CN105349569B - 一组不同启动子介导的蛋白酶高通量筛选载体及筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组不同启动子介导的蛋白酶高通量筛选载体及筛选方法。本发明通过在pESD载体上插入不同转录强度的启动子GALX，构建了GALX–pESD‑GAL1/GAL10‑Aga2‑FLAG‑HA重组质粒，在相应的启动子后插入底物序列与酶突变体库，利用荧光标记技术和流式细胞仪检测细胞表面展示的蛋白，根据细胞表面荧光的强弱，从而分析底物与酶的不同比例下底物的酶切情况。这种方法在蛋白酶进化过程中，可以控制酶与底物的浓度在1:2到1:100之间，利用启动子转录的强弱来逐步提高酶活，最终获得高活性的蛋白酶突变体。

Description

一组不同启动子介导的蛋白酶高通量筛选载体及筛选方法

技术领域

本发明涉及的是蛋白酶高通量筛选技术，具体涉及一组不同启动子介导的蛋白酶高通量筛选载体及筛选方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

蛋白酶是指通过断裂氨基酸的酰胺键来水解蛋白质的一类酶。蛋白酶的种类很多，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶等，这些酶在工业生产及日常生活中都有着广泛的应用。随着蛋白酶的需求量日益剧增，蛋白酶的筛选方法也在不断探索更新。

先前的蛋白酶筛选方法中，主要是通过观看水解圈的有无及水解圈的大小来筛选目标蛋白酶，这种方法操作简单但工作量大，使用范围很局限，只适合小量筛选蛋白酶。随后在分子生物学的基础上，研究人员为了获得高活性的蛋白酶，通过分子改造，构建蛋白酶突变体库，水解圈筛选蛋白酶的方法已经远远不能满足此需求。在这种技术需求下，高通量筛选应运而生。

蛋白酶高通量筛选是指在细胞水平上运用自动化仪器，经计算机分析处理数据，最终收集样品。这种方法具有高度灵敏性、操作样品量大等优势，在蛋白酶定向进化过程中大大缩短了筛选时间，减少了工作量。

在高通量筛选蛋白酶的方法发展历程中，Dr.Yi构建了一种带有双向启动子的质粒pESD[Yi,L.,Gebhard,M.C.,Li,Q.,Taft,J.M.,Georgiou,G.,and Iverson,B.L.“Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening(YESS)of combinatorial libraries”,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2013,110(18):7229-34]。在该载体中，蛋白酶基因及其底物基因分列于可被半乳糖诱导的双向启动子GAL1-GAL10两端，同时紧靠底物基因的两端带有特异性标记基因FLAG和HA。底物基因与其两端带有的特异性标记基因连接在酵母细胞表面展示蛋白Aga2基因之后，从而其蛋白表达产物可被Aga2转运到表面。FLAG基因的氨基酸序列为DYKDDDDK，而HA基因的氨基酸序列为YPYDVPDYA。在FLAG基因与HA基因的蛋白表达产物成功展示在酵母表面后，基于其氨基酸序列的特异性，其蛋白产物能被带有不同荧光分子的特异性抗体所识别，从而给予酵母细胞相应的荧光。根据蛋白酶与底物是否有酶切反应使酵母细胞具有不同荧光，这些带有不同荧光的酵母细胞通过流式细胞仪分析，可以根据不同的目的要求筛选富集特定的细胞得到高特异性和高活性的蛋白酶突变株。这种方法虽然能够广泛用于蛋白酶突变株的筛选，但是其广谱性仍存在不足，主要表现在酶动力学检测范围的局限性。

