KR101562866B1

KR101562866B1 - 2,3-부탄다이올 생산용 균주 및 이를 이용한 2,3-부탄다이올의 생산방법

Info

Publication number: KR101562866B1
Application number: KR1020130104491A
Authority: KR
Inventors: 엄영순; 조숙형; 이진원; 공경택
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2013-08-30
Filing date: 2013-08-30
Publication date: 2015-10-27
Also published as: KR20150027370A

Abstract

본 발명은 크렙시엘라 옥시토카 M1(Klebsiella oxytoca M1, KCCM11177P) 균주를 유전자 조작하여 2,3-부탄다이올(2,3-butanediol)의 생산수율이 증가하는 2,3-부탄다이올의 생산방법 또는 상기 유전자 조작된 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주의 배양조건을 조절하여 아세토인과 같은 부산물들의 생산이 감소하고 2,3-부탄다이올의 생산이 증가하는 2,3-부탄다이올의 생산방법을 제공한다.

Description

2,3-부탄다이올 생산용 균주 및 이를 이용한 2,3-부탄다이올의 생산방법{Strain for manufacturing of 2,3-butanediol and method for producing 2,3-butanediol using the same}

본 발명은 2,3-부탄다이올 생산용 균주 및 2,3-부탄다이올 생산성을 향상시키고 부산물의 생산은 감소시키는 2,3-부탄다이올의 신규한 제조방법에 관한 것이다.

최근까지 대부분의 연료와 정제 화학 제품은 석유와 천연가스 기반으로 생산되어왔다. 하지만 석유고갈과 지구온난화와 같은 환경문제들이 대두되면서 바이오 화학산업을 기반으로 한 대체 에너지 생산에 관심이 높아지고 있다. 따라서 이러한 대체 에너지로서 바이오 연료에 대한 연구개발이 이루어져 왔다.

그 중 2,3-부탄다이올은 광범위하게 산업적으로 이용되고 있는데, 프린트 잉크, 화장품, 합성수지를 합성을 위한 용매제 등 다양한 제조 산업에서 이용되고 있다. 또한 생물학적으로 생산된 2,3-부탄다이올은 탈수과정을 통해 메틸에틸케톤(용매제)과 1,3-부타디엔(합성고무 생산에 사용) 등 유용한 물질로 변환이 가능하다는 장점이 있다.

2,3-부탄다이올은 에어로박터 에어로제네스(Aerobacter aerogenes), 크렙시엘라 유모니아(Klebsiella pneumonia), 크렙시엘라 옥시티카(Klebsiella oxytoca), 바실러스 폴리믹사(Bacillus polymyxa) 등과 같은 미생물로부터 생산되고, 이들 미생물은 글루코오스로부터 혼합유기산 발효를 통해 2,3-부탄다이올을 생산한다. 발효 과정에서 부산물로 아세토인, 에탄올, 락테이트, 아세테이트 등이 생성되는데, 2,3-부탄다이올의 생산을 높이기 위해서는 대사과정에서 부산물의 생산을 줄이고 글루코오스와 같은 기질로부터 빠른 시간에 최대의 해당 물질을 만들 수 있도록 대사공학적 접근이 필요하다.

공개특허공보 제10-2012-96755호

본 발명은 2,3-부탄다이올(2,3-butanediol)을 생산하는 크렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca) 재조합 균주를 제공하고자 한다. 또한, 아세토인을 비롯한 부산물의 생산을 감소시키고 2,3-부탄다이올(2,3-butanediol)의 수율을 증진시키는 2,3-부탄다이올의 생산방법을 제공하고자 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예는 크렙시엘라 옥시토카 M1(Klebsiella oxytoca M1, KCCM11177P)의 재조합 균주 및 이를 사용하는 2,3-부탄다이올(2,3-butanediol)의 수율이 증가하는 2,3-부탄다이올의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 다른 일 실시예는 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 배양조건을 조절하여 2,3-부탄다이올의 수율이 증가하는 2,3-부탄다이올의 생산방법을 제공한다.

본 발명에 따른 제조방법을 이용하면, 2,3-부탄다이올의 생산에 사용되는 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 아세토인 환원효소(acetoin reductase)를 과발현시킴으로써 발효 과정에서 생산되는 아세토인과 같은 부산물의 생산을 감소시킬 수 있다. 이로써 2,3-부탄다이올의 수율을 증가시킬 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 제조방법을 이용하면 2,3-부탄다이올의 생산에 사용되는 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 배양조건을 조절함으로써 2,3-부탄다이올의 생산을 증가시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터(pUC18CM)의 제작도표를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조한 재조합 벡터를 EcoRI에 처리하여 나타낸 도이다.
도 3은 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주를 교반속도 200 rpm의 배양조건하에서 배양함에 따른 생산물(M1 Products)을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주를 교반속도 400 rpm의 배양조건하에서 배양함에 따른 생산물(M1 Products)을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 온도별 주요 생산물을 나타낸 도이다.
도 6은 비교 균주 크렙시엘라 옥시토카 KCTC1686의 온도별 주요 생산물을 나타낸 도이다.
도 7은 다양한 pH 조건(5, 6, 7) 과 온도(30℃, 37℃)에서의 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주와 크렙시엘라 옥시토카 KCTC1686의 아세토인 환원효소 활성(AR activity)을 비교하여 나타낸 도이다.
도 8은 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주를 30℃, 37℃에서 각각 배양 시 시간에 따른 (a)아세토인 환원효소 활성(acetoin reductase activity)과 (b)budC 유전자 전사율을 비교하여 나타낸 도이다.
도 9는 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주(pUC18CM)와 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주(pUC18CN-budC)의 MES 첨가 여부에 따른 배양시간에 따른 pH 변화(a) 및 2,3-부탄다이올, 아세토인 생산량(b)을 비교하여 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 크렙시엘라 옥시토카 M1재조합 균주를 배양하면서 시간에 따라 생산되는 배양액 내의 2,3-부탄다이올(2,3-BD), 그 외 아세토인(acetoin), 에탄올(EtOH), 아세트산(acetic acid), 석시네이트(succinate), 젖산(lactate)의 농도를 각각 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 크렙시엘라 옥시토카 M1재조합 균주(M1 budC overexpression)와 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주(M1 wild type)의 2,3-부탄다이올(2,3-BDO) 생산수율(yield)을 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 크렙시엘라 옥시토카 M1재조합 균주(M1 budC overexpression)와 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주(M1 wild type)의 2,3-부탄다이올(2,3-BDO) 생산성(productivity)을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 2,3-부탄다이올 대사와 관련된 유전자로서 크렙시엘라 옥시토카 M1(Klebsiella oxytoca M1, KCCM11177P, 서열번호 1) 균주를 사용하여 부산물의 생산을 줄이고 2,3-부탄다이올의 생산율을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다.

2,3-부탄다이올은 용매, 부동액(anti-freeze solution), 가소제(plasticizer)의 합성에 이용되는 화학물질로서, 화학적인 전환을 통해 합성고무 제조에 사용되는 부타디엔(1,3-butadiene), 액체연료 첨가제(liquid fuel additive)인 MEK(methyl ethyl ketone), 식품 첨가제 향료로써 사용되는 아세토인(acetoin)과 디아세틸(diacetyl), 폴리우레탄의 전구체 등의 생산이 가능하다. 2,3-부탄다이올은 생물학적 방법으로 생산이 가능하며, 구체적으로 혼합산 발효(mixed acid fermentation) 대사경로를 통해 생산되고, 균주와 탄소원에 따라서 다양한 생산 양산을 보여준다. 글루코오스를 탄소원으로 이용하는 경우에는 피루베이트(pyruvate)와 아세토인(acetoin)을 거쳐 2,3-부탄다이올이 생산되거나 디아세틸(diacetyl)을 거치는 부탄다이올 사이클을 통해 2,3-부탄다이올이 생산되는 선택적 경로를 갖고 있다.

