CN117947077A - 一种高效表达非特异性过氧化酶毕赤酵母重组菌株的构建方法 - Google Patents
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Abstract
一种高效表达非特异性过氧化酶毕赤酵母重组菌株的构建方法，属于基因工程技术领域。其包括以下步骤：1)构建质粒；2)易错PCR突变体库构建；3)高拷贝菌株的构建；4)共表达分子伴侣。本发明至少具有以下优点：本发明以毕赤酵母GS115为出发菌，通过易错PCR文库构建、构建高拷贝菌株和共表达分子伴侣蛋白，实现PaDa‑I的高效分泌，底物为甲醇，发酵成本低，分离纯化过程简单，在制备PaDa‑I中具有潜力。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种高效表达非特异性过氧化酶毕赤酵母重组菌株的构建方法。
背景技术
茶树菇(Agrocybeaegerita)的非特异性过氧化酶(AaeUPO)是高度糖基化的硫代血红素酶，UPO是以H2O2为电子受体，不需要任何辅因子，与P450酶相比具有独特的优势。AaeUPO可催化脂肪族和芳香族化合物的羟基化、环氧化、脱烷基等反应。
除此之外，Aae UPO也成功应用于医疗行业，Aae UPO催化胆钙化醇和麦角钙化醇生成25-单羟基维生素(LUCAS F,BABOT E D,M,et al.Catal Sci Technol,2016,6(1):288-295)，该产物既是维生素，也是一种类固醇激素，它在促进钙的吸收利用、调节激素分泌和免疫功能等方面均发挥重要作用，是人类健康重要的化合物。
但Aae UPO的活性和表达量较低，这一因素成为了其在工业上大规模应用的主要限制因素。利用大肠杆菌生产UPO，无法对UPO进行糖基化等翻译后加工，存在二硫键和空间构象折叠不正确等问题，因此得到具有生物活性的蛋白的几率较小。然而利用黑曲霉表达UPO，内源蛋白分泌会竞争性消耗黑曲霉UPO表达通路中的资源，降低表达量，且不利于UPO的下游分离纯化。
毕赤酵母表达系统具有分泌型的表达形式，可获得了很多高产量的可溶性蛋白，且甲醇诱导型毕赤酵母菌株在真核蛋白表达及分析中非常有用，具有成本低、易于操作、适用于大规模发酵制备等优点。毕赤酵母具有进行糖基化修饰功能，有利于糖蛋白UPO的功能表达、毕赤酵母表达系统表达的蛋白与天然蛋白的活性和构象更接近，这为后续蛋白的分离纯化奠定了基础。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种高效表达非特异性过氧化酶毕赤酵母重组菌株的构建方法的技术方案。本发明以毕赤酵母GS115为出发菌，以茶树菇非特异性过氧化物酶突变体PaDa-I为基础，通过易错PCR文库构建、构建高拷贝菌株和共表达分子伴侣蛋白，构建了一种重组毕赤酵母菌株，从而提供了一种提高茶树菇非特异性过氧化物酶活性的方法。
本发明具体采用以下技术方案实现：
本发明第一方面提供了一种高效表达非特异性过氧化酶毕赤酵母重组菌株的构建方法，其包括以下步骤：
1)构建质粒：以茶树菇非特异性过氧化物酶突变体PaDa-I为基础，采用SPGma信号肽代替毕赤酵母内源信号肽，将SPGma信号肽与线性化质粒克隆连接得到重组质粒，所述SPGma信号肽序列如SEQ ID NO:2所示；
2)易错PCR突变体库构建：以步骤1)得到的重组质粒为模板进行易错PCR扩增获得易错PCR产物，将易错PCR产物与线性化质粒克隆连接获得重组质粒，将重组质粒Ⅱ转入毕赤酵母，并筛选阳性转化子，所有转化子构成易错PCR突变体库；从易错PCR突变体库中筛选出成功构建的重组质粒和重组菌株；
3)高拷贝菌株的构建：将步骤2)得到的重组质粒转入毕赤酵母，筛选得到高拷贝重组菌株；
