CN115074378B - 高产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建方法与应用 - Google Patents

高产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115074378B
CN115074378B CN202210673552.3A CN202210673552A CN115074378B CN 115074378 B CN115074378 B CN 115074378B CN 202210673552 A CN202210673552 A CN 202210673552A CN 115074378 B CN115074378 B CN 115074378B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
seq
corynebacterium glutamicum
plasmid
artificial sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210673552.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115074378A (zh
Inventor
陈涛
戴维
常志帅
崔洁瑶
王智文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University
Original Assignee
Tianjin University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University filed Critical Tianjin University
Priority to CN202210673552.3A priority Critical patent/CN115074378B/zh
Publication of CN115074378A publication Critical patent/CN115074378A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115074378B publication Critical patent/CN115074378B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/52—Propionic acid; Butyric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/13—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.13)
    • C12Y114/13111—Methanesulfonate monooxygenase (1.14.13.111)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01085—Fatty-acid synthase (2.3.1.85)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了高产3‑羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建方法与应用，其构建：(1)在谷氨酸棒状杆菌重组菌株Cgz14中用弱启动子PP7替换编码脂肪酸合酶fasA基因的启动子；敲除msmA和cg0635基因；(2)在pEC‑sod‑N‑C*质粒的mcr‑N基因和mcr‑C*基因之间插入来自谷氨酸棒杆菌ATCC 13032clpP基因的前62bp，得到pEC‑sod‑N‑HP‑C*质粒；(3)将pEC‑sod‑N‑HP‑C*质粒导入步骤(1)获得的谷氨酸棒杆菌中，即得，本发明所构建的菌株安全无害，可以利用乙酸在有氧条件下使用较简单的生产工艺生产3‑羟基丙酸，发酵产量30g/L以上。

Description

高产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建方法与应用
技术领域
本发明属于生物工程技术与应用领域，具体地涉及一种高产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建及应用。
背景技术
3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid，3-HP)，又名β-羟基丙酸，分子式和分子量分别是C3H6O3和90.08。3-羟基丙酸是非手性有机酸，在25℃，101kPa下表现为粘稠的液体。由于3-羟基丙酸有羟基和羧基两个活性末端，它可以发生多种化学反应，用于合成多种具有重要工业用途的化学品。因此3-羟基丙酸被认为是一种重要的化工原材料，目前已经广泛应用于医药行业，食品行业，农业和新材料等领域。在医药领域，3-羟基丙酸可以用于合成具有高附加值药物的中间体，由于其具有良好的生物可降解性和相容性，3-羟基丙酸还可被用于制作药物包装的材料；在农业领域，3-羟基丙酸是一种无耐药性的植物性细胞毒素，具有重要的农业化学应用价值；在材料领域，3-羟基丙酸可以通过缩合反应生成聚3-羟丙酸等聚合物，这些聚合物可以用于可降解塑料的制备。另外，3-羟基丙酸可以通过脱水反应生成丙烯酸，用于合成树脂、合成纤维的制造；通过还原反应，3-羟基丙酸可用于生产1，3-丙二醇，用于开发各种抗冻试剂，保护剂等。
目前，3-羟基丙酸的生产以石油为原料的化学合成法为主。但其过程繁琐、污染较重，不利于环境保护和能源节约。相比之下，生物法生产3-羟基丙酸工艺简单，对环境污染小，受到广泛关注。生物法生产3-羟基丙酸主要利用的底物有葡萄糖、甘油、木糖等，而利用乙酸作为底物生产3-羟基丙酸的研究较少，乙酸作为一种重要的一元酸，来源广泛，是工业发酵常见的副产物，利用乙酸作为底物生产化学品成本较低，同时有利于环境保护，近年来利用乙酸生产如丙酮、琥珀酸等化学品的研究逐渐受到关注[1,2]。
野生型的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)不能天然生产3-羟基丙酸。但是将经过代谢工程等手段改造的谷氨酸棒状杆菌作为3-羟基丙酸的生产菌株具有以下几点优势：1.谷氨酸棒状杆菌是一种典型的GRAS(Generally Recognized as Safe)菌株，非常适合3-羟基丙酸的生物大规模工业化生产，可以有效降低生产环节中用于生防的成本；2.鲁棒性强。作为一种革兰氏阳性菌，其对高浓度底物、纤维素水解液中的有害成分、高浓度盐、酸、醇等的耐受能力较强。3.作为一种重要的模式菌株，其生理生化特性及遗传背景比较清晰，相关的分子生物学方法和基因操作技术都比较成熟，有利于通过代谢工程及合成生物学的合理设计来改进菌种。
