KR102201720B1 - 1,3-pdo 생성능을 가지고 3-hp 생성능이 저해된 재조합 코리네박테리움 및 이를 이용한 1,3-pdo의 제조방법 - Google Patents

1,3-pdo 생성능을 가지고 3-hp 생성능이 저해된 재조합 코리네박테리움 및 이를 이용한 1,3-pdo의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 1,3-PDO 생성능을 가지고 3-HP 생성능이 저해된 재조합 코리네박테리움 및 이를 이용한 1,3-PDO의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 변이 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용하면, 저가의 글리세롤을 탄소원으로 하여 부산물인 3-HP의 생산능이 억제되어 고효율로 1, 3-프로판디올을 생산할 수 있다.

Description

1,3-PDO 생성능을 가지고 3-HP 생성능이 저해된 재조합 코리네박테리움 및 이를 이용한 1,3-PDO의 제조방법{Recombinant Corynebacterium Producing 1,3-PDO and Inhibited 3-HP Production and Method for Preparing 1,3-PDO Using Thereof}
본 발명은 1,3-PDO 생성능을 가지고 3-HP 생성능이 저해된 재조합 코리네박테리움 및 이를 이용한 1,3-PDO의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 코리네박테리움 글루타미쿰에서, 글리세롤 퍼실리테이터(glycerol facilitator)를 코딩하는 유전자, 글리세롤 카이네이즈를 코딩하는 유전자, 글리세롤 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자, 글리세롤 리액티베이즈(glycerol reactivase)를 코딩하는 유전자 및 1,3-프로판디올 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 알데하이드 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자가 결실 또는 약화되어 있어, 3-HP 생산능이 결실 또는 약화되고, 글리세롤로부터 1, 3-프로판디올을 생성하는 변이 미생물 및 이를 이용한 이를 이용한 1,3-PDO의 제조방법에 관한 것이다.
1,3-프로판디올(1,3-propanediol, 1,3-PDO)은 폴리에테르, 폴리우레탄, polytrimethylene terephthalate (PTT)와 같은 고분자 합성의 단량체로 사용되는 화학물질이다. 1,3-PDO에 대한 기존의 생산방법은 주로 화학적인 합성방법이 사용되었으며, 아크로레인(acrolein)의 수화, 에틸렌 옥사이드를 포스핀(phosohine) 존재 하에서, 하이드로포밀레이션(hydroformylation)하거나, 글리세롤을 효소적으로 전환하는 방법 등이 사용되고 있다. 이러한 화학적인 생산방법은 고비용 및 환경유해 생산공정이 포함되어 있어 한계를 가지고 있다(Lee et al., Renewable and Sustainable Energy Reviews, 42(Supplement C): 963-972; 미국등록특허 8,236,994 B2).
생물학적인 방법으로는 미생물을 이용하여 1,3-PDO를 생산하는 방법으로, 주로 Klebsiella, Clostridia, Enterobacter, Citrobacter, Lactobacilli 등의 미생물을 사용하여 수행한다. 이들은 모두 글리세롤을 연속적인 두 대사회로를 거쳐 1,3-PDO로 바로 전환하며, 글리세롤 디하이드라타아제(glycerol dehydratase)로 글리세롤을 3-하이드록시프로피온알데히드(3-hydroxyproprionaldehyde, 3-HPA)로 전환한 후 1,3-PDO 옥시도리덕테이즈로 3-HPA를 1,3-PDO로 환원시키는 대사회로이다(도 1). 듀퐁 사는 상기 대사회로를 대장균에 도입하여 이미 1,3-PDO 상업화에 성공하였다. 그러나 1,3-PDO를 생합성하는 대장균을 포함한 상기 대부분의 미생물들은 포메이트, 아세테이트, 락테이트, 에탄올, 2,3-부탄디올 등 다양한 종류의 부산물이 같이 생산된다는 단점이 있다.
코리네박테리움 글루타미쿰은 그람양성의 통성 혐기성균으로 아미노산 생산 발효 공정에 널리 사용되고 있으며, 또한, 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용하여 다양한 종류의 화학물질, 연료 등을 생산하기 위하여, 포도당, 자일로스 등 다양한 종류의 탄소원을 섭취할 수 있도록 대사공학적으로 연구가 많이 진행되었지만 1,3-PDO를 생산하는 연구는 거의 없으며, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 포도당과 글리세롤을 탄소원으로 사용하여 포도당으로 세포성장을 도모하고 글리세롤로 1,3-PDO를 생산하여 글루타민산을 동시 생산하는 연구가 보고되고 있다 (Huang et al., Scientific Reports, 7: 42246, 2017).
그러나, 1,3-PDO 생합성 대사회로에 있어서 중간체인 3-hydroxypropionaldehyde (3-HPA)는 세포 내 축적시 독성(toxic effect)을 야기하고, 1,3-PDO의 부산물 중 하나인 3-hydroxypropionic acid (3-HP)의 전구체로 작용하기도 한다. 3-HP는 알데하이드 디하이드로게네이즈 효소에 의해 3-HPA에서 전환되며, 이는 이미 코리네박테리움 글루타미쿰 내에 Cupriavidus necator 유래의 알데하이드 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자 GabD4의 변이효소인 GabD4(E209Q/E269Q)를 과발현하여 3-HP를 생산한 연구에도 보고된 바 있다 (Chen et al., Metabolic Engineering, 39:151, 2017). 하지만 이는 외래효소의 과발현에 의한 효과로 아직 코리네박테리움 글루타미쿰 내 자연적으로 존재하는 알데하이드 디하이드로게네이즈 중 3-HPA를 특이적으로 기질로 받아들여 3-HP 생합성에 관여하는 유전자에 대한 보고는 존재하지 않는다.
