CN110982832B - 一种辐射生物剂量计、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种辐射生物剂量计、制备方法及应用，属于生物技术领域。所述生物剂量计为在大肠杆菌的SoxR启动子下游加入EGFP基因构成的SoxR辐射生物剂量计或在大肠杆菌的Cda启动子下游加入EGFP基因构成的Cda辐射生物剂量计。所述辐射生物剂量计可在线实时监测物理辐射剂量的大小，具有广泛的检测和应用范围；应用了微生物的群体效应作为生物信号放大系统，灵敏度较现有相关检测技术有大幅提高；后期将所述辐射生物剂量计置于微流控芯片中培养，可实现在线实时监测，实现商品化生产，携带方便，检测快速，可随时提供环境中细胞毒性物质和辐射剂量的大小，为检测损伤剂量大小提供参考。

Description

一种辐射生物剂量计、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种辐射生物剂量计、制备方法及应用，具体地说，涉及一种运用生物技术改造基因序列的微生物作为辐射剂量的生物计量法，对低线性能量传递(LinearEenergy Transfer,LET)物理辐射及紫外线辐射进行监测，检测时间短，结果直观可见，且响应强度和辐射剂量存在一定的量效关系，通过荧光强度值的大小反映环境中所述辐射的细胞毒性大小，而且对化学细胞损伤试剂具有响应，具有检测广谱性；属于生物技术领域。

背景技术

水污染、噪音污染、空气污染和辐射被称为四大环境污染。按照辐射产生的生物学效应，分为电离辐射和非电离辐射两大类：当辐射能量达到12eV以上时，可使原子或分子丢失电子而生成带电的离子，导致生物组织产生相应的电离反应，机体受到较为严重的损伤，这类辐射称之为电离辐射；而当能量小于12eV时，辐射能量不足以直接使生物组织中的相关物质电离，称之为非电离辐射。辐射诱发产生自由基，造成细胞器的损伤，进而导致整个细胞损伤，甚至使机体发生病变和死亡。因辐射造成的生物机体的相关效应即为辐射生物学效应，包括蛋白质的损伤、遗传物质的损伤等，其中最主要的是胞内的遗传物质(主要为DNA)的损伤，造成DNA的单链断裂、双链断裂以及DNA的簇损伤等。当细胞内损伤积累到一定的限度导致无法完成自身的损伤修复工作，会启动细胞内的一系列信号转导途径，使细胞的生命周期产生停滞，进一步使细胞凋亡或者是坏死，最终可能造成机体的病变和死亡。已有研究表明一个未修复的DNA双链断裂就足以造成细胞的死亡；表1简单总结不同辐射大小对生物的危害程度。

表1症状与剂量的关系

机体受到电离辐射后，会产生某些生物学变化。用生物学指标确定已接受辐射剂量的理论和方法，称为生物剂量学。某些生物剂量测定体系称为生物剂量计。

生物传感器是对特定物质敏感，并将物质浓度转换为一定信号的装置。生物传感器和生物检测用于对环境中微量的物质进行检测。为了让这个检测更加灵敏，还需要生物放大器以提高对生物传感器在极其少量的物质存在时便做出反应，这在有毒物质的检测中显得尤为重要。另外伴随着生物计量学的发展，这几年对于生物传感等的研究也提出了更高的要求，而开发放大器远比改造现有特异性极强的生物传感元件要容易实现得多，通过放大器的引入，可以大大优化检测的最低限。

由于核能，放射能的广泛存在，评估放射的危害已成为辐射生物学和防护学研究的重要领域，应用基因组学测试基因的表达变化，过去研究集中的基因有细胞周期调节、DNA损伤修复、细胞凋亡和炎症等，多采用实时定量PCR以及质谱等方法，费时费力。

其他检测方法还有：Ames法，已经作为检测环境污染物的方法，是通过统计化合物处理组在最低营养琼脂培养基上的回复突变与对照组的菌落数，来确定被测化合物的致突变力。Ames法适用于检测各种化合物在不同剂量水平下对实验菌株的致突变作用，但所用的菌株多，操作繁琐，所需时间相对于其他检测方法较长，所述方法从被测化合物样品的准备必须至少2天；将荧光素酶基因lux导入，用测定细菌化学发光替代原平皿计数，降低了操作的复杂度，但诱导时间仍未缩短。Umu检测法具有简单快速(5h～6h)、敏感性高及廉价的优点，但检测结果不太稳定，特定菌株只能针对特定的一类化合物。β-半乳糖苷酶作为lacZ基因的蛋白产物，用于显色反应的检测结果表征，优点是快速和简单，但β-半乳糖苷酶不够灵敏，荧光素酶除了额外底物，还需活化剂和稳定剂加入，且具有信号闪烁与信号衰减。

近年来发明了启动子-报告因子系统，报告因子可通过分光光度计、酶标仪、荧光光度计、流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、电化学检测器及毛细管电泳-激光诱导荧光等仪器检测，提高了检测的方便性和多样性。如利用SOS反应启动子启动目的基因的表达，涉及的基因有uvrA,uvrB,uvrC,uvrD,ssb,recA和recN等，SOS-报告因子检测法简单、灵敏且快速高通量。

SOS应答(SOS Response)是细胞在严重危及生存环境中所表现出的一种生理状态。SOS应答机制最早发现于原核生物细胞中，是大肠杆菌对致死性DNA损伤的应答。当细菌DNA遭到破坏时(如受到紫外线照射)，细菌细胞内会启动一个SOS的诱导型DNA修复系统。参与SOS修复系统的许多基因受LexA阻遏蛋白的抑制，平时表达水平很低。当DNA严重受损时，DNA复制中断，本底水平表达的RecA与有缺口的单链DNA结合，被激活成为蛋白酶，将LexA蛋白切割成无活性形式，以解除LexA蛋白对基因转录的阻遏效应。SOS体系高效表达，DNA得到修复。当修复完成后，RecA蛋白恢复到非蛋白水解酶的形式，LexA蛋白逐步积累并重新建立阻遏作用，在所发现的受LexA阻遏的基因中，很多是负责DNA损伤修复(包括切除修复和同源重组修复)的蛋白质组分，Cda即为损伤修复相关基因，简言之，上述蛋白质都和细胞处理所面临的生存逆境有关。Cda启动子经研究发现，其在启动子区域有两段近似LexA的序列，可以有效降低回文结构的形成，提高转录效率，降低背景。