经检索，目前有公开发表的文献对利用乙酸生产3-羟基丙酸进行了报道，大部分研究使用大肠杆菌作为宿主菌株。Lee等[3]改造大肠杆菌利用乙酸生产3-羟基丙酸，在摇瓶中产量达到3g/L；Lama等[4]构建的大肠杆菌工程菌株在2.5L发酵罐中采用两阶段发酵的策略，可以得到7.3g/L的3-羟基丙酸；Lai等[5]通过全细胞催化的策略在大肠杆菌中生产3-羟基丙酸，产量达到了15.8g/L，得率达到0.71g/g。这些研究展现了以乙酸为底物生产3-羟基丙酸的可行性，但是最终的工程菌株的产量等方面较不理想。因此亟待开发能够利用乙酸高产3-羟基丙酸的工程菌株。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株。
本发明的第二个目的是提供一种高产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法。
本发明的第三个目的是提供高产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株的应用。
本发明的技术方案概述如下：
高产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株构建方法，包括如下步骤：
(1)在谷氨酸棒状杆菌重组菌株Cgz14中用弱启动子PP7替换编码脂肪酸合酶fasA基因的启动子；敲除消耗丙二酰半醛生成乙酰辅酶A途径的msmA基因和cg0635基因；
所述弱启动子PP7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述fasA基因的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述msmA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述cg0635基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
(2)在pEC-sod-N-C*质粒的mcr-N基因和mcr-C*基因之间插入来自谷氨酸棒杆菌ATCC13032clpP基因的前62bp，得到pEC-sod-N-HP-C*质粒；
(3)将所述pEC-sod-N-HP-C*质粒导入到步骤(1)获得的谷氨酸棒杆菌中，得到高产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株；
所述质粒pEC-sod-N-C*的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述mcr-N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述mcr-C*基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述clpP基因的前62bp的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述质粒pEC-sod-N-HP-C*的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
上述方法构建的高产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株。
上述菌株在生产3-羟基丙酸中的应用。
本发明所构建的高产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株安全无害，可以利用乙酸在有氧条件下使用较简单的生产工艺生产3-羟基丙酸，发酵产量30g/L以上，这为后续工业化生产3-羟基丙酸奠定了基础。
附图说明
图1为基因操作靶点。
图2为fasA基因启动子替换为弱启动子PP7的载体pD-P7-fasA质粒的图谱。
图3为msmA基因敲除载体pD-msmA质粒的图谱。
图4为cg0635基因敲除载体pD-cg0635质粒的图谱。
图5为pEC-sod-N-C*质粒图谱。
图6为pEC-sod-N-HP-C*质粒图谱。
图7为高产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌工程菌CW5在5L发酵罐中流加补料培养的生产曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。
本发明所用到的最初原始菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032来源为ATCC(American type culture collection，https://www.atcc.org/)， 购买于2012年10月。
本发明中使用的出发菌株谷氨酸棒杆菌重组菌株Cgz14参照已发表文献[6]构建获得。
重组质粒pK18mobsacB和表达载体pEC-XK99E购买于BioVector NTCC公司(http://www.biovector.net/)；质粒pEC-sod-N-C*参照已发表文献[6]获得。
所用甘油、琥珀酸、乳酸、乙酸等标准品从sigma公司(http://www.sigmaaldrich.com/sigma-aldrich)购买；3-羟基丙酸标准品从TCI公司(https://www.tcichemicals.com)购买。
所用限制性内切酶、去磷酸化酶、DNA连接酶等分子生物学试剂从Thermo公司购买(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)。
所用其他生化试剂从生工生物工程(上海)股份有限公司购买(http://www.sangon.com/)。
实施例1：用弱启动子PP7替换编码脂肪酸合酶fasA基因的启动子
本发明中所涉及谷氨酸棒杆菌无痕操作技术与工具载体pD-sacB的构建的具体操作方法与所用引物等可以参照已公开专利(申请号：CN201710215459.7，高产手性D-(-)-乙偶姻的谷氨酸棒杆菌菌株及构建及应用)；使用的出发菌株谷氨酸棒杆菌重组菌株Cgz14可以参照已发表文献[6](本发明将其命名为CW1)。
替换fasA基因的启动子(SEQ ID NO.2)为弱启动子PP7(SEQ ID NO.1)的具体操作如下：
以C.glutamicum ATCC 13032的基因组为模板，以如下引物进行PCR扩增。fasA-1(SEQ ID NO.20)和fasA-2(SEQ ID NO.21)，fasA-3(SEQ ID NO.22)和fasA-4(SEQ IDNO.23)两对引物用于扩增带有部分PP7启动子序列的fasA基因启动子的上下游同源臂fasA-U-P7(SEQ ID NO.10)和P7-fasA-D(SEQ ID NO.11)，经过纯化回收后利用引物fasA-1，fasA-4进行融合PCR扩增，得到融合产物fasA-U-P7-D(SEQ ID NO.12)。然后将融合产物fasA-U-P7-D和pD-sacB使用Thermo Fast digest BamHI/XbaI双酶切，经连接、转化后得到fasA基因启动子替换载体pD-P7-fasA(见图2)。将测序结果正确的质粒通过电转化导入谷氨酸棒状杆菌CW1中，通过无痕操作技术得到fasA基因启动子替换菌株CW2。
实施例2：消耗丙二酰半醛生成乙酰辅酶A途径的msmA基因的敲除
敲除消耗丙二酰半醛生成乙酰辅酶A途径的msmA基因(SEQ ID NO.3)的具体操作如下：
