DE60031165T2

DE60031165T2 - Promoter und intron des aktin depolymerizing factor aus mais

Info

Publication number: DE60031165T2
Application number: DE60031165T
Authority: DE
Inventors: Beth Indianapolis RUBIN-WILSON; A. Kelley Lebanon SMITH
Original assignee: Dow AgroSciences LLC
Current assignee: Corteva Agriscience LLC
Priority date: 1999-11-23
Filing date: 2000-11-22
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2020-11-23
Also published as: WO2001038518A1; EP1242595B1; AU1798201A; ES2269207T3; DK1242595T3; JP4911850B2; EP1242595A1; BR0015784A; MXPA02005193A; ATE341623T1; AR026577A1; US20030213009A1; BRPI0015784B1; CA2394792C; CA2394792A1; DE60031165D1; CN1409762A; US7071385B2; JP2003519474A

Description

Bereich der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die gentechnische Entwicklung von Pflanzen. Die Erfindung liefert DNA-Sequenzen und Konstrukte, die geeignet sind zum Steuern der Expression von rekombinanten Genen in Pflanzen. Im Spezielleren liefert die Erfindung neue Regulationssequenzen, die von Actindepolymerisierungsfaktor (ADF) aus Mais abgeleitet sind.
Hintergrund der Erfindung
Pflanzengentechnikprojekte erfordern einen Zugang zu einer Vielzahl von genetischen Elementen, die verwendet werden zum Steuern bzw. Regulieren der Transgenexpression. Zwei Beispiele solcher genetischer Elemente sind Promotoren und Introns.
Die Initiierung der Transkription wird reguliert durch einen Promotor. Ein gegebenes Projekt erfordert typischerweise die Verwendung mehrerer verschiedener Promotoren. Ein Promotor wird verwendet werden, um das Gen, das von Interesse ist, zu steuern und ein anderer wird z.B. verwendet zum Steuern des selektierbaren Markers.
Ein eukaryotisches Gen ist üblicherweise unterbrochen durch nichtcodierende Sequenzen, die als Introns bezeichnet werden. Das Anfangstranskriptionsprodukt eines eukaryotischen Gens ist prä-mRNA, welche Sequenzen umfasst, die den Introns entsprechen. Die Introns werden während des post-Transkriptionsprozessierens entfernt, um die mRNA bereitzustellen, die translatiert wird, um ein Protein zu produzieren. Studien, die die Rolle von Introns bei der Regulierung der Genexpression charakterisieren, haben gezeigt, dass das erste Intron des Alkoholdehydrogenasegens aus Mais (Adh-1) die Fähigkeit aufweist zum Erhöhen der Expression unter Anaerobiose. Callis J., M. Fromm und V. Walbot (1987), Gene Dev. 1: 1183–1200. Das Intron stimuliert auch Expression (zu einem geringeren Ausmaß) beim Fehlen von Anaerobiose. Es wird angenommen, dass diese Verstärkung ein Ergebnis einer Stabilisierung der prä-mRNA in dem Kern ist. Mascarenhas et al. berichteten von einer 12-fachen und 20-fachen Verstärkung der CAT-Expression durch Verwendung des Adh-1-Introns. Mascarenhas et al., „Intron-Mediated Enhancement of Heterologous Gene Expression in Maize", Plant Molecular Biology, 15: 913–920, 1990. Mehrere andere Introns sind aus Mais und anderen Monokotyledonen identifiziert worden, die Genexpression erhöhen. Vain, P. et al. (1996), Plant Cell Reports 15: 489–494. Siehe auch WO98/5921.
Die cDNA-Sequenz für Mais-ADF ist bekannt (GenBank, Hinterlegungsnummer X97726), jedoch ist die Genom-ADF-Sequenz nicht veröffentlicht worden. Im Speziellen ist die Sequenz für den ADF-Promotor bisher weder veröffentlicht worden noch sind ADF-Introns identifiziert worden.
Kurze Beschreibung der Sequenzen

SEQ ID NR: 1 ist die DNA-Sequenz für das AP2/BC294-PCR-Produkt, einschließlich der Sequenz für den ADF-Promotor und ADF-Intron 1.
SEQ ID NR: 2 ist die DNA-Sequenz für pDAB305.

Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung liefert ein Nukleinsäuresäurekonstrukt oder ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend die Basen 1 bis 734 von SEQ ID NR: 1 und ein Intron, das geeignet ist zum Verstärken der Expression oder umfassend einen Promotor, der geeignet ist zur Verwendung in Pflanzen, und die Basen 882 bis 2161 von SEQ ID NR: 1.
Unter einem anderen ihrer Aspekte liefert die Erfindung ein Nukleinsäurekonstrukt, umfassend, operativ verbunden in der 5'-3'-Richtung

a) einen Mais-ADF-Promotor, umfassend die Basen 1 bis 734 von SEQ ID NR: 1;
b) eine nicht-translatierte Leadersequenz bzw. Leitsequenz;
c) ein Intron, das geeignet ist zum Verstärken der Expression;
d) ein interessierendes Gen; und
e) ein 3'UTR.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Intron ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Adh1-Intron 1 und ADF-Intron 1 (bp 882–2161 von SEQ ID NR: 1).
Unter einem anderen ihrer Aspekte liefert die Erfindung ein Nukleinsäurekonstrukt, umfassend in der 5'-3'-Richtung

a) einen in Pflanzen funktionalen Promotor;
b) eine nicht-translatierte Leitsequenz;
c) ADF-Intron 1, umfassend die Basen 882 bis 2161 von SEQ ID NR: 1;
d) eine Klonierungsstelle;
e) ein 3'UTR.

