JP2995070B2 - 水素細菌由来チトクロームｃ遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は高度好熱性絶対独立栄養性水素細菌であるヒ
ドロゲノバクター サーモフィラス（Hydrogenobacter
thermophilus）由来のチトクロームＣ−552蛋白質をコ
ードする遺伝子および該遺伝子を用いたＣ−552の製造
方法に関するものである。

（従来の技術） チトクロームＣは生体内でチトクロームオキシダー
ゼ、レダクターゼなどの酸化還元酵素と速やかに電子の
やりとりをしている。この電子の授受はヘム鉄の酸化還
元反応に基づいている。最近、チトクロームＣを中心と
した金属蛋白質について、こうした電子移動反応を応用
的に発展させる研究が始まっている（例えば、J.Romisc
h et al.,Eur.J.Biochem.,164,111,1987）。その将来的
な展望は生物の素材、素子をまねた新素材、すなわちバ
イオチップの開発である。従来の半導体素子では得られ
なかった生物学的な新しい機能が期待されているのであ
るが、たとえば、生体分子機能を有する触媒電極の作製
が期待されている。現時点では溶液中でチトクロームＣ
を金属電極表面に並べて電子伝達を行う研究がなされて
いる（H.A.O.Hill et al.J.Electroanal.Chem.,217,14
1,1987）。この電子伝達にはヘムｃ近傍のリジン残基の
正電荷が重要であるといわれている（M.J.Eddowes,J.A
m.Chem.Soc.,101,7113,1979）。

Ｃ−552は、アミノ酸配列の結果からリジン残基を多
く含み、さらに蛋白質全般からみても特異的に等電点が
高いことから、それらのリジン残基の多くは分子表面に
位置すると思われる（Y.Sanbongi et al.J.Bacteriol.1
71,65,1989）。こうした理由から、Ｃ−552は電子伝達
を効率よく行うことができ、電極素子として用いる上で
優れている。またＣ−552は報告されているチトクロー
ムＣの中で最も低分子量であることから、電極表面に接
触する密度も高くなる点も優れた点である。さらに、通
常のチトクロームＣは80℃前後で変性するが、Ｃ−552
はきわめて熱安定性が高く120℃でも変性しない。この
点は他のチトクロームＣにはない優れた特徴である（Y.
Sanbongi et al.J.Bacteriol.171,65,1989）。

またウマ由来のチトクロームＣは、心筋梗塞、脳出血
などの脳血管障害、一酸化炭素中毒症、肺疾患による呼
吸困難などの組織酸素欠乏状態に起因する諸症状の改善
に対して有効である。Ｃ−552は分子量が小さく、安定
性が優れていることから医薬としても優れていると思わ
れる。

Ｃ−552は、ヒドロゲノバクター サーモフィラスの
細胞のペリプラズム画分に存在する蛋白質で、その発現
レベルはかなり大きいと推定されている（Y.Sanbongi e
t al.J.Bacteriol.171,65,1989）。したがって、Ｃ−55
2の発現を制御しているプロモーター、ターミネータ
ー、シグナルペプチドは、効率よく機能していると考え
られ、これらの構造を知ることも有意義である。

また、Ｃ−552は食品等の変異原性を低下せしめるた
めにも有用である。食品、特にコーヒー飲料は突然変異
原性を有する場合があり、その突然変異原性は、ペルオ
キシダーゼを添加することにより消失させることができ
る（特開昭60−62945号）。しかし、従来知られている
ペルオキシダーゼでは、耐熱性が不十分であり、高温
（例えば、80℃以上）において、または長い時間（例え
ば、24時間以上）において活性を保持できるものは知ら
れていないので、コーヒー飲料の製造に用いる場合、実
用上の問題があった。

一方、チトクロームＣには、ペルオキシダーゼ活性が
あることが知られている。本発明における水素細菌チト
クロームＣは、前述のように、極めて熱に対して安定性
を有し、かつ、ペルオキシダーゼ活性を高温で、長時間
保持することができる。従って、コーヒー飲料の変異原
性を消失させるうえで、本発明におけるチトクロームＣ
を用いることは非常に有用である。

また、過酸化水素は、細胞毒性や発癌性を有すること
が既に知られている。これに本発明におけるチトクロー
ムＣを用いれば、過酸化水素を通常よりも過酷な条件下
で長時間処理することにより分解し続けられるので、細
胞毒性や発癌性の低減に有用である。