以C.glutamicum ATCC 13032的基因组为模板，以如下引物进行PCR扩增。msmA-1(SEQ ID NO.24)和msmA-2(SEQ ID NO.25)，msmA-3(SEQ ID NO.26)和msmA-4(SEQ IDNO.27)两对引物用于扩增msmA基因上下游同源臂msmA-U(SEQ ID NO.13)和msmA-D(SEQ IDNO.14)；经过纯化回收后利用引物msmA-1，msmA-4进行融合PCR扩增，得到融合产物msmA-U-D(SEQ ID NO.15)。然后将融合产物msmA-U-D和pD-sacB使用Thermo Fast digest BamHI/XbaI双酶切，经连接、转化后得到msmA基因敲除载体pD-msmA(见图3)。将测序结果正确的质粒通过电转化导入谷氨酸棒状杆菌CW2中，通过无痕操作技术得到msmA基因敲除菌株CW3。
实施例3：消耗丙二酰半醛生成乙酰辅酶A途径的cg0635基因的敲除
敲除消耗丙二酰半醛生成乙酰辅酶A途径的cg0635基因(SEQ ID NO.4)的具体操作如下：
以C.glutamicum ATCC 13032的基因组为模板，以如下引物进行PCR扩增。cg0635-1(SEQ ID NO.28)和cg0635-2(SEQ ID NO.29)，cg0635-3(SEQ ID NO.30)和cg0635-4(SEQID NO.31)两对引物用于扩增cg0635基因上下游同源臂cg0635-U(SEQ ID NO.16)和cg0635-D(SEQ ID NO.17)；经过纯化回收后利用引物cg0635-1，cg0635-4进行融合PCR扩增，得到融合产物cg0635-U-D(SEQ ID NO.18)。然后将融合产物cg0635-U-D和pD-sacB使用Thermo Fast digest BamHI/XbaI双酶切，经连接、转化后得到cg0635基因敲除载体pD-cg0635(见图4)。将测序结果正确的质粒通过电转化导入谷氨酸棒状杆菌CW3中，通过无痕操作技术得到cg0635基因敲除菌株CW4。
实施例4：使用游离型多拷贝质粒过表达3-羟基丙酸合成途径mcr基因
本发明中使用的质粒pEC-sod-N-C*(SEQ ID NO.5)(见图5)可以参照已发表文献[6]。
以C.glutamicum ATCC 13032的基因组为模板，用引物HP-1(SEQ ID NO.32)和HP-2(SEQ ID NO.33)进行扩增得到clpP基因的前62bp的片段(SEQ ID NO.8)。以质粒pEC-sod-N-C*为模板，用引物HP-3(SEQ ID NO.34)和HP-4(SEQ ID NO.35)进行扩增，得到含有mcr-N基因(SEQ ID NO.6)和mcr-C*基因(SEQ ID NO.7)的线性化的质粒片段pEC-sod-N-C*-L(SEQ ID NO.19)。经过纯化回收后将clpP基因的前62bp的片段(SEQ ID NO.8)和pEC-sod-N-C*-L使用Thermo Fast digest SacI/XmaJI双酶切，经连接、转化后得到pEC-sod-N-HP-C*质粒(SEQ ID NO.9)(见图6)。
将测序结果正确的pEC-sod-N-HP-C*质粒(SEQ ID NO.9)通过电转化导入谷氨酸棒杆菌CW4中，得到使用游离型多拷贝质粒非诱导过表达3-羟基丙酸合成途径基因mcr的菌株CW5(高产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株)
本发明涉及的基因操作见图1，图1中“×”表示敲除，下划线表示过表达，下箭头表示下调，双斜杠表示解调。
本发明中的菌株代号如CW1-CW5是为了方便描述，但不应理解为对本发明的限定。实施例5：利用构建的高产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株进行3-羟基丙酸的分批补料发酵
接种方式为：取一管在-80℃保藏的CW5菌株种子液，于冰上融化后取200μl到装有50ml 2×YT培养基的250mL摇瓶中，培养24h左右，接种到1000ml摇瓶中(使用CGXIIG1培养基，装液量为200ml，初始OD600为0.5)。培养24h后，将200ml培养基转接到含有1.8L CGXIIG2培养基的5L发酵罐中开始发酵，其中发酵温度为30℃，通气量为1vvm，初始转速为300rpm，并且通过自动调节转速控制溶氧≥30％；通过流加冰乙酸控制pH＝7，当乙酸浓度低于5g/L时补加7g/L的乙酸钠；发酵12h开始每12h流加20ml的Feed1。在140h左右结束流加发酵。
2×YT培养基为：5g/L酵母提取物，16g/L胰蛋白胨，5g/L氯化钠，5g/L乙酸钠，121℃，0.1Mpa下灭菌20min。
CGXIIG1培养基配方为：10g/L酵母提取物，10g/L硫酸铵，5g/L尿素，14g/L乙酸钠，21g/L 3-(N-吗啡啉)丙磺酸，1g/L磷酸氢二钾，1g/L磷酸二氢钾，1.25g/L硫酸镁七水，10mg/L氯化钙，20mg/L硫酸亚铁七水，20mg/L硫酸锰一水，2mg/L硫酸锌七水，0.4mg/L硫酸铜，40μg/L氯化镍一水，0.2mg/L生物素，0.2mg/L维生素B1，121℃，0.1Mpa下灭菌20min。
CGXIIG2培养基配方为：20g/L酵母提取物，10g/L硫酸铵，7g/L乙酸钠，1g/L磷酸氢二钾，1g/L磷酸二氢钾，1.25g/L硫酸镁七水，10mg/L氯化钙，20mg/L硫酸亚铁七水，20mg/L硫酸锰一水，2mg/L硫酸锌七水，0.4mg/L硫酸铜，40μg/L氯化镍一水，0.2mg/L生物素，0.2mg/L维生素B1，121℃，0.1Mpa下灭菌20min。
Feed1配方为：105g/L尿素，10g/L磷酸氢二钾，10g/L磷酸二氢钾，2mg/L生物素，121℃，0.1Mpa下灭菌20min。
从发酵结果可以看出，最终生成30.5g/L的3-羟基丙酸，平均生产速率212mg/L/h，得率0.16g/g乙酸(见图7)。
本发明所构建的高产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株能够达到较高的3-羟基丙酸产量及产率，具有很好的应用前景。
本发明构建的菌株，其基因型为C.glutamicum ATCC 13032ΔldhΔmsmAΔcg0635PP1-glt AATG→TTGPP7-fasAΔfasO(accBC)ΔfasO(accD1)；pEC-sod-N-HP-C*。其可以利用乙酸生产30.5g/L的3-羟基丙酸。
本发明的菌株的构建，其步骤的前后顺序不限定，本领域的技术人员按本发明公开的内容达到本发明的目的均属于本发明的保护范围。
参考文献：
[1]Yang H,Huang B,Lai NY,et al.Metabolic engineering of Escherichiacoli carrying the hybrid acetone-biosynthesis pathway for efficient acetonebiosynthesis from acetate[J].Microbial Cell Factories,2019,18:1-9.
[2]Niu H,Li RR,Wu J,et al.Production of succinate by recombinantEscherichia coli using acetate as the sole carbon source[J].3Biotech,2018,8(10):1-7.
