
   の５′末端領域と一致するか、これから誘導されるか若
   しくはこれを有する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ９、大豆のレグヘモグロビン遺伝子の５′末端領域と一
   致するか、これから誘導されるか若しくはこれを有する
   ＤＮＡ断片を使用する特許請求の範囲第８項記載の方法
   。 １０、次の配列、 【遺伝子配列があります】 を有するＬｂａ遺伝子の５′末端領域と一致するか、こ
   れから誘導されるか若しくはこれを有するＤＮＡ断片を
   使用する特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１、次の配列、 【遺伝子配列があります】 を有するＬｂｃｌ遺伝子の５′末端領域と一致するか、
   これから誘導されるか若しくはこれを有するＤＮＡ断片
   を使用する特許請求の範囲第９項記載の方法。 １２、次の配列、 【遺伝子配列があります】 を有するＬｂｃ２遺伝子の５′末端領域と一致するか、
   これから誘導されるか若しくはこれを有するＤＮＡ断片
   を使用する特許請求の範囲第９項記載の方法。 １３、次の配列、 【遺伝子配列があります】 を有するＬｂｃ３遺伝子の５′末端領域と一致するか、
   これから誘導されるか若しくはこれを有するＤＮＡ断片
   を使用する特許請求の範囲第９項記載の方法。 １４、次の配列、 【遺伝子配列があります】 を有するＹＥＰ　Ｌｂ　ＣＡＴ遺伝子の５′末端領域と
   一致するか、これから誘導されるか若しくはこれを有す
   るＤＮＡ断片を使用する特許請求の範囲第９項記載の方
   法。 １５、組み換えプラスミドを酵母細胞に導入することに
   よりポリペプチドを製造するにあたり、植物のレグヘモ
   グロビン遺伝子の５′末端領域を有するＤＮＡ断片にお
   いてプロモーター配列とリーダー配列とを有するプラス
   ミドを組み換えプラスミドとして使用する特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 １６、植物レグヘモグロビン遺伝子の５′末端領域並び
   に３′末端領域を有するＤＮＡ断片においてプロモータ
   ー配列とリーダー配列とを有するプラスミドを組み換え
   プラスミドとして使用する特許請求の範囲第１５項記載
   の方法。 １７、特許請求の範囲第１〜７項記載の方法を実施する
   場合に使用するリーダー配列を有するＤＮＡ断片におい
   て、細胞内ヘムにより発現または媒介される調節に関し
   て標的であるｍＲＮＡストランドに転写される短いＤＮ
   Ａ断片であることを特徴とするＤＮＡ断片。 １８、自然の条件下でリーダー配列が細胞内ヘムにより
   発現または媒介される調節に関し標的である植物レグヘ
   モグロビン遺伝子、酵母遺伝子または他の遺伝子からの
   リーダー配列と一致するか、これから誘導されるか若し
   くはこれを有する特許請求の範囲第１７項記載のＤＮＡ
   断片。 １９、大豆のレグヘモグロビン遺伝子からのリーダー配
   列と一致するか、これから誘導されるか若しくはこれを
   有する特許請求の範囲第１８項記載のＤＮＡ断片。 ２０、次の配列、 【遺伝子配列があります】 を有するＬｂａ遺伝子からのリーダー配列と一致するか
   、これから誘導されるか若しくはこれを有する特許請求
   の範囲第１９項記載のＤＮＡ断片。 ２１、次の配列、 【遺伝子配列があります】 を有するＬｂｃｌからのリーダー配列と一致するか、こ
   れから誘導されるか若しくはこれを有する特許請求の範
   囲第１９項記載のＤＮＡ断片。 ２２、次の配列、 を有するＬｂｃ２遺伝子からのリーダー配列と一致する
   か、これから誘導されるか若しくはこれを有する特許請
   求の範囲第１９項記載のＤＮＡ断片。 ２３、次の配列、 【遺伝子配列があります】 を有するＬｂｃ３遺伝子からのリーダー配列と一致する
   か、これから誘導されるか若しくはこれを有する特許請
   求の範囲第１９項記載のＤＮＡ断片。 ２４、次の配列、 【遺伝子配列があります】 を有するＹＥＰ　Ｌｂ　ＣＡＴ遺伝子からのリーダー配
   列と一致するか、これから誘導されるか若しくはこれを
   有する特許請求の範囲第１９項記載のＤＮＡ断片。 ２５、プロモーター配列とリーダー配列とを有し、かつ
   植物レグヘモグロビン遺伝子の５′末端領域と一致する
   か、これから誘導されるか若しくはこれを有する特許請
   求の範囲第１、４、５、６、７または８項記載のＤＮＡ
   断片。 ２６、プロモーター配列とリーダー配列とを有し、かつ
   大豆のレグヘモグロビン遺伝子の５′末端領域と一致す
   るか、これから誘導されるか若しくはこれを有する特許
   請求の範囲第１、４、５、６、７、８または９項記載の
   ＤＮＡ断片。 ２７、特許請求の範囲第１０項記載の方法を実施する場
   合に使用するＤＮＡ断片において、次の配列、 【遺伝子配列があります】 を有するＬｂａ遺伝子の５′末端領域と一致するか、こ
   れから誘導されるか若しくはこれを有することを特徴と
   するＤＮＡ断片。 ２８、特許請求の範囲第１１項記載の方法を実施する場
   合に使用するＤＮＡ断片において、次の配列、 【遺伝子配列があります】 を有するＬｂｃ１遺伝子の５′末端領域と一致するか、
   これから誘導されるか若しくはこれを有することを特徴
   とするＤＮＡ断片。 ２９、特許請求の範囲第１２項記載の方法を実施する場
   合に使用するＤＮＡ断片において、次の配列、 【遺伝子配列があります】 を有するＬｂｃ２遺伝子の５′末端領域と一致するか、
   これから誘導されるか若しくはこれを有することを特徴
   とするＤＮＡ断片。 ３０、特許請求の範囲第１３項記載の方法を実施する場
   合に使用するＤＮＡ断片において、次の配列、 【遺伝子配列があります】 を有するＬｂｃ３遺伝子の５′末端領域と一致するか、
   これから誘導されるか若しくはこれを有することを特徴
   とするＤＮＡ断片。 ３１、特許請求の範囲第１４項記載の方法を実施する場
   合に使用するＤＮＡ断片において、次の配列、 【遺伝子配列があります】 を有するＹＥＰ　Ｌｂ　ＣＡＴ遺伝子の５′末端領域と
   一致するか、これから誘導されるか若しくはこれを有す
   ることを特徴とするＤＮＡ断片。 ３２、特許請求の範囲第１〜１６項記載の方法を実施す
   る場合に使用することのできるプラスミドにおいて、特
   許請求の範囲第１７〜２４項のうちいずれか一項記載の
   第１ＤＮＡ断片、または特許請求の範囲第２５〜３１項
   のうちいずれか一項記載のＤＮＡ断片を有することを特
   徴とするプラスミド。 ３３、ＹＥＴ　Ｌｂ　ＣＡＴである特許請求の範囲第３
   ２項記載のプラスミド。 ３４、ＹＥＴ　５Ｌｂ　Ｋｍである特許請求の範囲第３
   ２項記載のプラスミド。