ES2269207T3 - Promotor e intron del factor despolimerizador de la actina del maiz. - Google Patents
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Abstract
Una construcción de ácido nucleico o molécula de ácido nucleico aislada, que comprende las bases 1 a 734 de la SEQ. ID No: 1 y un intrón adecuado para potenciar la expresión.
Description
Promotor e intrón del factor despolimerizador de
la actina del maíz.
Esta invención se refiere a ingeniería genética
de plantas. La invención proporciona secuencias y construcciones de
ADN que son útiles para controlar la expresión de genes
recombinantes en plantas. Más particularmente, la invención
proporciona secuencias regulatorias novedosas derivadas del factor
despolimerizador de la actina (ADF) del maíz.
Los proyectos de ingeniería genética en las
plantas requieren el acceso a diversos elementos genéticos que se
usan para regular la expresión transgenética. Dos ejemplos de tales
elementos genéticos son los promotores y los intrones.
La iniciación de la transcripción es regulada
por un promotor. Un proyecto dado requiere típicamente el uso de
varios promotores diferentes. Se usará un promotor para manejar el
gen de interés, y se usará uno diferente, por ejemplo, para manejar
el marcador seleccionable.
Un gen eucariótico está interrumpido usualmente
por secuencias no codificantes llamadas intrones. El producto
inicial de transcripción de un gen eucariótico es el
pre-ARNm, que incluye secuencias correspondientes a
los intrones. Los intrones son retirados durante el proceso de
post-transcripción para proporcionar el ARNm que es
traducido para producir una proteína. Los estudios que caracterizan
el papel de los intrones en la regulación de la expresión de genes
han mostrado que el primer intrón del gen de la alcohol
deshidrogenasa (Adh-1) del maíz tiene la
capacidad de incrementar la expresión bajo anaerobiosis. Callis J.,
M. Fromm, y V. Walbot. (1987), Gene Dev.
1:1183-1200. El intrón también estimula la expresión
(en menor grado) en ausencia de anaerobiosis. Se piensa que este
aumento es un resultado de una estabilización del
pre-ARNm en el núcleo. Mascarenhas et al.
reportaron un aumento de 12 veces y 20 veces de la expresión de CAT
por el uso del intrón del Adh-1. Mascarenhas
et al., "Intron-Mediated Enhancement of
Heterologous Gene Expression in Maize," Plant Molecular Biology,
15:913-920, 1990. Se han identificado varios otros
intrones en el maíz y otras plantas monocotiledóneas que incrementan
la expresión de genes. Vain, P. et al. (1996), Plant Cell
Reports 15:489-494. Véase también la solicitud de
patente internacional WO98/5921.
La secuencia de ADNc para el ADF del maíz es
conocida (nº de acceso en GenBank X97726), pero la secuencia
genómica del ADF no ha sido publicada. En particular, la secuencia
para el promotor del ADF no ha sido publicada hasta ahora, ni ha
sido identificado ningún intrón del ADF.
La SEQ ID NO: 1 es la secuencia de ADN para el
producto de PCR AP2/BC294, que incluye la secuencia para el promotor
del ADF y el intrón 1 del ADF.
La SEQ ID NO: 2 es la secuencia de ADN para el
pDAB305.
La invención proporciona una construcción de
ácido nucleico o una molécula aislada de ácido nucleico que
comprende las bases 1 a 734 de la SEQ. ID No: 1 y un intrón adecuado
para potenciar la expresión, o que comprende un promotor adecuado
para el uso en plantas, y las bases 882 a 2161 de la SEQ. ID No:
1.
En otro de sus aspectos, la invención
proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende,
enlazado operativamente en la dirección 5' a 3',
| a) | un promotor del ADF del maíz que comprende las bases 1 a 734 de la SEQ ID No: 1; |
| b) | una secuencia líder no traducida; |
| c) | un intrón adecuado para potenciar la expresión; |
| d) | un gen de interés; y |
| e) | una UTR 3'. |
En una realización preferida, el intrón se
selecciona del grupo que consiste en intrón 1 del Adh1 e
intrón 1 del ADF (pb 882-2161 de la SEQ ID NO
1).
En otro de sus aspectos, la invención
proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende, en la
dirección 5' a 3',
| a) | un promotor funcional en plantas; |
| b) | una secuencia líder no traducida; |
| c) | el intrón 1 del ADF que comprende las bases 882-2161 de la SEQ ID No: 1; |
| d) | un sitio de clonación; |
| e) | una UTR 3'. |
En otro de sus aspectos, la invención
proporciona un plásmido que comprende un promotor del ADF del maíz
que comprende los pb 1-678 de la SEQ ID NO 1 y un
intrón adecuado para potenciar la expresión, o los pb
882-2161 de la secuencia del intrón 1 del ADF del
maíz de la SEQ ID NO: 1 y un promotor adecuado para el uso en
plantas.