SoxR蛋白操纵子原理是，SoxR感受胞内氧化还原电势，通过铁硫簇失去一个电子，而激活目标基因的表达。SoxR在大肠杆菌中能应答过氧化物，负责抗氧化胁迫的全局性调控。当环境中没有氧自由基存在时，SoxR蛋白呈还原态，其与RNA聚合酶结合，生成的复合物相当于弱启动子，抑制后续基因的表达，但当加入氧自由基时SoxR蛋白被氧化，使蛋白构象发生变化，此时其与RNA聚合酶结合相当于强启动子，就可以启动后续基因表达。绿色荧光蛋白的64位氨基酸由苯丙氨酸突变为亮氨酸后成为增强型绿色荧光蛋白，折叠时间缩短至两个小时，有效的减少了折叠所需时间。因此这两种生物传感器相比于传统的更高效，灵敏。

发明内容

针对上述现有技术只针对化学毒性试剂检测，对辐射因素的关注少，且在先前的检测方法中存在的Ames法检测时间长，化学传感器检测法干扰信号多，且均存在检测背景高，灵敏度低的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种辐射生物剂量计，采用基因工程菌作为微生物传感器，并通过荧光信号直观反应辐射剂量，并有效的运用群体效应进行信号的放大，创新建立了一种辐射生物剂量计，所述辐射生物剂量计相比于其他化学剂量计有许多优点：无毒无害，在线鉴测制备方便，成本低，且生物之间的相互作用可以加以利用，利用微生物间的群体效应，可实现信号的放大，方便检测，提高了辐射生物剂量计的检测灵敏度。

本发明的目的之二在于提供一种辐射生物剂量计的制备方法。

本发明的目的之三在于提供一种辐射生物剂量计的应用，所述辐射生物剂量计不仅可在线实时监测物理辐射剂量的大小，而且对化学毒性物质也有较高的灵敏度效应，具有广泛的检测和应用范围；应用了微生物的群体效应作为生物信号放大系统，灵敏度较现有相关检测技术有大幅提高；将所述辐射生物剂量计置于微流控芯片中培养，可实现在线实时监测，实现商品化生产，携带方便，检测快速，可随时提供环境中细胞毒性物质和辐射剂量的大小。

为实现本发明的目的，提供下述技术方案。

一种辐射生物剂量计，所述生物剂量计采用基因工程菌作为生物传感器来测定已接受的辐射剂量，所述生物剂量计为SoxR辐射生物剂量计或Cda辐射生物剂量计。

其中，所述SoxR辐射生物剂量计为在大肠杆菌基因序列中的SoxR启动子基因下游加入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的基因工程菌，SoxR启动子基因中含有核糖体结合位点(RBS)，EGFP基因位于RBS下游，可以基于SoxR启动子基因诱导后表达下游的EGFP基因，通过测定EGFP基因表达后EGFP的强度来测定生物接受的辐射剂量；

所述Cda辐射生物剂量计为在所述SoxR辐射生物剂量计的基础上，用Cda启动子基因序列替代SoxR启动子基因序列，得到的基因工程菌，其中，Cda启动子基因序列中含有RBS，EGFP基因位于RBS下游；辐射诱导Cda启动子表达，进而表达下游的EGFP基因。

优选所述大肠杆菌为模板大肠杆菌MG1655(Escherichia coli K-12substr.MG1655)和宿主大肠杆菌DH5α(Escherichia coli(E.coli)Strain:DH5a)。

优选所述SoxR辐射生物剂量计中携带目的基因的载体的核苷酸全序列为核苷酸序列表中数字标识符<210>所表示的序列标识符1所述的核苷酸序列，即核苷酸序列表中的SEQ ID No.1(以下简称SEQ ID No.1，其余核苷酸序列依次顺序命名)。

优选所述Cda辐射生物剂量计中携带目的基因的载体的核苷酸全序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.2。

一种本发明所述的辐射生物剂量计的制备方法，所述制备方法步骤如下：

(1)以大肠杆菌基因组为模板，采用PCR扩增目的基因SoxR启动子；以质粒pColD-CA23的基因组为模板，采用PCR扩增目的基因Cda启动子；以利用密码子简并性优化的含EGFP报告基因的PUC 19克隆质粒基因组为模板，PUC 19克隆质粒基因组核苷酸序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.3，采用PCR扩增目的基因EGFP基因；将PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分离，获得所述目的基因片段DNA。

所述目的基因及对应引物如表2所示：

表2目的基因及对应引物

优选以大肠杆菌MG1655基因组为模板，采用PCR扩增目的基因SoxR启动子。

优选PCR反应扩增体系如下：

上游引物1μL、下游引物1μL、模板1μL、PCR Mix(含高保真DNA聚合酶)10μL和无菌水7μL，总共为20μL的体系。

优选PCR反应条件为：

步骤①：94℃变性3min，50℃复性30s，72℃延伸1min，

步骤②：94℃变性30s，50℃复性30s，72℃延伸1min；

步骤②循环30次，然后4℃保温。

(2)将步骤(1)获得的目的基因SoxR启动子片段DNA用EcoRI和XbaI酶切，EGFP片段DNA用XbaI和Hind III酶切，将酶切后的SoxR启动子片段DNA用T4连接酶与酶切后的EGFP片段DNA连接，然后进行琼脂糖凝胶电泳分离，获得大小约1500bp的序列条带，用EcoRI和HindIII酶切，将酶切产物分别与相同用EcoRI和HindIII酶切后的PUC57(Escherichiacoli，Cloning vectorpUC57)表达载体用T4连接酶连接，获得所述SoxR辐射生物剂量计中携带目的基因的载体，其核苷酸全序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.1；

将步骤(1)获得的目的基因Cda启动子片段DNA用EcoRI和XbaI酶切，EGFP片段DNA用XbaI和Hind III酶切，将酶切后的Cda启动子片段DNA用T4连接酶与酶切后的EGFP片段DNA连接，然后进行琼脂糖凝胶电泳分离，获得大小约1500bp的序列条带，用EcoRI和HindIII酶切，将酶切产物分别与相同用EcoRI和HindIII酶切后的PUC57表达载体用T4连接酶连接，获得所述Cda辐射生物剂量计中携带目的基因的载体，其核苷酸全序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.2。

(3)将步骤(2)获得的所述SoxR辐射生物剂量计中携带目的基因的载体转化进入大肠杆菌感受态细胞，筛选，测序验证正确，得到基因工程菌，为本发明所述的SoxR辐射生物剂量计；

将步骤(2)获得的所述Cda辐射生物剂量计中携带目的基因的载体转化进入大肠杆菌感受态细胞，筛选，测序验证正确，得到基因工程菌，为本发明所述的Cda辐射生物剂量计。