이에, 본 발명자들은 생물학적인 경로를 통해 보다 효율적으로 1,3-PDO를 생산하고자 예의 노력한 결과, 1,3-PDO 생산능을 가지면서, 3-HP 생산능이 저해 또는 결실된 변이 코리네박테리움 글루타미쿰을 제작하기 위하여, 글리세롤 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자, 글리세롤 디하이드라테이즈를 코딩하는 유전자, 글리세롤 리액티베이즈(glycerol reactivase)를 코딩하는 유전자 및 1,3-프로판디올 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자를 도입하여, 1,3-PDO의 생산능을 부여하고 이와 동시에 코리네박테리움 글루타미쿰 내 존재하는 후보 알데하이드 디하이드로게네이즈 유전자들의 결실을 통해 3-HPA 생산능을 저해한 변이 코리네박테리움 글루타미쿰을 배양하는 경우, 3-HP 생성능이 억제되어, 1,3-PDO를 효율적으로 생산하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 3-HP 생성능이 억제되어, 1,3-PDO를 효율적으로 생산할 수 있는 변이 코리네박테리움 글루타미쿰을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 변이 코리네박테리움 글루타미쿰을 배양하는 것을 특징으로 하는 1,3-PDO의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰에서, (i) 글리세롤 퍼실리테이터(glycerol facilitator)를 코딩하는 유전자, (ii) 글리세롤 카이네이즈를 코딩하는 유전자, 글리세롤 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자, (iii) 글리세롤 리액티베이즈(glycerol reactivase)를 코딩하는 유전자 및 (iv) 1,3-프로판디올 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 알데하이드 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자가 결실 또는 약화되어 있어, 3-HP 생산능이 결실 또는 약화되고, 글리세롤로부터 1, 3-프로판디올을 생성하는 변이 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a)상기 변이 미생물을 글리세롤 함유 배지에서 배양하여 1,3-프로판디올을 생성시키는 단계; 및 (b)상기 생성된 1,3-프로판디올을 수득하는 단계를 포함하는 글리세롤로부터 1,3-프로판디올을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 변이 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용하면, 저가의 글리세롤을 탄소원으로 하여 부산물인 3-HP의 생산능이 억제되어 고효율로 1, 3-프로판디올을 생산할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 변이 코리네박테리움 글루타미쿰의 1,3-PDO 생합성 대사회로, 3-HP생합성 대사회로 및 글리세롤 분해 대사회로를 포함한 전체적인 대사회로 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 글리세롤 분해 대사회로를 코딩하는 glpF, glpK 및 glpD 유전자가 삽입된 pCSglpFKD 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
도 3은 13종의 aldehyde dehydrogenase 후보 중 NCgl0049 유전자를 결실하기 위해 제작한 pCG-9ts-ALD1 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
도 4는 3-HPA 생합성 대사회로 구축을 위해 glycerol dehydratase를 코딩하는 pduCDEGH 유전자 클러스터를 삽입하여 제조한 pEK-pdu 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
도 5는 1,3-PDO 생합성 대사회로 구축을 위해 대장균 1,3-PDO oxidoreductase를 코딩하는 yqhD유전자를 pEK-pdu 벡터에 삽입하여 제조한 pEK-pduyE 재조합 벡터를 나타낸 것이다.
도 6은 임의의 11종의 aldehyde dehydrogenase가 결실된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주들에 pCSglpFKD, pEK-pduyE 벡터를 도입하여 글리세롤을 단일 탄소원으로 활용할 시 3-HP 생산 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 임의의 11종의 aldehyde dehydrogenase가 결실된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주들에 pCSglpFKD 및 pEK-pduyE 벡터를 도입하여 글리세롤을 단일 탄소원으로 활용할 시 1,3-PDO 생산 결과를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 1,3-PDO 생산능을 갖는 변이 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용한 1,3-PDO 수율을 향상시키기 위하여, 상기 변이 코리네박테리움 글루타미쿰에서 1,3-PDO의 전구체인 3-HPA와 동일한 전구체로부터 전환되는 3-HP의 생산능을 저해하여, 1,3-PDO 생산이 증가한 변이 코리네박테리움 글루타미쿰을 제작하였다.
본 발명에서 상기 ,3-PDO 생산능을 갖는 변이 코리네박테리움 글루타미쿰은 자연적으로 1,3-PDO 생산능을 갖지 않는 코리네박테리움 글루타미쿰에 대하여 글리세롤 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자, 글리세롤 디하이드라테이즈(glycerol dehydrtase)를 코딩하는 유전자, 글리세롤 리액티베이즈(glycerol reactivase)를 코딩하는 유전자 및 1,3-프로판디올 옥시도리덕테이즈(1,3-PDO oxidoreductase)를 코딩하는 유전자를 도입하여, 1,3-PDO 생산능을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰을 제작하였다.
본 발명에서 있어, 상기 글리세롤 디하이드라테이즈(glycerol dehydrtase)를 코딩하는 유전자, 글리세롤 리액티베이즈(glycerol reactivase)를 코딩하는 유전자 및 1,3-프로판디올 옥시도리덕테이즈(1,3-PDO oxidoreductase)를 코딩하는 유전자는 Klebsiella pneumoniae 유래 pduCDEGH, 대장균 유래 yqhD를 사용하였으며, 코리네박테리움 글루타미쿰에 상기 유전자를 도입하여 1,3-PDO 생산능을 확인하였다.
본 발명에서 사용한 코리네박테리움 글루타미쿰은 자연적으로 글리세롤 확산은 가능한 미생물이지만 단일 탄소원으로 활용 시 세포성장이 가능하지 않기 때문에 글리세롤 퍼실리테이터(glycerol facilitator)를 코딩하는 유전자, 글리세롤 카이네이즈를 코딩하는 유전자 및 글리세롤 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자를 도입하여 글리세롤 탄소원에서 세포성장을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰을 제작하였다.
본 발명에서 있어서, 상기 글리세롤 퍼실리테이터를 코딩하는 유전자, 글리세롤 카이네이즈를 코딩하는 유전자 및 글리세롤 디하이드로게네이즈는 각각 대장균 유래 glpF, glpK, glpD 를 도입하였다.
본 발명에서 있어서 1,3-PDO 생합성 대사회로가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰은 1,3-PDO 이외에 3-HP(3-hydroxypropionic acid)를 주부산물로 생산하며, 3-HP는 1,3-PDO와 동일한 전구체인 3-HPA(3-hydroxypropionaldehyde)에서 알데하이드 디하이드로게나아제(aldehyde dehydrogenase) 효소에 의해 전환된다. 코리네박테리움 글루타미쿰 내에 존재하는 알데하이드 디하이드로게나아제들의 후보 효소들에 대하여 3-HPA에 특이적으로 높게 반응하는 효소를 규명하고 in vivo 배양을 통해 나타나는 효과를 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 코리네박테리움 글루타미쿰에서, (i) 글리세롤 퍼실리테이터(glycerol facilitator)를 코딩하는 유전자, (ii) 글리세롤 카이네이즈를 코딩하는 유전자, 글리세롤 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자, (iii) 글리세롤 리액티베이즈(glycerol reactivase)를 코딩하는 유전자 및 (iv) 1,3-프로판디올 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 알데하이드 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자가 결실 또는 약화되어 있어, 3-HP 생산능이 결실 또는 약화되고, 글리세롤로부터 1, 3-프로판디올을 생성하는 변이 미생물에 관한 것이다.