En otro de sus aspectos, la invención
proporciona una planta transformada que comprende al menos una
célula vegetal que contiene una construcción de ácido nucleico de la
invención. La planta puede ser monocotiledónea o dicotiledónea. Las
plantas preferidas son el maíz, arroz, algodón y tabaco.
En otro de sus aspectos, la invención
proporciona una semilla o grano que contiene una construcción de
ácido nucleico de la invención.
El promotor del ADF se usa en construcciones que
tienen un intrón adecuado para potenciar la expresión y que está
incorporado preferiblemente en el líder no traducido 5' del gen de
interés y 3' del promotor. Los intrones adecuados incluyen el intrón
1 del ADF, el intrón 1 del Adh1, el intrón 1 de la Ubiquitina, y el
intrón 1 del Bronce 2.
La secuencia líder no traducida usada en las
construcciones de la invención puede derivar de cualquier fuente
adecuada, y puede ser modificada específicamente para incrementar la
traducción del ARNm. La región no traducida 5' se puede obtener a
partir de la secuencia líder nativa del promotor, la secuencia líder
nativa del gen o región codificante a ser expresada, ARNs virales,
genes eucarióticos adecuados, o puede ser una secuencia
sintética.
El gen de interés usado en las construcciones de
la invención puede ser cualquier gen que se desee expresar en
plantas. Son genes particularmente útiles los que confieren
tolerancia a herbicidas, insectos o virus, y genes que proporcionan
un valor nutricional mejorado o características de procesado de la
planta mejoradas. Los ejemplos de genes agronómicamente útiles y
adecuados incluyen el gen insecticida del Bacillus
thuringiensis para conferir resistencia a los insectos, y el gen
de la
5'-enolpiruvil-3'-fosfoshikimato
sintasa (EPSPS) y cualquier variante suya para conferir tolerancia
a los herbicidas de glifosato. Como entienden fácilmente los
expertos en la técnica, se puede usar cualquier gen agronómicamente
importante que confiera un rasgo deseado.
La UTR 3', o región no traducida 3', que se
emplea en las construcciones de la invención es una que confiere un
procesamiento eficaz del ARNm, que mantiene la estabilidad del
mensaje y que dirige la adición de ribonucleótidos de adenosina al
extremo 3' de la secuencia de ARNm transcrita. La UTR 3' puede ser
nativa con la región promotora, nativa con el gen estructural, o
puede derivar de otra fuente. Está disponible una amplia variedad de
regiones de terminación que se pueden obtener a partir de genes con
capacidad de expresión en huéspedes vegetales, p.ej., genes
bacterianos, de opinas, virales y vegetales. Las UTRs 3' adecuadas
incluyen, pero no están limitadas a: la UTR 3' del per5
(solicitud de patente internacional WO98/56921), la UTR 3' del gen
de la nopalina sintasa (nos), tmL 3', o acp 3',
por ejemplo.
La presente invención es aplicable, de manera
general, a la expresión de genes estructurales tanto en plantas
monocotiledóneas como dicotiledóneas. Esta invención es
particularmente adecuada para cualquier miembro de la familia
vegetal de las monocotiledóneas (monocot) que incluyen, pero no
están limitados a, maíz, arroz, cebada, avena, trigo, sorgo,
centeno, caña de azúcar, piña, batatas, cebolla, plátano, coco y
dátiles. Una aplicación preferida de la invención es en la
producción de plantas de maíz transgénicas. La invención es
particularmente aplicable a la familia Graminaceae, en
particular al maíz, trigo, arroz, avena, cebada y sorgo. Las
especies dicotiledóneas incluyen tabaco, tomate, girasol, algodón,
remolacha azucarera, patata, lechuga, melón, soja y canola (semilla
de colza).
El intrón 1 del ADF se puede usar con promotores
distintos al promotor del ADF para potenciar la expresión. El
promotor usado con el intrón 1 del ADF puede ser cualquier promotor
adecuado para el uso en plantas. El promotor seleccionado debe ser
capaz de causar suficiente expresión de la proteína deseada por sí
solo, pero especialmente cuando se usa con el intrón 1 del ADF, para
dar como resultado la producción de una cantidad eficaz de la
proteína deseada para provocar que las células vegetales y las
plantas regeneradas a partir de ella exhiban las propiedades que
estén causadas fenotípicamente por la proteína expresada. Los
promotores adecuados se pueden obtener de diversas fuentes, tales
como plantas o virus de ADN de plantas. Los promotores preferidos
son el promotor del ADF, el promotor del per5, el promotor
del 35T (descrito en adelante en los Ejemplos 20 y 23), y el
promotor de la ubiquitina. Los promotores útiles incluyen los
aislados del grupo caulimovirus, tales como los promotores de
transcripción del virus del mosaico de la coliflor 19S y 35S
(CaMV19S y CaMV35S). Otros promotores útiles incluyen el promotor
del CaMV35S potenciado (eCaMV35S) descrito por Kat et al.