优选所述宿主细胞即大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌DH5α感受态细胞。

优选转化采用化学转化法；具体转化及验证可采用如下方法：

将大肠杆菌DH5α感受态细胞解冻后与所述携带目的基因的载体混合冰敷1h，然后42℃热激90s，继续冰敷2min～3min，加入800μL的LB液体培养基复苏1h，然后涂到具有氨苄抗性LB平板培养基上过夜(由于PUC57携带氨苄抗性)；第二天选择具有氨苄抗性LB培养基平板上长出的单克隆接种于液体LB培养基，过夜培养后提取质粒，用EcoRI和Hind III酶切质粒进行验证，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，获得一条大小约1500bp的序列条带和一条大小约2600bp的序列条带，说明本发明所述辐射生物剂量计构建成功。

一种本发明所述的辐射生物剂量计的应用，所述应用为在辐射剂量测定中的应用；具体应用步骤如下：

(1)将所述辐射生物剂量计在液体培养基进行辐射处理；

(2)用荧光酶标仪进行实验组荧光测量和拍照，以及测对照组本底荧光表达情况；

(3)采用辐射处理所述辐射生物剂量计作为实验组，将未辐射处理所述辐射生物剂量计作为对照组；

(4)分别测量实验组和对照组的OD和荧光值：OD＝600(OD₆₀₀)，荧光测量激发光波长488nm，发射波波长520nm；

(5)计算ROD＝ODx/OD₀，ROD表示光密度比值，ODx表示实验组的光密度值，OD₀表示对照组的光密度值；

SFU＝绿色荧光强度/OD₆₀₀；IF＝SFU_实验/SFU_对照；SFU表示荧光单位；

(6)将步骤(5)获得数据进行作图分析。

(7)建立物理辐射剂量与所述辐射生物剂量计荧光强度值的量效关系，测定辐射剂量。

优选步骤(1)：将所述辐射生物剂量计在LB液体培养基中培养至OD＝0.4～0.5，此时处于对数生长期，进行辐射处理；

步骤(2)：采用钴60源的γ射线照射处理对数生长期的所述辐射生物剂量计作为实验组，将未照射处理的对数生长期的所述辐射生物剂量计作为对照组。

原理

本发明的原理是在辐射等有害因素刺激下，作为辐射生物剂量计的基因工程菌发生SOS反应和氧化应激反应，使相关启动子启动，表达下游的蛋白序列，将绿色荧光蛋白置于相关启动子下，则环境有害因素触发生物抗性反应后，传感器工程菌启动子诱导下游的报告因子表达出荧光，通过相关检测设备检测荧光强度大小，反映有害因素对传感器工程菌的损伤程度，从而反映环境中有害因素的量。

有益效果

1.本发明提供了一种辐射生物剂量计，传统方法对特定的DNA损伤产物(生物标志物)进行检测的问题有：难以应用于未知化合物暴露下的毒性监测，细胞外的实验无法告知被测化合物是否对细胞内的DNA具有损伤作用以及毒性的大小；难以筛选与检测一些潜在的DNA损伤试剂和这类化合物的混合物，需要复杂的实验操作和大型仪器的支撑，不太可能用于污染地区的现场检测和一段时间的实时监控等；本发明采用基因工程菌作为微生物传感器，并通过荧光信号直观反应辐射剂量，并有效的运用群体效应进行信号的放大，创新建立了一种辐射生物剂量计，所述辐射生物剂量计相比于其他化学剂量计具有以下特点：无毒无害，在线鉴测制备方便，成本低，且生物之间的相互作用可以加以利用，利用微生物间的群体效应，可实现信号的放大，方便检测，提高了检测灵敏度；

2.本发明提供了一种辐射生物剂量计，所述生物剂量计利用启动子-报告因子系统，报告因子采用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，EGFP属于蛋白的自发荧光，具有稳定明亮的荧光和更稳定的抗光漂白能力，直接的荧光检测不需要额外底物的加入，大大简化了操作程序且对活细胞没有毒害作用，适用于定量测定与分析；由于EGFP的高效折叠效率使检测时间大大缩短；将来自细菌的氧化应激操纵子SoxR基因或来自大肠杆菌携带的质粒pColD-CA23的高效损伤反应相关基因序列Cda基因作为启动子，可有效的响应细胞损伤从而启动后续基因的高效表达；优选用Cda基因作为启动子，因为Cda启动子DNA序列中特有的两部分LexA序列能有效减少了转录过程中的回文结构，提高了启动子的启动效率，而降低了背景荧光；

3.本发明提供了一种辐射生物剂量计的应用，进行物理辐射刺激显示了阳性结果，在研究中使用物理辐射进行诱导表达实验，通过荧光酶标仪测量的荧光强度来反映物理辐射剂量大小与启动子被诱导程度，即荧光蛋白表达情况之间的关系；基因工程菌可以通过相应群体效应产生增强变化的绿色荧光蛋白强度，且变化规律与无放大结构的传感器测量的结果一致，可以得出，基因群体效应的循环，可以满足信号放大的需求同时不会造成信号失真，从而总结得出荧光强度和物理辐射剂量间的相关关系。

附图说明

图1为实施例1中SoxR启动子+EGFP基因序列条带、Cda启动子+EGFP基因序列条带、PUC57表达载体质粒及PUC57表达载体质粒酶切条带的琼脂糖凝胶电泳分离结果图。

图2为实施例1中所述SoxR辐射生物剂量计中携带目的基因的载体转化进入大肠杆菌感受态细胞后单克隆质粒酶切验证图。

图3为所述Cda辐射生物剂量计中携带目的基因的载体转化进入大肠杆菌感受态细胞单克隆质粒酶切验证图。

图4为实施例1制得的SoxR辐射生物剂量计在物理辐射毒性大小测定中结果。

图5为实施例1制得的Cda辐射生物剂量计在物理辐射毒性大小测定中结果。

图6为实施例1制得的Cda辐射生物剂量计对照组(a)和实验组(b)在辐射剂量的测定中辐照后培养2h的荧光显微镜结果。

图7为实施例1制得的Cda辐射生物剂量计的诱导因子在辐射剂量的测定中的变化情况。

具体实施方式

以下实施例中：

所述琼脂糖凝胶电泳分离均采用质量体积分数为1％的胶浓度，即所称取琼脂糖粉的质量(g)与所加TAE缓冲液的体积(mL)的比例；所使用的Marker为Marker III，共有七条带，从上到下分别为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、800bp、500bp和200bp。

实施例1

一种本发明所述的辐射生物剂量计的制备方法，所述制备方法步骤如下：

(1)以大肠杆菌MG1655基因组为模板，采用PCR扩增目的基因SoxR启动子；以质粒pColD-CA23的基因组为模板，采用PCR扩增目的基因Cda启动子；以苏州金唯智生物科技有限公司(GENEWIZ)合成的利用密码子简并性优化的含EGFP基因序列的PUC 19克隆质粒(Escherichia coli，Cloning vector pUC19)基因组为模板，采用PCR扩增目的基因EGFP基因；将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，采用Marker为Marker III，分离完后切胶回收，获得所述目的基因片段DNA。

