CN116536346A - 提高毕赤酵母胞外葡萄糖氧化酶产量的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提高毕赤酵母胞外葡萄糖氧化酶产量的方法及应用。所述方法包括：(1)在毕赤酵母中引入外源的(a)毕赤酵母信号肽‑葡萄糖氧化酶表达盒，以及(b)Ees的表达盒；(2)培养步骤(1)的毕赤酵母，表达葡萄糖氧化酶。可选地，(b)中还包括引入Sec22和/或Bet1的表达盒。采用本发明构建的重组表达系统进行表达，表达的蛋白接近天然。采用本发明构建的表达系统和方法，可高效表达和分泌葡萄糖氧化酶。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，更具体地，本发明涉及提高毕赤酵母胞外葡萄糖氧化酶产量的方法及应用。
背景技术
葡萄糖氧化酶GOD(Glucose oxidase；EC 1.1.3.4)是一种氧化还原酶，对β-D-葡萄糖有很高的催化专一性，其催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸内酯，葡萄糖酸内酯进一步水解生成葡萄糖酸。
GOD具有广泛的应用，目前已被应用于食品、纺织、医疗、生物传感器以及生物燃料电池等多个行业，在食品行业可以作为食品防腐剂和颜色稳定剂，还可以生产葡萄糖酸。在纺织行业可被用来生产过氧化氢用于纺织品漂白，在医疗行业可利用GOD做成血糖仪检测糖尿病患者血糖浓度等等。葡萄糖氧化酶还被应用在生物燃料电池行业中，将过氧化氢酶和GOD固定在同一电极上，由于GOD催化葡萄糖反应是氧化还原反应，所以电子能够转移到另一端的碳电极上，从而形成了绿色环保的生物燃料电池，可以为生物传感器和人造器官提供持续的能源。在口腔中，链球菌的存在通常会提升蛀牙的几率，可以在牙膏中加入GOD，能够和口腔残留的葡萄糖反应，产生的过氧化氢能起到抑制有害菌的滋生和繁殖，从而降低患口腔疾病的概率。
但商品GOD的产量较低，这一因素成为了其在工业上大规模应用的主要限制因素。目前，本领域通过微生物发酵的方法生产GOD，但是，利用黑曲霉或青霉发酵生产GOD在酶产量以及分离方法上还有待提高。而利用大肠杆菌生产GOD，无法对GOD进行翻译后加工，合成的GOD无活性。本领域技术人员也利用毕赤酵母生产GOD，但是产量及酶活性仍有待提高，还需要进一步地优化GOD的生产工艺。
毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种广泛应用于分泌表达外源蛋白的真核系统，其具有众多优点：分子遗传水平的操作简单，易于构建工程菌；能在胞内表达或分泌表达重组蛋白；蛋白质翻译后修饰更接近高等真核生物，如蛋白糖基化、二硫键形成等，重组蛋白容易正确折叠；重组蛋白能大批量发酵生产，影响重组蛋白产量及品质的因素易于控制。尽管其接受度越来越高并且应用也日益成功，但毕赤酵母在表达外源蛋白中依旧存在很多限制，其中，蛋白分泌过程是最常见的瓶颈之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高毕赤酵母胞外葡萄糖氧化酶产量的方法及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种提高毕赤酵母胞外葡萄糖氧化酶产量的方法，包括：(1)在毕赤酵母中引入外源的(a)毕赤酵母信号肽-葡萄糖氧化酶表达盒，以及(b)以下蛋白的表达盒：SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白(Ees)；(2)培养步骤(1)的毕赤酵母，表达葡萄糖氧化酶。
在一个或多个实施方式中，所述的提高为显著性提高，较佳地，与未引入SEQ IDNO:1所示氨基酸序列的蛋白的表达葡萄糖氧化酶的毕赤酵母相比，葡萄糖氧化酶的胞外表达/总表达提高10％以上、20％以上、30％以上、50％以上、70％以上、80％以上、90％以上、100％以上、150％以上、200％以上、300％以上、400％以上、500％以上或更高。
在一个或多个实施方式中，“-”表示毕赤酵母信号肽与葡萄糖氧化酶操作性连接。
在一个或多个实施方式中，(b)中，还包括引入选自下组的蛋白的表达盒：SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的蛋白(Sec22)，或SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的蛋白(Bet1)。
在一个或多个实施方式中，所述毕赤酵母信号肽包括选自：SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的信号肽(GAS1)；SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的信号肽(FRE2)；SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的信号肽(DAN4)；SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的信号肽(MSB2)；或SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的信号肽(DSE4)。
在一个或多个实施方式中，所述毕赤酵母信号肽为SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的信号肽(GAS1)。
在一个或多个实施方式中，(a)中，所述的毕赤酵母信号肽-葡萄糖氧化酶为1～15拷贝，较佳地为2～12拷贝，更佳地为3～10拷贝，更佳地为5～9拷贝(如5、6、7或8拷贝)。
在一个或多个实施方式中，(a)中，所述的葡萄糖氧化酶为突变型葡萄糖氧化酶，其第20位由Val突变为Trp，第30位由Thr突变为Val。
在一个或多个实施方式中，野生型的GOD基因编码的氨基酸序列如Uniprot：P13006(不含前22位为信号肽序列)。
在一个或多个实施方式中，外源引入的基因通过同源重组的方式整合到毕赤酵母的基因组中。
在一个或多个实施方式中，所述的表达盒中还包括：适用于毕赤酵母表达的启动子和终止子；较佳地，所述启动子包括：AOX启动子、GAP启动子、DAS1启动子、FDH1启动子；较佳地，所述的终止子包括AOXTT、RPS3tt。
在本发明的另一方面，提供一种高产葡萄糖氧化酶的重组毕赤酵母，其中包含外源的：(a)毕赤酵母信号肽-葡萄糖氧化酶表达盒，以及(b)以下蛋白的表达盒：SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白(Ees)。
在一个或多个实施方式中，(b)中，还包括引入选自下组的蛋白的表达盒：SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的蛋白，或SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的蛋白。
在一个或多个实施方式中，所述毕赤酵母信号肽包括选自：SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的信号肽(GAS1)；SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的信号肽(FRE2)；SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的信号肽(DAN4)；SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的信号肽(MSB2)；或SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的信号肽(DSE4)；较佳地，所述毕赤酵母信号肽为SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的信号肽(GAS1)。
