CN114410496A - 一种提高毕赤酵母外源蛋白产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高毕赤酵母外源蛋白产量的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过过量表达热胁迫应答相关基因HSP78和SSA3，促进热胁迫应答机制的激活帮助胞内蛋白正确折叠，进而提升了毕赤酵母外源蛋白的产量。过量表达HSP78和SSA3后菌株的绿色荧光蛋白、脂肪酶和磷脂酶的表达量都有不同程度的提升，其中绿色荧光蛋白表达量最高提升50％，脂肪酶表达量最高提升57％，磷脂酶表达量最高提升81％，表明热激蛋白HSP78和SSA3在毕赤酵母表达外源蛋白、并提升外源蛋白的产量中具有更好的应用价值。

Description

一种提高毕赤酵母外源蛋白产量的方法

技术领域

本发明涉及一种提高毕赤酵母外源蛋白产量的方法，具体涉及一种激活热胁迫应答机制提高毕赤酵母外源蛋白产量的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

毕赤酵母是广泛用于工业生产的重要的细胞工厂，研究报道其可以表达从人类内皮抑素到蜘蛛牵丝蛋白等超过500种外源蛋白。并且，毕赤酵母表达系统在工业应用及实验室水平研究方面都具有诸多优势包括：(1)毕赤酵母自身蛋白分泌量少，外源蛋白在毕赤酵母中分泌量高可达其总蛋白的5％～40％；(2)毕赤酵母作为真核表达系统能对翻译后的蛋白进行加工和修饰作用；(3)毕赤酵母易于工业化；(4)毕赤酵母细胞培养基价格低廉；(5)外源蛋白基因可以在毕赤酵母基因组中整合表达，避免出现基因的丢失现象等。同时，FDA鉴定毕赤酵母为GARS菌株，符合食品级要求，已有许多毕赤酵母生产的食品酶被应用于食品行业。

毕赤酵母作为重要的工业应用菌株，提升其外源蛋白表达能力一直是研究的热点与难点。提高菌株外源蛋白表达水平常用的技术手段有基因的密码子优化、信号肽优化、基因拷贝数优化和蛋白折叠分泌途径优化等，鲜有研究从菌株自身环境耐受性角度出发来提高毕赤酵母的外源蛋白表达水平。

发明内容

[技术问题]

毕赤酵母外源蛋白表达能力常常受到环境逆境胁迫的影响，并且大量的未完全正确折叠的蛋白在胞内积累造成内质网压力，可能会影响毕赤酵母细胞的外源蛋白表达能力。热胁迫应答机制调控热激蛋白等伴侣分子协助胞内蛋白进行正确折叠。因此，适当激活毕赤酵母的热胁迫应答机制有望提高毕赤酵母的外源蛋白表达能力，为提高毕赤酵母外源蛋白表达量提供新的思路。

[技术方案]

在酵母细胞中热激胁迫应答通常在外源蛋白表达中激活起到促进作用。过量表达的外源蛋白在内质网-高尔基体途径中造成蛋白折叠与分泌的压力，导致蛋白错误折叠和聚集，并且进一步阻滞蛋白的成熟与分泌。细胞通过启动热激蛋白等伴侣蛋白的表达能协助胞内错误蛋白的正确折叠。热激蛋白的表达主要由热激转录因子诱导激活，促进热激蛋白的表达或许能在提高毕赤酵母外源蛋白表达中发挥重要作用。

HSP70家族热激蛋白的主要功能是保护从核糖体中出现的新生多肽与帮助蛋白质的靶向和易位，并在重新折叠受损的蛋白质或引导它们的发生泛素化和降解中都发挥重要作用。其中，热激蛋白SSA3和HSP78的主要功能为参与蛋白的降解和重折叠等。因此，本专利从热胁迫应答机制出发探究提高热激蛋白SSA3和HSP78的表达量对毕赤酵母外源蛋白表达的影响，本发明发现了热激蛋白SSA3和HSP78在提高毕赤酵母外源蛋白表达量中起到重要作用。