Unter einem anderen ihrer Aspekte liefert die Erfindung ein Plasmid, umfassend einen Mais-ADF-Promotor, umfassend bp 1–878 von SEQ ID NR: 1 und ein Intron, das geeignet ist zur Verstärkung der Expression, oder die Mais-ADF-Intron 1-Sequenz bp 882–2161 von SEQ ID NR: 1 und einen Promotor, der geeignet ist zur Verwendung in Pflanzen.
Unter einem anderen ihrer Aspekte liefert die Erfindung eine transformierte Pflanze, umfassend mindestens eine Pflanzenzelle, die ein Nukleinsäurekonstrukt der Erfindung enthält. Die Pflanze kann eine Monokotyledone oder Dikotyledone sein. Bevorzugte Pflanzen sind Mais, Reis, Baumwolle und Tabak.
Unter einem anderen ihrer Aspekte liefert die Erfindung Samen oder Korn, der/das ein Nukleinsäurekonstrukt der Erfindung enthält.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Der ADF-Promotor wird in Konstrukten verwendet, die ein Intron aufweisen, das geeignet ist zur Verstärkung der Expression und das vorzugsweise in den nichttranslatierten Leader bzw. die nichttranslatierte Leitsequenz 5' zum interessierenden Gen und 3' zum Promotor eingebaut ist. Geeignete Introns enthalten das ADF-Intron 1, Adh1-Intron 1, Ubiquitin-Intron 1 und Bronze 2-Intron 1.
Die nicht-translatierte Leitsequenz, die in Konstrukten der Erfindung verwendet wird, kann abgeleitet sein von einer geeigneten Quelle oder kann spezifisch modifiziert sein, um die Translation der mRNA zu erhöhen. Die 5'-nicht-translatierte Region kann erhalten werden aus der nativen Leitsequenz des Promotors, der nativen Leitsequenz des Gens oder der zu exprimierenden Codierungsregion, viralen RNAs, geeigneten eukaryotischen Genen oder kann eine synthetische Sequenz sein.
Das interessierende Gen, das in Konstrukten der Erfindung verwendet wird, kann jedes Gen sein, von dem gewünscht ist, es in Pflanzen zu exprimieren. Besonders geeignete Gene sind diejenigen, die Toleranz für Herbizide, Insekten oder Viren verleihen, und Gene, die verbesserten Nährwert oder Verarbeitungscharakteristika der Pflanze verleihen. Beispiele geeigneter agronomisch nutzvoller Gene umfassen die Insektiziden Gene von Bacillus thuringiensis zum Verleihen von Insektenresistenz und das 5'-Enolpyruvyl-3'-phosphoshikimatsynthase (EPSPS)-Gen und jede Variante davon zum Verleihen einer Toleranz gegenüber Glyphosatherbiziden. Wie für den Fachmann in der Technik leicht verständlich, kann jedes agronomisch wichtige Gen, das ein gewünschtes Merkmal verleiht, verwendet werden.
Die 3'-UTR oder 3'-nicht-translatierte Region, die in Konstrukten der Erfindung verwendet wird, ist eine solche, die ein effizientes Prozessieren der mRNA verleiht, Stabilität der Message beibehält und die Addition von Adenosinribonukleotiden an das 3'-Ende der transkribierten mRNA-Sequenz steuert. Die 3'-UTR kann nativ mit der Promotorregion, nativ mit dem Strukturgen sein, oder kann von einer anderen Quelle abgeleitet sein. Eine große Vielzahl von Terminierungsregionen ist verfügbar, die aus Genen erhalten werden können, die in der Lage sind zur Expression in Pflanzenwirten, z.B. bakterielle, opine, virale und pflanzliche Gene. Geeignete 3'-UTRs umfassen zum Beispiel, ohne darauf begrenzt zu sein: die per5 3'-UTR (WO98/56921), die 3'-UTR des Nopalinsynthase (nos)-Gens, tml 3' oder acp 3'.
Die vorliegende Erfindung ist allgemein anwendbar auf die Expression von Strukturgenen sowohl in monokotyledonen als auch dikotyledonen Pflanzen. Die Erfindung ist besonders geeignet für jedes Mitglied der monokotyledonen (Monocot) Pflanzenfamilie, einschließlich, ohne darauf begrenzt zu sein, Mais, Reis, Gerste, Hafer, Weizen, Sorghum, Roggen, Zuckerrohr, Ananas, Süßkartoffel, Zwiebel, Banane, Kokosnuss und Dattel. Eine bevorzugte Anwendung der Erfindung ist die Erzeugung von transgenen Maispflanzen. Die Erfindung ist besonders anwendbar auf die Familie Graminaceae, im Besonderen Mais, Weizen, Reis, Hafer, Gerste und Sorghum. Dikotyledone Spezies umfassen Tabak, Tomate, Sonnenblume, Baumwolle, Zuckerrübe, Kartoffel, Kopfsalat, Melone, Sojabohne und Canola (Rapssamen).