在一个或多个实施方式中，所述的毕赤酵母信号肽-葡萄糖氧化酶为1～15拷贝，较佳地为2～12拷贝，更佳地为3～10拷贝，更佳地为5～9拷贝(如5、6、7或8拷贝)。
在一个或多个实施方式中，所述的葡萄糖氧化酶为突变型葡萄糖氧化酶，其第20位由Val突变为Trp，第30位由Thr突变为Val。
在本发明的另一方面，提供所述的重组毕赤酵母的应用，用于生产葡萄糖氧化酶。
在本发明的另一方面，提供一种用于生产葡萄糖氧化酶的试剂盒，所述试剂盒中包括所述的重组毕赤酵母。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、不同信号肽的MGOD表达载体构建过程。pX分别代表载体pGAMu1，pFRMu1，pDAMu1，pDSMu1和pMSMu1。
图2、通过酶切连接法构建促分泌成分共表达质粒。X分别代表BET1、EES、SAR1、SEC22和YKT6；pUX分别代表pUBE1、pUEE、pUSA1、pUSE22和pUYK6。
图3、通过同源交换法构建促分泌成分共表达质粒。
图4、联合共表达质粒pUEE/SE22的构建。
图5、重组菌G1Be1、G1Ees、G1Sa1、G1Se13、G1Sec、G1Yk6(A)和G1EeSe(B)构建过程。X代表促分泌成分BET1、EES、SAR1、SEC13、SEC22和YKT6；G1x代表对应重组菌G1Be1、G1Ees、G1Sa1、G1 Se13、G1Sec和G1Yk6。其中，CYCTT为终止子，Hph为由TEF1启动子驱动的源于Klebsiella pneumonia的潮霉素B磷酸转移酶基因。
图6、PCR验证含不同信号肽的MGOD表达质粒。
图7、不同信号肽重组菌孔板考察。
图8、重组菌M1，GM1，5GM1和8GM1摇瓶诱导培养144h胞内外单位菌体酶活。
图9、6种目的基因(A)和EES表达单元(B)PCR产物电泳图。Lane M1和M2：DL2000DNA Marker；Lane M3：DL10000 DNA Maker；Lane 1：BET1；Lane 2：YKT6；Lane 3：SEC22；Lane 4：SEC13；Lane 5：EES；Lane 6：SAR1；Lane 7：以AOX为启动子，AOXTT为终止子的EES表达单元。
图10、摇瓶诱导培养144h各重组菌DCW(A)和胞外GOD产量(B)。Control为出发菌8GM1。
图11、摇瓶诱导培养重组菌8GM1、G1Sec、G1Ees和G1EeSe生长曲线(A)和胞内外GOD单位菌体产量(B)。
图12、5L反应器水平重组菌G1EeSe生产GOD。
具体实施方式
在生物技术领域中，异源蛋白的重组表达是一个重要研究课题。为了提高重组蛋白的表达率，需大量的实验室工作，经多次试验、分析、总结与再试验的努力才能达到最后的成功。有很多因素可以影响重组蛋白表达率；而若是考虑蛋白的分泌表达，那么更多的因素需要考虑。
本发明人致力于提高酵母细胞生产葡萄糖氧化酶(GOD)的产量及其分泌表达的产量，经过深入的研究和大量的筛选，开发了能够有效促进提高毕赤酵母胞外葡萄糖氧化酶产量的方法，所述方法通过在酵母菌株中将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白(Ees)与GOD共表达，较佳地还共表达SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白(Sec22)，或SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的蛋白(Bet1)。同时，本发明还提供了以毕赤酵母(Pichia pastoris)为宿主构建的高效分泌GOD的重组菌。与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示序列的蛋白同源性较高的同功能变体也可被应用于本发明中。同时，本发明人还优化了GOD分泌表达的表达策略，通过适当拷贝数的设置，有效地提高了GOD的产量。
术语
如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系，或者是指蛋白质/基因与宿主细胞之间的关系。例如，尽管宿主细胞自身也可能包含相应的基因或产生相应的蛋白质，合成/重组建立的基因/蛋白质当通过基因工程方法引入到宿主细胞中时，其相应于该宿主细胞为“外源的”或“异源的”。
如本文所用，所述的“可操作地连接(相连)”或“操作性连接(相连)”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
如本文所用，所述的“重组表达盒”是指包含有表达目的蛋白所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下下元件：启动子、编码蛋白的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件时操作性相连的。
如本文所用，所述的“构建体(构建物)”或“表达构建体(构建物)”是指重组DNA分子，它包含预期的核酸编码序列，其可以包含一个或多个基因表达盒。所述的“构建体(构建物)”通常被包含在表达载体中。
所述的“启动子”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。
如本文所用，所述的“信号肽”是分泌蛋白新生肽链N端的一段氨基酸残基组成的肽段，其长度一般为20～30个氨基酸残基。信号肽可对待分泌蛋白进行适当的引导，同时这个肽段可被切除。
促表达基因
经过大量研究筛选和实验工作，本发明人确定了有利于大幅度提高GOD产量的优化方案，包括在宿主细胞(毕赤酵母细胞)中上调Ees、Sec22或Bet1的表达或活性。较佳地，Ees、Sec22或Bet1被重组表达(过表达)于酵母细胞中以促进MOD的表达。
作为本发明的优选方式，Ees来源于毕赤酵母，其具有SEQ ID NO:1所示的序列；Sec22来源于毕赤酵母，其具有SEQ ID NO:2所示的序列；Bet1来源于毕赤酵母，其具有SEQID NO:3所示的序列。
应理解，在得知了本发明所披露的所述Ees、Sec22或Bet1的功能或所述Ees、Sec22或Bet1在其所参与的信号通路(较佳地，也包括其上游基因和下游基因)中的功能后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的Ees、Sec22或Bet1的表达或活性或调节Ees、Sec22或Bet1的相关上游基因或下游基因。比如可以采用本领域人员熟知的多种方法来过表达Ees、Sec22或Bet1或其上游基因或下游基因。
本发明中，上调所述的Ees、Sec22或Bet1蛋白或其编码基因、其上游或下游蛋白或其编码基因的表达包括应用Ees、Sec22或Bet1蛋白或其编码基因的上调剂。所述上调剂可包括促进剂、激动剂、激活剂。所述的“上调”、“促进”包括了蛋白活性的“上调”、“促进”或蛋白表达的“上调”、“促进”，且它们为具有统计学意义的“上调”、“促进”。任何可提高Ees、Sec22或Bet1或含有其的信号通路蛋白(包括其上游和下游蛋白)的活性、提高Ees、Sec22或Bet1或包含其的信号通路蛋白的稳定性、上调Ees、Sec22或Bet1或包含其的信号通路基因的表达、增加Ees、Sec22或Bet1或包含其的信号通路蛋白有效作用时间的物质、增加各个蛋白的磷酸化/激活水平，这些物质均可用于本发明，作为对于上调Ees、Sec22或Bet1或信号通路有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。
