KR102118705B1 - CRISPR/Cas 시스템과 재조합 효소 및 단일가닥 올리고디옥시리보핵산을 이용한 코리네박테리움 변이균주 제조방법 - Google Patents

CRISPR/Cas 시스템과 재조합 효소 및 단일가닥 올리고디옥시리보핵산을 이용한 코리네박테리움 변이균주 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 정상 박테리아를 온도 민감성 또는 항생제 감응성을 가지며, (i) 재조합 효소(recombinase) 를 발현하는 효소발현벡터로 1차 형질전환시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득된 1차 형질전환된 박테리아의 수용 세포(competent cell)를 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 수용 세포(competent cell)에, 상기 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN)과 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하며 항생제 감응성 또는 온도 감응성을 가지는 제1벡터를 도입하여 2차 형질전환시키는 단계; 및 (e) 상기 2차 형질전환된 박테리아에서 삽입된 효소발현벡터 및 제1벡터를 제거하는 단계를 포함하고, 상기 효소발현벡터 및 제1벡터 중 하나 이상은 Cas 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법은 타겟 유전자를 효과적으로 결실시키고, 재조합된 미생물을 신속하게 그리고 높은 효율로 선별할 수 있으며, 또한, 최종적으로 선별된 재조합 미생물 내에 외래 벡터를 모두 제거할 수 있기 때문에, 재조합 코리네박테리움의 산업적 활용에 매우 유용하다.

Description

CRISPR/Cas 시스템과 재조합 효소 및 단일가닥 올리고디옥시리보핵산을 이용한 코리네박테리움 변이균주 제조방법{Method of Preparing Corynebacterium Variant Based on CRISPR/Cas System, Recombinase, and ssODN}
본 발명은 CRISPR/Cas 시스템, 재조합 효소(Recombinase) 및 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(ssODN)을 이용하여 박테리아 유전자를 결실시키고, 결실된 변이균주를 신속하게 선별하는 것을 특징으로 하는 변이균주의 제조방법에 관한 것이다.
발효식품에서 발달한 미생물 이용기술은 생산물의 안전성과 환경친화적인 특징으로 인해 화학물질을 생산하는 분야에도 널리 이용되고 있으며, 최근에는 미생물 대사공학(metabolic engineering)에 의하여 생산성이 향상된 미생물 개량이 가능한 기술수준에까지 이르렀다.
미생물 대사공학(metabolic engineering)이란 미생물의 유전체 해독(whole genome sequencing)으로 얻어진 유전자 정보에 대해, 유전자 재조합 기술과 생물공학적 기술을 적용시켜 대상 미생물을 개량하기 위해, 새로운 대사회로를 도입하거나 기존의 대사회로를 제거, 증폭, 변경시켜 산업적으로 유용한 방향으로 변경하는 일련의 기술이다.
미생물이 생산하는 유용 산물로서, 식품 및 가축 사료에 이용되는 아미노산은 여러 미생물 중 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)을 이용하여 주로 생산되고 있다. 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 균주는 그람 양성 균주로서, 글루타메이트, 라이신, 트레오닌과 같은 아미노산 및 이노신산과 같은 퓨린 계열의 핵산을 생산하는 용도로 널리 이용되고 있다. C. glutamicum은 생장 조건이 용이하며, 대장균에 비해 4배 가량 고농도 배양이 가능하고, 유전체 구조가 안정적이어서 돌연변이 발생 확률이 낮다. 또한, 비병원성 균주이고 포자를 만들지 않아 환경에 유해한 영향을 미치지 않는 등 산업용 균주로서의 장점을 갖추고 있다.
상기 미생물의 생산 수율을 높이기 위하여 미생물 대사공학(metabolic engineering)이 적용된 코리네박테리움(Corynebacterium) 개발에 대한 관심이 꾸준히 증가하고 있으며, 이에 적용되는 유전자 조작기술은 변이주 라이브러리 제작 또는 변이 유도에 의한 고성능 균주를 선별하거나, 이중 교차(double crossover)를 유도하여 유전체를 조작하는 등의 노동집약적이며 시간이 오래 걸리는 전통적인 방법이 활용되고 있다.
최근 코리네박테리움(Corynebacterium) 속의 유전체를 보다 효과적으로 엔지니어링하기 위하여, C. glutamicum에 재조합 효소(recombinase)에 기반한 리컴비니어링(recombineering)을 적용한 기법이 개발되었다(Binder et al., Nucleic Acids Research, 41(12): 6360-6369, 2013). 상기 기술은 변이주 라이브러리 제조 없이, ssODN(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid)과 재조합 효소인 E. coli prophage의 RecT를 이용하여 특정 유전자를 결실시킨다는 특징이 있다. 다만, 변이 효율이 상당히 낮기 때문에, 변이균주를 다시 바이오센서링을 할 수 있도록 추가 조작해 유세포분석법(fluorescence-activated cell sorting, FACS)을 적용하여 변이주를 선별하는 특징이 있으며, 변이균주 제작과정은 번거롭지만 목적하는 유전자가 결실된 개량된 미생물을 신속하게 선별할 수 있다는 장점이 있다.
특히 RecT와 ssODN를 사용해서는 한 번에 수 염기쌍(base pair)밖에 치환할 수 없다는 기술적 한계가 있으며, 미생물의 종류에 따라서, 수복 기전(repair system)의 강도와 RecT의 활성이 동일하지 않아 재조합 효율이 달라진다는 문제가 있다.
미생물이 바이러스에 대응하기 위한 면역체계인 CRISPR/Cas 시스템은 2012년 이종의 세포에 CRISPR/Cas 시스템을 도입하여 타겟 염기서열을 선택적으로 절단할 수 있고, 이를 이용하여 미생물부터 인간 세포에 이르기까지의 다양한 세포에 대한 게놈을 편집할 수 있다는 것이 알려지게 되어, 유전자 편집기술로서, 생물 개량에 있어서 보다 효율적이고 편리하게 활용될 수 있을 것으로 기대되고 있다(Jinek et al., Science, 337(6096): 816-821, 2012).
유전자 편집기술에 있어서, CRISPR/Cas 시스템 중 CRISPR/Cas9 시스템은 이를 구성하는 Cas9 및 sgRNA에 의하여 타겟 DNA 상에 이중가닥절단(double-strand break, DSB)을 생성시키고, 세포는 이를 손상부위로 인식하여 비상동적 말단접합(non-homologous end joining, NHEJ) 또는 상동성 기반수복(homology-directed repair, HDR)에 의한 통상적인 DNA repair 과정을 유도하게 되며, 이 과정에서 변이 또는 유전자 교체에 의한 정상화가 가능하기 때문에, 이를 활용하여 게놈 편집을 유도할 수 있다: 비상동적 말단접합(non-homologous end joining, NHEJ) 기전은 CRISPR/Cas 시스템의 작용으로 생성된 DSB를 다듬은 후, 단순 접합시키는데, 그 과정에서 틀이동돌연변이(frameshift mutation)가 도입되어 손쉽게 유전자 결실을 유도할 수 있으며, 반면 절단된 부위와 상동성의 유전자 단편이 존재하는 경우에는 상동성 기반수복(homology-directed repair, HDR) 기전이 일어날 수 있으며, 이 기전을 통해서는 유전자 치환에 의한 정상화 또는 결실을 유도할 수 있다.
일부 생명체의 경우 내재된 재조합 능력에 차이가 있기 때문에, NHEJ 경로로는 DSB를 수복할 수 없거나, HDR을 이용해서 DSB를 수복하는 데에 어려움이 있는 미생물이 존재한다. 따라서 CRISPR/Cas 시스템이 유전자 편집에 상당히 편리한 수단인 것은 사실이나, NHEJ 경로로는 DSB를 수복할 수 없는 미생물에서는 타겟 유전자를 결실하기 위해 CRISPR/Cas를 도입하면 세포가 모두 사멸하는 현상이 종종 관찰되기 때문에, 모든 미생물에 자유롭게 적용하기는 어렵다. 다만, 대부분의 미생물에서 NHEJ 경로를 통한 DSB 수복은 미약하더라도 상동성기반 수복(homology-directed repair, HDR) 경로를 통한 DSB 수복은 작동하기 때문에, 타겟 유전자를 결실시키기 위해 이종 유래 재조합 효소를 추가로 도입해 균주의 리컴비니어링 능력을 강화하거나, 타겟 유전자를 결실시키는 대신 Cas9의 핵산절단활성을 제거한 dCas9(inactive Cas9)을 사용하여 타겟 유전자의 발현을 억제하는 대체방법이 필요하다. 그 대표적인 예로, Cas9으로부터 뉴클레아제(nuclease) 기능을 제거한 dCas9(catalytically-dead Cas9)을 활용해 C. glutamicum의 표적 유전자 발현량을 조절하는 시스템이 보고되었다(Cleto et al., ACS Synthetic Biology 5(5): 375-385, 2016).
C. glutamicum의 유전자 편집기술에 있어서는 최근 Cas9과 sgRNA를 도입하여 유전자 Ncgl1221을 결실시키는 방법(CN105238806A)이 시도되었는데, 결실 효율이 5%로 상당히 낮아 편집 효율을 증가시킬 필요가 있다.
이에 본 발명자들은 CRISPR/Cas 시스템을 활용해 박테리아의 유전체를 효과적으로 엔지니어링할 수 있는 시스템을 구축하고자 노력한 결과, Cas9과 sgRNA를 E. coli Rac prophage 유래 재조합 효소인 RecT 및 ssODN과 접목해 이용할 경우, C. glutamicum의 γ-aminobutyric acid 대사의 말단 경로에 관여하는 Ncgl1221(glutamate exporter), gabT(GABA aminotransferase), gabP(GABA permease)를 효과적으로 결실시키고, 재조합된 박테리아를 신속하게 그리고 높은 효율로 선별할 수 있음을 확인하였으며, 또한 제조된 상기 글루탐산(glutamate) 과생산 균주인 재조합 C. glutamicum을 사용하여 GABA 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 재조합 효소(recombinase) 및 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(ssODN)로 타겟 유전자를 결실함에 있어서, CRISPR/Cas 시스템을 이용하여 변이 균주를 선별하는 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 또한 감마-아미노뷰티르산(γ-aminobutyric acid, GABA) 대사과정에 관여하는 박테리아 변이주를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리아 변이주를 이용한 감마-아미노뷰티르산(γ-aminobutyric acid, GABA)의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 정상 박테리아를 온도 민감성 또는 항생제 감응성을 가지며, (i) 재조합 효소(recombinase) 를 발현하는 효소발현벡터로 1차 형질전환시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득된 1차 형질전환된 박테리아의 수용 세포(competent cell)를 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 수용 세포(competent cell)에, 상기 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN)과 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하며 항생제 감응성 또는 온도 감응성을 가지는 제1벡터를 도입하여 2차 형질전환시키는 단계; 및 (e) 상기 2차 형질전환된 박테리아에서 삽입된 효소발현벡터 및 제1벡터를 제거하는 단계를 포함하고, 상기 효소발현벡터 및 제1벡터 중 하나 이상은 Cas 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 정상 박테리아를 제1항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에 온도 민감성 또는 상기 마커에 의한 항생제 저항성을 가지며 (i) 재조합 효소(recombinase)를 발현하는 효소발현벡터로 형질전환시키는 단계; (b) 상기 형질전환된 박테리아의 수용 세포(competent cell)를 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 수용 세포(competent cell)에 제1 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN)과 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하며, 제2항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에, 상기 제2항생제에 대한 항생제 감응성 또는 온도 감응성을 가지는 제1벡터를 도입하여 1차 형질전환시키는 단계; (d) 상기 1차 형질전환된 균주를 상기 제1항생제는 포함하면서 상기 제2항생제를 포함하지 않은 배지에서 온도 민감성 조건에서 배양하여 삽입된 제1벡터를 제거하여 제1타겟 유전자가 결실된 변이균주를 선별하는 단계; (e) 제 n(n은 2 이상의 정수) 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN) 및 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 포함하는 제n벡터를 사용하되, 나머지 구성은 실질적으로 동일하게 하여 상기 (b) 단계 내지 (d) 단계를 n-1 회 반복하여, n 개의 타겟 유전자가 결실된 다중변이균주를 제조하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계에서 제조된 다중변이균주에서, 삽입된 효소발현벡터 및 제 n벡터를 제거하는 단계를 포함하고, 상기 효소발현벡터, 제1벡터 및 제n벡터 중 하나 이상은 Cas 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의하여 제조된 글루탐산(glutamate) 과생산능을 가지는 박테리아 변이주 및 이를 이용한 감마-아미노뷰티르산(γ-aminobutyric acid, GABA)의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법은 타겟 유전자를 효과적으로 결실시키고, 재조합된 미생물을 신속하게 그리고 높은 효율로 선별할 수 있으며, 특히 Cas 단백질, sgRNA 및 RecT를 발현하는 벡터는 온도 민감성 또는 항생제 감응성의 특징을 가지도록 개량되었기 때문에, 배양 온도 조절, 및 항생제 유무에 의한 배양 조건 변화로 균체 내에서 용이하게 제거할 수 있다.
이러한 특징은 (a) 도입한 벡터를 균주 내에서 손쉽게 제거할 수 있기 때문에, 여러 유전자를 순차적으로 또는 동시에 결실시키는데 새로운 벡터 도입에 활용 가능하며; (b) 형질전환된 박테리아를 용이하게 선별할 수 있고; 또한 (c) 최종적으로 선별된 변이주 내에 외래 벡터가 존재하지 않기 때문에, 유용 산물 생산과 관련된 산업적 활용에 매우 유용하다.
도 1은 pEKEx1 벡터의 개략도이다.
도 2는 Cas9 단백질을 발현하기 위해 제작한 pEKEx1-Cas9opt 벡터의 개략도이다.
도 3은 pEKEx1-Cas9opt를 도입한 재조합 C. glutamicum에서 Cas9 단백질의 발현을 확인한 SDS-PAGE 결과이다.
도 4는 pCG9-series 벡터 및 pCG9ts-series 벡터에 도입할 sgRNA를 증폭하기 위해 템플릿으로 사용한 pUC19-sgRNA 벡터의 개략도이다.
도 5는 pEKEx1-Cas9opt 벡터에 표적 유전자를 절단하는 sgRNA를 결합하여 pCG9-series 벡터를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 6은 C. glutamicum에 cas9 유전자와 sgRNA 유전자를 도입하기 위한 pCG9-series 벡터의 개략도이다.
도 7은 C. glutamicum에서 argR 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 발현시키는 pEKEx1-sgRNA argR1 벡터의 개략도이다.
도 8은 pCG-argR1 벡터의 개략도이다.
도 9는 C. glutamicum에 dCas9 단백질을 발현하기 위한 pEKEx1-dCas9 벡터의 개략도이다.
도 10은 argR 유전자를 표적으로 하는 sgRNA와 dCas9 단백질을 발현하는 pdCG9-srgR1 벡터의 개략도이다.
도 11은 전기천공법을 이용해 C. glutamicum에 pEKEx1-Cas9opt 벡터, pEKEx1-sgRNA argR1 벡터, pCG9-argR1 벡터, pdCG9-argR1 벡터를 도입했을 때 형성된 콜로니의 수를 나타내는 그래프이다.
도 12는 pTacCC1 벡터의 개략도이다.
도 13은 C. glutamicum에서 재조합 효소 RecT를 발현시키는 pTacCC1-recT 벡터의 개략도이다.
도 14는 재조합 C. glutamicum에서 재조합 효소 RecT 단백질의 발현을 확인한 SDS-PAGE 결과이다.
도 15는 C. glutamicum에서 N-말단에 6xHis가 결합된 재조합 효소 RecT를 발현시키는 pTacCC1-HrT 벡터의 개략도이다.
도 16은 Cas9과 sgRNA 및 ssODN과 RecT를 이용해 표적 유전자를 결실시키는 기작을 설명하는 모식도이다.
도 17은 ragR 유전자을 타겟으로 하는 ssODN 결합부위를 설명하는 모식도이다.
도 18은 C. glutamicum에 핵산을 도입하기 위한 전기 천공법의 효율을 올리기 위해, (a) 배지, (b) 천기 천공용 큐벳의 두께, (c) 전기 천공법 중 저항값, 및 (d) 전기 천공법 후 세포 회복 시간, 및 (e) 균주의 종류를 변경하며 형성되는 콜로니의 수를 측정한 그래프이다.
도 19는 C. glutamicum에 도입할 경우 온도 민감성을 보이는 pEKTs1 벡터의 개략도이다.
도 20은 C. glutamicum에 Cas9 단백질을 발현시키는 온도 민감성 벡터 pEKTs1-Cas9opt 벡터의 개략도이다.
도 21은 C. glutamicum에 Cas9과 sgRNA를 발현시키는 온도 민감성 벡터 pCG9ts-series 벡터의 개략도이다.
도 22는 glutamate decarboxylase GadB를 발현하는 재조합 C. glutamicum에서 l-Glutamate로부터 GABA를 생산하고 GABA를 분해하는 대사 경로 및 이에 관련된 유전자를 나타낸 개략도이다.
도 23은 RecT 재조합 효소를 발현하는 C. glutamicum 균주에 온도 민감성 pCG9ts-series 벡터와 ssODN을 도입하고 다시 제거하는 과정을 반복함으로써 여러 개의 유전자를 순차적으로 결실시키는 과정을 설명하는 개략도이다.
도 24는 C. glutamicum에 Lactobacillus brevis ATCC 367에서 유래한 glutamate decarboxylase 유전자 gadB2 유전자를 도입하기 위한 pGA7 벡터의 개략도이다.
도 25는 Ncgl1221, gabT, gabP 유전자를 모든 조합으로 결실시킨 pGA7 벡터를 도입한 재조합 C. glutamicum 균주를 96시간 동안 플라스크에서 배양한 뒤 생산된 GABA 농도의 그래프이다.
도 26은 재조합 C. glutamicum을 이용해 96시간 동안 플라스크에서 배양 중 측정한 OD, l-glutamage 농도, GABA 농도를 나타낸 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에 잘 알려져 있고, 통상적으로 사용되는 것이다.
일반적으로 CRISPR/Cas 시스템은 핵산절단효소인 Cas 단백질 및 가이드 RNA(guide RNA)로 복합체를 형성하여 작용한다. 이중 CRISPR/Cas9 시스템에서는 가이드 RNA에 해당하는 crRNA와 tracrRNA를 하나로 연결한 단일사슬 가이드 RNA(sgRNA) 역시 Cas9 단백질과 복합체를 형성할 수 있다.
가이드 RNA(guide RNA)의 안내 서열(guide sequence)이 타겟 유전자에 상보적인 서열을 가지고 있기 때문에, 타겟 유전자에 결합하고, 핵산절단효소인 Cas9에 의하여 PAM 모티프(protospacer adjacent motif)의 인접 부위를 절단하여 DSB(double strand break)를 생성하게 되며, 상기 절단부위를 복구시키려는 숙주 세포에 내재된 DNA 수복 과정을 통해 타겟 유전자가 결실되는 특징이 있다.
본 발명자들은 코리네박테리움(Corynebacterium) 속인 C. glutamicum에서 감마-아미노뷰티르산(γ-aminobutyric acid, GABA) 대사 경로의 말단에 관여하는 Ncgl1221(glutamate exporter), gabT(GABA aminotransferase), 및 gabP(GABA permease) 유전자를 결실시키기 위하여, CRISPR/Cas 시스템을 활용하고자 하였다.
이에 대한 예비실험으로서, C. glutamicum에 argR1에 대한 CRISPR/Cas 시스템을 적용한 결과, 도 11에서 나타난 바와 같이, pCG9-argR1을 도입한 경우에는 재조합 C. glutamicum의 콜로니가 수득되지 않는다는 특징을 확인하였다. 통상적으로, 대부분의 미생물에서는 NHEJ 경로를 통한 DSB 수복은 미약하나 상동성 기반 수복(homology-directed repair, HDR) 경로를 통한 DSB 수복은 작동하고, 특히 C. glutamicum에서 유전자를 결실시킬 경우, 상동 재조합(homologous recombination)을 활용할 수 있다는 점이 알려져 있다(Nesvera et al., Applied Microbiology and Biotechnology, 90(5):1641-1645, 2011). 따라서 상기 예비실험 결과는 C. glutamicum는 CRISPR/Cas 시스템에 의하여 게놈 상에 생성된 DSB를 NHEJ를 통해 수복할 수 없기 때문에, C. glutamicum이 모두 사멸한 것으로 해석하였으며. 따라서, CRISPR/Cas 시스템을 이용한 단순 결실을 활용할 수 없다는 것을 확인하고, 상동성 기반 수복 원리를 이용하여 타겟 유전자를 결실시키는 방법으로 개발전략을 수정하였다.
상동성 기반 수복 원리인 리컴비니어링(Recombineering)을 위해서는 타겟 유전자와 상동적인 서열을 가지는 템플릿 DNA 도입과 함께 제조합 시스템으로 E. coli 파지 λ의 재조합 시스템인 λ Red 시스템 혹은 E. coli Rac prophage의 재조합 효소인 RecT/ssODN 등을 활용할 수 있다.
RecT/ssODN는 미생물의 염색체 복제 도중 형성된 복제 분기점에서 아직 복제되지 않은 지연 가닥(lagging strand)에 결합하고, 여기에서 새로운 오카자키 절편(Okazaki fragment)의 프라이머로 작동하여 표적 유전자를 변형시키는데 작용하는 것으로 추정되고 있다(Murphy, EcoSal Plus, 2016. doi:10.1128/ecosalplus.ESP-0011-2015).
본 발명과 관련해서, CRISPR/Cas 시스템과 템플릿 DNA과 더불어, E. coli 파지 λ의 재조합 시스템인 λ Red 시스템을 함께 사용하여 리컴비니어링을 접목하고자 하였으나, 유전자가 결실된 C. glutamicum를 얻지 못하였다(data not shown). 반면, E. coli의 Rac prophage 유래 RecT 및 ssODN을 CRISPR/Cas 시스템과 함께 활용한 결과, 결실효과가 향상되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명자들은 CRISPR/Cas 시스템과 RecT/ssODN을 접목시켜, 유전자 결실은 RecT/ssODN에 의하여 진행되도록 하고, 결실되지 않은 균주는 CRISPR/Cas 시스템으로 사멸시키는 시스템을 디자인하였으며, 이러한 시스템을 이용하여 Ncgl1221(glutamate exporter), gabT(GABA aminotransferase), 및 gabP(GABA permease)가 결실된 글루탐산(glutamate) 과생산 C. glutamicum 변이균주 제조에 활용한 결과, 신속하고 편리하며 고수율로 다중 유전자가 변이된 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 변이균주를 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다
본 발명에서는 CRISPR/Cas 시스템을 구성하는 Cas 단백질, 단일사슬 가이드 RNA(sgRNA), RecT로 대표되는 재조합 효소(recombinase) 및 ssODN을 이용하여 코리네박테리움(Corynebacterium) 속에 형질전환시켜 변이균주를 제조하는 특징이 있다. 이를 위하여, 본 발명에서는 '효소발현벡터' 및 '제1벡터'를 이용하여 Cas 단백질, 가이드 RNA(guide RNA), RecT로 대표되는 재조합 효소(recombinase)를 전달한다.
본 발명에서의 '효소발현벡터'는 재조합 효소(recombinase) 및/또는 Cas 단백질을 발현하는 벡터로서, 재조합 효소(recombinase)와 Cas 단백질이 동일 벡터 또는 별개의 벡터로 구성되어 발현되는 특징이 있다.