[3]Lee JH,Cha S,Kang CW,et al.Efficient conversion of acetate to 3-hydroxypropionic acid by engineered Escherichia coli[J].Catalysts,2018,8(11):1-10.
[4]Lama S,Kim Y,Nguyen DT,et al.Production of 3-hydroxypropionic acidfrom acetate using metabolically-engineered and glucose-grown Escherichiacoli[J].Bioresource technology,2021,320:1-9.
[5]Lai NY,Luo YV,Fei P,et al.One stone two birds:Biosynthesis of 3-hydroxypropionic acid from CO2 and syngas-derived acetic acid in Escherichiacoli[J].Synthetic and systems biotechnology,2021,6(3):144-152.
[6]Chang ZS,Dai W,Mao YF,et al.Enhanced 3-hydroxypropionic acidproduction from acetate via the malonyl-CoApathway in Corynebacteriumglutamicum[J].Frontiers in Bioengineering and Biotechnology,2022,9:1-12.
序列表
<110> 天津大学
<120> 高产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建方法与应用
<160> 35
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaattattt taaatttcac attgacacgg acgtgacatt gtgatacaat ggtagagtgc 60
<210> 2
<211> 282
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌( Corynebacterium glutamicum atcc 13032)
<400> 2
tgattacctg caggtttccc tcacttgttg gaaggacctt ttcgtccatg aaagttttgt 60
ttggaagagg ttaaatggca cgataagagg agcggaaaat gccacgcccg caaaagatga 120
cgttttcctc atgatttgtg gcatattgtt ttctatccaa tgtcaccctg gtggtttaca 180
ggcgtgccat tttctttaca aaagagtatt aaccgaaact tcaggtcagg atccacgccc 240
tgcgttcatc ccggctaagt tatacaagga gcgagttctc ac 282
<210> 3
<211> 1515
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌( Corynebacterium glutamicum atcc 13032)
<400> 3
atgtctgaac cacaaaccat ctcgcactgg attgacggcg cgatttcccc atccacttcc 60
ggcaagaccg ctcctgtcta caatcctgca actggccagg tcaccgccaa tgttgcgctg 120
gctagccagg aagagatcga tgccaccatc gcttctgcca ccaaggctgc taagacgtgg 180
ggcaacctgt ctatcgctaa gcgccaagct gtgcttttca acttccgtga gctgctgaat 240
gctcgcaagg gtgagctggc ggagatcatc actgcagagc acggcaaggt cttgtccgat 300
gccatgggtg aaatcctgcg cggccaggaa gtcgtggagc ttgctaccgg tttcccacac 360
ctgcttaaag gtgcgttcaa cgagaacgtc tccaccggca ttgatgtgta ttccttgaag 420
cagccactgg gtgttgtcgg tatcatcagc ccgttcaact tccctgcgat ggtgccgatg 480
tggtttttcc caatcgcaat cgctgcaggc aacgcagtta ttttgaagcc ttcagagaag 540
gatccttcgg cagcgctgtg gatggctcag atctggaagg aagctggtct tccagacggc 600
gtattcaacg tgctccaggg cgacaagctg gctgttgatg gtttgctgaa cagccctgat 660
gtctctgcga tttccttcgt gggttccacc ccaatcgcaa agtacatcta cgagacttcc 720
gcgaagaacg gcaagcgcgt ccaggcgttg ggcggcgcga agaaccacat gctggtgctg 780
ccagatgctg atctggatct ggttgccgat caggcaatca acgcaggtta cggcgctgcc 840
ggtgagcgtt gcatggctgt ttctgtggtc ttggctattg aatctgttgc cgacgagctc 900
attgagaaga tcaaggagcg catcgacacc ctgcgcatcg gcaacggtgc cggcgacgag 960
cagggcgagc cgcacctggg cccactaatc accgacgtcc accgcgacaa ggtcgcttct 1020
tatgtcgaca tcgctgaggc cgacggcgcc aagatcatcg tggacgggcg taactgcgcc 1080
gtagacgggc acgaggaggg cttcttcttc ggccctacgc ttatcgacga catcccactc 1140
acgtcccgcg cctacaccga agaaatcttc ggcccggtcc tctctgtcgt tcgtgtcgca 1200
tccttcgacg aggcaattga gctgatcaac tccggtgaat tcggcaacgg aaccgcaatc 1260
ttcaccaacg atggtggagc ggcacgccgc ttccagcatg agatcgaagt gggcatgatc 1320
ggcatcaacg taccaatccc agtgcctgtt gcgtaccact ccttcggtgg ttggaagaac 1380
tccctcttcg gtgacgccaa ggcatatggc actcaaggtt ttgatttctt caccagggaa 1440
aaggcgatca ccagccgttg gctcgaccca gcaacccacg gtggcattaa cctcggtttc 1500
ccacagaacg attaa 1515
<210> 4
<211> 324
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌( Corynebacterium glutamicum atcc 13032)
<400> 4
ttggaaagtt ccaattctca ggcacaggga cgtgcggaca gaattctcga ttcagccttg 60
aaagaaggcg cttcaatagt tgttgatggc cgtacagctc gagaatttca gatggacatc 120
gaagtcggaa tggttggcat taacgtgcca atcccagtcc caattggcgc tttctcattt 180
ggaggttgga aagactcact attcggagac acacacatgt atggatctga gtctttcaac 240
ttctataccc gaagcaaggt ggttaccact cgctggcctc ttccaaatga atcacagatt 300
gagcttggct tccccaccca ctaa 324
<210> 5
<211> 9509
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cttaaggaat tctagctgcc aattattccg ggcttgtgac ccgctacccg ataaataggt 60
cggctgaaaa atttcgttgc aatatcaaca aaaaggccta tcattgggag gtgtcgcacc 120