이에 본 발명의 일 실시예는 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 아세토인 환원효소(acetoin reductase)를 과발현시킴으로써, 2,3-부탄다이올(2,3-butanediol)의 수율이 증가하는 2,3-부탄다이올의 생산방법을 제공한다.

본 발명은 일 실시예는 아세토인 환원효소 인코딩 유전자를 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주로서, 아세토인 환원효소를 과발현시킨 2,3-부탄다이올 생산용 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주를 사용할 수 있다.

이때 아세토인 환원효소(acetoin reductase)는 아세토인을 환원시키는 효소로서, 알코올 디하이드로지네이즈(alcohol dehydrogenase, budC, 서열번호 2) 유전자가 이를 코딩하는 유전자이다. 본 발명의 일 실시예로서 사용되는 상기 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 budC 유전자가 코딩하는 아세토인 환원효소는 다른 크렙시엘라 옥시토카 균주의 아세토인 환원효소와 활성이 전혀 다르며, 이는 일부 아미노산 서열의 차이때문인 것으로 판단된다. 상기 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 아세토인 환원효소가 타균주의 아세토인 환원효소와 차별되는 특징 중 하나로는 온도조건에 따른 활성차이가 있다. 예를 들면, 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 아세토인 환원효소는 pH 5의 조건에서 30℃에 비해 37℃에서 아세토인 환원효소 활성이 급격히 감소하지만, 타 균주의 일례인 크렙시엘라 옥시토카 KCTC1686 균주의 아세토인 환원효소는 상기 온도에 따른 활성차가 나타나지 않는다.

본 발명의 일 실시예로서 사용되는 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 경우 엠피실린(ampicillin)에 내성을 나타내고 클로람페니콜(chloramphenicol)에 내성이 없으므로, 셔틀벡터(shuttle vector)에 항생제 저항성 유전자로서 Cm^r 유전자(chloramphenicol resistant gene, 서열번호 3)를 더 포함하여 발현벡터를 제조할 수 있다. 그리고 본 발명의 일 실시예로서 제조되는 재조합 벡터는 셔틀벡터에 Cm^r 유전자가 삽입된 발현 벡터에 아세토인 환원효소 인코딩 유전자를 삽입한 것이다.

구체적으로 본 발명은 일 실시예로서,

셔틀벡터에 Cm^r 유전자를 삽입하여 발현 벡터를 제조하는 단계;

상기 발현 벡터에 아세토인 환원효소 인코딩 유전자를 삽입하고 클로닝(cloning)하여 재조합 벡터를 제조하는 단계;및

상기 재조합 벡터를 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주에 도입하여 형질전환하는 단계;

를 포함하는 방법에 의해 2,3-부탄다이올 생산용 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주를 제조할 수 있다.

이때 본 발명의 일 실시예로서 사용되는 상기 셔틀벡터는 두 개의 다른 생물체에서 복제될 수 있는 클로닝 벡터를 의미하는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 본 발명의 일 실시예는 셔틀벡터로서 당업계에서 통상적으로 사용되는 벡터를 모두 사용할 수 있으며, 구체적으로 pUC18, pUC19 (Invitrogen, USA), pBR322 (Promega, USA) 등을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는 본 발명의 일 실시예로서 pUC18 벡터(서열번호 4)를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예로서 사용되는 상기 발현벡터(expression vector)는 벡터에 삽입된 외래유전자가 숙주생물 내에서 발현되도록 만들어진 클로닝 벡터(cloning vector)를 의미하는 것으로서, 발현벡터의 전사에 제공되는 추가단편에 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 상기 추가단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 발현벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택마커, 폴리아데닐화 신호 등을 또한 포함한다. 발현벡터는 예를 들어 플라스미드, 바이러스 중 하나 이상으로부터 유도될 수 있다. 본 발명의 일 실시예는 발현벡터로서 당업계에서 통상적으로 사용되는 벡터를 모두 사용할 수 있으며, 구체적으로 pUC18CM, pBR322, pET28a (Novagen, USA) 등을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는 본 발명의 일 실시예로서 pUC18CM 벡터(pUC18-Cm^r 벡터, 서열번호 5)를 사용할 수 있다. 이때 프로모터는 pUC18벡터에 존재하는 Lac 프로모터(IPTG induction)를 사용할 수 있으며, 개시, 종료 코돈, 폴리 아데닐화 신호 역시 pUC18 벡터 내에 존재하는 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예로서 사용되는 발현벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린 등에 대한 내성 유전자를 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 일 실시예로서 사용되는 발현벡터는 프로모터서열, 발현 대상 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 터미네이터 서열을 포함하며, 상기 서열들이 5'-3' 순서대로 연결될 수 있다.

본 발명에서 일 실시예로서 사용되는 발현대상 유전자는 상기 아세토인 환원효소 인코딩 유전자로서 budC 유전자를 예로 들 수 있다. 이 유전자는 발현벡터 내부에 도입되어 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주 내에서 발현되게 된다. 본 발명에서 일 실시예로서 사용되는 상기 budC 유전자는 80% 이상의 상동성, 보다 구체적으로 90% 이상의 상동성을 갖는 유전자를 포함한다.

또한, 본 발명의 다른 일 실시예로서 상기 재조합 벡터를 제조하는 단계는 발현 벡터에 아세토인 환원효소 인코딩 유전자를 PCR 등을 이용하여 증폭시킨 후 삽입하여 클로닝할 수 있다.

상기 재조합 벡터를 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주에 도입하여 형질전환하는 단계는 통상적으로 사용되는 형질전환 방법이라면 모두 사용될 수 있으며, 예를 들면 수용성 세포(competent cell)을 준비하는 단계와 전기천공(Electroporation) 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면 상기 수용성 세포를 준비하는 단계는,

LB(Luria-Bacteria) 배지에서 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주를 35~39℃에서 밤새 배양하는 단계;

상기 LB 배지의 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주를 계대배양(subculture)하고, 5000~6000rpm로 2~6℃에서 8~12분 동안 원심분리하여 OD₆₀₀이 0.2일 때 수확하는 단계;

200~300mL의 매우 차가운 탈이온화 증류수와 15~25mL의 차가운 10%(w/v) 글리세롤로 세포 펠렛(pellet)을 세척하는 단계;및

최종 OD₆₀₀이 100인 차가운 10% 글리세롤의 적당한 부피 내에서 재부유(resuspend)시키고 -70℃~-80℃에서 저장하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 의하면 상기 전기천공 단계는,

정제된 플라스미드 DNA 60~65ng과 매우 차갑게 냉장시킨 세포 현탁액 45~55μl을 혼합하고 매우 차갑게 냉장시킨 전기천공 큐벳(electroporation cuvettes)으로 옮기는 단계;

12.5kV/cm, 200 Ω, 25μF(시상수 4.4ms)의 조건 하에서 전기천공하는 단계;

LB 배양액 0.8~1.2mL를 맥동세포(pulsed cells)와 혼합하고 35~39℃에서 50~70분 동안 200~300rpm으로 흔들면서 배양하는 단계;및

적당한 부피의 세포 혼합물을 스프레드(spread)하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따라 상기와 같이 제조된 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주는 아세토인 환원효소 인코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의하여 형질전환됨으로써 아세토인 환원효소(acetoin reductase)를 과발현시킨다. 따라서, 상기 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주를 사용하여 2,3-부탄다이올을 생산할 경우, 아세토인 환원효소의 과발현에 의해 아세토인뿐 만 아니라 석시네이트, 아세테이트 등의 부산물의 생산도 감소하므로 균주가 2,3-부탄다이올의 생산에 소비하는 탄소원의 양에 대한 2,3-부탄다이올(2,3-butanediol)의 생산수율을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예는 앞서 기술한 상기 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주를 배지에서 배양하는 것을 포함하는 2,3-부탄다이올의 생산방법을 제공한다.