본 발명에서의 '제1벡터'는 CRISPR/Cas 시스템에 작용하는 Cas 단백질 및/또는 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하는 벡터로서, Cas 단백질을 상기 효소발현벡터로 구성하지 않을 경우에는 상기 제1벡터에 삽입할 수 있다. 이 경우, Cas 단백질은 가이드 RNA(guide RNA)와 동일 벡터 또는 별개의 벡터로 구성되어 발현되는 특징이 있다.
본 발명에서 하나 이상의 타겟 유전자를 결실시키는 방법은 효소발현벡터와 제1 타겟 유전자를 결실시키기 위한 제1벡터를 사용하여 변이균주를 제조하고, 상기 균체에 도입된 효소발현벡터는 제거하지 않고 유지한 상태에서, 제1벡터만 제거한 다음, 제2타겟 유전자를 결실시키기 위한 제2벡터를 다시 도입함으로써 구현이 가능하다.
본 발명의 제1양태에서, (a) 정상 박테리아를 온도 민감성 또는 항생제 감응성을 가지며, (i) 재조합 효소(recombinase) 를 발현하는 효소발현벡터로 1차 형질전환시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득된 1차 형질전환된 박테리아의 수용 세포(competent cell)를 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 수용 세포(competent cell)에, 상기 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN)과 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하며 항생제 감응성 또는 온도 감응성을 가지는 제1벡터를 도입하여 2차 형질전환시키는 단계; 및 (e) 상기 2차 형질전환된 박테리아에서 삽입된 효소발현벡터 및 제1벡터를 제거하는 단계를 포함하고, 상기 효소발현벡터 및 제1벡터 중 하나 이상은 Cas 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (e)단계는 상기 (d) 단계의 2차 형질전환된 박테리아를 10℃ 내지 42℃에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 제1양태는 다음의 관점에서 구현될 수 있다.
본 발명은 제1 관점에서, (a) 정상의 박테리아를 온도 민감성을 가지며, (i) 재조합 효소(recombinase) 및 (ii) Cas 단백질을 발현하는 효소발현벡터로 1차 형질전환시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득된 1차 형질전환된 박테리아의 수용 세포(competent cell)를 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 수용 세포(competent cell)에, 상기 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN) 및 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하며, 항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에 항생제 감응성을 가지는 제1벡터를 도입하여 2차 형질전환시키는 단계; (d) 상기 2차 형질전환된 박테리아를 상기 항생제 선별마커(selective marker)에 상응하는 항생제가 첨가된 배지에서 배양하여 변이균주를 1차 선별하는 단계; 및 (e) 상기 1차 선별된 변이균주에서 삽입된 효소발현벡터 및 제1벡터를 제거하는 단계를 포함하는 박테리아 변이주의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 제2 관점에서, (a) 박테리아를 항생제 감응성을 가지며, (i) 재조합 효소(recombinase) 및 (ii) Cas 단백질을 발현하는 효소발현벡터로 1차 형질전환시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득된 1차 형질전환된 박테리아의 수용 세포(competent cell)를 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 수용 세포(competent cell)에, 상기 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN) 및 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하며 온도 민감성을 가지는 제1벡터를 도입하여 2차 형질전환시키는 단계; 및 (d) 상기 2차 형질전환된 박테리아에서 삽입된 효소발현벡터 및 제1벡터를 제거하는 단계를 포함하는 타겟 유전자가 결실된 박테리아 변이주의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 제3 관점에서, (a) 박테리아를 제1항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에 상기 항생제에 대한 항생제 감응성을 가지며, (i) 재조합 효소(recombinase) 및 (ii) Cas 단백질을 발현하는 효소발현벡터로 1차 형질전환시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득된 1차 형질전환된 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 균주의 수용 세포(competent cell)를 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 수용 세포(competent cell)에, 상기 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN), 및 (ii) Cas 단백질 및 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하며, 제2항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에 상기 항생제에 대한 항생제 감응성을 가지는 제1벡터를 도입하여 2차 형질전환시키는 단계; 및 (d) 상기 2차 형질전환된 박테리아에서 삽입된 효소발현벡터 및 제1벡터를 제거하는 단계를 포함하는 타겟 유전자가 결실된 박테리아 변이주의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 제4 관점에서, (a) 박테리아를 온도 민감성을 가지며, (i) 재조합 효소(recombinase) 및 (ii) Cas 단백질을 발현하는 효소발현벡터로 1차 형질전환시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득된 1차 형질전환된 박테리아의 수용 세포(competent cell)를 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 수용 세포(competent cell)에, 상기 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN) 및 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하며 온도 민감성을 가지는 제1벡터를 도입하여 2차 형질전환시키는 단계; 및 (d) 상기 2차 형질전환된 박테리아에서 삽입된 효소발현벡터 및 제1벡터를 제거하는 단계를 포함하는 타겟 유전자가 결실된 박테리아 변이주의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 제5 관점에서, (a) 박테리아를 온도 민감성을 가지며, 재조합 효소(recombinase)를 발현하는 효소발현벡터로 1차 형질전환시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득된 1차 형질전환된 박테리아의 수용 세포(competent cell)를 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 수용 세포(competent cell)에, 상기 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN), 및 (ii) Cas 단백질 및 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하며 항생제 감응성을 가지는 제1벡터를 도입하여 2차 형질전환시키는 단계; 및 (d) 상기 2차 형질전환된 박테리아에서 삽입된 효소발현벡터 및 제1벡터를 제거하는 단계를 포함하는 타겟 유전자가 결실된 박테리아 변이주의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 제6 관점에서, (a) 박테리아를 항생제 감응성을 가지며, 재조합 효소(recombinase)를 발현하는 효소발현벡터로 1차 형질전환시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득된 1차 형질전환된 박테리아의 수용 세포(competent cell)를 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 수용 세포(competent cell)에, 상기 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN), 및 (ii) Cas 단백질 및 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하며 온도 민감성을 가지는 제1벡터를 도입하여 2차 형질전환시키는 단계; 및 (d) 상기 2차 형질전환된 박테리아에서 삽입된 효소발현벡터 및 제1벡터를 제거하는 단계를 포함하는 타겟 유전자가 결실된 박테리아 변이주의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 제7 관점에서, (a) 박테리아를 제1항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에 상기 항생제에 대한 항생제 감응성을 가지며, 재조합 효소(recombinase)를 발현하는 효소발현벡터로 1차 형질전환시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득된 1차 형질전환된 박테리아의 수용 세포(competent cell)를 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 수용 세포(competent cell)에, 상기 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN), 및 (ii) Cas 단백질 및 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하며 제2항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에 상기 항생제에 대한 항생제 감응성을 가지는 제1벡터를 도입하여 2차 형질전환시키는 단계; 및 (d) 상기 2차 형질전환된 박테리아에서 삽입된 효소발현벡터 및 제1벡터를 제거하는 단계를 포함하는 타겟 유전자가 결실된 박테리아 변이주의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 제8 관점에서, (a) 박테리아를 제1항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에 온도 민감성을 가지며, 재조합 효소(recombinase)를 발현하는 효소발현벡터로 1차 형질전환시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 수득된 1차 형질전환된 박테리아의 수용 세포(competent cell)를 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 수용 세포(competent cell)에, 상기 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN), 및 (ii) Cas 단백질 및 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하며 제2항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에 온도 민감성을 가지는 제1벡터를 도입하여 2차 형질전환시키는 단계; 및 (d) 상기 2차 형질전환된 박테리아에서 삽입된 효소발현벡터 및 제1벡터를 제거하는 단계를 포함하는 타겟 유전자가 결실된 박테리아 변이주의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 삽입된 효소발현벡터 및 제1벡터를 제거하는 단계는 상기 2차 형질전환된 박테리아를 10℃ 내지 42℃에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 삽입된 효소발현벡터 및 제1벡터를 제거하는 단계는 상기 2차 형질전환된 박테리아를 10℃ 내지 42℃에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 제조방법에서, 타겟 유전자의 결실은 재조합 효소(recombinase)와 ssODN에 의하여 진행되며, 박테리아 변이주의 선별은 CRISPR/Cas 시스템에 의한 이중나선 절단(Double stranded break, DSB) 생성 및 항생제 첨가에 의한 균체 사멸유도에 의하여 진행된다.
본 발명에서 상기 재조합 효소(recombinase)는 RecT, RecET 시스템, Bet 및 λ Red 시스템으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하나, 이에 제한된 것은 아니며, 본 발명에서의 재조합 효소는 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN)과 결합 또는 작용하여, 유전자를 결실 또는 삽입시킬 수 있다.
본 발명에서의 용어 '효소발현벡터'는 가이드 RNA(guide RNA)가 아닌 재조합 효소(recombinase) 및/또는 핵산절단효소인 Cas 단백질을 발현하는 벡터로서, 균주를 최초 형질전환시킬 때 사용하는 특징이 있다. 상기 효소발현벡터는 하나의 벡터에 재조합 효소(recombinase) 단독, 재조합 효소(recombinase)와 Cas 단백질을 동시 또는 개별적으로 발현하도록 구성할 수 있다.
본 발명의 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN)은 벡터에 의한 발현이 아닌, 디옥시리보핵산 상태로 직접 균주에 삽입되는 것을 특징으로 하고, 80 내지 100 nucleotide의 길이를 가질 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니며, 타겟 유전자 정보를 근거로 제조회사에 의뢰하여 당업자라면 용이하게 제조가 가능하다.
본 발명의 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded olideoxyribonucleic acid, ssODN)은 코리네박테리움(Corynebacterium)의 염색체가 복제될 때, 지연가닥(lagging strand) 또는 선도가닥(leading strand)에 결합하도록 서열을 선택할 수 있다. 상기 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN)은 5' 상동 부위(homology arm)과 3' 상동 부위(homology arm)으로 구성되어, 타겟 유전자와 상보적으로 결합할 수 있다. 또한, 타겟 유전자 내 상기 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN)의 각 상동 부위가 결합하는 영역은 일정 거리를 두고 떨어져 있을 수 있으며, 이 경우, 타겟 유전자 서열에서 ssODN의 각 상동부위가 결합되지 않은 내측 영역은 루프(loop) 구조를 형성할 수 있다.
예시적으로, 본 발명에서는 80 nucleotide의 길이를 가지는 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN)의 5' 상동 부위(homology arm)과 3' 상동 부위(homology arm)는 각각 40 nucleotide의 길이가 되도록 제조하였으며, 타겟 유전자 서열에서 상기 상동 부위와 결합하지 않은 내측 서열, 즉 루프 영역은 100 내지 400 nucleotide의 길이를 가질 수 있으며, 이에 한정된 것은 아니다.
단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN)가 5' 상동 부위(homology arm)과 3' 상동 부위(homology arm)만으로 구성될 경우, 타겟 유전자와의 결합으로 루프 영역이 제거되기 때문에, 균주에 삽입할 경우 타겟 유전자는 결실되는 특징이 있으며, 외래 유전자 또는 외래 유전자 조절인자를 각 상동 부위 사이의 영역, 즉 루프 영역에 위치하도록 한 뒤, 균주에 삽입할 경우에는 상기 외래 유전자 또는 조절인자가 도입될 수 있고, 이 경우 타겟 유전자의 과발현이 가능하다.
본 발명의 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN)은 균주에 삽입할 때, 벡터를 사용하지 않고, ssODN 상태로 직접 균주에 도입하는 특징이 있다.
본 발명에서, 상기 가이드 RNA(guide RNA, gRNA)는 타겟 유전자의 서열에 상보적인 서열을 가지는 안내 서열(guide sequence)을 포함한다.
본 발명에서, 상기 가이드 RNA(guide RNA)는 (i) 타겟 유전자의 서열에 상보적으로 결합하는 안내 서열(guide sequence)을 포함하는 crRNA, (ii) 타겟 유전자의 서열에 상보적으로 결합하는 안내 서열(guide sequence)을 포함하는 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 이중 RNA(dual RNA), 또는 (iii) crRNA 및 tracrRNA가 하나의 가닥으로 구성된 단일사슬 가이드 RNA(single-strand guide RNA, sgRNA)일 수 있다.
본 발명의 상기 가이드 RNA(guide RNA)의 안내 서열(guide sequence)는 길이가 20 nucleotide로 이에 한정되지 않으며, 타겟 유전자의 서열 중 결실시키고자 하는 영역에 상보적으로 결합하는 서열을 가지는 특징이 있다. 타겟 유전자 상에서 안내 서열(guide sequence)과 상보적인 서열의 3' 말단과 바로 인접하는 상보적 서열에 PAM 서열(protospacer adjacent motif)이 존재하는 것을 특징으로 한다.
가이드 RNA(guide RNA)에 있어서, 상기 안내 서열(guide sequence)은 sgRNA Designer(Doench et al., Nature Biotechnology 34(2):184-191, 2016); E-CRISP(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/Heigwar et al., Nature Methods 11(2):122-123, 2014); Benchling(https://benchling.com); sgRNA scorer 2.0(https://crispr.med.harvard.edu/sgRNAScorerV2; Chari et al., ACS Synthetic Biology, 2017. doi: 10.1021/acssynbio.6b00343), CRISPy-web(Blin et al., Synthetic and Systems Biotechnology, 1(2): 118-121, 2016)을 이용하여 당업자라면 용이하게 선별할 수 있다.
본 발명에서, 상기 가이드 RNA(guide RNA)는 crRNA, 또는 crRNA 및 tracrRNA로 구성된다. 안내 서열(guide sequence) 부위를 제외한 crRNA 및/또는 tracrRNA는 RNA 스케폴드를 형성하여 상기 부위에 Cas 단백질이 결합하는 특징이 있다. 상기 Cas 단백질은 CRISPR/Cas 시스템에서 필수적인 핵산절단효소로서, DSB(double strand break)을 생성한다. CRISPR/Cas 시스템은 CRISR/Cas type I, CRISPR/Cas type II, CRISPR/Cas type III, CRISPR/Cas type IV, CRISPR/Cas type V, 및 CRISPR/Cas type VI으로 분류될 수 있으며, 이에 작용하는 Cas 단백질은 Cas3, Cas9, Cpf1, Cas6, C2c2 등일 수 있다.
따라서, 본 발명의 Cas 단백질은 Cas3, Cas9, Cpf1, Cas6, 또는 C2c2로 선택된 핵산절단효소일 수 있으며, 보다 바람직하게는 CRISPR/Cas type II의 Cas9인 특징이 있다.
Cas 단백질의 유전자 및 단백질의 정보는 국립생명공학정보센터(national center for biotechnology information, NCBI)의 GenBank에서 구할 수 있다.
본 발명에서의 Cas 단백질, 예시적으로 Cas9(CRISPR associated protein 9)은 가이드 RNA(guide RNA)의 RNA 스캐폴드 부분과 결합하며 복합체를 형성하고, 타겟 유전자의 서열에 존재하는 PAM 서열을 인지하여 타겟 유전자로 CRISPR/Cas 시스템을 인도하며, 가이드 RNA의 안내 서열과 타겟 유전자 사이의 상보적 결합을 통해 타겟 유전자를 식별하며, 최종적으로 활성 부위인 HNH 도메인과 RuvC 도메인에 의하여 핵산 절단활성을 나타낸다.
이러한 Cas9의 여러 도메인 중 염기 절단에 관여하는 두 개의 도메인에 특정 아미노산에 하나의 변이가 도입되면 핵산절단능력을 상실하는 것이 알려져 있다. 그 예로 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes)의 Cas9의 경우 아미노산 10번과 840번을 각각 알라닌으로 변이시키면(D10A 및 H840A 변이), DNA 절단 능력을 상실하게 되고 이를 보통 dCas9이라고 한다. 또한, 10번, 840번 중 어느 하나의 아미노산을 알라닌으로 변이(D10A 또는 H840A 변이)시킨 Cas9 효소는 이중 가닥 염기 중 한 가닥만을 절단하는 닉카아제(nickase) 활성을 가지는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서는 Cas 단백질과 가이드 RNA(guide RNA)를 균주에 동시에 도입할 경우에는 단일 벡터 또는 서로 다른 벡터에 의하여 발현되도록 구성할 수 있으며, 발현된 Cas 단백질과 가이드 RNA(guide RNA)는 균주 내에서 발현된 다음, 자발적으로 복합체를 형성할 수 있다. 상기 복합체는 'CRISPR/Cas 시스템', 'CRISPR complex", Cas9-gRNA complex', 'CRISPR/Cas 복합체', 'Cas 단백질 복합체' 등의 용어와 혼용될 수 있다.
본 발명에서의 Cas 단백질, 바람직하게는 Cas9은 코리네박터(Corynebacter), 수테렐라(Sutterella), 레지오넬라(Legionella), 트레포네마(Treponema), 피리팩터(Filifactor), 유박테리움(Eubacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 미코플라즈마(Mycoplasma), 박터로이드(Bacteroides), 플라비플라비이볼라(Flaviivola), 플라보박테리움(Flavobacterium), 아조스피릴룸(Azospirillum), 글루코나세토박터(Gluconacetobacter), 나이세리아(Neisseria), 로세부리아(Roseburia), 파비바큐럼(Parvibaculum), 스타필로코커스(Staphylococcus), 니트라티프랙터(Nitratifractor), 코리네박터리움(Corynebacterium),및 캠필로박터(Campylobacter)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 Cas 단백질의 오소로그(ortholog)를 포함하는 미생물 속으로부터 유래할 수 있으며, 바람직하게는 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes)로 부터 분리된 것, 또는 재조합 단백질일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 Cas 단백질은 형질전환된 변이주에서 원활하게 발현될 수 있도록, 코돈 최적화가 되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 재조합 효소(Recombinase) 및 Cas 단백질은 발현능 향상을 위하여 인위적으로 hexahistidine이 아미노산 서열에 포함되도록 효소 유전자를 개량하여 벡터에 삽입할 수 있으며, 이는 당업계에 종사하는 자에게는 자명한 기술이다.
본 발명에서 가이드 RNA(guide RNA) 및 Cas 단백질은 복합체를 형성하여 유전자 편집 기능을 나타내며, Cas 단백질은 안내 서열(guide sequence)과 상관없이 가이드 RNA(guide RNA) 내 RNA 스케폴드의 서열이 동일하다면 서로 다른 타겟을 인지하는 가이드 RNA(guide RNA)와 결합이 가능하다. 따라서 하나 이상의 유전자를 결실시키기 위해서는 균주에 하나의 Cas 단백질을 발현하는 유전자와 서로 다른 타겟 유전자에 상보적인 안내 서열(guide sequence)을 가지는 하나 이상의 가이드 RNA(guide RNA)를 동시에 발현하도록 형질전환함으로써, 다중변이 편집효과를 유도할 수 있다.
본 발명에서는 ssODN의 각 상동부위(homolgy arm)가 이에 상응하는 서열을 가지는 타겟 유전자에 상보적으로 결합하고, 타겟 유전자에서 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN)의 상동 부위(homolgy arm)와 결합하지 않은 타겟 유전자의 3' 말단 및 5' 말단의 내측 서열은 루프 구조(loop)를 형성하게 되며(도 17), 가이드 RNA(guide RNA)는 상기 루프 영역 상의 서열에 결합하는 특징이 있다. 이 때, 상기 '루프 영역 상의 서열'은 ssODN이 결합된 가닥의 서열, 또는 이에 상보적인 서열일 수 있다.
본 발명에서의 용어, '상동'이란 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타낸다.
본 발명의 제조방법에서는 하나의 가이드 RNA(guide RNA)와 두 가지 이상의 ssODN을 이용하여, 둘 이상의 타겟 유전자를 동시에 결실시킬 수 있으며, 이 경우, 각각의 ssODN은 결실시키고자 하는 영역 각각의 양 말단 바깥쪽에 동시 결합하며, 가이드 RNA(guide RNA)는 ssODN이 결합하는 타겟 유전자들 중 하나의 유전자에 대해 ssODN이 결합하였을 경우 형성되는 루프(loop) 영역의 서열에 상보적으로 결합하도록 서열을 선택하는 특징이 있다.
본 발명의 제조방법에서, 상기 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodexoyribonucleic acid, ssODN)은 타겟 유전자의 개수만큼 균주에 삽입하는 것을 특징으로 한다. 반면, 가이드 RNA(guide RNA)는 타겟 유전자의 결실과 무관하게 절단에 의하여 균주가 사멸되는 효과를 야기하기 때문에, 결실할 타겟 유전자의 수와 동일한 수로 균주에 도입할 필요가 없다. 예를 들면, 본 발명에서, gapT 및 gapP를 동시에 결실시킬 경우에는 상기 유전자에 대한 두 개의 ssODN과 둘 중 하나에 결합능을 가지는 가이드 RNA(guide RNA)만 균주에 도입하여도 용이하게 동시 결실이 가능한 것을 실시예4-2에서 확인하였다. 다만, 이러한 동시 결실 효과를 가지려면, 동시 결실의 타겟 유전자가 서로 인접해야 한다는 한계가 있다. 이 경우, 상기 '인접'은 범위는 100kb 이하이며, 바람직하게는 10 kb 이하, 보다 바람직하게는 5 kb 이하인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제조방법에서, 상기 수용 세포(competent cell)은 상기 (a) 단계의 형질전환 균주를 Tween-20, DL-트레오닌(Theronine), 이소니아지드 (isoniazid) 및 글라이신(Glycine)이 함유된 배지를 사용하여 OD600이 0.3 내지 0.5의 범위까지 배양하여 제조하는 것을 특징으로 한다. 상기 배양은 박테리아에 대해 이후 단계에서 ssODN, Cas 단백질 및 가이드 RNA(guide RNA), 또는 ssODN 및 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하는 벡터의 형질전환 효율을 보다 향상시키기 위한 전처리이며, 보다 상세하게는 Ruan et al., 2015(Biotechnology Lett, 37:2445, 2015)에 개시되어 있다.
본 발명의 박테리아는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 균주일 수 있으며, 바람직하게는 C. glutamicum ATCC 13032일 수 있고, 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명에서의 용어, '형질전환'은 유전자의 '삽입' 또는 '도입'과 동일한 의미로 사용될 수 있으며, DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서, 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 형질전환은 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당업계에 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 또는 염화칼슘(CaCl2)을 이용한 침전법, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, 양이온 리포좀법, DEAE(diethylaminoethyl)덱스트란법, 및 초산리튬-DMSO법 등이 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 전기천공법(electroporation)으로 제조하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서의 용어 '전기천공법(electroporation)'은 세포막을 가지는 생물체에서 DNA 분자가 통과해서 들어가는 세포막이 전기 펄스에 의해 순간적으로 열리면서 DNA 분자가 세포 내로 유입되는 원리를 이용하여 미생물을 유전자를 삽입하는 방법이다.