以上に述べたようにＣ−552は、優れた物性を持った
蛋白質であるが、ヒドロゲノバクター サーモフィラス
は、水素を理由する絶対独立栄養細菌であり、培養は水
素、酸素、二酸化炭素の混合ガスを培地中に通気し、約
70℃で培養する。本菌は有機物を資化せず、代わりに水
素を必要とするが、水素ガスは引火性の強いガスである
ので大量に培養するのは危険を伴う。また、70℃を維持
するのはコストが高くつく。一方、Ｃ−552遺伝子を
得、組換えDNAの手法により培養の容易な宿主中で発現
させることによりＣ−552を発現できれば、有用なＣ−5
52をよりたやすく、大量に得ることが出来る。Ｃ−552
のアミノ酸配列は前述のように公知ではあるが、１）原
核生物のチトクロームＣ遺伝子には、蛋白質をコードす
る配列の他にシグナルペプチドのコード配列があり、チ
トクロームＣの生合成に重要な役割を担っているが、Ｃ
−552のアミノ酸配列からこのシグナルペプチドの配列
を予想することはできず、遺伝子の塩基配列を決定する
ことが必須である、２）蛋白質のアミノ酸配列の分析結
果にはしばしば誤りがありうるので、Ｃ−552の遺伝子
の塩基配列を決定して初めて、正確な構造を知ることが
出来る、３）アミノ酸配列から遺伝子の塩基配列を類推
することができるが、コドンの縮重の問題から遺伝子の
配列を１通りに決定できず、人為的に合成したDNA配列
ではしばしば発現に不都合を生じる、といった問題を解
決するためにはＣ−552の遺伝子を得て、その塩基配列
を決定する必要がある。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、Ｃ−552遺伝子および該遺伝子を有するプ
ラスミド、該プラスミドにより形質転換された組換え宿
主細胞、及び該宿主細胞を培養してＣ−552を製造する
方法を提供する。

Ｃ−552はシグナルペプチドをともなって生合成され
るので、本発明によればこのシグナルペプチドも一緒に
用いて酵母や大腸菌等の大量培養に適する宿主中で蛋白
質の分泌生産を行うことが可能である。Ｃ−552は菌体
の中でかなり高いレベルで発現していると思われ、高発
現を担っているＣ−552のプロモーター領域やターミネ
ーター領域の構造も有用であろう。とくにこれらのシグ
ナルペプチドやプロモーターは高温で正常に機能すると
いう特徴を持っている。従って、これらは例えば高温で
生育する生物で蛋白質を発現させるときに有用であろ
う。

また原核生物のチトクロームＣのアミノ酸配列は真核
生物のチトクロームＣのアミノ酸配列とは相同性が低
く、多様性に富んでいる（Dickerson,Scientific Ameri
can,242,137,1980）。Ｃ−552は原核生物の典型的なチ
トクロームＣであり、Ｃ−552が発現すれば他の原核生
物のチトクロームＣも発現すると思われる。このような
チトクロームＣの例として、硫酸還元菌のチトクローム
C3が挙げられる。

以上に述べたことを目的として、Ｃ−552遺伝子のク
ローニングと構造解析、及び酵母および大腸菌での発現
を行った。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、遺伝子組換えDNA技術を用いてＣ−552
の遺伝子を単離し、構造遺伝子、シグナル配列、プロモ
ーター、およびターミネーター領域の塩基配列を決定し
た。

すなわち、本発明は、ヒドロゲノバクター サーモフ
ィラスＣ−552をコードしているDNA配列、そのシグナル
配列、プロモーター、ターミネーターの配列、これらを
含有するプラスミド及び該プラスミドにより形質転換さ
れた宿主細胞を提供するものである。それらの配列は後
に詳述する各図面に記載されている。なお、本明細書中
でアミノ酸配列または塩基配列に関して、「実質的に同
一な配列」という表現を用いた場合は、自然界で通常起
こりうる、表現型に影響を及ぼさない程度のアミノ酸の
置換、削除および／または挿入を含む変異配列を意味す
る。

Ｃ−552蛋白質をコードする遺伝子は例えば次のよう
にして得ることが出来る。すなわち、既に知られている
蛋白質のアミノ酸配列から推察される遺伝子の塩基配列
に基づきオリゴヌクレオチドを２つ合成し、これをプロ
ーブとしてＣ−552の遺伝子のクローニングを行った。
ヒドロゲノバクター サーモフィラス菌体より得た染色
体DNAをいくつかの制限酵素で消化後、サザンブロッテ
ィングし、合成オリゴヌクレオチドを用いてハイブリダ
イゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの結
果、プローブは染色体DNAを制限酵素Hind IIIで消化し
て得られた2.5kbのDNA断片と強くハイブリダイズした。
この断片を回収後、pBR327のHind III部位にサブクロー
ニングし、大腸菌を形質転換した。形質転換株からプラ
スミドを得て、先ほどのプローブを用いて同様にハイブ
リダイゼーションを行い、プローブとハイブリダイズす
るDNAをもつ形質転換株を得た。