在Yi.的实验中，使用的双向启动子GAL1-GAL10的转录强度为4:5，转录表达的酶与底物的浓度比例接近1:1，这样的浓度比例极大地限制了此方法的酶动力学检测范围，具体为：1、具有高活性的酶无法运用此方法；2、无法有效筛选出高活性的突变体；3、无法精细调控突变体筛选过程。为解决这些问题，控制酶与底物的浓度比例，获得更加广泛的筛选范围成为一个行之有效的方法。利用荧光定量检测来比较酵母细胞中启动子调控转录的强弱，已分析出在不同启动子之间有不同的相对的转录强度比例[John Blazeck,RishiGarg,Ben Reed,Hal S.Alper.“Controlling Promoter Strength and Regulation inSaccharomyces cerevisiae Using Synthetic Hybrid Promoters”，Biotechnology andBioengineering,2012,109(11):2884]，如与GAL1启动子相比，有4种启动子的转录强度比例分别为GAL1-A：GAL1为1/4、GAL1-B：GAL1为1/12.5、GAL1-C：GAL1为1/25、GAL1-D：GAL1为1/50使用这些启动子可以精确控制酶与底物的不同浓度比，从而逐步提高蛋白酶的酶活来达到最终筛选获得高活性蛋白酶的目的。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一组高通量筛选载体pBDYD-GALX，即在pESD载体的双向启动子基础上，将控制底物表达的双向启动子GAL1-GAL10两端均连接表面展示蛋白Aga2和抗体标签FLAG和HA，在载体上再分别加入一种相对转录强度确定的启动子GALX控制酶的表达，根据启动子GALX的不同，能准确调节蛋白酶与其底物浓度比例在1:2至1:100之间变化，从而有效地扩大了酶动力学范围。

具体地，本发明的第一个目的是这样实现的：一组用于蛋白酶高通量筛选的空白重组载体，该空白重组载体为pBDYD-GALX，其结构为GALX–pESD–HA–FLAG-Aga2-GAL1/GAL10-Aga2–FLAG-HA，所述的GALX为控制蛋白酶按照不同强度表达的启动子，所述的GAL1/GAL10为控制底物表达的双向启动子，所述的Aga2为表面展示蛋白，所述的FLAG和HA为抗体标签；根据启动子GALX的不同，该重组载体通能调节蛋白酶与其底物浓度比例在1:2至1:100之间变化。

优选地，如上所述用于蛋白酶高通量筛选的空白重组载体，其中的GALX包括Gal4pBS2、Gal4pBS2/4、Gal4pBS1、Gal4pBS3、GAL1、LEUM、TEF、CYC、GPD。

在本发明的实施例中构建了五种不同GALX启动子强度的空白重组载体，分别命名为BD1、BD2、BD3、BD4、BD5，五种载体上都没有底物和酶的序列，只是启动子转录强度有所差异。其中BD1质粒的酶部分的启动子GALX转录强度是底物部分启动子GAL1强度的1/50，即意味着酶的表达量是底物表达量的1/100；BD2质粒表达的酶量是底物量的1/50；BD3质粒表达的酶量是底物量的1/25；BD4质粒表达的酶量是底物量的1/8；BD5质粒表达的酶量是底物量的1/2。

本发明还提供了一组含有酶和底物片段的蛋白酶高通量筛选载体，该蛋白酶高通量筛选载体的结构为GALX–protease–pESD–HA–substrate–FLAG-Aga2-GAL1/GAL10-Aga2–FLAG–substrate-HA，所述的GALX为控制蛋白酶按照不同强度表达的启动子，所述的GAL1/GAL10为控制底物表达的双向启动子，所述的Aga2为表面展示蛋白，所述的FLAG和HA为抗体标签，所述的protease为蛋白酶，所述的substrate为底物；根据启动子GALX的不同，该载体能调节蛋白酶与其底物浓度比例在1:2至1:100之间变化。

本发明的第二个目的是提供一种采用上述载体进行高通量蛋白酶筛选的方法，利用高通量筛选载体，在双向启动子GAL1-GAL10两端均连接底物序列和启动子GALX后插入Fast-TEV酶，利用荧光抗体FLAG(anti-FLAG-APC)和HA(anti-HA-FITC)的信号强弱来区分蛋白酶的酶切效率，并结合流式细胞仪筛选分析酶切结果。