所述PUC 19克隆质粒基因组核苷酸序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.3，具体如下：

5’-ATTCTAGAATGGTGAGCAAAGGCGAAGAACTGTTTACCGGCGTTGTGCCGATTCTGGTGGAACTGGATGGCGATGTGAACGGCCACAAATTTAGCGTGAGCGGCGAAGGTGAAGGTGATGCAACCTATGGCAAGCTGACTTTAAAGTTCATCTGCACCACTGGTAAACTGCCGGTTCCGTGGCCGACTTTAGTTACCACTTTAACCTATGGCGTGCAATGCTTTAGCCGCTATCCGGACCACATGAAACAGCACGATTTCTTTAAGAGCGCAATGCCGGAGGGCTACGTGCAAGAACGCACCATCTTTTTCAAGGACGACGGTAACTATAAAACCCGCGCCGAGGTGAAATTTGAGGGTGACACTTTAGTGAACCGCATTGAACTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAAGACGGCAACATTTTAGGCCATAAATTAGAATACAATTACAATAGTCATAATGTTTATATTATGGCCGATAAACAGAAAAATGGTATCAAAGTTAATTTTAAGATCCGCCATAACATTGAAGACGGTAGCGTGCAGCTGGCCGACCATTATCAGCAGAATACCCCGATCGGTGATGGTCCGGTGTTACTGCCGGATGATCATTATTTAAGTACCCAGAGCGCTTTAAGCAAAGACCCGAATGAGAAACGCGATCACATGGTGCTGCTGGAATTTGTGACCGCCGCCGGCATTACCTTAGGCATGGATGAGCTGTATAAATAAAAGCTTAAC-3’。

所述目的基因及对应引物分别如表2所示：

表2目的基因及对应引物

PCR反应扩增体系如下：

上游引物1μL、下游引物1μL、模板1μL、PCR Mix(含高保真DNA聚合酶)10μL和无菌水7μL，总共为20μL的体系。

PCR反应条件为：

步骤①：94℃变性3min，50℃复性30s，72℃延伸1min，

步骤②：94℃变性30s，50℃复性30s，72℃延伸1min；步骤②循环30次，然后4℃保温。

(2)将步骤(1)获得的目的基因SoxR启动子片段DNA用EcoRI和XbaI酶切，EGFP片段DNA用XbaI和Hind III酶切，将酶切后的SoxR启动子片段DNA用T4连接酶与酶切后的EGFP片段DNA连接，然后进行琼脂糖凝胶电泳分离，获得大小约1500bp的序列条带，为SoxR启动子+EGFP基因序列条带，用EcoRI和HindIII酶切，将酶切产物分别与相同用EcoRI和HindIII酶切后的PUC57表达载体用T4连接酶连接，获得所述SoxR辐射生物剂量计中携带目的基因的载体，其核苷酸全序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.1，具体如下：

5’-TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCTCGCGAATGCATCTAGATGCTCTAGAGCGGGTTGACAGGATTTACGAGGTGACGTAACTTTTCACTGTATATAAAACCAGCCAAGCTTGGCAATTCACTAGTCAAACTAAAGCGCCCTTGTGGCGCTTTAGTTTTGTTCATCTTCCAGCAAGCGTGCGCCGGTACCTTCTTCTCCTAAGCGGTCGCCCGGGTTACGCAACGGGCAATCACTGCGCGAAAGGCAGCCACAACCAATACATCCGTCCAGTTCGTCACGCAGCGCCACTAAGGTATGAATGCGCCGATCCAACTCTTCTCGCCATTGGGACGAAAGCTGTTTCCACTCTTTCGCACTTAACGTATGCCCTTCGGGCAACACGCCAAACGCTTCACCAATGGTCGCCAGCGGAATGCCAATACGCTGAGCAATTTTGATAATTGCAACATATCGCAACACATCACGTTTATATCGCCGCTGATTGCCGCTGTTACGGATACTGGTAATCAACCCTTTACTTTCATAGAAATGCAGCGCCGATACCGCCACACCGCTGCGTTTCGCCACTTCGCCGGGGGTTAGCAGCGCTTTAATGCGGGGTAATTTCTTTTCCATAAATCGCTTTACCTCAAGTTAACTTGAGGAATTATACTCCCCAACAGATGAATTAACGAACTGAACACTGAAAAGAGGCAGATTTATGTCCCATCAGAAAATTATTCAGGATCTTATCGCATGGATTGACGAGCATATTGACCAGCCGTAAGCATGCAAGGAGAATTACATGGTGAGCAAAGGCGAAGAACTGTTTACCG GCGTTGTGCCGATTCTGGTGGAACTGGATGGCGATGTGAACGGCCACAAATTTAGCGTGAGCGGCGAAGGTGAAGG TGATGCAACCTATGGCAAGCTGACTTTAAAGTTCATCTGCACCACTGGTAAACTGCCGGTTCCGTGGCCGACTTTA GTTACCACTTTAACCTATGGCGTGCAATGCTTTAGCCGCTATCCGGACCACATGAAACAGCACGATTTCTTTAAGA GCGCAATGCCGGAGGGCTACGTGCAAGAACGCACCATCTTTTTCAAGGACGACGGTAACTATAAAACCCGCGCCGA GGTGAAATTTGAGGGTGACACTTTAGTGAACCGCATTGAACTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAAGACGGCAACATT TTAGGCCATAAATTAGAATACAATTACAATAGTCATAATGTTTATATTATGGCCGATAAACAGAAAAATGGTATCA AAGTTAATTTTAAGATCCGCCATAACATTGAAGACGGTAGCGTGCAGCTGGCCGACCATTATCAGCAGAATACCCC GATCGGTGATGGTCCGGTGTTACTGCCGGATGATCATTATTTAAGTACCCAGAGCGCTTTAAGCAAAGACCCGAAT GAGAAACGCGATCACATGGTGCTGCTGGAATTTGTGACCGCCGCCGGCATTACCTTAGGCATGGATGAGCTGTATA AATAACGGCTAGCCCTCGAGGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATATACTAGTAGCGGCCGCTGCAGTATCGGATCCCGGGCCCGTCGACTGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC-3’；

其中，斜体部分为SoxR启动子序列，粗斜体部分为RBS，下划线标记部分为EGFP序列。

将步骤(1)获得的目的基因Cda启动子片段DNA用EcoRI和XbaI酶切，EGFP片段DNA用XbaI和Hind III酶切，将酶切后的Cda启动子片段DNA用T4连接酶与酶切后的EGFP片段DNA连接，然后进行琼脂糖凝胶电泳分离，获得大小约1500bp的序列条带，为Cda启动子+EGFP基因序列条带，用EcoRI和HindIII酶切，将酶切产物分别与相同用EcoRI和HindIII酶切后的PUC57表达载体用T4连接酶连接，获得所述Cda辐射生物剂量计中携带目的基因的载体，其核苷酸全序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.2，具体如下：