本发明提供了一种底盘细胞，所述底盘细胞为在宿主细胞中过表达来源于Komagataellaphaffii的HSP78或SSA3基因。

在一种实施方式中，所述HSP78基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述SSA3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在一种实施方式中，所述宿主细胞为原核或真核微生物。

本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的基因、或含有核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的基因的表达载体在提高宿主细胞外源蛋白产量中的应用。

在一种实施方式中，所述外源蛋白包括利用宿主细胞表达的任一蛋白。

在一种实施方式中，所述外源蛋白包括绿色荧光蛋白、磷脂酶或脂肪酶。

在一种实施方式中，所述表达载体包括pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K、pPIC9K或pGAPZα系列载体。

优选地，所述表达载体为pGAPZα。

在一种实施方式中，所述宿主细胞包括毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。

优选地，所述宿主细胞为毕赤酵母。

本发明提供了一种提高宿主细胞外源蛋白产量的方法，所述方法是在宿主细胞中过表达核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的基因，或向宿主细胞中转入表达核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的表达载体。

在一种实施方式中，所述表达载体包括pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K、pPIC9K或pGAPZα系列载体。

优选地，所述表达载体为pGAPZα。

在一种实施方式中，所述宿主细胞包括毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。

优选地，所述宿主细胞为毕赤酵母。

在一种实施方式中，所述外源蛋白包括绿色荧光蛋白、磷脂酶或脂肪酶。

[本发明的有益效果]

本发明通过在毕赤酵母中过表达来源于Komagataellaphaffii的热激蛋白HSP78和SSA3构建得到底盘细胞，在底盘中表达外源的蛋白，发现过量表达HSP78和SSA3都能提高毕赤酵母的外源蛋白表达量，获得两株外源蛋白表达量提高的毕赤酵母菌株。过量表达菌株的外源蛋白表达量能显著提高30％以上，因而热激蛋白HSP78和SSA3在毕赤酵母表达外源蛋白、并提升外源蛋白的产量中具有较好的应用价值。

附图说明

图1为重组质粒PGAP-SSA3图谱。

图2为重组质粒PGAP-HSP78图谱。

图3为过量表达HSP78和过量表达SSA3对毕赤酵母绿色荧光蛋白表达的影响。

具体实施方式

(1)下列实施例中涉及的培养基如下

YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)液体培养基(100mL)：1.0g酵母粉，2.0g蛋白胨，2.0g葡萄糖；

BMGY(Buffered Glycerol-complex Medium)培养基(100mL)：1.0g酵母粉，2.0g蛋白胨，1.0g甘油，100mM pH 6.0磷酸缓冲液，10％(v/v)YNB溶液；

BMMY(Buffered Methanol-complex Medium)培养基(100mL)：1.0g酵母粉，2.0g蛋白胨，1％(v/v)甲醇，100mM pH 6.0磷酸缓冲液，10％(v/v)YNB溶液。

(2)酶活的定义和检测方法

荧光强度分析步骤简述如下：接种菌株单克隆至YPD液体培养基中培养至其对数生长期；离心收集适量菌体，用PBS洗涤菌体沉淀，离心获得菌体沉淀，再次用PBS重新悬浮菌体沉淀；取200μL稀释后的菌悬液于可避光96微孔板；设置酶标仪参数488/525nm，读取荧光强度值，不同样品胞内荧光强度值以菌悬液OD₆₀₀值校准后进行比较。

脂肪酶酶活力测定原理：根据脂肪酶水解pNPP生成有颜色的对硝基苯酚和棕榈酸。对硝基苯酚溶液在410nm波长下有最大的吸收峰，因此通过其在410nm波长的吸收值可以测定脂肪酶水解活力。