この形質転換株は、Hind IIIで切り出される2.5kbのD
NAを含むプラスミドを持っていた。このプラスミドの制
限酵素処理とその消化物のサザンハイブリダイゼーショ
ンを繰り返した結果、合成した２種のプローブはAcc I
とPst Iで切り出される1.1kbのDNA断片とハイブリダイ
ズした。この断片を大腸菌でのクローニング用プラスミ
ドpUC19（宝酒造）のPst I、Acc I部位にサブクローニ
ングしたプラスミドを調製し、このプラスミドを鋳型
に、合成ヌクレオチドをプライマーとして用いて塩基配
列の決定を行った。その結果、Ｃ−552の翻訳領域、シ
グナル配列、プロモーター、ターミネーター領域の塩基
配列が明らかになった（第2A図〜第2E図を参照）。

次に、Ｃ−552の酵母での発現を行った。発現用ベク
ターに組み込むため、Ｃ−552遺伝子の終止コドン（第2
A図の472〜474番目のTAA）の直後に、部位特異的に変異
をおこさしめる方法にて制限酵素Sal I部位を作製し、
さらに、開始コドン（第2A図の178〜180番目のATG）の
直前に制限酵素EcoR I部位を作製するか、またはシグナ
ル配列（第2A図の178番目のＡ〜231番目のＣ）の直後に
EcoR I部位と開始コドンATGを同様の方法にて作製し
た。こうして用意された２種の変異DNAの一方は、挿入
された二つの制限部位の間にｃ−552の翻訳領域を有
し、そして他方は該領域をそのシグナル配列とともに有
している。これら２種のDNAからEcoR IとSal Iで切り出
されるDNA断片を酵母の発現ベクターにつなぎこんだ。
このプラスミドを、イソー１ チトクロームＣ遺伝子CY
Clを欠損しているために乳酸を炭素源にして増殖できな
い酵母の株XS−30−2BΔCYClに導入したところ、何れの
変異DNAで形質転換した酵母も乳酸を炭素源として生育
するようになった。これは、Ｃ−552が酵母のイソー１
チトクロームＣの代わりに酵母の電子伝達系で機能し
たことを示している。換言すれば、Ｃ−552がヘムｃを
持つ形で酵母内で発現したことになる。酵母が、原核生
物のしかも分子量が異なり、アミノ酸配列の相同性の低
いＣ−552を発現できたことは予想外のことである。酵
母はＣ−552のみならず、原核生物、真核生物のあらゆ
るチトクロームＣ（例えばチトクロームC3,チトクロー
ムC2を発現できると予想される。

また、前述のＣ−552をコードしているDNAを大腸菌の
発現ベクターにつなぎ、大腸菌を形質転換したうち、
「シグナルペプチドをもたないＣ−552をコードしてい
るDNAを有する」形質転換株は、Ｃ−552を発現してお
り、この形質転換株から得た組換えＣ−552蛋白質は、
ヒドロゲノバクター サーモフィラス由来のＣ−552と
同様の優れた性質を有していた。

ここで決定した塩基配列を利用すれば、組換えＣ−55
2を製造したり、あるいは、プロモーターなどを利用し
て高温で蛋白質を生産したりできる。また組換え酵母を
培養することにより、優れた特徴を持つＣ−552を大量
に、容易に得ることができる。以下に本発明を実施例に
基づいて詳細に説明する。実験の手順は特に記述しない
限り、ManiatisらのMolecular Cloning（Cold Spring H
arbor,1982）によった。

実施例１ ヒドロゲノバクター サーモフィラスＣ−55
2遺伝子のクローニング （１）ヌクレオチドプローブの合成 既に決定したＣ−552のアミノ酸配列のうち、７番目
から15番目までのアミノ酸配列、Gln−Lys−Gly−Cys−
Met−Ala−Cys−His−Asp−に基づいてオリゴヌクレオ
チドを合成した。第１図に示したような２本の17マーの
オリゴヌクレオチド、プローブ１（５′TGTATGGCNTGTCA
TGA3′）、プローブ２（５′CAGAAGGGNTGTATGGC3′）を
ベックマン社のDNA合成装置System−１により合成し
た。ここでＮはG,A,T,Cの４種のうちのいずれかの塩基
を意味する。合成したヌクレオチドはベックマン社の推
奨する方法で精製した。