본 발명에서의 전기천공법(electroporation)은 1mm 큐벳을 사용하여, 3 내지 5 ms의 충격시간 동안 10 내지 20 kv/cm의 전기장을 가하는 것을 특징으로 하나, 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명에서의 용어, '선별 마커(selective marker)'는 '선발 마커', '선택 표지' 등의 용어와 혼용될 수 있으며, 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 부여하는 유전자를 발현하는 염기 서열로서, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포와 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당되며, 항생제 내성 유전자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 '선별 마커'는 항생제 내성 유전자로서, 상기 항생제는 카나마이신(kanamycin), 스펙티노마이신(spectinomycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), 또는 아프라마이신(apramycin)일 수 있으며, 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명에서의 용어, '결실(deletion)'이라는 용어는 유전자의 활성을 억제하는 것을 나타내고, 이 과정에 의하여 유전자는 '결실된' 상태라고 말한다. 상기 활성의 억제는 발현되지 않도록 또는 발현 산물이 그 기능을 상실하도록 i) 관련 유전자의 발현 산물을 적절한 방법에 의하여 불활성화시키는 것, ii) 관련 유전자의 발현을 억제하는 것, iii) 관련 유전자의 적어도 일 부분을 제거하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 유전자를 결실시키면 해당 유전자를 본질적으로 억제하는데, 상기 유전자는 본 발명에 따른 개량형 균주의 동정, 분리 및 정제를 용이하게 하는 선발 마커 유전자로 치환할 수 있다.
본 발명의 용어, '벡터'는 '플라스미드'와 혼용하여 사용할 수 있으며, 미생물 내에서 주염색체와 독립적으로 존재하면서, 복제될 수 있는 환상의 DNA이다. 일반적으로 벡터는 미생물 내에서 벡터 형태로 유지되기 위한 복제 원점(origin of replication, ori), 항생제 저항성 유전자와 같은 미생물를 선별하기 위한 선발 표지 유전자(selectable marker gene), 및 외래 유전자의 클로닝을 위한 다중클로닝부위(multi-cloning site, MCS)를 포함한다.
본 발명에서의 용어, '셔틀벡터'는 일반적으로 복수의 균주에서 유지 가능한 벡터를 포함한다. C. glutamicum - E. coli 셔틀벡터는 C. glutamicum의 복제 원점(ori) 및 E. coli의 복제 원점(ori)을 모두 포함하고 있다. 셔틀벡터를 사용함으로써 대상 균주에 원하는 형질을 용이하게 도입할 수 있다.
코리네박테리움(Corynebacterium) 속 유래 변이균주에 대해 타겟 유전자를 결실시킨 다음, 산업 균주로 활용하기 위해서는 삽입된 외래 벡터를 제거해야 한다. 아울러, 최적의 균주를 개발하기 위해서는 대부분의 경우 여러 개의 유전자를 결실시켜야 하는데, 하나의 표적 유전자를 결실시킨 뒤 다음번 표적 유전자를 결실시키기 위해서는 먼저 도입한 벡터를 제거해야 한다. 결과적으로 유전자 결실을 마친 코리네박테리움(Corynebacterium) 속으로부터 이전 삽입된 벡터를 손쉽게 제거할 수 있는 방안이 필수적이다.
따라서, 본 발명에서는 삽입된 외래 벡터가 특정 배양조건에서 균주 내에서 제거될 수 있도록 '온도 민감성' 또는 '항생제 감응성'의 특징을 가지도록 인위적으로 제작하였다.
또한, 본 발명에서 제작된 벡터는 하나의 항생제 선별 마커(selective marker)을 가지고 있다.
본 발명에서의 '온도 민감성' 벡터는 pBL1 복제 원점을 가지며, 이에 작용하는 Rep 단백질 상에 단일 염기 돌연변이를 가지도록 인위적으로 조작한 벡터이다. 상기 Rep 단백질은 pBL1 복제 원점(ori)의 복제과정에 관여하며, 상기 Rep 단백질의 유전자에 단일 염기 돌연변이(C→T)가 도입되면, P47S의 아미노산 치환이 발생하고, 이러한 벡터를 포함한 균주는 무항생제 배지에서 배양 온도가 34℃ 이상으로 상승할 경우, pBL1 복제 원점(ori)은 그 기능을 상실하는 것으로 알려져 있다(Nakamura et al., Plasmid 56(3):179-186, 2006). 따라서, 상기 복제 원점을 가진 벡터를 이용하여 제조된 박테리아 변이주는 벡터 내 존재하는 항생제 선별 마커(selective marker)에 상응하는 항생제가 첨가된 배지를 사용하여 10℃ 내지 30℃에서 배양할 경우 벡터가 안정적으로 유지되지만, 무항생제 배지에서 34℃ 이상, 통상적으로 37℃ 내지 42℃ 이하에서 배양할 경우, 벡터가 유지되지 못하므로, 따라서, 항생제 유무와 배양 온도를 조절함으로써, 벡터를 유지 또는 제거할 수 있다.
본 발명에서의 '항생제 감응성' 벡터는 본 기술을 개발하는 과정에서 pTacCC1 계열의 벡터는 상기 벡터에 삽입된 저항성 유전자 즉 항생제 선별마커(selective marker)에 상응하는 항생제의 농도가 낮아질 경우, 벡터가 소실되는 것을 발견하고, 이러한 특징을 벡터 제거에 활용하게 되었다.
또한, '제1항생제 감응성' 벡터 및 '제2항생제 감응성' 벡터는 서로 다른 저항성 유전자가 삽입된 벡터로서, 해당 항생제의 농도가 낮추고 10℃ 내지 42℃에서 배양할 경우, 해당 벡터만 소실되는 특징이 있다.
따라서, 본 발명에서 '온도 민감성' 벡터는 pBL1 복제 원점을 가지며, 이에 작용하는 Rep 단백질 상에 단일 염기 돌연변이를 가지도록 인위적으로 조작되었으며, 항생제 선별 마커(selective marker)를 가지고 있는 벡터이다.
또한, 본 발명에서 '항생제 감응성' 벡터는 항생제 선별 마커(selective marker) 즉, 항생제 저항성 유전자를 가지며 pCC1 복제 원점을 가지는 벡터로서, 특히 '제1항생제 감응성' 및 '제2항생제 감응성'에 작용하는 항생제는 서로 다른 특징이 있다.
본 벡터에서 상기 항생제는 카나마이신(kanamycin), 스펙티노마이신(spectinomycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), 또는 아프라마이신(apramycin)일 수 있으며, 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명의 변이균주의 제조방법에서, 재조합 효소(recombinase) 및/또는 Cas 단백질을 발현하는 효소발현벡터를 온도 민감성 또는 항생제 감응성의 특징을 갖는 벡터로 제조할 수 있다.
본 발명의 변이균주의 제조방법에서, Cas 단백질 및/또는 sgRNA를 발현하는 제1벡터를 온도 민감성 또는 항생제 감응성의 특징을 갖는 벡터로 제조할 수 있다.
예시적으로 본 발명의 제1 관점과 관련하여, 재조합 효소(recombinase) 및 Cas 단백질을 발현하는 온도 민감성 벡터(pEKTs-series 등 pBL1ts 복제 원점 기반 벡터)를 사용하여 1차 형질전환된 균주에, 항생제 감응성(pTacCC1-series 등 pCC1 복제 원점 기반)의 가이드 RNA(guide RNA) 발현벡터를 사용하여 2차 형질전환시킨 후, (a) 10℃ 내지 34℃에서 상기 '온도 민감성 벡터' 및 상기 '항생제 감응성 벡터'의 항생제 선별 마커(selective marker)에 상응하는 2종의 항생제를 첨가한 배지를 사용하여 배양할 경우에는 두 벡터가 모두 균주 내에 유지되는 반면, (b) 상기 '항생제 감응성 벡터'의 항생제 선별 마커(selective marker)에 상응하는 항생제가 첨가되지 않았으나 상기 '온도 민감성 벡터'의 항생제 선별 마커(selective marker)에 상응하는 항생제가 첨가된 배지를 사용하여 배양할 경우 항생제 감응성 벡터인 가이드 RNA(guide RNA) 발현벡터는 균주 내에서 제거되고 재조합 효소(recombinse) 및 Cas 단백질 발현 벡터만 유지되는 특징이 있다.
예시적으로 본 발명의 제2 관점과 관련하여, 재조합 효소(Recombinase) 및 Cas 단백질을 발현하는 항생제 감응성 벡터(pTacCC1-series 등의 pCC1 복제 원점 기반 벡터)를 사용하여 1차 형질전환된 균주에 온도 민감성 벡터(pCG9ts-series 등 pBL1ts 복제 원점 기반 벡터)의 가이드 RNA(guide RNA) 발현벡터를 사용하여 2차 형질전환시킨 후, (a) 10℃ 내지 34℃에서 상기 '온도 민감성 벡터' 및 상기 '항생제 감응성 벡터'의 항생제 선별 마커(selective marker)에 상응하는 2종의 항생제를 첨가하여 배양할 경우에는 두 벡터가 모두 균주 내에 유지되는 반면, (b) 34℃ 내지 42℃에서 상기 '온도 민감성 벡터'의 항생제 선별 마커(selective marker)에에 상응하는 항생제가 첨가되지 않았으나 상기 '항생제 감응성 벡터'의 항생제 선별 마커(selective marker)에 상응하는 항생제만 첨가된 배지를 사용하여 배양할 경우에는 온도 감응성 벡터, 즉 가이드 RNA(guide RNA) 발현벡터는 균주 내에서 제거되고 재조합 효소(recombinse) 및 Cas 단백질을 발현하는 효소발현벡터만 유지되는 특징이 있다.
예시적으로 본 발명의 제3 관점과 관련하여, 재조합 효소(Recombinase) 및 Cas 단백질을 발현하는 제1항생제 감응성 벡터(pTacCC1-series 등의 pCC1 복제 원점 기반 벡터)를 사용하여 1차 형질전환된 균주에 제2항생제 감응성 벡터(pTacCC1-series 등의 pCC1 복제 원점 기반 벡터)의 가이드 RNA(guide RNA) 발현벡터를 사용하여 2차 형질전환시킨 후, (a) '제1항생제 감응성 벡터' 및 '제2항생제 감응성 벡터'의 항생제 선별 마커(selective marker)에 상응하는 2종의 항생제(이하, 각각 '제1항생제' 및 '제2항생제'라고 한다)를 첨가하여 배양할 경우에는 두 벡터가 모두 균주 내에 유지되는 반면, (b) '제1항생제'만 포함하고, '제2항생제'가 포함되지 않은 배지를 사용하여 배양할 경우에는 가이드 RNA(guide RNA) 발현벡터는 균주 내에서 제거되고 재조합 효소(recombinse) 및 Cas 단백질을 발현하는 효소발현벡터만 유지되는 특징이 있다.
예시적으로 본 발명의 제4 관점과 관련하여, 재조합 효소(recombinase) 및 Cas 단백질을 발현하며 제1항생제에 대한 항생제 선별 마커(selective marker)를 가지는 온도 민감성 벡터(pEKTs-series 등 pBL1ts 복제 원점 기반 벡터)를 사용하여 1차 형질전환된 균주에, 제2항생제에 대한 항생제 선별 마커(selective marker)를 가지는 온도 민감성 벡터(pEKTs-series 등 pBL1ts 복제 원점 기반 벡터)의 가이드 RNA(guide RNA) 발현벡터를 사용하여 2차 형질전환시킨 후, (a) 10℃ 내지 34℃에서 상기 제1항생제 및 상기 제2항생제를 함께 첨가한 배지를 이용하여 배양할 경우에는 두 벡터가 모두 균주 내에 유지되는 반면, (b) 34℃ 내지 42℃에서 무항생제 배지에서 배양할 경우 두 벡터가 모두 제거될 수 있으나, (c) 34℃ 내지 42℃에서 상기 제1항생제는 첨가하고 상기 제2항생제를 포함하지 않은 배지에서 배양할 경우 효소발현벡터만 가진 균주가 선별될 수 있다.
예시적으로 본 발명의 제5 관점과 관련하여, 재조합 효소(recombinase)를 발현하는 온도 민감성 벡터(pEKTs-series 등 pBL1ts 복제 원점 기반 벡터)를 사용하여 1차 형질전환된 균주에 항생제 감응성(pTacCC1-series 등 pCC1 복제 원점 기반)의 Cas 단백질/가이드 RNA(guide RNA) 발현벡터를 사용하여 2차 형질전환시킨 후, (a) 10℃ 내지 34℃에서 상기 '온도 민감성 벡터' 및 상기 '항생제 감응성 벡터'에 상응하는 항생제를 첨가한 배지를 사용하여 배양할 경우에는 두 벡터가 모두 균주 내에 유지되는 반면, (b) 상기 '항생제 감응성 벡터'에 상응하는 항생제가 첨가되지 않았으나 상기 '온도 민감성 벡터'에 상응하는 항생제가 첨가된 배지를 사용하여 배양할 경우 항생제 감응성 벡터, 즉 가이드 RNA(guide RNA) 발현벡터는 균주 내에서 제거되고 재조합 효소(recombinse) 및 Cas 단백질 발현 벡터만 유지되는 특징이 있다.
또한, 도 23의 예시에 나타난 바와 같이, 예시적으로 본 발명의 제6 관점과 관련하여, 재조합 효소(recombinase)를 발현하는 항생제 감응성 벡터(pTacCC1-series 등의 pCC1 복제 원점 기반 벡터)를 사용하여 1차 형질전환된 균주에 온도 민감성 벡터(pCG9ts-series 등 pBL1ts 복제 원점 기반 벡터)의 Cas9/가이드 RNA(guide RNA) 발현벡터를 사용하여 2차 형질전환시킨 후, (a) 30℃ 내지 34℃에서 상기 '온도 민감성 벡터' 및 상기 '항생제 감응성 벡터'에 상응하는 항생제를 첨가하여 배양할 경우에는 두 벡터가 모두 균주 내에 유지되는 반면, (b) 34℃ 내지 42℃에서 상기 '온도 민감성 벡터'에 상응하는 항생제가 첨가되지 않았으나 상기 '항생제 감응성 벡터'에 상응하는 항생제가 첨가된 배지를 사용하여 배양할 경우에는 온도 감응성 벡터, 즉 가이드 RNA(guide RNA) 발현벡터는 균주 내에서 제거되고 재조합 효소(recombinse) 및 Cas 단백질을 발현하는 효소발현벡터만 유지되는 특징이 있다.
예시적으로 본 발명의 제7 관점과 관련하여, 재조합 효소(recombinase)를 발현하는 제1항생제 감응성 벡터(pTacCC1-series 등의 pCC1 복제 원점 기반 벡터)를 사용하여 1차 형질전환된 균주에 제2항생제 감응성 벡터(pTacCC1-series 등의 pCC1 복제 원점 기반 벡터)의 Cas 단백질/가이드 RNA(guide RNA) 발현벡터를 사용하여 2차 형질전환시킨 후, (a) '제1항생제 감응성' 및 '제2항생제 감응성'에 상응하는 항생제(이하, 각각 '제1항생제' 및 '제2항생제'라고 한다)를 각각 첨가하여 배양할 경우에는 두 벡터가 모두 균주 내에 유지되는 반면, (b) '제1항생제'만 포함하고, '제2항생제'가 포함되지 않은 배지를 사용하여 배양할 경우에는 가이드 RNA(guide RNA) 발현벡터는 균주 내에서 제거되고 재조합 효소(recombinse) 및 Cas 단백질을 발현하는 효소발현벡터만 유지되는 특징이 있다.
예시적으로 본 발명의 제8 관점과 관련하여, 재조합 효소(recombinase)를 발현하는 온도 민감성 벡터(pEKTs-series 등 pBL1ts 복제 원점 기반 벡터)를 사용하여 1차 형질전환된 균주에 온도 민감성 벡터(pEKTs-series 등 pBL1ts 복제 원점 기반 벡터)의 Cas 단백질/가이드 RNA(guide RNA) 발현벡터를 사용하여 2차 형질전환시킨 후, (a) 10℃ 내지 34℃에서 상기 '재조합 효소 및 Cas 단밸질 발현벡터' 및 상기 '가이드 RNA 발현벡터'에 상응하는 항생제를 첨가하여 배양할 경우에는 두 벡터가 모두 균주 내에 유지되는 반면, (b) 34℃ 내지 42℃에서 상기 '재조합 효소 및 Cas 단백질 발현벡터' 및 상기 '가이드 RNA 발현벡터'에 상응하는 항생제가 포함되지 않은 배지에서 배양할 경우 두 벡터가 모두 제거될 수 있으나, 34℃ 내지 42℃에서 상기 '재조합 효소 및 Cas 단백질 발현벡터'에 상응하는 항생제는 포함되었으나 상기 '가이드 RNA 발현벡터'에 상응하는 항생제는 포함되지 않은 배지에서 배양할 경우 효소발현벡터만 가진 균주가 선별될 수 있다.
이 때, 상기 '제1항생제' 및 상기 '제2항생제'는 서로 다른 항생제인 특징이 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 하나의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는 상기 타겟 유전자에 상보적인 결합능을 가지는 하나의 ssODN 및 하나의 가이드 RNA(guide RNA)를 균주 내에 동시에 도입함으로써, 변이균주를 수득할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 타겟 유전자는 둘 이상인 것을 특징으로 하며, 상기 둘 이상의 타겟 유전자는 동시에 또는 순차적으로 결실시킬 수 있다. 본 발명에서는 둘 이상의 타겟 유전자를 동시에 결실하기 위해서는 둘 이상의 타겟 유전자에 각각 상보적인 결합능을 가지는 둘 이상의 ssODN 및 상기 ssODN이 결합하는 유전자 중 하나에 상보적인 결합능을 가지는 가이드 RNA(guide RNA)를 사용하여 복수의 유전자를 결실시킬 수 있다. 이 경우, 둘 이상의 ssODN 및 하나의 가이드 RNA(guide RNA)는 동시에 균주에 도입하는 특징이 있으며, 상기 동시 결실에 있어서, 둘 이상의 ssODN이 동시에 결합하는 서로 다른 인접한 유전자의 거리는 100 kb 이하, 바람직하게는 10 kb 이하, 보다 바람직하게는 3 kb 이하일 수 있으며, 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 둘 이상의 타겟 유전자를 순차적으로 결실시킬 경우에는 재조합 효소(recombinase), 또는 재조합 효소 및 Cas 단백질의 발현 벡터인 효소발현벡터만 유지되도록 배양조건을 조절하고, 제1타겟 유전자에 대한 ssODN과 가이드 RNA(guide RNA), 또는 ssODN 및 Cas 단백질/가이드 RNA(guide RNA)를 발현하는 제1벡터를 온도 민감성 또는 항생제 감응성의 배양 조건에 의하여 제거한 다음, 제2 타겟 유전자에 대한 ssODN과 가이드 RNA(guide RNA), 또는 ssODN 및 Cas 단백질/가이드 RNA(guide RNA)를 발현하는 벡터를 추가 도입하는 과정을 반복 수행함으로써, 다중변이균주를 수득할 수 있다.
본 발명에서는 CRISPR/Cas 시스템을 구성하는 Cas 단백질, 가이드 RNA(guide RNA), RecT로 대표되는 재조합 효소(recombinase) 및 ssODN을 이용하여 코리네박테리움(Corynebacterium) 속에 형질전환시켜 다중변이균주를 제조하는 특징이 있다. 이를 위하여, 본 발명에서는 '효소발현벡터' 및 '제1벡터'를 이용하여 Cas 단백질, 가이드 RNA(guide RNA), RecT로 대표되는 재조합 효소(recombinase)를 전달한다.
본 발명에서의 '효소발현벡터'는 재조합 효소(recombinase) 및/또는 Cas 단백질을 발현하는 벡터로서, 재조합 효소(recombinase)와 Cas 단백질이 동일 벡터 또는 별개의 벡터로 구성되어 발현되는 특징이 있다.
본 발명에서의 '제1벡터'는 CRISPR/Cas 시스템에 작용하는 Cas 단백질 및/또는 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하는 벡터로서, Cas 단백질을 상기 효소발현벡터로 구성하지 않을 경우에는 상기 제1벡터에 삽입할 수 있다. 이 경우, Cas 단백질은 가이드 RNA(guide RNA)와 동일 벡터 또는 별개의 벡터로 구성되어 발현되는 특징이 있다.
본 발명에서의 '제1항생제 감응성 벡터'는 제1 항생제 선별 마커(selective marker)를 가짐과 동시에 상기 제1항생제에 대한 항생제 감응성을 가지는 특징이 있다
본 발명에서의 '제2항생제 감응성 벡터'는 제2 항생제 선별 마커(selective marker)를 가짐과 동시에 상기 제2항생제에 대한 항생제 감응성을 가지는 특징이 있다
본 발명에서 형질전환으로 도입하는 벡터만을 고려할 때, 하나 이상의 타겟 유전자를 결실시키는 방법은 효소발현벡터와 제1 타겟 유전자를 결실시키기 위한 제1벡터를 사용하여 변이균주를 제조하고, 상기 균체에 도입된 효소발현벡터는 제거하지 않고 유지한 상태에서, 제1벡터만 제거한 다음, 제2타겟 유전자를 결실시키기 위한 제2벡터를 다시 도입함으로써 다중변이균주 제조하는 특징이 있다. 이 경우, 두 개의 타겟 유전자를 결실시키기 위해서는 제1타겟 유전자에 대한 제1벡터의 도입 및 제거 후에 제2벡터의 도입과정을 실시하고, 세 개의 타겟 유전자를 결실시키기 위해서는 제1타겟 유전자에 대한 제1벡터의 도입 및 제거, 제2타겟 유전자에 대한 제2벡터의 도입 및 제거, 그리고 제3벡터의 도입으로 2회의 벡터 제거단계를 포함하는 제조방법을 수행하여야 한다.
따라서, 본 발명에서 하나의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는 제1벡터만이 사용될 수 있으며, 두 개의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는 제1벡터 및 제2벡터가 사용되고 1 회의 벡터 제거단계를 포함하며, n(n은 2 이상의 정수) 개의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는 제1벡터부터 제n 벡터를 사용하며, n-1회의 벡터 제거단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서는 타겟 유전자를 결실시키기 위해서는 ssODN과 벡터가 함께 균주 내로 도입되어야 하며, 특히, ssODN는 벡터가 아닌 핵산분자로 도입되기 때문에, 세포 분열과정에서 희석되어 특별한 처리 없이도 자연스럽게 균체 내에서 제거되는 특징이 있다.
본 발명은 제 2 양태에서, (a) 정상 박테리아를 제1항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에 온도 민감성 또는 상기 마커에 의한 항생제 저항성을 가지며 (i) 재조합 효소(recombinase)를 발현하는 효소발현벡터로 형질전환시키는 단계; (b) 상기 형질전환된 박테리아의 수용 세포(competent cell)를 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 수용 세포(competent cell)에 제1 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN)과 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하며, 제2항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에, 상기 제2항생제에 대한 항생제 감응성 또는 온도 감응성을 가지는 제1벡터를 도입하여 1차 형질전환시키는 단계; (d) 상기 1차 형질전환된 균주를 상기 제1항생제는 포함하면서 상기 제2항생제를 포함하지 않은 배지에서 온도 민감성 조건에서 배양하여 삽입된 제1벡터를 제거하여 제1타겟 유전자가 결실된 변이균주를 선별하는 단계; (e) 제 n(n은 2 이상의 정수) 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN) 및 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 포함하는 제n벡터를 사용하되, 나머지 구성은 실질적으로 동일하게 하여 상기 (b) 단계 내지 (d) 단계를 n-1 회 반복하여, n 개의 타겟 유전자가 결실된 다중변이균주를 제조하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계에서 제조된 다중변이균주에서, 삽입된 효소발현벡터 및 제 n벡터를 제거하는 단계를 포함하고, 상기 효소발현벡터, 제1벡터 및 제n벡터 중 하나 이상은 Cas 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법에 관한 것이다.
상기 제 2 양태는 다음의 관점에서 구현될 수 있다.