본 발명에서 3-HP 생산능이 저해되는 변이 코리네박테리움 글루타미쿰을 제공하는 데 있어서 관여하는 효소인 알데하이드 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 코리네박테리움 글루타미쿰 내에 존재하는 11종의 후보 유전자들로 이는 각각 NCgl0049, NCgl0157, Ncgl0437, NCgl0463, NCgl0521, NCgl0523, NCgl0900, NCgl2272, NCgl2578, NCgl2619, NCgl2698이다.
본 발명에서 3-HP 생합성 저해를 위해 선택한 상기 11종의 후보 유전자들의 결실을 통해 3-HP 생산 변화를 확인하고 1,3-PDO 생산능이 증가한 변이 코리네박테리움 글루타미쿰을 제조하였다.
본 발명에 있어서, 상기 알데하이트 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자 중 하나 이상의 유전자가 결실 또는 약화되어 있는 것을 특징으로 헐 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 글리세롤 퍼실리테이터(glycerol facilitator)를 코딩하는 유전자, 글리세롤 카이네이즈를 코딩하는 유전자 및 글리세롤 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자는 각각 glpF, glpK 및 glpD 인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 글리세롤 디하이드라테이즈를 코딩하는 유전자, 글리세롤 리액티베이즈(glycerol reactivase)를 코딩하는 유전자 및 1,3-프로판디올 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자는 각각 pduCDEG 및 yqhD 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 도입되는 유전자들은 tac, trc, 및 tuf로 구성된 군에서 선택되는 강한 프로모터에 의해 과발현되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "내재적 활성"이란, 본래 미생물이 변형되지 않은 상태에서 가지고 있는 효소의 활성 상태를 의미하고, "내재적 활성에 비해 강화되도록 변형"된다는 의미는 변형 전 상태의 효소 활성과 비교할 때 당해 활성이 신규로 도입되거나 더 향상된 것을 의미한다.
본 발명에서 "효소 활성의 강화"란, 효소 자체의 활성이 새로 도입되거나 증대되어 본래 기능 이상의 효과를 도출하는 것을 포함할 뿐만 아니라, 내재적 유전자 활성의 증가, 내부 또는 외부 요인으로부터 내재적 유전자 증폭, 상기 유전자 발현의 억제 조절 인자의 결실, 유전자 카피수 증가, 외부로부터의 유전자 도입, 발현조절 서열의 변형, 특히 프로모터 교체 또는 변형 및 유전자내 돌연변이에 의한 효소 활성의 증가 등에 의해 그 활성이 증가되는 것을 포함한다.
본 발명에서 "내재적 활성에 비하여 강화되도록 변형"되었다는 것은, 활성을 나타내는 유전자가 도입되거나 또는 당해 유전자의 카피수 증가, 상기 유전자 발현의 억제 조절 인자의 결실 또는 발현조절서열의 변형, 예를 들어 개량된 프로모터의 사용 등과 같은 조작이 이루어지기 전의 미생물이 가지는 활성에 비하여 조작이 이루어진 이후의 미생물이 가지고 있는 활성이 증가된 상태를 의미한다.
본 발명에서 "결실"이란 해당유전자의 일부 또는 전체염기를 변이, 치환 또는 삭제시키는 방법을 통해 해당유전자가 발현되지 않도록 하거나 발현되더라도 효소활성을 나타내지 못하도록 하는 것을 포괄하는 개념으로 해당 유전자의 효소가 관여하는 생합성 경로를 차단하는 모든 것을 포함한다.
본 발명에서 "과발현"이란 보통상태에서 세포내 해당유전자가 발현되는 수준보다 높은 수준의 발현을 일컫는 것으로써, 유전체 상에 존재하는 유전자의 프로모터를 강력한 프로모터로 치환하거나, 발현벡터에 해당유전자를 클로닝하여 세포에 형질전환시키는 방법을 통해 발현량을 증가시키는 것 등을 포함하는 개념이다.
본 발명에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환 되어야 한다. 본 발명에 있어서, 선호되는 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵 숙주세포는 E. coli DH5α, E. col JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli XL-1Blue(Stratagene), E. coli B, E. coli B21 등을 포함한다. 그러나 FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera)등이 또한 사용될 수 있다. 전술한 E. coli에 덧붙여, 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있다.
원핵세포의 형질전환은 Sambrook et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있으며, pET 계열 벡터(Novagen)를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 pET 계열 벡터를 사용하여 클로닝을 수행하면, 발현되는 단백질의 말단에 히스티딘기들이 결합되어 나오므로, 상기 단백질을 효과적으로 정제할 수 있다. 클로닝된 유전자로부터 발현된 단백질을 분리하기 위해서는 당업계에 공지된 일반적인 방법이 이용될 수 있으며, 구체적으로, Ni-NTA His-결합 레진(Novagen)을 사용하는 크로마토그래피 방법을 이용하여 분리할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 재조합벡터는 pET-SLTI66인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 숙주세포는 대장균 또는 아그로박테리움인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 "발현 조절 서열 (expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 이러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다. 본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어, Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 바이러스의 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 프로모터는 대장균에서 본 발명의 단백질을 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된(이종) DNA가 생성될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.
물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 본 발명에 따른 단백질의 cDNA를 클로닝하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로써, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
하기 실시예에서는 도입 대상 유전자로 특정 균주 유래의 유전자만을 예시하였으나, 도입되는 숙주세포에서 발현되어 동일한 활성을 나타내는 한 그 제한이 없다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.
실시예 1: 글리세롤을 단일 탄소원으로 성장가능한 변이 코리네박테리움 글루타미쿰의 제조를 위한 pCSglpFKD 벡터 제작
1-1:글리세롤 분해 대사회로 구축을 위한 pCSglpFKD 벡터 제작
코리네박테리움 글루타미쿰은 글리세롤을 단일 탄소원으로 사용하여 세포성장을 하지 못하는 것으로 알려져있다. 따라서 글리세롤 분해 대사회로를 구축하기 위해 먼저 대장균 W3110 유래의 글리세롤 분해 대사회로를 담당하는 효소를 코딩하는 유전자를 코리네박테리움 글루타미쿰 셔틀벡터인 pCES208s-H36-S3을 이용하여 발현시켰다.
