MXPA02005193A - Promotor e intron de factor despolimerizante de actina de maiz. - Google Patents

Abstract

El promotor y un intron derivado de factor despolimerizante de actina de maiz y variantes geneticas o supresiones de los mismos, son utiles para controlar la expresion de transgenes en plantas.

Description

PROMOTOR E I NTRON DE FACTOR DESPOLIMERIZANTE DE ACTI NA DE MAIZ Campo de la invención Esta invención se refiere a ingeniería genética de plantas. La invención proporciona secuencias de DNA y constructos que son útiles para controlar la expresión de genes recombinantes en plantas. De manera más particular, la invención proporciona novedosas secuencias reguladoras derivadas de factor despolimerizante de actina de maíz (ADF).

Antecedentes de la invención Los proyectos de ingeniería genética de planta requieren acceso a una variedad de elementos genéticos que son usados para regular la expresión de transgenes. Dos ejemplos de tales elementos genéticos son promotores e intrones. La iniciación de la transcripción es regulada por un promotor. Un proyecto dado normalmente requiere el uso de varios promotores diferentes. Un promotor será usado para impulsar el gene de interés, y uno diferente usado, por ejemplo, para impulsar el marcador seleccionable. Un gene eucariótico es usualmente interrumpido por secuencias no de codificación llamadas intrones. El producto inicial de transcripción de un gene eucariótico es pre m RNA, el cual incluye secuencias correspondientes a los intrones. Los intrones son removidos durante el procesamiento post-transcripción para proporcionar el m RNA que es traducido para producir una proteína. Los estudios que caracterizan el papel de los intrones en la regulación de la expresión de genes han mostrado que el primer intrón del gene de alcohol deshidrogenasa de maíz (Adh-1) tiene la capacidad para incrementar la expresión bajo anaerobiosis. Callis J., M. Fromm, y V. Walbot. (1987), Gene Dev. 1:1183-1200. El intrón también estimula la expresión (a un menor grado) en la ausencia de anaerobiosis. Se piensa que esta intensificación es el resultado de una estabilización del pre-mRNA en el núcleo. Mascarenhas et al. reportó una intensificación de 12 veces y 20 veces de expresión de CAT mediante el uso del intrón Adh-1. Mascarenhas et al., "Intron-Mediated Enhancement of Heterologous Gene Expression in Maize" (Intensificción mediada por intrones de la expresión de genes heterologos en maíz), Plant Molecular Biology, 15:913-920, 1990. Otros diversos intrones han sido identificados del maíz y otras monocotiledóneas, las cuales aumentan la expresión de genes. Vain, P. et al. (1996), Plant Cell Reports 15:489-494. Ver además W098/5921. La secuencia de cDNA para ADF de maíz es conocida (GenBank acceso no. X97726), pero la secuencia de ADF genóica no ha sido publicada. En particular, la secuencia para el promotor de ADF no ha sido publicada hasta ahora, ni han sido identificados los intrones de ADF.

Breve descripción de las secuencias SEQ ID NO:1 es la secuencia de DNA para el producto de PCR AP2/BC294, incluyendo la secuencia del promotor de ADF y el intrón 1 de ADF. SEQ ID NO:2 es la secuencia de DNA para pDAB305.

Breve descripción de la invención La invención proporciona moléculas de DNA correspondientes a o derivadas de, el promotor de ADF y el intrón 1 de ADF.

Breve descripción de la invención La invención proporciona moléculas de DNA correspondientes a o derivadas del promotor de ADF y el intrón 1 de ADF. En otro de sus aspectos, la invención proporciona un constructo de DNA que comprende, enlazado operativamente en la dirección 5' a 3', a) un promotor de ADF de maíz; b) una secuencia líder sin traducir; c) un intrón; d) un gene de interés; y e) un 3'UTR. En una modalidad preferida, el promotor de ADF comprende 1-734 pb de la SEQ ID NO 1, y el intrón es seleccionado del grupo que consiste del intrón 1 de Adh1 y el intrón 1 de ADF (882-2161 pb de SEQ ID NO 1). En otro de sus aspectos, la invención proporciona un constructo de DAN que comprende, en la dirección 5' a 3', a) un promotor funcional en plantas; b) una secuencia líder sin traducir; c) el intrón 1 de ADF; d) un sitio de clonación; e) un 3'UTR.

En otro de sus aspectos, la invención proporciona un plásmido que comprende un promotor de ADF de maíz, de preferencia 1 -878 pb de SEQ I D NO 1 , o la secuencia de intrón 1 de ADF de maíz, de preferencia 882-21 61 pb de SEQ I D NO: 1 . En otro de sus aspectos, la invención proporciona una planta transformada que comprende al menos una célula de planta que contiene un constructo de DNA de la invención. La planta puede ser una monocotiledónea o dicotiledónea. Las plantas preferidas son maíz, arroz, algodón y tabaco. En otro de sus aspectos, la invención proporciona semilla o grano que contiene un constructo de DNA de la invención. En uno de sus aspectos , la invención es considerada al abarcar cualquier versión suprimida del promotor de ADF que proporciona un promotor de planta funcional. Tales promotores son abarcados por el término "promotor de ADF" . Una secuencia será considerada como que proporciona un promotor "funcional" para fines de esta aplicación si la secuencia puede ser substituida por 3056-3790 pb de pDAB 621 o 3962-4694 pb de pDAB625 para producir un constructo que da la expresión de GUS transiente por arriba de los niveles de soporte cuando se prueban como en el Ejemplo 5. Aquéllos expertos en la técnica entenderán que varias supresiones desde la secuencia de 733 pb identificada como el promotor de ADF en SEQ I D NO: 1 puede hacerse sin destruir funcionalidad de la secuencia como un promotor. Los experimentos de supresión están dentro de la habilidad en la técnica . De preferencia, un promotor de ADF de la invención comprenderán 200 pares de bases contiguos que son idénticas a 200 pares de bases contiguos de la secuencia definida por 1 -734 pb de S EQ I D NO: 1 . Más preferible son promotores de ADF que comprenden 500 pares de bases contiguos que son idénticos a 500 pares de bases contiguos de la secuencia definida por 1 -734 pb de SEQ I D ??. ? . De manera sim ilar, la invención cubre versiones suprimidas del intrón de ADF que funcionan para intensificar la expresión cuando se usa con un promotor. El término "intrón de ADF 1 " es pretendida para abarcar tales versiones suprimidas. De preferencia, un intrón 1 de ADF de la invención comprenderá 600 pares de bases contiguos que son idénticos a 600 pares de bases contiguos de la secuencia definida por 882-2161 pb de SEQ I D NO: 1 . Más preferible, son intrones de ADF que comprenden 1000 pares de bases contiguos de la secuencia definida por 882-2161 pb de SEQ I D NO: 1 .