ADF-Intron 1 kann verwendet werden mit Promotoren, die verschieden sind von dem ADF-Promotor, zum Verbessern der Expression. Der Promotor, der mit ADF-Intron 1 verwendet wird, kann jeder Promotor sein, der geeignet ist zur Verwendung in Pflanzen. Der ausgewählte Promotor sollte in der Lage sein ausreichend Expression des gewünschten Proteins alleine zu bewirken, jedoch im Besonderen bei Verwendung mit ADF-Intron 1, um zu der Produktion einer effektiven Menge des gewünschten Proteins zu führen, um zu bewirken, dass die Pflanzenzellen und Pflanzen, die daraus generiert werden, die Eigenschaften zeigen, die phänotypisch durch das exprimierte Protein bewirkt werden. Geeignete Promotoren können aus einer Vielzahl von Quellen erhalten werden, wie etwa Pflanzen oder Pflanzen-DNA-Viren. Bevorzugte Promotoren sind der ADF-Promotor, per5-Promotor, der 35T-Promotor (hier nachfolgend beschrieben in den Beispielen 20 und 23) und der Ubiquitin-Promotor. Geeignete Promotoren umfassen diejenigen, die aus der Caulimovirusgruppe isoliert sind, wie etwa die Blumenkohlmosaikviren 19S- und 35S-(CaMV19S und CaMV35S)-Transkriptionspromotoren. Andere geeignete Promotoren umfassen den verstärkten CaMV35S-Promotor (eCaMV35S), wie von Kat et al. (1987) Science 236: 1299–1302 beschrieben, und den kleine Subeinheit-Promotor von Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylaseoxygenase (RUBISCO). Beispiele anderer geeigneter Promotoren sind Reisactin-Promotor; Cyclophilin-Promotor; Ubiquitin-Promotor; ADH1-Promotor, Callis et al., supra; Klasse 1-Patatin-Promotor, Bevan et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14 (11), 4675–4638; ADP-Glucosepyrophosphorylase-Promotor; Beta-Conglycinin-Promotor, Tiemey et al. (1987) Planta 172: 356–363; E8-Promotor, Deikman et al. (1988) Embo J. 7 (11) 3315–3320; 2AII-Promotor, Pear et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13: 639–651; Acid Chitinase-Promotor, Samac et al. (1990) Plant Physiol. 93: 907–914.
Der Aufbau einer Genkassette unter Verwendung des ADF-Promotors oder ADF-Intron 1 wird leicht realisiert unter Verwendung allgemein bekannter Verfahren, wie etwa denjenigen, die offenbart sind in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manuel, 2. Ausgabe, Cold Spring; und Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, NY. DNA, die für den ADF-Promotor codiert, kann hergestellt werden aus chromosomaler DNA oder DNA synthetischen Ursprungs durch Verwendung allgemein bekannter Techniken. Genom-DNA kann isoliert werden durch Standardtechniken. Sambrook et al. (1989); Mullis et al. (1987), Meth. Enz., 155: 335. Horton et al. (1989), Gene, 77: 61; Erlich (Hrsg.) (1989). PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification. Es ist ebenfalls möglich, synthetische Sequenzen durch Oligonukleotidsynthese herzustellen.
Siehe Caruthers (1983) in: Methodology of DNA and RNA, (Hrsg.) Weissman und Beaucage et al. (1981), Tetrahedron Letters, 22: 1859–1962).
Herkömmliche Technologien zum Einführen von biologischem Material in Wirtszellen umfassen Elektroporation (siehe Shigekawa und Dower (1988), Biotechniques, 6: 742; Miller, et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 856–860; und Powell, et al. (1988), Appl. Environ. Microbiol., 54: 655–660); directe DNA-Aufnahme-Mechanismen (siehe Mandel und Higa (1972), J. Mol. Biol., 53: 159–162; Dityatkin, et al. (1972), Biochimica et Biophysica Acta, 281: 319–323; Wigler, et al. (1979), Cell, 16: 77; und Uchimiya, et al. (1982), in: Proc. 5^th Intl. Cong. Plant Tissue and Cell Culture, A. Fujiwara (Hrsg.), Jap. Assoc. for Plant Tissue Culture, Tokio, S. 507–508); Fusionmechanismen (siehe Uchidaz, et al. (1980), in: Introduction of Macromolecules Into Viable Mammalian Cells, Baserga et al. (Hrsg.) Wistar Symposium Series, 1: 169–185); infektiöse Mittel (siehe Fraley, et al. (1986), CRC Crit. Rev. Plant Sci., 4: 1–46); und Anderson (1984), Science, 226: 401–409); Microinjektionsmechanismen (siehe Crossway, et al. (1986), Mol. Gen. Genet., 202: 79–185); und Hochgeschwindigkeitsprojektilmechanismen (siehe EPO 0 405 696 von Miller, Schuchardt, Skokut und Gould, (The Dow Chemical Company).
Das geeignete Verfahren zum Transformieren einer ausgewählten Wirtszelle kann entsprechend der verwendeten Wirtszelle ausgewählt werden. Basierend auf der bestehenden Erfahrung scheint ein geringer Unterschied vorzuliegen bei der Expression von Genen, wenn sie einmal in Zellen insertiert sind, welcher dem verwendeten Transformationsverfahren an sich zuzuschreiben ist. Wenn es einmal in das Pflanzengewebe eingebracht ist, kann die Expression des Strukturgens untersucht werden in einem Übergangsexpressionssystem oder sie kann untersucht werden nach Selektion hinsichtlich stabiler Integration innerhalb des Pflanzengenoms.
