CN104781419B - Nadp(h)传感器和醇脱氢酶的研发 - Google Patents

Nadp(h)传感器和醇脱氢酶的研发 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种NADP(H)纳米传感器，其包含i)调节物能够与之结合的核酸序列，其中调节物的氧化状态取决于NADP(H)的可用性；ii)RNA聚合酶能够与之结合的接在核酸序列i)之后的启动子序列，其中RNA聚合酶对启动子序列的亲和力受调节物的氧化状态影响；iii)处于启动子序列ii)控制下并编码自发荧光蛋白的核酸序列。本发明也涉及细胞、用于分离编码NADP(H)依赖性酶的基因的方法和NADP(H)纳米传感器的用途。

Description

NADP(H)传感器和醇脱氢酶的研发
技术领域
本发明涉及NADP(H)纳米传感器、细胞、用于分离编码NADP(H)依赖性酶的基因的方法和NADP(H)纳米传感器的用途。
背景技术
许多例子中公开了NADP(H)依赖性酶在化学工业中作为催化剂的用途。因此，醇脱氢酶，也称作氧化还原酶或酮还原酶，用于还原羰基。特别地，对映特异性和区域特异性用于还原前手性酮类。用于有用化学化合物合成的这类酮还原酶的例子是非对称还原4-氯乙酰乙酸酯(US 5,559,030，US 5,700,670和US 5,891,685)，还原二羧酸类(US 6,399,339)、还原叔丁基-(S)-氯-5-羟-3-氧代己酸酯(US 6,645,746和WO-A-01/40450)、还原基于吡咯并三嗪的化合物(US-A-2006/0286646)，还原取代的苯乙酮(US 6,800,477，US-A-2012/0178142)或还原羟硫杂环戊烷类(WO-A-2005/054491)。α-卤代酮同样酶促还原成α-卤代醇。这也可以通过分离的酶或用完整细胞实施(WO-A-2008/038050)。借助来自短乳杆菌(Lactobacillus brevis)或布氏热厌氧菌(Thermoanaerobium brokii)的特定醇脱氢酶，实现8-氯-6-氧代辛酸烷基酯还原为(R)-或(S)-8-氯-6-羟辛酸烷基酯，其分别用作(R)-α-硫辛酸和(S)-α-硫辛酸的前体(US 7,157,253)。还描述了制备光学活性烷醇的方法，其中通过酶促还原相应酮类实施例如(1S)-3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-丙-1-醇和(1S)-3-氯-1-(2-噻吩基)-丙-1-醇的制备(WO-A-2006/094945)。同样已知通过酮还原酶或醇脱氢酶对映特异地制备3-羟丁基3-羟丁酸酯的方法(US-A-2012/0064611)。US 6,645,746公开了来自木兰假丝酵母(Candida magnoliae)的氨基酸序列，所述氨基酸序列可以用于借助NADP(H)将叔丁基-(5S)-6-氯-5-羟-3-氧代己酸酯还原成叔丁基-(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟己酸酯。在这份文献的说明书中，使用优选地与来自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的葡萄糖脱氢酶共表达的酶，借助葡萄糖脱氢酶并以葡萄糖作为辅底物实施辅因子NADP(H)的再生。WO-A-2004/111083描述了一种用于对映选择性酶促还原酮类、尤其2-和3-氧代酸酯的方法，其中反应由来自荚膜毕赤酵母(Pichia capsulata)的氧化还原酶催化。WO-A-2005/108593描述了一种用于制备1-丁醇的方法，其中2-丁酮在双相体系中用羰基还原酶(例如来自近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis))和辅酶还原。EP-A-2,061,880公开了一种从α,β-不饱和炔酮衍生物中NADP(H)依赖性酶促制备烯酮衍生物的方法，其中相应的还原酶以纯化形式使用或还以微生物原样形式使用。EP-A-2,087,127描述了一种用于在NADP(H)存在下使用氧化还原酶/脱氢酶，通过对映选择性酶促还原仲二酮(secodione)衍生物而制备仲醇(secol)衍生物的方法。
除NADP(H)-依赖性还原酮类和醛类之外，NADP(H)依赖性酶，即所谓的烯酯还原酶(enoate reductase)，还用于对映特异性还原烯酮类。因此，Kataoka和同事已经报道，通过使用来自马其顿假丝酵母(Candida macedoniensis)的烯酯还原酶连同来自大肠杆菌的产生NADP(H)的葡萄糖脱氢酶一起，将酮异佛尔酮制备性还原成(6R)-levodione(Kataoka,Kotaka,Thiwthong,Wada,Nakamori和Shimizu,J.Biotechnol.,2004,114,1–9)。
进一步描述了NADP(H)依赖性酶在其中例如还原后接着环化成环氧化物的偶联系统中的用途。因此描述了使用(R)-或(S)-选择性醇脱氢酶旨在形成相应对映异构体并随后实现碱诱导环化成特定环氧化物的用途(CA 2 612 407)。
如果使用单加氧酶，酶促提供NADP(H)也是必需的，如来自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的经非常彻底研究的单加氧酶P450BM3(CYP102A1)的情形(Appl.Microbiol.Biotechnol.(2012)95:357–367)。这种脂肪酸羟化酶氧化广泛类型的底物，如链烷类、烯类和芳香烃类。单加氧酶催化羟化作用，但是需要NADP(H)的化学计量供应。
NADP(H)依赖性酶还用于例如2-酮酸还原性胺化成相应的D-氨基酸(WO-A-2006/113085)，或从2-酮庚二酸酯还原性胺化成6-氨基己酸(WO-A-2012/031911)。
NADP(H)依赖性酶的最多样性用途的概述可以在例如Hollmann,Arendsa和Holtmann(Green Chemistry,2011,13,2285-2313)或还在Liese,Seelbach和Wandrey编著的教材"Industrial Biotransformations"(Wiley-VCH Verlag,2006,ISBN:3-527-31001-0)中找到。
无论NADP(H)依赖性酶将用于哪种具体反应，初始前提是提供确保高转化和高度立体特异的合适酶。这种前提转而总是筛选这类酶，这可以按多种方式实施。
