CN118010686A - 一种定向进化衣康酸生物传感器识别赖氨酸的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种定向进化衣康酸生物传感器识别赖氨酸的方法及应用，所述方法是先从识别衣康酸的转录因子YpItcR及其调控的启动子Pccl出发，构建衣康酸生物传感器模型质粒YpItcR/Pccl‑mrfp1；之后采用易错PCR扩增YpItcR基因，并以YpItcR/Pccl‑mrfp1为模板扩增带有启动子Pccl和mrfp1报告蛋白基因的线性化质粒骨架，通过组装环化以构建YpItcR基因突变子质粒文库；然后建立高通量筛选方法，获得敏感性识别赖氨酸的突变子LYS‑5。本发明为氨基酸生物传感器定制提供新方法，也为赖氨酸工业菌株进化及高通量筛选提供生物传感器元器件。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种定向进化衣康酸生物传感器识别赖氨酸的方法及应用。
背景技术
氨基酸的生产关乎国计民生，我国是氨基酸生产和消耗大国，尤其是三大主要氨基酸：谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸，年生产总产量占据氨基酸总量98％。近年来，随着合成生物学的快速发展，我国氨基酸的工业菌株培育工作取得飞跃式进步。日益激烈的市场环境，对于我国氨基酸生产菌株培育工作提出新的要求，例如通过开发高通量的智能筛选技术，以期进一步提升氨基酸高产菌株生产效率。
诱变育种是提升工业菌株生产效率的常规手段，但如若缺乏高效、快速和准确的高通量筛选方法，会极大的影响筛选正突变菌株的几率。生物传感器是生物技术领域重要的信号识别元件，这类元件可以识别酶、蛋白质、DNA、化合物等一系列生物物质，并能将与识别物质的浓度转化为可定量的理化信号。通过响应机制的不同，可将人工生物传感器大致分为转录因子和核酸开关两类，现已广泛用于高效微生物细胞工厂的创建、高通量筛选和细胞代谢的实时监控。然而，相对于微生物细胞中成千上万种类的代谢产物，已挖掘开发的生物传感器还十分有限，这主要是因为天然的特异性响应化合物的传感器元件挖掘困难。因此，改造天然氨基酸生物传感器，改变其识别化合物特异性，是创建出特定氨基酸生物传感器新策略。
目前，氨基酸领域生物传感器，多为转录因子型生物传感器，其改造策略主要从已挖掘的天然氨基酸生物传感器出发，进化转录因子区域，筛选识别不同氨基酸的生物传感器。该策略在新氨基酸生物传感器开发非常高效，但其问题在于，筛选到的生物传感器突变子，还会响应原先识别的氨基酸。考虑到氨基酸在代谢过程广泛存在，该弊端会严重干扰新挖掘的生物传感器突变子应用于氨基酸代谢产物精准检测及菌株进化。
衣康酸是一种重要的五碳有机酸，其化学结构与多种氨基酸相似，并且衣康酸代谢并不存在于常规微生物中。近年来，识别衣康酸生物传感器被挖掘，并被应用于衣康酸生物合成。但是如何从识别衣康酸的生物传感器出发，降低或排除干扰以建立定向进化衣康酸生物传感器识别赖氨酸的方法，现有文献中未有报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种定向进化衣康酸生物传感器识别赖氨酸的方法及应用，从识别衣康酸的生物传感器出发，筛选获得敏感性识别赖氨酸的突变子，特异性和敏感性更强。
基于上述目的，本发明提供了一种定向进化衣康酸生物传感器识别赖氨酸的方法，所述方法是先从识别衣康酸的转录因子YpItcR及其调控的启动子Pccl出发，构建衣康酸生物传感器模型质粒YpItcR/Pccl-mrfp1；之后采用易错PCR扩增YpItcR基因，并以YpItcR/Pccl-mrfp1为模板扩增带有启动子Pccl和mrfp1报告蛋白基因的质粒骨架，通过组装环化以构建YpItcR基因突变子质粒文库；然后将YpItcR基因突变子质粒文库转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过调控所述启动子Pccl表达红色荧光蛋白，建立高通量筛选方法，获得敏感性识别赖氨酸的突变子LYS-5。
所述易错PCR扩增是利用第一引物组和非保真DNA酶，在50mM Mg2+和5mM Mn2+条件下进行的，突变率控制在0.5-1％；第一引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物YpItcR-F-2和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物YpItcR-R-2。扩增获得转录因子序列突变库，再通过Gibson组装，与线性化质粒环化，获得质粒文库。所述线性化质粒，为pUC19质粒骨架，并包含启动子Pccl及其下游表达的红色荧光蛋白基因mrfp1。
所述扩增带有启动子Pccl和mrfp1报告蛋白基因的质粒骨架采用的上游引物Pccl-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物pUC19-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
所述构建衣康酸生物传感器模型质粒YpItcR/Pccl-mrfp1的方法是先分别以识别衣康酸的转录因子YpItcR基因及其调控的启动子Pccl的DNA序列、pUC19载体、红色荧光基因mrfp1为模板，扩增得到相应的衣康酸生物传感器识别区域、pUC19质粒骨架和报告蛋白基因，之后通过Gibson组装、环化得到模型质粒YpItcR/Pccl-mrfp1。