具体地，本发明的第二个目的是这样实现的：

一种蛋白酶高通量筛选方法，该方法包括如下步骤：

A、构建权利要求1所述的不同GALX的空白重组载体；

B、在步骤A所得空白重组载体的基础上，通过添加蛋白酶和底物的基因片段构建权利要求2所述的蛋白酶高通量筛选载体，并转化得到含不同转录强度启动子的高通量筛选工程菌；

C、含不同转录强度启动子的高通量筛选工程菌的诱导表达；

D、流式细胞仪检测底物与酶在不同比例时的荧光信号强度，从而得到高活性的蛋白酶突变体。

优选地，如上所述的蛋白酶高通量筛选方法，其中步骤A中的构建方法包括如下步骤：

(1)采用PCR克隆方法得到GAL10启动子端连接的Aga2-FLAG-HA复合体的基因片段；

(2)将步骤(1)获得的PCR产物回收后，用限制性核酸内切酶SalⅠ和NdeⅠ双酶切，再与经过限制性核酸内切酶SalⅠ和NdeⅠ双酶切后的载体pESD酶连；酶连产物直接转化到大肠杆菌感受态细胞中，挑选转化子经测序验证，得到重组质粒pESD-HA-FLAG-Aga2-GAL1/GAL10-Aga2-FLAG-HA；

(3)采用PCR克隆方法得到多种不同转录强度的启动子GALX的基因片段；

(4)将步骤(3)获得的PCR产物回收后，用限制性内切酶EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切，再与经过限制性核酸内切酶EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切的步骤(2)的重组质粒酶连；酶连产物直接转化到大肠杆菌感受态细胞中，挑选转化子经测序验证，得到含不同GALX的空白重组载体。

优选地，如上所述的蛋白酶高通量筛选方法，其中步骤B包括如下具体步骤：

(1)采用PCR克隆方法得到GAL10启动子端连接的Aga2-FLAG-substrate-HA复合体的基因片段；

(2)将步骤(1)获得的PCR产物回收后，用限制性内切酶SalⅠ和NdeⅠ双酶切，再与经过限制性核酸内切酶SalⅠ和NdeⅠ双酶切空白重组载体pBDYD-GALX酶连；酶连产物直接转化到大肠杆菌感受态细胞中，挑选转化子经测序验证，得到含有重组质粒pBDYD-GAL10-Aga2-FLAG-substrate–HA；

(3)采用PCR克隆方法得到GAL1启动子端连接的Aga2-FLAG-substrate-HA复合体的基因片段；

(4)将步骤(3)获得的PCR产物回收后，用限制性内切酶SacⅠ和SpeⅠ双酶切，再与经过限制性核酸内切酶SacⅠ和SpeⅠ双酶切的步骤(2)中重组质粒酶连；酶连产物直接转化到大肠杆菌感受态细胞中，挑选转化子经测序验证，得到含有重组质粒pBDYD-GAL1-Aga2-FLAG-substrate–HA；

(5)采用PCR克隆方法得到Fast-TEV酶的基因片段；

(6)将步骤(5)获得的PCR产物回收后，用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，再与经过限制性核酸内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切的步骤(4)中的重组质粒酶连；酶连产物直接转化到大肠杆菌感受态细胞中，每种转录强度的启动子挑选转化子经测序验证，得到蛋白酶高通量筛选载体GALX–protease–pESD–HA–substrate–FLAG-Aga2-GAL1/GAL10-Aga2–FLAG–substrate–HA；

(7)将构建并验证的蛋白酶高通量筛选载体GALX–protease–pESD–HA–substrate–FLAG-Aga2-GAL1/GAL10-Aga2–FLAG–substrate–HA，通过化学转化法转入酿酒酵母EBY100(URA+,leu-,trp-)中。

优选地，如上所述的蛋白酶高通量筛选方法，其中步骤C包括如下具体步骤：将含带有不同启动子质粒的酿酒酵母EBY100，接种于YNB–CAA-Glucose培养基中，于30℃、225rpm培养12h，培养至OD600＝2.5～3，换YNB–CAA-Galactose培养基诱导并使起始OD600＝0.5，于30℃、225rpm培养，诱导8h后取样。