(1987) Science 236:1299-1302 y la pequeña subunidad
promotora de la ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa
oxigenasa (RUBISCO). Los ejemplos de otros promotores adecuados son
el promotor de la actina del arroz; promotor de la ciclofilina;
promotor de la ubiquitina; promotor del ADH1, Callis et al.,
arriba.; promotor de la patatina de Clase I, Bevan et al.
(1986) Nucleic Acids Res. 14 (11), 4675-4638;
promotor de la ADP glucosa pirofosforilasa; promotor de la
.beta.-conglicinina, Tiemey et al. (1987) Planta 172:
356-363; promotor de E8, Deikman et al.
(1988) Embo J. 7 (11) 3315-3320; promotor del 2AII,
Pear et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13:
639-651; promotor de la chitinasa ácida, Samac et
al. (1990) Plant Physiol. 93:907-914;
La construcción de un casete génico utilizando
el promotor del ADF o el intrón 1 del ADF se consigue fácilmente
utilizando métodos bien conocidos, tales como los descritos en
Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2nd edition. Cold Spring; y Ausubel et al,
(1987). Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley
and Sons, New York, NY. El ADN que codifica el promotor del ADF se
puede preparar a partir de ADN cromosómico o ADN de origen sintético
usando técnicas bien conocidas. El ADN genómico se puede aislar por
técnicas estándar. Sambrook et al. (19B9); Mullis et
al. (1987), Meth. Enz., 155:335. Horton et al.
(1989), Gene, 77:61.; Erlich (ed.) (1989)). PCR Technology:
Principles and Applications for DNA Amplification. También es
posible preparar secuencias sintéticas por síntesis de
oligonucleótidos. Véase Caruthers (1983) en: Methodology of DNA
and RNA, (ed.) Weissman, y Beaucage et al. (1981),
Tetrahedron Letters, 22: 1859-1962).
Las tecnologías convencionales para introducir
material biológico en células huésped incluyen electroporación
(véase Shigekawa y Dower (1988), Biotechniques, 6:742; Miller, et
al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
85:856-860; y Powell, et al. (1988), Appl.
Environ. Microbiol., 54:655-660); mecanismos de
absorción directa de ADN (véase Mandel e Higa (1972), J. Mol. Biol.,
53:159-162; Dityatkin, et al. (1972),
Biochimica et Biophysica Acta, 281:319-323; Wigler,
et al. (1979), Cell, 16:77; y Uchimiya, et al. (1982),
en: Proc. 5th Intl. Cong. Plant Tissue and Cell Culture, A. Fujiwara
(ed.), Jap. Assoc. for Plant Tissue Culture, Tokyo, págs.
507-508); mecanismos de fusión (véase Uchidaz, et
al. (1980), en: Introduction of Macromolecules Into Viable
Mammalian Cells, Baserga et al. (eds.) Wistar Symposium
Series, 1:169-185); agentes infecciosos (véase
Fraley, et al. (1986), CRC Crit. Rev. Plant Sci.,
4:1-46); y Anderson (1984), Science,
226:401-409); mecanismos de microinyección (véase
Crossway, et al. (1986), Mol. Gen. Genet.,
202:179-185); y mecanismos de proyectiles de alta
velocidad (véase la solicitud de patente europea EPO 0 405 696, de
Miller, Schuchardt, Skokut y Gould, (The Dow Chemical Company).
El procedimiento apropiado para transformar una
célula huésped seleccionada se puede elegir de acuerdo con la célula
huésped usada. Basándose en la experiencia hasta la fecha, parece
haber poca diferencia en la expresión de genes, una vez insertados
en las células, atribuible al propio método de transformación. Una
vez introducido en el tejido vegetal, la expresión del gen
estructural puede ser ensayada en un sistema de expresión
transiente, o puede ser determinada después de la selección por la
integración estable dentro del genoma de la planta.
Se conocen técnicas para el cultivo in
vitro de tejido vegetal, y en varios casos, para la regeneración
a plantas enteras. El procedimiento apropiado para producir plantas
transgénicas maduras se puede elegir de acuerdo con la especie de
planta usada. La regeneración varía de especie a especie de plantas.
Una regeneración eficaz dependerá del medio, del genotipo y de la
historia del cultivo. Una vez que se han obtenido plantas enteras,
pueden ser reproducidas sexualmente o clónicamente de una manera tal
que al menos una copia de la secuencia esté presente en las células
de la progenie de la reproducción. Se puede recoger una semilla de
las plantas regeneradas para un uso futuro, y las plantas crecidas
de esta semilla. Los procedimientos para transferir el gen
introducido de la planta transformada originalmente a cultivos
comercialmente útiles son conocidos por los expertos en la
técnica.