본 발명은 제9 관점에서, (a) 박테리아를 제1항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에 온도 민감성을 가지며 (i) 재조합 효소(recombinase) 및 (ii) Cas 단백질을 발현하는 효소발현벡터로 형질전환시키는 단계; (b) 상기 형질전환된 박테리아의 수용 세포(competent cell)를 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 수용 세포(competent cell)에 제1 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN) 및 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하며, 제2항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에, 상기 제2항생제에 대한 항생제 감응성을 가지는 제1벡터를 도입하여 1차 형질전환시키는 단계; (d) 상기 1차 형질전환된 균주를 제1항생제는 포함하면서 상기 제2항생제를 포함하지 않은 배지 및 온도 민감성 조건에서 배양하여 삽입된 제1벡터를 제거하여 제1타겟 유전자가 결실된 변이균주를 선별하는 단계; (e) 제 n(n은 2 이상의 정수) 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN) 및 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 사용하되, 나머지 구성은 실질적으로 동일하게 하여 상기 (b) 단계 내지 (d) 단계를 n-1 회 반복하여, n 개의 타겟 유전자가 결실된 다중변이균주를 제조하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계에서 제조된 다중변이균주에서 삽입된 효소발현벡터 및 제n벡터를 제거하는 단계를 포함하는 타겟 유전자가 결실된 박테리아 변이주의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서 하나 이상의 타겟 유전자를 결실시키는 방법은 효소발현벡터와 제1 타겟 유전자를 결실시키기 위한 ssODN 및 제1벡터를 사용하여 변이균주를 제조하고, 상기 균체에 도입된 효소발현벡터는 제거하지 않고 유지한 상태에서, 제1벡터만 제거한 다음, 제2타겟 유전자를 결실시키기 위한 ssODN 및 제2벡터를 다시 도입함으로써 다중변이균주 제조하는 특징이 있다. 이 경우, 두 개의 타겟 유전자를 결실시키기 위해서는 제1타겟 유전자에 대한 제1벡터의 도입 및 제거 후에 제2벡터의 도입과정을 실시하고, 세 개의 타겟 유전자를 결실시키기 위해서는 제1타겟 유전자에 대한 제1벡터의 도입 및 제거, 제2타겟 유전자에 대한 제2벡터의 도입 및 제거, 그리고 제3벡터의 도입으로 2회의 벡터 제거단계를 포함하는 제조방법을 수행하여야 한다.
따라서, 따라서, 형질전환으로 도입하는 벡터만을 고려할 때, 본 발명에서 하나의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는 제1벡터만이 사용될 수 있으며, 두 개의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는 제1벡터 및 제2벡터가 사용되고 1 회의 벡터 제거단계를 포함하며, n(n은 2 이상의 정수) 개의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는 제1벡터부터 제n벡터를 사용하며, n-1회의 벡터 제거단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 제10 관점에서, (a) 박테리아를 제1항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에 상기 제1항생제에 대한 항생제 감응성을 가지며 (i) 재조합 효소(recombinase) 및 (ii) Cas 단백질을 발현하는 효소발현벡터로 형질전환시키는 단계; (b) 상기 형질전환된 박테리아의 수용 세포(competent cell)를 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 수용 세포(competent cell)에 제1 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN) 및 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하며, 제2항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에 온도 민감성을 가지는 제1벡터를 도입하여 1차 형질전환시키는 단계; (d) 상기 1차 형질전환된 균주를 제1항생제는 포함하면서 상기 제2항생제를 포함하지 않은 배지 및 온도 민감성 조건에서 배양하여 삽입된 제1벡터를 제거하여 제1타겟 유전자가 결실된 변이균주를 선별하는 단계; (e) 제 n(n은 2 이상의 정수) 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN) 및 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 사용하되, 상기 (b) 단계 내지 (d) 단계를 n-1 회 반복하여 n 개의 유전자가 결실된 다중변이균주를 제조하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계에서 제조된 다중변이균주에서 삽입된 효소발현벡터 및 제n벡터를 제거하는 단계를 포함하는 타겟 유전자가 결실된 박테리아 변이주의 제조방법에 관한 것이다
본 발명에서 하나 이상의 타겟 유전자를 결실시키는 방법은 효소발현벡터와 제1 타겟 유전자를 결실시키기 위한 ssODN 및 제1벡터를 사용하여 변이균주를 제조하고, 상기 균체에 도입된 효소발현벡터는 제거하지 않고 유지한 상태에서, 제1벡터만 제거한 다음, 제2타겟 유전자를 결실시키기 위한 ssODN 및 제2벡터를 다시 도입함으로써 다중변이균주 제조하는 특징이 있다. 이 경우, 두 개의 타겟 유전자를 결실시키기 위해서는 제1타겟 유전자에 대한 제1벡터의 도입 및 제거 후에 제2벡터의 도입과정을 실시하고, 세 개의 타겟 유전자를 결실시키기 위해서는 제1타겟 유전자에 대한 제1벡터의 도입 및 제거, 제2타겟 유전자에 대한 제2벡터의 도입 및 제거, 그리고 제3벡터의 도입으로 2회의 벡터 제거단계를 포함하는 제조방법을 수행하여야 한다.
따라서, 따라서, 형질전환으로 도입하는 벡터만을 고려할 때, 본 발명에서 하나의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는 제1벡터만이 사용될 수 있으며, 두 개의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는 제1벡터 및 제2벡터가 사용되고 1 회의 벡터 제거단계를 포함하며, n(n은 2 이상의 정수) 개의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는 제1벡터부터 제n벡터를 사용하며, n-1회의 벡터 제거단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 제11 관점에서, (a) 박테리아를 제1항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에 상기 제1항생제에 대한 항생제 감응성을 가지며 (i) 재조합 효소(recombinase) 및 (ii) Cas 단백질을 발현하는 효소발현벡터로 형질전환시키는 단계; (b) 상기 형질전환된 박테리아의 수용 세포(competent cell)를 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 수용 세포(competent cell)에 제1 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN) 및 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하며, 제2항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에 상기 제2항생제에 대한 항생제 감응성을 가지는 제1벡터를 도입하여 1차 형질전환시키는 단계; (d) 상기 1차 형질전환된 균주를 상기 제1항생제는 포함하면서 상기 제2항생제를 포함하지 않은 배지 및 온도 민감성 조건에서 배양하여 삽입된 제1벡터를 제거하여 제1타겟 유전자가 결실된 변이균주를 선별하는 단계; (e) 제 n(n은 2 이상의 정수) 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN) 및 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 사용하되, 나머지 구성은 실질적으로 동일하게 하여 상기 (b) 단계 내지 (d) 단계를 n-1 회 반복하여, n 개의 타겟 유전자가 결실된 다중변이균주를 제조하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계에서 제조된 다중변이균주에서 삽입된 효소발현벡터 및 제n벡터를 제거하는 단계를 포함하는 타겟 유전자가 결실된 박테리아 변이주의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서 하나 이상의 타겟 유전자를 결실시키는 방법은 효소발현벡터와 제1 타겟 유전자를 결실시키기 위한 제1벡터를 사용하여 변이균주를 제조하고, 상기 균체에 도입된 효소발현벡터는 제거하지 않고 유지한 상태에서, 제1벡터만 제거한 다음, 제2타겟 유전자를 결실시키기 위한 제2벡터를 다시 도입함으로써 다중변이균주 제조하는 특징이 있다. 이 경우, 두 개의 타겟 유전자를 결실시키기 위해서는 제1타겟 유전자에 대한 제1벡터의 도입 및 제거 후에 제2벡터의 도입과정을 실시하고, 세 개의 타겟 유전자를 결실시키기 위해서는 제1타겟 유전자에 대한 제1벡터의 도입 및 제거, 제2타겟 유전자에 대한 제2벡터의 도입 및 제거, 그리고 제3벡터의 도입으로 2회의 벡터 제거단계를 포함하는 제조방법을 수행하여야 한다.
따라서, 형질전환으로 도입하는 벡터만을 고려할 때, 본 발명에서 하나의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는 제1벡터만이 사용될 수 있으며, 두 개의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는 제1벡터 및 제2벡터가 사용되고 1 회의 벡터 제거단계를 포함하며, n(n은 2 이상의 정수) 개의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는 제1벡터부터 제n벡터를 사용하며, n-1회의 벡터 제거단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 제12 관점에서, (a) 박테리아를 제1항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에 온도 민감성을 가지며 (i) 재조합 효소(recombinase) 및 (ii) Cas 단백질을 발현하는 효소발현벡터로 형질전환시키는 단계; (b) 상기 형질전환된 박테리아의 수용 세포(competent cell)를 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 수용 세포(competent cell)에 제1 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN) 및 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하며, 제2항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에 온도 민감성을 가지는 제1벡터를 도입하여 1차 형질전환시키는 단계; (d) 상기 1차 형질전환된 균주를 상기 제1항생제는 포함하면서 상기 제2항생제를 포함하지 않은 배지 및 온도 민감성 조건에서 배양하여 삽입된 제1벡터를 제거하여 제1타겟 유전자가 결실된 변이균주를 선별하는 단계; (e) 제 n(n은 2 이상의 정수) 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN) 및 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 사용하되, 나머지 구성은 실질적으로 동일하게 하여 상기 (b) 단계 내지 (d) 단계를 n-1 회 반복하여, n 개의 타겟 유전자가 결실된 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 다중변이균주를 제조하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계에서 제조된 다중변이균주에서 삽입된 효소발현벡터 및 제n벡터를 제거하는 단계를 포함하는 타겟 유전자가 결실된 박테리아 변이주의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서 하나 이상의 타겟 유전자를 결실시키는 방법은 효소발현벡터와 제1 타겟 유전자를 결실시키기 위한 ssODN 및 제1벡터를 사용하여 변이균주를 제조하고, 상기 균체에 도입된 효소발현벡터는 제거하지 않고 유지한 상태에서, 제1벡터만 제거한 다음, 제2타겟 유전자를 결실시키기 위한 ssODN 및 제2벡터를 다시 도입함으로써 다중변이균주 제조하는 특징이 있다. 이 경우, 두 개의 타겟 유전자를 결실시키기 위해서는 제1타겟 유전자에 대한 제1벡터의 도입 및 제거 후에 제2벡터의 도입과정을 실시하고, 세 개의 타겟 유전자를 결실시키기 위해서는 제1타겟 유전자에 대한 제1벡터의 도입 및 제거, 제2타겟 유전자에 대한 제2벡터의 도입 및 제거, 그리고 제3벡터의 도입으로 2회의 벡터 제거단계를 포함하는 제조방법을 수행하여야 한다.
따라서, 형질전환으로 도입하는 벡터만을 고려할 때, 본 발명에서 하나의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는 제1벡터만이 사용될 수 있으며, 두 개의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는 제1벡터 및 제2벡터가 사용되고 1 회의 벡터 제거단계를 포함하며, n(n은 2 이상의 정수) 개의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는 제1벡터부터 제n벡터를 사용하며, n-1회의 벡터 제거단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 제13 관점에서, (a) 박테리아를 제1항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에 온도 민감성을 가지며 재조합 효소(recombinase)를 발현하는 효소발현벡터로 형질전환시키는 단계; (b) 상기 형질전환된 박테리아의 수용 세포(competent cell)를 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 수용 세포(competent cell)에 제1 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN) 및 (ii) Cas 단백질 및 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하며, 제2항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에 상기 제2항생제에 대한 항생제 감응성을 가지는 제1벡터를 도입하여 1차 형질전환시키는 단계; (d) 상기 1차 형질전환된 균주를 상기 제1항생제는 포함하면서 상기 제2항생제를 포함하지 않은 배지 및 온도 민감성 조건에서 배양하여 삽입된 제1벡터를 제거하여 제1타겟 유전자가 결실된 변이균주를 선별하는 단계; (e) 제 n(n은 2 이상의 정수) 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN) 및 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 사용하되, 나머지 구성은 실질적으로 동일하게 하여 상기 (b) 단계 내지 (d) 단계를 n-1 회 반복하여, n 개의 타겟 유전자가 결실된 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 다중변이균주를 제조하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계에서 제조된 다중변이균주에서 삽입된 효소발현벡터 및 제1벡터를 제거하는 단계를 포함하는 타겟 유전자가 결실된 박테리아 변이주의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서 하나 이상의 타겟 유전자를 결실시키는 방법은 효소발현벡터와 제1 타겟 유전자를 결실시키기 위한 ssODN 및 제1벡터를 사용하여 변이균주를 제조하고, 상기 균체에 도입된 효소발현벡터는 제거하지 않고 유지한 상태에서, 제1벡터만 제거한 다음, 제2타겟 유전자를 결실시키기 위한 ssODN 및 제2벡터를 다시 도입함으로써 다중변이균주 제조하는 특징이 있다. 이 경우, 두 개의 타겟 유전자를 결실시키기 위해서는 제1타겟 유전자에 대한 제1벡터의 도입 및 제거 후에 제2벡터의 도입과정을 실시하고, 세 개의 타겟 유전자를 결실시키기 위해서는 제1타겟 유전자에 대한 제1벡터의 도입 및 제거, 제2타겟 유전자에 대한 제2벡터의 도입 및 제거, 그리고 제3벡터의 도입으로 2회의 벡터 제거단계를 포함하는 제조방법을 수행하여야 한다.
따라서, 따라서, 형질전환으로 도입하는 벡터만을 고려할 때, 본 발명에서 하나의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는 제1벡터만이 사용될 수 있으며, 두 개의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는 제1벡터 및 제2벡터가 사용되고 1 회의 벡터 제거단계를 포함하며, n(n은 2 이상의 정수) 개의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는 제1벡터부터 제n벡터를 사용하며, n-1회의 벡터 제거단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 제14 관점에서, (a) 박테리아를 제1항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에 상기 제1항생제에 대한 항생제 감응성을 가지며 재조합 효소(recombinase)를 발현하는 효소발현벡터로 형질전환시키는 단계; (b) 상기 형질전환된 박테리아의 수용 세포(competent cell)를 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 수용 세포(competent cell)에 하나의 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN), 및 (ii) Cas 단백질 및 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하며, 제2항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에 온도 민감성을 가지는 제1벡터를 도입하여 1차 형질전환시키는 단계; (d) 상기 1차 형질전환된 균주를 상기 제1항생제는 포함하면서 상기 제2항생제를 포함하지 않은 배지 및 온도 민감성 조건에서 배양하여 삽입된 제1벡터를 제거하여 제1 타겟 유전자가 결실된 변이균주를 선별하는 단계; (e) 제 n(n은 2 이상의 정수) 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN) 및 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 사용하되, 나머지 구성은 실질적으로 동일하게 하여 상기 (b) 단계 내지 (d) 단계를 n-1 회 반복하여, n 개의 타겟 유전자가 결실된 다중변이균주를 제조하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계에서 제조된 다중변이균주에서 삽입된 효소발현벡터 및 제1벡터를 제거하는 단계를 포함하는 타겟 유전자가 결실된 박테리아 변이주의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서 하나 이상의 타겟 유전자를 결실시키는 방법은 효소발현벡터와 제1 타겟 유전자를 결실시키기 위한 ssODN 및 제1벡터를 사용하여 변이 균주를 제조하고, 상기 균체에 도입된 효소발현벡터는 제거하지 않고 유지한 상태에서, 제1벡터만 제거한 다음, 제2타겟 유전자를 결실시키기 위한 ssODN 및 제2벡터를 다시 도입함으로써 다중변이균주 제조하는 특징이 있다. 이 경우, 두 개의 타겟 유전자를 결실시키기 위해서는 제1타겟 유전자에 대한 제1벡터의 도입 및 제거 후에 제2벡터의 도입과정을 실시하고, 세 개의 타겟 유전자를 결실시키기 위해서는 제1타겟 유전자에 대한 제1벡터의 도입 및 제거, 제2타겟 유전자에 대한 제2벡터의 도입 및 제거, 그리고 제3벡터의 도입으로 2회의 벡터 제거단계를 포함하는 제조방법을 수행하여야 한다.
따라서, 따라서, 형질전환으로 도입하는 벡터만을 고려할 때, 본 발명에서 하나의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는 제1벡터만이 사용될 수 있으며, 두 개의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는 제1벡터 및 제2벡터가 사용되고 1 회의 벡터 제거단계를 포함하며, n(n은 2 이상의 정수) 개의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는 제1벡터부터 제n벡터를 사용하며, n-1회의 벡터 제거단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 제15 관점에서, (a) 박테리아를 제1항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에 상기 제1항생제에 대한 항생제 감응성을 가지며 재조합 효소(recombinase)를 발현하는 효소발현벡터로 형질전환시키는 단계; (b) 상기 형질전환된 박테리아의 수용 세포(competent cell)를 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 수용 세포(competent cell)에 하나의 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN), 및 (ii) Cas 단백질 및 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하며, 제2항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에 상기 제2항생제에 대한 항생제 감응성을 가지는 제1벡터를 도입하여 1차 형질전환시키는 단계; (d) 상기 1차 형질전환된 균주를 상기 제1항생제는 포함하면서 상기 제2항생제를 포함하지 않은 배지 및 온도 민감성 조건에서 배양하여 삽입된 제1벡터를 제거하여 제1타겟 유전자가 결실된 변이균주를 선별하는 단계; (e) 제 n(n은 2 이상의 정수) 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN) 및 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 사용하되, 나머지 구성은 실질적으로 동일하게 하여 상기 (b) 단계 내지 (d) 단계를 n-1 회 반복하여, n 개의 타겟 유전자가 결실된 다중변이균주를 제조하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계에서 제조된 다중변이균주에서 삽입된 효소발현벡터 및 제n벡터를 제거하는 단계를 포함하는 타겟 유전자가 결실된 박테리아 변이주의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서 하나 이상의 타겟 유전자를 결실시키는 방법은 효소발현벡터와 제1 타겟 유전자를 결실시키기 위한 ssODN 및 제1벡터를 사용하여 변이균주를 제조하고, 상기 균체에 도입된 효소발현벡터는 제거하지 않고 유지한 상태에서, 제1벡터만 제거한 다음, 제2타겟 유전자를 결실시키기 위한 ssODN 및 제2벡터를 다시 도입함으로써 다중변이균주 제조하는 특징이 있다. 이 경우, 두 개의 타겟 유전자를 결실시키기 위해서는 제1타겟 유전자에 대한 제1벡터의 도입 및 제거 후에 제2벡터의 도입과정을 실시하고, 세 개의 타겟 유전자를 결실시키기 위해서는 제1타겟 유전자에 대한 제1벡터의 도입 및 제거, 제2타겟 유전자에 대한 제2벡터의 도입 및 제거, 그리고 제3벡터의 도입으로 2회의 벡터 제거단계를 포함하는 제조방법을 수행하여야 한다.
따라서, 형질전환으로 도입하는 벡터만을 고려할 때, 본 발명에서 하나의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는 제1벡터만이 사용될 수 있으며, 두 개의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는 제1벡터 및 제2벡터가 사용되고 1 회의 벡터 제거단계를 포함하며, n(n은 2 이상의 정수) 개의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는 제1벡터부터 제n벡터를 사용하며, n-1회의 벡터 제거단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 제16 관점에서, (a) 박테리아를 제1항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에 온도 감응성을 가지며 재조합 효소(recombinase)를 발현하는 효소발현벡터로 형질전환시키는 단계; (b) 상기 형질전환된 박테리아의 수용 세포(competent cell)를 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 수용 세포(competent cell)에 하나의 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN), 및 (ii) Cas 단백질 및 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하며, 제2항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에 온도 민감성을 가지는 제1벡터를 도입하여 1차 형질전환시키는 단계; (d) 상기 1차 형질전환된 균주를 상기 제1항생제는 포함하면서 상기 제2항생제를 포함하지 않은 배지 및 온도 민감성 조건에서 배양하여 삽입된 제1벡터를 제거하여 제1타겟 유전자가 결실된 변이균주를 선별하는 단계; (e) 제 n(n은 2 이상의 정수) 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN) 및 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 사용하되, 나머지 구성은 실질적으로 동일하게 하여 상기 (b) 단계 내지 (d) 단계를 n-1 회 반복하여, n 개의 타겟 유전자가 결실된 다중변이균주를 제조하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계에서 제조된 다중변이균주에서 삽입된 효소발현벡터 및 제n벡터를 제거하는 단계를 포함하는 타겟 유전자가 결실된 박테리아 변이주의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서 하나 이상의 타겟 유전자를 결실시키는 방법은 효소발현벡터와 제1 타겟 유전자를 결실시키기 위한 제1벡터를 사용하여 변이균주를 제조하고, 상기 균체에 도입된 효소발현벡터는 제거하지 않고 유지한 상태에서, 제1벡터만 제거한 다음, 제2타겟 유전자를 결실시키기 위한 제2벡터를 다시 도입함으로써 다중변이균주 제조하는 특징이 있다. 이 경우, 두 개의 타겟 유전자를 결실시키기 위해서는 제1타겟 유전자에 대한 제1벡터의 도입 및 제거 후에 제2벡터의 도입과정을 실시하고, 세 개의 타겟 유전자를 결실시키기 위해서는 제1타겟 유전자에 대한 제1벡터의 도입 및 제거, 제2타겟 유전자에 대한 제2벡터의 도입 및 제거, 그리고 제3벡터의 도입으로 2회의 벡터 제거단계를 포함하는 제조방법을 수행하여야 한다.
따라서, 형질전환으로 도입하는 벡터만을 고려할 때, 본 발명에서 하나의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는, 제1벡터만이 사용될 수 있으며, 두 개의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는 제1벡터 및 제2벡터가 사용되고 1 회의 벡터 제거단계를 포함하며, n(n은 2 이상의 정수) 개의 타겟 유전자를 결실시킬 경우에는 제1벡터부터 제n벡터를 사용하며, n-1회의 벡터 제거단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서는 타겟 유전자를 결실시키기 위해서는 ssODN과 벡터가 함께 균주 내로 도입되어야 하며, 특히, ssODN는 벡터가 아닌 핵산분자로 도입되기 때문에, 세포 분열과정에서 희석되어 특별한 처리 없이 자연스럽게 균체 내에서 제거되는 특징이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN)은 하나 이상 도입할 수 있으며 또한, 상기 (c) 단계의 제1벡터에서 발현되는 가이드 RNA(guide RNA)는 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 하나 이상의 타겟 유전자를 결실시키기 위해서는 하나 이상의 ssODN 및 가이드 RNA(guide RNA)를 균주에 도입함으로써, 가능하다. 이 경우 하나의 타겟 유전자에 대한 ssODN/가이드 RNA를 삽입하고 난 다음, 다른 타겟 유전자에 대한 ssODN 및 가이드 RNA를 삽입하는 식의 순차적 결실뿐만 아니라, 복수 개의 ssODN 및 복수 개의 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하는 복수 개의 벡터를 균주에 도입한 다음, 상기 방법을 반복함으로써, 하나 이상의 타겟 유전자를 동시에 결실시키면서 순차적으로 또 다른 타겟 유전자를 추가로 결실시킬 수 있다.