反应过程：0.025mL适当稀释的酶液与0.6mL底物反应溶液吹吸混合均匀，40℃水浴2min后加入0.015mL反应终止液终止反应，测定A₄₁₀。

在40℃条件下，每分钟产生1μmol对硝基苯酚的酶量被定义为一个脂肪酶水解酶活国际单位。根据对硝基苯酚的标准曲线计算摩尔消光系数，按公式4-1进行计算脂肪酶的水解活性：

公式中V为反应体系的总体积(mL)；ε为摩尔消光系数(mL·mmol^-1)；t代表反应时间(min)；V′表示加入酶液的体积(mL)。

(3)电转化法

将DNA片段通过电转化转入毕赤酵母感受态，使其整合入毕赤酵母基因组，操作步骤简述如下：取1μL的质粒DNA与毕赤酵母感受态细胞轻轻吹吸混合均匀；将混合物转移至预冷的电转杯中，设置参数条件为2000V，5ms进行电转；电击后立即加入1mL预冷的1M山梨醇溶液，置于28℃金属浴复苏1～2h；取适量复苏菌液涂布于添加目的抗性的固体培养基上，置于30℃恒温培养箱培养3～4d；挑选阳性转化子进行下一步验证。

(4)基因表达水平检测方法-RT-qPCR法

对于通过液氮研磨法提取对数生长期的酵母细胞总RNA，将获得的总RNA按照反转录试剂盒说明书进行反转录反应，以获得的cDNA为模板进行RT-qPCR反应。以Actin作为看家基因，计算样品组和对照组的待测目的基因与看家基因的扩增Ct值差值，采用基因相对转录水平计算方法2^-ΔΔCt方式计算表达倍数，从而分析比较样品组与对照组待测目的基因的差异表达情况。

实施例1：过量表达热胁迫相关基因的质粒的构建

以毕赤酵母基因组为模板，利用P1和P2引物扩增HSP78基因片段(核苷酸序列如SEQID NO:1所示)；以载体pGAPZα为模板，利用P3和P4引物扩增载体片段，采用无缝克隆试剂盒将两个片段连接成环形质粒后立即转化至大肠杆菌感受态细胞，测序验证，得到测序正确的阳性转化子，从阳性转化子中提取质粒，得到过量表达质粒。

以毕赤酵母基因组为模板，P5和P6引物扩增SSA3基因片段(核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示)，以载体pGAPZα为模板，P7和P8引物扩增载体片段，采用无缝克隆试剂盒将两个片段连接成环形质粒后立即转化至大肠杆菌感受态细胞，测序验证，得到测序正确的阳性转化子，从阳性转化子中提取质粒，得到过量表达质粒。

P1：AACAACTATTTCGAAATGTTGAAAGCACGTACTGTCA，

P2：TTCTGTTTAGTCCTTAATAATTTCATATTCAGCAGG，

P3：ATTATTAAGGACTAAACAGAAGACGGGAGACACT，

P4：CTTTCAACATTTCGAAATAGTTGTTCAATTGAT，

P5：AACAACTATTTCGAAATGGGTAAATCAATTGGAATTGATTTGGG，

P6：CGTCTTCTGTTTAATCGACTTCTTCCACGGTT，

P7：GAAGAAGTCGATTAAACAGAAGACGGGAGACACT，

P8：ATTTACCCATTTCGAAATAGTTGTTCAATTGAT。

实施例2：过量表达HSP78和SSA3对毕赤酵母绿色荧光蛋白表达的影响

将实施例1中构建得到的过量表达质粒进行线性化，将线性化过量表达质粒转化到P_GAP启动子表达绿色荧光蛋白的毕赤酵母(此毕赤酵母的具体构建方法见文献Oxidativestress tolerance contributes to heterologous protein production in Pichiapastoris，公开于2021年)感受态中，构建毕赤酵母热胁迫相关基因过量表达重组菌株EGFP-SSA3和EGFP-HSP78。通过RT-qPCR的方式确定过量表达菌株中的SSA3和HSP78的基因转录水平分别比过量表达之前提高了4.7倍和6.3倍。