优选地，如上所述的蛋白酶高通量筛选方法，其中步骤D包括如下具体步骤：

(1)每次取样取10⁶个细胞，先用溶液A洗一次，再用溶液B洗一次，整个过程应在冰上操作，转速为3000rpm，离心2min；最后用20μl溶液B和0.3μl浓度为0.5μg/μl的荧光抗体Anti-FLAG-APC和浓度0.5μg/μl的Anti-HA-FITC重悬，将细胞先置于4℃15min，再室温放置30min，整个过程避光操作；

(2)将标记好的细胞于3000rpm，离心2min，去掉上清；再用溶液B洗一次，最后用1×PBS重悬细胞，重悬的细胞用于CytoFLEX流式细胞仪分析，检测的荧光信号通道是APC和FITC；根据APC和FITC的信号有无及强弱，来判断底物与蛋白酶在不同比例的切割情况，从而根据各种酶的具体情况选择合适的启动子来筛选蛋白酶突变体；

所述的溶液A：1×PBS，0.5％BSA，1mM EDTA，pH 7.4；所述的溶液B：1×PBS，0.5％BSA，pH7.4。

本发明与现有技术相比具有明显的优势：

(1)与之前酵母表面展示使用的pESD质粒相比，不只是调控底物与酶的表达量一致，还可以控制酶与底物的浓度在1:2到1:100之间范围内波动，对于一些最开始无酶活或酶活低的蛋白酶而言，一次突变不可能获得高活性，因为目前的筛选效率达不到，那么根据本发明中通过对启动子转录强度的控制，利用启动子转录的强弱来逐步提高蛋白酶酶活，最终获得高活性的蛋白酶突变体。

(2)在pBDYD质粒上，双向启动子GAL1-GAL10两端的酵母细胞表面展示蛋白Aga2的基因是不同的，这是为了避免在片段与载体的重组过程中出现错误的连接，导致最终的重组子错误；但是不同的Aga2基因编码出来的Aga2的氨基酸序列是相同的，因为只有这种蛋白质序列才能将目标蛋白展示到细胞表面。同样地，在双向启动子GAL1-GAL10两端与Aga2表面展示蛋白相连的内质网分泌信号的碱基也是不同的，而翻译出来的氨基酸序列相同。

(3)在构建的pBDYD质粒上，因为底物和酶的分别表达，有三个不同启动子强度的启动子在起始蛋白质的转录过程，那么在载体上相应的各有三个终止子终止转录，分别为MATa、T-ADH1和T-CYC1转录终止子。

(4)本发明构建的高通量筛选载体可用于多种蛋白酶的筛选，只需要在载体的相应位置插入底物序列和酶的突变体库，即可用于高通量筛选。与之前使用的方法相比较，思路明晰，方法简单，操作简便易行，成本低，筛选方便、直观、快捷，尤其适合于高通量筛选突变体库。

附图说明

图1为载体pBDYD的构建流程图：在pESD载体的基础上，在双向启动子GAL1-GAL10的两端均连接的是表达底物的相关序列，在载体上其他位置插入启动子GALX。

图2为Fast-TEV酶与底物反应的实验结果：

表达酶的启动子与表达底物的启动子强度比例分别为1:2、1:8、1:25，以酶端启动子与底物端启动子强度比例1:100为对照。其中1:100的对照组显示双信号，几乎没有切割，1:2的实验组是APC单信号，说明已经完全切割，1:8和1:25的信号介于其中；

酶端启动子与底物端启动子强度比例为1:100。在不同的时间段取样，0h、3h、6h、12h、23h的样品经流式细胞仪检测，3h时底物和酶已有部分开始表达，但是因为表达的酶只有底物的百分之一，底物几乎没有剪切，出现Anti-FLAG-PE和Anti-6x HA-FITC的双信号；6h到12h时双信号持续增加，到23h底物全部展示到细胞表面，Anti-FLAG-PE和Anti-6x HA-FITC的双信号达到最大。

图3为不同启动子强度的TEV突变酶(S219V)切割底物的情况：

表达酶的启动子与表达底物的启动子强度比例为1:100和1:25的两个质粒BD1-1和BD3-1，经过3h到23h的诱导，表达的TEV突变酶很少量，几乎不能切割底物；