因此，公司提供酶收集物，所述酶收集物必须随后接受测试以确定它们是否将所需的离析物转化成所需的产物，例如，位于丹麦的Novozymes A/S。也可以通过利用天然多样性，使用所需的酶。例如，通过从生物或宏基因组文库获得酶，所述酶转而必须测试特异性。多样性也可以由人类通过以下方式建立：诱变现存的酶并且随后对获得的酶测试修改的底物特异性。在WO-A-2012/069434中公开了通过分子技术产生多种酶的例子，其中获得制备n-杂环光学活性醇的NADP(H)依赖性酶。还描述了制备12α-羟基类固醇脱氢酶突变体的相似方法(EP-A-2 441 771)。制备接受高通量分析的大型基因文库包括：将基因文库克隆入复制型表达载体中，用所得到的载体文库转化合适的细胞并在促进检测所需活性和分离载体的条件下表达组合方式获得的基因，其中所述载体编码已经检测到产物的基因。
迄今已经优选地在具有96孔、384孔或甚至1,536孔的微量滴定板中实施对离析物以所需方式转化成产物的直接测试。这些平板使得平行测试96种、384种或1,536种酶成为可能。可以通过色谱技术直接确定所需酶反应的产物。这种方法需要从96孔、384孔或1,536孔取出样品和色谱拆分以检测反应产物，所述反应产物可以例如是醇类或羰基化合物。不用说，这种方法复杂且费时。因此经常使用间接测试。因此利用以下事实：NADP(H)在340nm吸光，但是NADP不吸光。原则上可以通过这种方式确定消耗的NADP(H)的量。备选地，在羰基还原酶催化的醇氧化中，也可以按这种方式测量NADP向NADP(H)的转化。在这种反应和相当的反应中，通过340nm处吸光度的增加确定辅因子NADP的还原。还原型辅因子的内在荧光还可以同等用于定量。这在微量滴定板读数设备中实现。
在用于确定NADP(H)消耗量以检测酶促还原性转氨基作用和酮还原的另一种方法中，通过颜色指示剂确定伴随NADP(H)消耗的pH变化(US7,642,073)。通过合适地选择颜色指示剂，可以确定颜色变化的波长，波长转而在微量滴定板读数设备中测定。
还描述了具体的微量滴定板体系，其中通过具有特定分析物结合特性的膜和液体流，以微量滴定板样式实施采用多达1,536个孔的筛选(EP-A-1,628,768)。
也已经作出尝试以使得分析物通过与可检测基团例如荧光团偶联而更容易检测。为此，分析物在实施反应之前与荧光基团共价结合。当实施反应并且分析物相应地反应时，荧光基团的荧光应当变化，例如因基团的分裂或因分析物结构的改变而变化。荧光的变化则是分析物转化的量度。然而，这种方法的缺点是荧光基团经常影响分析物的反应性。WO-A-2007/131696描述，通过在待研究的样品中提供荧光染料和大环结构并至少在两个时间点测量荧光染料的荧光特性，可以测定分析物浓度。大环结构因而结合染料，并且在分析物的待研究浓度范围内，这从大环结构替换出荧光染料。
在现有技术已知的用于分离新的NADP(H)消耗酶或来自基因文库的具有修饰的底物特异性的NADP(H)消耗酶的体外筛选环境下，总体缺点是使用了不可能进行高通量筛选的微量滴定板系统，例如采用荧光激活的细胞分选法(FACS)时是可能的情形。
另外，在分离新的NADP(H)依赖性酶的体外筛选环境下，经常使用细胞裂解物作为潜在的新酶来源，因为以纯形式分离在操作上是困难的。然而，这类裂解物或制备物在新NADP(H)依赖性酶的常规筛选中的问题是反应批次一般含有与NADP(H)相互作用的不溶性物质或其他酶。这导致高空白值或还导致在340nm处改变的非特异性吸收，这降低准确度和吸收测量的价值。这同样适用于辅因子的荧光测量，它同样因不溶性物质变得困难。
发明概述
本发明基于克服与分离新NADP(H)依赖性酶相关的现有技术中存在的缺点。
特别地，本发明基于提供下述工具的目的，可以使用所述工具以便能够在高通量筛选中例如借助FACS从细胞悬液以最简单的可能方式分离可能表达新NADP(H)依赖性酶的那些细胞。特别地，这些细胞的分离应当不包括细胞分解，并且尤其还不包括分析性确定特定离析物、产物或辅因子的浓度。
本发明还基于提供下述细胞的目的，其中所述细胞在潜在NADP(H)依赖性酶的基因(例如以质粒形式)已经引入细胞后可以特别容易地就这种细胞表达的基因是否实际上编码NADP(H)依赖性酶进行分析，并且尤其在不需要细胞破裂的情况下。此外，以这种方式鉴定的细胞应当能够在高通量筛选中(例如借助FACS)尽可能地以定向方式从许多细胞(例如从细胞悬液)中分离。
通过下述NADP(H)纳米传感器向实现上述目的做出贡献，所述纳米传感器包含
i)调节物能够与之结合的核酸序列，其中调节物的氧化状态取决于NADP(H)的可用性；
ii)RNA聚合酶能够与之结合的接在核酸序列i)之后的启动子序列，其中RNA聚合酶对启动子序列的亲和力受调节物的氧化状态影响；
iii)处于启动子序列ii)控制下并编码自发荧光蛋白的核酸序列。
令人惊讶地发现使用本发明的NADP(H)纳米传感器时，可以在体内特别容易地测定胞内NADP浓度或NADP(H)浓度，并因此间接地测定细胞中NADP(H)依赖性酶的活性。如果含有本发明NADP(H)纳米传感器的细胞以NADP(H)依赖性酶的高活性为特征，则NADP的浓度相应地高(并且NADP(H)浓度相应地低)。取决于细胞的这种还原状态，该调节物能够影响RNA聚合酶对控制自发荧光蛋白表达的启动子的亲和力或编码自发荧光蛋白的mRNA的稳定性。自发荧光蛋白的表达是因此受细胞的还原状态控制，并且转而可以通过用激发自发荧光蛋白发出光的电磁辐射照射以简单方式监测。细胞发出的光因此是细胞的还原状态的指示并且因而是NADP(H)依赖性酶表达程度的指示。
根据本发明NADP(H)纳米传感器的一个优选实施方案，调节物是Sox调节蛋白(SoxR)并且启动子序列是soxS启动子序列。来自大肠杆菌K12的SoxR基因以登录号b4063，ECK4055保藏在美国国家医学图书馆的国家生物技术信息中心(NCBI)数据库(Bethesda，MD，美国)中。SoxR含有对转录活性必需的两个[2Fe-2S]簇。每种SoxR多肽含有检测细胞还原状态的[2Fe-2S]簇。Fe-SoxR和apo-SoxR均与启动子区结合，但是仅Fe-SoxR以氧化形式有助于启动子激活。铁-硫簇的氧化还原状态调节SoxR活性。SoxR的靶基因是相邻的soxS，其序列以登录号b4062,ECK4054保藏在美国国家医学图书馆的国家生物技术信息中心(NCBI)数据库(Bethesda，MD，美国)中。根据需要，可以通过NADP(H)依赖性还原酶如Rsx或RseC促进细胞的还原状态。
在这种联系下，进一步优选的是组分i)和ii)由来自大肠杆菌的基因间区形成，所述基因间区位于soxR和soxS之间并且包含SoxR结合序列、接在SoxR结合序列之后的soxS启动子序列和接在soxS启动子序列之后的在mRNA水平对应于核糖体结合位点的序列，或由与所述基因间区同源的核酸序列形成。在这种情境中，组分i)和ii)优选地由选自以下的核酸序列形成：
a)根据SEQ.ID.No.01的核酸序列，
b)与a)的核酸序列具有至少70％、优选地至少80％、仍然更优选地至少85％、仍然更优选地至少90％、仍然更优选地至少91％、仍然更优选地至少92％、仍然更优选地至少93％、仍然更优选地至少94％、仍然更优选地至少95％、仍然更优选地至少96％、仍然更优选地至少97％、仍然更优选地至少98％和最优选地至少99％同一性的核酸序列，所述核酸序列能够结合SoxR，从而RNA聚合酶对soxS启动子的亲和力取决于SoxR的氧化状态，和