5’-TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCTCGCGAATGCATCTAGATGCTCTAGAGCGGGTTGACAGGATTTACGAGGTGACGTAACTTTTCACTGTATATAAAACCAGCCAAGCTTGGCAATTCACTAGTATCTGCATGCCAATGAATTCTGCCAGTCGGCGCTCTTCGGCTTCGGTCAGTCTATGGCGTTTCATGGTGGTCTCCGGGTGTTTCTCTGGTGTCATAACAGTTTAACTGTTGGCTCTCTCCTTATGCTAATCAGCCTTCTTTCATGCCTGTTGCCATTGAGTTTAAGAATGATTGGTTGTTTTTCTTGAGCGTTTTCACAAAAACGTAAATCCAGTGGGTTGACAGGATTTACGAGGTGACGTAACTTTTTACTGTACATAAAACCAGTGGTTTTATGTACAGTTTGTTGTTTTTAACGCATTGTTTTAAAAGTCAAAGAGGTGTTTTTATGAGTGACCCATGGGAAGAGGTGTTTGCATGGTGAGCAAAGGCGAAGAACTGTTTAC CGGCGTTGTGCCGATTCTGGTGGAACTGGATGGCGATGTGAACGGCCACAAATTTAGCGTGAGCGGCGAAGGTGAA GGTGATGCAACCTATGGCAAGCTGACTTTAAAGTTCATCTGCACCACTGGTAAACTGCCGGTTCCGTGGCCGACTT TAGTTACCACTTTAACCTATGGCGTGCAATGCTTTAGCCGCTATCCGGACCACATGAAACAGCACGATTTCTTTAA GAGCGCAATGCCGGAGGGCTACGTGCAAGAACGCACCATCTTTTTCAAGGACGACGGTAACTATAAAACCCGCGCC GAGGTGAAATTTGAGGGTGACACTTTAGTGAACCGCATTGAACTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAAGACGGCAACA TTTTAGGCCATAAATTAGAATACAATTACAATAGTCATAATGTTTATATTATGGCCGATAAACAGAAAAATGGTAT CAAAGTTAATTTTAAGATCCGCCATAACATTGAAGACGGTAGCGTGCAGCTGGCCGACCATTATCAGCAGAATACC CCGATCGGTGATGGTCCGGTGTTACTGCCGGATGATCATTATTTAAGTACCCAGAGCGCTTTAAGCAAAGACCCGA ATGAGAAACGCGATCACATGGTGCTGCTGGAATTTGTGACCGCCGCCGGCATTACCTTAGGCATGGATGAGCTGTA TAAATAACGGCTAGCCCTCGAGGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCTACTAGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATATACTAGTAGCGGCCGCTGCAGTATCGGATCCCGGGCCCGTCGACTGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC-3’

其中，斜体部分为Cda启动子序列，粗斜体部分为RBS，下划线标记部分为EGFP序列。

实验结果如图1所示，图1中第1泳道为Marker III，共有七条带，从上到下分别为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、800bp、500bp和200bp；第2泳道为SoxR启动子+EGFP基因序列条带，大小约1500bp；第3泳道为PUC57表达载体质粒，可见有3条条带，从下到上分别是质粒双螺旋结构，线性结构和开环结构；第5～8泳道为Cda启动子+EGFP基因序列条带，最亮的条带集中在1500bp左右，第9～12泳道为PUC57表达载体质粒的酶切条带，最上方的条带为未被限制性核酸内切酶切断的质粒。

(3)将步骤(2)获得的所述SoxR辐射生物剂量计中携带目的基因的载体转化进入大肠杆菌感受态细胞，筛选，测序验证正确，得到基因工程菌，为本发明所述的SoxR辐射生物剂量计；

将步骤(2)获得的所述Cda辐射生物剂量计中携带目的基因的载体转化进入大肠杆菌感受态细胞，验证正确，得到基因工程菌，为本发明所述的Cda辐射生物剂量计。

所述大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌DH5α感受态细胞。

转化采用化学转化法；具体转化及验证采用如下方法：

将大肠杆菌DH5α感受态细胞解冻后与所述携带目的基因的载体混合冰敷1h，然后42℃热激90s，继续冰敷2min～3min，加入800μL的LB液体培养基复苏1h，然后涂到具有氨苄抗性LB平板培养基上过夜(由于PUC57携带氨苄抗性)；第二天选择具有氨苄抗性LB培养基平板上长出的单克隆接种于液体LB培养基，过夜培养后提取质粒，用EcoRI和Hind III酶切质粒进行验证，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，获得一条大小约1500bp的序列条带和一条大小约2600bp的序列条带，说明本发明所述辐射生物剂量计构建成功。

所述SoxR辐射生物剂量计中携带目的基因的载体转化进入大肠杆菌感受态细胞后单克隆质粒酶切验证图如图2所示，第1泳道为MarkerⅢ，第2泳道为单克隆质粒电泳条带，第3泳道和第4泳道为酶切后的单克隆质粒电泳条带，可看出质粒已完全切开，得到的一条大小约1500bp的SoxR启动子+EGFP基因序列条带和一条大小约为2600bp的载体序列条带。

所述Cda辐射生物剂量计中携带目的基因的载体转化进入大肠杆菌感受态细胞单克隆质粒酶切验证图如图3所示，第1泳道为MarkerⅢ；第2泳道为酶切后单克隆质粒的电泳条带，可看出质粒已完全切开，最上面一条条带为没有切开的所述单克隆质粒，下面两条条带分别为一条大小约为2600bp的载体序列条带和一条大小约1500bp的Cda启动子+EGFP基因序列条带。

一种本实施例所述的辐射生物剂量计的应用，所述应用为在辐射剂量测定中的应用；具体应用步骤如下：

(1)将所述辐射生物剂量计在LB液体培养基中培养至OD＝0.4～0.5，此时处于对数生长期，进行辐射处理；

(2)用荧光酶标仪进行荧光测量和拍照，以及测本底荧光表达情况；

(3)采用钴60源的γ射线照射处理对数生长期的所述辐射生物剂量计作为实验组，预试验处理剂量为5Gy/min、10Gy/min、15Gy/min和20Gy/min；正式实验处理剂量为50Gy/min、100Gy/min、200Gy/min、300Gy/min和10Gy/min；同时将未照射处理的对数生长期的所述辐射生物剂量计作为对照组；