상기 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주를 배양하는데 사용되는 배지는 일 실시예로서 탄소원으로 글루코오스, 질소원으로 효모 추출물, 카자미노산 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 재조합 균주가 배양된 배지에서 2,3-부탄다이올을 수득할 수 있으며, 이는 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의해 분리 또는 정제되어 수득될 수 있다. 구체적으로 저비용, 고순도 및 고효율면에서, 본 발명에 따른 상기 재조합 균주에 의해 생산된 2,3-부탄다이올 발효액으로부터 증류(distillation), 용매 추출(solvent extraction) 등의 방법을 이용하여 2, 3-부탄다이올을 분리, 정제할 수 있다. 이 외에도 2,3-부탄다이올 발효액으로부터 소수성 제올라이트상에 2,3-부탄다이올을 흡수시키고, 무수 에탄올을 이용하여 2,3-부탄다이올을 녹여 분리한 다음, 에탄올을 제거함으로써 2,3-부탄다이올을 수득하는 방법, 2,3-부탄다이올보다 높은 끓는점을 가지고 있으며 수난용성이고, 2,3-부탄다이올과 공비 혼합물을 형성하지 않는 인산에스테르를 용매로 사용하여, 수용액으로부터 2,3-부탄다이올을 용매 추출하는 방법, 글루코스, 소르비탈과 같은 탄수화물의 수소첨가분해 생성물(2,3-부탄다이올과 프로필렌 글리콜)에 공비혼합물(azeotrope) 형성제를 사용하여 증류함으로써 2,3-부탄다이올을 회수하는 방법 등에 의해 2,3-부탄다이올을 수득할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 일 실시예는 크렙시엘라 옥시토카 M1(Klebsiella oxytoca M1, KCCM11177P) 재조합 균주를, 350~450rpm의 교반속도; 27~33℃의 온도; 및 pH 5-7의 조건 중 하나 이상의 조건에서 배양하여 아세토인 환원효소(acetoin reductase)를 과발현시키는 것을 포함하는 2,3-부탄다이올의 생산방법을 제공한다.

이때 상기 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주는 당업계에서 통상적으로 이루어지는 방법에 의해 배양될 수 있으며, 상기 배양하는 단계에서의 상기와 같은 배양조건을 조절함으로써 아세토인 환원효소를 과발현시켜, 결과적으로 2,3-부탄다이올의 생산향상을 유도할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따르면 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주를 배지에서 330~470rpm 또는 350~450rpm, 보다 구체적으로 380~420rpm으로 교반(agitation)하면서 배양하는 것을 포함할 수 있다. 유전자 재조합 하지 않은 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주를 상기 교반속도로 교반시킬 경우에는 빨라진 교반속도로 인해 아세토인으로부터 2,3-부탄다이올로의 전환이 적어진다는 문제점이 있는 반면, 본 발명은 일 실시예로서 아세토인 환원효소를 과발현시킨 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주를 사용하므로 상기와 같이 높은 교반속도로 배양시킬 경우에도 우수한 2,3-부탄다이올 생산수율을 얻을 수 있다. 다만, 교반속도가 470rpm 초과인 경우 2,3-부탄다이올의 생산량은 증가하지만 아세토인과 같은 부산물의 생산도 함께 증가한다는 단점이 있고, 330rpm 미만인 경우에는 부산물의 생산은 상대적으로 적지만 2,3-부탄다이올의 생산량이 높지 않다는 문제가 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면 상기 배양하는 단계의 온도는 25~35℃ 또는 27~33℃, 보다 구체적으로 29~31℃로 조절될 수 있다. 이때, 상기 배양하는 단계의 pH는 5.2~6.8 보다 구체적으로 5.5~6.5로 조절될 수 있다.

이는 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주는 배양온도에 따라 생산물의 차이가 나타나는데, 배양온도가 상기 범위일 때는 주요생산물이 2,3-부탄다이올인데 반해, 35℃ 이상에서는 2,3-부탄다이올의 전구물질인 아세토인이 주요 생산물이어서 2,3-부탄다이올의 생산이 저하되기 때문이다. 또한 배양단계의 pH가 5.2 이하에서는 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 환원효소가 매우 낮은 효소활성을 나타내므로, 상기 pH를 상기 범위로 조절함으로써 배지의 탄소원에 대한 2,3-부탄다이올의 생산수율을 상승시킬 수 있다.

이하, 실시예 및 시험예를 들어 본 발명에 따른 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주의 제조방법 및 2,3-부탄다이올의 생산방법 및 그에 따른 효과를 상세하게 설명한다. 하지만 아래 실시예 및 시험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1] 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주의 제조

발현 벡터의 제조

먼저, pUC18 플라스미드에 708-FLPe 플라스미드의 Cm^r 유전자를 삽입하여 발현 벡터(pUC18CM)를 제조하였다. 그리고 도 1에 발현 벡터(pUC18CM)의 제작도표를 나타내었다.

구체적으로 pUC18CM 벡터는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

먼저 708-FLPe(Gene Bridge, A105) 플라스미드 내의 Cmr 유전자를 주형으로 하여 PCR 실시하였고, 이때 사용한 프라이머는 하기와 같다.

Cmr F: GAC GTC TGA GAC GTT GAT CGG(서열번호 6)

Cmr R: GAC GTC ATT CAG GCG TAG CAC(서열번호 7)

그리고 상기 PCR은 98 ℃에서 3분 동안 전변성(predenature)을 1 사이클 실시한 후, 98℃에서 10초 동안 변성(denature) - 60℃에서 10초 동안 어닐링(annealing) - 72℃에서 10초 동안 신장(elongation)을 30 사이클 반복실시하였다. 그리고 72℃에서 5분 동안 추가 신장(extra elongation)을 1 사이클 더 실시하여 수행하였다.

그 다음, pUC18 플라스미드를 AatII로 다이제스쳔(digestion)한 후 PCR 생산물인 측을 라이게이션(ligation)하였다. 그리고 E.coli DH5a에 형질전환하였다. 마지막으로 LB 아가(Luria Bertani agar, Cm 10μg/ml)에서 생성된 콜로니(colony)를 접종하여 플라스미드를 분리한 후(plasmid isolation) 후 제한효소를 처리하여 확인하였다. 이때 상기 LB 배지의 조성은 트립톤(Tryptone; 10 g/L, Difco), 소듐클로라이드(Sodium chloride; 10 g/L, Junsei), 효모 추출물(Yeast extract; 5 g/L, Difco)을 포함한다.

재조합 벡터의 제조

그 다음, 크렙시엘라 옥시토카 M1의 아세토인 환원효소(acetoin reductase)를 암호화 하는 유전자인 budC 유전자를 PCR(Polymerase chain reaction)을 이용하여 증폭하고, 상기 발현 벡터(pUC18CM)에 삽입하여, 재조합 벡터를 제조하였다. 그리고 EcoRI에 처리하여 이를 확인하고, 도 2에 나타내었다.