대장균 W3110(ATCC 39936)의 염색체 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 및 2의 프라이머로 PCR을 수행하여 glycerol facilitator와 glycerol kinase operon 효소를 코딩하는 glpFK 유전자 절편을 수득하였고, 서열번호 3 및 4의 프라이머로 PCR을 수행하여, glycerol-3-phosphate dehydrogenase를 코딩하는 glpD 유전자 절편을 수득하였다. 상기 glpFK 유전자 절편과 상기 glpD 유전자 절편을 접합시키기 위하여 서열번호1 및 4의 프라이머로 오버랩핑 PCR을 수행하여 glpFKD 유전자 절편(서열번호 53)을 제작하였다. pCES208s-H36-S3 벡터(pCES208-H36 벡터(대한민국특허공개10-2013-0022691 또는 Yim SS,et al., Biotechnol Bioeng, 110:2959, 2013, 서열번호 54)의 Km 항생제를 Spectinomycin 항생제로 치환한 벡터, 서열번호 21)를 선형화시키기 위하여 서열번호 5 및 6의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였,고 상기 제조된 glpFKD 유전자 절편과 깁어셈블리(Gibson assembly) 방법을 이용하여 pCSglpFKD 벡터를 제작하였다(도 2).
pCSglpFKD 벡터 제작용 프라이머
서열번호 염기서열
서열번호 1 5'-TTGGTTGGTAGGAGTAGCATGGGATCCATGAGTCAAACATCAACCTT-3'
서열번호 2 5'-GTTTCCATCTATATCTCCTTTTATTCGTCGTGTTCTTCCC-3'
서열번호 3 5'-AAGGAGATATAGATGGAAACCAAAGATCTGAT-3′'
서열번호 4 5'-TAATTATAATGGCCGGCTGGGCCTCTAGAGTTACGACGCCAGCGATAACC-3′'
서열번호 5 5'-TCTAGAGGCCCAGCCGGCCATTATAATTAG-3'
서열번호 6 5'-GGATCCCATGCTACTCCTACCAACCAAGGT-3'
실시예 2: 3-HP 생합성 저해를 위한 aldehyde dehydrogenase 결실 벡터 제작
글리세롤로부터 1,3-PDO를 생산할 경우 생산되는 전구체인 3-HPA는 세포 내 존재하는 aldehyde dehydrogenase 효소에 의하여 3-HP로 전환된다. 하지만 코리네박테리움 글루타미쿰 내에 해당 전구체를 기질로 받아들이는 반응을 촉매하는 효소는 보고된 바 없다. 따라서 해당 반응을 매개하는 aldehyde dehydrogenase 효소를 규명하고 해당 효소를 코딩하는 유전자를 균주의 게놈 상에서 결실시켜, 3-HP 생합성 저해하기 위하여, 먼저 코리네박테리움 글루타미쿰 내에 존재하는 13종의 임의의 aldehyde dehydrogenase 효소를 선별하였다 (표 2).
이 후 해당 13종의 임의의 aldehyde dehydrogenase 효소를 코딩하는 유전자(서열번호 56~68)의 결실에 따른 3-HP 생합성 저해효과를 확인하기 위하여, 먼저 코리네박테리움 글루타미쿰에 pTacCC1-HrT 벡터가 형질전환된 균주를 제작하였다 (Cho et al., Metabolic Engineering, 42: 157-167, 2017). 이 후 상기 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 대하여 i) 12종의 유전자의 sgRNA 서열을 각각 포함하는 pCG9ts-series, ii) 13종의 유전자에 각각 결합하는 ssODN을 제작하여 코리네박테리움 글루타미쿰에 대한 유전자 결실을 시도하였다.
2-1: 13종의 유전자의 sgRNA 안내서열을 포함하는 pCG9ts-series벡터의 제조
우선 sgRNA의 안내 서열의 비특이적 표적을 분석하고 최적의 sgRNA 안내 서열을 제공해주는 온라인 프로그램 CRISPy-web(Blin et al., Synthetic and Systems Biotechnology, 1(2):118-121, 2016)을 이용하여, off-target effect가 낮은 최적의 안내 서열(guide sequence)을 다음과 같이 선별하였다(표 2).
CRISPy-web을 이용한 13종의 임의의 aldehyde dehydrogenase에 대한 sgRNA 안내서열
Guide sequence 타겟 유전자 sgRNA 안내서열 Sequence
서열번호 7 NCgl0049 TTCGTGGACTAAGAAACGGT
서열번호 8 NCgl0157 TGCAGGATTGTAGACAGGAG
서열번호 9 NCgl0248 TTCACCTCAGAGACGATTAG
서열번호 10 NCgl0437 TGTTTGCTAAAGAGTAGGAA
서열번호 11 NCgl0463 AACTCCCCGCGAAAGATCCG
서열번호 12 NCgl0521 TTCGGAGACACACACATGTA
서열번호 13 NCgl0523 CCAGTGACTTTAGAGCTAGG
서열번호 14 NCgl0900 CCAACTGATATCGTGCTGTA
서열번호 15 NCgl1526 GTCGCCAGTGTATGCGTGAA
서열번호 16 NCgl2272 GCGCAGCAAAGCTACGTTTC
서열번호 17 NCgl2578 ATCGTCGTAAGGATTGATAT
서열번호 18 NCgl2619 GAGGTTATAGCGCCATTTAC
서열번호 19 NCgl2698 CTTGCCAATCCGATTAGAGC
상기 sgRNA 안내서열(서열번호 7~19)을 포함하는 pCG9ts-series 벡터를 제조하기 위하여 pUC19-sgRNA벡터(대한민국특허출원 제2017-0042124호; Cho et al., Metabolic Engineering, 42: 157-167, 2017, 서열번호 55)를 주형으로 하고, 서열번호 20 및 23의 프라이머를 이용하여 NCgl0049 유전자를 표적으로 하며 sgRNA-T1/TE 서열(대한민국특허출원 제2017-0042124호; Cho et al., Metabolic Engineering, 42: 157-167, 2017)을 코딩하는 DNA 조각을 증폭하였다. 증폭한 DNA 조각을 서열번호 21 및 22의 프라이머로 PCR을 진행하여 다시 한번 증폭하였다. pEKts-Cas9 벡터((대한민국특허출원 제2017-0042124; Cho et al., Metabolic Engineering, 42: 157-167, 2017, 서열번호 66)를 StuI의 효소 처리한 후 상기 증폭된 절편과 Gibson assembly방법을 통해 최종적으로 Cas9 단백질과 함께 NCgl0049 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 발현하는 pCG9ts-ALD1 벡터를 제조하였다. 이 후 동일한 방법으로 각 13종의 임의의 효소를 코딩하는 유전자를 표적하는 절편을 제작하여 (서열번호 20, 21, 22는 동일. 각 유전자에 대해 서열번호 24~35 순서로 PCR 진행) pCG9ts- ALD2, pCG9ts-ALD3, pCG9ts-ALD4, pCG9ts-ALD5, pCG9ts-ALD6, pCG9ts-ALD7, pCG9ts-ALD8, pCG9ts-ALD9, pCG9ts-ALD10, pCG9ts-ALD11, pCG9ts-ALD12 및 pCG9ts-ALD13 벡터를 제작하였다.