本发明还提供了一种上调细胞中Ees、Sec22或Bet1表达的方法，所述的方法包括：将Ees、Sec22或Bet1的编码基因或含有所述编码基因的表达构建物或载体转入细胞中。此外，也可对Ees、Sec22或Bet1或其编码基因进行功能获得性突变；以表达增强型启动子或组织特异性启动子促进Ees、Sec22或Bet1的编码基因的表达；或，以增强子促进Ees、Sec22或Bet1的编码基因的表达。应理解，其它的上调细胞中Ees、Sec22或Bet1表达的方法也应被包含在本发明中。
本发明的Ees、Sec22或Bet1的编码基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。
信号肽
信号肽对分泌性重组蛋白的表达有较为重要，合适的信号肽可以使目的蛋白的表达量、尤其是分泌表达量成倍提高。毕赤酵母本身分泌的内源蛋白质较少，因而通过信号肽序列来引导外源蛋白质的分泌可方便纯化操作。目前常用的信号肽有酿酒酵母α交配因子(α-MF)和毕赤酵母酸性磷酸酶(PHO1)信号肽，其中前者在应用上更为广泛。尽管α-MF信号肽是一个强信号肽，重组蛋白在此信号肽的引导下可以获得高表达。但是某些外源蛋白用α-MF信号肽进行分泌表达，会使得重组蛋白质的氨基末端有所延伸(Liu PT etal.Protein Expr Purif,2001,22:381-387)。如人α-1干扰素用α-MF信号肽来分泌表达，可见到部分重组蛋白的N-端带有9-11个α-MF信号肽氨基酸残基，这给纯化工艺造成很大的难题。在GOD的表达中也碰到类似问题。
本发明人在研究中发现，SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的信号肽(GAS1)；SEQ IDNO:5所示氨基酸序列的信号肽(FRE2)；SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的信号肽(DAN4)；SEQID NO:7所示氨基酸序列的信号肽(MSB2)；或SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的信号肽(DSE4)，当应用于毕赤酵母分泌表达GOD时，具有良好表达效率，与其融合的GOD蛋白质能被正确加工，以及被引导而促进分泌表达。最为优选的，所述的信号肽为SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的信号肽(GAS1)。
表达盒、重组表达载体及重组细胞
本发明构建了用本发明的毕赤酵母信号肽引导的GOD(毕赤酵母信号肽-GOD)的表达盒，用于转染到酵母细胞中进行表达。所述毕赤酵母信号肽选自GAS1、FRE2、DAN4、MSB2、DSE4；较佳地为GAS1。
本发明中，也构建了Ees、Sec22和/或Bet1的表达盒，以用于与GOD供表达、促进GOD的表达。
作为本发明的优选方式，应用的酵母启动子优选地可以是AOX1启动子，也可以是GAP启动子或其它酵母启动子。
作为本发明的优选方式，本发明所述的GOD的表达盒中，从5’至3’依次包括：启动子序列，本发明的毕赤酵母信号肽编码序列，GOD成熟肽编码序列，翻译终止子序列，这些序列操作性相连。
本发明用于重组表达的细胞是酵母细胞，所述的酵母例如毕赤酵母(Pichia)、汉逊酵母(Hansenula)、假丝酵母(Candida)或球拟酵母(Torulopsis)等。作为本发明的优选方式，所述的酵母细胞是毕赤酵母细胞。毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达。所述的外源基因表达框架包括启动子、外源基因克隆位点、信号肽、外源基因表达盒、终止序列、筛选标记等。表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合；由于毕赤酵母可以以甲醇为唯一的碳源和能源，绝大多数微生物并不能以甲醇为碳源，因此在发酵过程中可以减少杂菌的污染，而且大规模工业发酵技术相对比较成熟。包括培养基、发酵方法等已经经过详尽研究，使得发酵的重现性和自动化程度都极为良好。
作为本发明的优选方式，所述“毕赤酵母信号肽-GOD”为1～15拷贝，较佳地为2～12拷贝，更佳地为3～10拷贝，更佳地为5～9拷贝(如5、6、7或8拷贝)。
本发明的方法中，对于培养毕赤酵母的方法和培养基没有特别的限制，可以采用本领域常规使用的方法和培养基。在培养重组细胞分泌表达出GOD后，还可包括步骤：从培养产物(培养基或发酵液)中分离GOD。从培养产物中分离或纯化GOD可采用本领域技术人员熟知的技术。例如可采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose离子交换、凝胶过滤法纯化、分子筛、或采用亲和层析法纯化。
本发明还提供了包含有本发明所构建的重组表达载体以及酵母细胞的试剂盒；或者包含本发明所构建的重组酵母细胞的试剂盒。
其它常用于进行转基因操作的试剂也可被包含在所述的试剂盒中，以方便本领域技术人员使用。
此外，所述试剂盒中还可包含有指导本领域技术人员操作的使用说明书。
表达方法及应用
GOD具有广泛的应用，而商品GOD产量较低是其在工业上大规模应用的主要限制因素。毕赤酵母表达系统是一种广泛应用于分泌表达外源蛋白的真核系统，其在表达外源蛋白时，蛋白分泌过程是最常见的瓶颈之一。本发明中提供了GOD的优化表达策略。
基于本发明人的优化策略，本发明提供了一种提高毕赤酵母胞外葡萄糖氧化酶产量的方法，包括：(1)在毕赤酵母中引入外源的(a)毕赤酵母信号肽-葡萄糖氧化酶表达盒，以及(b)以下蛋白的表达盒：SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白(Ees)；(2)培养步骤(1)的毕赤酵母，表达葡萄糖氧化酶。较佳地，(b)中，还包括引入选自下组的蛋白的表达盒：SEQID NO:2所示氨基酸序列的蛋白(Sec22)，或SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的蛋白(Bet1)。
在本发明的优选实施例中，为了提高毕赤酵母分泌表达GOD的产量，本发明人优化了信号肽和GOD基因剂量，获得了GOD产量较高的重组菌8GM1，在此基础上，分别共表达多种基因，包括：BET1、EES、SEC22、YKT6、SEC13和SAR1等，其中，共表达EES、SEC22和BET1的相应重组菌G1Ees、G1Sec和G1Be1，摇瓶诱导培养144h，胞外单位菌体GOD产量较对照菌8GM1分别提高至1.86、1.14和1.07倍，即共表达EES、SEC22和BET1，可有效促进重组菌分泌表达GOD。
在本发明的优选实施例中，对于促进作用较大的基因EES和SEC22，共表达EES提高重组菌G1Ees胞内外和总GOD产量，而共表达SEC22提高重组菌G1Sec的GOD分泌率。联合共表达EES和SEC22，重组菌G1EeSe，较单独共表达EES，重组菌G1Ee，分泌率增加，胞外单位菌体GOD产量进一步提高至G1Ee的1.14倍，是出发菌8GM1的2.15倍，即共表达EES和SEC22的作用较为独立，联合共表达二者，将实现协同增效的表达效果。在5-L反应器水平，重组菌G1EeSe的最高GOD体积酶产量达到7223.0U/mL，本领域中对于GOD表达而言，这是很高的水平。
采用本发明构建的重组表达系统进行表达，表达的蛋白接近天然。采用本发明构建的表达系统和方法，在简单的合成培养基中可实现高密度培养，操作简单、能有大规模发酵设备进行表达，生产成本低廉。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料与方法
1、候选的助表达基因以及信号肽