Descripción detallada de la invención El promotor de ADF es usado, de preferencia, en constructos que tienen un intrón incorporado en el lider sin traducir 5' del gene de interés y 3' del promotor. Intrones adecuados incluyen el intrón 1 de ADF, el intrón 1 de Adh 1 , el intrón 1 de Ubiquitin y el intrón 1 de Bronze 2. La secuencia l íder sin traducir usada en constructos de la invención puede ser derivada de cualquier fuente adecuado y puede modificarse de manera especifica para incrementar la traducción del mRNA. La región no traducida 5' puede ser obtenida de la secuencia l íder natural del promotor, la secuencia líder natural del gene o región de codificación a ser expresada, RNAs virales, genes eucarióticos adecuados, o puede ser una secuencia sintético. El gene de interés usado en constructos de la invención puede ser cualquier gene que es deseado para expresar en plantas. Los genes particularmente útiles son aquéllos que confieren tolerancia a herbicidas, insectos o virus, y genes que proporcionan valor nutricional o características de procesamiento de la planta mejorados. Ejemplos de genes agronómicamente útiles adecuados incluyen el gene insecticida de Bacillus thuringiensis para conferir la resistencia de insecto y el gene de 5'-enolpiruvil-3'-fosfoshikimato sintasa (EPSPS) y cualquier variante del mismo para conferir tolerencia a herbicidas de glifosato. Como se entiende fácilmente por los expertos en la técnica, cualquier gene agronómicamente importante que confiera un rasgo deseado puede ser usado. La región 3' UTR o 3' sin traducir, empleada en constructos de la invención, en una que confiere un procesamiento eficiente del mRNA, mantiene estabilidad del mensaje y dirige la adición de ribonucleótidos de adenosina al extremo 3' de la secuencia de mRNA transcrita. La 3' UTR puede ser natural con la región de promotor, natural con el gene estructural, o puede ser derivada de otra fuente. Una amplia variedad de regiones de terminación está disponible que puede obtenerse de genes capaces de expresión en huéspedes de plantas, por ejemplo, genes bacterianos, opine, virales y de plantas. 3' UTRs adecuadas incluyen, pero no están limitadas : 3' UTR de per5 (W098/56219), la 3' UTR del gene de nopalina sintasa (nos), tml 3' o acp 3', por ejemplo.