c)能够在严格条件下与根据a)或b)的互补核酸序列杂交的核酸序列，所述核酸序列能够结合SoxR，从而RNA聚合酶对soxS启动子的亲和力取决于SoxR的氧化状态。
根据本发明的NADP(H)纳米传感器的这个特别优选实施方案的第一变型，其包含
(α1)SoxR的大肠杆菌基因(soxR)或与此同源的核酸序列；
(α2)在(α1)之后的来自大肠杆菌的基因间区，所述基因间区位于soxR和soxS之间并且包含SoxR结合序列、接在SoxR结合序列之后的soxS启动子序列和接在soxS启动子序列之后的在mRNA水平对应于核糖体结合位点的序列，或与所述基因间区同源的核酸序列，如上所述作为组分i)和ii)；
(α3)根据需要，在(α2)之后的来自大肠杆菌的soxS基因的部分序列或与此同源的核酸序列；
(α4)在(α2)或(α3)、优选地(α3)之后的编码自发荧光蛋白并处于soxS启动子序列控制下的核酸序列，作为组分iii)。
如上文并且还在下文中使用的词“在序列a)之后的序列b)”将根据本发明理解为意指，序列b)不必然地必须直接与序列a)结合，反而中间序列也可以位于序列a)和序列b)之间。
根据这个具体的实施方案，NADP(H)纳米传感器包含大肠杆菌soxR基因(soxR)或与此同源的核酸序列作为组分(α1)，组分(α1)优选地选自：
a)根据SEQ.ID.No.02的核酸序列，
b)编码具有根据SEQ.ID.No.03的氨基酸序列的多肽的核酸序列，
c)与a)或b)的核酸序列具有至少70％、优选地至少80％、仍然更优选地至少85％、仍然更优选地至少90％、仍然更优选地至少91％、仍然更优选地至少92％、仍然更优选地至少93％、仍然更优选地至少94％、仍然更优选地至少95％、仍然更优选地至少96％、仍然更优选地至少97％、仍然更优选地至少98％和最优选地至少99％同一性的核酸序列，所述核酸序列编码多肽，所述多肽能够与来自大肠杆菌的位于soxR和soxS之间的基因间区内的SoxR结合序列结合，并且其氧化状态能够影响RNA聚合酶对同样位于来自大肠杆菌的基因间区内的启动子序列的亲和力，
d)编码多肽的核酸序列，所述多肽与SEQ.ID.No.03具有至少70％、优选地至少80％、仍然更优选地至少85％、仍然更优选地至少90％、仍然更优选地至少91％、仍然更优选地至少92％、仍然更优选地至少93％、仍然更优选地至少94％、仍然更优选地至少95％、仍然更优选地至少96％、仍然更优选地至少97％、仍然更优选地至少98％和最优选地至少99％的同源性，所述核酸序列编码多肽，所述多肽能够与来自大肠杆菌的位于soxR和soxS之间的基因间区内的SoxR结合序列结合，并且其氧化状态能够影响RNA聚合酶对同样位于来自大肠杆菌的基因间区内的启动子序列的亲和力，并且
e)能够在严格条件下与根据组a)至d)之一的互补核酸序列杂交的核酸序列，所述核酸序列编码多肽，所述多肽能够与来自大肠杆菌的基因间区中位于soxR和soxS之间的SoxR结合序列结合并且其氧化状态能够影响RNA聚合酶对同样位于来自大肠杆菌的基因间区内的启动子序列的亲和力。
如本文所用的表述“同源性”(或“同一性”)可以由等式H(％)＝[1-V/X]×100确定，其中H指同源性，X是比较序列的核碱基/氨基酸总数并且V是序列中相对于比较序列而言视为不同的核碱基/氨基酸的数目。在全部情况下，术语编码多肽的核酸序列包括根据遗传密码简并性的条件似乎可能的全部序列。
可以使用序列对比程序(BLAST，Altschul等人,J.Mol.Biol.1990,215,403-410)确定核酸序列的同一性。两个氨基酸序列之间的同源性百分数可以同样由本领域技术人员使用从现有技术已知的方法轻易地确定。可以根据本发明使用的合适程序是BLASTp(Altschul等人,1997；"Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of proteindatabase search programs"；Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402)。
本领域技术人员可以找到用于杂交的说明，尤其在手册“The DIG System User'sGuide for Filter Hybridization"of Boehringer Mannheim GmbH(Mannheim,Germany,1993)中，以及Liebl等人,(International Journal of Systematic Bacteriology 41:255-260(1991))中。在严格条件下进行杂交，也就是说仅其中探针(例如，与soxR或soxS或来自大肠杆菌的基因间区soxRS互补的核苷酸序列)和靶序列(即用探针处理的多核苷酸)至少70％同一的才进行杂交。已知通过变动缓冲液组成、温度和盐浓度影响或决定包括洗涤步骤的杂交的严格性。与洗涤步骤相比，杂交反应通常以相对低的严格性实施(HybaidHybridisation Guide,Hybaid Limited,Teddington,UK,1996)。对于杂交反应，例如，可以在大约50℃-68℃的温度使用与5×SSC缓冲液相对应的缓冲液。在这种情况下，探针还可以与对探针的序列具有小于70％同一性的多核苷酸杂交。这类杂交分子较不稳定并且通过在严格条件下洗涤移除。这可以例如在建立大约50℃-68℃、大约52℃-68℃、大约54℃-68℃、大约56℃-68℃、大约58℃-68℃、大约60℃-68℃、大约62℃-68℃、大约64℃-68℃、大约66℃-68℃的温度时，通过降低盐浓度至2×SSC并根据需要随后降低至0.5×SSC来实现(DIG系统滤膜杂交用户指南，Boehringer Mannheim，Mannheim，德国，1995)。优选地，洗涤步骤在大约62℃-68℃、优选地64℃-68℃或大约66℃-68℃、特别优选地大约66℃-68℃的温度实施。适宜的情况下，可能降低盐浓度至与0.2×SSC或0.1×SSC相对应的浓度。通过以大约1-2℃的进阶从50℃至68℃逐步增加杂交温度，可以分离编码soxR或soxS或soxRS的基因间区的多核苷酸片段，所述多核苷酸片段例如与所用探针的序列具有至少70％或至少80％或至少90％至95％或至少96％至98％或至少99％同一性。杂交的进一步说明可在市场上以所谓试剂盒的形式获得(例如来自Roche Diagnostics GmbH的DIG Easy Hyb,Mannheim，德国，目录号1603558)。
根据这个具体实施方案的NADP(H)纳米传感器包含编码自发荧光蛋白的核酸序列作为组分(α4)并且其在(α2)或α3)之后，优选地在靶基因soxS(α3)之后，尤其靶基因soxS的前5个至200个核苷酸之后，并且处于soxS启动子序列控制下，作为组分iii)。