구체적으로, 상기 재조합 백터는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

먼저, 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 유전체(genomic DNA)를 주형으로 하여 PCR을 실시하였다. 이때 사용한 프라이머는 하기와 같다.

budC1: GGATCCTGGGCCAGCTTCATCTCAGTCAA (BamHI, 서열번호 8)

budC2: AAGCTTCGCTGAAGCCGGGGCAAACC (HindIII, 서열번호 9)

그리고 상기 PCR은 98 ℃에서 3분 동안 전변성(predenature)을 1 사이클 실시한 후, 98℃에서 10초 동안 변성(denature) - 58℃에서 10초 동안 어닐링(annealing) - 72℃에서 10초 동안 신장(elongation)을 30 사이클 반복실시하였다. 그리고 72℃에서 5분 동안 추가 신장(extra elongation)을 1 사이클 더 실시하여 수행하였다.

그 다음, pUC18CM 플라스미드의 MCS 사이트에 존재하는 BamHI, HindIII 제한효소 사이트를 다이제스쳔(digestion)한 후 budC PCR 생산물을 라이게이션(ligation)하였다.

마지막으로, pUC18CM-budC를 E.coli DH5a에 형질전환한 후 Cm 10μg/ml가 포함된 LB 아가 플레이트(LB agar plate)에 도말한 다음, 콜로니를 접종하여 재조합 플라스미드를 확인하였다.

크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주의 제조

상기에서 제조한 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 벡터를 크렙시엘라 옥시토 카 M1 균주에 도입하여 형질전환한 후, Cm 20μg/L 가 포함된 배지에서 배양하여 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주를 제조하였다.

이때 상기 형질전환은 다음과 같은 방법에 의해 수행되었다.

먼저 LB(Luria-Bacteria) 배지에서 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주를 37℃에서 밤새 배양하고, 이를 다시 계대배양(subculture)한 다음, 5500rpm로 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 OD₆₀₀이 0.2일 때 수확하였다. 그리고 250mL의 매우 차가운 탈이온화 증류수와 20mL의 차가운 10%(w/v) 글리세롤로 세포 펠렛(pellet)을 세척하였다. 최종 OD₆₀₀이 100인 차가운 10% 글리세롤의 적당한 부피 내에서 재부유(resuspend)시키고 -75℃에서 저장하여, 수용성 세포(competent cell)을 준비하였다.

그 다음, 상기에서 제조한 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 벡터 DNA 60~65ng과 매우 차갑게 냉장시킨 세포 현탁액(수용성 세포 형태의 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주) 45~55μl을 혼합하고 매우 차갑게 냉장시킨 전기천공 큐벳(electroporation cuvettes)으로 옮겼다. 12.5kV/cm, 200 Ω, 25μF(시상수 4.4ms)의 조건 하에서 전기천공하였다. 그리고나서, LB 배양액 0.8~1.2mL를 맥동세포(pulsed cells)와 혼합하고 35~39℃에서 50~70분 동안 200~300rpm으로 흔들면서 배양하였으며, 이 세포 혼합물을 스프레드(spread)함으로써 전기천공을 실시하여 형질전환을 수행하였다.

[시험예 1] 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 배양시 교반속도에 따른 2,3-부탄다이올 생산

상기 실시예 1에서 제조한 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주의 2,3-부탄다이올 생산능의 평가 실험에 앞서, 재조합 이전의 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 특성을 분석하기 위하여, 하기의 실험을 실시하였다.

교반속도 200 rpm 하에서 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 배양

먼저, 배지를 발효조에 넣고 균주를 접종하여 유가배양(fed-batch culture)하였다. 이때 한 발효조는 교반속도 200rpm, 에어레이션(aeration) 2.5vvm, 초기 pH는 7이었으며 5N KOH를 사용하여 pH 5.5로 적정하였다. 또한, 배양온도는 30 ℃, 발효조 내 배지의 부피(working volume)는 1L였다. 배지에는 탄소원으로써 글루코오스 80g/L에 600g/L의 글루코오스를 더 공급하여 주고, 질소원으로서 효모 추출물 5 g/L, 카자미노산(Casamino acid) 10 g/L가 포함되었다. 이외 배지에 포함되는 구체적인 구성성분은 상기 표 1에 나타내었다.

구성성분	g/L
K₂HPO₄	13.7
KH₂PO₄	2
(NH₄)₂HPO₄	3.3
(NH₄)₂SO₄	6.6
MgSO₄·7H₂O	0.25
FeSO₄·7H₂O	0.05
ZnSO₄·7H₂O	0.001
MnSO₄·H₂O	0.001
CaCl₂·2H₂O	0.01
EDTA	0.05
글루코오스(glucose)	50

그 결과, 90시간 후 배지에서 생산된 2,3-부탄다이올의 농도는 약 84 g/L였으며, 부산물인 아세토인은 약 7g/L로 소량 생산되었다(도 3 참조).

교반속도 400 rpm 하에서 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 배양

먼저, 배지를 발효조에 넣고 균주를 접종하여 유가배양(fed-batch culture)하였다. 이때 한 발효조는 교반속도 400rpm, 에어레이션(aeration) 1 vvm, 초기 pH는 6이었으며 5N NaOH 를 사용하여 pH 6로 계속 유지하였다. 또한, 배양온도는 30 ℃, 발효조 내 배지의 부피(working volume)는 1L였다. 배지에는 탄소원으로써 글루코오스 80g/L에 600g/L의 글루코오스를 더 공급하여 주고, 질소원으로서 효모 추출물 5 g/L, 카자미노산(Casamino acid) 10 g/L가 포함되었다. 이외 배지에 포함되는 구체적인 구성성분은 상기 표 1과 동일하다.

그 결과, 61시간 후 배지에서 생산된 2,3-부탄다이올의 농도는 약 87.01g/L였으며, 이와 함께 부산물인 아세토인도 27.77g/L 생산되었다(도 4 참조). 즉, 상기 교반속도를 200rpm으로 하여 배양하였을 때와 비교하여 보면 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 2,3-부탄다이올 생산 과정에서 교반속도를 400rpm으로 높였을 때 2,3-부탄다이올의 생산 수율은 증가하였지만 부산물인 아세토인의 생산도 함께 크게 증가함을 알 수 있다.

[시험예 2] 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 배양온도에 따른 2,3-부탄다이올 생산

상기 시험예 1의 실험에 이어서, 하기에서는 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주 내에서 아세토인을 2,3-부탄다이올로 전환시키는 효소인 아세토인 환원효소의 특성을 분석하기 위한 실험을 실시하였다.

이때 비교예로서 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주와 16S rDNA 분석 결과 99.5% 유사성을 갖는 크렙시엘라 옥시토카 KCTC1686 균주도 동일 배양조건으로 배양하여 각 균주의 온도에 따른 2,3-부탄다이올 및 부산물인 아세토인의 생산량을 비교하였다.

크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 배양

먼저, LB 배지에 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주를 접종하여 밤새(O/N) 전배양(preculture)하였다. 그 다음, 상기 표 1의 조성을 갖는 배지 20mL를 100mL의 플라스크에 넣고 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주를 접종하였다. 그리고 배양온도를 각각 37℃, 30℃로 하여 150rpm으로 교반하며 배양하였다.

12시간 간격으로 1mL씩 샘플링하였으며, 이를 각각 10배 희석하여 HPLC(제조사: Agilent, 제품명: Agilent 1260 (Waldbronn, Germany), refractive index detector (RID); Aminex HPX-87 H Ion Exclusion Column (300 mm X 7.8 mm, Bio-Rad, Hercules, CA, USA))로 분석하였고, 20배 희석하여 가스 크로마토그래피(Gas Chromatography; Shimadzu GC-2010, Kyoto, Japan), 프레임 이오나이즈 디텍터(flame ionized detector, FID; HP-INNOWax column; 30 m X 0.32 mm X 0.25㎛)로 분석하였다. 그리고 배양시간에 따른 탄소원인 글루코오스의 소비량, 2,3-부탄다이올 및 부산물인 아세토인의 생산량을 각 배양 온도별로 도 5에 나타내었다.