또한, 본 발명에서 둘 이상의 타겟 유전자를 동시 결실시킬 경우, 둘 이상의 타겟 유전자에 각각 상보적인 결합능을 가지는 둘 이상의 ssODN 및 상기 ssODN이 결합하는 유전자 중 하나에 상보적인 결합능을 가지는 가이드 RNA(guide RNA)를 사용하여 복수의 유전자를 결실시킬 수 있다. 이 경우, 둘 이상의 ssODN 및 하나의 가이드 RNA(guide RNA)는 동시에 균주에 도입하는 특징이 있으며, 각 ssODN이 결합하는 타겟 유전자는 인접한 유전자인 특징이 있다. 상기 동시 결실에 있어서, 둘 이상의 ssODN이 동시에 결합하는 서로 다른 인접한 유전자의 거리는 100 kb 이하, 바람직하게는 10 kb 이하, 보다 바람직하게는 3 kb 이하일 수 있으며, 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명의 박테리아는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 균주일 수 있으며, 바람직하게는 C. glutamicum ATCC 13032일 수 있고, 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명의 제조방법에 의하여 최종 선별된 변이 균주를 34℃ ~ 42℃에서 항생제 감응성에 상응하는 항생제를 포함하지 않은 배지를 사용하여 배양할 경우, 도입된 벡터가 모두 제거되어, 산업적으로 활용할 수 있다.
본 발명의 용어 '변이균주'는 야생형 미생물의 유전자를 인위적으로 변형 또는 변이시켜, 야생형과 다른 유전형을 가진 미생물을 일컫는 것으로, '변이주', '형질전환체, 하나 이상의 유전자가 변이 또는 결실되었을 경우에는 '다중변이균주'로 통용될 수 있다.
본 발명에서의 '온도 민감성' 벡터는 pBL1 복제 원점을 가지며, 이에 작용하는 Rep 단백질 상에 단일 염기 돌연변이를 가지도록 인위적으로 조작한 벡터이다. 상기 rep 단백질은 pBL1 복제 원점(ori)의 복제과정에 관여하며, 상기 Rep 단백질의 유전자에 단일 염기 돌연변이(C→T)가 도입되면, P47S의 아미노산 치환이 발생하고, 이러한 벡터를 포함한 균주의 배양 온도가 항생제 첨가 없이 34℃ 이상으로 상승할 경우, pBL1 복제 원점(ori)은 그 기능을 상실하는 것으로 알려져 있다(Nakamura et al., Plasmid 56(3):179-186, 2006). 따라서, 상기 복제 원점을 가진 벡터를 이용하여 제조된 박테리아 변이주는 항생제가 존재하는 배지에서 10℃ ~ 30℃에서 배양할 경우 벡터가 안정적으로 유지되지만, 무항생제 배지에서 34℃ 이상, 통상적으로 37℃ 내지 42℃ 이하에서 배양할 경우, 벡터가 유지되지 못하므로, 따라서, 무항생제 배양조건에서 배양 온도를 조절함으로써, 벡터를 유지 또는 제거할 수 있다.
본 발명에서의 '항생제 감응성' 벡터는 본 기술을 개발하는 과정에서 pTacCC1 계열의 벡터는 상기 벡터에 삽입된 저항성 유전자, 즉 항생제 선별 마커(selective marker)에 상응하는 항생제의 농도가 낮아질 경우, 벡터가 소실되는 것을 발견하고, 이러한 특징을 벡터 제거에 활용하게 되었다.
또한, '제1항생제 감응성' 벡터 및 '제2항생제 감응성' 벡터는 제1항생제 선별 마커(selective marker) 또는 제1항생제 선별 마커(selective marker)를 가진 벡터로서, 서로 다른 저항성 유전자가 삽입된 특징이 있으며, 해당 항생제의 농도가 낮아질 경우, 이에 상응하는 벡터만 소실되는 특징이 있다.
따라서, 본 발명에서 '온도 민감성' 벡터는 pBL1 복제 원점을 가지며, 이에 작용하는 Rep 단백질 상에 단일 염기 돌연변이를 가지도록 인위적으로 조작한 벡터이다.
또한, 본 발명에서 '항생제 감응성' 벡터는 항생제 저항성 유전자를 가지며 pCC1 복제 원점을 가지는 벡터로서, 특히 '제1항생제 감응성' 및 '제2항생제 감응성'에 작용하는 항생제는 서로 다른 특징이 있다.
본 벡터에서 상기 항생제는 카나마이신(kanamycin), 스펙티노마이신(spectinomycin), 스트렙토마이신(streptomycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), 또는 아프라마이신(apramycin)일 수 있으며, 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 벡터가 항생제 선발 마커(selective marker)를 가짐과 동시에 항생제 감응성의 특징을 가질 경우, 상기 '선별 마커'에 상응하는 항생제와 상기 '항생제 감응성'에 작용하는 항생제는 동일하거나 서로 다른 항생제를 사용하여도 무방하다. 후자의 경우에는 2종의 항생제 선발 마커(selective marker)가 벡터에 존재함으로써, 구현될 수 있다.
본 발명에서, '온도 민감성' 벡터를 제거할 경우, 온도를 34℃ 이상, 통상적으로 37℃ 내지 42℃ 이하에서, 상기 벡터에 포함된 항생제 선별 마커(selective marker)에 상응하는 항생제를 포함하지 않은 배지에서 배양하여야만 벡터가 완전히 제거될 수 있다.
본 발명에서의 용어 '재조합'은 예컨대 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터 등을 언급하며 사용될 때, 이종(heterologous) 핵산 또는 단백질의 도입 또는 천연형 (native) 핵산 또는 단백질의 변경, 또는 변형된 세포로부터 유래한 세포에 의해 변형된 세포, 핵산, 단백질, 또는 벡터를 나타낸다.
본 발명은 또한 타겟 유전자를 감마-아미노뷰티르산(γ-aminobutyric acid, GABA) 합성 대사관련된 유전자를 결실시킬 수 있다.
상기 감마-아미노뷰티르산(γ-aminobutyric acid, GABA) 합성 대사에 관여하는 유전자는 Ncgl1221, gabT, 및 gabP인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 제17 관점에서, Ncgl1221, gabT, 및 gabP이 결실된 글루탐산(glutamate) 과생산능을 가지는 박테리아 변이주에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 변이 균주는 본 발명의 제조방법을 통하여, 세 개의 유전자를 동시에 또는 순차적으로 결실시켜 제조할 수 있다: 예시적으로, 본 발명의 글루탐산(glutamate) 과생산능을 가지는 박테리아 변이주를 순차적 결실에 의하여 제조할 수 있다: 효소발현벡터를 삽입하여 박테리아를 형질전환시킨 다음, (a) Ncgl1221를 타겟으로 하는 ssODN 및 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하는 제1벡터로 1차 형질전환시키고, 상기 제1벡터의 온도 민감성 또는 항생제 감응성의 특징에 따라 배양 조건을 조절하여 제1벡터를 제거함으로써, 재조합 효소(recombinase) 및/또는 Cas 단백질만이 발현되며 Ncgl1221가 결실된 1차 형질전환된 균주를 수득할 수 있다. 그런 다음, (b) gabT를 타겟으로 하는 ssODN 및 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하는 제2벡터를 추가로 삽입하고, 상기 제2벡터 제거과정을 반복하여 Ncgl1221 및 gabT가 결실된 2차 형질전환된 균주를 제조할 수 있다. 그런 후에 다시, (c) 상기 Ncgl1221 및 gabT가 결실된 2차 형질전환된 균주에 gabP를 타겟으로 하는 ssODN 및 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하는 제3벡터를 다시 삽입하여 Ncgl1221, gabT 및 gabP가 결실된 3차 형질전환균주를 제조함으로써, 타겟 유전자를 모두 결실시킬 수 있다. 최종적으로 재조합 효소(recombinase) 및/또는 Cas 단백질을 발현하는 벡터를 제거하는 배양 조건을 이용하여 변이 균주 내 도입된 외래 벡터를 모두 제거함으로써, 순차적 결실에 의하여 변이균주를 완성하였다.
또한, 본 발명의 글루탐산(glutamate) 과생산능을 가지는 박테리아 변이주를 동시 결실에 의하여 제조할 수 있다: 재조합 효소(recombinase) 및/또는 Cas 단백질을 발현하는 효소발현벡터를 삽입하여 형질전환시킨 다음, (a) gabT 및 gabP를 타겟으로 하는 ssODN, 및 gabT 또는 gabP 타겟으로 하는 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하는 제1벡터로 1차 형질전환시키고, 최종적으로 재조합 효소(recombinase) 및/또는 Cas 단백질을 발현하는 벡터를 제거하는 배양 조건을 이용하여 변이 균주 내 도입된 외래 벡터를 모두 제거함으로써, 동시 결실에 의한 변이균주를 제조할 수 있다.
상기 둘 이상의 타겟 유전자 동시 결실에 의한 변이균주 제조에 있어서는 인접한 유전자에 대해서는 각 타겟에 상보적으로 결합하는 둘 이상의 ssODN 및 하나의 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA(guide RNA)로 결실이 가능하기 때문에, 3kb 정도 떨어진 gabT 및 gabP에 적용할 경우, 2 종의 ssODN과 1 종의 가이드 RNA(guide RNA)만으로도 결실 효과를 얻을 수 있는 특징이 있다.
상기 '벡터를 제거하는 배양 조건'은 온도 민감성 벡터(pEKTs-series 등 pBL1ts 복제 원점 기반 벡터)는 항생제가 존재하는 조건에서 10℃ 내지 34℃에서 배양할 경우에는 벡터가 유지되는 반면, 무항생제 배지에서 34℃ 내지 37℃에서 배양할 경우에는 벡터가 제거되는 특징을 가진다. 또한, 항생제 감응성 벡터(pTacCC1-series 등 pCC1 복제 원점 기반)는 항생제 감응성에 상응하는 항생제가 배지를 사용하여 10℃ 내지 42℃에서 배양할 경우에는 벡터가 유지되지만, 상기 항생제가 첨가되지 않은 배지를 사용하여 10℃ 내지 42℃에서 배양할 경우에는 벡터가 제거될 수 있다.
본 발명은 제18 관점에서, 상기 균주를 배양하여 감마-아미노뷰티르산(γ-aminobutyric acid, GABA)를 생성하는 단계; 및 상기 생성된 감마-아미노뷰티르산(γ-aminobutyric acid, GABA)를 회수하는 단계를 포함하는 감마-아미노뷰티르산(γ-aminobutyric acid, GABA) 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 균주, 변이균주 또는 형질전환체의 '배양'은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 미생물에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.
구체적으로, 배양에 사용되는 배지는 특정한 미생물의 요구조건을 적절하게 만족시킬 수 있도록 다양한 탄소원, 질소원, 미량원소 성분, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 다양한 미생물 배양 배지들은 예를 들어 문헌("Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981.)에 기재되어 있다.
상기 탄소원은 탄수화물, 지방, 지방산, 알코올, 유기산, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 탄소원을 포함할 수 있다. 상기 탄수화물은 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있다. 상기 지방은 대두유, 해바라기유, 파자마유, 코코넛유, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있다. 상기 지방산은 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있다. 상기 알코올은 글리세롤, 에탄올 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있다. 상기 유기산은 아세트산을 포함할 수 있다.
상기 질소원은 유기 질소원, 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 유기 질소원은 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 대두밀, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있다. 상기 무기 질소원은 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄, 질산암모늄, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있다.
상기 배지는 인, 금속염, 아미노산, 비타민, 전구체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포 함할 수 있다. 상기 인의 공급원은 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 또는 이들에 상응하는 소듐-함유염을 포함할 수 있다. 상기 금속염은 황산마그네슘 또는 황산철을 포함할 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
본 실시예 및 하기 실시예들에서 사용한 제한효소는 New England Biolabs (미국) 및 Enzynomics(한국), PCR 중합효소는 BIOFACT(한국), DNA 접합 효소 (DNA ligase)는 Elpis Biotech (한국)에서 구입하였다. 이외의 것에 대해서는 별도로 표시하였다.
실시예1: C. glutamicum 에서 Cas9 및 guide RNA의 발현 및 성능 확인
1-1: Cas9을 발현하는 벡터(pEKEx1-Cas9opt)의 제조
C. glutamicum에서 Cas9 단백질을 효과적으로 발현할 수 있는 벡터 pEKEx1-Cas9opt를 다음과 같은 과정을 통해 제조하였다.
pCRISPR-Cas9 벡터(Tong et al., ACS Synthetic Biology, 4(9): 1020-1029, 2015)로 부터 Cas9 유전자를 추출하기 위하여, 상기 벡터를 Template로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 Actinomycetes의 코돈출현빈도(codon usage)에 따라 코돈 최적화(codon optimization)이 된 cas9 유전자를 증폭하였다.
이때 증폭하는 과정에서 사용한 서열번호 1의 프라이머에 포함된 hexahistidine 태그의 서열에 의하여, 증폭된 cas9 유전자의 5′ 말단에 hexahistidine 태그의 서열이 첨가되었다.
서열번호 염기서열
서열번호 1 5′-TCACACAGGA AACAGAATTC ATGCATCATC ATCATCATCA TATGGACAAG AAGTACTCCA TCGGC-3′
서열번호 2 5′-GCAGGTCGAC GGATCCAAGC TTTCAGTCGC CGCC-3′
증폭한 서열은 EcoRI과 BamHI으로 절단된 pEKEx1(도 1; Eikmanns et al., Gene 102(1): 93-98, 1991)에 SLIC(one-step sequence and ligation-independent cloning) 프로토콜(Jeong et al., Applied and Environmental Microbiology, 78(15):174, 2012)을 이용해 삽입하였으며, 최종적으로 pEKEx1-Cas9opt를 제조하였다(도 2).
SLIC에 이용한 T4 DNA polymerase는 New England Biolabs(미국)에서 구입하였다.
1-2: pEKEx1-Cas9opt에서의 Cas9 발현 확인
cas9 유전자가 삽입된 pEKEx1-Cas9opt로부터 C. glutamicum 내에서 Cas9이 발현하는지를 확인하기 위해, 상기 벡터를 전기천공법(electroporation)으로 C. glutamicum ATCC 13032에 도입하였다.
상기 전기천공법을 통한 형질전환은 우선, early exponential phase로 배양된 C. glutamicum에 대해, 0 ~ 4℃로 냉각된 10% glycerol로 2회 세척하여 수용성 세포(competent cell)로 변형시키고, 도입하고자 하는 벡터와 혼합한 후, 0 ~ 4℃로 냉각되고 전극 사이 거리가 1 mm인 전기천공용 큐벳에 옮겨, 25 μF의 정전 용량, 1.8 kV의 전압, 및 200 Ω 저항으로 전기 충격을 가해 진행하였다.
상기 전기천공법을 진행한 세포는 RG 배지(10 g/L glucose, 40 g/L BHI, 10 g/L Beef extract, 30 g/L sorbitol)를 참가하고, 30℃에서 200 rpm으로 교반하며 회복시키고, 일부를 25 μg/mL kanamycin이 첨가된 RG 고체 배지(10 g/L glucose, 40 g/L BHI, 10 g/L beef extract, 30 g/L sorbitol, 1.5 g/L agarose)에 도말하고 30℃에서 배양하여 형질전환된 콜로니를 얻었다.
상기 형질전환 C. glutamicum 콜로니에 대해 cas9 유전자가 삽입된 pEKEx1-Cas9opt로부터 Cas9이 발현하는지를 확인하기 위해 상기 형질전환 C. glutamicum 균주를 다시 RG 배지(10 g/L glucose, 40 g/L BHI, 10 g/L beef extract, 30 g/L sorbitol)와 BHI(brain heart infusion, Becton, Dickinson and Company(미국))에 접종해 30℃에서 24시간 동안 200 rpm의 조건에서 교반 배양하였다. 배양 중 0, 0.5, 1, 및 2 mM IPTG를 첨가하고, 배양이 종료되면, 원심분리법으로 균체를 회수한 뒤 600 nm 파장에서 최종 광학밀도(OD600)가 7이 되도록 완충용액(20 mM Tris-HCl (pH8.0), 300 mM NaCl, 5 mM Imidazole)을 사용하여 균체를 현탁한 후, 초음파 분쇄법(sonication)을 통해 융해시켰다.
초음파 분쇄법으로 융해하여 얻은 균체 유래 단백질을 10% Tricine-SDS-PAGE(Schagger et al., Nature Protocols, 1(1):16-22, 2006)을 이용하여 전개 시키고, Coomassie Briliant Blue R-250를 사용한 종래의 방법으로 염색하여 Cas9의 발현 유무를 확인하였다(Lawrence et al., Journal of Visualized Experiments, (30):e1350, 2009. doi: 10.3791/1350).
그 결과, cas9 유전자가 삽입된 pEKEx1-Cas9opt로 형질전환된 C. glutamicum 균주를 RG 배지에 배양하였을 때 IPTG를 첨가하지 않은 경우 Cas9 단백질이 발현되지 않으며 IPTG가 0.5 mM 이상 농도로 첨가할 경우 Cas9 단백질이 강하게 발현되는 것을 확인하였다. 반면 상기 균주를 BHI에서 배양할 경우 IPTG를 첨가하지 않아도 Cas9 단백질이 발현되는 것을 확인하였다(도 3).
1-3: Cas9과 guide RNA를 동시에 발현하는 벡터(pCG9-series)의 제조
상기 pEKEx1-Cas9opt에 guide RNA로서 sgRNA를 코딩하는 유전자를 추가로 클로닝하여 C. glutamicum에서 Cas9과 sgRNA가 동시에 발현되도록 하기 위하여 벡터 pCG9-series를 다음과 같이 제조하였다.
pWAS 벡터(Na et al., Nature Biotechnology, 31(2):170-174, 2013)를 템플릿으로 하고, 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 T1/TE 종결 부위(terminator)를 증폭하며 표적 유전자와 상보적으로 결합하는 안내 서열(guide sequence)를 제외한 sgRNA의 서열이 결합된 sgRNA-T1/TE DNA 조각을 증폭하였다. 그 후, 상기 증폭된 sgRNA-T1/TE DNA를 EcoRI과 HindIII로 절단된 pUC19에 삽입하여 pUC19-sgRNA를 제조하였다(도 4).
서열번호 염기서열
서열번호 3 5′-atgctcgaat tcgttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgctt cactcgagcc aggcatcaaa ta-3′
서열번호 4 5′-atgctcaagc tttataaacg cagaaaggcc cac-3′
상기 pUC19-sgRNA의 sgRNA를 템플릿으로 하여 pEKEx1-Cas9opt에 삽입할 sgRNA 및 T1/TE 종결 부위의 염기서열을 코딩하는 DNA 조각 추출하기 위하여, 서열번호 5와 서열번호 6의 프라이머를 이용하여 원하는 안내 서열이 담긴 sgRNA-T1/TE DNA 조각을 증폭하였다. 단, 서열번호 5에서 20개의 N은 표적 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 20개의 염기서열을 의미한다.
이어서 증폭한 DNA 조각을 템플릿으로 하여 서열번호 7과 서열번호 8의 프라이머를 이용하여 pEKEx1-Cas9opt에 도입할 sgRNA-T1/TE DNA 최종 조각을 증폭하였다.
서열번호 염기서열
서열번호 5 5′-TTGACAATTA ATCATCGGCT CGTATAATGT GTGGNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNGTTTTA GAGCTAGAAA TAGCAAGT-3′
서열번호 6 5′-TATAGATATC CCGCGGTATA TTAATTAATA TAAACGCAGA AAGGCCC-3′
서열번호 7 5′-TGGATGATGG GGCGATTCAG GTATAGATAT CTTGACAATT AATCATCGGC T-3′
서열번호 8 5′-AAGGTGTTGC TGACTCATAC CAGGTATAGA TATCCCGCGG TATA-3
증폭한 상기 조각은 pEKEx1-Cas9opt의 StuI 위치에 Gibson assembly (Gibson et al., Nature Methods, 6(5):343-345, 2009)를 이용해 클로닝하였다(도 5). 그 결과 C. glutamicum에서 Cas9 단백질과 sgRNA를 동시에 발현할 수 있는 pCG9-series를 제작하였다(도 6).
1-4: pCG9-series에서의 Cas9 및 sgRNA의 동시발현능 확인
pCG9-series로 형질전환된 C. glutamicum에서 Cas9-sgRNA 복합체가 발현되어 표적 유전자를 절단하는 능력을 보이는지 확인하기 위해, C. glutamicum의 아르지닌 리프레서(arginine repressor) argR 유전자를 타겟으로 하여, 이에 대한 Cas9과 sgRNA를 발현하는 pCG9-argR1를 전기천공법으로 C. glutamicum에 도입하였을 때 형질전환 효율을 측정하는 실험을 다음과 같이 진행하였다.
본 실험에서는 pEKEx1-Cas9opt, pEKEx1-sgRNA argR1 및 pdCG9-argR1을 대조군으로 사용하였으며, 이에 필요한 벡터, pEKEx1-sgRNA argR1 및 pdCG9-argR1를 다음과 같이 추가로 제작하였다.
(a) pEKEx1-sgRNA argR1의 제조
pUC19-sgRNA를 템플릿으로 하여, sgRNA-T1/TE DNA를 증폭하기 위하여 실시예 1-3에서 언급한 서열번호 5의 프라이머에 C. glutamicum의 아르지닌 리프레서 argR 유전자를 표적으로 하는 5′-TGG-3′를 PAM서열로 하는 guide sequence(5′-AGCTCTCATT TTGCAGATTT-3′)가 포함된 서열번호 9 및 서열번호 6의 프라이머를 이용하여 sgRNA-T1/TE DNA 조각을 1차적으로 증폭하였다.
상기 안내 서열은 CRISPy-web을 사용하여 선별하여 개시코돈 근방의 상기 서열로 결정하였다.
다음, 상기 증폭물에 대해 서열번호 7과 서열번호 8의 프라이머를 이용하여 2차적으로 증폭하였다. 증폭한 argR 유전자를 표적으로 하는 sgRNA-T1/TE 서열을 코딩하는 DNA 절편은 pEKEx1의 StuI 절단 부위에 삽입되도록 Gibson assembly를 통해 pEKEx1에 결합하였다. 그 결과, C. glutamicum argR을 표적으로 하는 sgRNA를 발현시키는 pEKEx1-sgRNA argR1이 제작되었다(도 7).
서열번호 염기서열
서열번호 9 5′-TTGACAATTA ATCATCGGCT CGTATAATGT GTGGAGCTCT CATTTTGCAG ATTTGTTTTA GAGCTAGAAA TAGCAAGT-3′
(b) pCG9-argR1의 제조
Cas9 단백질과 함께 C. glutamicum argR 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 동시에 발현하는 pCG9-argR1를 다음과 같이 제조하였다.
pEKEx1-sgRNA argR1를 템플릿으로 하고, 서열번호 7과 서열번호 8의 프라이머를 이용하여 C. glutamicum argR 유전자를 표적으로 하는 sgRNA-T1/TE 서열을 코딩하는 DNA 조각을 증폭하였다. 증폭한 DNA 조각을 pEKEx1-Cas9opt를 StuI의 절단 부위에 Gibson assembly를 통해 삽입하여, 최종적으로 Cas9 단백질과 함께 C. glutamicum argR 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 발현하는 pCG9-argR1를 제조하였다(도 8).
(c) dCas9을 포함하는 pEKEx1-dCas9 및 pdCG9-argR1의 제조
C. glutmaicum argR을 표적으로 하는 sgRNA와 표적 유전자에 결합은 하나 DNA 절단활성은 상실한 dCas9 단백질을 발현하는 pdCG9-argR1를 제작하기 위해 먼저 pEKEx1-dCas9을 제작하였다.
pCRISPR-dCas9 벡터(Tong et al., ACS Synthetic Biology, 4(9): 1020-1029, 2015)로 부터 dCas9의 유전자를 추출하기 위하여, 상기 벡터를 템플릿으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 Actinomycetes의 코돈출현빈도(codon usage)에 따라 코돈 최적화 (codon optimization)이 된 cas9를 증폭하였다.