sgRNA-T1/TE 조각을 증폭하기 위한 프라이머
서열번호 염기서열
서열번호 20 TATAGATATCCCGCGGTATATTAATTAATATAAACGCAGAAAGGCCC
서열번호 21 TGGATGATGGGGCGATTCAGGtatagatatcTTGACAATTAATCATCGGCT
서열번호 22 AAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGTATAGATATCCCGCGGTATA
pCG9ts-series 벡터들 제작용 프라이머 및 13종의 임의의 선별된 효소
서열번호 유전자 annotation 염기서열
서열번호 23 NCgl0049 SSADH ttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggTTCGTGGACTAAGAAACGGTgttttagagctagaaatagcaagt
서열번호 24 NCgl0157 mqo ttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggTGCAGGATTGTAGACAGGAGgttttagagctagaaatagcaagt
서열번호 25 NCgl0248 asd ttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggTTCACCTCAGAGACGATTAGgttttagagctagaaatagcaagt
서열번호 26 NCgl0437 ttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggTGTTTGCTAAAGAGTAGGAAgttttagagctagaaatagcaagt
서열번호 27 NCgl0463 SSADH ttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggAACTCCCCGCGAAAGATCCGgttttagagctagaaatagcaagt
서열번호 28 NCgl0521 ttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggTTCGGAGACACACACATGTAgttttagagctagaaatagcaagt
서열번호 29 NCgl0523 betB ttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggCCAGTGACTTTAGAGCTAGGgttttagagctagaaatagcaagt
서열번호 30 NCgl0900 gapB ttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggCCAACTGATATCGTGCTGTAgttttagagctagaaatagcaagt
서열번호 31 NCgl1526 gapA ttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggGTCGCCAGTGTATGCGTGAAgttttagagctagaaatagcaagt
서열번호 32 NCgl2272 proA ttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggGCGCAGCAAAGCTACGTTTCgttttagagctagaaatagcaagt
서열번호 33 NCgl2578 vdh ttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggATCGTCGTAAGGATTGATATgttttagagctagaaatagcaagt
서열번호 34 NCgl2619 gabD2/ssadh ttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggGAGGTTATAGCGCCATTTACgttttagagctagaaatagcaagt
서열번호 35 NCgl2698 ald ttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggCTTGCCAATCCGATTAGAGCgttttagagctagaaatagcaagt
2-2: 13종의 유전자에 각각 결합하는 ssODN 제조
13종의 임의의 타겟 유전자들을 결실시키기 위한 ssODN은 sgRNA의 안내서열이 결합하는 위치가 ssODN의 두 결합 서열 사이 구간에 위치하도록 선정하여, 그 길이가 총 80 nucleotide가 되도록 디자인하였다 (표 5). 이 때 ssODN은 5'-homology arm 및 3'-homology arm으로 구성되며, 각 homology arm은 40 base pair로, sgRNA의 안내서열과 상보적인 서열을 포함하는 타겟 유전자 영역의 양 말단 바깥쪽에 결합할 수 있도록 디자인하였다. ssODN이 타겟과 결합하면, loop 구조가 형성되며, 이 부위가 결실되는 영역이 된다, 상기 결실 영역의 길이는 PCR을 통해 표적 유전자 결실 여부를 손쉽게 파악할 수 있도록 100 base pair가 되도록 디자인하였다.
13 종의 임의의 aldehyde dehydrogenase 유전자에 결합하는 ssODN 서열
서열번호 염기서열
서열번호 36 ggtgccatgggtgccaaaatgcgcaacatcggcgaagcttcgacgaaggcgtcaccgtgggccccctggttgaggaaaaa
서열번호 37 actggattgacggcgcgatttccccatccacttccggcaagctgctaagacgtggggcaacctgtctatcgctaagcgcc
서열번호 38 gactgttgtggataactcttctgcttggcgcaaggacgaccagtgctgaagccacttcacgatgccgctggtcttgtaaa
서열번호 39 gtcggtagctttcaaaagctcgcttcgccgatgttgtggccactcgccatcaatcagtgaacacccatgcagtgcggttg
서열번호 40 ccacgattccacccagtggatgtccgcgctctctgatgcacagagatcatccacctggaagctggaaaatccgttgcaga
서열번호 41 gtaaccaccttgcttcgggtatagaagttgaaagactcaggacttcgatgtccatctgaaattctcgagctgtacggcca
서열번호 42 gtcgagagtactgacatgtctgcatcaggaaggataatcgcttgtctactccggggtggcggacaagggcatcaccgaaa
서열번호 43 cttcgaagaatccgaaagcaccgacctgcgtgccttcctgtcctggtttcccgcgaggcactgtatgacggtgctcgtct
서열번호 44 aacgatgttgactgctgctgcacgtgcacgacgcaggtcgttggtgcgaggcagttggtggtgcaagatgcgccggagat
서열번호 45 ctgcaggatttccacgagcttggtgttggaatgcacagctcgcccaaaggcacacggacctgcttcatctgaatgccgtt
서열번호 46 ggcatcaacatcagcaatggaagcttgtttgctttcggcgcaaatgttgcagtcacaaggtctcctaaagttgattgtgg
서열번호 47 cccttgaaagtgcaaaagcatgctcgacgtcttgctcatcatgaagttctttaggcagcggacctaaaggaagacgtttg
서열번호 48 ggaatgatcttgtcggatgcagcgcggttgatcagcttgcgccctctgggatgagatcgccgatgatgttaatcagatac
실시예 3: 3-HP 생산능이 저해되고 1,3-PDO 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰의 제조 및 확인
3-1: 3-HP 생산능이 저해된 코리네박테리움 글루타미쿰 제조
3-HP 생합성에 관여하리라 생각되는 임의의 13종의 aldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자를 게놈 상에서 결실시키기 위하여 실시예 2-1과 2-2에서 제작된 pCG9ts-ALD 벡터들과 ssODN을 각각 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰(ATCC 13032)에 형질전환하였다. 이 후 형질전환된 변이 코리네박테리움 글루타미쿰 균주들에 대하여 pTacCC1-HrT 벡터(대한민국특허출원 제2017-0042124호; Cho et al., Metabolic Engineering, 42: 157-167, 201, 서열번호 57)와 pCG9ts-ALD 벡터들을 37℃ BHI plate에서 curing 작업을 통해 제거하였다. 이 과정을 통해 제작된 균주들은 표 6에 보이는 바와 같다. 그러나 WAH3 균주와 WAH9 균주는 제작이 되지 않았는데 해당 두 유전자는 세포 생존에 필요한 필수유전자라 판단된다.