根据本发明，根据组分iii)的编码自发荧光蛋白的基因序列处于启动子序列ii)控制下(根据上文对本发明NADP(H)纳米传感器的具体实施方案描述的第一变体，编码自发荧光蛋白的基因序列(α4)处于soxS启动子序列控制下)。在这种情境下，术语“处于启动子序列控制下”优选地理解为意指编码自发荧光蛋白的基因序列与启动子功能性连接。如果启动子和编码自发荧光蛋白的基因序列和任选地其他调节元件，例如终止子或核糖体结合位点，以每个调节元件可以在核酸序列的转基因表达中实现其功能的方式有序排列，则这两种序列是功能连接的。为此，化学意义上的直接连接不是绝对必需的。遗传调控序列，例如增强子序列，也能够从更远离的位置或甚至从其它DNA分子上对靶序列发挥它们的作用。优选这样的布局，其中编码自发荧光蛋白的基因序列安置在启动子序列后(即在3'末端)，从而两个序列彼此共价地结合。优选地，在这种情况下，编码自发荧光蛋白的基因序列和启动子序列之间的距离小于200碱基对、特别优选地小于100碱基对、非常特别优选地小于50碱基对。编码自发荧光蛋白的基因序列和启动子还可能彼此功能性连接，从而在这两个基因序列之间仍然存在同源基因的一部分序列(也就是说，野生型细胞中其表达受该启动子调节的基因)(根据上文描述的NADP(H)纳米传感器的具体实施方案，组分(α3)的soxS基因的多个部分可以因此在soxS启动子序列和编码自发荧光蛋白的核酸序列(α4)之间)。在表达这种DNA构建体时，从自发荧光蛋白和由同源基因的相应部分序列编码的氨基酸序列获得融合蛋白(＝翻译融合)。同源基因的这类部分序列的长度并不关键，只要不明显地损害自发荧光蛋白的功能能力，也就是说受特定波长的光激发时其有荧光的特性。在上文描述的本发明NADP(H)纳米传感器的具体实施方案情况下，soxS部分序列(α3)优选地包含soxS基因的至少前5个核苷酸、仍然更优选地至少前10个核苷酸和仍然更优选地至少前20个核苷酸、但是优选地最多前200个核苷酸、仍然更优选地最多前150个核苷酸和仍然更优选地最多前100个核苷酸。
编码自发荧光蛋白的核酸序列(iii)(或(α4)和(β4))优选地包含编码荧光蛋白的基因，所述基因编码多管水母属(Aequora)荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)及其在不同波长范围内有荧光的变体(例如黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein；CFP)或其荧光增强的荧光蛋白(例如增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)或增强型青色荧光蛋白(ECFP)。可以根据本发明进一步使用编码其他自发荧光蛋白例如DsRed、HcRed、AsRed、AmCyan、ZsGreen、AcGFP、ZsYellow的基因序列，如从美国BD Biosciences,Franklin Lakes已知。也可使用光受体蛋白，其含有所谓的LOV结构域。在这种情境中，特别优选的自发荧光蛋白是EYFP。
根据本发明的NADP(H)纳米传感器的特别优选实施方案的第二变体，其包含
(β1)SoxR的大肠杆菌基因(soxR)或与此同源的核酸序列；
(β2)在(β1)之后的来自大肠杆菌的基因间区，所述基因间区位于soxR和soxS之间并且包含SoxR结合序列、接在SoxR结合序列之后的soxS启动子序列和接在soxS启动子序列之后的在mRNA水平对应于核糖体结合位点的序列，或与所述基因间区同源的核酸序列，如上所述作为组分i)和ii)；
(β3)在(β2)之后并处于soxS启动子序列控制下的来自大肠杆菌soxS基因的序列、这个基因的部分序列或与此同源的核酸序列；
(β3')在(β3)之后的在mRNA水平对应于核糖体结合位点的其他序列；
(β4)在(β3')之后的编码自发荧光蛋白并处于soxS启动子序列控制下的核酸序列，作为组分iii)。
优选的组分(β1)、(β2)、(β3)和(β4)是上文已经作为优选组分与本发明NADP(H)纳米传感器的特别优选实施方案的第一变型相关联而提到的那些组分(α1)、(α2)、(α3)和(α4)。在这种DNA构建体的表达期间，形成SoxS或这种蛋白质的片段和与之独立的自发荧光蛋白(＝转录融合)。
还通过包含本发明NADP(H)纳米传感器的细胞为实现上述目的作出贡献。在这种情况下，本发明的NADP(H)纳米传感器可以在细胞中以附加体形式或染色体形式存在。
尤其可以提到的合适细胞的例子是大肠杆菌(Escherichia coli)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或另一种真细菌(Eubacterium)、或是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或另一种酵母。
本发明的细胞适于确立特定基因序列是否编码NADP(H)依赖性酶。为此目的，将编码潜在NADP(H)依赖性酶的基因引入该细胞中并表达。如上文所述，细胞发出光是细胞的还原状态的指示并且因而是NADP(H)依赖性酶表达程度的指示。
在这种情况下，根据本发明，“NADP(H)依赖性酶”理解为意指参与底物转化成反应产物的至少部分步骤的任何酶，其中所述反应产物在化学上与这种底物不同，NADP(H)作为辅因子参与这种转化的至少一个部分步骤。
根据本发明细胞的一个优选实施方案，除本发明的NADP(H)纳米传感器之外，这种细胞因此还包含具有任选突变基因的质粒，所述基因编码NADP(H)依赖性酶。在这种情境中，NADP(H)依赖性酶优选地选自醇脱氢酶、醛脱氢酶、乳酸脱氢酶、烯酯还原酶、环氧化物还原酶、二氨基庚二酸脱氢酶、氨基酸脱氢酶、醛氧化还原酶、链烷还原酶、胺还原酶、环氧化物脱氢酶、羧酸脱氢酶、羟酸酮还原酶和羟酸脱卤素酶。
还通过重组细胞为实现上述目的作出贡献，所述重组细胞包含编码自发荧光蛋白的核酸序列，其中自发荧光蛋白在细胞中表达的程度取决于胞内NADP(H)的可用性。在这种联系下，特别优选的细胞是上文描述的细胞，尤其包含本发明NADP(H)传感器的细胞。
还通过一种用于分离编码NADP(H)依赖性酶的基因的方法为实现上述目的作出贡献，所述方法包括方法步骤：
(I)提供本发明的NADP(H)纳米传感器；
(II)将NADP(H)纳米传感器引入细胞中；
(III)将可以编码NADP(H)依赖性酶的基因引入方法步骤(II)中获得的细胞的细胞悬液的单个细胞中；
(IV)将细胞与NADP(H)依赖性酶的底物温育；
(V)通过检测胞内荧光活性鉴定细胞悬液中具有增加的NADP(H)依赖性酶活性的单个细胞；
(VI)从细胞悬液分离鉴定的细胞；
(VII)分离鉴定的细胞中编码NADP(H)依赖性酶的基因。
可以借助这种方法分离新的NADP(H)依赖性酶和具有增加的或修饰的底物识别作用的突变型NADP(H)依赖性酶。