（２）ヒドロゲノバクター サーモフィラスの染色体DN
Aの調製 本菌の染色体DNAを以下のようにして精製した。培養
した菌体2gを20mlのSTE緩衝液（20％サッカロース,10mM
Tris−HCl pH8.0、1mMEDTA）に懸濁後、80mgのリゾ
チームを加えて37℃で10分間保持した。これに終濃度50
μg/mlになるようにプロテイナーゼＫを添加し、37℃で
30分間保持した。次に10％SDSを終濃度0.5％になるよう
に添加し、さらにプロテイナーゼＫを100μg/mlになる
ように加えた後、37℃で30分間保持した。さらに10％SD
Sを終濃度２％になるように添加した後、50℃で60分間
保持した。

この液に等量のフェノール／クロロフォルム（Maniat
is,Molecular Cloning）を加え、穏やかにかくはんした
後に遠心分離し、上層を回収した。この操作を３回繰り
返した。これに倍量のエタノールを加えて、遠心してDN
Aを沈澱として回収した。

このDNAを10mlのTE緩衝液（10mM Tris−HCl pH8.
0、1mM EDTA）に懸濁し、RNaseを終濃度20μg/mlにな
るように添加し、37℃で30分間保持した後、TE緩衝液に
透析して、染色体DNA溶液として以下の実験に用いた。

（３）サザンハイブリダイゼーション 常法によりサザンハイブリダイゼーションを行った。
得られた染色体DNA断片を制限酵素Hind IIIで消化後、
アガロースゲル電気泳動を行い、ナイロンメンブレンHy
bond−Ｎ（アマシャム社）にサザンブロットした。ブロ
ットしたメンブレンを｛γ−³²P｝ATPでラベルしたプロ
ーブ1,2を用いてハイブリダイゼーションを行った。ハ
イブリダイゼーションしたメンブレンをフィルムに感光
させ、オートラジオグラムを得た。

オートラジオグラムの結果、2.5kbの断片と両プロー
ブが特異的にハイブリダイズしたことが分かった。従っ
て、Ｃ−552の遺伝子はこのDNA断片中に存在しているこ
とが分かった。

（４）サブクローニング 2.5kbのHind III消化断片を含むアガロースゲル部分
を切り出し、常法によりDNAを回収した。

他方、大腸菌のベクターとして広く用いられているpB
R327をHind IIIで消化後、常法に従ってアルカリフォス
ファターゼ処理し、フェノール／クロロフォルム抽出を
行った。このDNA断片と先ほどの2.5kbのDNA断片を常法
どおりライゲースにより結合させ、大腸菌HB101株を形
質転換した。159株の形質転換株が得られたので、先述
のプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションの
手法にて、スクリーニングを行った。その結果、11個の
陽性クローンを得た。

11個の陽性クローンを2ml培養し、常法に従いプラス
ミドDNAを得た。このDNAをHind IIIで消化後、サザンハ
イブリダイゼーションを行った。その結果２種のプロー
ブとハイブリダイズする１つのプラスミドを得て、pT13
5とした。pT135を用いて、制限酵素消化とサザンハイブ
リダイゼーションを繰り返した結果、1.1kbのAcc I−Ps
t I断片が両プローブとハイブリダイズした。

このDNA断片をAcc IとPst Iで消化したpUC19とライゲ
ーションし、大腸菌HB101を形質転換した。得られたプ
ラスミドをpUHTC135とした。

なお、該プラスミドにより形質転換された大腸菌はEs
cherichia coli SAM 1306と命名され、工業技術院微生
物工業技術研究所に微工研菌寄第10546号（FERM P−105
46）として寄託されたが、平成２年２月１日にブタペス
ト条約上の寄託に移管され、FERM BP−2748の寄託番号
が付与された。

（５）塩基配列の決定 プラスミドpUHTC135を常法どおり得た。このプラスミ
ドを鋳型にして、スクリーニングに用いたプローブ２お
よびリバースプライマー（宝酒造）をプライマーにし
て、２本鎖ダイデオキシシークエンス法を行い、Ｃ−55
2の遺伝子配列を決定した。２本鎖ダイデオキシシーク
エンス法の詳細は例えば高浪らの続生化学実験講座、遺
伝子研究法Ｉ（東京化学同人）に示されている。決定で
きた塩基配列中（第2A図）には、Ｃ−552のシグナルペ
プチドをコードする領域、プロモーター領域およびター
ミネーター領域も含まれていた。