이때 증폭하는 과정에서 사용한 서열번호 1의 프라이머에 포함된 hexahistidine 태그의 서열에 의해 증폭된 cas9의 5′ 말단에 hexahistidine 태그의 서열이 포함되도록 제작하였다. 증폭한 서열은 pEKEx1의 EcoRI 및 BamHI의 절단 부위에 SLIC 프로토콜을 이용해 삽입하여, pEKEx1-dCas9opt를 제작하였다(도 9).
다음, pEKEx1-sgRNA argR1를 템플릿으로 하고, 서열번호 7과 서열번호 8의 프라이머를 이용하여 C. glutamicum argR 유전자를 표적으로 하는 sgRNA-T1/TE 서열을 코딩하는 DNA 조각을 증폭하였다. 상기 증폭한 DNA 조각은 pEKEx1-dCas9opt의 StuI 절단부위에 Gibson assembly를 통해 삽입하여, 최종적으로 dCas9과 argR1 sgRNA를 동시 발현하는 pdCG9-argR1를 제작하였다(도 10).
(d) C. glutamicum 에서의 Cas9-sgRNA 복합체 형성능 확인
pEKEx1-sgRNA argR1, pEKEx1-Cas9opt, 및 pCG9-argR1, 및 pdCG9-argR1을 실시예 1-2에 실시한 방법과 동일한 전기천공법을 통해 C. glutamicum에 도입하여, 복합체 형성능을 확인하였다.
그 결과, sgRNA 또는 Cas9 단독으로 발현되거나, dCas9과 sgRNA을 함께 발현시킨 경우, 형질전환된 C. glutamicum의 콜로니는 확인되었으나, pCG9-argR1 도입에 의한 sgRNA와 Cas9을 동시 발현시켰을 경우에는 C. glutamicum의 콜로니를 확인할 수 없어 모두 사멸한 것으로 확인되었다(도 11).
Cas9-sgRNA가 미생물 내에서 발현되어 미생물의 게놈 내 유전자를 절단하여 이중가닥절단(double-strand break, DSB)을 생성시키면 비상동적 말단 접합(non-homologous end joining, NHEJ)을 통한 DSB 수리가 용이하지 않은 대부분의 미생물은 사멸한다는 보고가 있다. 즉, 도 11에서도 이와 동일한 결과를 얻었으며, 이를 바탕으로 C. glutamicum는 비상동적 말단 접합(non-homologous end joining, NHEJ) 기전이 미약한 미생물이며, 본 발명에서의 pCG9-argR1에서 발현된 Cas9 및 sgRNA가 균체 내에서 Cas9-sgRNA 복합체를 형성할 수 있음이 확인되었다.
지금까지의 실험결과에 의하여, C. glutamicum에 대해 CRISPR/Cas 시스템을 도입할 경우, 미생물이 모두 사멸하기 때문에, 단순히 특정 유전자를 타겟으로 하는 sgRNA 및 Cas9을 삽입하는 것만으로는 타겟 유전자의 결실이 가능하지 않다는 점을 확인하고, NHEJ 대신 상동 재조합 원리인 HDR기전을 활용하여 미생물을 형질전환시키기 위해 다음의 실험을 진행하였다.
실시예2: Cas9-sgRNA와 상동 재조합 원리를 사용한 재조합 미생물의 제조
2-1: E. coli Rac prophage 유래 RecT, ssODN 및 pCG9-argR1을 이용한 유전자 편집효과
최근 C. glutamicum에서는 E. coli의 Rac prophage에서 유래하는 RecT 단백질 및 ssODN을 사용할 경우, C. glutamicum의 염색체 엔지니어링 효율이 우수하다는 것이 알려져 있다(Blinder et al., Nucleic Acids Research, 41(12): 6360-6369, 2013). 따라서 본 발명에서는 C. glutamicum에서 표적 유전자를 결실시키기 위해 Cas9와 sgRNA 및 ssODN과 더불어 RecT를 접목시킨 시스템을 시도하게 되었다.
(a) C. glutamicum-E. coli 셔틀 벡터(shuttle vector) pTacCC1의 제조
C. glutamicum에서 E. coli prophage 유래 RecT 재조합 효소 발현벡터를 제조하기 전에, Cas9-sgRNA 및 RecT를 각각 서로 다른 벡터를 이용하여 발현시켜야 하기 때문에, 우선적으로는 C. glutamicum에서 Cas9-sgRNA 발현 벡터의 백본인 pEKEx1과 공존할 수 있는 서로 다른 복제 원점(ori)을 가지는 셔틀벡터 제조가 필요하다. C. glutamicum에서 pEKEx1와 같은 pBL1 복제 원점(ori) 기반의 벡터와 상호 간섭 없이 공존할 수 있는 복제 원점으로는 pCC1 복제 원점(ori)이 알려져 있다. 이러한 pCC1 복제 원점(ori)을 기반으로 한 C. glutamicum - E. coli 셔틀 벡터(shuttle vector)를 제작하고자 하였다.
먼저, E. coli용 벡터인 pACYC184(Chang et al., Journal of Bacteriology, 134(3): 1141-1156, 1978)를 템플릿으로 하여 서열번호 10과 서열번호 11의 프라이머를 사용하여 p15A 복제 원점(ori)을 증폭하였다. 또한, pKCA212-MCS(Shin et al., Microbial Cell Factories, 15(1):174, 2016)을 템플릿으로 하여 서열번호 12과 서열번호 13의 프라이머를 이용하여 pCC1 복제 원점(ori)을 증폭하였다. 또한, E. coli 발현 벡터(expression vector) pTac15K(Lee et al., US20110269183A)를 템플릿으로 하여 서열번호 14와 서열번호 15의 프라이머를 이용하여 Ptac-rrnB T1T2를 증폭하였다. 그리고 E. coli 발현 벡터 pCDFDuet-1(Novagen, 독일)을 템플릿으로 사용하여 서열번호 16과 서열번호 17의 프라이머를 사용해 spectinomycin를 발현하는 저항성 유전자 aadA를 증폭하였다.
상기 증폭한 네 가지 DNA 조각들을 Gibson assembly를 통해 하나의 벡터에 삽입시킴으로써, C. glutamicum - E. coli 셔틀 벡터(shuttle vector)인 pTacCC1를 제조하였다(도 12).
서열번호 염기서열
서열번호 10 5′-GGAGTGTATA CTGGCTTACT ATG-3′
서열번호 11 5′-ACATGAGAAT TACAACTTAT ATCGTATG-3′
서열번호 12 5′-CATACGATAT AAGTTGTAAT TCTCATGTAG TTCTCCCGCT GCTTGCTC-3′
서열번호 13 5′-CGATAAGCTC CGGATCCTCT AATGCATGCT AGTGTGGTGA G-3′
서열번호 14 5′-TAGAGGATCC GGAGCTTATC G-3′
서열번호 15 5′-CGGATACATA TTTGAATGTA TTTAG-3′
서열번호 16 5′-CATAGTAAGC CAGTATACAC TCCGACCGAG TGAGCTAGCT ATTTG-3′
서열번호 17 5′-CTAAATACAT TCAAATATGT ATCCGCTGAG CAATAACTAG CATAAC-3′
(b) RecT 발현 벡터(pTacCC1-recT)의 제조
C. glutamicum에서 RecT를 발현시키기 위해 recT 유전자를 pTacCC1에 삽입하기 위하여 다음의 실험을 진행하였다.
E. coli K-12 MG1655의 유전체 DNA(genomic DNA)를 템플릿으로 하여 서열번호 18과 서열번호 19의 프라이머를 사용하여 recT 유전자를 증폭하였다. 증폭한 recT 유전자를 코딩하는 DNA 절편은 SLIC을 통해 EcoRI과 SalI으로 절단한 pTacCC1 에 삽입하여, 최종적으로 pTacCC1-recT를 제조하였다(도 13).
서열번호 염기서열
서열번호 18 5′-TCACACAGGA AACAGAATTC ATGACTAAGC AACCACCAAT C-3′
서열번호 19 5′-ATGCCTGCAG GTCGACTTAT TCCTCTGAAT TATCGATTAC AC-3′
상기 pTacCC1-recT를 전기천공법을 통해 C. glutamicum ATCC 13032에 도입한 후, Tricine-SDS-PAGE(Schagger et al., Nature Protocols, 1(1): 16-22, 2006)를 통해 RecT 재조합 효소가 발현됨을 확인하였다(도 14).
(c) 6xHis가 부착된 RecT 발현 벡터(pTacCC1-HrT)의 제조
통상적으로 C. glutamicum에서 단백질의 N-말단에 6개의 히스티딘 (hexahistidine, 6xHis) 서열을 첨가하면 단백질의 발현량이 증가한다는 기존 보고(Shin et al., Microbial Cell Factories, 15(1):174, 2016)를 근거로, pTacCC1-recT의 recT 유전자 상부(upstream)에 6xHis를 코딩하는 염기서열을 다음의 과정을 통해 추가하였다.
pTacCC1-recT에 6xHis를 코딩하는 염기 서열을 추가하기 위해, pTacCC1-recT 를 템플릿으로 하고 서열번호 20과 서열번호 21의 프라이머를 사용하여 recT 유전자의 상부에 6xHis를 코딩하는 서열이 추가된 DNA 절편을 증폭하였다.
서열번호 염기서열
서열번호 20 5′-ATGCATCACC ACCATCACCA TATGACTAAG CAACCACCAA T-3′
서열번호 21 5′-GAATTCTGTT TCCTGTGTGA-3′
증폭된 DNA 절편은 T4 폴리뉴클레오티드인산화효소(T4 polynucleotide kinase, T4 PNK; Enzynomics, 한국)을 이용해 5′ 말단을 인산화하고 동시에 T4 DNA 접합 효소를 이용해 양 말단을 서로 접합하여 pTacCC1-HrT를 제조하였다(도 15).
상기 제조된 pTacCC1-HrT를 C. glutamicum ATCC 13032에 전기천공법을 통해 도입하고 pTacCC1-HrT로 형질전환된 재조합 C. glutamicum 균주를 확보하였다.
상기 pTacCC1-HrT가 도입된 재조합 C. glutamicum에서 6xHis가 첨가된 RecT 재조합 효소의 발현량은 상기 pTacCC1-recT가 도입된 재조합 C. glutamicum에서 RecT 재조합 효소의 발현량을 확인한 경우와 동일한 방법으로 확인한 결과, recT 유전자의 상부에 6xHis를 코딩하는 염기서열을 첨가한 경우 RecT 재조합 효소의 발현량이 소폭 더 상승한 것을 확인할 수 있었다(도 14).
(d) recT, ssODN 및 Cas9/sgRNA를 이용한 형질전환 효율 확인
RecT를 비롯한 박테리오파지 혹은 prophage 유래 재조합 효소와 ssODN을 이용한 리컴비니어링의 경우 숙주 미생물의 염색체 복제과정에서 형성된 복제 분기점에서 복제 전의 지연 가닥(lagging strand)에 ssODN이 재조합 효소들의 도움을 받아 상보적으로 결합하면서 새로운 오카자키 절편(Okazaki fragment)의 프라이머로 작동함으로써 표적 유전자를 변형시킨다고 알려져 있다(Murphy, EcoSal Plus, 2016. doi:10.1128/ecosalplus.ESP-0011-2015).
따라서, 본 발명에서는 이를 이용하여 RecT와 complex를 형성하고 있는 ssODN이 표적 유전자에 상보적으로 결합함으로써 표적 유전자를 결실시키고, 표적 유전자의 결실시키고자 하는 서열을 절단하는 Cas9-sgRNA 복합체가 유전자가 결실되지 않은 염색체에 DSB를 도입해 ssODN과 RecT에 의해 표적 유전자가 결실되지 않은 숙주를 죽이는 시스템이다(도 16).
또한, argR 유전자를 타겟으로 하는 ssODN은 sgRNA의 안내 서열(guide sequence)이 결합하는 부위의 외측 양쪽에 각각 결합하는 5'-상동부위(homology arm) 및 3'-상동부위(homology arm)으로 구성되어, 타겟과 결합하게 되면, loop 구조를 형성하는 특징이 있다(도 17).
아울러, 표적 유전자가 결실되지 않았는데도 Cas9-sgRNA 벡터(pCG9-series 벡터)가 도입되지 않아 살아남는 세포를 제거하기 위해 Cas9-sgRNA 벡터가 도입되지 않은 세포는 살아남을 수 없도록 Cas9-sgRNA 벡터 상에 내성 유전자가 존재하는 항생제 kanamycin으로 추가적인 선별을 하도록 시스템을 디자인하였다.
pTacCC1-HrT를 포함하는 재조합 균주 C. glutamicum ATCC 13032에 대하여, 전기천공법을 통해 pCG9-argR1과 서열번호 22의 ssODN을 함께 도입하여 콜로니 수를 확인하였다. 최종적으로 kanamycin이 25 μg/mL, spectinomycin이 200 μg/mL 첨가된 RG 배지에서 세포를 선별한 결과, ssODN만으로 형질전환했을 경우, 콜로니 수는 약 6200개였으며, ssODN과 pCG9-argR1를 함께 사용하여 형질전환했을 경우, 콜로니 수는 1개 정도 수득 되었다. 또한, 서열번호 23과 서열번호 24의 프라이머를 이용해 콜로니 PCR로 성장한 콜로니들을 선별한 결과, 표적한 argR 유전자가 결실된 콜로니를 확인할 수 있었다.
서열번호 염기서열
서열번호 22 5′-TAATTCACCT AGTTCTTTAC CTGTGAGCGG ATCACGGGCG TGCGAGTCAC GGGATTTAAG TTTTCCGGTG TTGACGGGGT-3′
서열번호 23 5′-TCCTTGTCCG ATGATCTGCA-3′
서열번호 24 5′-GTATGCGTAG ATGTCCTTGG-3′
2-2: Cas9-sgRNA, RecT 및 ssODN을 이용한 유전자 결실효율 향상
실시예 2-1에서 Cas9-sgRNA argR1, RecT 및 ssODN을 사용하여 C. glutamicum에서 표적 유전자 argR을 결실시킬 수 있다는 것을 확인하였으나, argR 유전자 결실이 일관성 있게 관찰되지 않는다는 문제가 있음을 동시에 확인하였다. 이러한 문제는 본 실험에서 미생물의 형질전환에 이용한 전기천공법의 효율이 좋지 않기 때문으로 분석하였고, 따라서 이에 대한 문제해결을 위하여 다음의 실험을 진행하였다(Choi et al., Microbial Cell Factories, 14:21, 2015).
전기천공법을 위한 C. glutamicum의 수용성 세포(competent cells)를 제조하는데 있어서, C. glutamicum 배양 과정 중에 C. glutamicum의 세포벽 형성을 방해함으로써, 전기천공법의 효율을 높이기 위한 방법이 알려져 있으며(Ruan et al., Biotechnology Letters, 37(12):2445-2452, 2015), 이를 본 시스템에 적용한 결과, C. gltuamicum에서 argR 유전자 결실을 위해 사용했던 기존의 전기천공법과 대비해 형성되는 항생제 내성 재조합 C. glutamicum의 콜로니 수가 13,000배 가량 증가된 것으로 나타났다(도 18).
상기 전기천공법을 이용하여 RecT를 발현하는 C. glutamicum ATCC13032에 서열번호 30의 ssODN과 pCG9-argR1을 각각 10 μg, 및 1 μg씩 도입하고, 200 μg/mL spectinomycin과 25 μg/mL kanamycin이 첨가된 고체 배지에서 배양한 후, 이로부터 얻어진 콜로니에 대해 서열번호 23과 서열번호 24의 프라이머를 이용해 콜로니 PCR를 수행한 결과, argR에서 의도한 400 bp 길이의 서열이 결실된 콜로니들이 반복해서 확인되었다(표 9). 이후 유전자 결실 실험에서는 재조합 C. glutamicum 균주에 벡터 및 ssODN을 도입하기 위해 상기 최적화한 전기천공법을 적용하였다.
Trial Colony counts Knockout efficiency
(% yield)
Total Knockout
1 8 1 12.5
2 3 0 0
3 6 1 16.7
4 0 0 N/A
5 3 0 0
6 6 1 16.7
7 9 1 11.1
8 8 3 37.5
실시예3: 유전자 결실된 재조합 C. glutamicum 로부터 벡터 제거
RecT를 발현하는 재조합 C. glutamicum에 대해 ssODN과 pCG9-series를 이용하여 표적 유전자를 결실시킨 후 산업 균주로 활용하기 위해서는 상기 벡터를 제거해야 한다. 아울러, 최적의 균주를 개발하기 위해서는 대부분의 경우, 여러 개의 유전자를 결실시켜야 한다. 따라서 하나의 표적 유전자를 결실시킨 뒤 다음번 표적 유전자를 결실시키기 위해서는 먼저 도입한 벡터를 제거해야만 다음번 유전자 결실을 위해 사용할 또 다른 벡터를 도입할 수 있다. 따라서, 유전자 결실을 마친 C. glutamicum으로부터 벡터를 손쉽게 제거할 수 있는 방안이 필수적이다.
3-1: 온도 민감성 Cas9-sgRNA 벡터 제작 및 제거효율 검증
실시예 1-3에서 개시된 Cas9과 sgRNA를 동시에 발현하는 pCG9-series를 온도 민감성 벡터로 제작하기 위하여 다음의 실험을 진행하였다.
C. glutamicum 내에서 pCG9-series를 안정하게 유지시켜주는 복제 원점은 pBL1 복제 원점(ori)의 복제에 관여하는 Rep 단백질의 유전자에 단일 염기 돌연변이(C→T)가 도입되어 Rep 단백질에 P47S 아미노산 치환이 발생하는 경우, 배양 온도를 34℃ 이상으로 높여주는 것만으로 복제 원점(ori)으로서의 기능이 무력화되는 온도 민감성 복제 원점(ori)으로 전환시킬 수 있다(Nakamura et al., Plasmid 56(3): 179-186, 2006). 이러한 pCG9-series를 온도 민감성 벡터로 전환하기 위해 pCG9-series에 상기 온도 민감성 복제 원점을 도입하기로 하였다.
먼저, pCG9-series의 백본 벡터인 pEKEx1-Cas9opt의 pBL1 복제 원점을 온도 민감성 복제 원점으로 전환하기 위해 pEKEx1-Cas9opt를 템플릿으로 하여 서열번호 25과 서열번호 26의 프라이머를 사용하여 벡터 전체를 증폭하였다. 증폭된 선형 DNA 절편은 T4 PNK와 T4 DNA 접합 효소를 사용하여 각각 5′ 말단을 인산화시킨 다음, DNA 절편의 양 말단을 접합시켜 온도 민감성 벡터 pEKTs1을 제조하였다(도 19).
그런 다음, 상기 pEKTs1를 템플릿으로 하여 서열번호 27과 서열번호 28의 프라이머를 사용하여 온도 민감성 pBL1 복제 원점을 포함하는 DNA 절편을 증폭시키고, 도 2의 pEKEx1-Cas9opt를 템플릿으로 이용하여 서열번호 27과 서열번호 28의 프라이머를 사용하여 cas9 유전자를 포함하는 DNA 절편을 증폭하였다. 증폭한 두 DNA 절편은 Gibson assembly를 통해 하나의 벡터로 결합시켰으며, 그 결과, pEKTs1-Cas9opt를 제조하였다(도 20).
서열번호 염기서열
서열번호 25 5′-TCTCTGGCTG AATTGGAAGT CATGG-3′
서열번호 26 5′-TGACCCCCAG CGAGAGTGAG-3′
서열번호 27 5′-CTCACAATTC CACACAACAT ACGAGCCGGA AGCATAAAGT-3′
서열번호 28 5′-AGACCCATCA TAGTTTGCCC CCGCGACATT GACCATAAAT-3′
그 후, 상기 pEKTs1-Cas9opt로부터 실시예 1-3의 방법과 동일한 방법으로, Cas9과 sgRNA를 동시 발현하는 온도 민감성 벡터인 pCG9ts-series를 제조하였다(도 21).
상기 pCG9ts-series를 포함하는 재조합 C. glutamicum 균주를 항생제(kanamycin)가 첨가되지 않은 고체 배지에서 1 자로 스트리킹해 37℃에서 배양한 결과, 벡터가 제거된 균주를 손쉽게 제작할 수 있음을 확인하였다(표 11).
Trial pCG9ts curing at 37°C
Total Cured Curing rate (%)
1 50 48 96
2 50 13 26
3 50 3 6
4 20 6 30
3-2: 항생제 의존성 특성을 이용한 pTacCC1-HrT의 제거효율 검증
pTacCC1-HrT 벡터의 C. glutamicum 용 복제 원점인 pCC1 복제 원점은 온도 민감성의 특징을 가지고 있지 않다. 그러나 이의 백본인 pTacCC1 자체가 불안정하여 항생제의 농도를 낮춤에 따라 재조합 C. glutamicum으로부터 pTacCC1 계열의 벡터가 점차 소실된다는 것을 발견하였으며, 이를 벡터 제거에 응용하고자, 항생제 농도 변경에 의한 제거효율을 다음과 같이 검증하였다.
pTacCC1-HrT를 포함하는 재조합 C. glutamicum에 대해, 상기 벡터는 selective marker gene으로 spectinomycin 발현 유전자를 포함하고 있으므로, 항생제는 spectinomycin를 사용하였다.
그리하여, spectinomycin을 첨가하지 않은 고체 배지에 pTacCC1-HrT 벡터가 도입된 재조합 C. glutamicum을 1 자로 스트리킹한 뒤 배양한 결과, pTacCC1-HrT 벡터가 제거되어 spectinomycin 내성을 보이지 않는 C. glutamicum가 얻어짐을 확인하였다(표 12).
Trial pTacCC1-HrT curing on no antibiotics
Total Cured Curing rate (%)
1 30 18 60
2 30 17 57
3 20 16 80
4 50 40 80
3-3: pCG9ts-series 및 pTacCC1-HrT의 동시 제거능 검증
아울러, pCG9ts-series 및 pTacCC1-HrT, 두 벡터를 동시에 제거하는 것이 가능한지를 확인하기 위하여, 상기 두 벡터로 형질전환된 C. glutamicum을 상기 각 벡터의 selective marker gene이 내성을 보이는 spectinomycin과 kanamycin을 모두 포함하지 않는 고체 배지에 1 자로 스트리킹한 뒤 37℃에서 배양한 후, 확실한 선별을 위하여 동일 배양방법을 1회 반복한 결과, 두 벡터가 모두 제거된, 재조합 C. glutamicum 균주를 얻을 수 있었다(표 13).
Trial pCG9ts-series and pTacCC1-HrT curing on no antibiotic at 37°C
Total Cured Curing rate (%)
1 30 30 100
2 30 30 100
3 30 30 100
실시예4: GABA 생산능의 재조합 C. glutamicum 의 제조
4-1: Ncgl1221 , gabT , gabP 유전자 결실을 위한 벡터 및 ssODN의 제조
도 22의 GABA(γ-aminobutyric acid) 생합성 말단 경로에 관여하는 세 유전자 Ncgl1221, gabT, gabP가 결실된 재조합 C. glutamicum를 제조하기 위해서, pTacCC1-HrT로 형질전환된 C. glutamicum에 삽입할 i) 상기 세 유전자의 sgRNA 서열을 각각 포함하는 pCG9ts-series, ii) 상기 세 유전자에 각각 결합하는 ssODN을 다음과 제작하였으며, 도 23에 개시된 바와 같이, C. glutamicum에 대한 유전자 결실을 시도하였다.