크렙시엘라 옥시토카 KCTC1686 균주의 배양

상기 37℃, 30℃의 배양온도에서의 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 배양방법과 균주로서 크렙시엘라 옥시토카 KCTC1686 균주를 사용한 것을 제외하고는 동일한 조건 및 방법으로 각각 37℃, 30℃의 배양온도에서 크렙시엘라 옥시토카 KCTC1686 균주를 배양하였다. 그리고 배양시간에 따른 탄소원인 글루코오스의 소비량, 2,3-부탄다이올 및 부산물인 아세토인의 생산량을 각 배양온도별로 도 6에 나타내었다.

그 결과, 도 5 및 6에 나타난 바와 같이, 크렙시엘라 옥시토카 KCTC1686 균주는 30℃와 37℃ 모두에서 2,3-부탄다이올과 부산물로 아세토인을 생산하였다. 이에 반해, 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 경우에는 30℃에서 2,3-부탄다이올을 생산하고 부산물로 아세토인을 약간 생성한 것과 달리, 37℃에서는 2,3-부탄다이올의 전구물질인 부산물 아세토인을 주로 생산함을 알 수 있다. 이는 각 균주에서 아세토인을 2,3-부탄다이올로 전환하는 효소인 아세토인 환원효소의 온도 또는 pH에 따른 활성차이에서 비롯된 것으로 판단된다.

[시험예 3] 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 배양시 배양온도 및 pH에 따른 2,3-부탄다이올 생산

상기 시험예 2에서 나타난 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 온도 또는 pH에 따른 아세토인 환원효소(acetoin reductase, AR)의 특이성에 기초하여, 하기의 실험에서는 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 조단백질(crude protein)을 이용하여 30℃, 37℃의 배양온도에서 pH 5, 6, 7의 다양한 pH 조건하에서 아세토인 환원효소의 활성을 측정하였다.

구체적으로, LB 배지에 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주를 접종하여 밤새(O/N) 전배양(preculture)하였다. 그 다음, 상기 표 1의 조성을 갖는 배지 20mL를 100mL의 플라스크에 넣고 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주를 접종하였다. 30℃에서 150rpm으로 교반하여 배양 후 균액을 원심분리하여 클렙시엘라 옥시토카 M1의 세포만 추출한 다음 세포를 용해시킨 후, 조단백질(crude protein)을 이용하여 30℃와 37℃에서 pH 5, 6 또는 7의 적정 버퍼에서 아세토인 환원효소의 활성을 측정하였다. 이때 pH5는 50mM의 아세테이트(acetate) 버퍼로, pH6 및 7은 50mM의 포스페이트(phosphate) 버퍼로 적정하였다.

그리고, 아세토인 환원효소(BudC)에 의해 아세토인으로부터 2,3-부탄다이올이 생성되고 그 과정에서 NADH가 소비되어 NAD⁺가 되므로, 배양액에 아세토인과 NADH 를 첨가한 상태에서 조단백질(crude protein)을 첨가하여 NADH 소모 정도를 측정함으로써 아세토인 환원효소의 활성 측정하였다. 배양액에 용균버퍼(lysis buffer)로 용균(lysis) 후 바로 단백질의 양을 재고 NADH assay를 실시하였고, 이때 사용된 NADH는 15mM(최종 0.15mM), 아세토인은 10mM(최종 0.1mM)였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

이때 비교 실험을 위하여 크렙시엘라 옥시토카 KCTC1686 균주도 상기와 같은 조건 및 방법으로 배양하여 아세토인 환원효소의 활성을 측정하고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

실험 결과 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주는 비교 균주인 크렙시엘라 옥시토카 KCTC1686 균주에 비하여 모든 조건에서 낮은 아세토인 환원효소 활성(AR activity)을 나타냈다. 특히 pH 5 조건에서는 30℃에 비해 37℃에서 아세토인 환원효소 활성이 급격히 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 반면 크렙시엘라 옥시토카 KCTC1686 균주의 경우는 pH 5에서도 30℃와 37℃ 조건 모두에서 비슷한 정도의 아세토인 환원효소 활성을 나타냈다. 이는 본 발명에서 사용되는 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 아세토인 환원효소가 타균주의 아세토인 환원효소와 차별되는 특성을 가짐을 의미한다.

[시험예 4] 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 배양시 배양온도에 따른 budC mRNA 전사와 단백질 발현률 비교

상기 시험예 3에 이어서, 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 배양시 배양온도에 따른 budC mRNA 전사와 단백질 발현률 비교를 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다.

먼저, 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주를 LB 배지에 접종하여 밤새(O/N) 전배양(preculture)하였다. 그 다음, 상기 표 1의 조성을 갖는 배지 20mL를 100mL의 플라스크에 넣고 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주를 접종하였다. pH 6에서 배양온도를 각각 30℃, 37℃로 하여 150rpm으로 교반하며 배양하였다. pH6은 50mM의 포스페이트 버퍼로 적정하였다.

그리고 상기 각 온도에서 배양한 균주의 배양액에 아세토인과 NADH를 첨가한 상태에서 조단백질(crude protein)을 첨가하고 용균버퍼(lysis buffer)로 용균(lysis) 후 바로 단백질의 양을 잰 후 NADH assay를 실시하였고, 이때 사용된 NADH는 15mM(최종 0.15mM), 아세토인은 10mM(최종 0.1mM)였다. 그리고 NADH 소모 정도를 시간별로(6, 12, 24 시간) 5mL씩 원심분리하여 각각 측정함으로써 아세토인 환원효소의 활성(acetoin reductase activity)을 측정하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

또한, 시간별 budC 유전자의 전사율은 하기의 방법으로 측정 및 비교하였다.

총 RNA 분리를 위하여 각 온도 (30℃, 37℃)에서 배양한 균액을 시간에 따라 (6, 12, 24h) 5mL씩 분주한 후, 세포 펠렛(cell pellet)만 모아 -70℃에 보관 후 실험을 진행하였다. RNA 분리는 트리졸(Trizol) 용액(Ambion, Auckland, New Zealand)을 이용하여 실험하였으며, RT-PCR 시 DNA 오염을 방지하기 위하여 DNase I (Invitrogen, CA, USA) 처리를 37℃에서 30분간 한 후 RT-PCR을 진행하였다. 양성 대조군(Positive control)로 하우스 키핑(house-keeping) 유전자인 16s rDNA 유전자의 염기서열을 이용하여 프라이머를 하기와 같이 제작하였고, budC의 전사율을 알아보기 위하여 budC 염기서열을 이용하여 프라이머를 하기와 같이 제작하였다.

16S rDNA1: 5'-TGCCTGATGGAGGGGGATAA-3' (서열번호 10)

16S rDNA2: 5'-AGCGTCAGTCTTTGTCCAGG-3' (서열번호 11)

RTbudC1: 5'-GAGATTCGCGAGGACGTGAT-3' (서열번호 12)

RTbudC2: 5'-GACGTCTTCCGGCTCTGAAA-3' (서열번호 13)

그리고 DNA 오염을 확인하기 위하여 DNase 처리 한 RNA 샘플을 이용하여 역전사(reverse transcription)과정 없이 PCR을 다른 샘플들과 같은 조건에서 진행하였다. RT-PCR은 one- step RT-PCR premix(GenDEPOT, Baker, TX, USA)를 이용하여 총 RNA 2μg으로 진행하였다. 그리고 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8 (a) 및 (b)에서 나타난 바와 같이 아세토인 환원효소 활성은 37℃에서는 12h 이후 급격히 감소하였고, 30℃에서는 12h에 약간 감소하였다가 24h에 다시 회복됨을 알 수 있었다(a). 또한 budC 유전자의 mRNA 전사율도 상기 (a)의 아세토인 환원효소 활성과 같은 결과가 나타났다(b). 이는 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 온도에 따른 주요 생산물들의 생산량 차이는 아세토인 환원효소 활성의 발현 정도에 의한 것임을 의미한다.