La presente invención generalmente es aplicable a la expresión de genes estructurales tanto en plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Esta invención es particularmente adecuada para cualquier miembro de la familia de plantas monocotiledóneas (monocot) incluyendo, pero no limitando a, maíz, arroz, cebada, avena, trigo, sorgo, centeno, caña de azúcar, piña, camote, cebolla, plátano, coco y dátiles. Una apllicación preferida de la invención es en la producción de plantas de maíz transgénico. La invención es particularmente aplicable a la familia Graminaceae, en particular a maíz, trigo, arroz, avena, cebada y sorgo. Las especies dicotiledóneas incluyen tabaco, tomate, girasol, algodón, betabel, papa, lechuga, melón, soya y cañóla (semilla de colza). El intrón 1 de ADF pueden usarse con promotores diferentes al promotor de ADF para intensificar la expresión. El promotor usado con intrón 1 de ADF puede ser cualquier promotor adecuado para uso en plantas. El promotor seleccionado debería ser capaz de provocar suficiente expresión de la proteína deseada sola, pero especialmente cuando se usa con intrón 1 de ADF, para resultar en la producción de una cantidad efectiva de la proteína deseada para provocar que las células de plantas y plantas regeneradas a partir de las mismas exhiben las propiedades que son fenotípicamente provocadas por la proteína expresada. Los promotores adecuados pueden ser obtenidos de una variedad de fuentes, tales como, plantas o virus de DNA de planta. Los promotores preferidos son el promotor de ADF, promotor de per5, el promotor de 35T (descrito posteriormente en los Ejemplos 20 y 23), y el promotor de ubiquitina. Los promotores útiles incluyen aquéllos aislados del grupo caulimovirus, tales como el virus de mosaico de coliflor 19S y 35S (eCa V35S) como se describe por Kat et al. (1987) Science 236:1299- 1302 y el promotor de subunidad pequeña de ribulosa 1 ,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa (RUBISCO). Ejemplos de otros promotores adecuados son promotor de actina de arroz; promotor de ciclofilina; promotor de ubiquitina; promotor de ADH1, Cali js et al., supra; promotor de patatina clase I, Bevan et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14 (11), 4675-4638; promotor de ADP glucosa pirofosforilasa; promotor de .bet.-conglicinina, Tiemey et al. (1987) Planta 172: 356-363; promotor de #8, Deikman et al. (1988) Embo J.7 (11) 3315-3320; promotor de 2AII, Pear et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13: 639-651; promotor de ácido quitinasa, Samac et al. (1990) Plant Physiol.93: 907-914. La construcción de un cartucho de gene utilizando el promotor de ADF o intrón 1 de ADF es lograda fácilmente utilizando métodos bien conocidos, tales como aquéllos descritos en Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonación molecular: un manual de laboratorio), 2a edición, Cold Spring; y Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology (Protocolos en biología molecular), John Wiley and Sons, Nueva York, NY. DNA que codifica el promotor de ADF puede prepararse a partir de DNA cromosómico o DNA de origen sintético al usar técicas bien conocidas. El DNA genómico puede ser aislado mediante técnicas estándares. Sambrook et al., (1989); Mullís et al. (1987), Meth. Enz.. 155:355. Horton et al. (1989), Gene, 77:61; Erlich (ed.) (1989). PCR Technology: Principies and Applications for DNA Amplificaron (Tecnología de PCR: principios y aplicaciones para amplificación de DNA) . También es posible preparar secuencias sintéticas mediante síntesis de oligonucleótidos. Ver Caruthers ( 1 983) en: Methodoloqy of DNA and RNA (Metodología de DNA y RNA), (ed.) Weissman, y Beaucage et al. ( 1 981 ) , Terahedron Letters. 22 : 1 859- 1 962). La presente invención también incluye secuencias de DNA que tienen homolog ía de secuencia substancial con las secuencias regulatorias descritas de manera específica, de manera que son capaces de tener el efecto descrito en la expresión . Como se usa en la presente solicitud , el término "homología de secuencia substancial" es usado para indicar que una secuencia de nucleótidos (en el caso de DNA o RNA) o una secuencia de aminoácidos (en el caso de una proteína o polipéptido) exhibe equivalencia substancial, funcional o estructural con otra secuencia de nucleótidos o aminoácidos. Cualquier diferencia funcional o estructural entre secuencias teniendo homolog ía de secuencia substancial será la mínima ; esto es, no afectarán la capacidad de la secuencia para funcionar como se indica en la presente solicitud. Secuencias que tienen homolog ía de secuencia substancial con las secuencias descritas en la presente son usualmente variantes de la