aagtactttt gcgaagcgcc atttgacgga ttttcaaaag atgtatatgc tcggtgcgga 180
aacctacgaa aggatttttt acccatgtcc ggcactggcc gtttagctgg caagatcgct 240
ctgatcaccg gcggcgctgg taacattggc tctgaactga cccgtcgttt tttagcagag 300
ggcgcaaccg tgatcatctc cggtcgcaat cgtgcaaagc tcaccgcact ggcagagcgc 360
atgcaagctg aggctggcgt cccagctaag cgcatcgatt tagaggtcat ggacggctcc 420
gaccccgttg cagtgcgcgc tggtattgaa gcaatcgtcg ctcgccacgg ccagatcgac 480
atcctcgtca acaatgctgg ttccgctggt gcacagcgtc gcctcgctga aattcctctg 540
accgaggctg agctgggccc cggtgctgaa gaaactttac atgcttctat cgctaattta 600
ctcggcatgg gctggcattt aatgcgcatc gcagcaccac acatgccagt gggttccgca 660
gtcatcaatg tgtccaccat cttctcccgc gctgaatact acggccgcat cccatacgtg 720
accccaaagg cagcactgaa cgcactctcc cagctggctg cacgcgaact gggtgctcgt 780
ggcatccgcg tgaacaccat ctttcccggt ccaatcgaat ccgatcgcat ccgcaccgtg 840
ttccagcgta tggaccagct gaagggccgc ccagagggtg acaccgctca ccatttttta 900
aacactatgc gtctctgccg tgcaaacgat caaggtgctc tcgaacgtcg ctttccatcc 960
gtgggcgatg tggcagatgc tgcagtgttt ttagcatctg cagagtctgc agctctgtcc 1020
ggcgaaacca ttgaggtcac ccacggcatg gagctgccag cttgctccga gacctcttta 1080
ctggctcgta ccgatttacg tactatcgat gcatccggcc gcaccacttt aatttgcgct 1140
ggcgaccaga ttgaagaggt gatggctctc accggtatgc tgcgcacttg cggctccgag 1200
gtgattatcg gcttccgctc cgcagctgct ctggcacagt tcgagcaagc tgtgaacgag 1260
tcccgccgtc tcgctggtgc agatttcacc ccaccaatcg ctctcccatt agatcctcgc 1320
gacccagcaa ccatcgatgc tgtgtttgat tgggctggtg aaaacactgg cggtatccac 1380
gctgctgtga tcctccccgc tacctcccac gagccagctc catgcgtcat cgaagtcgac 1440
gacgaacgcg tgctgaactt cttagcagat gaaatcaccg gcactatcgt catcgcatcc 1500
cgcctcgcac gttactggca gtcccaacgt ctcacccccg gtgctcgtgc acgcggtcca 1560
cgtgtgatct tcctctccaa cggcgctgac caaaacggca acgtctacgg tcgcattcag 1620
tccgctgcaa tcggtcaact gatccgcgtg tggcgccatg aggcagaact cgattaccag 1680
cgtgcatccg cagctggtga ccacgtgctg ccacccgttt gggctaatca aatcgtgcgc 1740
ttcgctaacc gttctctgga gggcctcgaa tttgcttgcg cttggactgc tcagttatta 1800
cactcccagc gccacatcaa cgagatcact ttaaacatcc ccgctaatat ttaagagctc 1860
aaaggaggac aaccatgtct gcaaccaccg gcgctcgttc cgcttccgtc ggttgggctg 1920
aatctctgat cggtttacat ttaggcaaag tggcactgat cactggtggc tccgctggta 1980
ttggcggcca gatcggtcgt ctgctcgcac tctccggcgc acgtgtgatg ctcgctgcac 2040
gcgaccgcca taagctggag cagatgcaag ctatgattca gtccgaactc gctgaagtgg 2100
gctacactga cgtcgaagat cgtgtgcaca ttgctcccgg ttgcgacgtc tcctccgagg 2160
cacaactggc agatctcgtc gagcgcaccc tctccgcttt cggcactgtc gactatttaa 2220
tcaacaacgc tggtatcgct ggtgtcgagg agatggtgat cgatatgccc gttgagggtt 2280
ggcgtcacac cctcttcgca aatttaatct ccaactactc tctcatgcgc aagctggcac 2340
ctctgatgaa gaagcaaggc tccggttaca ttttaaatgt gtcctcctac ttcggcggcg 2400
agaaggacgc tgctatccca tacccaaacc gcgctgacta cgcagtctcc aaggctggtc 2460
agcgcgcaat ggcagaagtg tttgcacgct ttctgggtcc cgaaatccag atcaacgcaa 2520
tcgctcccgg tccagtcgag ggtgatcgcc tccgtggcac cggcgaacgt cccggtctgt 2580
tcgctcgccg tgcacgcctc attttagaga acaagcgttt aaatgagctg cacgcagctc 2640
tcatcgctgc tgctcgcact gacgagcgtt ccatgcacga gctggtggaa ctcttattac 2700
caaatgatgt ggcagcactc gaacagaacc cagcagcacc aaccgctctg cgtgaattag 2760
cacgccgctt tcgttccgaa ggtgatccag cagcttcctc ttcctccgct ctgctcaacc 2820
gctctatcgc agctaagtta ttagctcgcc tccacaacgg cggctacgtt ttaccagcag 2880
acatcttcgc taatttacca aacccacccg atcctttctt cacccgtgca cagatcgacc 2940
gcgaggctcg caaggtccgt gacggcatca tgggtatgct gtatttacag cgtatgccta 3000
ccgagtttga cgtggctatg gcaaccgtgt actatttagc tgaccgcgtc gtctccggcg 3060
agaccttcca cccatccggc ggtctccgtt acgagcgcac ccctaccggt ggtgaattat 3120
tcggcctccc ttcccccgaa cgtttagcag aactggtggg ttccactgtc tatttaatcg 3180
gcgaacacct caccgaacac ctcaatttac tggcacgtgc atatttagag cgttatggcg 3240
cacgccaagt tgtgatgatc gtcgagaccg agaccggcgc tgaaaccatg cgccgtttac 3300
tccatgatca cgtcgaagct ggtcgtctga tgaccatcgt ggctggtgac cagatcgagg 3360
cagcaatcga tcaagctatc acccgttatg gccgtcccgg tcccgttgtc tgcaccccat 3420
tccgcccact gcctaccgtg ccactggtgg gccgcaagga ctccgactgg tccaccgtgc 3480
tgtccgaggc agagtttgct gaactgtgcg aacaccagct gacccaccat tttcgcgtcg 3540