[시험예 5] 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주와 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주의 MES 첨가 여부에 따른 2,3-부탄다이올 생산량 비교

상기 시험예 1-4의 결과로 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 2,3-부탄다이올과 부산물들의 생산량 차이가 아세토인 환원효소 활성의 발현정도에 따른 것임을 알았으므로, 하기의 시험에서는 이를 증가시키기 위하여 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주에 아세토인 환원효소 인코딩 유전자로 budC 유전자를 도입한 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주를 제조하고 배양조건에 따른 각 균주의 2,3-부탄다이올 생산량을 다시 비교해보았다.

먼저, 상기 실시예 1에서 제조한 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주와 크렙시엘라 옥시토카 M1(KCCM11177P) 균주를 각각 상기 표 1의 배지에 글루코오스가 40g/L로 포함되고 배양온도가 37℃인 것을 제외하고는 상기 시험예 2의 "크렙시엘 라 옥시토카 M1 균주의 배양"과 동일한 방법으로 배양하였다.

그리고 pH 변화에 따른 차이를 비교하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제조한 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주와 크렙시엘라 옥시토카 M1(KCCM11177P) 균주를 배양시 배지에 MES(2-morpholinoethanesulfonic acid)를 첨가한 것을 제외하고는 상기 조건, 방법과 동일한 조건 및 방법으로 배양하였다. 이때 MES는 수산화나트륨 혹은 다른 염기로 중화함으로써 유효 pH 범위를 5.5~7.0로 유지시켜주는 양성 이온완충액이다.

그 다음, MES를 첨가한 경우와 아닌 경우의 배양시간에 따른 pH변화를 각 균주별로 측정하여 도 9 (a)에 나타내었고, 이들 경우 각각의 2,3-부탄다이올 생산량을 상기 시험예 4와 동일한 방법으로 측정하고 비교하여 도 9 (b)에 나타내었다.

그 결과, 유전자 조작을 하지 않은 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주(pUC18CM)의 경우 37℃에서 아세토인을 주로 생산한데 반해, 아세토인 환원효소를 과발현시킨 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주(pUC18CM-budC)의 경우에는 37℃에서 2,3-부탄다이올의 생산이 증가하고 아세토인의 생산이 급격히 감소한 것으로 나타났다. 특히 MES(2-morpholinoethanesulfonic acid)를 이용하여 급격한 pH 감소가 일어나지 못하도록 조절하자 2,3-부탄다이올의 생산량이 더욱 증가하는 결과를 얻었다.

따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 온도에 따른 생산물의 차이는 아세토인 환원효소의 온도에 따른 발현 차이에 의한 것으로 생각할 수 있다. 이에 아세토인 환원효소를 과발현한 재조합 균주를 이용하여 400rpm 교반 하에서 배양하면 부산물인 아세토인의 생산은 감소하고, 2,3-부탄다이올의 생산능이 향상될 것이라 예상할 수 있었다. 또한, 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주의 아세토인 환원효소의 특성으로 미루어 보아 pH가 5-7 범위 내로 유지될 경우 2,3-부탄다이올의 생산수율이 더 향상될 것이라 생각되었다.

[시험예 6] 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주의 2,3-부탄다이올 생산

본 발명의 일 실시예에 따른 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주의 2,3-부탄다이올 생산성을 확인하기 위하여 2,3-부탄다이올 및 그외 부산물들의 배양액내 농도를 측정하는 하기의 실험을 실시하였다.

먼저, 상기 실시예 1에서 제조한 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주의 콜로니를 LB 배지 (Cm 20μg/L)에 접종한 후 30℃에서 밤새 배양하였다. 배양된 균주를 상기 표 1의 조성을 갖는 배지 100mL에 계대배양 후 10시간 동안 30℃에서 배양하였다. 그 다음, 균주를 상기 표 1의 조성을 갖는 배지 1L에 10%(w/v)가 되도록 접종 후 발효조(제조사: Fermentec (Korea), 제품명: XP 50, vessle: 3.5L)에서 유가배양(fed-batch culture)하였다. 이때 교반속도는 400rpm, 에어레이션(aeration)은 1vvm이고, 5N NaOH 사용하여 pH를 6으로 적정하였다.

이때 재조합 균주를 배양하면서 시간에 따라 생산되는 배양액 내의 2,3-부탄다이올(2,3-BD), 그 외 아세토인(acetoin), 에탄올(EtOH), 아세트산(acetic acid), 석시네이트(succinate), 젖산(lactate)의 농도를 다음과 같이 각각 측정하였다.

먼저 각 시간에 따라 발효조에 연결되어 있는 샘플링포트를 통해 주사기를 이용하여 발효액 1mL씩을 채취하였다. 이때 발효조 내에 연결되어있는 pH 프로브와 온도계에 의해 pH, 온도 등은 각 시간별로 측정 가능하다. 또한, OD(흡광도)는 배양액 일부를 증류수에 희석하여 스펙트로포토미터(spectrophotometer)를 이용하여 600nm에서 측정하였고, 배양액의 균을 원심분리한 후 상층액만 채취하여 0.4㎛ 기공크기(pore size)의 필터를 이용하여 여과한 후 배양액 내에 포함된 생산물을 측정하였다. 여과 한 배양액 내에 탄소원인 글루코오스의 양은 Merk 사의 글루코오스 키트(glucose kit)를 이용하여 측정하였다.

발효 산물로서 2,3-부탄다이올, 아세토인, 아세틱 애시드, 에탄올 등은 가스 크로마토그래피(Gas Chromatography; Shimadzu GC-2010, Kyoto, Japan), 프레임 이오나이즈 디텍터(flame ionized detector, FID; HP-INNOWax column; 30 m X 0.32 mm X 0.25㎛)를 이용하여 측정하였다. 그리고 상기 배양시간에 따른 농도측정결과를 도 10에 나타내었다.

도 10으로부터, 배양시간이 증가함에 따라 2,3-부탄다이올(2,3-BD)의 농도가 매우 증가하여 61시간 후 116.08g/L로 생산된데 반해, 아세토인은 61시간 후 14.41g/L로 매우 낮게 생산되었으며, 나머지 부산물들도 그 이하로 생산되었음을 알 수 있다. 이는 본 발명에 따른 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주가 유전자 조작 하지 않은 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주와 달리 아세토인 환원효소를 과발현시킴으로써 2,3-부탄다이올에 비하여 아세토인을 비롯한 부산물들을 현저히 적게 생산하여, 2,3-부탄다이올의 생산수율이 우수함을 의미한다.

[시험예 7] 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주의 2,3-부탄다이올 생산수율

본 발명의 일 실시예에 따른 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주의 2,3-부탄다이올 생산수율을 확인하기 위하여 하기의 실험을 실시하였다.

상기 실시예 1에서 제조한 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주를 하기와 같이 배양하였다.

먼저, 상기 실시예 1에서 제조한 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주의 콜로니를 LB 배지 (Cm 20μg/L)에 접종한 후 30℃에서 밤새 배양하였다. 배양된 균주를 글루코오스가 80g/L, 질소원으로 초기에 효모 추출물이 5g/L, 카사모노산이 10g/L로 포함된 것을 제외하고는 상기 표 1과 동일한 조성을 갖는 배지 100mL에 계대배양 후 12시간 동안 30℃에서 배양하였다. 이때 글루코오스는 약 10g/L남았을 때 60g/L가 되도록 600g/L의 글루코오스를 100mL 더 공급해 주었다.