本发明人针对大量的候选基因进行了筛选，以找到适于促进葡萄糖氧化酶表达的优选基因，其中部分基因的信息如表1。一些信号肽的序列如表1。
表1
2、质粒与菌株
本发明所使用和构建的质粒和菌株见下表2和表3。
表2、质粒
表3、菌株
3、培养基
(1)LB培养基
酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。
(2)YPD培养基
胰蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L。
(3)BMGY生长培养基
胰蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，YNB 13.4g/L，甘油10g/L，0.1M pH＝6.0的K2HPO4/KH2PO4缓冲液。
(4)BMMY诱导培养基
胰蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，YNB 13.4g/L，0.1M pH＝6.0的K2HPO4/KH2PO4缓冲液。诱导表达时，1％甲醇/24h。
(5)YPD培养基
胰蛋白胨20g/L，甘油10g/L，酵母提取物10g/L。
(6)BSM培养基
甘油40g/L，硫酸钾18g/L，氢氧化钾4.13g/L，硫酸镁14.88g/L，磷酸27mL，0.93g/L硫酸钙(灭菌时加入1/1000消泡剂，发酵接种时加入4.13mL PTM1)。
(7)PTM1微量元素
碘化钾0.09g，五水硫酸铜6g，一水硫酸锰3g，二水钼酸钠0.2g，硼酸0.02g，氯化锌20g，氯化钴0.5g，七水硫酸亚铁65g，生物素0.2g，浓硫酸5mL。
(8)甘油补料
50％(w/v)甘油，使用时补加1.2％的PTM1。
(9)甲醇补料
100％甲醇，使用时补加1.2％的PTM1。
4、试剂和引物
引物见表4。标品GOD购自Sigma公司，辣根过氧化物酶购自上海生工生物有限公司。邻联茴香胺购自上海迈瑞尔化学技术有限公司。潮霉素购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。其他常规试剂均为进口或国产分析纯。Super-Fidelity DNAPolymerase，ClonExpress II One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司。Ligation Mix、酵母RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、限制性内切酶购自大连宝生物工程有限公司。质粒提取试剂盒、PCR纯化试剂盒、胶回收试剂盒购自Axygen公司。
表4、引物
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5、菌株培养
大肠杆菌培养：挑取单菌落接种于装有LB的试管中，于37℃、220rmp过夜培养。
毕赤酵母孔板筛选考察：从转化板上挑选单菌落，接种于含有300μL BMGY培养基的96孔板中，250rpm，30℃培养24h，作为种子液。接着，吸取上述种子液，接种于每孔含900μL BMMY诱导培养基的48深孔板中，220rpm，30℃培养24h，收集培养液测定菌浓和胞外酶活。
毕赤酵母种子培养：从平板上挑取单菌落接种于装有3mL YPD的试管中，于30℃、220rmp培养18～24h。
毕赤酵母诱导培养：吸取上述毕赤酵母种子液，接种到装有25mL BMGY培养基的250mL摇瓶中，于30℃、220rmp条件下培养至OD600＝4～6之间，离心5min收集全部菌体，用BMMY培养基重悬菌体，并调节OD600＝1左右，然后转入到盛有50mL BMMY培养基的500mL摇瓶中进行诱导培养，每隔24h取样，并补充1％的甲醇。
毕赤酵母5L反应器发酵实验，整个发酵分为三个阶段：批发酵阶段、甘油流加阶段、甲醇诱导阶段；在批发酵过程中，通气量为1.5VVM，搅拌转速为600rmp，待批发酵结束，DO开始上升时，开始补加甘油，控制甘油流速，使DO维持在20％左右，至OD600接近400时，停止补加甘油，待DO回升，饥饿30-60min后，开始缓慢补加甲醇，通过调整甲醇流速，搅拌速率等，控制DO在10％左右。整个发酵过程通过补加氨水维持pH在5.5，发酵温度为29.5℃。诱导阶段，每隔一段时间取样，测定菌浓和胞外酶活。
菌体干重的测定：取发酵液，稀释到一定的倍数，测定菌体的OD600，根据OD600和干重的关系：DCW(g/L)＝0.24×OD600+1.23(R2＝0.994)，计算DCW。
6、GOD酶活测定
取2.5mL邻联茴香胺溶液(0.21mM邻联茴香胺，0.1M Na2HPO4-柠檬酸，pH＝6)、0.3mL葡萄糖溶液(18％)和0.1mL辣根过氧化物酶溶液(90U/mL)混匀后，置于37℃温浴5min。取一定体积、稀释合适倍数的待测液，加入到上述体系中，反应3min后，加入2mol/L硫酸终止反应，以不加待测液的反应体系为对照，测定OD500。以纯品葡萄糖氧化酶(sigma)溶液作标准曲线。
GOD酶活定义：在37℃条件下，每分钟催化1μmol的β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸的酶量为一个酶活单位U。
单位菌体酶活(比酶活)＝体积酶活(U/mL)/菌体干重(g/mL)。
7、胞内GOD检测
取一定体积样品离心后去上清，加入Breaking Buffer吸打混匀，洗涤菌体，5000rpm，离心5min，去上清。然后加入一定体积Breaking Buffer重悬菌体，并加入等体积的0.5mm酸洗玻璃珠。接着，将加入玻璃珠的样品，经冷冻研磨仪(JXFSTPRP-CL，上海净信)破碎细胞后，12000rpm，离心10min，再将上清液转移至新的1.5mL离心管中，用于测定胞内GOD酶活(见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册)。
8、含不同信号肽的MGOD表达载体的构建
如图1所示，将合成的GAS1-F序列(含有GAS1的信号肽正向序列及BamH I酶切位点)和GAS1-R序列(含有GAS1的反向互补序列及EcoR I酶切位点)(表4)进行退火反应，得到两端分别含有BamH I与EcoR I酶切位点的GAS1信号肽序列。将该序列酶切后，与BamH I/EcoR I双酶切后的pαMu1片段进行连接，热激转化至大肠杆菌DH5α的感受态细胞中，在含有Amp抗生素的平板上筛选转化子，以构建载体pGAMu1。采用相同的方法，分别将序列对FRE2-F/FRE2-R，DAN4-F/DAN4-R，DSE4-F/DSE4-R和MSB2-F/MSB2-R进行退火反应，然后与BamH I/EcoR I双酶切后的pαMu1片段进行连接，经转化筛选以分别构建载体pFRMu1，pDAMu1，pDSMu1和pMSMu1。
9、共表达质粒的构建
如图2所示，分别采用引物BET1-F/R、EES-F/R、SAR1-F/R、SEC22-F/R和YKT6-F/R，以GS115的cDNA为模板，PCR获得相应BET1、EES、SAR1、SEC22和YKT6片段。然后，将相应片段和质粒pAOX-UH分别用酶NotⅠ和Xba I进行双酶切线性化，经回收纯化后，分别将纯化后的相应片段与线性化载体进行连接，以构建相应的质粒pUBE1、pUEE、pUSA1、pUSE22和pUYK6。
如图3，采用引物SEC13-F/R，以GS115的cDNA为模板进行PCR获得SEC13片段。然后，将相应片段与经酶SalⅠ线性化的质粒pAOX-UH进行无缝连接(同源序列交换的方式)，以构建相应的质粒pUSE13。
如图4，采用引物EES/SEC22-F/R，以质粒pUEE为模板进行PCR，获得带有AOX启动子和AOXTT终止子的相应片段，胶回收纯化后与经限制性内切酶Spe I线性化的质粒pUSE22进行无缝连接(同源序列交换的方式)，以构建质粒pUEE/SE22。