比较Fast-TEV酶和TEV突变酶从0到23h的酶切效果检测。取3h到23h的样品经流式细胞仪检测，结果TEV突变酶几乎没有切割底物，而Fast-TEV酶的Anti-FLAG-PE和Anti-6xHA-FITC双信号始终处在TEV突变酶的信号下方，说明使用不同转录强度的启动子可以达到进化蛋白酶的效果。

具体实施方式

以下是本发明优选的实施例，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉此技术的本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

实施例1产pBDYD载体的基因工程菌的构建

载体pBDYD的构建流程如附图1所示。具体实施步骤为：

(1)采用PCR克隆方法得到GAL10启动子端连接的Aga2-FLAG-HA复合体的基因片段。

PCR反应体系：10×KOD buffer，5μl；dNTP(2.5mM)，2μl；正向引物(10μM)，2μl；反向引物(10μM)，2μl；Pfu聚合酶，2μl；模板，1μl；加ddH₂O至50μl。

PCR扩增体系：95℃，5min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，30个循环；72℃，5min；4℃，∞。

设计的引物如下：

正向引物：5’GTAATACGACTCACTATAGGGCCCGGGCGTCGAC3’

反向引物：5’CGGTTAGAGCGGATCTACATATGGCTCATGC3’

(2)将步骤(1)获得的PCR产物用PCR clean up试剂盒(Gene Mark)回收，用限制性内切酶SalⅠ和NdeⅠ双酶切，酶切体系为：SalⅠ，0.5μl；NdeⅠ，1.5μl；10×O buffer，5μl；PCR回收产物，30μl，加ddH₂O至50μl。37℃处理6h后，用1％的琼脂糖凝胶回收，再与经过限制性核酸内切酶SalⅠ和NdeⅠ双酶切后琼脂糖凝胶回收的载体pESD在16℃酶连16h，酶连体系为：酶切片段，1.2μl；酶切载体，0.3μl；10×T4DNA ligase buffer，2μl；T4DNA ligase，0.2μl；加ddH₂O至20μl。酶连产物直接转化到大肠杆菌XL-GOLD(Invitrogen公司)感受态细胞中，挑选四个转化子经测序验证后得到含有重组质粒pESD-GAL10-Aga2-FLAG-HA。

(3)采用PCR克隆方法得到五种不同转录强度的启动子GALX的基因片段。

PCR反应体系：10×KOD buffer，5μl；dNTP(2.5mM)，2μl；正向引物(10μM)，2μl；反向引物(10μM)，2μl；Pfu聚合酶，2μl；模板，1μl；加ddH₂O至50μl。

PCR扩增体系：95℃，5min；95℃，30s，58℃，30s，72℃，45s，30个循环；72℃，5min；4℃，∞。

设计的引物列表如下：

(4)将步骤(3)获得的PCR产物用PCR clean up试剂盒(Gene Mark)回收，用限制性内切酶EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切，酶切体系为：EcoRⅠ，0.5μl；KpnⅠ，0.5μl；10×BamHⅠbuffer，5μl；PCR回收产物，30μl，加ddH₂O至50μl。37℃处理6h后，用1％的琼脂糖凝胶回收，再与经过限制性核酸内切酶EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切后琼脂糖凝胶回收的(2)中的重组质粒在16℃酶连16h，酶连体系为：酶切片段，1.2μl；酶切载体，0.3μl；10×T4DNA ligase buffer，2μl；T4DNA ligase，0.2μl；加ddH₂O至20μl。酶连产物直接转化到大肠杆菌XL-GOLD(Invitrogen公司)感受态细胞中，每种转录强度的启动子挑选四个转化子经测序验证后得到含有重组质粒pBDYD-GALX。

实施例2产高通量筛选质粒的基因工程菌的构建

(1)采用PCR克隆方法得到GAL10启动子端连接的Aga2-FLAG-substrate-HA复合体的基因片段。

PCR反应体系：10×KOD buffer，5μl；dNTP(2.5mM)，2μl；正向引物(10μM)，2μl；反向引物(10μM)，2μl；Pfu聚合酶，2μl；模板，1μl；加ddH₂O至50μl。