그 다음, 균주를 상기 배지와 동일한 조건의 배지 1L에 10%(w/v)가 되도록 접종 후 발효조에서 유가배양(fed-batch culture)하였다. 이때 교반속도는 400rpm, 에어레이션(aeration)은 1vvm이고, 5N NaOH 사용하여 pH를 6으로 적정하였다.

그리고 본 발명의 일 실시예에 따른 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주의 2,3-부탄다이올 생산수율 향상정도를 비교하기 위하여, 유전자 조작하지 않은 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주를 사용하였다는 것을 제외하고는 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주와 동일한 방법으로 유전자 조작하지 않은 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주를 배양하였다.

그 다음, 배양시간에 따른 배지에 포함된 상기 각 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주(M1 budC overexpression)과 유전자 조작하지 않은 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주(M1 wild type)를 1mL씩 샘플링하여 이들의 2,3-부탄다이올의 생산수율(yield)(g/g)을 배양시간에 따라 각각 분석하여 도 11에 나타내었다. 이때 2,3-부탄다이올의 생산수율(yield)은 배지의 탄소원인 글루코오스의 소비량(g)에 대한 2,3-부탄다이올의 생산량(g)으로서 가스크로마토그래피(Gas Chromatography; Shimadzu GC-2010, Kyoto, Japan), 프레임 이오나이즈 디텍터(flame ionized detector, FID; HP-INNOWax column; 30 m X 0.32 mm X 0.25㎛)와 HPLC(High performance liquid chromatography; 제조사: Agilent, 제품명: Agilent 1260 (Waldbronn, Germany), refractive index detector (RID); Aminex HPX-87 H Ion Exclusion Column(300 mm X 7.8 mm, Bio-Rad, Hercules, CA, USA))를 사용하여 측정, 분석하였다.

또한, 배양시간에 따른 배지에 포함된 상기 각 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주(M1 budC overexpression)과 유전자 조작하지 않은 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주(M1 wild type)의 2,3-부탄다이올의 생산성(productivity)(g/L/h)을 배양시간에 따라 각각 측정하여 도 12에 나타내었다. 이때 2,3-부탄다이올의 생산성(productivity, g/L/h)는 생산된 2,3-부탄다이올의 농도(g/L)를 배양시간(h)에 대하여 나타낸 것으로서 가스크로마토그래피(Gas Chromatography; Shimadzu GC-2010, Kyoto, Japan), 프레임 이오나이즈 디텍터(flame ionized detector, FID; HP-INNOWax column; 30 m X 0.32 mm X 0.25㎛)와 HPLC를 사용하여 측정, 분석하였다.

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 61시간 후 본 발명의 일 실시예 따른 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주(M1 budC overexpression)의 2,3-부탄다이올의 생산수율은 0.48로서, 비교예인 유전자 조작을 하지않은 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주 M1(M1 wild type)의 생산수율 0.38보다 향상하였음을 알 수 있다.

또한, 도 12에 나타난 바와 같이, 61시간 후 본 발명의 일 실시예 따른 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주(M1 budC overexpression)의 2,3-부탄다이올의 생산성은 1.90 g/L/h으로서, 비교예인 유전자 조작을 하지않은 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주 M1(M1 wild type)의 생산성 1.43 g/L/h 보다 현저히 향상하였음을 알 수 있다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11177P