シグナル領域も含めた翻訳領域は、開始コドンATG
（第2A図、178〜180番目）から翻訳が始まり終止コドン
TAA（第2A図、472〜474番目）で翻訳が終了する、98ア
ミノ酸をコードしていた。すでに決定されているＣ−55
2のアミノ酸配列は19番目のアスバラギン（第2A図中、
Ｎで示されている）から始まっており、このアスパラギ
ン以後の配列はＣ−552の配列と完全に一致した（第2D
図）。アミノ末端より前の18番目までのアミノ酸配列は
Ｃ−552には含まれない配列で、Ｃ−552が細胞のペリプ
ラズマ画分に存在することから、Ｃ−552をペリプラズ
マ画分に移行させるためのシグナルペプチドとして機能
しているものと考えられる（第2C図）。また翻訳領域の
GC含量が高いことが特徴的である。

５′非翻訳領域には、原核生物のプロモーターとして
知られている−35領域，−10領域及びSD領域に対応する
塩基配列が存在している。したがって、この部分がＣ−
552のプロモーターである（第2B図）。また、３′非翻
訳領域にはCAGCGGATTACATCTGという回文様配列が存在し
ており、これがＣ−552の転写等の終了に寄与している
ターミネーターであると考えられる（第2E図）。

実施例２ Ｃ−552遺伝子の酵母による発現 実施例１で得たＣ−552の遺伝子を用いて酵母での発
現を行った。酵母での異種のチトクロームＣの発現につ
いては、特開平１−37291号に詳しく記載されており、
Ｃ−552の発現についても同様の方法において行った。
部位特異的に変異を起こす方法は、バイオラド社のミュ
ータジェネシスキットによった。ここで用いた合成ヌク
レオチドは、アプライドバイオシステムズ社の390A DN
A合成装置にて合成した。

プラスミドp UHTC135をHind IIIとXba Iで消化して得
られる1.1kbのDNA断片をM13mp19のHind IIIとXba Iによ
る消化物とライゲーションし、大腸菌MV1190に形質転換
した。ホワイトプラークを成す形質転換株から、一本鎖
DNAを調製した。この一本鎖DNAに、合成ヌクレオチドA2
49（５′CGCCCCGTCGACTTACTTTAT3′）をアニールさせ、
バイオラド社のミュータジェネシスキットを用いて部位
特異的な変異を起こさせた。この操作によりＣ−552遺
伝子の終止コドンの３′側に制限酵素Sal I部位が生じ
る。

次にこの組換えM13ファージの１本鎖DNAを鋳型にして
合成ヌクレオチドA237（５′TGTTCATTCATGAATTCGGCAAAG
3′）とA238（５′TCTTCATGAATTCTACCTC3′）でそれぞ
れ同様に変異を起こさせた。A237の変異はＣ−552のシ
グナルペプチドの直後にEcoR I部位を作製すると同時に
開始コドンであるATGを挿入するためのものである。こ
の変異を持つ組換え２本鎖M13DNAをM13−12とした。A23
8の変異はＣ−552の開始コドンATGの直前にEcoR I部位
を作製するためのもので、この変異を持つ組換え２本鎖
M13DNAをM13−11とした。両者の挿入部分の配列を常法
に従い決定し、予期した通りの変異が起こっていること
を確認した。また、Ｃ−552遺伝子の配列に異常が生じ
ていないことも確認した。

pYHCC101（特開平１−37291号参照）は酵母と大腸菌
のシャトルベクターであり、かつ酵母での発現ベクター
である。このプラスミドは工業技術院微生物工業技術研
究所にFERM P−9475の寄託番号で寄託されたが、平成２
年２月23日にブタペスト条約上の寄託に移管され、FERM
BP−2767の寄託番号が付与された。このプラスミドに
おいてはヒトチトクロームＣ遺伝子が酵母のグリセルア
ルデヒド３燐酸デヒドロゲナーゼ（GPD）プロモーター
により転写される。このヒトチトクロームＣ遺伝子の代
わりに、Ｃ−552の遺伝子を導入し酵母中で転写、発現
させる目的で以下のように行った。M13−11,M13−12を
それぞれEcoR IとSal Iで切り出されるＣ−552遺伝子を
含むDNA断片と、pYHCC101のEcoR IとSal Iで切り出され
る約8kbのDNA断片をライゲーションし、大腸菌HB101に
形質転換した。得られた目的のプラスミドをそれぞれpY
HTC11、pYHTC12とした。両者は共にＣ−552遺伝子を含
むが、前者はシグナル配列を含んでいる点で後者と異な
っている。これらのプラスミドの造成過程の概略を第３
図に示す。