4)共表达分子伴侣：将步骤3)得到的高拷贝重组菌株进行分子伴侣共表达优化，并验证其是否能够稳定表达，得到重组酵母菌株。
进一步，所述线性化质粒为pPICZαA-PaDa-I，所述质粒载体为pPICZαA。
进一步，所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。
进一步，所述分子伴侣包括HAC1、PDI和Ero1。
本发明第二方面提供了上述任一方法制备的高效表达非特异性过氧化酶毕赤酵母重组菌株。
本发明第三方面提供了信号肽优化和伴侣共表达优化的组合策略在提高非特异性过氧化酶分泌效率及酶活中的应用。
本发明至少具有以下优点：本发明以毕赤酵母GS115为出发菌，通过易错PCR文库构建、构建高拷贝菌株和共表达分子伴侣蛋白，实现PaDa-I的高效分泌，底物为甲醇，发酵成本低，分离纯化过程简单，在制备PaDa-I中具有潜力。
附图说明
图1为重组表达载体pPICZαA-PaDa-I-SPGma质粒图。
图2为重组菌MPGma,4MPGma摇瓶诱导培养96h酶活。
图3为内参基因GAP标准曲线。
图4为目的基因PaDa-I标准曲线。
图5为Ero1、HAC1和PDI等3中目的基因PCR产物电泳图，图中图注：泳道1：Ero1，泳道2：HAC1，泳道3：PDI。
图6为表达载体pPICZαA-HAC1/PDI构建示意图。
图7为4MPGma-HAC1、4MPGma-PDI、4MPGma-Ero1、4MPGma-HAC1/Ero1、4MPGma-HAC1/PDI、和4MPGma-Ero1/PDI摇瓶诱导培养96h酶活。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明本发明。
本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
上游基因工程操作所用试剂：本发明实施例中使用的一步克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自Axygen杭州有限公司；易错PCR试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司；E.coli BL21(DE3)购自上海生工，质粒pPICZαA、pPIC9K等购自杭州弘赛生物科技有限公司；DNA marker、琼脂糖电泳试剂、引物合成与基因测序工作由杭州擎科生物技术有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。
实施例1：重组载体的构建
以茶树菇非特异性过氧化物酶突变体PaDa-I(SEQ ID NO.1)为基础，为增加其在毕赤酵母的表达量，在PaDa-I的基础上，采用SPGma(SEQ ID NO.2)信号肽代替其内源信号肽(前4 3个氨基酸)。将合成的Gma-F(ATGCGAGGAACGCCCATATTTGCTTCTCTCATAGCGCTCTTC)序列和Gma-R(GCGAATTTCCAACGTAGGAAGTATTTCGTCGAGCTGCTCC)序列进行退火反应，得到SPGma信号肽序列(SEQ ID NO.2)与线性化质粒pPICZαA-PaDa-I一步克隆连接起来，线性化所用引物为：PaDaI-F(TTCCTACGTTGGAAATTCGCGAACCTGGTTTGCCACCTGGTC)和PaDaI-R(AATATGGGCGTTCCTCGCATCGTTTCGAATAATTAGTTGTTTTTTGATC)，然后热激转化至大肠杆菌BL21的感受态细胞中，涂布于含25μg/mL博莱霉素抗生素的LB固体培养基上，过夜培养，经测序，重组载体pPICZαA-PaDa-I-SPGma构建成功，构建过程如图1所示。重组载体pPICZαA-PaDa-I-SPGma经内切酶PmeI线性化后，电击转化到毕赤酵母GS115感受态中,涂布于YPD培养基平板(含100μg/mL博莱霉素)，置于30℃，培养3天。待YPD板上长出单菌落，挑取单菌落，随后进行PCR菌落验证，并送杭州擎科测序,根据测序结果，重组菌株构建成功，命名为PGma。