扩增pUC19质粒骨架的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的上游引物pUC19-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物pUC19-R；扩增报告蛋白基因的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的上游引物mRFP1-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的下游引物rrnb-R；扩增衣康酸生物传感器识别区域的引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示的上游引物YpItcR-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的下游引物Pccl-R。
所述高通量筛选方法是将YpItcR突变子质粒文库转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，经第一次培养后，获得不少于105个突变子菌株，利用微生物克隆筛选系统，从超过105的菌株中挑取不少于104个不发红色荧光的菌株至深孔板第二次培养，之后利用荧光酶标仪检测红色荧光强度，将显著表达红色荧光的突变子菌株筛选出来。再经过复筛和验证，最终获得突变子LYS-5。该突变子菌株在无赖氨酸培养基中几乎不表达红色荧光蛋白，但随着添加赖氨酸浓度提升，突变子菌株红色荧光蛋白逐步增强，说明突变子LYS-5可敏感性识别赖氨酸。
所述第一次培养是采用含100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃静置培养过夜。
所述第二次培养是采用含10mM赖氨酸的LB液体培养基，37℃培养12小时。
在无赖氨酸存在条件下，突变子LYS-5不会调控启动子Pccl表达红色荧光蛋白，而随着赖氨酸浓度增加，LYS-5调控启动子Pccl表达红色荧光蛋白荧光强度增强。
本发明还提供所述定向进化衣康酸生物传感器识别赖氨酸的方法在氨基酸生物传感器进化及突变体高通量筛选中的应用。
具体而言，定向进化衣康酸生物传感器识别赖氨酸的方法包括以下步骤：
S1：衣康酸生物传感器模型质粒YpItcR/Pccl-mrfp1构建：克隆来自Yersiniapseudotuberculosis的识别衣康酸的转录因子YpItcR基因和转录因子调控启动子Pccl，与红色荧光基因mrfp1扩增后的报告蛋白基因，以及pUC19质粒骨架环化，得到识别衣康酸的生物传感器模型质粒YpItcR/Pccl-mrfp1，并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞；
S2：YpItcR突变子质粒文库构建：利用非保真DNA酶和适量金属离子(50mmol/LMg2+和5mmol/L Mn2+)，易错PCR扩增YpItcR基因，突变率控制在0.5％-1％。利用高保真DNA酶扩增带有Pccl和红色荧光基因mrfp1的pUC19质粒骨架，突变YpItcR的PCR产物与骨架通过Gibson组装环化，获得YpItcR突变子质粒文库；
S3：建立识别赖氨酸的突变子的高通量筛选方法：将上述质粒文库转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布到含100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃静置培养过夜后，利用微生物克隆挑选系统，从超过105的克隆中，挑取不少于104个不发红色荧光的克隆分别到96深孔板中，96深孔板中含有适量的10mM赖氨酸的LB液体培养基，37度培养12小时，利用荧光酶标仪检测红色荧光强度。
筛选的显著呈现红色荧光的菌株，通过摇瓶验证，在0-10mM不同浓度赖氨酸的LB液体培养基条件下，检测筛选的突变子菌株荧光蛋白表达水平，最终获得敏感性响应赖氨酸浓度的YpItcR突变子菌株。
本发明的有益效果：
1)与传统氨基酸生物传感器挖掘相比，效率更高，与现有氨基酸生物传感器改造策略相比，筛选的生物传感器突变子特异性和敏感性更强；
2)与现有氨基酸生物传感器改造相比，出发生物传感器识别衣康酸在常规微生物代谢中并不存在，因而突变子虽不能摆脱对衣康酸的识别，但由于代谢不存在，不会存在应用中被干扰的情况；
3)与现有氨基酸生物传感器改造相比，出发传感器识别衣康酸，其结构与氨基酸相似，并被报道该生物传感器可以较微弱的识别10多种氨基酸，因此，该技术可适用于多种氨基酸生物传感器开发，也为赖氨酸工业菌株进化及高通量筛选提供生物传感器元器件。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为定向进化衣康酸生物传感器原理及过程示意图；
图2为识别赖氨酸的突变子高通量筛选结果分析；
图3为突变子LYS-5敏感性验证结果分析；
图4为突变子LYS-5特异性验证结果分析。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
需要说明的是，除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本发明中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