secuencia descrita, tales como mutaciones, pero también pueden ser secuencias sintéticas. En la mayoría de los casos, las secuencias que tienen 95% de homología para las secueacias descritas específicamente en la presente, funcionarán como equivalentes, y en muchos casos considerablemente menos homología , por ejemplo 75% u 80% , será aceptable . Ubicar las partes de estas secuencias que no son críticas puede ser lento, pero es rutina y se encuentra dentro de la habilidad en la técnica. Se contempla que las secuencias corresondientes a las secuencias antes notadas pueden contener una o más modificaciones en las secuencias del tipo natural, pero todavía harán los elementos respectivos comparables con respecto a las enseñanzas de esta invención. Por ejemplo, como se nota antes, pueden usarse fragmentos. Uno puede incorporar modificaciones en las secuencias aisladas incluyendo la adición, supresión o substitución no conservadora de un número limitado de varios nucleótidos o la substitución conservadora de muchos nucleótidos. Además, la construcción de tales moléculas de DNA pueden emplear fuentes, las cuales se ha mostrado que confieren intensificación de expresión de genes heterólogos colocados bajo su control regulatorio. Técnicas ejemplares para modificar secuencias de oligonucleótidos incluyen usar mutgénesis de sitio dirigido, mediada por polinucleótidos. Ver Zoller et al. (1984), DNA, 3:479; Higuchi et al. (1988), Nucí. Acids Res.. 16:7351-7367; Horton et al. (1989), Gene. 77:61; y PCT Technology: Principies and Applications for DNA Amplificatíon (Tecnología de PCT: principios y aplicaciones para amplificación de DNA), (ed) Eriich (1989). Tecnologías convencionales para introducir material biológico en células huéspedes incluyen electroporación (ver Shígekawa y Dower (1988), Biotechniques, 6:742; iller, et al. (1988), Proc. Nati. Acad. Sci, USA, 85:856-860; Powell, et al (1988), Appl. Environ. Microbiol. , 54:655-660); mecanismos de captación de DNA directa (ver Mandel y Higa (1972), J. Mol. Biol. , 53:159-162; Dityatkin, et al. (1972), Biochimica et Biophysica Acta, 281:319-323; Wigler, et al. (1979), Cell, 16:77; y Uchimiya, et al, (1982), En: Proc. 5th Intl. Cong. Plant Tissue and Cell Culture, A. Fujiwara (ed.), Jap. Assoc. For Plant Tissue Culture, Tokio, pp. 507-508); mecanismos de fusión (ver Uchidaz, et al. (1980), En: Introduction of Macromolecules Into Viable Mammalian Cells (Introducción de macromoléculas en células de mamífero viables), Baserga et al. (eds.) Wistar Symposium Series, 1:169-185); agentes infecciosos (ver Fraley, et al. (1986), CRC Crit. Rev. Plant Sci., 4:1-46); y Anderson (1984), Science, 226:401-409); mecanismos de microinyección (ver Crossway, et al. (1986), Mol. Gen. Genet., 202:179-185); y mecanismos de proyectiles de alta velocidad (ver EPO 0 405 696 para Miller, Schuchardt, Skokut y Gould, (The Dow Chemical Company). El procedimiento apropiado para transformar una célula huésped seleccionada puede ser elegido de acuerdo con la célula huésped usada. Con base en la experiencia hasta la fecha, parece haber poca diferencia en la expresión de genes, una vez insertados en las células, atribuibles al método de transformación por sí mismo. Una vez introducido en el tejido de planta, la expresión del gene estructural puede ser ensayada en un sistema de expresión transiente, o puede ser determinada después de la selección para integración estable dentro del genoma de la planta. Las técnicas son conocidas para el cultivo in vitro de tejido de planta y en un número de casos para regeneración en plantas completas. El procedimiento apropiado para producir plantas transgénicas maduras puede ser elegido de acuerdo con la especie de planta usada. La regeneración varía de especie a especie de plantas. La regeneración eficiente dependerá del medio, del genotipo y de la historia del cultivo. Una vez que se han obtenido plantas enteras, pueden ser reproducidas sexual o clonalmente en tal manera que al menos una copia de la secuencia esté presente en las células de la progenie de la reproducción. Las sem illas de las plantas regeneradas pueden ser recolectadas para uso futuro y pueden hacerse crecer plantas a partir de estas semillas. Los procedimientos para transferir el gene introducido desde la planta originalmente transformada en cultivos comercialmente útiles son conocidos para aquéllos expertos en la técnica. En los siguientes ejemplos , todas las manipulaciones de biolog ía molecular se hicieron de acuerdo con procedimientos descritos en Molecular Cloning : A Laboratory Manual (Clonación molecular: un manual de laboratorio) (Maniatis, T. , Fritsch , E. F. , Sambrook, J . , 1 982, Cold Spring Harbor Laboratory).