cacgctggat cgcactgtct gacggcgctc gtttagctct cgtgaccccc gaaaccactg 3600
caacctctac caccgagcag tttgctctgg caaacttcat caaaactact ttacacgcat 3660
tcactgcaac catcggcgtg gaatccgaac gcaccgcaca gcgcattctg attaaccaag 3720
ttgatttaac ccgccgcgct cgcgcagaag aaccacgcga tcctcacgaa cgtcagcaag 3780
aactggaacg cttcatcgaa gcagtgctgc tggtgaccgc accactccca cccgaagctg 3840
atacccgcta cgctggtcgc atccaccgtg gtcgtgctat caccgtgtaa ggtacccggg 3900
gatcctctag agtcgacctg caggcatgca agcttggctg ttttggcgga tgagagaaga 3960
ttttcagcct gatacagatt aaatcagaac gcagaagcgg tctgataaaa cagaatttgc 4020
ctggcggcag tagcgcggtg gtcccacctg accccatgcc gaactcagaa gtgaaacgcc 4080
gtagcgccga tggtagtgtg gggtctcccc atgcgagagt agggaactgc caggcatcaa 4140
ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg 4200
aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg ggagcggatt tgaacgttgc gaagcaacgg 4260
cccggagggt ggcgggcagg acgcccgcca taaactgcca ggcatcaaat taagcagaag 4320
gccatcctga cggatggcct ttttgcgttt ctacaaactc tttttgttta tttttctaaa 4380
tacattcaaa tatgtatccg ctcatgaatt aattccgcta gatgacgtgc ggcttcgacc 4440
tcctgggcgt ggcgcttgtt ggcgcgctcg cggctggctg cggcacgaca cgcgtctgag 4500
cagtattttg cgcgccgtcc tcgtgggtca ggccggggtg ggatcaggcc accgcagtag 4560
gcgcagctga tgcgatcctc cactactgcg cgtcctcctg gcgctgccga gcacgcagct 4620
cgtcggccag ctcttcaagg tcggccacaa gcgtttctag gtcgctcgcg gcacttgccc 4680
agtcgcgtga tgctggcgcg tctgtcgtat cgagggcgcg gaaaaatccg atcaccgttt 4740
ttaaatcgac ggcggcatcg agtgcgtcgg actccagcgc gacatcggag agatccaccg 4800
ctgatgcttc aggccagttt tggtacttcg tcgtgaaggt catgacacca ttataacgaa 4860
cgttcgttaa aaattctagc cccaattctg ataatttctt ccggcactcc tgcgaaaacc 4920
tgcgagactt cttgcccaga aaaaacgcca agcgcagcgg ttaccgcact ttttttccag 4980
gtgatttcac cctgaccagc gaagcggcac tttagtgcat gaggtgtgcc cctggtttcc 5040
cctctttgga gggttcaacc caaaaaagca cacaagcaaa aatgaaaatc atcatgagca 5100
agttggtgcg aagcagcaac gcgctagctc caaaaaggtc tccaggatct cgaggagatt 5160
tttgaggggg agggagtcga ggaagagcca gagcagaagg cgggggaacc gttctctgcc 5220
gacagcgtga gcccccctta aaaatcaggc cggggaggaa ccggggaggg atcagagcta 5280
ggagcgagac accctaaagg gggggaaccg ttttctgctg acggtgtttc gtttattagt 5340
tttcagcccg tggatagcgg agggtgaggg caagtgagag ccagagcaag gacgggaccc 5400
ctaaaggggg gaaccgtttt ctgctgacgg tgtttcgttt attagttttc agcccgtgga 5460
cggccgcgtt tagcttccat tccaagtgcc tttctgactt gttggatgcg cctttcactg 5520
acacctagtt cgcctgcaag ctcacgagtc gagggatcag caaccgattg agaacgggca 5580
tccaggatcg cagttttgac gcgaagttcg agcaactcgc ctgtcatttc tcggcgtttg 5640
tttgcttccg ctaatcgctg tcgcgtctcc tgcgcatact tactttctgg gtcagcccat 5700
ctgcgtgcat tcgatgtagc tgcgccccgt cgccccatcg tcgctagagc tttccgccct 5760
cggctgctct gcgtttccac ccgacgagca gggacgactg gctggccttt agccacgtag 5820
ccgcgcacac gacgcgccat cgtcaggcga tcacgcatgg cgggaagatc cggctcccgg 5880
ccgtctgcac cgaccgcctg ggcaacgttg tacgccactt catacgcgtc gatgatcttg 5940
gcatctttta ggcgctcacc agcagctttg agctggtatc ccacggtcaa cgcgtggcga 6000
aacgcggtct cgtcgcgcgc tgcgcgctct ggatttgtcc agagcactcg cacgccgtcg 6060
atcaggtcgc cggacgcgtc cagggcgctc ggcaggctcg cgtccaaaat cgctagcgcc 6120
ttggcttctg cggtggcgcg ttgtgccgct tcaatgcggg cgcgtccgct ggaaaagtcc 6180
tgctcaatgt actttttcgg cttctgtgat ccggtcatcg ttcgagcaat ctccattagg 6240
tcggccagcc gatccacacg atcatgctgg cagtgccatt tataggctgt cggatcgtct 6300
gagacgtgca gcggccaccg gctcagccta tgcgaaaaag cctggtcagc gccgaaaaca 6360
cgagtcattt cttccgtcgt tgcagccagc aggcgcatat ttgggctggt tttacctgct 6420
gcggcataca ccgggtcaat gagccagatg agctggcatt tcccgctcag cggattcacg 6480
ccgatccaag ccggcgcttt ttctaggcgt gcccatttct ctaaaatcgc gtagacctgc 6540
gggtttacgt gctcaatctt cccgccggcc tggtggctgg gcacatcgat gtcaagcacg 6600
atcaccgcgg catgttgcgc gtgcgtcagc gcaacgtact ggcaccgcgt cagcgctttt 6660
gagccagccc ggtagagctt tggttgggtt tcgccggtat ccgggttttt aatccaggcg 6720
ctcgcgaaat ctcttgtctt gctgccctgg aagctttcgc gtcccaggtg agcgagcagt 6780
tcgcggcgat cttctgccgt ccagccgcgt gagccgcagc gcatagcttc ggggtgggtg 6840
tcgaacagat cggcggacaa tttccacgcg ctagctgtga ctgtgtcctg cggatcggct 6900
agagtcatgt cttgagtgct ttctcccagc tgatgactgg gggttagccg acgccctgtg 6960