En los siguientes ejemplos todas las
manipulaciones de biología molecular se hicieron según los
procedimientos descritos en Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J., 1982, Cold Spring Harbor
Laboratory).
Se aislaron secuencias flanqueantes en 5' del
gen del factor de despolimerización de la actina (Zmbap3) a partir
de ADN genómico de maíz, var. OQ414 (línea registrada de Dow
AgroSciences). La secuenciación del ADN se llevó a cabo usando el
kit de secuenciación de ADN ABI Prism con polimerasa AmpliTaq®
Polymerase FS como describe el fabricante (Perkin Elmer/Applied
Biosystems Division, Foster City, CA). Las reacciones de
secuenciación se ejecutaron en un secuenciador de ADN Applied
Biosystem 373A (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division).
La secuencia flanqueante en 5' del ADF se
comparó con la secuencia de ADNc publicada y se encontró que
divergía debido a la presencia de un intrón inmediatamente 3'
respecto al codón de inicio ATG.
La siguiente tabla enumera las características
del producto de PCR AP2/BC294 (SEQ ID NO: 1):
Las dos primeras y las dos últimas bases del
intrón son secuencias consenso de sitios de empalme, internas al
intrón. Las secuencias justo fuera del intrón son también casi
consenso.
En los siguientes ejemplos, el promotor del ADF
y el intrón del ADF fueron evaluados usando vectores de expresión
basados en el plásmido pDAB305. El pDAB305 es un plásmido de 5796 pb
que alberga un promotor que contiene una copia tándem del
potenciador 35S del virus del mosaico de la coliflor (35S), una
versión delecionada del intrón 1 del Adh1, y el líder no
traducido de la proteína de la envoltura del virus del mosaico del
rayado del maíz fusionado con el gen uidA, que es seguido
después por la UTR 3' del nos. La secuencia para el pDAB305
se da en la SEQ ID NO: 2. Las características de la secuencia se
describen en la siguiente tabla:
El plásmido pDAB620 es esencialmente el pDAB305,
pero con el promotor del ADF reemplazando al promotor doblemente
potenciado del CaMV 35S y el intrón del ADH/líder del intrón del
MSV. Para clonar el promotor del ADF sin un intrón detrás de la
región codificante GUS, el promotor del ADF fue amplificado con
cebadores diseñados para añadir un sitio 5' Hind III y un sitio 3'
Nco I. Las amplificaciones por PCR se realizaron usando 70 ng de ADN
plantilla (SEQ ID NO: 1 clonada en el vector
PCR®2.1-Topo), tampón de PCR GeneAmp® 10 x (Perkin
Elmer/Applied Biosystems Division), 50 picomoles de cada cebador, y
5 unidades de polimerasa AmpliTaq Gold^{TM} (Perkin Elmer/Applied
Biosystems Division) en un volumen total de 100 ul. Las
amplificaciones se realizaron usando el GeneAmp® PCR System 9600
(PE/ABI), usando las siguientes condiciones de ciclo: 96ºC 10
minutos, 94ºC, 1 minuto, 55ºC 2 minutos, 72ºC 3 minutos, 20 ciclos,
seguido de una extensión a 72ºC durante 7 minutos. El producto de
PCR resultante de 906 pb fue clonado en el
PCR®2.1-Topo (Invitrogen). Se seleccionaron colonias
individuales para la extracción y secuenciación de ADN como se
describe anteriormente. Para clonar el promotor del ADF en pDAB305,
el fragmento del promotor del ADF fue aislado de los clones
recombinantes PCR®2.1-Topo (Invitrogen) como
fragmento Hind III y Nco I por digestión con enzimas de restricción
Nco I y Hind III (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA). El
fragmento ADF fue purificado en un gel preparativo de agarosa y el
ADN se extrajo usando columnas rotatorias de agarosa GenElute
(Supelco, Inc., Bellefonte, PA). El plásmido pDAB305 fue preparado
por digestión con Hind III y Nco I (New England Biolabs) para
excluir el promotor e intrón existentes. El plásmido digerido se
hizo correr en un gel preparativo de agarosa (FMC), se cortó el
fragmento del gel, y se extrajo el ADN de la agarosa usando columnas
rotatorias de agarosa GenElute (Supelco, Inc.). El fragmento
promotor ADF Hind III/Nco I fue combinado con el vector delecionado
pDAB305, y fue ligado usando el kit Rapid DNA Ligation (Roche
Diagnostics, antiguamente Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)
según las instrucciones del fabricante. Células competentes para
subclonación Efficiency DH5\alpha^{TM} (Gibco/BRL, Gaithersburg,
MD) fueron transformadas con la mezcla de ligación según el
protocolo incluido con las células, y cultivadas en placas en medio
LB que contenía 75 ug/ml de ampicilina. Las placas se incubaron
durante una noche a 37ºC. Se seleccionaron colonias individuales
para la extracción del ADN y la secuenciación del ADN descritas.