각 11종의 임의의 aldehyde dehydrogenase가 결실된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주
균주명 genotype
WT C. glutamicum ATCC 13032
WAH1 WT NCgl0049
WAH2 WT NCgl0157
WAH4 WT NCgl0437
WAH5 WT NCgl0463
WAH6 WT NCgl0521
WAH7 WT NCgl0523
WAH8 WT NCgl0900
WAH10 WT NCgl2272
WAH11 WT NCgl2578
WAH12 WT NCgl2619
WAH13 WT NCgl2698
3-2: 1,3-PDO 생합성 대사회로 구축을 위한 pEK-pduyE 벡터 제작
1,3-PDO 생합성 대사회로를 구축하기 위하여, 코리네박테리움 글루타미쿰의 pEKEx1 셔틀벡터(Eikmanns et al., Gene 102: 93, 1991, 서열번호 58)를 이용하여 클렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae) DSMZ2026(KCTC 4952)와 대장균 W3110 유래의 외래효소를 발현시켰다
먼저, 클렙시엘라 뉴모니에 DSMZ2026 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고 서열번호 49 및 50의 프라이머로 PCR을 수행하여 glycerol dehydratase와 glycerol reactivase를 코딩하는 pduCDEGH 유전자 클러스터 절편(서열번호 59)을 수득하였다. 상기 수득한 pduCDEGH 유전자 절편을 셔틀벡터 pEKEx1벡터에 접합시키기 위하여 제한효소 EcoRI과 PstI로 처리한 후, Gibson assembly로 접합시켜 pEK-pdu 벡터(도 4)를 제작하였다.
그 후 pTac15kyqhD 재조합 벡터(pTac15k 벡터(p15A origin, tac promoter, KmR)에 E. coli W3110 유래 yqhD 가 삽입되어 있는 재조합 벡터, 서열번호 60)를 주형으로 하여, 서열번호 51 및 52의 프라이머로 PCR을 수행하여 1,3-PDO oxidoreductase를 코딩하는 yqhD 유전자 절편을 수득하였다.
상기 수득한 유전자 절편을 pEK-pdu 벡터에 접합시키기 위해 제한효소 DraI을 처리하였고 깁슨어셈블리로 접합시켜 pEK-pduyE 벡터(도 5)를 제작하였다.
pEK-pduyE벡터를 제작하기 위한 프라이머
서열번호 염기서열
서열번호 49 5'-ACAATTTCACACAGGAAACAGAATTCATGAGATCGAAAAGATTTGAAG-3'
서열번호 50 5'-AAAACAGCCAAGCTTGGCTGCAGTTAAGCATGGCGATCCCGAAATG-3′'
서열번호 51 5'-TTCCAATGATGAGCACTTTTTTGACAATTAAT-3'
서열번호 52 5'-GCGCCACATAGCAGAACTTTTTAGCGGGCGGCTTCGTATATAC-3'
3-3: in vivo 배양을 통한 3-HP 생산능 저해 및 1,3-PDO 생산능 향상 확인
실시예 3-1에 제작된 각각의 균주들에 글리세롤 분해 대사회로 구축을 위한 pCSglpFKD 벡터와 1,3-PDO 생합성 대사회로 구축을 위한 pEK-pduyE 를 함께 형질전환하였다. 이 후 25 μg/L 카나마이신 (Kanamycin) 및 200 μg/L 스펙티노마이신 (Spectinomycin)이 첨가된 BHIS 평판배지(조성은 37 g/L Brain Heart Infusion (BHI), 91 g/L sorbitol, 15 g/L agar)에서 선별하였다. 상기 형질전환된 11종의 변이미생물들을 10 mL BHIS 배지(조성은 37 g/L Brain Heart Infusion (BHI), 91 g/L sorbitol )가 포함된 test tube 접종하여 30℃에서 16시간 동안 전배양을 수행한 후, 전배양한 배양액 1 mL를 250 mL 배플 플라스크에 25mL 의 CGXII 배지(표8)에 접종하여 배양하였다. 초기 글리세롤 농도는 40g/L로 설정하였고 배지 내 yeast extract 10 g/L를 추가하였으며 3배수 플라스크 배양을 48시간 진행하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 배양에 사용된 CGXII 배지 조성
CGXII-glycerol 배지의 성분 농도
CaCl2·2H2O 13 mg/L
FeSO4·7H2O 10 mg/L
MnSO4·5H2O 14 mg/L
ZnSO4·7H2O 1 mg/L
CuSO4·5H2O 300 μg/L
NiCl2·6H2O 20 μg/L
(NH4)2SO4 20 g/L
Urea 2 g/L
KH2PO4 1 g/L
K2HPO4 1 g/L
Biotin 200 μg/L
Thiamine 500 μg/L
Protocatechuic Acid 30 mg/L
MOPS 42 g/L
Glycerol 40g/L
Spectinomycin 200 μg/L
3-HP 농도 측정을 위해 사용한 HPLC 조건은 다음과 같다. 먼저 Agilent 1100 series HPLC 기기를 사용하였으며 detector와 칼럼으로 DAD detector, agilent MetaCarb 87H column, UV 210nm (another detector)을 이용하였으며 이 때 버퍼로는 0.1% H3PO4를 40ㅀC 조건하에 flow rate 0.5 mL/min로 흘러주어 측정하였다. 다음으로 1.3-PDO 측정을 위하여 Waters 1515 high performance liquid chromatography(Waters 1 Co., Milford, MA, USA)를 사용하였고 이 때 dectector와 칼럼은 Waters 2414 refractive index detectors와 A MetaCarb 87H column (300 by 7.8 mm; Agilent)을 이용하였다. 이 때 버퍼로는 0.01 N H2SO4를 35ㅀC 조건하에 flow rate 4 of 0.5 mL/min로 흘려주어 측정하였다.