将构建得到的重组菌株EGFP-SSA3和EGFP-HSP78分别接种于YPD培养基中进行发酵培养。通过对产物蛋白绿色荧光蛋白的荧光强度测定来确定这些基因对毕赤酵母外源蛋白表达水平的影响。结果显示，过量表达热胁迫相关基因HSP78和SSA3能够提高绿色荧光蛋白的表达水平，分别提高30％和50％。

实施例3：过量表达HSP78和SSA3对其他外源蛋白发酵表达验证

通过将线性化过量表达质粒分别转化到表达脂肪酶(表达脂肪酶的毕赤酵母具体构建方法参见公开于2013年的文献Enhancement of lipase r27RCL production inPichia pastoris by regulating gene dosage and co-expression with chaperoneprotein disulfide isomerase中的菌株SRCL1)和磷脂酶(表达磷脂酶的毕赤酵母具体构建方法参见公开于2015年的文献Streptomyces violaceoruber Phospholipase A2:Expression in Pichia pastoris,Properties,and Application in Oil Degumming中的重组毕赤酵母GS115)的毕赤酵母感受态中，再次构建毕赤酵母热胁迫相关基因过量表达菌株。将过量表达菌株的单克隆于BMGY/BMMY培养基中发酵培养。通过RT-qPCR的方式确认基因的过量表达水平。

结果表明过量表达热胁迫基因HSP78后，脂肪酶表达水平提高45％，磷脂酶表达水平提高70％，其中HSP78转录水平分别提高了4.9倍和5.2倍；过量表达热胁迫基因SSA3后，脂肪酶表达水平提高57％，磷脂酶表达水平提高81％，其中SSA3转录水平分别提高了6.2倍和7.1倍。

本发明中所涉及的序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2如下所示：

SEQ ID NO:1:

ATGTTGAAAGCACGTACTGTCAAGCCTAACCAACTGAGACTAAATGCGTTGAGGGCAAAAGTTCCTAGGATACTGTTGGCCTCATCGCTATCGACATTGAGTCTTCGGACAAGCTCCAACACATTAGCTGTTAGACCGGTTCAACCGAAGATTCCCTTTGCCAGACATAATGTGAATCATTTACGACTAAGAACTCCGATGTCCATTAGGTTTGCCAGTAGCGGCGGCCCACAAATAAATATGAATGGACAGCAGGAGGAAGAATTGCCTGCTCTACAAAAATATGGTGTCAATTTGACTCAATTGGCCAAAGATGGAAAGCTTGATCCTGTTATCGGGAGGGATGAAGAGATTCGTCGTACGATTCAAATTTTGTCTCGTAGGACTAAGAACAACCCAGCTTTGATAGGAAATGCTGGTACAGGTAAAACTGCCATCATGGAAGGACTTGCTCAGAGAATTATCAAAGGAGAGGTCCCTGAAAGTATGAAGGATAAAGAAGTTGTCGCCCTTGATCTTGGATCATTGATTTCAGGTGCCAAGTTTAGAGGTGAATTTGAAGAGCGTTTGAAAGCTGTATTGAAAGAGCTGGACGAGGCCCATGGCAACATTATCCTGTTTATCGACGAACTACACATACTATTGGGGCTAGGTAAAGCAGAAGGTTCAATTGATGCATCAAACTTGTTGAAACCCGCTCTGGCTAGAGGCCAATTGCAATGTTGTGGAGCAACAACAATTGAGGAATACAGAAAATACATTGAAAAAGATGCTGCATTAGCAAGAAGATTCCAAAGTGTTTTGGTTAATGAGCCATCCGTACAAGATGCTATTAGCATACTAAGAGGATTGAAAGAAAAATATGAGATTCATCATGGTGTTCGTATAACTGACTCGGCACTGGTCACCGCCGCCGTGTATTCTAATCGTTATATCACAGACAGATTCTTGCCTGATAAGGCCATTGATTTAGTTGATGAAGCATGCTCCGCCTTGCGTTTACAACATGAGTCTAAGCCCGATGTTATCCAACAATTGGATCGCCAAATCATGACCATCCAGATTGAATTGGAATCTTTGAGAAAAGAAACTGACCCGATTTCCGTAGAAAGAAGAGATAAGCTAGATGAACAGCTGAAACTTAAAAAGGAAGAACTGGAAAGGTTGACTCAGGTCTGGGAAGATGAAAAGAATAGCTTGGAGAAGATCAAGACTGCCAAGGAAGAACTCGAACAATCGAAACTAGAGTTAGAAAGGGCACAAAGGGAAGGTGATTTTGGAAAGGCATCCATGCTAAGGTATTCCAAGATTCCAGAACTTGAGCAAAAAGTTTCTGCTACTGCTCAAAGAGTCAAAGAAGGAGAGTCTGAAACGACCACCAATTTACTTCATGAATCAGTTACTTCAGATGACATTGCTTGGGTTGTTTCAAAAATGACGGGTGTTCCGGTTCAATCATTGATGAAAGGTGAGAAGGACAAGCTGTTATACATGGAGGAATCCATCAAGTCTAGAGTTATAGGTCAGGATGAAGCAATTCATTCAGTTGCCGATGCAGTCAGACTTCAAAGAGCTGGTCTTACAAACGAAAAAAGACCTATTGCAAGCTTTATGTTTTTGGGTCCTACTGGTACTGGTAAGACTGAACTCACTAAGTCCCTGGCAGAATTTTTATTCAACGACGAGAATGCTGTGGTGAGGTTTGACATGTCTGAATTTCAGGAGAGACACTCTTTGTCGAGACTGATAGGAGCTCCACCTTCATACGTAGGTTTTGAAGAAGGAGGTGAACTAACAGAAGCTGTCAGACGTAAACCATATGCAGTTGTCTTATTTGATGAATTTGAAAAGGCACATCGGGACATTTCCAAACTGATGCTTCAGATTCTCGATGAAGGTAACTTGACAGATTCTCAGGGACACAAGATTGACTTTAAAAATACTATCATTATCATGACATCCAATCTTGGCCAAGATTTATTATTGGCTGACACAGAACTTGAAAATGTCGGTGGAAAAGTTAGTGAGAAGACTAAGAATGAAGTCATACAGGTAATGAAACAGAACTACCCACCTGAGTTTATCAATAGACTGGATGACGTTTTGGTCTTCAATAGACTCTCGAGAGAGTCCTTGAGAAAGATTGTTGACATCAGATTGAGTGAAGTCCAAGACAGATTGGTTGATAGAAGAATTGAGCTCAAGCTCACAGACGCTGCCAAGGAATGGCTCACAGAGAAGGGATATGACCCATTGTATGGTGCTAGACCTTTGAACAGAGTCATTAAGAAGCAGCTGCTGAACCCTCTTTCCATTAGATTGATTCAAGGAGAGATTACCAATAACTCAACTGTCAAGGTTGACCTTGTTGATGGTGATTTACAGATCACAAGTGAGAAGAATGAAGCTGAGGCAGAGACTGTCCGTAAGGAGGATGGCGATGAGCCTGCTGAATATGAAATTATTAAGGACTAA

SEQ ID NO:2:

ATGGGTAAATCAATTGGAATTGATTTGGGTACCACATACTCTTGTGTGGCACATTTTGCTAATGATCGTGTTGAGATCATAGCTAACGACCAAGGTAACAGGACGACTCCATCGTTCGTCGCCTTTACCGACACTGAAAGATTGATTGGTGATGCTGCAAAGAACCAAGCTGCCATGAATCCAGCTAACACTGTTTTCGATGCCAAACGTTTAATCGGTAGAAAATTCGACGACCCGGAAACTCAGGCCGATATTAAGCACTTCCCTTTCAAAGTTATCAACAAGGGGGGAAAGCCTAATATCCAAGTCGAATTTAAGGGTGAGACTAAGGTTTTCAGCCCCGAAGAGATTTCCTCCATGGTTCTAACAAAAATGAAGGATACTGCTGAGCAGTATTTGGGTGAGAAAATCAACGATGCAGTTGTCACTGTTCCTGCTTACTTCAATGACTCTCAAAGACAAGCCACCAAGGATGCTGGTTTGATTGCTGGTTTGAACGTTCAAAGAATCATTAATGAGCCCACCGCTGCCGCAATTGCTTACGGGTTGGACAAGAAGGATGCAGGCCACGGTGAGCACAACATTCTAATCTTCGATCTAGGTGGAGGAACTTTCGATGTTTCTCTACTATCTATTGATGAGGGTATTTTCGAAGTCAAGGCCACCGCAGGTGACACCCACTTGGGTGGTGAGGACTTCGATAACAGATTAGTCAACCACTTTATCGCCGAGTTCAAGAGAAAGACCAAGAAAGATCTTTCTACAAACCAGAGATCCCTTAGAAGACTAAGAACCGCTTGTGAGCGTGCAAAGAGAACTTTGTCTTCTTCTGCTCAGACCTCCATCGAGATTGATTCTTTGTTCGAGGGTATCGACTTCTACACCTCGATCACTAGAGCTAGATTCGAGGAGCTCTGTGCCGACTTGTTCAGATCCACCATCGAGCCTGTTGAGAGAGTCTTGAAAGACTCCAAGTTGGACAAATCTCAAGTTCATGAGATTGTTTTGGTTGGTGGTTCTACCAGAATTCCAAAGGTTCAGAAATTAGTTTCTGACTTTTTCAATGGTAAGGAGCCAAACAAGTCCATCAACCCAGACGAAGCCGTTGCATATGGTGCTGCTGTCCAAGCAGCTATTTTGTCTGGAGATACTTCTTCCAAGACACAAGACTTGTTATTGCTGGATGTTGCTCCTCTATCTTTGGGTATTGAAACCGCTGGTGGTATCATGACCAAGCTGATCCCAAGAAACTCCACAATCCCAGCCAAAAAGTCAGAAATCTTTTCGACATATGCTGACAACCAACCAGGTGTTTTGATTCAAGTCTTTGAAGGTGAGAGAACTAGAACCAAGGACAACAACCTGTTGGGTAAGTTTGAACTTTCTGGTATTCCTCCTGCTCCAAGAGGTGTTCCTCAAATTGAGGTCACCTTCGATATGGATGCCAACGGTATTTTGAATGTATCTGCTGTTGAGAAGGGTACCGGTAAGACTCAAAAGATTACTATTACCAACGATAAGGGAAGATTGTCCAAGGAAGACATCGAGAGAATGGTTTCTGAAGCTGAAAAATTCAAGGATGAAGACGAGAAGGAAGCCGAGAGAGTTGCTGCCAAGAATGGCTTGGAATCATATGCTTACTCTCTGAAGAACTCTGCAGCTGAATCTGGATTCAAGGACAAGGTTGGAGAGGATGATCTTGCCAAGTTGAACAAGTCAGTTGAAGAGACAATATCTTGGTTAGATGAGTCACAATCTGCTTCCACAGACGAGTACAAGGACAGGCAAAAGGAATTGGAAGAAGTTGCTAACCCAATAATGAGCAAGTTCTATGGAGCTGCTGGTGGAGCTCCTGGTGGAGCTCCTGGTGGCTTCCCTGGAGGTTTCCCTGGCGGAGCTGGCGCAGCTGGCGGTGCCCCAGGTGGTGCTGCCCCAGGCGGAGACAGCGGACCAACCGTGGAAGAAGTCGATTAA