按照2％(v/v)接种比例取试管种子液转接至装有25mL BMGY液体培养基的锥形瓶，30℃、200rpm培养至种子液OD600达到2-6左右。将种子液转入无菌50mL离心管，4℃、5000rpm离心收集菌体。将菌体沉淀全部转接至装有35mL BMMY液体培养基锥形瓶，30℃、200rpm摇瓶发酵。每24h向培养基中按照1％(v/v)比例添加甲醇诱导，诱导96h结束。
将菌液在4℃，5000rpm离心10分钟，收集上清液。将获得的粗酶液用ABTS法测定酶活，方法如下：96孔板中依次加入100mM磷酸盐缓冲液(pH 4.4)158μL，3mMABTS20μL，粗酶液20μL，充分混匀后加入0.2M H2O22μL，在418nm波长检测其吸光值变化。代入公式计算酶活，酶活＝Ew×Vtotal×Vsample -1×ε-1×d-1，其中Vsample代表待测酶液体积，ε摩尔吸光度值；d为比色皿直径；Vtotal代表测定体系总体积，Ew样品吸光度。经计算酶活为0.9U/mL。
酶活定义：在25℃和pH 4.4条件下，每分钟水解1μmol底物(ABTS)生成对应产物(ABTS自由基)所需的酶量为1个酶活单位(U)
实施例2：易错PCR突变体库构建
以构建好的pPICZαA-PaDa-I-SPGma质粒为模板，用引物EPGma-F(AAAAACAACTAATTATTCGAAACGATG)和EPGma-R(CCAGGTGGCAAACCAGGTTC)进行易错PCR扩增获得突变的SPGma信号肽序列。
易错PCR反应体系为：
易错PCR反应参数：
将易错PCR产物与线性化的质粒pPICZαA-PaDa-I通过一步克隆连接获得重组质粒，重组质粒经内切酶PmeI线性化后电转至毕赤酵母GS115，涂布于YPD平板(含100μg/mL博莱霉素)筛选阳性转化子，所有转化子构成易错PCR突变体库。
高通量筛选酶活提高突变菌株；从YPD平板上挑选单个克隆子菌落接种于含有300μL YPD培养基的48孔板中，每孔对应一个转化子，每块48孔板同时接种菌株PGma，作为阳性对照，30℃、220rpm振荡培养24h，然后每孔加入600μLBMGY培养基培养48h后，加入400μLBMMY培养基，并每24h添加1％(v/v)甲醇诱导，诱导96h后，离心取上清用ABTS法测定酶活，以重组菌株PGma作为对照，将酶活高于对照的克隆子挑出。
经过构建突变体库，筛选300个克隆，筛选出一株酶活提高的克隆子，此即为目的克隆菌株。试管活化，并与对照进行对比，进行摇瓶诱导培养，后取上清液测定酶活，结果显示该突变体酶活为1.09U/mL，酶活提升了21.1％。
菌落PCR验证后，送杭州擎科测序，进行序列分析，分析突变碱基位点及氨基酸位点对酶活的影响。测序结果显示突变酶基因发生了1个突变，为A17D，突变体具体序列如SEQID NO.3所示，即成功构建重组质粒pPICZαA-PaDa-I-MSPGma，该突变菌株命名为MPGma。
实施例3：高拷贝菌株的构建
在重组菌MPGma的基础上，进一步优化PaDa-I的基因剂量以提高重组菌分泌表达PaDa-I。将经内切酶PmeI线性化的质粒pPICZαA-PaDa-I-MSPGma，电击转化到毕赤酵母GS115感受态中，并涂布于含不同博莱霉素浓度(100，200，400，600和800μg/mL)的YPD平板上，进行博莱霉素浓度梯度筛选。
如图2所示，通过筛选获得一株酶活提高较大的重组菌4MPGma，经摇瓶诱导培养96h，离心收集上清液，ABTS法测定酶活为1.98U/mL。对比重组菌MPGma酶活提升了81.7％。