Ejemplo 1 Secuencia de flanqueo 5' de ADF Se aislaron las secuencias de flanqueo 5' del gene de factor despolimerizante de actina (Zmbap3) a partir de DNA genómico de maíz, var. OQ414 (línea de propietario Dow AgroSciences) . Se logró la secuenciación de DNA usando el conjunto ABI Prism DNA Sequencing con AmpliTaq® Polymerase FS como se describe por el fabricante (Perkin Elmer/Applied Biosystems División , Foster City, CA) . Reacciones de secuenciación se hicieron correr en un secuenciador de DNA Applied Biosystem 373A (Perkin Elmer/Applied Biosystems División) .

La secuencia de flanqueo 5' de ADF se comparó con la secuencia de cDNA publicada y se encontró que difieren debido a la presencia de un intrón inmediatamente 30 al codón de inicio ATG. La siguiente tabla indica las características del producto de PCR AP2/BC294 (SEQ ID NO:1): CARACTERISTICAS DE PRODUCTO DE PCR AP2/BC294 Las primeras dos y las últimas dos bases del intrón son secuencias de sitio de empalme de intrón de consenso internas al intrón. Las secuencias justo fuera del intrón también son casi de consenso. En los siguientes ejemplos, el promotor de ADF e intrón de ADF fueron evaluados usando vectores de expresión basados en el plásmido pDAB305. pDAB305 es un plásmido de 5796 pb que aloja un promotor conteniendo copia en tándem del intensificador de virus de mosaico de cliflor 35S (35S), una versión suprimida del inrón 1 de Adh1 y el líder sin traducir de la proteína de recubrimiento de virus de mosaico rayado de maíz fusionado con el gene uidA, el cual es seguido entonces por 3'UTR nos. La secuencia para pDAB305 está dada en SEQ ID NO:2. Las características de la secuencia son descritas en la siguiente tabla. Características de pDAB 305 Ejemplo 2 Construcción de pDAB620 El plásmido pDAB620 es esencialmente pDAB305, pero con el promotor de ADF reemplazando el promotor intensificado doble 35S de CaMV y el l íder de intrón 1 de ADH/intrón de MSV. Para clonar el promotor de ADF sin un intrón detrás de la región de codificación de GUS, el promotor de ADF fue amplificado con los iniciadores diseñados para adicionar un sitio 5' H ind I I I y un sitio 3' Neo I . Se realizaron ampl ificaciones de PCR usando 7 ng de DNA de plantilla (SEQ I D NO: 1 clonada en el vector PCR®2. 1 -Topo) , amortiguador de PCR GeneAmp® 10 x (Perkin Elmer/Applied Biosystems División) , 50 picomoles de cada iniciador, y 5 unidades de polimerasa AmpliTaq Gold R (Perkin Elmer/Applied Biosystems División) en un volumen total de 1 00 ul. Las amplificaciones fueron realizadas usando el GeneAmp® PCR System 9600 (PE/ABI) usando las siguientes condiciones de ciclo: 96°C 1 0 minutos, 94°C, 1 minuto, 55°C 2 minutos, 72°C 3 minutos, 20 ciclos, seguido por una extensión de 72°C durante 7 min utos. El producto de PCR de 9056 pb resultante se clonó en PCR®2. 1 -Topo (I nvitrogen) . Se seleccionaron colonias individuales para extracción de DNA y secuenciación como se describe antes. Para clonar el promotor de ADF en pDAB305, el fragmento de promotor de ADF fue aislado de los clones de PCR®2.1 -Topo recombinantes (Invitrogen) como un fragmento de Hind I I I y Neo I mediante digestión con enzimas de restricción de Neo I y Hind I I I (New England Biolabs, Inc. , Beverly, MA). El fragmento de ADF fue purificado en un gel de agarosa preparatorio y el DNA fue extraído usando GenElute Agarose Spin Columns (Supelco, I nc. , Bellefonte, PA) . Se preparó plásmido pDAB305 mediante digestión con Hind I I I y Neo I (New England Biolabs) para separar el promotor e intrón existente. El plásmido digerido se corrió en un gel de agarosa preparador (FMC) , el fragmento se cortó del gel y el DNA extra ído de la agarosa usando GenElute Agarose Spin Columns (Supelco, Inc.) - El fragmento de promotor Hínd l l l/Nco I de ADF se combinó con el vector pDAB305 suprim ido y se ligó usando el conjunto Rapid DNA Ligation (Roche Diagnostics anteriormente Boehringer Mannheim , I ndianapolis, I N) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Células Efficiency DH5ocM R Competent de subclonación (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) fueron transformadas con la mecía de ligación de acuerdo con el protocolo incl uido con las células , se platinaron en medio LB conteniendo 75 ug/ml de ampicilina. Las placas se incubaron durante la noche a 37°C. Colonias individuales se seleccionaron para extracción de DNA y secuenciación de DNA como se describe. Esos plásmidos que contenían el fragmento de promotor de ADF reemplazando el fragmento de promotor de CaMV/intrón 1 de ADH/líder de MSV se llamaron pDAB620. Características de pDAB620 Ejemplo 3 Construcción de PDAB621 El plásmido pDAB621 difiere de pDAB620 del Ejemplo 2 porque contiene el l íder de intrón ADH/MSV inmediatamente 3' al promotor de ADF . Para clonar el promotor de ADF en frente del líder de intrón I de ADH/MSV modificado, se diseñaron iniciadores para incorporar un sitio Hind I I I y un sitio Bam H I sobre el extremo 5' y 3' del promotor de ADF, respectivamente, usando la amplificación de PCR. La amplificación de PCR del promotor de ADF se realizó usando un cilcilzador de temperatura Robocycler® Gradient 96 (Stratagene) usando las siguientes condiciones: 70 ng de DNA (SEQ I D NO: 1 ) clonados en el vector PCR®2. 1 -Topo, 1 5 ul 3.3x XL amortiguador I I del conjunto GeneAmp® XL PCR (Perkin elmer/Applied Biosystems División) , 50 picomoles de cada iniciador, 1 m de acetato de mag nesio, 0.2 m M de cada dNTP, 1 .5 ul de rTth DNA polimerasa (Perkin Elmer/Applied Biosystems División). El producto se clonó en el PCR®2. 1 Topo (I nvitrogen). Las colonias individuales fueron seleccionadas y se extrajo DNA usando un método de lisis alcalina. El fragmento de ADF se purificó en un gel de agarosa preparatorio y el DNA se extrajo usando GenElute Agarose Spin Columns (Supelco, Inc. ). Para clonar el promotor de ADF en pDAB305, el promotor de ADF fue aislado de los clones PCR® 2. 1 -Topo recombinantes (I nvitrogen) como un fragmento Hind I I I y BamH I . El plásmido pDAB305 fue preparado mediante digestión con H ind I I I y Bam HI (NEB) para separar el promotor existente. El fragmento de promotor de Hind l l l/Bam H I de ADF fue combinado con el pDAB305 sumprimido y ligado usando el conjunto Rapid DNA Ligation (Roche Diagnostics anteriormente Boehringer Mannheim, I ndianapolis, IN). Células Efficiency DH5aM R Competent de subclonación (Gibco/BRL) fueron transformadas con la mezcla de ligación y las células se platinaron en medio LB conteniendo 75 ug/ml de ampicilina. Las placas fueron incubadas durante la noche a 37°C. Se seleccionaron colonias individuales para extracción de DNA y secuenciación de DNA como se describe . Esos plásmidos, los cuales conten ían el framgento promotor de ADF reemplazando el promotor de CaMV fueron llamados pDAB621 .