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高毕赤酵母外源蛋白产量的方法

<130> BAA220039A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2475

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgttgaaag cacgtactgt caagcctaac caactgagac taaatgcgtt gagggcaaaa 60

gttcctagga tactgttggc ctcatcgcta tcgacattga gtcttcggac aagctccaac 120

acattagctg ttagaccggt tcaaccgaag attccctttg ccagacataa tgtgaatcat 180

ttacgactaa gaactccgat gtccattagg tttgccagta gcggcggccc acaaataaat 240

atgaatggac agcaggagga agaattgcct gctctacaaa aatatggtgt caatttgact 300

caattggcca aagatggaaa gcttgatcct gttatcggga gggatgaaga gattcgtcgt 360

acgattcaaa ttttgtctcg taggactaag aacaacccag ctttgatagg aaatgctggt 420

acaggtaaaa ctgccatcat ggaaggactt gctcagagaa ttatcaaagg agaggtccct 480

gaaagtatga aggataaaga agttgtcgcc cttgatcttg gatcattgat ttcaggtgcc 540

aagtttagag gtgaatttga agagcgtttg aaagctgtat tgaaagagct ggacgaggcc 600

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gaaggttcaa ttgatgcatc aaacttgttg aaacccgctc tggctagagg ccaattgcaa 720

tgttgtggag caacaacaat tgaggaatac agaaaataca ttgaaaaaga tgctgcatta 780

gcaagaagat tccaaagtgt tttggttaat gagccatccg tacaagatgc tattagcata 840

ctaagaggat tgaaagaaaa atatgagatt catcatggtg ttcgtataac tgactcggca 900

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agaaaagaaa ctgacccgat ttccgtagaa agaagagata agctagatga acagctgaaa 1140

cttaaaaagg aagaactgga aaggttgact caggtctggg aagatgaaaa gaatagcttg 1200

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<211> 1974

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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actcaggccg atattaagca cttccctttc aaagttatca acaagggggg aaagcctaat 300

atccaagtcg aatttaaggg tgagactaag gttttcagcc ccgaagagat ttcctccatg 360

gttctaacaa aaatgaagga tactgctgag cagtatttgg gtgagaaaat caacgatgca 420

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attactatta ccaacgataa gggaagattg tccaaggaag acatcgagag aatggtttct 1560

gaagctgaaa aattcaagga tgaagacgag aaggaagccg agagagttgc tgccaagaat 1620

ggcttggaat catatgctta ctctctgaag aactctgcag ctgaatctgg attcaaggac 1680

aaggttggag aggatgatct tgccaagttg aacaagtcag ttgaagagac aatatcttgg 1740

ttagatgagt cacaatctgc ttccacagac gagtacaagg acaggcaaaa ggaattggaa 1800

gaagttgcta acccaataat gagcaagttc tatggagctg ctggtggagc tcctggtgga 1860

gctcctggtg gcttccctgg aggtttccct ggcggagctg gcgcagctgg cggtgcccca 1920

ggtggtgctg ccccaggcgg agacagcgga ccaaccgtgg aagaagtcga ttaa 1974

Claims (10)

1.一种底盘细胞，其特征在于，在宿主细胞中过表达来源于Komagataellaphaffii的HSP78或SSA3基因。

2.根据权利要求1所述的底盘细胞，其特征在于，所述HSP78基因的核苷酸序列如SEQID NO:1所示；所述SSA3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根据权利要求1所述的底盘细胞，其特征在于，所述宿主细胞为原核或真核微生物。

4.核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的基因、或含有核苷酸序列如SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2所示的基因的表达载体在提高宿主细胞外源蛋白产量中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述外源蛋白包括利用宿主细胞表达的任一蛋白。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述表达载体包括pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K、pPIC9K或pGAPZα系列载体。

7.根据权利要求4～6任一所述的应用，其特征在于，所述宿主细胞包括毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。

8.一种提高宿主细胞外源蛋白产量的方法，其特征在于，在宿主细胞中过表达核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的基因，或向宿主细胞中转入表达核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的表达载体。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述表达载体包括pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K、pPIC9K或pGAPZα系列载体。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述外源蛋白包括绿色荧光蛋白、磷脂酶或脂肪酶。

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