(a) pCG9ts-series의 제조
우선 sgRNA의 안내 서열의 비특이적 표적을 분석하고 최적의 sgRNA 안내 서열을 추천해주는 온라인 프로그램 CRISPy-web(Blin et al., Synthetic and Systems Biotechnology, 1(2):118-121, 2016)을 이용하여, off-target effect가 낮은 최적의 안내 서열(guide sequence)을 다음과 같이 선별하였다(표 14).
Guide sequence 서열번호 Target gene
(position(bp)) 		Sequence Strand PAM # of promiscuous targets
0-bp 1-bp 2-bp
gs_1221 74 Ncgl1221
(435-458)		 GCACTGATTACTACCCAAAT Lagging CGG 0 0 1
gs_gabT 75 gabT
(457-480)		 TCGACAACGCGTACCACGGA Leading CGG 0 0 0
gs_gabP 76 gabP
(827-850)		 TGGCCATGTAATAGGCCACT Lagging GGG 0 0 0
상기 안내 서열(guide sequence)을 포함하는 벡터를 제조하기 위하여 실시예 1-3에 기재된 것과 동일한 방법으로, 표 15에 개시된 각 유전자의 sgRNA가 포함되도록 pEKEx1-Cas9opt를 이용하여 pCG9ts-Ncgl1221, pCG9ts-gabT, 및 pCG9ts-gabP를 제작하였다.
유전자 서열번호 염기서열
Ncgl1221 서열번호 29 5′-TTGACAATTA ATCATCGGCT CGTATAATGT GTGGGCACTG ATTACTACCC AAATGTTTTA GAGCTAGAAA TAGCAAGT-3′
gabT 서열번호 30 5′-TTGACAATTA ATCATCGGCT CGTATAATGT GTGGTCGACA ACGCGTACCA CGGAGTTTTA GAGCTAGAAA TAGCAAGT-3′
gabP 서열번호 31 5′-TTGACAATTA ATCATCGGCT CGTATAATGT GTGGTGGCCA TGTAATAGGC CACTGTTTTA GAGCTAGAAA TAGCAAGT-3′
(b) 각 유전자에 대한 ssODN의 제조
타겟 유전자를 결실시키기 위한 ssODN은 실시예 2-1에서도 설명한 바와 같이, sgRNA의 guide sequence가 결합하는 위치가 ssODN의 두 결합 서열 사이 구간에 위치하도록 기계적으로 선정하여, 총 80 nt가 되도록 디자인하였다. ssODN은 5'-homology arm 및 3'-homology arm으로 구성되며, 각 homology arm은 40 base pair로, sgRNA의 안내 서열과 상보적인 서열을 포함하는 타겟 유전자 영역의 양 말단 바깥쪽에 결합할 수 있도록 디자인하였다. ssODN이 타겟과 결합하면, loop 구조가 형성되며, 이 부위가 결실되는 영역이 된다, 상기 결실 영역의 길이는 PCR을 통해 표적 유전자 결실 여부를 손쉽게 파악할 수 있도록 100 - 400 bp가 되도록 디자인하였다.
Name Sequence Description
ssODN1221_250(서열번호 32) CCTTACACGTTGAGCATGAAGAGCCAAAGACCTCGCTTATCAGAAGATCCTGTCGTTTGGCGGACGTGTCCGCATGAGCA Ncgl1221; lagging strand; 250-bp deletion; for ΔgabT strain generation
ssODN1221_400(서열번호 33) TCGTGCAAGTCACCGCCGGCAATCAATGGCTGGTCGAACGCGCATGAGCACGTCCCTGTTGTTGGGTGCGCTGCTCTTGC Ncgl1221; lagging strand; 400-bp deletion; for ΔgabT strain generation
ssODNgabT_100(서열번호 34) CCGTCGCGCAGTGGGTAAGACATTGGTGCACGGTAGACGTGACCGCGCCCTTGCCGGTGTAGGCGCGTGCCACCTTGACG gabT; lagging strand; 100-bp deletion
ssODNgabT_300(서열번호 35) GTGGAAATGGCTGCGAGGAATCCTGGTGCGGGGACGATGACGGCTTCGGCGCCAGAGTTAAACAGCGCGCTCTTCTTGTC gabT; lagging strand; 300-bp deletion; for ΔgabT strain generation
ssODNgabP_150(서열번호 36) GCGCATCGCGGTGAATCCAATGGCGATGAATGAAGTGAACATGCCGATGATGATCGCGCGTGGCACTGCCTTCGGGGTGG gabP; lagging strand; 150-bp deletion; for ΔgabP strain generation
ssODNgabP_400(서열번호 37) AGTGGTGGAAGAACAGTTAGTCCGACAGCAACGGATCGCTAAGCACTGTCCATCCACACAGCACGATGATGATCGTTGCC gabP; lagging strand; 400-bp deletion; for ΔgabP strain generation
4-2: 재조합 C. glutamicum 의 제조
하기에 개시된 순차적 결실 또는 동시 결실을 통해 수득한 형질전환 균주의 유전형은 표 17에 나타난 바와 같다. 예를 들면, 표 17에 개시된 균주 중에서, Ncgl1221이 결실된 균주 WH2에 대해 gabT 와 gabP 유전자의 동시적 결실 기술을 이용하여 제조된 WH8을 제조하고, 항생제 의존성을 이용하여 pTacCC1-HrT를 제거한 W2 내지 W8의 균주를 수득하였다.
Strain Description
WT C. glutamicum ATCC 13032
WT-HrT WT strain harboring pTacCC1-HrT
WHC2 WT-HrT ΔNcgl1221 harboring pCG9ts-Ncgl1221
WHC3 WT-HrT ΔgabT harboring pCG9ts-gabT
WHC4 WT-HrT ΔgabP harboring pCG9ts-gabP
WHC5 WT-HrT ΔNcgl1221 ΔgabT harboring pCG9ts-gabT
WHC6 WT-HrT ΔNcgl1221 ΔgabP harboring pCG9ts-gabP
WHC7 WT-HrT ΔgabT ΔgabP harboring pCG9ts-gabP
WHC8 WT-HrT ΔNcgl1221 ΔgabT ΔgabP harboring pCG9ts-gabT
WH2 WT-HrT ΔNcgl1221
WH3 WT-HrT ΔgabT
WH4 WT-HrT ΔgabP
WH5 WT-HrT ΔNcgl1221 ΔgabT
WH6 WT-HrT ΔNcgl1221 ΔgabP
WH7 WT-HrT ΔgabT ΔgabP
WH8 WT-HrT ΔNcgl1221 ΔgabT ΔgabP
W2 WT ΔNcgl1221
W3 WT ΔgabT
W4 WT ΔgabP
W5 WT ΔNcgl1221 ΔgabT
W6 WT ΔNcgl1221 ΔgabP
W7 WT ΔgabT ΔgabP
W8 WT ΔNcgl1221 ΔgabT ΔgabP
(a) 순차적 유전자 결실에 의한 재조합 미생물의 제조
실시예 4-1에서 제조된 pCG9ts-Ncgl1221, pCG9ts-gabT, 및 pCG9ts-gabP을 포함하는 벡터 및 각 유전자별 ssODN을 사용하여 RecT를 발현하는 C. glutamicum에 순차적으로 2-2의 최적화된 전기천공법을 이용하여 형질전환시켜 타겟 유전자 결실을 시도하였으며, 각 유전자의 결실 여부는 표 18의 프라이머를 사용하여 확인하였다.
Name Sequence Target description
seq_1221_F
(서열번호 38)		 TTCCTCGGTCGGTTCGATGG Ncgl1221; with seq_1221_R
seq_1221_R
(서열번호 39)		 GATCATCCCCAACTCCACGG Ncgl1221; with seq_1221_F
seq_gabT_F
(서열번호 40)		 TAGCACGAGCACTTGCACCG gabT; with seq_gabT_R
seq_gabT_R
(서열번호 41)		 CTTCAATGGCTGCAAGTGCC gabT; with seq_gabT_F
seq_gabP_F
(서열번호 42)		 ACCAAGAAGCCACTGCAGCT gabP; with seq_gabP_R
seq_gabP_R
(서열번호 43)		 GTGACTATGCCCAACCCGCA gabP; with seq_gabP_F
플레이트 상에서 배양된 콜로니 중 8개를 무작위로 선택하거나 모두를 분석한 결과, 결실 효율은 표 19에 나타난 바와 같이, 우수한 것으로 확인되었다.
Trial Target Gene Guide sequence Strain KO length (bp) Colony count Knockout efficiency (% yield)
Total Knockout
1 Ncgl1221 gs_1221 WT-HrT 400 12 5 41.7
2 Ncgl1221 gs_1221 WT-HrT 400 6 1 16.7
3 Ncgl1221 gs_1221 WT-HrT 400 11 4 36.4
4 Ncgl1221 gs_1221 WT-HrT 250 8 3 37.5
5 Ncgl1221 gs_1221 WT-HrT 250 13 10 76.9
6 Ncgl1221 gs_1221 WT-HrT 250 8 3 37.5
7 gabT gs_gabT WT-HrT 300 15 12 80.0
8 gabT gs_gabT WT-HrT 100 42 42 100
9 gabT gs_gabT WH2 300 22 16 72.7
10 gabT gs_gabT WH2 100 3 2 66.7
11 gabP gs_gabP WT-HrT 400 7 3 42.9
12 gabP gs_gabP WT-HrT 150 8a 7 87.5
13 gabP gs_gabP WH2 400 8a 7 87.5
14 gabP gs_gabP WH2 150 8a 7 87.5
15 gabP gs_gabP WH3 400 8a 6 75.0
16 gabP gs_gabP WH3 150 8a 7 87.5
(b) 유전자 동시 결실에 의한 재조합 미생물의 제조
1 μg의 pCG9ts-gabT 및 표 19의 ssODN, ssODNgabT_100 및 ssODNgabP_150 각각 10 μg를 혼합하여 전기 천공법을 통해 RecT를 발현하는 C. glutamicum 균주에 동시에 도입했을 때, gabT 유전자와 gabP 유전자 모두가 결실된 콜로니를 선별할 수 있었다. 마찬가지로 1 μg의 pCG9ts-gabP 및 ssODN ssODNgabT_100 및 ssODNgabP_150 각각 10 μg을 혼합하여 전기 천공법을 통해 RecT를 발현하는 C. glutamicum 균주에 동시에 도입했을 때 gabT 유전자와 gabP 유전자 모두가 결실된 콜로니를 선별할 수 있었다(표 20).
Trial Strain Cas9-sgRNA vector Colony count CoPaR efficiency (%)
Total gabP KO gabT KO Overlapped KO Among total colony Among targeted KO
1 WT-HrT pCG9ts-gabT 11 1 5 1 9.1 20.0
2 WH2 pCG9ts-gabT 12 1 12 1 8.3 8.3
3 WT-HrT pCG9ts-gabP 19 13 3 3 15.8 23.1
반면 Ncgl1221과 gabT 혹은 Ncgl1221과 gabP의 동시적 결실은 관찰할 수 없었다. gabT와 gabP 내에서 결실시킨 영역 사이의 거리는 약 3 kb인 반면 Ncgl1221과 gabT 혹은 gabP 사이의 거리는 약 830 kb인 점을 고려할 때 표적으로 삼은 두 유전자 사이의 거리가 유전자 동시적 결실 효율에 영향을 주는 것으로 판단된다.
4-3: 유전자 결실된 C. glutamicum 의 GABA 생산능 확인
실시예 4-2의 미생물은 glutamate 과발현 미생물로서, 이에 GABA 생산능을 가지도록 전환하기 위하여 Lactobacillus brevis ATCC 367 유래 glutamate decarboxylase(gadB2) 유전자를 추가 도입해야 한다, 따라서 이를 위해 상기 유전자의 발현벡터인 pGA7를 다음과 같이 제조하였다.
(a) pGA7 및 이를 포함하는 형질전환 균주의 제조
먼저, L. brevis ATCC 13032의 유전체 DNA를 템플릿으로 사용하여 서열번호 44과 서열번호 45의 프라이머를 이용하여 gadB2 유전자를 증폭하였다. 증폭한 gadB2 유전자를 코딩하는 DNA 절편과 pEKEx1을 BamHI과 SalI으로 절단한 뒤 서로 접합시켜, pGA7를 제작하였다(도 24).
서열번호 염기서열
서열번호 44 5′-AGTAGGATCC AATGATTAAG GAGGCAAGCC-3′
서열번호 45 5′-GCTTGTCGAC TCCTCTATTA ACTCACCATT-3′
제작한 pGA7를 표 23에 개시된 WT, W2, W3, W4, W5, W6, W7 및 W8의 균주에 전기천공법을 통해 도입하여, 각각 GAB1, GAB2, GAB3, GAB4, GAB5, GAB6, GAB7, GAB8 균주를 제작하였고, 음성 대조군으로는 pEKEx1가 도입된 GAB0 균주를 제조하였다(표 22).
Strain Description
GAB0 WT harboring pEKEx1
GAB1 WT harboring pGA7
GAB2 W2 harboring pGA7
GAB3 W3 harboring pGA7
GAB4 W4 harboring pGA7
GAB5 W5 harboring pGA7
GAB6 W6 harboring pGA7
GAB7 W7 harboring pGA7
GAB8 W8 harboring pGA7
(b) 재조합 C. glutamicum 의 GABA 생산능 확인
표 25에 개시된 균주를 25 μg/mL kanamycin이 첨가된 고체 RG 배지에 새롭게 스트리킹하여 각각 배양하고, 10 mL GAP-seed 배지에 접종한 뒤 baffled flask(erlenmeyer flask)에서 96시간 동안 30℃, 200 rpm의 조건에서 OD600 = 20 ~ 60까지 균체를 늘린 후, GABA 생산용 배양에 시드로 사용하였다. 상기 GAP-Seed 배지의 조성은 표 23에 개시된 바와 같다.
GAP-Seed 배지의 성분 농도
Glucose 40 g/L
MgSO4*?*7H2O 0.4 g/L
FeSO4*?*7H2O 10 g/L
MnSO4*?*5H2O 10 g/L
KH2PO4 1 g/L
Urea 4 g/L
Thiamine-HCl 200 μg/L
Biotin 50 μg/L
Commercial soy sauce (Soy Sauce Jin Gold F3, Sempio, Korea) 55 mL/L
pH (by 5 M KOH) 7.0
상기 균주를 이용하여 GABA를 생산하기 위하여, 상기 배양한 균체를 최종 OD600 ~ 0.2이 되도록 10 mL의 GAP-main 배지가 포함된 baffled flask(erlenmeyer flask)에 접종하고 30℃에서 96시간 동안 200 rpm의 조건에서 본배양을 진행하였다. 상기 GAP-main 배지의 조성은 표 24에 개시된 바와 같다.
GAP-main 배지의 성분 농도
Glucose 40 g/L
MgSO4●7H2O 0.4 g/L
FeSO4●7H2O 10 g/L
MnSO4●5H2O 10 g/L
KH2PO4 1 g/L
Urea 4 g/L
Thiamine-HCl 200 μg/L
Biotin 50 μg/L
Commercial soy sauce (Soy Sauce Jin Gold F3, Sempio, Korea) 55 mL/L
pH (by 5 M KOH) 7.0
상기 본배양 과정에서 분석을 위해 24시간째와 96시간째 한번씩 샘플을 취하여, 16,100×g에서 10 분 동안 원심분리한 후 상등액만을 취해 증류수로 희석하고, 0.2-μm filter를 이용하여 불순물을 제거한 다음, HPLC (Agilent Technologies)를 통해 기보고된 방법 (Shin et al., Microbial Cell Factories, 15(1):174, 2016)으로 농도를 측정하였다.
그 결과, 총 7 가지 유전자 결실 조합 중 gabT(GAB3), gabT와 gabP(GAB7), 및 Ncgl1221과 gabT, gabP(GAB8) 유전자가 결실된 재조합 C. glutamicum의 GABA 생산량이 각각 27.5±2.5 g/L, 28.7±0.1 g/L, 27.5±0.3 g/L로 가장 좋은 것으로 나타났다(도 25 및 도 26).
실시예5: 본 유전자 결실 시스템의 성능 추가 검증
본 발명의 유전자 결실 시스템의 활용이 상기 실시예들에 국한되지 않음을 보이기 위해 하기의 실험을 추가로 진행하였다.
5-1: 다양한 균주에서의 다양한 유전자 결실
본 발명의 유전자 결실 시스템을 적용할 수 있는 균주 및 표적 유전자의 범위가 상기 실시예에서 이용한 C. glutamicum ATCC 13032 유래의 균주 및 Ncgl1221, gabT 및 gabP 유전자에 국한되지 않음을 보이기 위해 C. glutamicum ATCC 21831 유래의 C. glutamicum AR4ΔargF, 산업 균주인 C. glutamicum S112 및 유래 균주 S112ΔargR 및 상기 실시예에서 이용한 C. glutamicum ATCC 13032 (이하 WT)로부터 snaA, argF, crtEb 및 hmuO 유전자 결실을 진행하였다.
유전자 결실에 필요한 pCG9ts-series 벡터를 구축하고자 상기 실시예 4-1 (a)에 개시한 방법을 따라 표 25의 서열을 안내 서열(guide sequence)로 포함하는 pCG9ts-series 벡터 pCG9ts-snaA, pCG9ts-argF, pCG9ts-crtEb 및 pCG9ts-hmuO를 제작하였다.
Guide sequence 서열번호 Target gene Sequence
gs_snaA4 77 snaA TGCTCGAAGCTTTGCTGAAC
gs_argF1 78 argF TTTTCGGAGCGTCCACTCGA
gs_argF2 79 argF TGCCTTGAGCTTTGCGGCTA
gs_crtEb 80 crtEb ATGAAAAGAATAACTAGGAA
gs_hmuO 81 hmuO AAGCAACAGCGACCTATCGG
또한 표적 유전자를 결실시키기 위해 필요한 ssODN은 실시예 4-1 (b)에 개시된 바와 같이 디자인하되, 결실시키고자 하는 서열의 길이가 100 bp가 되도록 표 26과 같이 디자인하였다.
Name Sequence Description
ssODNsnaA_A_100(서열번호 46) CGTTTTGCCTGCTACACAAGCTGACTTCCCTAAGATCGTCAGATTGAGAAGCAGTATGCAGTGGCGGGAAATATTGATGT snaA; lagging strand; 100-bp deletion
ssODNsnaA_C_100(서열번호 47) ACATCAATATTTCCCGCCACTGCATACTGCTTCTCAATCTGACGATCTTAGGGAAGTCAGCTTGTGTAGCAGGCAAAACG snaA; lagging strand; 100-bp deletion
ssODNargF_100(서열번호 48) AAGGCTATTGCCGAGACAATCGCATAAAGGACTTAAACTTTCATTTGGGTGGACATGCCATCGTCGTGGATTCCGGCAGC? argF; lagging strand; 100-bp deletion
ssODNcrtEb_100(서열번호 49) AACGCAATTTCGGTGCTGAATAAGCAATCACTGCTAGCACTGGGAACTTTTCGGTAGCACGGCCCCCTCGACGCCGCCTT crtEb; lagging strand; 100-bp deletion
ssODNhmuO_100(서열번호 50) ACCGCGGTTGCGGCCACGCAGGCTCACAAAGGACACCACTATCTGCTCACCGGGAAGCTCGATGCGCAGGCATTTATCAA hmoO; lagging strand; 100-bp deletion
상기 pCG9ts-series 벡터 및 ssODN을 이용해 유전자 결실을 진행하기 위하여 상기 실시예 4-2에 개시된 방법을 이용해 상기 균주 C. glutamicum AR4ΔargF, C. glutamicum S112, C. glutamicum S112ΔargR 및 C. glutamicum WT에 pTacCC1-HrT 벡터를 도입하여 표 27의 균주를 수득하였다.
Strain Description
AR4ΔargF-HrT AR4ΔargF strain harboring pTacCC1-Hrt
S112-HrT S112-HrT strain harboring pTacCC1-Hrt
S112ΔargR-HrT S112ΔargR-HrT strain harboring pTacCC1-Hrt
WT-HrT WT strain harboring pTacCC1-HrT
실시예 2-2의 최적화된 전기천공법을 이용하여 상기 표 27에 개시된 균주를 상기 표 25의 벡터와 표 26의 ssODN을 이용해 형질전환 시켜 표적 유전자 결실을 시도하였으며, 각 유전자의 결실 여부는 표 28의 프라이머를 사용하여 확인하였다.
Name Sequence Target description
seq_snaA_F
(서열번호 51)		 GCCTCTGACATCGTTTGAGC snaA; with seq_snaA_R
seq_snaA_R
(서열번호 52)		 TGGGCGAACAAATATGCGAA snaA; with seq_snaA_F
seq_argF_F
(서열번호 53)		 AGGCTATTGCCGAGACAATC argF; with seq_argF_R
seq_argF_R
(서열번호 54)		 AAGTTTTCCGGTGTTGACGG argF; with seq_argF_F
seq_crtEb_F
(서열번호 55)		 GGCTAGGCAAGTTACAGAAC crtEb; with seq_crtEb_R
seq_crtEb_R
(서열번호 56)		 GCATCACTACTAGATCCACC crtEb; with seq_crtEb_F
seq_hmuO_F
(서열번호 57)		 CCGACTCTTCGCCAAGACTT hmuO; with seq_hmuO_F
seq_hmuO_R
(서열번호 58)		 ACGCAGGCTCACAAAGGACA hmuO; with seq_hmuO_F
플레이트 상에서 배양된 콜로니를 모두 분석한 결과, 결실 효율은 표 29에 나타난 바와 같이 다양한 균주 및 다양한 유전자 모두에 대해 우수한 것으로 확인되었다.
Trial Target Gene Guide sequence ssODN Strain KO length (bp) Colony count Knockout efficiency (% yield)
Total Knockout
1 snaA gs_snaA4 ssODN_snaA_A_100 AR4ΔargF-HrT 100 7 7 100.00
2 snaA gs_snaA4 ssODN_snaA_C_100 AR4ΔargF-HrT 100 3 3 100.00
3 argF gs_argF1 ssODN_argF_100 S112-HrT 100 48 26 54.17
4 argF gs_argF2 ssODN_argF_100 S112-HrT 100 4 2 50.00
5 argF gs_argF1 ssODN_argF_100 S112ΔargR-HrT 100 39 34 87.18
6 crtEb gs_crtEb ssODN_crtEb_100 WT-HrT 100 17 12 70.59
7 hmuO gs_hmuO ssODN_hmuO_100 WT-HrT 100 8 4 50.00
5-2: 다양한 길이의 유전자 결실
본 발명의 유전자 결실 시스템을 이용해 결실시킬 수 있는 유전자의 길이가 상기 실시예에 개시된 100 -400 bp에 국한되지 않으며, 유전자 결실에 이용하는 ssODN이 표적 유전자의 지연 가닥에 상보적임에 국한되지 않고 선도 가닥에 상보적인 경우에도 성공적으로 유전자 결실을 일으킬 수 있음을 보이고자 본 실시예의 유전자 결실을 진행하였다.
표적 유전자로 삼은 gabT 유전자를 중심으로 100 - 5000 bp 길이의 서열을 결실시키기 위한 ssODN은 표 30과 같이 디자인하였다.