PCR扩增体系：95℃，5min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，30个循环；72℃，5min；4℃，∞。

设计的引物如下：

正向引物：5’GTAATACGACTCACTATAGGGCCCGGGCGTCGAC3’

反向引物：5’CGGTTAGAGCGGATCTACATATGGCTCATGC3’

(2)将步骤(1)获得的PCR产物用PCR clean up试剂盒(Gene Mark)回收，用限制性内切酶SalⅠ和NdeⅠ双酶切，酶切体系为：SalⅠ，0.5μl；NdeⅠ，1.5μl；10×O buffer，5μl；PCR回收产物，30μl，加ddH₂O至50μl。37℃处理6h后，用1％的琼脂糖凝胶回收，再与经过限制性核酸内切酶SalⅠ和NdeⅠ双酶切后琼脂糖凝胶回收的载体pBDYD在16℃酶连16h，酶连体系为：酶切片段，1.2μl；酶切载体，0.3μl；10×T4DNA ligase buffer，2μl；T4DNA ligase，0.2μl；加ddH₂O至20μl。酶连产物直接转化到大肠杆菌XL-GOLD(Invitrogen公司)感受态细胞中，挑选四个转化子经测序验证后得到含有重组质粒pBDYD-GAL10-Aga2-FLAG-substrate-HA。

(3)采用PCR克隆方法得到GAL1启动子端连接的Aga2-FLAG-substrate-HA复合体的基因片段。

PCR反应体系：10×KOD buffer，5μl；dNTP(2.5mM)，2μl；正向引物(10μM)，2μl；反向引物(10μM)，2μl；Pfu聚合酶，2μl；模板，1μl；加ddH₂O至50μl。

PCR扩增体系：95℃，5min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，30个循环；72℃，5min；4℃，∞。

设计的引物如下：

正向引物：5’GTAATACGACTCACTATAGGGCCCGGGCGAGCTC3’

反向引物：5’CGGTTAGAGCGGATCTAACTAGTGCTCATGC3’

(4)将步骤(3)获得的PCR产物用PCR clean up试剂盒(Gene Mark)回收，用限制性内切酶SacⅠ和SpeⅠ双酶切，酶切体系为：SacⅠ，0.5μl；SpeⅠ，1.5μl；10×O buffer，5μl；PCR回收产物，30μl，加ddH₂O至50μl。37℃处理6h后，用1％的琼脂糖凝胶回收，再与经过限制性核酸内切酶Sac和SpeⅠ双酶切后琼脂糖凝胶回收的载体pBDYD在16℃酶连16h，酶连体系为：酶切片段，1.2μl；酶切载体，0.3μl；10×T4DNA ligase buffer，2μl；T4DNA ligase，0.2μl；加ddH₂O至20μl。酶连产物直接转化到大肠杆菌XL-GOLD(Invitrogen公司)感受态细胞中，挑选四个转化子经测序验证后得到含有重组质粒pBDYD-GAL1-Aga2-FLAG-substrate-HA。

(5)采用PCR克隆方法得到TEV酶的基因片段。

PCR反应体系：10×KOD buffer，5μl；dNTP(2.5mM)，2μl；正向引物(10μM)，2μl；反向引物(10μM)，2μl；Pfu聚合酶，2μl；模板，1μl；加ddH₂O至50μl。

PCR扩增体系：95℃，5min；95℃，30s，58℃，30s，72℃，45s，30个循环；72℃，5min；4℃，∞。

设计的引物如下：

正向引物：5’GGATCGAATTCCCTACTTCATACATTTTCAATTAAG3’

反向引物：5’GATCTCGAGCTATTAGGATCCGCGTCAGCTAGC3’