Techniken für die in vitro-Kultivierung von Pflanzengewebe sind bekannt und in einer Vielzahl von Fällen zur Regeneration in Gesamtpflanzen. Das geeignete Verfahren zum Herstellen reifer transgener Pflanzen kann gemäß der verwendeten Pflanzenspezies ausgewählt werden. Die Regeneration variiert von Spezies zu Spezies der Pflanzen. Wirkungsvolle Regeneration wird abhängen von dem Medium, dem Genotyp und der Historie der Kultur. Wenn einmal vollständige Pflanzen erhalten worden sind, können sie sexuell oder durch Klonieren auf eine solche Art reproduziert werden, dass mindestens eine Kopie der Sequenz in den Nachkommenszellen der Reproduktion vorliegt. Samen von diesen regenerierten Pflanzen können gesammelt werden für eine zukünftige Anwendung und für Pflanzen, die aus diesen Samen gezüchtet werden. Verfahren zum Überführen des eingebauten Gens von der ursprünglich transformierten Pflanze in kommerziell geeignete Sorten sind dem Fachmann in der Technik bekannt.
In den folgenden Beispielen wurden alle Molekularbiologiemanipulationen durchgeführt gemäß den in Molecular Cloning beschriebenen Verfahren: A Laboratory Manual (Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J., 1982, Cold Spring Harbor Laboratory).
Beispiel 1
ADF 5'-Flankierungssequenz
Actindepolymerisierungsfaktorgen (Zmbap3) 5'-Flankierungssequenzen wurden aus Maisgenom-DNA, Variante OQ414 (geschützte Linie von Dow AgroSciences) isoliert. DNA-Sequenzierung wurde durchgeführt unter Verwendung des ABI Prism DNA Sequencing Kit mit AmpliTaq^® Polymerase FS, wie vom Hersteller beschrieben (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA). Sequenzierungsreaktionen wurden auf einem Applied Biosystem 373A DNA-Sequenzierer (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division) durchgeführt.
Die ADF 5'-Flankierungssequenz wurde verglichen mit der veröffentlichten cDNA-Sequenz und es wurde gefunden, dass sie aufgrund des Vorliegens eines Introns unmittelbar 3' zu dem ATG-Startcodon abweicht.
Die folgende Tabelle gibt die Merkmale des AP2/BC294 PCR-Produkts (SEQ ID NR: 1) an:
MERKMALE DES AP2/BC294 PCR-PRODUKTS
Die ersten beiden und die letzten beiden Basen des Introns sind übereinstimmende (konsens) Intronssplicestellensequenzen, intern zum Intron. Die gerade außerhalb dieses Introns liegenden Sequenzen sind ebenfalls nahezu übereinstimmend.
In den folgenden Beispielen wurden der ADF-Promotor und das ADF-Intron beurteilt unter Verwendung von Expressionsvektoren, basierend auf Plasmid pDAB305. pDAB305 ist ein 5796 bp-Plasmid, enthaltend einen Promotor, der eine Tandemkopie des Blumenkohlmosaikvirus 35S-Enhancers (35S) enhält, eine deletierte Version des Adh1-Intron 1, und die nicht-translatierte Leitsequenz des Maisfasermosaikvirushüllproteins, fusioniert an das uidA-Gen, das dann gefolgt wird von der nos-3'-UTR. Die Sequenz für pDAB305 ist in SEQ ID NR: 2 angegeben. Die Merkmale der Sequenz sind in der folgenden Tabelle beschrieben.
Merkmale von pDAB305
Beispiel 2
Aufbau von pDAB620
Plasmid pDAB620 ist im Wesentlichen pDAB305, wobei jedoch der ADF-Promotor den doppelt verstärkten CaMV35S-Promotor und die ADH-Intron I/MSV-Intronleitsequenz ersetzt. Zum Klonieren des ADF-Promotors ohne ein Intron nach der GUS-Codierungsregion wurde der ADF-Promotor amplifiziert mit Primern, die entwickelt sind, um eine 5'-Hind III-Stelle und 3'-NcoI-Stelle hinzuzufügen. PCR-Amplifikationen wurden durchgeführt unter Verwendung von 70 ng Templat-DNA (SEQ ID NR: 1, kloniert in dem PCR^® 2.1-Topo-Vektor), GeneAmp^® 10 × PCR-Puffer (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division), 50 Picomol von jedem Primer, und 5 Einheiten AmpliTaq Gold^TM-Polymerase (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division) in einem Gesamtvolumen von 100 μl. Amplifikationen wurden durchgeführt unter Verwendung des GeneAmp^® PCR Systems 9600 (PE/ABI) unter Verwendung der folgenden Zyklusbedingungen: 96°C 10 Minuten, 94°C 1 Minute, 55°C 2 Minuten, 72°C 3 Minuten, 20 Zyklen, gefolgt von 7 Minuten Verlängerung bei 72°C. Das resultierende 906 bp-PCR-Produkt wurde kloniert in das PCR^® 2.1-Topo (Invitrogen). Einzelne Kolonien wurden selektiert für DNA-Extraktion und Sequenzieren, wie oben beschrieben. Zum Klonieren des ADF-Promotors in pDAB305 wurde das ADF-Promotorfragment isoliert aus den rekombinanten PCR^® 2.1-Topo (Invitrogen)-Klonen als ein Hind III- und NcoI-Fragment durch Verdau mit NcoI- und Hind III-Restriktionsenzymen (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA). Das ADF-Fragment wurde auf einem präparativen Agarosegel gereinigt und die DNA wurde extrahiert unter Verwendung von GenElute Agarose Spin-Säulen (Supelco, Inc., Bellefonte, PA). Plasmid pDAB305 wurde hergestellt durch Verdau mit Hind III und NcoI (New England Biolabs), um den vorliegenden Promotor und das Intron zu entfernen. Das verdaute Plasmid wurde auf einem präparativen Agarosegel (FMC) laufengelassen, das Fragment wurde von dem Gel herausgeschnitten und DNA aus der Agarose extrahiert unter Verwendung von GenElute Agarose Spin Columns (GenElute Agarose Spin-Säulen) (Supelco, Inc.). Das ADF Hind III/NcoI-Promotorfragment wurde kombiniert mit dem deletierten pDAB305-Vektor und ligiert unter Verwendung des Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, früher Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), gemäß den Anweisungen des Herstellers. Subcloning Efficiency DH5α^TM Competent Cells (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) wurden transformiert mit dem Ligationsgemisch entsprechend dem Protokoll, das mit den Zellen erhalten wurde, und plattiert auf LB-Medium, enthaltend 75 μg/ml Ampicillin. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Einzelne Kolonien wurden ausgewählt zur DNA-Extraktion und DNA-Sequenzierung, wie beschrieben. Diejenigen Plasmide, die das ADF-Promotorfragment enthielten, das das CaMV-Promotor/ADH-Intron I/MSV-Leitsequenzfragment ersetzen, wurden als pDAB620 bezeichnet.