Características de pDAB621 Ejemplo 4 Construcción de pDAB625 El plásmido pDAB625 difiere del plásmido pDAB620 esencialmente porque el intrón 1 de ADF es clonado inmediatamente 3' al promotor ADF. Para crear el vector de promotor de ADF/intrón de ADF, las secuencias de promotor e intrón se fusionaron usando una estrategia de extensión de traslape de empalme de PCR (PCR Protocols: A Guide to ethods and Applications (Protocolos de PCR: una guía para métodos y aplicaciones), ed. Innis, M.; Gelfand, D.; Sninsky, J.; White, T., 1990, Academic Press). El promotor de ADF el intrón de ADF fueron amplificados en reacciones preparadas usando iniciadores adecuados. Las condiciones de reacción fueron como sigue: 10 ng de DNA de plantilla (SEQ ID NO:1 clonadas en vector PCR® 2.1-Topo), 10 ul de amortiguador GeneAmp® 10x PCR (PE/ABI), 100 pmoles de cada iniciador, 5 unidades de AmpliTaq GoldMR Polymerase (PE/ABI) en un volumen de 100 ul. El ciclizado se hizo en un termociclizador GeneAmp® PCR System 9600 programado con el siguiente perfil: 95°C 10 minutos, (94°C 30 s, 60°C 30 s, 72°C 1 min) durante 15 ciclos, 72°C durante 5 minutos. El fragmento de promotor y el producto de intrón se fusionaron en una reacción de PCR, los cuales contenían los siguientes componentes: 50 ng de cada producto de PCR, 30 ul de amortiguador 3.3x XL (PE/ABI), 4 ul de acetato de magnesio 25 mM, 10 ul de dNTPs 2 mM, 100 pmoles de cada iniciador, 6 unidades de rTth DNA Polymerase (PE/ABI) en un volumen final de 50 ul. Las reacciones se realizaron en un ciclizador de temperatura RoboCycler® Gradiente 96 (Stratagene) usando el siguiente perfil de ciclizado: 94°C 1 minuto, [94°C 30 s, 70°C 4 minutos] x 20 ciclos, 72°C 10 minutos. El producto de PCR de 2184 pb resultante en un gel de agarosa preparatorio (FMC). El fragmento se cortó y se extrajo DNA usando GenElute Agarose Spin Columns (Supelco, INC.). El fragmento de 2184 pb se amontonó en otra reacción de PCR, y el producto de esta reacción se clonó en PCR® 2.1-Topo (Invitrogen). Se seleccionaron colonias individuales para extracción y secuenciación de DNA como se describe antes. Para clonar la fusión de promotor de ADF/intrón de ADF en pDAB305, el producto de fusión se aisló de los clones de PCR® 2.1-Topo recombinante (Invitrogen) como un fragmento Hind III y Ncol por digestión con enzimas de restricción Hind III y Ncol (New England Biolabs Inc.)- Se preparó plásmido pDAB305 mediante digestión con Hind III y Ncol (NEB) para separar el promotor e intrón/líder existentes. El fragmento de promotor ADF/intrón ADF/promotor Hind lll/NcOI se combinó con pDAB305 suprimido de Hind lll/Nco I y se ligó usando el conjunto Rapid DNA Ligation (Roche Diagnostics anteriormente Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Células Efficiency DH5aMR Competent de subclonación (Gibco/BRL) se transformaron con la mezcla de ligación y se platinaron células en medio LB conteniendo 75 ug/ml de ampicilina. Las placas se incubaron durante la noche a 37°C. Se seleccionaron colonias individuales para extracción de DNA y secuenciación de DNA como se describe. Esos plásmidos que contenían el fragmento de promotor de ADF/intrón de ADF reemplazando el promotor de Ca V/intrón de ADH fueron llamados pDAB625.