作为NADP(H)传感器和作为细胞优选的传感器和细胞是上文已经作为优选传感器或细胞与本发明传感器或本发明细胞相联系而描述的那些。
在方法步骤(I)和(II)中，首先通过将本发明的NADP(H)纳米传感器引入细胞，制备本发明的细胞，这种引入可能以附加体形式或染色体形式进行。
在本发明方法的方法步骤(III)中，随后将可以编码NADP(H)依赖性酶的基因引入方法步骤(II)中获得的细胞的细胞悬液的单个细胞中，所述基因尤其可能是质粒编码的NADP(H)依赖性酶突变基因。为了将位点非特异性突变引入质粒编码的NADP(H)依赖性酶基因以增加多样性，优选地借助易错聚合酶链反应(PCR)和扩增技术实施体外诱变。在这种情况下，待突变的基因接受使用聚合酶的PCR作用，其中取决于反应条件，所述聚合酶将单个碱基不正确地掺入合成的基因(Tindall,K.R.和T.A.Kunkel："Fidelity of DNAsynthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase"；Biochemistry,1988,27(16),第6008-13页)。这种方法的频繁变型包括在PCR批次中使用锰(II)离子或核苷酸类似物(Cadwell R.C等人,(1992)；PCR Methods Appl.(2),第28-33页/Leung D.W等人,(1989)Techniques(1),第11-15页)。用于引入突变的这些技术称作“易错PCR(epPCR)”(LabrouNE："Random mutagenesis methods for in vitro directed enzyme evolution"；Curr.Protein.Pept.Sci.2010(11),第91-100页)。突变可以例如是点突变，并且例如可以通过聚合酶产生置换、缺失或插入。突变率在1-40个突变/1kb之间，优选地1-5个突变/1kb。然而，突变也可以使用Stratagene QuikChange试剂盒(La Jolla，加利福尼亚州，美国)借助饱和诱变法产生，或还使用一种称作SeSam的方法(EP1 670 914B1)产生，其中借助所述方法，任何现存的核苷酸在饱和作用下转变成任何可能的核苷酸。
其活性可以用携带纳米传感器的宿主以高通量分析的可能NADP(H)依赖性酶例如是1,2-脱氢网状霉素还原酶(1.5.1.27)、2-烯酰辅酶A还原酶(1.3.1.10)、2-烯酰辅酶A还原酶(1.3.1.39)、烯醛/酮氧化还原酶(1.3.1.74)细胞色素P450还原酶(1.6.2.4)、NADP(H)脱氢酶(1.6.99.1)、NADP(H)脱氢酶(黄素)(1.6.8.2)、NADP(H)脱氢酶(醌)(1.6.5.10)、NADP(H)-依赖性1,5-失水-D-果糖还原酶(1.1.1.263)、NADP(H)-依赖性细胞色素P450还原酶(1.6.2.4)、二氢硫辛酸脱氢酶(1.6.99.1)、DT-二氢硫辛酸脱氢酶(1.6.5.5)、铁氧还蛋白还原酶(1.18.1.2)、NADP(H)氧化酶(1.6.3.1、1.6.5.10、1.6.3.1、1.6.3.1、1.6.3.1)、P450氧化还原酶(1.6.2.4)、P450还原酶(1.6.2.4)、过氧化物酶(1.11.1.2)、醌接纳体氧化还原酶(1.6.5.5)、醌氧化还原酶(1.6.5.10)、NADP(H)特异性FMN还原酶(1.5.1.38)、硫氧还蛋白还原酶(1.8.1.9)、转氢酶(1.6.1.2)、NADP(H)-醛还原酶(1.1.1.2)、戊醛糖还原酶(1.1.1.21)、NADP(H)-醛糖还原酶(1.1.1.21)、NADP(H)-羰基还原酶(1.1.1.184)、NADP(H)-CYP还原酶(1.6.2.4)、NADP(H)-细胞色素c氧化还原酶(1.6.2.4)、NADP(H)-细胞色素c还原酶(1.1.1.2)、NADP(H)-细胞色素f还原酶(1.6.2.5)、NADP(H)-细胞色素P450还原酶(1.6.2.4)和NADP(H)-细胞色素P450还原酶(1.14.13.68)。
随后通过转化将NADP(H)依赖性酶基因中含有突变的质粒引入微生物例如大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)中。在这种情况下，术语“转化”包括用于转移多核苷酸、尤其DNA至目的细菌中的全部方法。这些方法尤其包括在转化中使用分离的DNA、电转化或电穿孔，通过细胞接触(如在接合中)转移或借助粒子轰击法转移DNA。
在过程步骤(III)后，已经将任选地编码NADP(H)依赖性酶的基因引入来自方法(II)中所获得的细胞的细胞悬液的单个细胞(并表达)，随后将细胞在方法步骤(IV)中与NADP(H)依赖性酶的底物温育，随后在方法步骤(V)中通过检测胞内荧光活性鉴定细胞悬液中NADP(H)依赖性酶活性增加的单个细胞。为此目的，将细胞悬液暴露于在这种频率的电磁辐射，所述频率激发NADP(H)纳米传感器的自发荧光蛋白发出光。
在方法步骤(VI)中，随后从细胞悬液分离鉴定的细胞，这种分离优选地借助流式细胞术(FACS＝荧光激活的细胞分选法)，非常特别优选地借助高通量流式细胞术(HT-FACS＝高通量荧光激活的细胞分选法)实施。关于借助流式细胞术分析细胞悬液的详细内容可以在例如Sack U,Tarnok A,Rothe G(编著)：Diagnostik.Grundlagen,Methoden und klinische Anwendungen der Durchflusszytometrie,Basel,Karger,2007,第27–70页中找到。
在方法步骤(VII)中，随后分离并根据需要分析在鉴定的细胞中编码NADP(H)依赖性酶的基因，例如通过从已经分离并鉴定的细胞分离携带酶的质粒并通过测序验证它们导致改进性荧光的突变。
还通过本发明NADP(H)纳米传感器用于体内鉴定编码NADP(H)依赖性酶的基因的用途为实现上述目的作出贡献。
现在借助附图和非限制性例子更详细地解释本发明。
附图说明
图1通过上文描述的特别优选的实施方案的例子，显示本发明的NADP(H)纳米传感器运行的功能模型。
图2显示实施例3中制备的大肠杆菌BL21(DE3)细胞的特异性荧光，所述大肠杆菌BL21(DE3)细胞具有本发明的NADP(H)纳米传感器(pSensox)和表达的醇脱氢酶(Lbadh)(实心正方形)。具有无活性醇脱氢酶的纳米传感器pSennegK的荧光作为对照显示(空心正方形)。
图3显示形成自发荧光蛋白作为转录融合(顶部)和翻译融合(底部)的图。