Aquellos plásmidos que contenían el fragmento promotor del ADF que
reemplazaba al fragmento promotor del CaMV/intrón I del ADH/líder
del MSV fueron llamados pDAB620.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido pDAB621 difiere del pDAB620 del
Ejemplo 2 en que contiene el intrón/líder ADH/MSV inmediatamente 3'
respecto al promotor del ADF. Para clonar el promotor del ADF
delante del intrón 1 del ADH/líder del MSV modificado, se diseñaron
cebadores para incorporar un sitio Hind III y un sitio BamH I sobre
el extremo 5' y 3' del promotor del ADF, respectivamente, usando
amplificación por PCR. La amplificación por PCR del promotor del ADF
se realizó usando un ciclador Robocycler® Gradient 96 Temperature
Cycler (Stratagene) usando las condiciones siguientes: 70 ng de ADN
(SEQ ID NO: 1) clonado en PCR®2.1-Topo vector), 15
ul de tampón 3,3x XL Buffer II del kit de PCR GeneAmp® XL (Perkin
Elmer/Applied Biosystems Division), 50 picomoles de cada cebador,
acetato de magnesio 1 mM, 0,2 mM de cada dNTP, 1,5 ul de ADN
polimerasa rTth (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division). El
producto fue clonado en el PCR® 2.1 Topo (Invitrogen). Se
seleccionaron colonias individuales y se extrajo el ADN usando un
método de lisis alcalina. El fragmento ADF fue purificado en un gel
preparativo de agarosa y el ADN se extrajo usando columnas
giratorias de agarosa GenElute (Supelco, Inc.). Para clonar el
promotor del ADF en pDAB305, el promotor del ADF se aisló de los
clones PCR® 2.1-Topo (Invitrogen) recombinantes como
fragmento Hind III y BamHI. El plásmido pDAB305 se preparó por
digestión con Hind III y BamHI (NEB) para excluir el promotor
existente. El fragmento promotor de ADF Hind III/Nco I fue combinado
con el vector delecionado pDAB305 y fue ligado usando el kit Rapid
DNA Ligation (Roche Diagnostics, antiguamente Boehringer Mannheim,
Indianapolis, IN). Se transformaron células competentes para
subclonación Efficiency DH5\alpha^{TM} (Gibco/BRL) con la
mezcla de ligación y las células se cultivaron en placas en medio LB
que contenían 75 ug/ml de ampicilina. Las placas se incubaron
durante una noche a 37ºC. Se seleccionaron colonias individuales
para la extracción del ADN y la secuenciación del ADN descritas.
Aquellos plásmidos que contenían el fragmento del promotor del ADF
que reemplazaba al promotor CaMV fueron llamados pDAB621.
El plásmido pDAB625 difiere del plásmido pDAB620
esencialmente en que el intrón 1 del ADF está clonado inmediatamente
en 3' respecto al promotor de ADF. Para crear el vector promotor del
ADF/intrón del ADF, se fusionaron las secuencias del promotor e
intrón usando una estrategia de extensión de solapamiento por
empalme con PCR (PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications,
ed. Innis, M.; Gelfand, D.; Sninsky, J.; White, T., 1990, Academic
Press). El promotor del ADF y el intrón del ADF fueron amplificados
en reacciones separadas usando cebadores adecuados. Las condiciones
de reacción fueron como sigue: 10 ng de ADN plantilla (SEQ ID NO: 1
clonada en el vector PCR® 2.1-Topo vector), 10 ul de
tampón de PCR GeneAmp® 10x (PE/ABI), 100 pmoles de cada cebador, 5
unidades de polimerasa AmpliTaq Gold^{TM} (PE/ABI) en un volumen
de 100 ul. La ciclación se hizo en un termociclador GeneAmp® PCR
System 9600 programado con el siguiente perfil: 95ºC 10 minutos,
(94ºC 30 s, 60ºC 30 s, 72ºC 1 min) durante 15 ciclos, 72ºC durante 5
minutos. El fragmento del promotor y el producto del intrón fueron
fusionados en una reacción PCR que contenía los siguientes
componentes: 50 ng de cada producto de PCR, 30 ul de tampón 3.3x XL
(PE/ABI), 4 ul de acetato de magnesio 25 mM, 10 ul de dNTPs 2 mM,
100 pmoles de cada cebador, 6 unidades de ADN polimerasa rTth
(PE/ABI) en un volumen final de 50 ul. Las reacciones se realizaron
en un ciclador RoboCycler® Gradient 96 Temperature Cycler
(Stratagene) usando el siguiente perfil de ciclación: 94ºC 1 minuto,
[94ºC 30 s, 70ºC 4 minutos]x 20 ciclos, 72ºC 10 minutos. El
producto de PCR resultante, de 2184 pb, se hizo correr en un gel
preparativo de agarosa (FMC). Se cortó el fragmento y se extrajo el
ADN usando columnas rotatorias de agarosa GenElute (Supelco, Inc.).