(4)分别测量实验组和对照组的OD和荧光值：OD＝600(OD₆₀₀)，荧光测量激发光波长488nm，发射波波长520nm；

(5)计算光密度比值(ROD)＝ODx/OD₀，其中，ODx表示实验组的光密度值，OD₀表示对照组的光密度值；

荧光单位(SFU)＝绿色荧光强度/OD₆₀₀；诱导因子(IF)＝SFU_实验/SFU_对照；

(6)将步骤(5)获得数据进行作图分析。

毒性大小测定中的结果如图4所示，可见随着物理辐射γ射线强度的加大，荧光蛋白的相对表达量逐渐提升；但是SoxR辐射生物剂量计存在本底荧光较高的问题。

Cda辐射生物剂量计在物理辐射损伤强度大小测定中的结果如图5所示，从图中可以看出，随着辐射强度的增加，相对荧光强度(SFU)值也在增加，说明辐射刺激后荧光表达量上升。且实验组与对照组相比，荧光增长明显，且背景荧光明显下降。

Cda辐射生物剂量计对照组(a)和实验组(b)在辐射剂量的测定中辐照后培养2h的荧光显微镜结果如图6所示，荧光显微镜下可见，实验组荧光强度明显表达量高于对照组。

(7)建立物理辐射剂量与所述辐射生物剂量计荧光强度值的量效关系，测定辐射剂量。

实施例1制得的Cda辐射生物剂量计的诱导因子在辐射剂量的测定中的变化情况如图7所示。可知，随着辐射剂量的增大，损伤越大，所述Cda辐射生物剂量计的生长逐渐放缓，荧光强度逐渐增强；辐射刺激2h后，出现了较为明显的荧光变化，且辐射剂量与诱导因子(实验组荧光强度与光密度的比值与对照组该值的比)出现了较好的相关关系，诱导因子与辐射剂量的相关关系为y＝0.0002x2-0.116x+1.1489。

从实验结果可见，SoxR辐射生物剂量计和Cda辐射生物剂量计这两种辐射剂量计均对辐射损伤有响应，Cda更适合检测辐射损伤效应，因为其响应较好，且背景干扰小，所以作为一种高效的辐射剂量计，优选Cda辐射剂量计。

核苷酸序列表

<110> 北京理工大学

<120> 一种辐射生物剂量计、制备方法及应用

<160> 9

<210> 1

<211> 3569

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<220>

<221> RBS

<222> （665）…（690）

<223> SoxR辐射生物剂量计中携带目的基因的载体

<400> 1

tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 60

gaggaagcct gcataacgcg aagtaatctt ttcggtttta aagaaaaagg gcagggtggt 120

gacaccttgc ccttttttgc cggactgcag cggccgctac tagtcaaact aaagcgccct 180

tgtggcgctt tagttttgtt catcttccag caagcgtgcg ccggtacctt cttctcctaa 240

gcggtcgccc gggttacgca acgggcaatc actgcgcgaa aggcagccac aaccaataca 300

tccgtccagt tcgtcacgca gcgccactaa ggtatgaatg cgccgatcca actcttctcg 360

ccattgggac gaaagctgtt tccactcttt cgcacttaac gtatgccctt cgggcaacac 420

gccaaacgct tcaccaatgg tcgccagcgg aatgccaata cgctgagcaa ttttgataat 480

tgcaacatat cgcaacacat cacgtttata tcgccgctga ttgccgctgt tacggatact 540

ggtaatcaac cctttacttt catagaaatg cagcgccgat accgccacac cgctgcgttt 600

cgccacttcg ccgggggtta gcagcgcttt aatgcggggt aatttctttt ccataaatcg 660

ctttacctca agttaacttg aggaattata ctccccaaca gatgaattaa cgaactgaac 720

actgaaaaga ggcagattta tgtcccatca gaaaattatt caggatctta tcgcatggat 780

tgacgagcat attgaccagc cgtaagcatg caaggagaat tacatggtga gcaagggcga 840

ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca 900

caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa 960

gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac 1020

ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa 1080

gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa 1140

ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct 1200

gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta 1260

caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt 1320

caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa 1380

cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacgac cactacctga gcacccagtc 1440

cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac 1500

cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag taactcgagg ccaggcatca 1560

aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt 1620

gaacgctctc tactagagtc acactggctc accttcgggt gggcctttct gcgtttatat 1680

gaattccaga aatcatcctt agcgaaagct aaggattttt tttatctgaa attctgcctc 1740

gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta gacgtcaggt 1800

ggcactcgag ttgatcgggc acgtaagagg ttccaacttt caccataatg aaataagatc 1860

actaccgggc gtattttttg agttatcgag attttcagga gctaaggaag ctaaaatgga 1920

gaaaaaaatc actggatata ccaccgttga tatatcccaa tggcatcgta aagaacattt 1980

tgaggcattt cagtcagttg ctcaatgtac ctataaccag accgttcagc tggatattac 2040

ggccttttta aagaccgtaa agaaaaataa gcacaagttt tatccggcct ttattcacat 2100

tcttgcccgc ctgatgaatg ctcatccgga atttcgtatg gcaatgaaag acggtgagct 2160

ggtgatatgg gatagtgttc acccttgtta caccgttttc catgagcaaa ctgaaacgtt 2220

ttcatcgctc tggagtgaat accacgacga tttccggcag tttctacaca tatattcgca 2280

agatgtggcg tgttacggtg aaaacctggc ctatttccct aaagggttta ttgagaatat 2340

gtttttcgtc tcagccaatc cctgggtgag tttcaccagt tttgatttaa acgtggccaa 2400

tatggacaac ttcttcgccc ccgttttcac catgggcaaa tattatacgc aaggcgacaa 2460

ggtgctgatg ccgctggcga ttcaggttca tcatgccgtt tgtgatggct tccatgtcgg 2520

cagaatgctt aatgaattac aacagtactg cgatgagtgg cagggcgggg cgtaatttga 2580

tatcgagctc gcttggactc ctgttgatag atccagtaat gacctcagaa ctccatctgg 2640

atttgttcag aacgctcggt tgccgccggg cgttttttat tggtgagaat ccaagcctcg 2700

agctgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat 2760

ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg 2820

agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc 2880

ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg 2940

tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag 3000

cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact 3060

ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg 3120

gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc 3180

ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg 3240

aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg 3300

cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag 3360

ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc 3420

gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctgtggaa aaacgccagc aacgcggcct 3480

ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc 3540

ctgattctgt ggataaccgt attaccgcc 3569

<210> 2

<211> 4016

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<220>

<221> RBS

<222> （712）…（740）

<223> Cda辐射生物剂量计中携带目的基因的载体

<400> 2

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420

tgcatctaga tgctctagag cgggttgaca ggatttacga ggtgacgtaa cttttcactg 480

tatataaaac cagccaagct tggcaatggc ttctgccagt cggcgctctt cggcttcggt 540

cagtctatgg cgtttcatgg tggtctccgg gtgtttctct ggtgtcataa cagtttaact 600

gttggctctc tccttatgct aatcagcctt ctttcatgcc tgttgccatt gagtttaaga 660

atgattggtt gtttttcttg agcgttttca caaaaacgta aatccagtgg gttgacagga 720

tttacgaggt gacgtaactt tttactgtac ataaaaccag tggttttatg tacagtttgt 780

tgtttttaac gcattgtttt aaaagtcaaa gaggtgtttt tatgagtgac ccatgggaag 840

aggtgtttgc atggtgagca aaggcgaaga actgtttacc ggcgttgtgc cgattctggt 900

ggaactggat ggcgatgtga acggccacaa atttagcgtg agcggcgaag gtgaaggtga 960

tgcaacctat ggcaagctga ctttaaagtt catctgcacc actggtaaac tgccggttcc 1020

gtggccgact ttagttacca ctttaaccta tggcgtgcaa tgctttagcc gctatccgga 1080

ccacatgaaa cagcacgatt tctttaagag cgcaatgccg gagggctacg tgcaagaacg 1140

caccatcttt ttcaaggacg acggtaacta taaaacccgc gccgaggtga aatttgaggg 1200

tgacacttta gtgaaccgca ttgaactgaa gggcatcgac ttcaaggaag acggcaacat 1260

tttaggccat aaattagaat acaattacaa tagtcataat gtttatatta tggccgataa 1320

acagaaaaat ggtatcaaag ttaattttaa gatccgccat aacattgaag acggtagcgt 1380

gcagctggcc gaccattatc agcagaatac cccgatcggt gatggtccgg tgttactgcc 1440

ggatgatcat tatttaagta cccagagcgc tttaagcaaa gacccgaatg agaaacgcga 1500

tcacatggtg ctgctggaat ttgtgaccgc cgccggcatt accttaggca tggatgagct 1560

gtataaataa cggctagccc tcgaggccag gcatcaaata aaacgaaagg ctcagtcgaa 1620

agactgggcc tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac gctctctact agagtcacac 1680

tggctcacct tcgggtgggc ctttctgcgt ttatatacta gtagcggccg ctgcagtatc 1740

ggatcccggg cccgtcgact gcagaggcct gcatgcaagc ttggcgtaat catggtcata 1800

gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag 1860

cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg 1920

ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca 1980

acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc 2040

gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg 2100

gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 2160

ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 2220

cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 2280

ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 2340

taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg 2400

ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 2460

ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 2520

aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 2580

tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac 2640

agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 2700

ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 2760

tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 2820

tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt 2880

cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta 2940

aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct 3000

atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg 3060

cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga 3120

tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt 3180

atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt 3240

taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt 3300

tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat 3360

gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc 3420

cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc 3480

cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat 3540

gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag 3600

aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt 3660

accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc 3720

ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa 3780

gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg 3840

aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa 3900

taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac 3960

cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtc 4016

<210> 3

<211> 737

<212> DNA

<213> 大肠杆菌克隆载体PUC19（Escherichia coli，Cloning vector pUC19）

<220>

<223> 利用密码子简并性优化的PUC 19克隆质粒

<400> 3

attctagaat ggtgagcaaa ggcgaagaac tgtttaccgg cgttgtgccg attctggtgg 60

aactggatgg cgatgtgaac ggccacaaat ttagcgtgag cggcgaaggt gaaggtgatg 120

caacctatgg caagctgact ttaaagttca tctgcaccac tggtaaactg ccggttccgt 180

ggccgacttt agttaccact ttaacctatg gcgtgcaatg ctttagccgc tatccggacc 240

acatgaaaca gcacgatttc tttaagagcg caatgccgga gggctacgtg caagaacgca 300

ccatcttttt caaggacgac ggtaactata aaacccgcgc cgaggtgaaa tttgagggtg 360

acactttagt gaaccgcatt gaactgaagg gcatcgactt caaggaagac ggcaacattt 420

taggccataa attagaatac aattacaata gtcataatgt ttatattatg gccgataaac 480

agaaaaatgg tatcaaagtt aattttaaga tccgccataa cattgaagac ggtagcgtgc 540

agctggccga ccattatcag cagaataccc cgatcggtga tggtccggtg ttactgccgg 600

atgatcatta tttaagtacc cagagcgctt taagcaaaga cccgaatgag aaacgcgatc 660

acatggtgct gctggaattt gtgaccgccg ccggcattac cttaggcatg gatgagctgt 720

ataaataaaa gcttaac 737

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SoxR启动子上游引物

<400>

gaattcacta gtcaaactaa agcgcccttg t 31

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SoxR启动子下游引物

<400> 5

tctagatgca tgcttacggc tggtcaatat gctcgtc 37

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cda启动子上游引物

<400> 6

gaattcacta gtatctgcat gccaatgaat tctgccagtc gg 42

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cda启动子下游引物

<400> 7

tctagatgca tgggactagt ctcacgcatg caaacacctc tttg 44

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFP基因上游引物

<400> 8

tctagagcat gcaaggagaa ttacatggtg agcaagggcg agg 43

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> EGFP基因下游引物

<400> 9

aagcttggaa ttcatataaa cgcagaaagg cccacccgaa gg 42

Claims (10)

1.一种辐射生物剂量计，其特征在于：所述生物剂量计为大肠杆菌SoxR辐射生物剂量计或大肠杆菌Cda辐射生物剂量计；

所述SoxR辐射生物剂量计为在大肠杆菌基因序列中的SoxR启动子基因下游加入EGFP基因的基因工程菌；

所述SoxR辐射生物剂量计中携带目的基因的载体的核苷酸全序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.1；

所述Cda辐射生物剂量计为在所述SoxR辐射生物剂量计的基础上，用Cda启动子基因序列替代SoxR启动子基因序列得到的基因工程菌；

所述Cda辐射生物剂量计中携带目的基因的载体的核苷酸全序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.2；

所述辐射为γ射线辐射。

2.根据权利要求1所述的一种辐射生物剂量计，其特征在于：所述大肠杆菌为模板大肠杆菌MG1655或宿主大肠杆菌DH5α。

3.一种如权利要求1或2所述的一种辐射生物剂量计的制备方法，其特征在于：

(1)以大肠杆菌基因组为模板，采用PCR扩增目的基因SoxR启动子；以质粒pColD-CA23的基因组为模板，采用PCR扩增目的基因Cda启动子；以利用密码子简并性优化的含EGFP基因序列的PUC 19克隆质粒基因组为模板，所述优化的PUC 19克隆质粒基因组核苷酸序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.3，采用PCR扩增目的基因EGFP；将PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分离，获得所述目的基因片段DNA；