10、不同信号肽MGOD重组菌和多拷贝重组菌8GM1的构建
分别将含不同信号肽的MGOD表达载体pGAMu1，pFRMu1，pDAMu1，pDSMu1和pMSMu1经酶Sal I线性化后，电击转化到毕赤酵母GS115感受态中，然后经MD平板筛选，以构建重组菌GM1，FM1，DAM1，DSM1和MM1。
多拷贝重组菌8GM1，将经酶Sal I线性化的载体pGAMu1，电击转化到毕赤酵母GS115感受态中，并在MD固体培养基平板上培养，待菌落长出后，使用无菌水洗涤收集MD平板上的重组菌，并涂布于含不同抗生素G418浓度(0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75和2.0mg/mL)的YPD平板上，筛选获得高拷贝重组菌8GM1。根据基因转化的规律，该高拷贝菌株可以重复制备获得。
11、基因拷贝数的测定
根据制造商的手册，使用Dr.GenTLETM(from Yeast)High Recovery(TAKARA)提取基因组DNA。参考Abad等报道的方法(Abad S et al.Real-time PCR-based determinationof gene copy numbers in Pichia pastoris.Biotechnol J.2010,5(4):413-420)，测定GOD基因拷贝数。
12、共表达菌株构建
将共表达各促分泌成分的相应载体(pUBE1、pUEE、pUSA1、pUSE13、pUSE22和pUYK6)和联合共表达EES与SEC22的载体pUEE/SE22，经XhoⅠ和AvrⅡ双酶切后，电击转化到毕赤酵母重组菌8GM1感受态中，涂布于含有潮霉素(终浓度为100μg/mL)的YPD平板上培养48-72h，筛选阳性转化子，获得相应共表达重组菌G1Be1、G1Ees、G1Sa1、G1Se13、G1Sec、G1Yk6和G1EeSe。上述含目的基因表达单元的线性化片段可通过同源臂(U1-up/U1-dn：PAS_chr1-4_0695/PAS_chr1-4_0164)交换的方式整合到重组菌8GM1基因组中，如图5，其中X代表促分泌成分BET1、EES、SAR1、SEC13、SEC22和YKT6(G1x代表对应重组菌G1Be1、G1Ees、G1Sa1、G1Se13、G1Sec和G1Yk6)。
实施例1、不同信号肽MGOD重组菌的构建及考察
将序列对GAS1-F/GAS1-R，FRE2-F/FRE2-R，DAN4-F/DAN4-R，DSE4-F/DSE4-R和MSB2-F/MSB2-R进行退火反应，与BamH I/EcoR I双酶切后的pαMu1片段进行连接，然后热激转化至大肠杆菌DH5α的感受态细胞中，在含有Amp抗生素的平板上筛选转化子，以构建含不同信号肽的MGOD表达载体pGAMu1，pFRMu1，pDAMu1，pDSMu1和pMSMu1。对所构建的质粒进行菌落PCR验证，所用引物为AOX-F/GOD-R。结果如图6所示，获得的片段大约500bp，与预期相符，经测序验证后，保存正确的质粒备用。分别将含不同信号肽的MGOD表达载体pGAMu1，pFRMu1，pDAMu1，pDSMu1和pMSMu1经酶Sal I线性化后，电击转化到毕赤酵母GS115感受态中，然后经MD平板筛选，以构建重组菌GM1，FM1，DAM1，DSM1和MM1。
从各重组菌转化后的MD平板上挑选20多株不同的转化子，接种到96孔板进行初步考察，以含α-MF信号肽的MGOM重组菌M1为对照菌，初步考察5种不同信号肽对MGOD表达的影响，结果见图7。
如图7所示，采用不同信号肽，MGOD的分泌表达水平不同，采用信号肽GAS1，FRE2，DAN4，DSE4，MSB2的重组菌胞外GOD相对比酶活均高于采用α-MF信号肽的对照菌M1。其中，采用信号肽GAS1的重组菌GM1胞外单位菌体酶活最高，为对照菌M1的5.3倍(孔板水平)；摇瓶诱导培养144h，重组菌GM1的胞外单位菌体酶活为8617.4U/g DCW，是对照菌M1的2.7倍(图8)。
实施例2、高拷贝重组菌8GM1的构建与考察
在重组菌GM1的基础上，进一步优化MGOD的基因剂量以提高重组菌分泌表达MGOD。将经酶Sal I线性化的载体pGAMu1，电击转化到毕赤酵母GS115感受态中，并在MD固体培养基平板上培养，待菌落长出后，使用无菌水洗涤收集MD平板上的重组菌，并涂布于含不同抗生素G418浓度(0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75和2.0mg/mL)的YPD平板上，进行G418抗生素梯度筛选。
如图8所示，通过筛选获得两株胞外酶产量提高较大的重组菌5GM1和8GM1，摇瓶诱导培养144h，胞外单位菌体酶活分别为22422.8和22769.5U/g DCW，是GM1(8617.41U/gDCW)的2.6倍。通过测定重组菌5GM1和8GM1的GOD基因拷贝数，发现它们的GOD基因拷贝数分别为5和8。对于这两株重组菌，8GM1的胞外单位菌体酶活略高于5GM1，同时其具有更高的GOD基因剂量和胞内酶产量，对其进行蛋白分泌过程改造，提示对提高GOD分泌表达更有效，因此，选择8GM1进行下一步改造。
实施例3、共表达质粒及相应重组菌构建
以G/GS115的cDNA为模板，通过PCR扩增获得6种目的基因，BET1(421bp)，YKT6(625bp)，SEC22(667bp)，SEC13(910bp)，EES(655bp)和SAR1(595bp)，结果如图9A，片段长度符合预期。将6种目的基因片段分别与酶切线性化的载体pAOX-UH连接获得相应的6种共表达质粒，分别命名为pUBE1，pUYK6，pUSE22，pUSE13，pUEE和pUSA1，测序结果表明6种共表达质粒均构建成功。类似的，以质粒pUEE为模板，采用PCR扩增获得带有AOX启动子和AOXTT终止子的EES表达单元(2047bp)，如图9B，片段大小与预期符合。将目的片段与线性化载体pUSE22连接，获得联合共表达EES和SEC22质粒pUEE/SE22，测序结果表明质粒构建成功。然后分别将各重组质粒电击转化至重组菌8GM1感受态中，筛选获得阳性转化子。
实施例4、共表达促分泌成分对重组菌GOD生产的影响
为了考察共表达6种促分泌成分对重组菌分泌表达GOD的影响，对重组菌G1Be1、G1Ees、G1Sa1、G1Se13、G1Sec和G1Yk6进行诱导培养。如图10A，诱导144h后，各共表达重组菌细胞干重(DCW)与对照菌8GM1相近，共表达各促分泌成分对生长影响较小。如图10B，共表达EES、SEC22和BET1的相应重组菌胞外单位菌体GOD产量分别为对照菌(22769.5U/g DCW)的1.89、1.14和1.07倍，分别为43095.1、26031.2、24255.1U/g DCW。可见，共表达EES、SEC22和BET1有助于重组菌分泌表达GOD。
同时，对于促进作用较大的基因EES和SEC22，如表5，摇瓶诱导培养144h，共表达EES，相应重组菌胞内外(总)GOD产量提高，分泌率较对照(0.70)下降，为0.65；而共表达SEC22，相应重组菌总GOD产量较对照略有下降，但分泌率却显著提高，为0.82，即共表达EES提高重组菌G1Ees胞内外总GOD产量，而共表达SEC22提高重组菌G1Sec的GOD分泌率。可见，重组菌分泌表达GOD时，分泌过程可能会成为GOD分泌表达的瓶颈，而这一瓶颈即可能会限制GOD的分泌，也可能会影响GOD的产生。而共表达EES可促进重组菌产生、分泌GOD，共表达SEC22可促进重组菌分泌GOD。
表5、GOD产量和分泌率