采用荧光定量PCR的双标准曲线法检测菌株4MPGma中PaDa-I基因拷贝数：
构建标准质粒；构建内参基因GAP标准质粒pMD20-GAP及目的基因标准质粒pMD20-MPGma。以毕赤酵母基因组为模板，PCR扩增GAP基因片段，扩增引物为GAP-F(ATCTACTAGTCATATGGATTTTAAGCCTTAGCAACGTGTTGC)/GAP-R(TC GGTACCCGGGGATCCGATATGGCTATCACTGTCGGTATTAACG)；以重组质粒pPICZαA-PaDa-I-MSPGma为模板，PCR扩增PaDa-I基因片段(含信号肽)，扩增引物为
MPGma-F(ATCTACTAGTCATATGGATTATGCGAGGAACGCCCATATT)/MPGma-R(TTCAGATCCTCTTCTGAGATTCTAGAATCTCTACCGTATGGGAAAA)。与经BamHI/XbaI双酶切后的pMD20质粒连接，转化大肠杆菌后涂布于氨苄青霉素抗性平板37℃过夜培养。挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，通过测序验证，得到标准质粒pMD20-GAP和pMD20-MPGma。
RT-PCR双标准曲线的制作；用微量核酸定量仪检测pMD20-GAP质粒和pMD20-MPGma质粒的质量浓度；根据以下公式换算拷贝数：拷贝数＝6.02×1023×质粒质量浓度/(660×M)，其中M代指所测基因长度(bp)。将质粒溶液用双蒸馏水稀释成103、104、105、106以及107个拷贝/μL的质粒梯度稀释液，分别用1μL各质粒梯度稀释液作为模板，以RT-GAP-F(ATCTACTAGTCATATGGATTTTAAGCCTTAGCAACGTGTTGC)/RT-GAP-R(TCGGTACCCGGGGATCCGATATGGCTATCACTGTCGGTATTAACG)、RT-MGma-F(ATCTACTAGTCATATGGATTATGCGAGGAACGCCCATATT)/RT-MGma-R(TTCAGATCCTCTTCTGAGATTCTAGAATCTCTACCGTATGGGAAAA)为引物，进行荧光定量PCR分析。每个样品重复检测3次，每次检测做3个平行样品。以荧光定量PCR给出的Ct值为纵坐标，质粒拷贝数为横坐标，建立双标准曲线，见图3和图4所示。
重组菌株4MPGma中PaDa-I基因拷贝数的确定；以重组菌株4MPGma基因组DNA 1μL为模板，进行荧光定量PCR，将得到的Ct值分别代入双标准曲线中，求出基因组DNA样品中GAP基因和PaDa-I基因的起始模板拷贝数。GAP基因在毕赤酵母的基因组中以单拷贝的形式存在，故PaDa-I基因拷贝数＝PaDa-I基因的起始模板拷贝数/GAP基因起始模板拷贝数。
分析结果表明，重组菌株4MPGma基因组中含有4个PaDa-I基因的拷贝数。
实施例4：共表达分子伴侣及相应菌株的构建
以毕赤酵母GS115基因组为模板，分别扩增HAC1(996bp)、Ero1(1584bp)、PDI(1554bp)等3种基因，扩增引物分别为HAC1-F(ATGCCCGTAGATTCTTCTCATAAGA)/HAC1-R(TCACCTGATCGCTATGCATGTC)/Ero1-F(ATGAGGATAGTAAGGAGCGTAGCTATC)/Ero1-R(TTACAAGTCTACTCTATATGTGGTATCTCGGTG)/PDI-F(ATGCAATTCAACTGGAATATTAAAACTG)/PDI-R(TTAAAGCTCGTCGTGAGCGTCTG)。结果如图5所示，片段长度符合预期。与经EcoR I/Not I双酶切后的线性化质粒pPIC9K连接，然后转化至大肠杆菌BL21的感受态细胞中，在含有Amp抗生素的平板上筛选转化子，以构建含不同分子伴侣的表达载体pPIC9K-HAC1、pPIC9K-Ero1和pPIC9K-PDI。