根据图1，NADP(H)纳米传感器可以包含SoxR的大肠杆菌基因(soxR)，接在这个基因之后来自大肠杆菌的基因间区，所述基因间区位于soxR和soxS之间并且包含soxR结合序列和接在SoxR结合序列之后的soxS启动子序列、接在这个启动子序列之后来自大肠杆菌的soxS基因的部分序列(soxS')和接在这个部分序列之后处于soxS启动子序列控制下的编码自发荧光蛋白(AFP)的核酸序列。在高细胞质NADP(H)浓度(图1中左上方)，[2Fe-2S]簇(rhomb)以被结合于启动子的SoxR还原的形式存在。在NADP(H)的可用性低时(图1中右上)，[2Fe-2S]簇氧化，并且所致的soxS启动子区扭曲导致对RNA聚合酶而言可能的靶基因转录启动。根据本发明，天然靶基因soxS与自发荧光蛋白(AFP)融合。通过消耗NADP(H)，NADP(H)依赖性酶造成soxS'-AFP的表达增加，并因此NADP(H)消耗增加造成细胞的荧光增加。
图3在顶部显示转录融合并在底部显示翻译融合。在这两种情况下，通过启动子P1形成转录物，所述启动子例如是受SoxR控制的soxS启动子。虽然在转录融合期间由于第二核糖体结合位点(RBS)的存在形成了两种分别的肽，但是在翻译融合期间形成单一肽，即融合蛋白，其中自发荧光蛋白含有额外的氨基酸序列。
实施例
实施例1
NADPH纳米传感器的构建(转录融合)
以引物对SoxS_for_SphI(SEQ.ID.No.04)和SoxR_rev_SalI(SEQ.ID.No.05)和来自大肠杆菌DH5α的染色体DNA作为模板，扩增基因soxR连同soxR-soxS的基因间区和soxS的前63个核苷酸。
SoxS_for_SphI：
ATCTGCATGCTTACGGCTGGTCAATATGCTCGTC
SoxR_rev_SalI：
GCTAGTCGACCAAACTAAAGCGCCCTTGTG
以引物对EYFP_for_SphI(SEQ.ID.No.06)和EYFP_rev_ClaI(SEQ.ID.No.07)和载体pSenLys作为模板，扩增eyfp基因连同核糖体结合位点。在专利申请WO-A-2011/138006中描述了载体pSenLys。
EYFP_for_SphI：
AGAGGCATGCAAGGAGAATTACATGGTGAGCAAGGGCGAGG
EYFP_rev_ClaI：
GCGCATCGATTTATTACTTGTACAGCTCGTCCATG
载体pBtacLbadh编码来自短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的NADPH依赖性醇脱氢酶(Lbadh)。它在Ernst等人,(Ernst M,Kaup B,Müller M,Bringer-Meyer S,Sahm H,Appl.Microbiol.Biotechnol.2005,66(6)，第629-34页)中描述。载体pBtacLbadh用限制性酶SalI和ClaI处理，并且从琼脂糖凝胶分离大小约5.0kb的载体片段并用碱性磷酸酶处理并且用来自Quiagen的QIAquick凝胶提取试剂盒(目录号28704)(希尔登，德国)纯化。随后借助来自New England BioLabs(New England Biolabs,240County Road,Ipswich,MA01938-2723)的T4DNA连接酶，连接两种PCR产物和载体。将连接批料直接转化至大肠杆菌菌株DH5α中。通过在已经补充有50mg/L氨苄青霉素的LB琼脂上涂布该转化批料，实施携带质粒的细胞的选择(Sambrook等人,"Molecular cloning:a laboratory manual",第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)。从转化体分离质粒DNA并通过用限制性酶BamHI处理，接着实施琼脂糖凝胶电泳进行检查。质粒称作pSenSox并作为序列SEQ.ID.No.08保藏。
产生pSennegK作为具有修饰的醇脱氢酶Lbadh的衍生物。为此目的，以引物ADH_negK_for(SEQ.ID.No.09)和ADH_negK_rev(SEQ.ID.No.10)并再以pBtacLbadh作为模板，扩增无活性Lbadh，其是具有221bp缺失的醇脱氢酶。将所产生的片段与含有基因eyfp连同核糖体结合位点的约5.7kb大小的载体片段连接。所产生的载体的序列作为SEQ.ID.No.11保藏。
ADH_negK_for：
ACAAGAATTCGCTAAGAGTGTCGGCACTCC
ADH_negK_rev：
GGCCAAGCTTCCGAAGAAGACACCATCAAG
产生pSen-L194S作为具有修饰的醇脱氢酶Lbadh的又一种衍生物。为此目的，采用引物L194S_for(SEQ.ID.No.12)和L194S_rev(SEQ.ID.No.13)，扩增pSenSox作为靶向插入突变的模板。借助测序验证产生的质粒。所产生的载体的序列作为SEQ.ID.No.14保藏。
L194S_for：
CTGGCTACATCAAGACACCATCTGTTGATG
L194S_rev：
CGGCCCCTGGTAGGTCATCAACAGATGGTG
产生pSen-L194A作为具有修饰的醇脱氢酶Lbadh的又一种衍生物。为此目的，采用引物L194A_for(SEQ.ID.No.15)和L194A_rev(SEQ.ID.No.16)，扩增pSenSox作为靶向插入突变的模板。借助测序验证产生的质粒。所产生的载体的序列作为SEQ.ID.No.17保藏。
L194A_for：
CTGGCTACATCAAGACACCAGCGGTTGATG
L194A_rev：
CGGCCCCTGGTAGGTCATCAACCGCTGGTG
实施例2
使用NADP(H)纳米传感器监测醇脱氢酶依赖性产物形成
将大肠杆菌BL21(DE3)(Life Technologies GmbH,Frankfurter Straβe129B,64293Darmstadt)用质粒pSenSox转化。将5ml 2×YT培养基(16g/l胰蛋白胨，10g/l酵母提取物，5g/l NaCl)用单菌落接种并将培养物在37℃和130转/分钟温育过夜。使用这种预培养物，将主培养物在50ml 2×TY中接种至OD 0.05并在37℃和130转/分钟温育。在OD 0.3，添加1mM IPTG并将培养物温育另外3小时至OD 5-6。
随后将0.9ml份的细胞悬液引入BioLector培养系统(m2plabs GmbH，Aachen，德国)的Flowerplate微量滴定板(48孔)的反应容器中。在0.1ml恒定体积内以渐增浓度添加乙酰乙酸甲酯(MAA)至细胞悬液。随后将Flowerplate微量滴定板在30℃，1,200转/分钟温育，振摇半径3mm。在BioLector培养系统中，将生长在线记录为620nm处的散射光，并且在激发波长485nm和发射波长520nm连续记录培养物的荧光。10小时后的特异性荧光对添加的MAA量作图并且在图2中显示(添加0-70mM乙酰乙酸甲酯至各个批次和在10小时后测定特异性荧光，这显示为黑色实心方框；具有无活性Lbadh的大肠杆菌BL21(DE3)pSennegK充当阴性对照(空心方框)。图2显示荧光随渐增MAA浓度增加。这种增加归因于pSenSox，因为采用在其他方面与pSenSox相同的具有无活性醇脱氢酶的质粒pSennegK的对照反应未造成荧光增加。