Características de pDAB625 Ejemplo 5 Prueba transiente de constructos de ADF-GUS Los cultivos de callo tipo II fueron iniciados a partir de embriones cigóticos inmaduros del genotipo "Hi-ll" (Armstrong et al. (191) Maize Genet. Cop. News Lett. 65:92-93). Los embriones fueron aislados de mazorcas crecidas en invernadero de cruzas entre padre Hi-ll A y padre Hi-ll B o embriones F2 derivados de una auto- o sib-polinización de una planta Hi-ll. Embriones inmaduros (1.5 a 3.5 mm) fueron cultivados en medio de iniciación de callo 15Ag10 consistiendo de sales N6 y vitaminas (Chu et al., (1978) The N6 médium and its application to another culture of cereal crops (El medio N6 y su aplicación a otro cultivo de cosechas de cereales) Proc. Symp. Plant tissue culture, Peking Press, 43-56) , 1 .0 mg/l 2 ,4-D, 25mM L-prolina , 1 00 mg/l hidrolisado de caseína, 1 0 mg/l de AgN03> 2.5 g/l de GELRITE (Schweizerhall , South Plainfield, NJ) y 20 g/l de sacarosa, con un pH de 5.8. Después de cuatro a seis semanas, se subcultivó el callo sobre medio de mantenimiento (medio de iniciación en el cual se omitió Ag N03 y la L-prolina se redujo a 6 mM) . La selección para callo tipo I I tuvo lugar aproximadamente 1 2- 16 semanas. Cada uno de los constructos GUS de prueba fue co-precipitado sobre partículas de oro con pDeLux (conteniendo un promotor modificado 35S que impulsa luciferasa con 3' UTR Nos) de acuerdo con el protocolo. Cantidades molares iguales de los plásmidos GUS fueron usadas. Un total de 70 µg de DNA, 35 µg de pDeLux más 35 µg de DNA de prueba y BluescriptMR DNA (Stratagene, La Jolla, CA) cuando fue necesario, se diluyeron en agua estéril a un volumen de 1 50 µ? . El DNA y el agua se adicionaron a 30 mg de partículas de oro esféricas de 1 .0 µ?? esterilizadas en la superficie (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) . La mezcla se agitó vortiginosamente de manera breve (aproximadamente 1 5 segundos) antes de adicionar 37 µ? de cloruro de calcio 2.5 M y 1 5 µ? de espermidina 0.1 M (libre de bases). Después de agitar vortiginosamente durante 30 segundos, se permitió que el DNA y el oro se precipitaran de la solución. El sobrenadante se removió y se adicionó 1 mi de etanol. La mezcla de DNA/oro se diluyó 1 :4 antes de usarse para transformación. El callo tipo I I se pretrató en medio osmótico durante aproximadamente 1 6 horas. El medio osmótico consistió de medio de mantenimiento con sorbitol 0.2 M y manitol 0.2 M . Posteriormente, el callo se colocó en placas de 60 x 20 mm de medio osmótico solidificado con 2% de agar para bombardeo de helio. Jaulas de pantalla de malla de 104 µ?? cubrieron cada objetivo (500-600 mg de callo) para prevenir salpicaduras y pérdida de tejido. Los objetivos fueron bombardeados individualmente con mezcla de DNA/oro usando el Dow AgroSciences Helium Blast Device 1 .0 (patente estadounidense no. 5, 141 , 1 31 ) . Bajo un vacío parcial de 6.2275 kPa, a una distancia de disparo de 1 0 cm y presión de 1 05.45 kg/cm2, la mezcla de DNA/oro se aceleró hacia cada objetivo cuatro veces, entregando 20 µ? por disparo. Los objetivos fueron girados 1 80° después de cada bombardeo. El tejido también se mezcló a la mitad a través del procedimiento para exponer el callo no bombardeado. Sobre la terminación del bombardeo , los objetivos fueron colocados sobre el medio osmótico original durante la incubación durante la noche a 26°C en la obscuridad . Se seleccionaron cuatro líneas de células de callos tipo I I para cada experimento. Se usaron dos objetivos de cada línea por constructo. Además, dos controles no transformados (NTC) compuestos de tejido depositado de las cuatro líneas se incluyeron . Los controles se transfirieron a medios osmóticos y bmbardeo de acuerdo con el protocolo anterior, pero no fueron sometidos a bombardeo de helio. Aproximadamente 20 horas después de bombardeo, 200-400 mg de cada objetivo se transfirieron a un tubo de muestra de 1 .5 mi (Kontes, Vineland , NJ) . Para extracción de proteínas, el callo fue homogeneizado usando un triturador de pellas Kontes de acero inoxidable energizado por un motor de 0.35 amp, 40 Watt (modelo 102, Rae Corporation , Mchenry, I L) a un ajuste de "90" . El reactivo de lisis de cultivo celular de un conjunto de Luciferase Assay (Promega, Madison, Wl) sirvió como el amortiguador de extracción . Los inhibidores de proteasa , fluoruro de fenilmetilsufonilo (PMSF) y sal de hemisulfato de leupeptina, se adicionaron al amortiguador de lisis en las concentraciones de 1 mM y 50 µ? , respectivamente. Antes de la molienda, se adicionaron 0.5 µ? de amortiguador de lisis por mg de tejido al tubo de muestra . El callo fue homogeneizado en cuatro intervalos de 25 segundos con una incubación de 1 0 segundos en hielo sigu iendo cada periodo de molienda. Posteriormente, 1 .0 µ? de amortig uador de lisis por mg de tejido se adicionó a la muestra, el cual se colocó en hielo hasta que se completó la molienda de muestra . Las muestras fueron centrifugadas entonces dos veces a 5°C durante 7 minutos a velocidad completa (centrífuga Eppendorf modelo 5414) . Después de la primera centrifugación, el sobrenadante de cada tubo se removió y la pella fue desechada. El extractos de callos (sobrenadantes) también fueron recolectados después de la segunda centrifugación y se mantenía en hielo para análisis GUS y LUC . Del conjunto LUC Assay, el amortiguador LUC Assay se preparó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este amortiguador se calentó a temperatura ambiente y se cargó en la bomba dispensadora de un fotómetro de luminiscencia automático (luminómetro modelo 1 251 y dispensador modelo 1 291 , Bio-Orbit, Finlandia) . Cada muestra se probó por triplicado al adicionar 20 µ? de extracto a tres frascos de luminómetro de polipropileno (Wallac, Gaithersburg , MD) . Por frasco, 100 µ? de amortiguador de ensayo se dispensaron y se detectó la luminiscencia sobre un periodo de integración de 45 segundos. "Reacciones de blanco", incluyendo 20 µ? de amortiguador de extracción en lugar de extracto de callo , también se midieron dentro de cada experimento. Para análisis de actividad GUS, se usó el conjunto de ensayo GUS-Lig ht R (Tropix, Bedford, MA) . Nuevamente, cada uestra se probó por triplicado, usando 20 µ? de extracto por frasco de luminómetro. Se preparó amortiguador de reacción GUS-LightM R del conjunto de ensayo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este amortiguador se calentó a temperatura ambiente y se adicionó en alícuotas de 1 80 µ? a cada frasco de luminómetro a intervalos de 10 segundos. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, se adicionaron 300 µ? de amortiguador GUS-LightM R Light Emission Accelerator y se detectó la luminiscencia sobre un periodo de integración de 5 segundos . También se incluyeron "reacciones de blanco" en el ensayo GUS , usando 20 µ? de amortigaudor de extracción en lugar de extracto de callo. Los resultados de GUS y LUC se reportaron en un idades de luz relativas (RLU). Ambas lecturas de "blanco" y NTC se restaron de los niveles de RLU de la muestra. Para comparación de un constructo de GUS a otro, las lecturas de GUS se normalizaron a los datos de LUC usando las raíces cuadradas de cada uno para calcular una proporción de GUS/LUC para cada muestra probada . Las proporciones para todas las muestras por constructo se promediaron entonces y los promedios fueron comparados usando una prueba T para análisis de significancia estadística. Un constructo de promotor 35S modificado (35T)/GUS/Nos poli A (pDAB305) se usó como un control en cada experimento. Los niveles de expresión de ocnstructo de prueba fueron reportados como un porcentaje de actividad pDAB305. El plásmido pDAB620 no demostró expresión alguna sobre soporte, en relación al control 35T. Sin embargo, en experimentos repetidos pDAB621 y pDAB625 promediaron 62% y 82% del estándar, respectivamente. pDAB621 se expresó consistentemente a niveles significativamente menores que el control . Mientras que , pDAB625 resultó en la expresión que fue un tanto más variable y en algunos casos probó ser tan buena como pDAB305.