그 결과, 도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, WAH13 균주 내에 pCSglpFKD 벡터와 pEK-pduyE 벡터가 형질전환된 균주에서 3-HP 생산이 가장 크게 저해되고 그에 따라 1,3-PDO 생산량이 가장 크게 증가하는 것을 확인하였다. 또한 WAH1, WAH2, WAH5, WAH6, 및 WAH7 도 함께 3-HP 생산이 저해되고 1,3-PDO 생산량이 증가함을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Hanwha Chemical Co., Ltd. Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Recombinant Corynebacterium Producing 1,3-PDO and Inhibited 3-HP Production and Method for Preparing 1,3-PDO Using Thereof <130> P18-B020 <160> 68 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ttggttggta ggagtagcat gggatccatg agtcaaacat caacctt 47 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gtttccatct atatctcctt ttattcgtcg tgttcttccc 40 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aaggagatat agatggaaac caaagatctg at 32 <210> 4 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 taattataat ggccggctgg gcctctagag ttacgacgcc agcgataacc 50 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tctagaggcc cagccggcca ttataattag 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggatcccatg ctactcctac caaccaaggt 30 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA <400> 7 ttcgtggact aagaaacggt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA <400> 8 tgcaggattg tagacaggag 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA <400> 9 ttcacctcag agacgattag 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA <400> 10 tgtttgctaa agagtaggaa 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA <400> 11 aactccccgc gaaagatccg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA <400> 12 ttcggagaca cacacatgta 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA <400> 13 ccagtgactt tagagctagg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA <400> 14 ccaactgata tcgtgctgta 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA <400> 15 gtcgccagtg tatgcgtgaa 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA <400> 16 gcgcagcaaa gctacgtttc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA <400> 17 atcgtcgtaa ggattgatat 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA <400> 18 gaggttatag cgccatttac 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA <400> 19 cttgccaatc cgattagagc 20 <210> 20 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for sgRNA-T1/TE fragment <400> 20 tatagatatc ccgcggtata ttaattaata taaacgcaga aaggccc 47 <210> 21 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for sgRNA-T1/TE fragment <400> 21 tggatgatgg ggcgattcag gtatagatat cttgacaatt aatcatcggc t 51 <210> 22 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for sgRNA-T1/TE fragment <400> 22 aaggtgttgc tgactcatac caggtataga tatcccgcgg tata 44 <210> 23 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for pCG9ts-series vector preparation <400> 23 ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt 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preparation <400> 28 ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggttcgga gacacacaca tgtagtttta 60 gagctagaaa tagcaagt 78 <210> 29 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for pCG9ts-series vector preparation <400> 29 ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggccagtg actttagagc tagggtttta 60 gagctagaaa tagcaagt 78 <210> 30 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for pCG9ts-series vector preparation <400> 30 ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggccaact gatatcgtgc tgtagtttta 60 gagctagaaa tagcaagt 78 <210> 31 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for pCG9ts-series vector preparation <400> 31 ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtgggtcgcc agtgtatgcg tgaagtttta 60 gagctagaaa tagcaagt 78 <210> 32 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for pCG9ts-series vector preparation <400> 32 ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtgggcgcag caaagctacg tttcgtttta 60 gagctagaaa tagcaagt 78 <210> 33 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for pCG9ts-series vector preparation <400> 33 ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggatcgtc gtaaggattg atatgtttta 60 gagctagaaa tagcaagt 78 <210> 34 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for pCG9ts-series vector preparation <400> 34 ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtgggaggtt atagcgccat ttacgtttta 60 gagctagaaa tagcaagt 78 <210> 35 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for pCG9ts-series vector preparation <400> 35 ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggcttgcc aatccgatta gagcgtttta 60 gagctagaaa tagcaagt 78 <210> 36 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODN sequence <400> 36 ggtgccatgg gtgccaaaat gcgcaacatc ggcgaagctt cgacgaaggc gtcaccgtgg 60 gccccctggt tgaggaaaaa 80 <210> 37 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODN sequence <400> 37 actggattga cggcgcgatt tccccatcca cttccggcaa gctgctaaga cgtggggcaa 60 cctgtctatc gctaagcgcc 80 <210> 38 <211> 80 <212> DNA <213> 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cctcgcacca 480 atggcaaagg tcctaaacga caagttcggc atcgagaacg gcctcatgac caccgttcac 540 gcatacactg gcgaccagcg cctgcacgat gcacctcacc gcgacctgcg tcgtgcacgt 600 gcagcagcag tcaacatcgt tcctacctcc accggtgcag ctaaggctgt tgctctggtt 660 ctcccagagc tcaagggcaa gcttgacggc tacgcacttc gcgttccagt