El fragmento de 2184 pb fue aumentado en otra reacción PCR, y el
producto de esta reacción fue clonado en PCR®
2.1-Topo (Invitrogen). Se seleccionaron colonias
individuales para la extracción y secuenciación del ADN como se
describe anteriormente. Para clonar la fusión del promotor del
ADF/intrón del ADF en el pDAB305, el producto de fusión fue aislado
de los clones recombinantes PCR®2.1-Topo
(Invitrogen) como fragmento Hind III y Nco I por digestión con
enzimas de restricción Hind III y Nco I (New England Biolabs, Inc.).
El plásmido pDAB305 se preparó por digestión con Hind III y NcoI
(NEB) para excluir el promotor e intrón/líder existentes. El
fragmento promotor de ADF/intrón de ADF Hind III/Nco I fue
combinado con el pDAB305 delecionado de Hind III/NCo I y fue ligado
usando el kit Rapid DNA Ligation (Roche Diagnostics, antiguamente
Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Se transformaron células
competentes para subclonación Efficiency DH5\alpha^{TM}
(Gibco/BRL) con la mezcla de ligación, y las células se cultivaron
en placas en medio LB que contenían 75 ug/ml de ampicilina. Las
placas se incubaron durante una noche a 37ºC. Se seleccionaron
colonias individuales para la extracción del ADN y la secuenciación
del ADN descritas. Aquellos plásmidos que contenían el fragmento
promotor del AD/intrón del ADF que reemplazaba al promotor del
CaMV/intrón del ADH fueron llamados pDAB625.
Se iniciaron cultivos de callo de tipo II a
partir de embriones zigóticos inmaduros del genotipo
"Hi-II" (Armstrong et al. (1991) Maize
Genet. Coop. News Lett. 65:92-93). Los embriones
fueron aislados de espigas crecidas en invernadero a partir de
cruces entre padre Hi-II A y padre
Hi-II B, ó embriones F_{2} derivados de una auto-
o sib-polinización de una planta
Hi-II. Se cultivaron los embriones inmaduros (1,5 a
3,5 mm) en medio de iniciación de callo 15Ag10, que consiste en
sales N6 y vitaminas (Chu et al, (1978) The N6 medium and
its application to anther culture of cereal crops. Proc. Symp.
Plant Tissue Culture, Peking Press, 43-56), 1,0 mg/l
de 2,4-D, L-prolina 25 0mM, 100 mg/l
de hidrolizado de caseína, 10 mg/l de AgNO_{3}, 2,5 g/l de GELRITE
(Schweizerhall, South Plainfield, NJ), y 20 g/l de sacarosa, con un
pH de 5,8. Después de cuatro a seis semanas, el callo fue
subcultivado en medio de mantenimiento (medio de iniciación en el
que se omitió el AgNO_{3} y la L-prolina se redujo
a 6 mM). La selección para el callo de Tipo II tuvo lugar durante
aproximadamente 12-16 semanas.
Cada una de las construcciones GUS de ensayo fue
co-precipitada sobre partículas de oro con pDeLux
(que contenía un promotor modificado del 35S que regula la
luciferasa con el UTR 3' del Nos) según el siguiente protocolo. Se
usaron cantidades molares iguales de los plásmidos GUS. Un total de
70 \mug de ADN, 35 \mug de pDeLux más 35 \mug de ADN de ensayo
y ADN Bluescript^{TM} (Stratagene, La Jolla, CA) cuando fue
necesario, se diluyó en agua estéril hasta un volumen de 150 \mul.
Se añadió el ADN y el agua a 30 mg de partículas de oro esféricas de
1,0 \mum, de superficie esterilizada (Bio-Rad
Laboratories, Hercules, CA). La mezcla fue agitada brevemente en un
vórtex (aproximadamente 15 segundos) antes de añadir 37 \mul de
cloruro cálcico 2,5 M y 15 \mul de espermidina 0,1 M (base libre).
Después de agitar en vórtex durante 30 segundos, se dejó precipitar
el ADN y el oro de la solución. Se retiró el sobrenadante y se
añadió 1 ml de etanol. La mezcla ADN/oro se diluyó a 1:4 antes del
uso para transformación.