此外，鉴于上述结果，共表达EES提高重组菌总GOD产量，而共表达SEC22提高重组菌GOD分泌率。根据实验结果，本发明人考虑到EES和SEC22在分泌过程中的可能存在不同功能，联合共表达EES和SEC22，较单独共表达EES而言，则可能提高重组菌GOD的分泌率，促进胞内GOD分泌到胞外，进一步提高GOD的胞外产量。因此，本发明人进一步在出发菌8GM1中联合共表达EES和SEC22，构建重组菌G1EeSe，并通过摇瓶诱导培养，考察联合共表达EES和SEC22对重组菌GOD分泌表达的影响。
如图11A，联合共表达EES和SEC22的重组菌G1EeSe与单独共表达EES或SEC22的重组菌G1Ees或G1Sec以及出发菌8GM1的生长相近，其中，重组菌G1EeSe和G1Ees生长略低于G1Sec和8GM1，结合图11B可知，重组菌G1EeSe和G1Ees的胞外和总GOD产量均显著高于重组菌G1Sec和8GM1，尤其G1EeSe的产量增加。由此，重组菌G1EeSe和G1Ees生长较G1Sec和8GM1略低，可能是由于更多的碳源、能源流向GOD生成。但这种生长的略低是基本可被忽略的，其构成的GOD的产量增加更具显著性。
如图11B和表5，联合共表达EES和SEC22，较单独共表达EES而言，重组菌G1EeSe的胞外单位菌体GOD产量较G1Ees高，胞内降低，总产量略有提高，分泌率提高；较单独共表达SEC22而言，重组菌G1EeSe较G1Sec胞内外和总的单位菌体GOD产量均提高，分泌率下降。诱导培养144h，重组菌8GM1，G1Sec，G1Ees和G1EeSe的胞外单位菌体GOD产量，总产量和分泌率分别为：22769.5，26031.2，43095.1，49065.2U/g DCW(胞外)；32550.4，31826.6，66172.3，67682.9(总)；0.70，0.82，0.65，0.72(分泌率)。由此可见，共表达EES和SEC22对重组菌表达GOD作用较为独立，联合共表达二者，具有协同增效作用。
此外，诱导144h联合共表达EES和SEC22，重组菌G1EeSe，较单独共表达EES，重组菌G1Ee，胞外单位菌体酶产量进一步提高至G1Ee的1.14倍，是8GM1的2.15倍。
实施例5、5-L反应器水平考察GOD高产菌G1EeSe生产GOD
为了更全面的考察重组菌G1EeSe22的特性，验证它的工业价值，在5L反应器中考察重组菌G1EeSe22的生长和产酶过程。
挑取重组菌G1EeSe22单菌落于装有3mL YPD培养基的试管中，于250rpm，30℃培养20-24h。接着吸取上述菌液，以10％的接种量接种于装有50mL YPG培养基的500mL摇瓶中，于250rpm，30℃培养18-20h后，以10％的接种量接种于装有2.5L BSM培养基的发酵罐中，进行发酵考察。
重组菌发酵共3个阶段，批培养阶段、甘油补料阶段和甲醇诱导阶段。如图12，甘油补料阶段，重组菌生长迅速，菌浓快速上升，进行约29h后，DCW达到95.2g/L。甲醇诱导阶段，比生长速率控制相对较低，诱导0-120h间，菌浓缓慢上升，DCW从95.2上升至108.8g/L，随后开始下降，至发酵结束时(312h)生物量降低至87.9g/L。诱导初期(0-48h)，产酶速率较低，此阶段，可能重组菌在不断适应甲醇培养；诱导48h后产酶速率迅速上升，96-120h间最高，随后开始逐步缓慢下降，至288h上清酶活达到最高，为7223.0U/mL，超过利用其它体系表达的最高水平。胞外蛋白主要为GOD，浓度可达30.7g/L。
结论
本发明在含有8拷贝外源蛋白GOD基因的重组菌8GM1基础上，分别共表达基因：BET1、EES、SEC22、YKT6、SEC13和SAR1等，其中，共表达EES、SEC22和BET1的相应重组菌G1Ees、G1Sec和G1Be1，摇瓶诱导培养144h，胞外单位菌体酶产量较对照菌8GM1分别提高至1.86、1.14和1.07倍，即共表达EES、SEC22和BET1，有助于重组菌分泌表达GOD。
同时，对于胞外酶产量提高较大的重组菌G1Ees和G1Sec，测定其胞内酶产量，并分析其GOD分泌表达特性：摇瓶诱导培养144h，与对照菌8GM1相比，重组菌G1Ees的胞内外(总)GOD产量提高，分泌率下降，为0.65(对照为0.70)；重组菌G1Sec的胞内GOD产量下降，总GOD产量略有下降，但分泌率却显著提高，为0.82，即共表达EES提高重组菌G1Ees胞内外总GOD产量，而共表达SEC22提高重组菌G1Sec的GOD分泌率。
进一步在出发菌8GM1中联合共表达EES和SEC22，摇瓶诱导培养，与重组菌G1Ees相比，G1EeSe的胞外单位菌体酶产量提高，胞内降低，总产量略有提高，分泌率提高；与重组菌G1Sec相比，G1EeSe胞内外和总的单位菌体酶产量均提高，分泌率下降。诱导培养144h，重组菌8GM1，G1Sec，G1Ees和G1EeSe的胞外单位菌体GOD产量，总产量和分泌率分别为：22769.5，26031.2，43095.1，49065.2U/g DCW(胞外)；32550.4，31826.6，66172.3，67682.9(总)；0.70，0.82，0.65，0.72(分泌率)。即共表达SEC22可促进重组菌分泌GOD，共表达EES可促进重组菌产生、分泌GOD，两者作用较为独立，联合共表达二者，作用具有叠加性。
此外，联合共表达EES和SEC22，重组菌G1EeSe，较单独共表达EES，重组菌G1Ee，胞外单位菌体GOD产量进一步提高至G1Ee的1.14倍，是出发菌8GM1的2.15倍，在5-L反应器水平，其最高体积酶产量达到7223.0U/mL。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。
序列表
<110> 华东理工大学
<120> 提高毕赤酵母胞外葡萄糖氧化酶产量的方法及应用
<130> 21A098
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 210
<212> PRT
<213> Pichia pastoris
<400> 1
Met Lys Phe Gly Val Ser Val Phe Leu Thr Ile Ile Ser Leu Cys Gln
1 5 10 15
Leu Ala Leu Gly Ser Gln Val Thr Phe Val Leu Gly Ala Gln Asp Arg
20 25 30
Glu Cys Tyr Tyr Val Phe Asn Asn Lys Pro Gly Ser Asn Ile Gly Tyr
35 40 45
Tyr Phe Ala Val Gln Ser Gly Gly Ser Phe Asp Val Asp Tyr Gln Ile
50 55 60
Lys Ala Pro Asn Gly Lys Ile Ile Val Lys Glu Asn Lys Gln Arg Gln
65 70 75 80
Gly Asp Trp Val Phe Asn Ala Asp Gln Asn Gly Glu Tyr Glu Phe Cys
85 90 95
Phe Ser Asn Gly Met Ser Thr Phe Ala Glu Lys Val Val Asp Phe Glu
100 105 110
Ile Lys Leu Glu Asp Asp Asp Phe Arg Ala Ala Leu Pro Asn Ala Pro
115 120 125
Ser Gln Gln Val Ala Thr Asp Glu Ile His Arg Thr Ile Asn Ser Leu
130 135 140
Glu Glu Lys Leu Gln Thr Leu Thr Arg Asp Tyr Gln Tyr Tyr Lys Thr
145 150 155 160
Arg Asn Asn Arg Asn Gln Ser Thr Val Lys Ser Thr Glu Ser Arg Ile
165 170 175