实施例3
使用NADP(H)纳米传感器确定不同的醇脱氢酶活性
在每种情况下，将菌株大肠杆菌BL21(DE3)(Life Technologies GmbH,Frankfurter Straβe 129B,64293Darmstadt)用pSennegK、pSen-L194S和pSen-L194A转化。此外，实施例2中描述的菌株大肠杆菌BL21(DE3)pSenSox用作为第二质粒的pET28a转化。最后提到的载体从Novagen(Life Technologies GmbH,Frankfurter Straβe 129B,64293Darmstadt)获得。将5ml 2×YT培养基(16g/l胰蛋白胨，10g/l酵母提取物，5g/lNaCl)用特定菌株的单菌落接种并将培养物在37℃和130转/分钟温育过夜。使用这种预培养物，将主培养物在50ml 2×TY中接种至OD 0.05并在37℃和130转/分钟温育。在OD 0.3，不添加IPTG或添加1mM IPTG至菌株大肠杆菌BL21(DE3)pSenSox并将培养物温育另外3小时至OD 5-6。
如实施例2中所述，随后将0.9ml份的细胞各自引入BioLector培养系统(m2plabsGmbH，Aachen，德国)的Flowerplate微量滴定板(48孔)的反应容器中。在每种情况下向细胞悬液以0.1ml添加乙酰乙酸甲酯(MAA)至终浓度40mM。随后将Flowerplate微量滴定板在30℃，1,200转/分钟温育，振摇半径3mm，并测定特异性荧光。表1中显示19小时后获得的特异性荧光。
此外，测定各个批次中重组大肠杆菌细胞的醇脱氢酶活性。为此目的，将细胞以10,000×g，4℃，5分钟收获并溶解于100mM磷酸钾缓冲液，pH 6.5，1mM二硫苏糖醇，1mMMgCl2中。通过Silamat S5(Ivoclar Vivadent GmbH，德国)借助0.1mm直径的玻璃珠破坏细胞。在定量醇脱氢酶活性的酶试验中使用在16,000×g，4℃，20分钟离心后获得的粗提取物。该试验含有5mM乙酰乙酸甲酯、0.25mM NADPH和在100mM pH6.5磷酸钾缓冲液中的1mMMgCl2以及0.01-0.1ml粗提取物。在340nm和30℃监测NADP(H)的还原。酶单位(U)表示为每分钟减少0.001mmol NADP(H)的粗提取物的量。它同样在表1中给出。
实施例4
分离具有修饰的底物识别作用的突变醇脱氢酶
来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的醇脱氢酶Lbadh对乙酰乙酸甲酯具有高活性，但是对作为底物的4-甲基-2-戊酮仅具有约10％低活性。为了进化出具有更高活性的Lbadh，将随机突变通过易错PCR(epPCR)插入pSenSox中。为了插入该突变，每个反应使用10ng pSenSox作为模板，以及0.1-0.8mM Mn2+，在<0.2mM Mn2+以下的较低浓度时，用Mg2+建立至少0.2mM的总浓度。每个反应添加0.5μl来自Fermentas(目录号EP0401)Taq聚合酶。多核苷酸
SEQ.ID.No.18：
ACAAGAATTCGCTAAGAGTGTCGGCACTCC
SEQ.ID.No.19：
GGCCAAGCTTCCGAAGAAGACACCATCAAG
作为引物使用。将反应温育30分钟。反应产物随后用BamHI和SalI处理并且与事先经相同处理的载体pSenSox连接。
大肠杆菌DH5αmcr用连接产物转化(Grant,1990,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences,USA,87,第4645-4649页)。在温育30小时后，将转化体用10ml 2×YT从平板洗下并且在新鲜的2×YT培养基中稀释10倍。在37℃温育4小时后，添加20mM 4-甲基-2-戊酮作为底物，并且进一步温育三小时后，发送批次用于FACS分析和分选。
为了FACS分析和分选具有高荧光的细胞，将2×YT培养基中的细胞悬液调节至小于0.1的光密度并且立即通过FACS ARIA II高速细胞分选仪(Becton Dickinson GmbH,Tullastr.8-12,69126海德堡)。用激发波长488nm和633nm实施分析并且在发射波长530±15nm和660±10nm在70psi样品压力下实施检测。用从属于设备的软件BD DIVA 6.1.3版分析数据。使用BD FACSflow作为鞘液。借助正向散射和反向散射设置电子门控以排除非细菌粒子。为了分选EYFP-阳性细胞，选择电子门控的下一个能级以排除无荧光细胞。以这种方式，在含有2×YT培养基的皮式培养皿上分选出123个荧光细胞。
如实施例2中所述，用37℃温育30小时后获得的菌落接种BioLector培养系统(m2plabs GmbH，Aachen，德国)的Flowerplate微量滴定板(48孔)的反应容器。但是，使用20mM 4-甲基-2-戊酮并且不使用乙酰乙酸甲酯底物。在120分钟后定量特异性荧光，并且如实施例3中所述，选择在酶试验中测定了其醇脱氢酶活性的克隆。这里使用20mM 4-甲基-2-戊酮作底物。
以这种方式获得的具有质粒pSen-A93M的突变体与起始菌株相比具有增加了26％的比活性(表2)，并且4-甲基-2-戊酮作为底物的转化速率增加37％。载体pSen-A93M的序列作为SEQ.ID.No.20保藏。
表1：完整细胞的醇脱氢酶活性与特异性荧光的相关性。
表2：以4-甲基-2-戊酮作为底物，借助NADP(H)纳米传感器和FACS分离的醇脱氢酶的活性和转化率增加。
实施例5
NADPH纳米传感器的构建(翻译融合)
以引物对SoxS_for_SphI_tl(SEQ.ID.No.21)和SoxR_rev_SalI_tl(SEQ.ID.No.22)和来自大肠杆菌DH5α的染色体DNA作为模板，扩增基因soxR连同soxR-soxS的基因间区和soxS的前63个核苷酸。
SoxS_for_SphI_tl：
ATCTGCATGCCGGCTGGTCAATATGCTCGTC
SoxR_rev_SalI_tl：
GCTAGTCGACCAAACTAAAGCGCCCTTGTG
以引物对EYFP_for_SphI_tl(SEQ.ID.No.23)和EYFP_rev_ClaI_tl(SEQ.ID.No.24)和载体pSenLys作为模板，扩增eyfp基因。在专利申请WO-A-2011/138006中描述了载体pSenLys。
EYFP_for_SphI_tl：
AGAGGCATGCGTGAGCAAGGGCGAGG
EYFP_rev_ClaI_tl：
GCGCATCGATTTATTACTTGTACAGCTCGTCCATG