本发明提供了一种定向进化衣康酸生物传感器识别赖氨酸的方法，衣康酸生物传感器，本发明仅以来源于Yersinia pseudotuberculosis的识别衣康酸的转录因子YpItcR基因以及该转录因子调控启动子Pccl。
实施例1
1.衣康酸生物传感器构建
以pUC19载体(Addgene：#50005)为模板，分别利用pUC19-F/pUC19-R扩增质粒骨架；以带有rrnb终止子的红色荧光蛋白mrfp1基因为模板，利用引物mRFP1-F/rrnb-R扩增报告蛋白基因；以全合成的YpItcR基因连接其调控的启动子Pccl的DNA序列为模板，利用YpItcR-F/Pccl-R扩增衣康酸生物传感器识别区域；最后利用Gibson组装，环化PCR片段获得重组质粒YpItcR/Pccl-mrfp1(质粒核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)，并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。
其中，pUC19-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：
GCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGC；
pUC19-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：
CACCGTCATCACCGAAACGCGC；
mRFP1-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：
GTTGGAGGAGGAACCATATGGCGAGTAGCGAAGACG；
rrnb-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：
CTCATTAGGCACCCCAGGCGAGAGCGTTCACCGACAAAC；
YpItcR-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示：
GCGTTTCGGTGATGACGGTGTCAAGGAAACACGGTCAG；
Pccl-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示：
CGTCTTCGCTACTCGCCATATGGTTCCTCCTCCAAC。
2.衣康酸生物传感器突变子文库构建
以YpItcR/Pccl-mrfp1为模板，分别利用Pccl-F/pUC19-R扩增带有启动子Pccl和mrfp1报告蛋白基因的质粒骨架；以转录因子YpItcR基因为模板，利用引物YpItcR-F-2/YpItcR-R-2和非保真DNA酶，在50mM Mg2+和5mM Mn2+条件下，通过易错PCR扩增YpItcR基因突变子库，突变率控制在0.5％-1％；最后利用Gibson组装，环化YpItcR基因突变子库和带有Pccl-mrfp1表达框的质粒骨架，获得突变子质粒库，并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中获得YpItcR基因突变子菌株库。
其中，Pccl-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：
ATATGACGTAACTCCATCTTCATATCCAAAAGCAATTAAAC；
YpItcR-F-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
TTTCGGTGATGACGGTGTCAAGGAAACACGGTCA；
YpItcR-R-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
TTGCTTTTGGATATGAAGATGGAGTTACGTCATAT；
3.本发明方法应用于产识别赖氨酸突变子高通量筛选
针对上述突变子菌株库，在含100mg/L氨苄青霉素抗性的LB固体培养基培养后，获得超过105个单菌落，利用微生物克隆筛选系统挑取不少于104个不发红色荧光的菌株至96深孔板(含有10mM赖氨酸和100mg/L氨苄青霉素抗性的LB液体培养基)，37℃摇床培养12小时。
4.本发明方法应用于识别赖氨酸突变子高通量分析验证
利用荧光酶标仪，分析挑取的克隆在含10mM赖氨酸培养基中培养后表达红色荧光情况。结果显示，有8个突变子菌株显著表达红色荧光蛋白(如图2所示)。
5.识别赖氨酸突变子敏感性分析
针对上述筛选的8个识别赖氨酸的突变子，分别在含0，2.5mM，5mM，10mM赖氨酸的LB培养基，37℃培养10小时，并分析红色荧光强度。其中，标记为LYS-5的突变子对赖氨酸浓度最为敏感，突变子菌株在不含赖氨酸的LB培养中几乎不表达红色荧光，而随着培养基中赖氨酸浓度增加，突变子表达红色荧光增强(如图3所述)。
6.突变子LYS-5特异性分析
针对上述筛选的突变子LYS-5，分别在含10mM谷氨酸、苏氨酸和谷氨酰胺的LB培养基培养，验证其识别不同氨基酸情况，结果如图4所示，突变子LYS-5几乎不识别其他氨基酸。
7.识别赖氨酸突变子LYS-5突变序列比对分析