tatcaccggt 720 tccgcaaccg acctgacctt caacaccaag tctgaggtca ccgttgagtc catcaacgct 780 gcaatcaagg aagctgcagt cggcgagttc ggcgagaccc tggcttactc cgaagagcca 840 ctggtttcca ccgacatcgt ccacgattcc cacggctcca tcttcgacgc tggcctgacc 900 aaggtctccg gcaacaccgt caaggttgtt tcctggtacg acaacgagtg gggctacacc 960 tgccagctcc tgcgtctgac cgagctcgta gcttccaagc tctaa 1005 <210> 65 <211> 1299 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl2272 <400> 65 atgagttcaa cgaccctaac tgatgaccaa attcgcgaca atgagcggac cgaagttcta 60 gctaaagcaa ctgcagctaa gaacatcgtc ccggatattg cagtgttggg caccggaccg 120 aagaacgcaa tcctgcgtgc ggcggcagat gaactcgttg cacgcagcgc agaaatcatc 180 gaagccaacg cttccgatat cgaagcgggt cgcgcaaacg gcatggaaga atccatgatt 240 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aatgggtgag cgtttggtgg gtttctctgc ggaattaggc 780 ggaaagaacc ctcttattgt ggccaaggat gcagatctgg acaaggtgga agctgagctt 840 ccgcaggcgt gtttttccaa ctcggggcaa ttgtgtgtct ccactgaacg tatttatgtc 900 gaggaagacg tgtacgagga ggtgattgca cggtttagca aggcggcgaa agccatgtcc 960 attggtgccg gatttgagtg gaaatatgag atgggttcgt tgatcaatca ggcgcagctg 1020 gatcgggtga gcacctttgt tgatcaggct aaagctgcgg gcgccacggt gctgtgcggt 1080 ggcaagtcac gccctgatat tggtcccttc ttctatgagc ccacggtatt ggcggatgtc 1140 ccagagggca ccccactgct cacggaggaa gtcttcgggc cggtggtgtt catcgaaaag 1200 gtagccacac tggaagaagc cgtcgataag gcaaatggca cgccctacgg cctgaatgcg 1260 tccgtctttg ggtcgtcgga aaccggcaat cttgttgcag gccagctgga agctggcggt 1320 atcggtatta atgatggcta cgccgcgacg tgggcgagcg tgtccacgcc tctgggtggc 1380 atgaagcagt cggggctggg gcaccgccat ggtgcggagg gaattacaaa atatgcggag 1440 atccgaaaca tcgcggagca gcgctggatg tctatgcgtg ggccggccaa aatgccgcga 1500 aaggtgtact cagacaccgt ggccacagcg ctaaagctgg gcaaaatctt taaagttttg 1560 ccgtag 1566 <210> 68 <211> 1521 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl2698 <400> 68 atgactgtct acgcaaatcc aggaaccgaa ggctcgatcg ttaactatga aaagcgctac 60 gagaactaca ttggtggcaa gtgggttcca ccggtagagg gccagtacct tgagaacatt 120 tcacctgtca ctggtgaagt tttctgtgag gtcgcacgtg gcaccgcagc ggacgtggag 180 cttgcactgg atgctgcaca tgcagccgct gatgcgtggg gcaagacttc tgtcgctgaa 240 cgtgctctga tcctgcaccg cattgcggac cgcatggaag agcacctgga agaaatcgca 300 gttgcagaaa cctgggagaa cggcaaggca gtccgtgaga ctcttgctgc agatatccca 360 ctggcaatcg accacttccg ctactttgct ggcgcgatcc gtgctcagga agatcgttcc 420 tcacagatcg accacaacac tgttgcttac cacttcaacg agccaatcgg tgttgttggt 480 cagatcattc cttggaactt cccaatcctc atggctacct ggaagctcgc accggcactt 540 gctgcaggta acgcgatcgt catgaagcca gctgagcaga ccccagcatc cattttgtat 600 ctgattaaca tcatcggcga tctcatccca gagggcgtcc tcaacatcgt caacggactc 660 ggcggtgaag caggcgctgc actgtccggc tctaatcgga ttggcaagat tgctttcacc 720 ggttccaccg aggtcggcaa gctgatcaac cgcgctgcat ccgacaagat cattcctgtc 780 accctggagc tcggcggtaa gtccccatcc atcttcttct ccgatgttct gtcacaggat 840 gacgccttcg cagagaaggc agttgaaggc ttcgcgatgt tcgccctcaa tcagggtgaa 900 gtttgtacct gtccttcccg tgcacttgtt catgagtcca tcgctgatga attcctcgag 960 cttggcgtga agcgagttca gaacatcaag ctgggtaacc cacttgatac tgaaaccatg 1020 atgggtgctc aggcgtccca ggagcagatg gacaagatct cctcctacct gaagatcggc 1080 ccagaagaag gcgctcaaac cctcactggt ggcaaggtca acaaggttga tggcatggag 1140 aacggttact acattgagcc aaccgttttc cgcggcacca acgacatgag gatcttccgc 1200 gaggaaatct tcggaccagt cctttctgtt gctaccttca gcgacttcga tgaggccatc 1260 cgtattgcaa acgacaccaa ctacggcctc ggcgctggtg tctggagccg tgaccaaaac 1320 accatttatc gtgcaggtcg cgcaatccag gctggtcgag tttgggtcaa ccagtaccac 1380 aactacccag cgcactccgc tttcggtgga tacaaggagt ccggcatcgg ccgtgagaac 1440 cacctcatga tgctgaacca ctaccagcag accaagaacc tgttggtctc ctacgatcca 1500 aacccaaccg gactgttctg a 1521

Claims (6)

  1. 코리네박테리움 글루타미쿰에서, (i) 글리세롤 퍼실리테이터(glycerol facilitator)를 코딩하는 유전자, (ii) 글리세롤 카이네이즈를 코딩하는 유전자, 글리세롤-3-인산 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자, (iii) 글리세롤 디하이드라테이즈(glycerol dehydratase)를 코딩하는 유전자, (iv) 글리세롤 리액티베이즈(glycerol reactivase)를 코딩하는 유전자 및 (v) 1,3-프로판디올 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 알데하이드 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자가 결실 또는 약화되어 있어, 3-HP 생산능이 결실 또는 약화되고, 글리세롤로부터 1, 3-프로판디올을 생성하는 변이 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 알데하이드 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자는 NCgl0049, NCgl0157, Ncgl0437, NCgl0463, NCgl0521, NCgl0523, NCgl0900, NCgl2272, NCgl2578, NCgl2619 또는 NCgl2698 인 것을 특징으로 하는 변이 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 글리세롤 퍼실리테이터(glycerol facilitator)를 코딩하는 유전자, 글리세롤 카이네이즈를 코딩하는 유전자 및 글리세롤 디하이드로게네이즈를 코딩하는 유전자는 각각 glpF, glpK 및 glpD 인 것을 특징으로 하는 변이 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 글리세롤 디하이드라테이즈를 코딩하는 유전자 및 글리세롤 리액티베이즈(glycerol reactivase)를 코딩하는 유전자는 pduCDEGH 클로스터이고, 1,3-프로판디올 옥시도리덕테이즈를 코딩하는 유전자는 yqhD 인 것을 특징으로 하는 변이 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 도입되는 유전자들은 tac, trc, 및 tuf로 구성된 군에서 선택되는 강한 프로모터에 의해 과발현되는 것을 특징으로 하는 변이 미생물.
  6. 다음 단계를 포함하는 글리세롤로부터 1,3-프로판디올을 제조하는 방법:
    (a)제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 변이 미생물을 글리세롤 함유 배지에서 배양하여 1,3-프로판디올을 생성시키는 단계; 및
    (b)상기 생성된 1,3-프로판디올을 수득하는 단계.
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Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2015, 20권, 페이지 834-843
Scientific Reports, 2017, 7권, Article No. 42246, 페이지 1-10

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