Name Sequence Description
ssODNgabT_100c
(서열번호 59)		 CGTCAAGGTGGCACGCGCCTACACCGGCAAGGGCGCGGTCACGTCTACCGTGCACCAATGTCTTACCCACTGCGCGACGG gabT; leading strand; 100-bp deletion
ssODNgabT_100
(서열번호 60)		 CCGTCGCGCAGTGGGTAAGACATTGGTGCACGGTAGACGTGACCGCGCCCTTGCCGGTGTAGGCGCGTGCCACCTTGACG gabT; laggiing strand; 100-bp deletion
ssODNgabT_200
(서열번호 61)		 GCCCTGGATCGGTTCAATGACCACGCAGGCGAGGTTTTCGGACCGCGCCCTTGCCGGTGTAGGCGCGTGCCACCTTGACG gabT; laggiing strand; 200-bp deletion
ssODNgabT_400
(서열번호 62)		 GATAGTGGCATGCCGCCGGCGATGCCTTTTGCGGTGGTGAGACCGCGCCCTTGCCGGTGTAGGCGCGTGCCACCTTGACG gabT; laggiing strand; 400-bp deletion
ssODNgabT_800
(서열번호 63)		 ACCATCACGGAGAGTGTCCTCTGCAATGACCAGTGGTGGCGACCGCGCCCTTGCCGGTGTAGGCGCGTGCCACCTTGACG gabT; laggiing strand; 800-bp deletion
ssODNgabT_1000
(서열번호 64)		 CGCGGGGAGTTTTCGCAGCCCATGAAGGACCAGCTGCAACGACCGCGCCCTTGCCGGTGTAGGCGCGTGCCACCTTGACG gabT; laggiing strand; 1000-bp deletion
ssODNhmuO_2000
(서열번호 65)		 GAATTTGCTTGTGCAACGCCTTCGGCCAAGTCGGTGAAAGGACCGCGCCCTTGCCGGTGTAGGCGCGTGCCACCTTGACG gabT; laggiing strand; 2000-bp deletion
ssODNhmuO_5000
(서열번호 66)		 TGAGTGCTGCATATTTATCATCAACAAGCACCACAGATTCGACCGCGCCCTTGCCGGTGTAGGCGCGTGCCACCTTGACG gabT; laggiing strand; 5000-bp deletion
실시예 2-2의 최적화된 전기천공법을 이용하여 상기 표 17에 개시된 WT-HrT 균주에 상기 실시예 4-1에서 제조한 pCG9ts-gabT 벡터와 표 30에 개시된 ssODN을 도입하여 유전자 결실을 시도하였으며, 각 ssODN을 사용한 경우에 대한 유전자 결실 여부는 표 31의 프라이머를 이용하여 확인하였다.
Name Sequence Target description
seq_gabT_F
(서열번호 40)		 TAGCACGAGCACTTGCACCG gabT; with seq_gabT_R (100, 200, 400-bp deletions), seq_gabT_2R (800, 1000-bp deletion), seq_gabT_3R (2000-bp deletion), seq_gabT_4R (5000-bp deletion)
seq_gabT_R
(서열번호 41)		 CTTCAATGGCTGCAAGTGCC gabT; with seq_gabT_F (100, 200, 400-bp deletions)
seq_gabT_2R
(서열번호 67)		 CCGCAAACCAACGGAAGTAT gabT; with seq_gabT_F (800, 1000-bp deletions)
seq_gabT_3R
(서열번호 68)		 GCCAAAAGGTGCTGCTGGGT gabT; with seq_gabT_F (2000-bp deletion)
seq_gabT_4R
(서열번호 69)		 ACCTTGTCCGCAAGGTAACG gabT; with seq_gabT_F (5000-bp deletion)
플레이트 상에서 배양된 콜로니를 모두 분석한 결과, 표 32에 나타난 바와 같이 본 발명의 유전자 결실 시스템을 이용해 5 kb 길이의 서열도 결실시킬 수 있음을 확인하였다. 또한 RecT/ssODN가 미생물의 염색체 복제 도중 형성된 복제 분기점에서 아직 복제되지 않은 지연 가닥(lagging strand)에 결합하고, 여기에서 새로운 오카자키 절편(Okazaki fragment)의 프라이머로 작동하여 표적 유전자를 변형시킨다고 추정한 기존의 보고 (Murphy, EcoSal Plus, 2016. doi:10.1128/ecosalplus.ESP-0011-2015)와 달리, RecT/ssODN가 표적 유전자의 선도가닥에 상보적으로 결합하거나 (표 32, trial 1 - 3) 지연가닥에 상보적으로 결합하는 경우 (표 32, trial 4 -6) 모두 유전자 결실 효율에는 차이가 없다는 것을 확인하였다.
Trial ssODN KO length (bp) Colony count Average knockout efficiency
(% yield)
Total Knockout
1 ssODN_gabT100c 100 30 29 0.788948
2 ssODN_gabT100c 100 51 32
3 ssODN_gabT100c 100 22 17
4 ssODN_gabT100 100 19 14 0.783234
5 ssODN_gabT100 100 17 12
6 ssODN_gabT100 100 43 39
7 ssODN_gabT200 200 5 2 0.582051
8 ssODN_gabT200 200 13 7
9 ssODN_gabT200 200 26 21
10 ssODN_gabT400 400 9 4 0.431481
11 ssODN_gabT400 400 20 7
12 ssODN_gabT400 400 2 1
13 ssODN_gabT800 800 3 0 0.155556
14 ssODN_gabT800 800 15 2
15 ssODN_gabT800 800 3 1
16 ssODN_gabT1000 1000 4 1 0.285088
17 ssODN_gabT1000 1000 19 2
18 ssODN_gabT1000 1000 6 3
19 ssODN_gabT2000 2000 2 0 0.333333
20 ssODN_gabT2000 2000 3 0
21 ssODN_gabT2000 2000 1 1
22 ssODN_gabT5000 5000 3 0 0.111111
23 ssODN_gabT5000 5000 5 0
24 ssODN_gabT5000 5000 3 1
5-3: 유전자 동시 결실의 다른 사례
본 발명의 유전자 결실 시스템을 이용한 2개의 유전자 동시 결실이 상기 실시예 4-2의 gabT 및 gabP 유전자에 한정되지 않음을 보이고자 본 실시예의 유전자 결실을 진행하였다.
유전자 결실에 필요한 pCG9ts-series 벡터를 구축하고자 상기 실시예 4-1 (a)에 개시한 방법을 따라 표 33의 서열을 안내 서열(guide sequence)로 포함하는 pCG9ts-series 벡터 pCG9ts-Ncgl0595를 제작하였다.
Guide sequence Target gene Sequence
gs_0595 Ncgl0595 GTTATCAAATATGATAGTTA
또한 표적 유전자를 결실시키기 위해 필요한 ssODN은 실시예 4-1 (b)에 개시된 바와 같이 디자인하되, 결실시키고자 하는 서열의 길이가 100 bp가 되도록 표 34와 같이 디자인하였다.
Name Sequence Description
ssODN0595_100
(서열번호 70)		 AGATCCTCTAGGGGGATTAAACCGAGCCAAATGCCAAGGTTAAAAGTTTAGGTGTTCCAGACTGCAGCTTTAAGACAAAT Ncgl0595; lagging strand; 100-bp deletion
ssODN0596_100
(서열번호 71)		 AAAAGTGCCAGTAATAATGCCAAATATATCCCATAAAAGAGAACTAGGAGAGTACCTAGATAAATAAAGGCCATAAAAAT Ncgl0596; lagging strand; 100-bp deletion
상기 pCG9ts-Ncgl0595 벡터 및 ssODN을 이용해 유전자 결실을 진행하기 위하여 실시예 4-2에 개시된 방법을 이용해 상기 실시예 5-1에서 WT-HrT 균주로부터 crtEb 유전자를 결실하여 제조한 (표 29, trial 6) WTΔcrtEb-HrT 균주에 pCG9ts-Ncgl0595 벡터 및 표 34에 개시된 ssODN을 도입하여 Ncgl0595 및 Ncgl0596 유전자 동시 결실을 진행하였다. 유전자 결실 여부는 표 35의 프라이머를 이용하여 1차확인한 뒤 염기 서열 분석을 통해 최종 확인하였다.
Name Sequence Target description
seq_0596_F
(서열번호 72)		 GGGCGAGATGACAATAGAAT Ncgl0505 and Ncgl0506; with seq_0596_R
seq_0596_R
(서열번호 73)		 CCATCTCAAAAGACCTCATACG Ncgl0505 and Ncgl0506; with seq_0595_F
플레이트 상에서 배양된 콜로니를 모두 분석한 결과, 표 36에 나타난 바와 같이 본 발명의 유전자 결실 시스템에서 pCG9ts-Ncgl0595 벡터를 이용해 Ncgl0595 유전자 하나만을 표적으로 삼으면서 Ncgl0595 유전자 및 Ncgl0596 유전자 모두를 동시에 결실시킴으로써 해당 시스템이 하나의 특정 사례에만 적용 가능한 것이 아니라 다양한 사례에 적용가능하다는 것을 확인하였다.
Trial Strain Cas9-sgRNA vector Colony count CoPaR efficiency (%)
Total Ncgl0595 KO Ncgl0596 KO Overlapped KO Among total colony Among targeted KO
1 WTΔcrtEb-HrT pCG9ts-NCgl0595 5 3 1 1 20.0 33.3
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Method of Preparing Corynebacterium Variant Based on CRISPR/Cas System, Recombinase, and ssODN <130> P17-B016 <160> 81 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tcacacagga aacagaattc atgcatcatc atcatcatca tatggacaag aagtactcca 60 tcggc 65 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gcaggtcgac ggatccaagc tttcagtcgc cgcc 34 <210> 3 <211> 112 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atgctcgaat tcgttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca 60 acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgctt cactcgagcc aggcatcaaa ta 112 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 atgctcaagc tttataaacg cagaaaggcc cac 33 <210> 5 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggnnnnnn nnnnnnnnnn nnnngtttta 60 gagctagaaa tagcaagt 78 <210> 6 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tatagatatc ccgcggtata ttaattaata taaacgcaga aaggccc 47 <210> 7 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tggatgatgg ggcgattcag gtatagatat cttgacaatt aatcatcggc t 51 <210> 8 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 aaggtgttgc tgactcatac caggtataga tatcccgcgg tata 44 <210> 9 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggagctct cattttgcag atttgtttta 60 gagctagaaa tagcaagt 78 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ggagtgtata ctggcttact atg 23 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 acatgagaat tacaacttat atcgtatg 28 <210> 12 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 catacgatat aagttgtaat tctcatgtag ttctcccgct gcttgctc 48 <210> 13 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cgataagctc cggatcctct aatgcatgct agtgtggtga g 41 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tagaggatcc ggagcttatc g 21 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 cggatacata tttgaatgta tttag 25 <210> 16 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 catagtaagc cagtatacac tccgaccgag tgagctagct atttg 45 <210> 17 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ctaaatacat tcaaatatgt atccgctgag caataactag cataac 46 <210> 18 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 tcacacagga aacagaattc atgactaagc aaccaccaat c 41 <210> 19 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 atgcctgcag gtcgacttat tcctctgaat tatcgattac ac 42 <210> 20 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 atgcatcacc accatcacca tatgactaag caaccaccaa t 41 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gaattctgtt tcctgtgtga 20 <210> 22 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 taattcacct agttctttac ctgtgagcgg atcacgggcg tgcgagtcac gggatttaag 60 ttttccggtg ttgacggggt 80 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 tccttgtccg atgatctgca 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 gtatgcgtag atgtccttgg 20 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 tctctggctg aattggaagt catgg 25 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 tgacccccag cgagagtgag 20 <210> 27 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 40 <210> 28 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 agacccatca tagtttgccc ccgcgacatt gaccataaat 40 <210> 29 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA-Ncg11221 <400> 29 ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggtcgaca acgcgtacca cggagtttta 60 gagctagaaa tagcaagt 78 <210> 30 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA-gabT <400> 30 ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggtcgaca acgcgtacca cggagtttta 60 gagctagaaa tagcaagt 78 <210> 31 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA-gabP <400> 31 ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggtggcca tgtaataggc cactgtttta 60 gagctagaaa tagcaagt 78 <210> 32 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODN1221_250 <400> 32 ccttacacgt tgagcatgaa gagccaaaga cctcgcttat cagaagatcc tgtcgtttgg 60 cggacgtgtc cgcatgagca 80 <210> 33 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODN1221_400 <400> 33 tcgtgcaagt caccgccggc aatcaatggc tggtcgaacg cgcatgagca cgtccctgtt 60 gttgggtgcg ctgctcttgc 80 <210> 34 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODNgabT_100 <400> 34 ccgtcgcgca gtgggtaaga cattggtgca cggtagacgt gaccgcgccc ttgccggtgt 60 aggcgcgtgc caccttgacg 80 <210> 35 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODNgabT_300 <400> 35 gtggaaatgg ctgcgaggaa tcctggtgcg gggacgatga cggcttcggc gccagagtta 60 aacagcgcgc tcttcttgtc 80 <210> 36 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODNgabP_150 <400> 36 gcgcatcgcg gtgaatccaa tggcgatgaa tgaagtgaac atgccgatga tgatcgcgcg 60 tggcactgcc ttcggggtgg 80 <210> 37 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODNgabP_400 <400> 37 agtggtggaa gaacagttag tccgacagca acggatcgct aagcactgtc catccacaca 60 gcacgatgat gatcgttgcc 80 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 ttcctcggtc ggttcgatgg 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 gatcatcccc aactccacgg 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 tagcacgagc acttgcaccg 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 cttcaatggc tgcaagtgcc 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 accaagaagc cactgcagct 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 gtgactatgc ccaacccgca 20 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 agtaggatcc aatgattaag gaggcaagcc 30 <210> 45 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 gcttgtcgac tcctctatta actcaccatt 30 <210> 46 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODNsnaA_A_100 <400> 46 cgttttgcct gctacacaag ctgacttccc taagatcgtc agattgagaa gcagtatgca 60 gtggcgggaa atattgatgt 80 <210> 47 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODNsnaA_C_100 <400> 47 acatcaatat ttcccgccac tgcatactgc ttctcaatct gacgatctta gggaagtcag 60 cttgtgtagc aggcaaaacg 80 <210> 48 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODNargF_100 <400> 48 aaggctattg ccgagacaat cgcataaagg acttaaactt tcatttgggt ggacatgcca 60 tcgtcgtgga ttccggcagc 80 <210> 49 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODNcrtEb_100 <400> 49 aacgcaattt cggtgctgaa taagcaatca ctgctagcac tgggaacttt tcggtagcac 60 ggccccctcg acgccgcctt 80 <210> 50 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODNhmuO_100 <400> 50 accgcggttg cggccacgca ggctcacaaa ggacaccact atctgctcac cgggaagctc 60 gatgcgcagg catttatcaa 80 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seq_snaA_F <400> 51 gcctctgaca tcgtttgagc 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seq_snaA_R <400> 52 tgggcgaaca aatatgcgaa 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seq_argF_F <400> 53 aggctattgc cgagacaatc 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seq_argF_R <400> 54 aagttttccg gtgttgacgg 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seq_crtEb_F <400> 55 ggctaggcaa gttacagaac 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seq_crtEb_R <400> 56 gcatcactac tagatccacc 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seq_hmuO_F <400> 57 ccgactcttc gccaagactt 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seq_hmuO_R <400> 58 acgcaggctc acaaaggaca 20 <210> 59 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODNgabT_100c <400> 59 cgtcaaggtg gcacgcgcct acaccggcaa gggcgcggtc acgtctaccg tgcaccaatg 60 tcttacccac tgcgcgacgg 80 <210> 60 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODNgabT_100 <400> 60 ccgtcgcgca gtgggtaaga cattggtgca cggtagacgt gaccgcgccc ttgccggtgt 60 aggcgcgtgc caccttgacg 80 <210> 61 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODNgabT_200 <400> 61 gccctggatc ggttcaatga ccacgcaggc gaggttttcg gaccgcgccc ttgccggtgt 60 aggcgcgtgc caccttgacg 80 <210> 62 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODNgabT_400 <400> 62 gatagtggca tgccgccggc gatgcctttt gcggtggtga gaccgcgccc ttgccggtgt 60 aggcgcgtgc caccttgacg 80 <210> 63 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODNgabT_800 <400> 63 accatcacgg agagtgtcct ctgcaatgac cagtggtggc gaccgcgccc ttgccggtgt 60 aggcgcgtgc caccttgacg 80 <210> 64 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODNgabT_1000 <400> 64 cgcggggagt tttcgcagcc catgaaggac cagctgcaac gaccgcgccc ttgccggtgt 60 aggcgcgtgc caccttgacg 80 <210> 65 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODNhmuO_2000 <400> 65 gaatttgctt gtgcaacgcc ttcggccaag tcggtgaaag gaccgcgccc ttgccggtgt 60 aggcgcgtgc caccttgacg 80 <210> 66 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODNhmuO_5000 <400> 66 tgagtgctgc atatttatca tcaacaagca ccacagattc gaccgcgccc ttgccggtgt 60 aggcgcgtgc caccttgacg 80 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seq_gabT_2R <400> 67 ccgcaaacca acggaagtat 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seq_gabT_3R <400> 68 gccaaaaggt gctgctgggt 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seq_gabT_4R <400> 69 accttgtccg caaggtaacg 20 <210> 70 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODN0595_100 <400> 70 agatcctcta gggggattaa accgagccaa atgccaaggt taaaagttta ggtgttccag 60 actgcagctt taagacaaat 80 <210> 71 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssODN0596_100 <400> 71 aaaagtgcca gtaataatgc caaatatatc ccataaaaga gaactaggag agtacctaga 60 taaataaagg ccataaaaat 80 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seq_0596_F <400> 72 gggcgagatg acaatagaat 20 <210> 73 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> seq_0596_R <400> 73 ccatctcaaa agacctcata cg 22 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gs_1221 <400> 74 gcactgatta ctacccaaat 20 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gs_gabT <400> 75 tcgacaacgc gtaccacgga 20 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gs_gabP <400> 76 tggccatgta ataggccact 20 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gs_snaA4 <400> 77 tgctcgaagc tttgctgaac 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gs_argF1 <400> 78 ttttcggagc gtccactcga 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gs_argF2 <400> 79 tgccttgagc tttgcggcta 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gs_crtEb <400> 80 atgaaaagaa taactaggaa 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gs_hmuO <400> 81 aagcaacagc gacctatcgg 20

Claims (20)

  1. 다음의 단계를 포함하는 타겟 유전자가 결실된 박테리아 변이주의 제조방법:
    (a) 정상 박테리아를 34℃ 이상에서 배양하거나, 항생제 선별마커에 대응하는 항생제가 없는 환경에서 배양할 경우, 소실되는 특성을 가지며 재조합 효소(recombinase)를 발현하는 효소발현벡터로 1차 형질전환시키는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 수득된 1차 형질전환된 박테리아의 수용 세포(competent cell)를 제조하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 수용 세포(competent cell)에, 상기 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN)과 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하며 항생제 선별마커에 대응하는 항생제가 없는 환경에서 배양하거나, 34℃ 이상에서 배양할 경우 소실되는 특성을 가지는 제1벡터를 도입하여 2차 형질전환시키는 단계; 및
    (d) 상기 2차 형질전환된 박테리아를 무항생제 배지에서 배양하여 삽입된 효소발현벡터 및 제1벡터를 제거하는 단계.
    여기서, 상기 효소발현벡터 및 제1벡터 중 하나 이상은 Cas 단백질을 발현함.
  2. 다음의 단계를 포함하는 박테리아 변이주의 제조방법:
    (a) 정상 박테리아를 제1항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에 상기 제1항생제가 없는 환경에서 배양하거나, 34℃ 이상에서 배양할 경우 소실되는 특성을 가지며 (i) 재조합 효소(recombinase)를 발현하는 효소발현벡터로 형질전환시키는 단계;
    (b) 상기 형질전환된 박테리아의 수용 세포(competent cell)를 제조하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 수용 세포(competent cell)에 제1 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN)과 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 발현하며, 제2항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에, 상기 제2항생제가 없는 환경에서 배양하거나, 34℃ 이상에서 배양할 경우 소실되는 특성을 가지는 제1벡터를 도입하여 1차 형질전환시키는 단계;
    (d) 상기 1차 형질전환된 균주를 상기 제1항생제는 포함하면서 상기 제2항생제를 포함하지 않은 배지에서 배양하되 34℃ 이상에서 배양하여 삽입된 제1벡터를 제거하여 제1타겟 유전자가 결실된 변이균주를 선별하는 단계;
    (e) 제 n(n은 2 이상의 정수) 타겟 유전자에 상보적으로 결합하는 (i) 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN) 및 (ii) 가이드 RNA(guide RNA)를 포함하며 제n+1항생제 선별마커(selective marker)를 가짐과 동시에, 상기 제n+1항생제가 없는 환경에서 배양하거나, 34℃ 이상에서 배양할 경우 소실되는 특성을 가지는 제n벡터를 사용하여 상기 (b) 단계 내지 (d) 단계를 n-1 회 반복하여, n 개의 타겟 유전자가 결실된 다중변이균주를 제조하는 단계; 및
    (f) 상기 (e) 단계에서 제조된 다중변이균주를 무항생제 배지에서 배양하여 삽입된 효소발현벡터 및 제 n벡터를 제거하는 단계,
    여기서, 상기 효소발현벡터, 제1벡터 및 제n벡터 중 하나 이상은 Cas 단백질을 발현함.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (d)단계는 상기 (c) 단계의 2차 형질전환된 박테리아를 10℃ 내지 42℃에서 배양하는 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법.
  4. 삭제
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (b) 단계는 Tween-20, DL-트레오닌(Theronine) 이소니아지드(isoniazid) 및 글라이신(Glycine)이 함유된 배지에서 배양하여 제조하는 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 재조합 효소(recombinase)는 RecT, RecET, Bet, 및 λ Red로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, (a) 단계의 재조합 효소(recombinase) 및 Cas 단백질은 동일 또는 서로 다른 벡터에 의하여 발현되는 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Cas 단백질 및 가이드 RNA(guide RNA)은 동일 또는 서로 다른 벡터에 의하여 발현되는 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN)은 디옥시리보핵산 상태로 세포에 직접 도입하는 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 타겟 유전자는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 둘 이상의 타겟 유전자는 상기 유전자의 서열에 각각 상보적으로 결합하는 (i) 둘 이상의 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN) 및 (ii) 상기 유전자의 서열 중 하나에 상보적으로 결합하는 가이드 RNA(guide RNA)를 사용하여 동시에 결실시키는 것을 특징으로 박테리아 변이주의 제조방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 효소발현벡터 또는 제1벡터는 서로 다른 항생제 선별마커(selective marker)를 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법.
  13. 삭제
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 타겟 유전자는 Ncgl1221, gabT, gabPsnaA, argF, crtEb 및 hmuO로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN)은 리보핵산 상태로 세포에 직접 도입하는 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법.
  16. 제2항에 있어서, 상기 제1항생제 및 상기 제2항생제는 서로 다른 항생제인 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 단일가닥 올리고디옥시리보핵산(single-stranded oligodeoxyribonucleic acid, ssODN)은 하나 이상 도입하는 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (c) 단계의 제1벡터에서 발현되는 가이드 RNA(guide RNA)는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 박테리아 변이주의 제조방법.
  19. 삭제
  20. 삭제
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