El callo de tipo II fue pretratado en medio
osmótico durante aproximadamente 16 horas. El medio osmótico
consistió en medio de mantenimiento con sorbitol 0,2 M y manitol 0,2
M. Después, el callo se puso en placas de 60 x 20 mm de medio
osmótico solidificado con 2% de agar para su bombardeo mediante
helio presurizado. Rejillas de 104 \mum de malla cubrieron cada
diana (500-600 mg de callo) para impedir
salpicaduras y pérdida de tejido. Las dianas fueron bombardeadas
individualmente con la mezcla ADN/oro usando el dispositivo Dow
AgroSciences Helium Blast Device 1.0 (patente de EE.UU. Nº
5.141.131). Bajo un vacío parcial de 84,7 kPa, a una distancia de
tiro de 10 cm y una presión de 10,33 MPa, la mezcla ADN/oro fue
acelerada hacia cada diana cuatro veces, administrando 20 \mul por
tiro. Se rotaron las dianas 180º después de cada bombardeo. El
tejido también fue mezclado a mitad del procedimiento para exponer
el callo no bombardeado. Tras completarse el bombardeo, las dianas
se pusieron sobre el medio osmótico original para una incubación
durante una noche a 26ºC en la oscuridad.
Se seleccionaron cuatro líneas celulares de
callo de tipo II para cada experimento. Se usaron dos dianas de cada
línea por construcción. También, se incluyeron dos controles no
transformados (CNT) compuestos de tejido reunido entre todas las
cuatro líneas. Los controles fueron transferidos a medios osmóticos
y de bombardeo según el protocolo anterior, pero no fueron sometidos
a bombardeo con helio.
Aproximadamente 20 horas después del bombardeo,
se transfirieron 200-400 mg de cada diana a un tubo
de muestras de 1,5 ml (Kontes, Vineland, NJ). Para la extracción de
proteínas, se homogeneizó el callo usando un almirez Kontes Pellet
Pestle de acero inoxidable propulsado por un motor de 0,35 amperios,
40 Watios (Modelo 102, Rae Corporation, McHenry, IL) a una
configuración de "90". El reactivo de lisis de cultivos
celulares de un kit de ensayo de luciferasa (Promega, Madison, WI)
sirvió como tampón de extracción. Se añadieron inhibidores de
proteasa, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) y sal de
hemisulfato de leupeptina al tampón de lisis a las concentraciones
de 1 mM y 50 \muM, respectivamente. Antes de moler, se añadieron
0,5 \mul de tampón de lisis por mg de tejido al tubo de muestras.
Se homogeneizó el callo en cuatro intervalos de 25 segundos, con una
incubación en hielo de 10 segundos después de cada periodo de
molienda. Después, se añadió 1,0 \mul de tampón de lisis por mg de
tejido a la muestra, que se puso en hielo hasta que se completó toda
la molienda de las muestras. Se centrifugaron después las muestras
dos veces a 5ºC durante 7 minutos a máxima velocidad (centrífuga
Eppendorf Modelo 5415). Después del primer centrifugado, se retiró
el sobrenadante de cada tubo y el sedimento fue descartado. También
se recogieron los extractos de callo (sobrenadantes) después del
segundo centrifugado, y se mantuvieron en hielo para los análisis de
GUS y LUC.
A partir del kit de ensayo LUC, se preparó el
tampón de ensayo LUC según las instrucciones del fabricante. Se
calentó este tampón hasta temperatura ambiente y se cargó en la
bomba dispensadora de un fotómetro de luminiscencia automático
(Luminómetro Modelo 1251 y Dispensador Modelo 1291,
Bio-Orbit, Finlandia). Cada muestra se ensayó por
triplicado añadiendo 20 \mul de extracto a tres viales de
polipropileno del luminómetro (Wallac, Gaithersburg, MD). Por vial,
fueron dispensados 100 \mul de tampón de ensayo y la luminescencia
fue detectada durante un periodo de integración de 45 segundos.
Dentro de cada experimento también se midieron "reacciones de
blanco", que incluyeron 20 \mul de tampón de extracción en vez
de extracto de callo.
Para el análisis de la actividad GUS, se usó un
kit de ensayo GUS-Light^{TM} (Tropix, Bedford,
MA). De nuevo, cada muestra se ensayó por triplicado, usando 20
\mul de extracto por vial del luminómetro. El tampón de reacción
de GUS-Light^{TM} se preparó a partir del kit de
ensayo según las instrucciones del fabricante. Se calentó este
tampón hasta temperatura ambiente y se añadió en alícuotas de 180
\mul a cada vial del luminómetro, a intervalos de 10 segundos.
Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, se
añadieron 300 \mul de tampón acelerador de la emisión de luz
GUS-Light^{TM} y la luminescencia fue detectada
durante un periodo de integración de 5 segundos. También se
incluyeron "reacciones de blanco" en el ensayo GUS, usando 20
\mul de tampón de extracción en vez de extracto de callo.
Los resultados de GUS y LUC se reportaron en
unidades de luz relativas (RLU). Las lecturas tanto de
"blancos" como de CNT fueron restadas de los niveles RLU de las
muestras. Para comparación de una construcción GUS con otra, las
lecturas GUS fueron normalizadas a los datos LUC usando las raíces
cuadradas de cada una para calcular una relación GUS/LUC para cada
muestra ensayada. Después se promediaron las relaciones para todas
las muestras por construcción, y las medias fueron comparadas usando
un test T para el análisis de la significancia estadística. Se usó
una construcción de promotor modificado 35S (35T)/GUS/Nos poli A
(pDAB305) como control en cada experimento. Los niveles de expresión
de la construcción de ensayo fueron reportados como tanto por ciento
de la actividad del pDAB305.