Phe Tyr Phe Ser Ile Phe Asp Val Leu Leu Met Cys Gly Met Ala Gly
180 185 190
Phe Gln Val Ala Val Val Gln Leu Phe Phe Lys Gly Ser Arg Lys Gln
195 200 205
Leu Val
210
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> Pichia pastoris
<400> 2
Met Val Lys Ser Thr Leu Ile Phe Arg Asn Asp Gly Leu Pro Leu Ser
1 5 10 15
Ala Thr Val Asp Asp Asp Gln Thr Gln Asn Leu Thr Glu Gln Lys Asn
20 25 30
Gln Ala Lys Ala Ile Val Asn Lys Val Asn Ser Asn Ser Ala Thr Glu
35 40 45
Ala Ser Ile Arg Ser Gly Asn Tyr Thr Ile His Tyr Leu Leu Arg Glu
50 55 60
Ser Ile Val Phe Leu Val Ile Val Asp Lys Ser Phe Ser Arg Asn Leu
65 70 75 80
Ala Phe Ala Tyr Leu Gln Glu Ile Ala Asn Glu Phe Ile Asn Ser His
85 90 95
Gly Asn Ala Ala Leu Arg Ser Asp Thr Arg Pro Tyr Gln Phe Val Ser
100 105 110
Phe Asp Ser Phe Met Ser Lys Thr Lys Lys Leu Tyr Gln Asp Ser Arg
115 120 125
Thr Gln Ser Asn Leu Asp His Leu Asn Asn Glu Leu Ser Asp Val Lys
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Arg Ile Met Thr Lys Asn Ile Glu Asp Leu Leu Tyr Arg Gly Glu Ser
145 150 155 160
Leu Asp Asp Met Ser Asp Leu Ser Tyr Asn Leu Arg Ala Glu Ser Lys
165 170 175
Lys Tyr Arg Lys Ala Ala Arg Arg Ile Asn Leu Glu Ala Leu Ile Lys
180 185 190
Gln Tyr Val Pro Val Ala Met Val Gly Ile Phe Phe Val Phe Ile Ile
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Trp Trp Ile Phe Leu Arg
210
<210> 3
<211> 132
<212> PRT
<213> Pichia pastoris
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Ser Leu Phe Glu Thr Arg Ser Ala Ser Pro Tyr Asp Asp Ala Pro Ser
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Lys Lys Asp Tyr Lys Ala Ser Leu Leu Ser Gln Leu Glu Ser Gln Asn
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Glu Asp Glu Leu Ser Ser Met Ser Glu Lys Val Leu Met Leu Lys Asn
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Leu Gly Ser Arg Met Gly Asp Glu Ile Lys Asn Ser Gln Leu Asn Ile
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Asp Asp Leu His Ser Thr Met Thr Asn Thr Gln Thr Arg Leu Lys Asn
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Val Trp Leu Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<400> 14
aattctacgt atccactgac tatattggtc aacagaacca acaacaagaa aagttgtggc 60
acgttggaag agaatgacat g 81
<210> 15
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gatccatgat taatttaaac tcctttctta tacttacagt aacactgtta tctccagctt 60
tggcatacgt ag 72
<210> 16
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aattctacgt atgccaaagc tggagataac agtgttactg taagtataag aaaggagttt 60
aaattaatca tg 72
<210> 17
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gatccatgtt cctcaaaagt ctccttagtt ttgcgtctat cctaacgctt tgcaaggcct 60
acgtag 66
<210> 18
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aattctacgt aggccttgca aagcgttagg atagacgcaa aactaaggag acttttgagg 60
aacatg 66
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ttgcggccgc aaatgtcaag tcgctattcg tcaaacttac 40
<210> 20
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gctctagagc tcatctaagc cacacaaaaa agaacc 36
<210> 21
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ttgcggccgc aaatgaagtt tggggtttcc gtattt 36
<210> 22
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gctctagagc ctacaccaat tgttttctgg aaccc 35
<210> 23
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ttgcggccgc aaatgtgggt actaaactgg ttccagga 38
<210> 24
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gctctagagc ttaaatgtac tgagagagcc atctgatacc 40