Merkmale von pDAB620
Beispiel 3
Aufbau von pDAB621
Plasmid pDAB621 unterscheidet sich von pDAB620 von Beispiel 2 dahingehend, dass es die ADH/MSV-Intronleitsequenz unmittelbar 3' zu dem ADF-Promotor enthält. Zum Klonieren des ADF-Promotors vor der modifizierten ADH-Intron I/MSV-Leitsequenz wurden Primer entwickelt, um eine Hind III-Stelle und eine BamH I-Stelle auf dem 5'- bzw. 3'-Ende des ADF-Promotors einzubauen, unter Verwendung von PCR-Amplifikation. PCR-Amplifikation des ADF-Promotors wurde durchgeführt unter Verwendung eines Robocycler^® Gradient 96 Temperature Cycler (Stratagene), unter Verwendung der folgenden Bedingungen: 70 ng DNA (SEQ ID NR: 1), kloniert in PCR^® 2.1-Topo Vektor), 15 μl 3.3 × XL Puffer II von dem GeneAmp^® XL PCR Kit (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division), 50 Picomol von jedem Primer, 1 mM Magnesiumacetat, 0,2 mM von jedem dNTP, 1,5 μl rTth DNA-Polymerase (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division). Das Produkt wurde kloniert in dem PCR^® 2.1 Topo (Invitrogen). Einzelne Kolonien wurden ausgewählt und DNA wurde extrahiert unter Verwendung eines alkalischen Lyseverfahrens. Das ADF-Fragment wurde gereinigt auf einem präparativen Agarosegel und die DNA wurde extrahiert unter Verwendung von GenElute Agarose Spin Columns (Supelco, Inc.). Zum Klonieren des ADF-Promotors in pDAB305 wurde der ADF-Promotor aus den rekombinanten PCR^® 2.1-Topo (Invitrogen) Klonen als ein Hind III- und BamHI-Fragment isoliert. Plasmid pDAB305 wurde hergestellt durch Verdau mit Hind III und BamHI (NEB), um den bestehenden Promotor herauszunehmen. Das ADF Hind III/BamHI-Promotorfragment wurde kombiniert mit dem deletierten pDAB305 und ligiert unter Verwendung des Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, früher Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Subcloning Efficiency DH5α^TM Competent Cells (Gibco/BRL) wurden transformiert mit dem Ligierungsgemisch und Zellen wurden plattiert auf LB-Medium, enthaltend 75 μg/ml Ampicillin. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Einzelne Kolonien wurden ausgewählt hinsichtlich DNA-Extraktion und DNA-Sequenzierung, wie beschrieben. Diejenigen Plasmide, die das ADF-Promotorfragment enthielten, das CaMV-Promotor ersetzt, wurden als pDAB621 bezeichnet.
Merkmale von pDAB621
Beispiel 4
Aufbau von pDAB625
Plasmid pDAB625 unterscheidet sich von Plasmid pDAB620 im Wesentlichen dahingehend, dass das ADF-Intron 1 unmittelbar 3' zu dem ADF-Promotor kloniert ist. Zum Erzeugen des ADF-Promotor/ADF-Intron-Vektors wurden der Promotor und Intronsequenzen fusioniert, unter Verwendung einer PCR-Splice Overlap Extension-Strategie (PCR Protokolle: A Guide to Methods and Applications, Hrsg. Innis, M.; Gelfand, D.; Sninsky, J.; White, T., 1990, Academic Press). Der ADF-Promotor und das ADF-Intron wurden in getrennten Reaktionen amplifiziert, unter Verwendung geeigneter Primer. Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt: 10 ng Templat DNA (SEQ ID NR: 1 kloniert in PCR^® 2.1-Topo Vektor), 10 μl GeneAmp^® 10 × PCR-Puffer (PE/ABI), 100 pMol von jedem Primer, 5 Einheiten AmpliTaq Gold^TM Polymerase (PE/ABI) in einem Volumen von 100 μl. Zyklisierung wurde durchgeführt in einem GeneAmp^® PCR-System 9600-Temperaturwechsler bzw. Thermocycler, programmiert mit dem folgenden Profil: 95°C 10 Minuten, 94°C 30 sec., 60°C 30 sec., 72°C 1 min.) für 15 Zyklen, 72°C für 5 Minuten. Das Promotorfragment und das Intron-Produkt wurden fusioniert in einer PCR-Reaktion die die folgenden Komponenten enthielt: 50 ng von jedem PCR-Produkt, 30 μl 3.3 × XL-Puffer (PE/ABI), 4 μl 25 mM Magnesiumacetat, 10 μl 2 mM dNTPs, 100 pMol von jedem Primer, 6 Einheiten rTth DNA-Polymerase (PE/ABI) in einem Endvolumen von 50 μl. Die Reaktionen wurden durchgeführt in einem RoboCycler^® Gradient 96 Temperature Cycler (Stratagene), unter Verwendung des folgenden Zyklisierungsprofils: 94°C 