これら２種のプラスミドで、酵母XS−30−2BΔCYCl
（Mat α、trp1,his3,ura3,leu2,cys1::LEU2）を形質転
換した。トリプトファンの合成能を回復した形質転換株
とXS−30−2BΔCYClについて、必要な栄養素（ヒスチジ
ン、ウラシル、必要ならばトリプトファン）を添加した
YNEL培地（0.67％ Difco yeast nitrogen base,0.05％
Difco yeast extract,2％ 乳酸ナトリウム）での増殖
を調べた。すなわち、YNED培地（YNEL培地の乳酸ナトリ
ウムの代わりに２％ぶどう糖を含む）で前培養した後、
YNEL培地に１％植菌し、増殖を660nmの吸光度の変化で
追跡した。結果を第４図に示した。XS−30−2BΔCYCl
は、電子伝達系蛋白質であるイソー１ チトクロームＣ
をコードしているCYClを欠損しているので、非発酵性炭
素源である乳酸を資化できず、YNEL培地では増殖しなか
った。ところが、pYHTC11またはpYHTC12で形質転換した
株は第４図に示したように、乳酸を資化して生育した。
これは、異種の蛋白質であるＣ−552が酵母において、
発現し、電子伝達系の１成分として機能したことを示
す。したがって、この組換え酵母を培養すれば酵母菌体
からＣ−552を得ることができる。

次に、形質転換株すなわちXS−30−2BΔCYCl（pYHTC1
1）とXS−30−2BΔCYCl（pYHTC12）を培養した。炭素源
として２％ぶどう糖と1.5％乳酸ナトリウムを含むバー
クホルダー培地（Burkholder、Am.J.Bot.,30、206、194
3）400mlで、よく攪はんして30℃で培養した。対照のた
め、XS−30−2BとXS−30−2BΔCYClも同様の条件で培養
した。集菌後、シャーマンらの方法（Sherman et al.,
J.Biol.Chem.,243,5446,1968）により、酵母を2mlの水
と1mlの酢酸エチルに懸濁し、室温で一晩振とうした。
遠心分離して水層を回収し、この画分のチトクロームＣ
含量と蛋白量を定量した。チトクロームＣ量は還元型吸
収スペクトルを分光光度計（日立220A）で測定し、550n
mの分子吸光係数27/mMを利用して定量した。蛋白定量は
ピアス社のBCA蛋白定量キットを用いた。XS−30−2BΔC
YClのチトクロームＣ含量は蛋白質1mgあたり0.075nmole
であったが、pYHTC11による形質転換株のチトクローム
Ｃ含量は蛋白質1mgあたり0.48nmole、pYHTC12による形
質転換株のチトクロームＣ含量は蛋白質1mgあたり0.40n
moleであった。pYHTC11,pYHTC12による形質転換株はXS
−30−2BΔCYClよりチトクロームＣ含量が高いので、Ｃ
−552が発現したと考えられる。

そこで、これらの酢酸エチル抽出画分をSDSポリアク
リルアミドゲル電気泳動し、ウェスタンブロットを行っ
た後、抗水素細菌Ｃ−552を用いて、Ｃ−552の発現を検
討した。この方法は、たとえば、今掘ら、続生化学実験
講座、蛋白質の化学、東京化学同人（1987）に示されて
いる。その結果、pYHTC12による形質転換株の抽出画分
には抗Ｃ−552抗体と反応するバンドが見られた。その
分子量は、天然のＣ−552と一致した（第6A図）。

実施例３ Ｃ−552遺伝子の大腸菌による発現 pYHTC11及びpYHTC12をそれぞれEcoR 1とSal1で消化し
て得られるＣ−552遺伝子含むDNA断片を市販の大腸菌の
発現ベクターであるpKK223−３（ファルマシア社）をEc
oR IとSal Iで消化したものとライゲーションした。こ
うして得られた目的のプラスミドは、Ｃ−552遺伝子が
大腸菌のtacプロモーターで制御される。一連のプラス
ミド構築の過程を第５図に示した。pYHTC11由来のもの
をpKHC11、そしてpYHTC12由来のものをpKHC12とした。
さらに、pKHC12をBamH IとSca Iで消化して得られるDNA
断片のうち、Ｃ−552遺伝子を含む断片を回収した。こ
れとpUC118（宝酒造）をBamH IとHinc IIで消化したDNA
断片を連結し、得られたプラスミドをpUK812とした。こ
れらのプラスミドの構築には宿主大腸菌としてJM109を
用いた。