agttcccgct cacggggcgt tcaacttttt caggtatttg tgcagcttat cgtgttttct 7020
tcgtaaatga acgcttaact accttgttaa acgtggcaaa taggcaggat tgatggggat 7080
ctagcttcac gctgccgcaa gcactcaggg cgcaagggct gctaaaggaa gcggaacacg 7140
tagaaagcca gtccgcagaa acggtgctga ccccggatga atgtcagcta ctgggctatc 7200
tggacaaggg aaaacgcaag cgcaaagaga aagcaggtag cttgcagtgg gcttacatgg 7260
cgatagctag actgggcggt tttatggaca gcaagcgaac cggaattgcc agctggggcg 7320
ccctctggta aggttgggaa gccctgcaaa gtaaactgga tggctttctt gccgccaagg 7380
atctgatggc gcaggggatc aagatctgat caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg 7440
attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc 7500
tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg 7560
caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactccaa 7620
gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc 7680
gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat 7740
ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg 7800
cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc 7860
gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag 7920
catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgcggat gcccgacggc 7980
gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc 8040
cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata 8100
gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc 8160
gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac 8220
gagttcttct gagcgggact ctggggttcg cggaatcatg accaaaatcc cttaacgtga 8280
gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 8340
tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 8400
ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc 8460
gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc 8520
tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg 8580
cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 8640
gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 8700
actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 8760
ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 8820
gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 8880
atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 8940
tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc 9000
tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg 9060
aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcctga tgcggtattt 9120
tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg 9180
ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg 9240
gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg 9300
gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca 9360
ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagcag atcaattcgc gcgcgaaggc gaagcggcat 9420
gcatttacgt tgacaccatc gaatggtgca aaacctttcg cggtatggca tgatagcgcc 9480
cggaagagag tcaattcagg gtggtgaat 9509
<210> 6
<211> 1650
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgtccggca ctggccgttt agctggcaag atcgctctga tcaccggcgg cgctggtaac 60
attggctctg aactgacccg tcgtttttta gcagagggcg caaccgtgat catctccggt 120
cgcaatcgtg caaagctcac cgcactggca gagcgcatgc aagctgaggc tggcgtccca 180
gctaagcgca tcgatttaga ggtcatggac ggctccgacc ccgttgcagt gcgcgctggt 240
attgaagcaa tcgtcgctcg ccacggccag atcgacatcc tcgtcaacaa tgctggttcc 300
gctggtgcac agcgtcgcct cgctgaaatt cctctgaccg aggctgagct gggccccggt 360
gctgaagaaa ctttacatgc ttctatcgct aatttactcg gcatgggctg gcatttaatg 420
cgcatcgcag caccacacat gccagtgggt tccgcagtca tcaatgtgtc caccatcttc 480
tcccgcgctg aatactacgg ccgcatccca tacgtgaccc caaaggcagc actgaacgca 540
ctctcccagc tggctgcacg cgaactgggt gctcgtggca tccgcgtgaa caccatcttt 600
cccggtccaa tcgaatccga tcgcatccgc accgtgttcc agcgtatgga ccagctgaag 660
ggccgcccag agggtgacac cgctcaccat tttttaaaca ctatgcgtct ctgccgtgca 720
aacgatcaag gtgctctcga acgtcgcttt ccatccgtgg gcgatgtggc agatgctgca 780
gtgtttttag catctgcaga gtctgcagct ctgtccggcg aaaccattga ggtcacccac 840
ggcatggagc tgccagcttg ctccgagacc tctttactgg ctcgtaccga tttacgtact 900
atcgatgcat ccggccgcac cactttaatt tgcgctggcg accagattga agaggtgatg 960