1 Minute, (94°C 30 sec., 70°C 4 Minuten) × 20 Zyklen, 72°C 10 Minuten. Das resultierende 2184 bp PCR-Produkt wurde auf einem präparativen Agarosegel (FMC) laufengelassen. Das Fragment wurde herausgeschnitten und DNA wurde extrahiert unter Verwendung von GenElute Agarose Spin Columns (Supelco, Inc.). Das 2184 bp-Fragment wurde zusammengefasst in einer anderen PCR-Reaktion und das Produkt dieser Reaktion wurde kloniert in PCR^® 2.1-Topo (Invitrogen). Einzelne Kolonien wurden ausgewählt zur DNA-Extraktion und -Sequenzierung, wie oben beschrieben. Zum Klonieren der ADF-Promotor/ADF-Intron-Fusion in pDAB305 wurde das Fusionsprodukt isoliert von den rekombinanten PCR^® 2.1-Topo (Invitrogen)-Klonen als ein Hind III- und NcoI-Fragment durch Verdau mit Hind III- und NcoI-Restriktionsenzymen (New England Biolabs Inc.). Plasmid pDAB305 wurde hergestellt durch Verdau mit Hind III- und NcoI-Restriktionsenzymen (New England Biolabs Inc.). Plasmid pDAB305 wurde hergestellt durch Verdau mit Hind III und NcoI (NEB), um den vorliegenden Promotor und Intron/Leisequenz zu entfernen. Das ADF-Promotor/ADF-Intron Hind III/NcoI-Promotorfragment wurde kombiniert mit dem Hind III/NcoI-deletierten pDAB305 und ligiert unter Verwendung des Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, früher Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Subcloning Efficiency DH5α^TM Competent Cells (Gibco/BRL) wurden transformiert mit dem Ligationsgemisch und Zellen wurden plattiert auf LB-Medium, das 75 μg/ml Ampicillin enthielt. Platten wurden über Nacht inkubiert bei 37°C. Einzelne Kolonien wurden zur DNA-Extraktion und zur DNA-Sequenzierung, wie beschrieben, ausgewählt. Diejenigen Plasmide, die das ADF-Promotor/ADF-Intron-Fragment, das das CaMV-Promotor/ADH-Intron ersetzt, wurden als pDAB625 bezeichnet.
Merkmale von pDAB625
BEISPIEL 5
KURZZEITTESTEN VON ADF-GUS-KONSTRUKTEN
Typ II-Kalluskulturen wurden initiiert aus unreifen zygotischen Keimen des Genotyps „Hi-II" (Armstrong et al. (1991) Maize Genet. Coop. News Lett. 65: 92–93). Keime wurden isoliert aus im Gewächshaus gezüchteten Maiskolben von Kreuzungen zwischen Hi-II-Eltern A und Hi-II-Eltern B oder F₂-Keime, die von einer Selbst- oder Geschwisterbestäubung einer Hi-II-Pflanze abgeleitet sind. Unreife Keime (1,5 bis 3,5 mm) wurden kultiviert auf 15Ag10 Kallusinitiierungsmedium, bestehend aus N6-Salzen und Vitaminen (Chu et al, (1978) The N6 medium and its application to anther culture of cereal crops. Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Peking Press, 43–56), 1,0 mg/l 2,4-D, 25 mM L-Prolin, 100 mg/l Caseinhydrolysat, 10 mg/l AgNO₃, 2,5 g/l GELRITE (Schweizerhall, South Plainfield, NJ) und 20 g/l Sucrose, bei einem pH-Wert von 5,8. Nach vier bis sechs Wochen wurde Kallus subkultiviert auf Erhaltungsmedium (Initiierungsmedium, worin AgNO₃ vermieden war und L-Prolin auf 6 mM verringert war). Selektion hinsichtlich Typ II-Kallus fand für 12–16 Wochen statt.
Jedes der Test-GUS-Konstrukte wurde copräzipitiert auf Goldteilchen mit pDeLux (enthaltend einen 35S-modifizierten Promotor, der Luziferase im Nos 3'UTR steuert), entsprechend dem folgenden Protokoll. Gleiche molare Mengen des GUS-Plasmids wurden verwendet. Insgesamt wurden 70 μg DNA, 35 μg pDeLux plus 35 μg Test-DNA und Bluescript^TM DNA (Stratagene, La Jolla, CA), falls erforderlich, in sterilem Wasser auf ein Volumen von 150 μl verdünnt. Die DNA und Wasser wurden zu 30 mg Oberflächen-sterilisierten sphärischen Goldteilchen mit 1,0 μm (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) gegeben. Das Gemisch wurde kurz gevortext (ungefähr 15 Sekunden) vor Zugabe von 37 μl 2,5 M Calciumchlorid und 15 μl 0,1 M Spermidin (freie Base). Nach dem Vortexen für 30 Sekunden ließ man DNA und Gold aus der Lösung präzipitieren. Der Überstand wurde entfernt und 1 ml Ethanol wurde zugegeben. Das DNA/Gold-Gemisch wurde 1:4 vor Verwendung zur Transformation verdünnt.