<210> 25
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ttgcggccgc aaatggtaaa gtccaccttg atctttagaa ac 42
<210> 26
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gctctagagc tcagcgcaag aatatccacc atatt 35
<210> 27
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ttgcggccgc aaatgaaact gtattattta ggagtgatca agac 44
<210> 28
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gctctagagc ctacataatt aaacagcaag agtttgtctt c 41
<210> 29
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
atctgaatag cgccgtcgac atggttacaa ttggaaacgc acatga 46
<210> 30
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
atgatgatga tgatggtcga ttattgatcg acttcgccag cg 42
<210> 31
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
actttaaaga gtacgtagca ctagtaacat cc 32
<210> 32
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tcgtctttgg atgttactag gaagatcttc atccgcacaa acgaaggtct c 51
Claims (10)
1.一种提高毕赤酵母胞外葡萄糖氧化酶产量的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)在毕赤酵母中引入外源的(a)毕赤酵母信号肽-葡萄糖氧化酶表达盒，以及(b)以下蛋白的表达盒：SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白；
(2)培养步骤(1)的毕赤酵母，表达葡萄糖氧化酶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(b)中，还包括引入选自下组的蛋白的表达盒：SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白，或SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的蛋。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述毕赤酵母信号肽包括选自：SEQ IDNO:4所示氨基酸序列的信号肽；SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的信号肽；SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的信号肽；SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的信号肽；或SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的信号肽；
较佳地，所述毕赤酵母信号肽为SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的信号肽。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，(a)中，所述的毕赤酵母信号肽-葡萄糖氧化酶为1～15拷贝，较佳地为2～12拷贝，更佳地为3～10拷贝，更佳地为5～9拷贝。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(a)中，所述的葡萄糖氧化酶为突变型葡萄糖氧化酶，其第20位由Val突变为Trp，第30位由Thr突变为Val。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表达盒中还包括：适用于毕赤酵母表达的启动子和终止子；较佳地，所述启动子包括：AOX启动子、GAP启动子、DAS1启动子、FDH1启动子；较佳地，所述的终止子包括AOXTT、RPS3tt。
7.一种高产葡萄糖氧化酶的重组毕赤酵母，其特征在于，其中包含外源的：(a)毕赤酵母信号肽-葡萄糖氧化酶表达盒，以及(b)以下蛋白的表达盒：SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白。
8.如权利要求7所述的重组毕赤酵母，其特征在于，(b)中，还包括引入选自下组的蛋白的表达盒：SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白，或SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的蛋白；和/或
所述毕赤酵母信号肽包括选自：SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的信号肽；SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的信号肽；SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的信号肽；SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的信号肽；或SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的信号肽；较佳地，所述毕赤酵母信号肽为SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的信号肽；和/或
所述的毕赤酵母信号肽-葡萄糖氧化酶为1～15拷贝，较佳地为2～12拷贝，更佳地为3～10拷贝，更佳地为5～9拷贝；和/或
所述的葡萄糖氧化酶为突变型葡萄糖氧化酶，其第20位由Val突变为Trp，第30位由Thr突变为Val。
9.权利要求7或8所述的重组毕赤酵母的应用，用于生产葡萄糖氧化酶。
10.一种用于生产葡萄糖氧化酶的试剂盒，所述试剂盒中包括权利要求7或8所述的重组毕赤酵母。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202210094734.5A CN116536346A (zh) | 2022-01-26 | 2022-01-26 | 提高毕赤酵母胞外葡萄糖氧化酶产量的方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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Family
ID=87449343
Family Applications (1)
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Country Status (1)
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