Ejemplo 6 Expresión estable en maíz La actividad de promotor de ADF fue caracterizada por la frecuencia de formación de callo de tejido de maíz transformado con plásmido pDAB630 (promotor de ADF/intrón de ADF/PAT/nosA) en la presencia de medio conteniendo un agente selectivo. Los casos de ma íz transgénico conteniendo PAT bajo control del promotor de actina de arroz también fueron producidos para servir como controles internos. En un total de 1 5 experimentos lado-a-lado, el constructo de ADF ya sea se desempeñó tan bien como o sobredesempeñó el constructo de promotor de actina de arroz con respecto a la recuperación de aislados resistentes a herbicidas. El análisis southern confirmó la presencia del gene PAT en todos los casos de ADF producidos.

Ejemplo 7 Maíz transgénico Las plantas transgénicas de dos casos transformados con plásmido pDAB625 se analizaron para expresión de GUS en tejido de hojas. En ensayos cuantitativos, se observaron niveles de GUS equivalentes a 0.02% de proteína extraíble total.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Rubin-Wilson, Beth Smith, Kelley A <120> PROMOTOR E INTRON DE FACTOR DESPOLIMERIZANTE DE ACTINA DE MAIZ <130> 50695 <140> <141> <150> US 60/167,111 <151 > 1999-11-23 <160> 2 <170> Patente en liberación Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2253 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: producto de PCR AP2/BC294 <400> 1 cgcccgggca ggtaaatagc aagtgatttt ctc ctatgg attecateta ttttcctggc 60 caccaaacta gcctraagat tgttttgtc tggatagcac aaaaattgtc catcttgctt 120 gcacccataa caczgccttg aacagaagat gca gattac ctgcatgcat tgaaegacat 180 accagataag tgccaccagt accacaaact tacatctcgg agacacetta ctatatgatt 240 tatgttgtca caacatacag gtattatact cae- .cttag agttgtattt ttatattcgt 300 attgtagtgt aat tgattt gtattagttt agt ctgtat tggttgtttc taaaaaaatc 360 gttagattat atcgataata tatgtggtat tc .-tttac gtaatcattg tgeactaaca 420 ttttgttgaa tata.tatat accgt gcaa cg acgggca cccaactagt tat eatta 480 tt tcccagg acg -cattc cgaaa ctct t gcggaga agaaaacgaa cgaaagatca 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gcttcataac tt 2253 <210> 2 <211> 5796 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <221> Descripción de secuencia artificial: pDAB305 <400> 2 tcgcgcgtt cggtgatgac ggtgaaaacc tc-gacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtcz gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagatcgta ctgagagtgc 180 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcg aaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240 attcgcca" caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tct cgctat 300 tacgccagc ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cccgatctag taacatagat 420 gacaccgcgc gcgacaattt atcctagttt gcgcsctata ¦ ttttgttttc tatcgcgtat 480 taaatgtata attgcgggac tctaatcata aaaacccatc tcataaataa cgtcatgcat 540 tacatgttaa ttattacatg cttaacgtaa tt aacagaa attatatgat aatcatcgca 600 agaccggcaa caggattcaa tcttaagaaa ctt attgcc aaatgtttga acgatcgggg 660 aaattcgagc tctccaattc cccaccgagg ct agccga cgatggtgcg ccaggagagt 720 tgttgattca ttgtttgcct 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Claims (14)

REIVINDICACIONES

1 . U na molécula de DNA aislada comprendiendo un promotor de ADF.

2. Una molécula de DNA aislada comprendiendo pares de bases 1 -734 de SEQ I D NO.1 , o un fragmento, variante genética o supresión de tal secuencia, que retiene la capacidad de funcionar como un promotor en células de plantas.

3. Un fragmento, variante genética o supresión de la molécula de la reivindicación 2, que comprende al menos 200 pares de bases consecutivos idénticos a 200 pares de bases consecutivos de la secuencia definida por pares de bases 1 -734 de SEQ I D NO: 1 .

4. Una molécula de DNA aislada teniendo una porción de nucleótidos de 20 pares de bases idéntica en la secuencia a una porción de 20 pares de bases consecutivos de la secuencia expuesta en los pares de bases 1 -734 de SEQ I D NO: 1 .

5. Una molécula de DNA aislda comprendiendo un intrón 1 de ADF.

6. Una molécula de DNA aislada que comprende 882-2161 pares de bases de SEQ I D NO: 1 , o un fragmento, variante genética o supresión de tal secuencia , la cual retiene la capacidad de intensificar la expresión cuando se usa con un promotor en células de plantas.

7. Un fragmento, variante genética o supresión de la molécula de la reivindicación 6, que comprende al menos 600 pares de bases consecutivos idénticos a 600 pares de bases consecutivos de la secuencia definida por los pares de bases 882-21 61 de SEQ I D NO: 1 .

8. Una molécula de DNA aislada teniendo una porción de nucleótidos de 20 pares de bases idéntica en la secuencia a una porción de 20 pares de bases consecutivos de la secuencia expuesta en los pares de bases 882-2161 de SEQ ID NO:1.

9. Un constructo de DNA comprendiendo un promotor enlazado operablemente a una secuencia de ácido nucleico heteróloga, en donde el promotor híbrida selectivamente a la SEQ ID NO:1.

10. Un constructo de DNA de la reividicación 9, en donde el promotor comprende (a) pares de bases 1-734 de SEQ ID NO:1, o (b) al menos 200 pares de bases consecutivos idénticos a 200 pares de bases consecutivos de la secuencia definida por las pares de bases 1-734 de SEQ ID NO:1, o (c) una porción de nucleótidos de 20 pares de bases idéntica en secuencia a una porción de 20 pares de bases consecutivos de la secuencia expuesta en los pares de bases 1-734 de SEQ ID NO.1.

11. Un constructo de DNA que comprende un intrón enlazado a una secuencia de ácido nucleico heteróloga, en donde dicho intrón híbrida selectivamente a SEQ ID NO:1.

12. Una planta transformada que comprende al menos una célula de planta que contiene un constructo de DNA de la reivindicación 9.

13. Una planta transformada que comprende al menos una célula de planta que contiene un constructo de DNA de la reivindicación 11.

14. Una semilla o grano que comprende un constructo de DNA de la reivindicación 9. 1 5. La semilla o g rano que comprende un constructo de DNA de la reivindicación 1 1 . 16. Un método para expresar una secuencia de ácido nucleico heterologa en una planta , que comprende: a) introducir en una célula de planta un vector que comprende un promotor de ADF operablemente enlazado a la secuencia de ácido nucleico heterologa; y b) regenerar una planta a partir de dicha célula. 1 7. Un método para producir sem il la q ue comprende: a) introducir en una célula de planta un vector que comprende un promotor de ADF operablemente enlazado a la secuencia de ácido nucleico heterologa; b) regenerar una planta a partir de dicha célula; y c) transmitir sexualmente dicho promotor de ADF operablemente enlazado a dicha secuencia de ácido nucleico heterologa a la progenie. 1 8. El método para producir semilla de la reivindicación 1 7, incluyendo el paso adicional de recolectar la semilla producida por dicha progenie. . ,,