Typ II-Kallus wurde vorbehandelt auf Osmosemedium für ungefähr 16 Stunden. Osmosemedium bestand aus Erhaltungsmedium mit 0,2 M Sorbitol und 0,2 M Mannitol. Nachfolgend wurde der Kallus auf 60 × 20 mm Platten Osmosemedium, verfestigt mit 2% Agar, zum Helium-Verblasen angeordnet. Käfige mit 104 μm Siebmaschenweite bedeckten jedes Target (500–600 mg Kallus), um ein Verspritzen und Verlust von Gewebe zu verhindern. Targets wurden einzeln mit DNA/Gold-Gemisch versprengt, unter Verwendung der Dow AgroSciences Helium Blasvorrichtung 1.0 (US Patent Nr. 5,141,131). Unter einem partiellen Vakuum von 25 Zoll Hg wurde bei einem Schussabstand von 10 cm und einem Druck von 1500 psi DNA/Gold-Gemisch in Richtung jedes Targets viermal beschleunigt, wobei 20 μl pro Schuss bereitgestellt werden. Die Targets wurden um 180°C nach jedem Versprengen rotiert. Das Gewebe wurde auch halbwegs gemischt durch das Verfahren, um nicht versprengten Kallus freizulegen. Nach Abschluss des Versprengens wurden die Targets auf dem ursprünglichen Osmosemedium für über Nacht-Inkubation bei 26°C im Dunkeln angeordnet.
Vier Typ II-Kalluszelllinien wurden ausgewählt für jeden Versuch. Zwei Targets aus jeder Linie wurden pro Konstrukt verwendet. Ebenfalls wurden zwei nichttransformierte Kontrollen (NTC), zusammengesetzt aus Gewebe, gepoolt aus allen vier Linien, eingeschlossen. Die Kontrollen wurden übergeführt in Osmose- und Versprengmedium gemäß dem obigen Protokoll, wurden jedoch nicht einem Heliumversprengen ausgesetzt.
Ungefähr 20 Stunden nach dem Versprengen wurden 200–400 mg von jedem Target in ein 1,5 ml Reagenzglas übergeführt (Kontes, Vineland, NJ). Zur Extraktion von Proteinen wurde Kallus homogenisiert unter Verwendung eines Kontes Pellet Pestle aus Edelstahl, angetrieben von einem Motor mit 0,35 Amp, 40 Watt (Modell 102, Rae Corporation, McHenry, IL) bei einer Einstellung von „90". Cell Culture Lysis Reagent von einem Luziferaseassaykit (Promega, Madison, WI) diente als der Extraktionspuffer. Proteaseinhibitoren, Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und Leupeptinhemisulfatsalz wurden zu dem Lysepuffer in den Konzentrationen 1 mM bzw. 50 μm gegeben. Vor dem Mahlen wurden 0,5 μl Lysepuffer pro mg Gewebe in das Reagenzglas gegeben. Der Kallus wurde in vier 25-Sekunden-Intervallen mit einer 10-Sekunden-Inkubation auf Eis nachfolgend auf jede Mahlperiode homogenisiert. Nachfolgend wurden 1,0 μl Lysepuffer pro mg Gewebe zu der Probe gegeben, welche auf Eis angeordnet wurde bis das gesamte Probemahlen abgeschlossen war. Die Proben wurden dann zweimal bei 5°C für 7 Minuten bei voller Geschwindigkeit (Eppendorf Zentrifuge Modell 5415) zentrifugiert. Nach dem ersten Rotieren wurde der Überstand von jedem Reagenzglas entfernt und das Pellet wurde verworfen. Kallusextrakte (Überstände) wurden ebenfalls nach dem zweiten Rotieren gesammelt und auf Eis für GUS- und LUC-Analysen gehalten.
Aus dem LUC-Assaykit wurde LUC-Assaypuffer hergestellt gemäß den Anweisungen des Herstellers. Dieser Puffer wurde auf Raumtemperatur erwärmt und in die Dosierpumpe eines automatischen Lumineszenzphotometers (Modell 1251 Luminometer und Modell 1291 Dispenser, Bio-Orbit, Finnland) eingebracht. Jede Probe wurde dreifach getestet durch Zugeben von 20 μl Extrakt in drei Polypropylenluminometerfläschchen (Wallac, Gaithersburg, MD). Pro Fläschchen wurden 100 μl Assaypuffer bzw. Untersuchungspuffer dispensiert und Lumineszenz wurde über eine 45-Sekunden-Integrationsperiode nachgewiesen. „Blindreaktionen", die 20 μl Extraktionspuffer anstelle von Kallusextrakt enthalten, wurden ebenfalls innerhalb jedes Versuchs gemessen.
Zur Analyse von GUS-Aktivität wurde ein GUS-Light^TM-Assaykit (Tropix, Bedford, MA) verwendet. Wieder wurde jede Probe dreifach getestet, unter Verwendung von 20 μl Extrakt pro Luminometerfläschchen. GUS-Light^TM Reaktionspuffer wurde hergestellt aus dem Assaykit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Dieser Puffer wurde auf Raumtemperatur erwärmt und in 180 μl Aliquoten in jedes Luminometerfläschchen in 10 Sekunden-Intervallen gegeben. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurden 300 μl GUS-Light^TM Light Emission Accelerator-Puffer zugegeben und Lumineszenz wurde nachgewiesen über eine 5 Sekunden-Integrationsperiode. „Blindreaktionen" waren ebenfalls in der GUS-Untersuchung enthalten, unter Verwendung von 20 μl Extraktionspuffer anstelle von Kallusextrakt.