所述目的基因及对应引物如下表所示：

表目的基因及对应引物

(2)将目的基因SoxR启动子片段DNA用EcoRI和XbaI酶切，EGFP片段DNA用XbaI和HindIII酶切，将酶切后的SoxR启动子片段DNA用T4连接酶与酶切后的EGFP片段DNA连接，然后进行琼脂糖凝胶电泳分离，获得大小约1500bp的序列条带，用EcoRI和HindIII酶切，将酶切产物分别与相同用EcoRI和HindIII酶切后的PUC57表达载体用T4连接酶连接，获得所述SoxR辐射生物剂量计中携带目的基因的载体，其核苷酸全序列为核苷酸序列表中的SEQ IDNo.1；或将目的基因Cda启动子片段DNA用EcoRI和XbaI酶切，EGFP片段DNA用XbaI和HindIII酶切，将酶切后的Cda启动子片段DNA用T4连接酶与酶切后的EGFP片段DNA连接，然后进行琼脂糖凝胶电泳分离，获得大小约1500bp的序列条带，用EcoRI和HindIII酶切，将酶切产物分别与相同用EcoRI和HindIII酶切后的PUC57表达载体用T4连接酶连接，获得所述Cda辐射生物剂量计中携带目的基因的载体，其核苷酸全序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.2；

(3)将所述SoxR辐射生物剂量计中携带目的基因的载体转化进入大肠杆菌感受态细胞，筛选，验证正确，得到所述的SoxR辐射生物剂量计；或将所述Cda辐射生物剂量计中携带目的基因的载体转化进入大肠杆菌感受态细胞，筛选，验证正确，得到所述的Cda辐射生物剂量计。

4.根据权利要求3所述的一种辐射生物剂量计的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中：

以大肠杆菌MG1655基因组为模板，采用PCR扩增目的基因SoxR启动子；

步骤(3)中：

所述宿主细胞即大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌DH5α感受态细胞。

5.根据权利要求3所述的一种辐射生物剂量计的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中：

PCR反应扩增体系如下：

上游引物1μL、下游引物1μL、模板1μL、含高保真DNA聚合酶的PCR Mix10μL和无菌水7μL，总共为20μL的体系；

PCR反应条件为：

①：94℃变性3min，50℃复性30s，72℃延伸1min，

②：94℃变性30s，50℃复性30s，72℃延伸1min；

步骤②循环30次，然后4℃保温；

步骤(3)中：

转化及验证采用如下方法：

将大肠杆菌DH5α感受态细胞解冻后与所述携带目的基因的载体混合冰敷1h，然后42℃热激90s，继续冰敷2min～3min，加入800μL的LB液体培养基复苏1h，然后涂到具有氨苄抗性LB平板培养基上过夜；第二天选择具有氨苄抗性LB培养基平板上长出的单克隆接种于液体LB培养基，过夜培养后提取质粒，用EcoRI和Hind III酶切质粒进行验证，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，获得一条大小约1500bp的序列条带和一条大小约2600bp的序列条带，测序比对正确，说明所述辐射生物剂量计构建成功。

6.根据权利要求3所述的一种辐射生物剂量计的制备方法，其特征在于：步骤(1)中：以大肠杆菌MG1655基因组为模板，采用PCR扩增目的基因SoxR启动子；

PCR反应扩增体系如下：

上游引物1μL、下游引物1μL、模板1μL、含高保真DNA聚合酶的PCR Mix10μL和无菌水7μL，总共为20μL的体系；

PCR反应条件为：

①：94℃变性3min，50℃复性30s，72℃延伸1min，

②：94℃变性30s，50℃复性30s，72℃延伸1min；

步骤②循环30次，然后4℃保温；

步骤(3)中：所述宿主细胞即大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌DH5α感受态细胞；

转化及验证采用如下方法：

将大肠杆菌DH5α感受态细胞解冻后与所述携带目的基因的载体混合冰敷1h，然后42℃热激90s，继续冰敷2min～3min，加入800μL的LB液体培养基复苏1h，然后涂到具有氨苄抗性LB平板培养基上过夜；第二天选择具有氨苄抗性LB培养基平板上长出的单克隆接种于液体LB培养基，过夜培养后提取质粒，用EcoRI和Hind III酶切质粒进行验证，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，获得一条大小约1500bp的序列条带和一条大小约2600bp的序列条带，测序比对正确，说明所述辐射生物剂量计构建成功。

7.一种如权利要求1或2所述的辐射生物剂量计的应用，其特征在于：所述应用为在γ射线辐射剂量测定中的应用。

8.根据权利要求7所述的一种辐射生物剂量计的应用，其特征在于：应用步骤如下：

(1)将所述辐射生物剂量计在液体培养基进行辐射处理及辐射剂量测定；

(2)用荧光酶标仪进行荧光测量和拍照，以及测本底荧光表达情况；

(3)采用辐射处理所述辐射生物剂量计作为实验组，将未辐射处理所述辐射生物剂量计作为对照组；

(4)分别测量实验组和对照组的OD和荧光值：OD＝600，荧光测量激发光波长488nm，发射波波长520nm；

(5)计算ROD＝ODx/OD₀，ROD表示光密度比值，ODx表示实验组的光密度值，OD₀表示对照组的光密度值；

SFU＝绿色荧光强度/OD₆₀₀；IF＝SFU_实验/SFU_对照；SFU表示荧光单位；

(6)建立物理辐射剂量与所述辐射生物剂量计荧光强度值的量效关系，测定辐射剂量。

9.根据权利要求8所述的一种辐射生物剂量计的应用，其特征在于：

步骤(1)中：

将所述辐射生物剂量计在LB液体培养基中培养至OD＝0.4～0.5，此时处于对数生长期，进行辐射处理及辐射剂量测定；

步骤(2)中:

采用钴60源的γ射线照射处理对数生长期的所述辐射生物剂量计作为实验组，将未照射处理的对数生长期的所述辐射生物剂量计作为对照组。

10.一种辐射生物剂量计的应用，其特征在于：所述应用为在γ射线辐射剂量测定中的应用；

所述生物剂量计为大肠杆菌SoxR辐射生物剂量计或大肠杆菌Cda辐射生物剂量计；

所述SoxR辐射生物剂量计为在大肠杆菌基因序列中的SoxR启动子基因下游加入EGFP基因的基因工程菌；

所述Cda辐射生物剂量计为在所述SoxR辐射生物剂量计的基础上，用Cda启动子基因序列替代SoxR启动子基因序列得到的基因工程菌。

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