形質転換体、JM109（pKHC11）、JM109（pKHC12）、JM
109（pUK812）をＬ培地にて2ml培養後、1.2の硝酸塩
を含む培地（１％ぶどう糖、0.08％硝酸ナトリウム、50
mM炭酸１ナトリウム、0.01％硫酸マグネシウム、0.7％
リン酸１カリウム、0.05％クエン酸３ナトリウム、0.1
％硫酸アンモニウム、１μg/mlチアミン、12μＭモリブ
デン酸アンモニウム、１μＭセレン酸、12mMクエン酸
鉄、0.5％バクトペプトン、pH7.0）に1ml植菌し、37℃
で24時間、静置培養した。またこの際、必要に応じて最
終濃度0.5mMのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド（IPTG）を発現誘導剤として加えた。培養後、
集菌して、以下の実験に供した。

菌体の破砕物をSDSポリアクリルアミドゲルにて電気
泳動し、ウェスタンブロットの後、抗Ｃ−552抗体を用
いて、Ｃ−552の検出を行った。その結果を第6B図に示
した。即ち、調べたJM109、JM109（pKHC11,−IPTG）、J
M109（pKHC11,＋IPTG）、JM109（pKHC12,−IPTG）、JM1
09（pKHC12,＋IPTG）のうちJM109（pKHC12,＋IPTG）だ
けに天然のＣ−552と同じ位置に特異的なバンドが観察
された。この結果から、大腸菌においてＣ−552蛋白が
発現していることがわかる。ここでは、Ｃ−552のシグ
ナルペプチドをコードする遺伝子を含むpKHC11による形
質転換株においては、抗体と反応するものがみられなか
ったのに対し、シグナルペプチドを含まない遺伝子を含
むpKHC12による形質転換株においてのみ発現がみられる
という予想外の結果が得られた。また、JM109（pKHC12,
＋IPTG）の培養菌株を分画し、Ｃ−552の細胞内での局
在性を調べたところ、Ｃ−552は細胞質に存在してい
た。

次にＣ−552の発現レベルを調べるために、前述のよ
うに培養した菌体をフレンチプレスにて破砕後、可溶性
画分の蛋白量及びチトクロームＣ量を測定した。JM109
（pKHC12,＋IPTG）、JM109（pUK812,＋IPTG）のＣ−552
含量は全蛋白質の約0.4％であった。

次に、JM109（pUK812,＋IPTG）の菌体から公知の方法
（Y.Sanbongi et al.,J.Bacteriol.,171,65,1989）によ
り組み換えＣ−552を精製した。

実施例４ 組換えチトクロームＣ−552の性質 精製したＣ−552の吸収スペクトル、熱安定性、酵素
学的性質は天然のＣ−552と一致した。以下に精製した
Ｃ−552の性質について述べる。

組換えチトクロームCC−552の性質 精製した組換えチトクロームＣ−552の還元型吸収ス
ペクトルを測定した結果を天然型のチトクロームＣ−55
2のそれと比較して第７図に示した。両者の吸収スペク
トルは一致した。チトクロームＣの吸収スペクトルは、
その分子構造を反映することは公知であり、したがっ
て、組み換えチトクロームＣ−552は、そのアミノ末端
にメチオニン残基をもつにもかかわらず、天然のチトク
ロームＣ−552と同じ構造をしていることがわかる。

さらに組み換えチトクロームＣ−552の構造を調べる
ためにそのCD（円二色性）を測定した。CDを測定するこ
とにより、蛋白質分子の二次構造を推定することができ
る。チトクロームＣ−552を50μg/mlとなるように10mM
KH₂PO₄−NaOH（pH7.0）に溶解し、210nmから250nmのCD
スペクトルをJASCO automatic recording spectropolar
imeter Model J−20（日本分光）を使用して測定した。
また、チトクロームＣ溶液を120℃、10分間オートクレ
ーブした後、室温に戻し、CDスペクトルを測定した。結
果を第８図に示した。図中ａはオートクレーブ前、Ｂは
オートクレーブ後のCDスペクトルである。第８図から、
組み換えＣ−552と天然Ｃ−552は同じ構造をしているこ
と、並びに組み換えＣ−552も天然Ｃ−552もオートクレ
ーブ処理により、構造が変化しないことがわかる。した
がって、組み換え法により生産したＣ−552は、その熱
安定性という産業上好都合な性質を保持していることが
分かった。ちなみに、ウマチトクロームＣは、オートク
レーブ後のCDスペクトルが顕著に変化しており、変性し
てしまったことがわかる。