对所构建的质粒进行菌落PCR验证并测序，所用引物为pPIC9K质粒通用验证引物，测序结果表明3种共表达质粒均构建成功。类似的，分别以质粒pPIC9K-Ero1和pPIC9K-PDI为模板，采用PCR扩增获得带有AOX1启动子和AOX1TT终止子的PDI和Ero1表达单元，将目的片段按排列组合的方式分别与线性化载体pPIC9K-HAC1、pPIC9K-Ero1连接，获得联合共表达质粒pPIC9K-HAC1/Ero1，pPIC9K-HAC1/PDI，pPIC9K-Ero1/PDI，质粒构建图如图6所示,以pPIC9K-HAC1/PDI为例。测序结果表明质粒均构建成功。然后分别将各重组质粒电击转化至重组菌4MPGma感受态中，筛选获得阳性转化子。根据杭州擎科公司测序结果显示，共表达分子伴侣重组菌株4MPGma-HAC1、4MPGma-PDI、4MPGma-Ero1、4MPGma-HAC1/Ero1、4MPGma-HAC1/PDI、和4MPGma-Ero1/PDI均构建成功。
为了考察共表达3种分子伴侣对重组菌分泌表达PaDa-I的影响，对以上6种重组菌进行诱导培养，按照2％(v/v)接种比例取试管种子液转接至装有25mL BMGY液体培养基的锥形瓶，30℃、200rpm培养至种子液OD600达到2-6左右。将种子液转入无菌50mL离心管，4℃、5000rpm离心收集菌体。将菌体沉淀全部转接至装有35mL BMMY液体培养基锥形瓶，30℃、200rpm摇瓶发酵。每24h向培养基中按照1％(v/v)比例添加甲醇诱导，诱导96h结束。并以重组菌4MPGma作为对照。诱导96h后，收集上清液测定酶活，结果如图7所示，从图中可以看出过表达分子伴侣PDI、Ero1-PDI、HAC1-PDI对应的酶活分别为3.25U/mL、5.0U/mL、4.89U/mL，分别为对照组的1.64倍、2.52倍、2.46倍。
Claims (6)
1.一种高效表达非特异性过氧化酶毕赤酵母重组菌株的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
1)构建质粒：以茶树菇非特异性过氧化物酶突变体PaDa-I为基础，采用SPGma信号肽代替毕赤酵母内源信号肽，将SPGma信号肽与线性化质粒克隆连接得到重组质粒，所述SPGma信号肽序列如SEQ ID NO:2所示；
2)易错PCR突变体库构建：以步骤1)得到的重组质粒为模板进行易错PCR扩增获得易错PCR产物，将易错PCR产物与线性化质粒克隆连接获得重组质粒，将重组质粒Ⅱ转入毕赤酵母，并筛选阳性转化子，所有转化子构成易错PCR突变体库；从易错PCR突变体库中筛选出成功构建的重组质粒和重组菌株；
3)高拷贝菌株的构建：将步骤2)得到的重组质粒转入毕赤酵母，筛选得到高拷贝重组菌株；
4)共表达分子伴侣：将步骤3)得到的高拷贝重组菌株进行分子伴侣共表达优化，并验证其是否能够稳定表达，得到重组酵母菌株。
2.如权利要求1所述的一种高效表达非特异性过氧化酶毕赤酵母重组菌株的构建方法，其特征在于所述线性化质粒为pPICZαA-PaDa-I，所述质粒载体为pPICZαA。
3.如权利要求1所述的一种高效表达非特异性过氧化酶毕赤酵母重组菌株的构建方法，其特征在于所述毕赤酵母为毕赤酵母GS115。
4.如权利要求1所述的一种高效表达非特异性过氧化酶毕赤酵母重组菌株的构建方法，其特征在于所述分子伴侣包括HAC1、PDI和Ero1。
5.权利要求1-4任一项所述的方法制备的高效表达非特异性过氧化酶毕赤酵母重组菌株。
6.信号肽优化和伴侣共表达优化的组合策略在提高非特异性过氧化酶分泌效率及酶活中的应用。
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