El plásmido pDAB620 no demostró expresión por
encima del fondo, respecto al control 35T. Sin embargo, en
experimentos repetidos pDAB621 y pDAB625 dieron de media 62% y 82%
del estándar, respectivamente. El pDAB621 expresó consistentemente
a niveles significativamente más bajos que el control. Mientras que
el pDAB625 dio como resultado una expresión que fue algo más
variable y en algunos casos resultó ser tan bueno como el
pDAB305.
La actividad del promotor del ADF fue
caracterizada por la frecuencia de formación de callo de tejido de
maíz transformado con el plásmido pDAB630 (promotor del ADF/intrón
del ADF/PAT/nosA) en presencia de medios que contenían un agente
selectivo. También se produjeron eventos de maíz transgénico que
contenían PAT bajo el control del promotor de la actina de arroz,
para servir como controles internos. En un total de 15 expermientos
estrechamente relacionados, la construcción de ADF rindió de igual
modo o bien superó a la construcción del promotor de la actina de
arroz con respecto a la recuperación de aislados resistentes a los
herbicidas. Un análisis "Southern" confirmó la presencia del
gen PAT en todos los eventos ADF producidos.
En plantas transgénicas de dos eventos
transformados con el plásmido pDAB625 se analizó la expresión GUS en
tejido foliar. En ensayos cuantitativos, se observaron niveles de
GUS equivalentes a 0,02% de proteína extraíble total.
<110> Rubin-Wilson, Beth
Smith, Kelley A
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROMOTOR E INTRON DEL FACTOR
DESPOLIMERIZADOR DE LA ACTINA DEL MAIZ
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 50695
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/167,111
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
23-11-1999
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2253
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Producto de PCR AP2/BC294
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5796
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: pDAB305
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (12)
1. Una construcción de ácido nucleico o
molécula de ácido nucleico aislada, que comprende las bases 1 a 734
de la SEQ. ID No: 1 y un intrón adecuado para potenciar la
expresión.
2. Un ácido nucleico según la
reivindicación 1, en el que el intrón es intrón 1 del ADF, intrón 1
del Adh1, intrón 1 de la ubiquitina, o intrón 1 del Bronce 2.
3. Una construcción de ácido nucleico
según la reivindicación 1 ó 2, en el que las bases 1 a 734 de la
SEQ. ID No: 1 y el intrón están unidos operativamente a una
secuencia de ácido nucleico heteróloga.
4. Una construcción de ácido nucleico o
molécula de ácido nucleico aislada, que comprende un promotor
adecuado para el uso en plantas y las bases 882 a 2161 de la SEQ. ID
No: 1.
5. Un ácido nucleico según la
reivindicación 4, en el que el promotor es el promotor del ADF, el
promotor del per5, el promotor del 35T, el promotor del CaMV19S, el
promotor del CaMV35S, el promotor del CaMV35S potenciado, la pequeña
subunidad promotora para la 1,5-bisfosfato
carboxilasa oxigenasa, el promotor de la actina del arroz, el
promotor de la ciclofilina, el promotor del ADH1, el promotor de la
patatina de Clase I, el promotor de la glucosa Pirofosforilasa, el
promotor de la beta conglicinina, el promotor del E8, el promotor
del 2All, o el promotor de la chitinasa ácida.
6. Un ácido nucleico según la
reivindicación 4, en el que el promotor comprende las bases 1 a 734
de la SEQ. ID No: 1.
7. Una construcción de ácido nucleico
según la reivindicación 4, 5 ó 6, en la que el promotor y las bases
882 a 2161 de la SEQ. ID No: 1 están unidos operativamente a una
secuencia de ácido nucleico heteróloga.
8. Una planta transformada, que
comprende al menos una célula vegetal que contiene una construcción
de ácido nucleico según la reivindicación 3 ó 7.
9. Una semilla o grano transformado, que
comprende una construcción de ácido nucleico según la reivindicación
3 ó 7.
10. Un método de transformar una planta, que
comprende:
- a)
- introducir en una célula vegetal un vector que comprende una construcción de ácido nucleico según la reivindicación 3 ó 7; y
- b)
- regenerar una planta a partir de dicha célula.
11. Un método de producir una semilla, que
comprende:
- a)
- introducir en una célula vegetal un vector que comprende una construcción de ácido nucleico según la reivindicación 3 ó 7;
- b)
- regenerar una planta a partir de dicha célula; y
- c)
- transmitir sexualmente dicha construcción de ácido nucleico a la progenie.
12. El método de la reivindicación 11, que
comprende además la etapa adicional de recoger la semilla producida
por dicha progenie.
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