载体pBtacLbadh编码来自短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的NADPH依赖性醇脱氢酶(Lbadh)。它在Ernst等人,(Ernst M,Kaup B,Müller M,Bringer-Meyer S,Sahm H,Appl.Microbiol.Biotechnol.2005,66(6)，第629-34页)中描述。载体pBtacLbadh用限制性酶SalI和ClaI处理，并且从琼脂糖凝胶分离大小约5.0kb的载体片段并用碱性磷酸酶处理并且用来自Quiagen的QIAquick凝胶提取试剂盒(目录号28704)(希尔登，德国)纯化。随后借助来自New England BioLabs(New England Biolabs,240County Road,Ipswich,MA01938-2723)的T4DNA连接酶，连接两种PCR产物和载体。将连接批料直接转化至大肠杆菌菌株DH5α中。通过在已经补充有50mg/L氨苄青霉素的LB琼脂上涂布该转化批料，实施携带质粒的细胞的选择(Sambrook等人,"Molecular cloning:a laboratory manual",第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)。从转化体分离质粒DNA并通过用限制性酶BamHI处理，接着实施琼脂糖凝胶电泳进行检查。质粒称作pSenSox_tl并作为序列SEQ.ID.No.25保藏。

Claims (15)

1.一种NADP(H)纳米传感器，其包含
i)结合调节物的核酸序列，其中调节物的氧化状态取决于NADP(H)的可用性；
ii)接在核酸序列i)之后的启动子序列，所述启动子序列能够与RNA聚合酶结合，其中RNA聚合酶对启动子序列的亲和力受调节物的氧化状态影响；
iii)处于启动子序列ii)控制下并编码自发荧光蛋白的核酸序列，
其中调节物是来自大肠杆菌的Sox调节蛋白SoxR并且启动子序列是来自大肠杆菌的soxS启动子序列，
其中组分i)和ii)由来自大肠杆菌的基因间区形成，所述基因间区位于soxR和soxS之间并且包含SoxR结合序列、接在SoxR结合序列之后的soxS启动子序列和接在soxS启动子序列之后的在mRNA水平对应于核糖体结合位点的序列，或由与所述基因间区同源的核酸序列形成，
其中组分i)和ii)由根据SEQ.ID.No.01的核酸序列形成。
2.根据权利要求1所述的NADP(H)纳米传感器，其包含
(α1)来自大肠杆菌的soxR基因或与此同源的核酸序列；
(α2)在(α1)之后的来自大肠杆菌的基因间区，所述基因间区位于soxR和soxS之间并且包含作为组分i)的SoxR结合序列、接在SoxR结合序列之后的作为组分ii)的soxS启动子序列和接在soxS启动子序列之后的在mRNA水平对应于核糖体结合位点的序列，或与所述基因间区同源的核酸序列；
(α3)根据需要，在(α2)之后的来自大肠杆菌的soxS基因的部分序列或与此同源的核酸序列；
(α4)在(α2)或(α3)之后的编码自发荧光蛋白并处于soxS启动子序列控制下的核酸序列，作为组分iii)。
3.根据权利要求1所述的NADP(H)纳米传感器，其包含
(β1)来自大肠杆菌的soxR基因或与此同源的核酸序列；
(β2)在(β1)之后的来自大肠杆菌的基因间区，所述基因间区位于soxR和soxS之间并且包含作为组分i)的SoxR结合序列、接在SoxR结合序列之后的作为组分ii)的soxS启动子序列和接在soxS启动子序列之后的在mRNA水平对应于核糖体结合位点的序列，或与所述基因间区同源的核酸序列；
(β3)在(β2)之后并处于soxS启动子序列控制下的来自大肠杆菌soxS基因的序列、这个基因的部分序列或与此同源的核酸序列；
(β3')在(β3)之后的在mRNA水平对应于核糖体结合位点的其他序列；
(β4)在(β3')之后的编码自发荧光蛋白并处于soxS启动子序列控制下的核酸序列，作为组分iii)。
4.根据权利要求2或3所述的NADP(H)纳米传感器，其中组分(α1)或(β1)选自：
a)根据SEQ.ID.No.02的核酸序列，和
b)编码具有根据SEQ.ID.No.03的氨基酸序列的多肽的核酸序列。
5.根据权利要求1所述的NADP(H)纳米传感器，其中编码自发荧光蛋白的核酸序列(iii)选自编码绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白和青色荧光蛋白的基因。
6.根据权利要求5所述的NADP(H)纳米传感器，其中编码自发荧光蛋白的核酸序列(iii)选自编码DsRed、HcRed、AsRed、AmCyan、ZsGreen、AcGFP和ZsYellow的基因。
7.根据权利要求5所述的NADP(H)纳米传感器，其中编码自发荧光蛋白的核酸序列(iii)是编码增强型绿色荧光蛋白、增强型黄色荧光蛋白、增强型蓝色荧光蛋白、增强型青色荧光蛋白的基因。
8.细胞，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的NADP(H)纳米传感器。
9.根据权利要求8所述的细胞，其中NADP(H)纳米传感器以附加体形式或染色体形式存在于细胞中。
10.根据权利要求8所述的细胞，其中细胞选自大肠杆菌(Escherichia coli)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的细胞，还包含具有编码NADP(H)依赖性酶的任选突变的基因的质粒。
12.根据权利要求11所述的细胞，其中NADP(H)依赖性酶选自醇脱氢酶、醛脱氢酶、乳酸脱氢酶、烯酯还原酶、环氧化物还原酶、二氨基庚二酸脱氢酶、氨基酸脱氢酶、醛氧化还原酶、链烷还原酶、胺还原酶、环氧化物脱氢酶、羧酸脱氢酶、羟酸酮还原酶和羟酸脱卤素酶。
13.一种用于分离编码NADP(H)依赖性酶的基因的方法，包括方法步骤：
(I)提供根据权利要求1至7中任一项所述的NADP(H)纳米传感器；
(II)将NADP(H)纳米传感器引入细胞中；
(III)将可以编码NADP(H)依赖性酶的基因引入方法步骤(II)中获得的细胞的细胞悬液的单个细胞中；
(IV)将细胞与NADP(H)依赖性酶的底物温育；
(V)通过检测胞内荧光活性鉴定细胞悬液中具有增加的NADP(H)依赖性酶活性的单个细胞；
(VI)从细胞悬液分离鉴定的细胞；
(VII)分离鉴定的细胞中编码NADP(H)依赖性酶的基因。
14.根据权利要求13所述的方法，其中借助流式细胞术从方法步骤(VI)中的细胞悬液分离出鉴定的细胞。
15.根据权利要求1至7中任一项所述的NADP(H)纳米传感器的用途，用于在微生物体内鉴定编码NADP(H)依赖性酶的基因。
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