実施例５ 組換えチトクロームＣのアミノ酸配列解析 組み換えＣ−552のアミノ末端のアミノ酸配列をアプ
ライド バイオシステムズ社の気相法シークエンサーに
て決定した。その結果、以下の配列を有していた： この配列はアミノ末端にメチオニン残基が付加されて
いることを除けば、天然のＣ−552のアミノ末端配列と
一致した。メチオニン残基の付加によっても、Ｃ−552
の産業上好ましい性質は損なわれていなかったので、こ
こに記載した方法によって、組み換えＣ−552を大量
に、安価に製造できるようなったと考えられる。なお、
ここで使用したプロモーター、大腸菌宿主などは、一例
であり、他のプロモーターや宿主を用いても、発現は可
能である。

（発明の効果） 以上のようにして、ヒドロゲノバクター サーモフィ
ラスＣ−552遺伝子のクローニングと塩基配列の決定を
行った。さらに、この遺伝子を酵母の発現ベクターにつ
ないで、乳酸を資化できない酵母に導入したところ、乳
酸の資化能が回復し、チトクロームＣ量も上昇したの
で、Ｃ−552が酵母で発現した。したがって、Ｃ−552を
組換えDNAの手法を用いて大量かつ容易に得ることがで
きる。また、酵母は真核生物のチトクロームＣのみなら
ず、それとは構造が似ていない原核生物のチトクローム
Ｃをも発現できる。

また、大腸菌の発現ベクターを用いると、大腸菌でも
組換えＣ−552を発現させることができた。大腸菌が生
産する組換えＣ−552は、ヒドロゲノバクター サーモ
フィラスの生産するＣ−552と実質的に同一であり、産
業上好ましい性質を保持していた。同様にして、他の宿
主生物を用いても、組換えＣ−552の生産は可能と思わ
れる。

また、高温でも機能できるという特徴をもつそのプロ
モーター、ターミネーター、シグナルペプチドの構造が
解明された。

【図面の簡単な説明】 第１図は、Ｃ−552遺伝子をスクリーニングするための
合成プローブの配列を対応するアミノ酸配列および可能
性のあるコドンとともに示した図であり、 第2A−１図および第2A−２図は、Ｃ−552遺伝子の塩基
配列を、プロモーター配列、シグナル配列、ターミネー
ター配列も含めて示す一連の図であり、 第2B図は、Ｃ−552遺伝子のプロモーター部分の塩基配
列を、その−35,−10およびSD配列に下線を付けて示し
た図であり、 第2C図は、Ｃ−552のシグナル配列およびそれをコード
する遺伝子の配列を示す図であり、 第2D図は、Ｃ−552の翻訳領域とそれをコードする遺伝
子の配列を示す図であり、 第2E図は、Ｃ−552のターミネーターの塩基配列を回文
構造をなす部分に下線を付けて示した図であり、 第３図は、Ｃ−552の酵母での発現に用いたプラスミド
の造成について概略を示した図であり、 第４図は、乳酸を炭素源としたときのＣ−552遺伝子を
発現している酵母の増殖を示したグラフであり、 第５図は、Ｃ−552の大腸菌での発現に用いたプラスミ
ドの造成について概略を示した図であり、 第6A図および第6B図は、それぞれ酵母中で発現させたＣ
−552および大腸菌中で発現させたＣ−552を、抗Ｃ−55
2抗体を用いて検出した結果を示す電気泳動写真の模式
図であり、 第7A図および第7B図は、それぞれ天然型のチトクローム
Ｃ−552および組換えチトクロームＣ−552の還元型吸収
スペクトル図であり、 第8A図、第8B図および第8C図は、それぞれ天然型のチト
クロームＣ−552、組換えチトクロームＣ−552およびウ
マ心筋チトクロームＣのCDスペクトル図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/31 C07K ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＲＩＲ／ＧＥＮＥＳＥＱ／Ｓｗｉｓｓ−ｐ ｒｏｔ

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下式： で表される、シグナルペプチドを含まない水素細菌由来
   チトクロームＣのアミノ酸配列又はその１もしくは複数
   のアミノ酸が置換、削除もしくは挿入されたアミノ酸配
   列をコードする遺伝子を大腸菌を宿主として、その細胞
   質中で発現させることを特徴とする水素細菌由来チトク
   ロームＣの製造方法。
2. 【請求項２】発現される水素細菌由来チトクロームＣの
   Ｎ末端にメチオニン残基が付加されている、請求項１の
   方法。