20110221

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Strain for manufacturing of 2,3-butanediol and method for producing 2,3-butanediol using the same <130> 13P163/IND <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1386 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Klebsiella oxytoca M1 <400> 1 cagagagctt gctctcgggt gacgagtggc ggacgggtga gtaatgtctg ggaaactgcc 60 tgatggaggg ggataactac tggaaacggt agctaatacc gcataacgtc gcaagaccaa 120 agagggggac cttcgggcct cttgccatca gatgtgccca gatgggatta gctagtaggt 180 ggggtaacgg ctcacctagg cgacgatccc tagctggtct gagaggatga ccagccacac 240 tggaactgag acacggtcca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg 300 ggcgcaagcc tgatgcagcc atgccgcgtg tatgaagaag gccttcgggt tgtaaagtac 360 tttcagcggg gaggaaggtg ttgaggttaa taaccttgtc aattgacgtt acccgcagaa 420 gaagcaccgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac ggagggtgca agcgttaatc 480 ggaattactg ggcgtaaagc gcacgcaggc ggtctgtcaa gtcggatgtg aaatccccgg 540 gctcaacctg ggaactgcat tcgaaactgg caggctggag tcttgtagag gggggtagaa 600 ttccaggtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tctggaggaa taccggtggc gaaggcggcc 660 ccctggacaa agactgacgc tcaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc 720 ctggtagtcc acgctgtaaa cgatgtcgac ttggaggttg ttcccttgag gagtggcttc 780 cggagctaac gcgttaagtc gaccgcctgg ggagtacggc cgcaaggtta aaactcaaat 840 gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgatg caacgcgaag 900 aaccttacct actcttgaca tccagagaac ttagcagaga tgctttggtg ccttcgggaa 960 ctctgagaca ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtt gtgaaatgtt gggttaagtc 1020 ccgcaacgag cgcaaccctt atcctttgtt gccagcgatt cggtcgggaa ctcaaaggag 1080 actgccagtg ataaactgga ggaaggtggg gatgacgtca agtcatcatg gcccttacga 1140 gtagggctac acacgtgcta caatggcata tacaaagaga agcgacctcg cgagagcaag 1200 cggacctcat aaagtatgtc gtagtccgga ttggagtctg caactcgact ccatgaagtc 1260 ggaatcgcta gtaatcgtgg atcagaatgc cacggtgaat acgttcccgg gccttgtaca 1320 caccgcccgt cacaccatgg gagtgggttg caaaagaagt aggtagctta accttcggga 1380 gggcgc 1386 <210> 2 <211> 771 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> budC <400> 2 atgaaaaaag tcgcactcgt gaccggcgcg ggccagggca tcgggaaagc tatcgccctt 60 cgcctggtta aagatggttt tgccgtggtt atcgccgatt acaatgacgc caccgcacag 120 gcggtcgccg atgaaattaa ccgcggcggc ggtcaggcgc tggcggtgaa ggtggatgtc 180 tctaaacgcg accagttttt tgccgccgta gaacaggcgc ggaagggcct gggcggtttt 240 gacgtgattg tgaacaacgc cggggtggcc ccctccacgc ctatcgaaga gattcgcgag 300 gacgtgatcg ataaagtcta caatatcaac gtcaaaggcg ttatctgggg tatccaggcc 360 gcggtagagg cgtttaaaaa agagggccac ggcggcaaaa tcatcaacgc ctgctcccag 420 gcgggccacg tgggtaaccc ggaactggcg gtctatagct caagtaagtt tgccgtgcgc 480 ggcctgacgc aaaccgccgc ccgcgatctg gcgcatctgg gaattaccgt taacggctac 540 tgcccgggga tcgttaaaac cccaatgtgg gcggaaatcg accgtcaggt ttccgaagcg 600 gcgggtaaac cgctgggcta cgggacccag gagttcgcca aacgcattac ccttggacgg 660 ctttcagagc cggaagacgt cgcggcctgc gtctcttatc tcgccggtcc ggactccagc 720 tatatgaccg gccaatcgct gctgatcgat ggcggcatgg tatttagcta a 771 <210> 3 <211> 823 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cmr gene <400> 3 tgagacgttg atcggcacgt aagaggttcc aactttcacc ataatgaaat aagatcacta 60 ccgggcgtat tttttgagtt atcgagattt tcaggagcta aggaagctaa aatggagaaa 120 aaaatcactg gatataccac cgttgatata tcccaatggc atcgtaaaga acattttgag 180 gcatttcagt cagttgctca atgtacctat aaccagaccg ttcagctgga tattacggcc 240 tttttaaaga ccgtaaagaa aaataagcac aagttttatc cggcctttat tcacattctt 300 gcccgcctga tgaatgctca tccggaattc cgtatggcaa tgaaagacgg tgagctggtg 360 atatgggata gtgttcaccc ttgttacacc gttttccatg agcaaactga aacgttttca 420 tcgctctgga gtgaatacca cgacgatttc cggcagtttc tacacatata ttcgcaagat 480 gtggcgtgtt acggtgaaaa cctggcctat ttccctaaag ggtttattga gaatatgttt 540 ttcgtctcag ccaatccctg ggtgagtttc accagttttg atttaaacgt ggccaatatg 600 gacaacttct tcgcccccgt tttcaccatg ggcaaatatt atacgcaagg cgacaaggtg 660 ctgatgccgc tggcgattca ggttcatcat gccgtttgtg atggcttcca tgtcggcaga 720 atgcttaatg aattacaaca gtactgcgat gagtggcagg gcggggcgta atttttttaa 780 ggcagttatt ggtgccctta aacgcctggt gctacgcctg aat 823 <210> 4 <211> 2686 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pUC18 vector <400> 4 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg 420 actctagagg atccccgggt accgagctcg aattcgtaat catggtcata gctgtttcct 480 gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt 540 aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc 600 gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg 660 agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg 720 gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 780 gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 840 cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 900 aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 960 tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 1020 ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat 1080 ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 1140 cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 1200 ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 1260 gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt 1320 atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 1380 aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 1440 aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 1500 gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc 1560 cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct 1620 gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca 1680 tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct 1740 ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca 1800 ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc 1860 atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg 1920 cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct 1980 tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa 2040 aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta 2100 tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc 2160 ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg 2220 agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa 2280 gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg 2340 agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc 2400 accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg 2460 gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 2520 cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 2580 ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc 2640 atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtc 2686 <210> 5 <211> 3515 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pUC18CM vector <400> 5 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg 420 actctagagg atccccgggt accgagctcg aattcgtaat catggtcata gctgtttcct 480 gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt 540 aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc 600 gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg 660 agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg 720 gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 780 gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 840 cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 900 aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 960 tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 1020 ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat 1080 ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 1140 cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 1200 ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 1260 gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt 1320 atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 1380 aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 1440 aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 1500 gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc 1560 cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct 1620 gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca 1680 tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct 1740 ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca 1800 ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc 1860 atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg 1920 cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct 1980 tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa 2040 aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta 2100 tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc 2160 ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg 2220 agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa 2280 gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg 2340 agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc 2400 accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg 2460 gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 2520 cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 2580 ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctgagacgt tgatcggcac 2640 gtaagaggtt ccaactttca ccataatgaa ataagatcac taccgggcgt attttttgag 2700 ttatcgagat tttcaggagc taaggaagct aaaatggaga aaaaaatcac tggatatacc 2760 accgttgata tatcccaatg gcatcgtaaa gaacattttg aggcatttca gtcagttgct 2820 caatgtacct ataaccagac cgttcagctg gatattacgg cctttttaaa gaccgtaaag 2880 aaaaataagc acaagtttta tccggccttt attcacattc ttgcccgcct gatgaatgct 2940 catccggaat tccgtatggc aatgaaagac ggtgagctgg tgatatggga tagtgttcac 3000 ccttgttaca ccgttttcca tgagcaaact gaaacgtttt catcgctctg gagtgaatac 3060 cacgacgatt tccggcagtt tctacacata tattcgcaag atgtggcgtg ttacggtgaa 3120 aacctggcct atttccctaa agggtttatt gagaatatgt ttttcgtctc agccaatccc 3180 tgggtgagtt tcaccagttt tgatttaaac gtggccaata tggacaactt cttcgccccc 3240 gttttcacca tgggcaaata ttatacgcaa ggcgacaagg tgctgatgcc gctggcgatt 3300 caggttcatc atgccgtttg tgatggcttc catgtcggca gaatgcttaa tgaattacaa 3360 cagtactgcg atgagtggca gggcggggcg taattttttt aaggcagtta ttggtgccct 3420 taaacgcctg gtgctacgcc tgaatgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac 3480 ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtc 3515 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cmr F <400> 6 gacgtctgag acgttgatcg g 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cmr R <400> 7 gacgtcattc aggcgtagca c 21 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> budC1 <400> 8 ggatcctggg ccagcttcat ctcagtcaa 29 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> budC2 <400> 9 aagcttcgct gaagccgggg caaacc 26 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rDNA1 <400> 10 tgcctgatgg agggggataa 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rDNA2 <400> 11 agcgtcagtc tttgtccagg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RTbudC1 <400> 12 gagattcgcg aggacgtgat 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RTbudC2 <400> 13 gacgtcttcc ggctctgaaa 20

Claims

아세토인 환원효소 인코딩 유전자를 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 기탁번호 KCCM11177P로 기탁된 크렙시엘라 옥시토카 M1(Klebsiella oxytoca M1) 균주로, 아세토인 환원효소(acetoin reductase)를 과발현시키고,
상기 아세토인 환원효소 인코딩 유전자는 서열번호 2의 알코올 디하이드로지네이즈(alcohol dehydrogenase, budC) 유전자인,
2,3-부탄다이올(2,3-butanediol) 생산용 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주.
제1항에 있어서, 상기 벡터는 Cm^r 유전자(chloramphenicol resistant gene)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올 생산용 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주.
삭제
제1항에 있어서, 상기 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주는 아세토인의 생산을 감소시키고 2,3-부탄다이올(2,3-butanediol)의 생산량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올 생산용 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주.
제1항에 있어서, 상기 벡터는 pUC18CM 벡터인 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올 생산용 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주.
제1항에 있어서, 상기 벡터는 도 1의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올 생산용 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주.
제1항, 제2항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 2,3-부탄다이올 생산용 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주의 제조방법으로,
셔틀벡터(shuttle vector)에 Cm^r 유전자를 삽입하여 발현 벡터를 제조하는 단계;
상기 발현 벡터에 아세토인 환원효소 인코딩 유전자를 삽입하고 클로닝(cloning)하여 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및
상기 재조합 벡터를 크렙시엘라 옥시토카 M1 균주에 도입하여 형질전환하는 단계;
를 포함하고,
상기 아세토인 환원효소 인코딩 유전자는 서열번호 2의 알코올 디하이드로지네이즈(alcohol dehydrogenase, budC) 유전자인,
2,3-부탄다이올 생산용 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 재조합 벡터를 제조하는 단계는 발현 벡터에 아세토인 환원효소 인코딩 유전자를 증폭시킨 후 삽입하여 클로닝하는 것을 특징으로 하는 2,3-부탄다이올 생산용 크렙시엘라 옥시토카 M1 재조합 균주의 제조방법.
제1항, 제2항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 기탁번호 KCCM11177P로 기탁된 크렙시엘라 옥시토카 M1(Klebsiella oxytoca M1)의 재조합 균주를 배양하는 것을 포함하는 2,3-부탄다이올 생산방법.
제1항, 제2항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 기탁번호 KCCM11177P로 기탁된 크렙시엘라 옥시토카 M1(Klebsiella oxytoca M1)의 재조합 균주를 하기의 조건 중 하나 이상의 조건에서 배양하여 아세토인 환원효소(acetoin reductase)를 과발현시키는 것을 포함하는 2,3-부탄다이올의 생산방법:
350~450rpm의 교반속도;
27~33℃의 배양온도; 및
pH 5-7.