GUS- und LUC-Ergebnisse wurden in relativen Lichteinheiten (RLU) angegeben. Sowohl „blind"- als auch NTC-Auslesungen wurden von Probe-RLU-Gehalten subtrahiert. Zum Vergleich von einem GUS-Konstrukt mit einem anderen wurden GUS-Auslesungen normalisiert auf LUC-Daten, unter Verwendung der Quadratwurzel von jedem, um ein GUS/LUC-Verhältnis für jede getestete Probe zu berechnen. Die Verhältnisse für alle Proben pro Konstrukt wurden dann gemittelt und die Mittelwerte wurden verglichen unter Verwendung eines T-Tests zur Analyse der statistischen Signifikanz. Ein modifiziertes 35S Promotor (35T)/GUS/Nos-Poly A-Konstrukt (pDAB305) wurde als eine Kontrolle in jedem Versuch verwendet. Testkonstruktexpressionsgrade wurden als Prozent der pDAB305-Aktivität angegeben.
Plasmid pDAB620 zeigte keine Expression über dem Hintergrund, relativ zu der 35T-Kontrolle. Jedoch in wiederholten Versuchen erzielten pDAB621 und pDAB625 im Mittel 62% bzw. 82% des Standards. pDAB621 exprimierte durchweg mit Graden, die wesentlich geringer sind als bei der Kontrolle. Während pDAB625 zur Expression führte, die etwas variabler war und sich in einigen Fällen so gut wie für pDAB305 erwies.
BEISPIEL 6
Stabile Expression in Mais
ADF-Promotoraktivität wurde charakterisiert durch die Häufigkeit von Kallusbildung von Maisgewebe, transformiert mit Plasmid pDAB630 (ADF-Promotor/ADF-Intron/PAT/nosA) in der Gegenwart von Medium, das ein selektives Mittel enthält. Ergebnisse mit transgenem Mais, enthaltend PAT, unter Kontrolle des Reisactinpromotors, wurden ebenfalls produziert, um als interne Kontrollen zu dienen. In insgesamt 15 parallelen Versuchen war die Leistungsfähigkeit des ADF-Konstrukts entweder so gut wie die des Reisactinpromotorkonstrukts oder besser als die des Reisactinpromotorkonstrukts hinsichtlich der Gewinnung Herbizid-resistenter Isolate. Southern-Analysen bestätigten das Vorliegen des PAT-Gens in allen ADF-Ergebnisse, die produziert wurden.
Beispiel 7
Transgener Mais
Transgene Pflanzen von beiden Ergebnissen, transformiert mit Plasmid pDAB625, wurden auf GUS-Expression in Blattgewebe analysiert. In quantitativen Untersuchungen wurden GUS-Gehalte beobachtet, die äquivalent 0,02% insgesamt extrahierbarem Protein sind.
Sequenzprotokoll

Claims

Nukleinsäurekonstrukt oder isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend die Basen 1 bis 734 mit der SEQ. ID Nr.: 1 und ein Intron, das geeignet ist zum Verstärken der Expression.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, worin das Intron das ADF-Intron 1, Adh1-Intron 1, Ubiquitin-Intron 1 oder Bronze 2-Intron 1 ist.
Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1 oder 2, worin die Basen 1 bis 734 von SEQ. ID Nr.: 1 und das Intron operativ mit einer heterologen Nukleinsäuresequenz verbunden sind.
Nukleinsäurekonstrukt oder isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend einen Promotor, der geeignet ist zur Verwendung in Pflanzen, und die Basen 882 bis 2161 von SEQ. ID Nr. 1
Nukleinsäure nach Anspruch 4, worin der Promotor der ADF-Promotor, per5-Promotor, 35T-Promotor, CaMV19S-Promotor, CaMV35S-Promotor, verstärkte CaMV35S-Promotor, Kleine Subeinheit-Promotor für 1,5-Bisphosphatcarboxylaseoxygenase, Reisaktin-Promotor, Cyclophilin-Promotor, ADH1-Promotor, Klasse 1 Patatin-Promotor, Glucose-Pyrophosphorylase-Promotor, beta-Conglycinin-Promotor, E8-Promotor, 2AII-Promotor oder saure Chitinase-Promotor ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 4, worin der Promotor die Basen 1 bis 734 von SEQ. ID Nr.: 1 umfasst.
Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 4, 5 oder 6, worin der Promotor und die Basen 882 bis 2161 von SEQ. ID Nr.: 1 operativ mit einer heterologen Nukleinsäuresequenz verbunden sind.
Transformierte Pflanze, umfassend mindestens eine Pflanzenzelle, die ein Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 3 oder 7 umfasst.
Transformierter Samen oder transformiertes Korn, der/das ein Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 3 oder 7 umfasst.
Verfahren zum Transformieren einer Pflanze, umfassend: a) Einführen eines Vektors, der ein Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 3 oder 7 umfasst, in eine Pflanzenzelle; und b) Regenerieren einer Pflanze aus der Zelle.
Verfahren zum Herstellen von Samen, umfassend: a) Einführen eines Vektors, der ein Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 3 oder 7 umfasst, in eine Pflanzenzelle, b) Regenerieren einer Pflanze aus der Zelle; und c) Sexuelles Übertragen des Nukleinsäurekonstrukts zur Erzeugung von Abkömmlingen.
Verfahren nach Anspruch 11, weiterhin umfassend den zusätzlichen Schritt des Sammelns des Samens, der durch Erzeugung von Abkömmlingen gebildet wird.