针对上述验证的突变子LYS-5，通过基因序列测序及比对分析发现，一共有7个位点碱基发生突变，突变率为0.796％。碱基突变位点分别是CGT→CAT(156aa)，CCG→CCA(166aa)，GCA→GCG(187aa)，ATT→ATC(200aa)，ACG→ATG(203aa)，GCA→ACA(237aa)，TAC→CAC(274aa)。其中，突变位点引发转录因子四个位点氨基酸突变，分别是R156H，T203M，A237T，Y274H。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种定向进化衣康酸生物传感器识别赖氨酸的方法，其特征在于，所述方法是先从识别衣康酸的转录因子YpItcR及其调控的启动子Pccl出发，构建衣康酸生物传感器模型质粒YpItcR/Pccl-mrfp1；之后采用易错PCR扩增YpItcR基因，并以YpItcR/Pccl-mrfp1为模板扩增带有启动子Pccl和mrfp1报告蛋白基因的质粒骨架，通过组装环化以构建YpItcR基因突变子质粒文库；然后将YpItcR基因突变子质粒文库转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过调控所述启动子Pccl表达红色荧光蛋白，建立高通量筛选方法，获得敏感性识别赖氨酸的突变子LYS-5。
2.根据权利要求1所述定向进化衣康酸生物传感器识别赖氨酸的方法，其特征在于，所述易错PCR扩增是利用第一引物组和非保真DNA酶，在50mM Mg2+和5mM Mn2+条件下进行的，突变率控制在0.5-1％；第一引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物YpItcR-F-2和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物YpItcR-R-2。
3.根据权利要求1所述定向进化衣康酸生物传感器识别赖氨酸的方法，其特征在于，所述扩增带有启动子Pccl和mrfp1报告蛋白基因的质粒骨架采用的上游引物Pccl-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物pUC19-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1所述定向进化衣康酸生物传感器识别赖氨酸的方法，其特征在于，所述构建衣康酸生物传感器模型质粒YpItcR/Pccl-mrfp1的方法是先分别以识别衣康酸的转录因子YpItcR基因及其调控的启动子Pccl的DNA序列、pUC19载体、带有红色荧光基因mrfp1为模板，扩增得到相应的衣康酸生物传感器识别区域、pUC19质粒骨架和报告蛋白基因，之后通过Gibson组装、环化得到模型质粒YpItcR/Pccl-mrfp1。
5.根据权利要求4所述定向进化衣康酸生物传感器识别赖氨酸的方法，其特征在于，扩增pUC19质粒骨架的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的上游引物pUC19-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物pUC19-R；扩增报告蛋白基因的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的上游引物mRFP1-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的下游引物rrnb-R；扩增衣康酸生物传感器识别区域的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的上游引物YpItcR-F和核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的下游引物Pccl-R。
6.根据权利要求1所述定向进化衣康酸生物传感器识别赖氨酸的方法，其特征在于，所述高通量筛选方法是将YpItcR突变子质粒文库转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，经第一次培养后，获得不少于105个突变子菌株，利用微生物克隆筛选系统，从超过105的菌株中挑取不少于104个不发红色荧光的菌株至深孔板第二次培养，之后利用荧光酶标仪检测红色荧光强度，将显著表达红色荧光的突变子菌株筛选出来。
7.根据权利要求6所述定向进化衣康酸生物传感器识别赖氨酸的方法，其特征在于，所述第一次培养是采用含100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃静置培养过夜。
8.根据权利要求6所述定向进化衣康酸生物传感器识别赖氨酸的方法，其特征在于，所述第二次培养是采用含10mM赖氨酸的LB液体培养基，37℃培养12小时。
9.根据权利要求1所述定向进化衣康酸生物传感器识别赖氨酸的方法，其特征在于，在无赖氨酸存在条件下，突变子LYS-5不会调控启动子Pccl表达红色荧光蛋白，而随着赖氨酸浓度增加，LYS-5调控启动子Pccl表达红色荧光蛋白荧光强度增强。
10.权利要求1-9任一项所述定向进化衣康酸生物传感器识别赖氨酸的方法在氨基酸生物传感器进化及突变体高通量筛选中的应用。
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