(6)将步骤(5)获得的PCR产物用PCR clean up试剂盒(Gene Mark)回收，用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，酶切体系为：EcoRⅠ，0.5μl；BamHⅠ，0.5μl；10×BamHⅠbuffer，5μl；PCR回收产物，30μl，加ddH₂O至50μl。37℃处理6h后，用1％的琼脂糖凝胶回收，再与经过限制性核酸内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后琼脂糖凝胶回收的(4)中的重组质粒在16℃酶连16h，酶连体系为：酶切片段，1.2μl；酶切载体，0.3μl；10×T4DNA ligase buffer，2μl；T4DNA ligase，0.2μl；加ddH₂O至20μl。酶连产物直接转化到大肠杆菌XL-GOLD(Invitrogen公司)感受态细胞中，每种转录强度的启动子挑选四个转化子经测序验证后得到含有重组质粒pBDYD-GALX-TEV protease。

(7)将构建好的重组质粒pBDYD-GALX-TEV protease，通过化学转化法转入酿酒酵母EBY100(URA+,leu-,trp-)中，然后涂布于MD平板。

实施例3不同启动子转录强度的高通量筛选工程菌的诱导表达

将含带有不同启动子质粒的酿酒酵母EBY100，接种于YNB–CAA-Glucose培养基中，于30℃、225rpm培养12h。培养至OD600＝2.5～3，换YNB–CAA-Galactose培养基诱导并使起始OD600＝0.5，于30℃、225rpm培养，诱导8h后取样。

实施例4流式细胞仪检测底物与酶的在不同比例时的荧光信号强度

每次取样取10⁶个细胞，先用溶液A(1X PBS，0.5％BSA，1mM EDTA，pH7.4)洗一次，再用溶液B(1X PBS，0.5％BSA，pH7.4)洗一次。整个过程应在冰上操作，转速为3000rpm，离心2min。最后用20μl溶液B和0.3μl荧光抗体Anti-FLAG-APC(GeneScript公司，0.5μg/μl)和Anti-HA-FITC(GeneScript公司，0.5μg/μl)重悬，将细胞先置于4℃15min，再室温放置30min，整个过程避光操作。

将标记好的细胞于3000rpm，离心2min，去掉上清。再用溶液B洗一次，最后用1×PBS重悬细胞，重悬的细胞用于CytoFLEX流式细胞仪分析，检测的荧光信号通道是APC和FITC。根据APC和FITC的信号有无及强弱，来判断底物与酶在不同比例的切割情况，如附图2中Fast-TEV酶与底物反应的实验结果及附图3中不同启动子强度的TEV突变酶(S219V)切割底物的情况，从而根据各种酶的具体情况选择合适的启动子来筛选蛋白酶突变体。

Claims (1)

1.一种蛋白酶高通量筛选方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

A、构建含有不同GALX的空白重组载体，所述空白重组载体为pBDYD-GALX，其结构为GALX-pESD-HA-FLAG-Aga2-GAL1/GAL10-Aga2-FLAG-HA，所述的GALX为控制蛋白酶按照不同强度表达的启动子，所述的GAL1/GAL10为控制底物表达的双向启动子，所述的Aga2为表面展示蛋白，所述的FLAG和HA为抗体标签；根据启动子GALX的不同，该重组载体通能调节蛋白酶与其底物浓度比例在1:2至1:100之间变化；所述的GALX包括Gal4pBS2、Gal4pBS2/4、Gal4pBS1、Gal4pBS3、GAL1、LEUM、TEF、CYC、GPD；

B、在步骤A所得空白重组载体的基础上，通过添加蛋白酶突变体库构建方法产生的具有不同生化表征的蛋白酶突变体基因片段，以及添加底物的基因片段，构建蛋白酶高通量筛选载体，并转化得到含不同转录强度启动子的高通量筛选工程菌；所述的蛋白酶高通量筛选载体的结构为GALX-protease-pESD-HA-substrate-FLAG-Aga2-GAL1/GAL10-Aga2-FLAG-substrate-HA，所述的protease为蛋白酶突变体，所述的substrate为底物；

C、含不同转录强度启动子的高通量筛选工程菌的诱导表达；

D、流式细胞仪检测底物与酶在不同比例时的荧光信号强度，从而得到高活性的蛋白酶突变体。

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