gctctcaccg gtatgctgcg cacttgcggc tccgaggtga ttatcggctt ccgctccgca 1020
gctgctctgg cacagttcga gcaagctgtg aacgagtccc gccgtctcgc tggtgcagat 1080
ttcaccccac caatcgctct cccattagat cctcgcgacc cagcaaccat cgatgctgtg 1140
tttgattggg ctggtgaaaa cactggcggt atccacgctg ctgtgatcct ccccgctacc 1200
tcccacgagc cagctccatg cgtcatcgaa gtcgacgacg aacgcgtgct gaacttctta 1260
gcagatgaaa tcaccggcac tatcgtcatc gcatcccgcc tcgcacgtta ctggcagtcc 1320
caacgtctca cccccggtgc tcgtgcacgc ggtccacgtg tgatcttcct ctccaacggc 1380
gctgaccaaa acggcaacgt ctacggtcgc attcagtccg ctgcaatcgg tcaactgatc 1440
cgcgtgtggc gccatgaggc agaactcgat taccagcgtg catccgcagc tggtgaccac 1500
gtgctgccac ccgtttgggc taatcaaatc gtgcgcttcg ctaaccgttc tctggagggc 1560
ctcgaatttg cttgcgcttg gactgctcag ttattacact cccagcgcca catcaacgag 1620
atcactttaa acatccccgc taatatttaa 1650
<210> 7
<211> 2016
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgtctgcaa ccaccggcgc tcgttccgct tccgtcggtt gggctgaatc tctgatcggt 60
ttacatttag gcaaagtggc actgatcact ggtggctccg ctggtattgg cggccagatc 120
ggtcgtctgc tcgcactctc cggcgcacgt gtgatgctcg ctgcacgcga ccgccataag 180
ctggagcaga tgcaagctat gattcagtcc gaactcgctg aagtgggcta cactgacgtc 240
gaagatcgtg tgcacattgc tcccggttgc gacgtctcct ccgaggcaca actggcagat 300
ctcgtcgagc gcaccctctc cgctttcggc actgtcgact atttaatcaa caacgctggt 360
atcgctggtg tcgaggagat ggtgatcgat atgcccgttg agggttggcg tcacaccctc 420
ttcgcaaatt taatctccaa ctactctctc atgcgcaagc tggcacctct gatgaagaag 480
caaggctccg gttacatttt aaatgtgtcc tcctacttcg gcggcgagaa ggacgctgct 540
atcccatacc caaaccgcgc tgactacgca gtctccaagg ctggtcagcg cgcaatggca 600
gaagtgtttg cacgctttct gggtcccgaa atccagatca acgcaatcgc tcccggtcca 660
gtcgagggtg atcgcctccg tggcaccggc gaacgtcccg gtctgttcgc tcgccgtgca 720
cgcctcattt tagagaacaa gcgtttaaat gagctgcacg cagctctcat cgctgctgct 780
cgcactgacg agcgttccat gcacgagctg gtggaactct tattaccaaa tgatgtggca 840
gcactcgaac agaacccagc agcaccaacc gctctgcgtg aattagcacg ccgctttcgt 900
tccgaaggtg atccagcagc ttcctcttcc tccgctctgc tcaaccgctc tatcgcagct 960
aagttattag ctcgcctcca caacggcggc tacgttttac cagcagacat cttcgctaat 1020
ttaccaaacc cacccgatcc tttcttcacc cgtgcacaga tcgaccgcga ggctcgcaag 1080
gtccgtgacg gcatcatggg tatgctgtat ttacagcgta tgcctaccga gtttgacgtg 1140
gctatggcaa ccgtgtacta tttagctgac cgcgtcgtct ccggcgagac cttccaccca 1200
tccggcggtc tccgttacga gcgcacccct accggtggtg aattattcgg cctcccttcc 1260
cccgaacgtt tagcagaact ggtgggttcc actgtctatt taatcggcga acacctcacc 1320
gaacacctca atttactggc acgtgcatat ttagagcgtt atggcgcacg ccaagttgtg 1380
atgatcgtcg agaccgagac cggcgctgaa accatgcgcc gtttactcca tgatcacgtc 1440
gaagctggtc gtctgatgac catcgtggct ggtgaccaga tcgaggcagc aatcgatcaa 1500
gctatcaccc gttatggccg tcccggtccc gttgtctgca ccccattccg cccactgcct 1560
accgtgccac tggtgggccg caaggactcc gactggtcca ccgtgctgtc cgaggcagag 1620
tttgctgaac tgtgcgaaca ccagctgacc caccattttc gcgtcgcacg ctggatcgca 1680
ctgtctgacg gcgctcgttt agctctcgtg acccccgaaa ccactgcaac ctctaccacc 1740
gagcagtttg ctctggcaaa cttcatcaaa actactttac acgcattcac tgcaaccatc 1800
ggcgtggaat ccgaacgcac cgcacagcgc attctgatta accaagttga tttaacccgc 1860
cgcgctcgcg cagaagaacc acgcgatcct cacgaacgtc agcaagaact ggaacgcttc 1920
atcgaagcag tgctgctggt gaccgcacca ctcccacccg aagctgatac ccgctacgct 1980
ggtcgcatcc accgtggtcg tgctatcacc gtgtaa 2016
<210> 8
<211> 62
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum atcc 13032)
<400> 8
atgagcgata ttcgtatggc agcccagggt gggcctggtt tcggaaatga cgtctttgat 60
cg 62
<210> 9
<211> 9595
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cttaaggaat tctagctgcc aattattccg ggcttgtgac ccgctacccg ataaataggt 60
cggctgaaaa atttcgttgc aatatcaaca aaaaggccta tcattgggag gtgtcgcacc 120
aagtactttt gcgaagcgcc atttgacgga ttttcaaaag atgtatatgc tcggtgcgga 180
aacctacgaa aggatttttt acccatgtcc ggcactggcc gtttagctgg caagatcgct 240
ctgatcaccg gcggcgctgg taacattggc tctgaactga cccgtcgttt tttagcagag 300
ggcgcaaccg tgatcatctc cggtcgcaat cgtgcaaagc tcaccgcact ggcagagcgc 360
atgcaagctg aggctggcgt cccagctaag cgcatcgatt tagaggtcat ggacggctcc 420
gaccccgttg cagtgcgcgc tggtattgaa gcaatcgtcg ctcgccacgg ccagatcgac 480
atcctcgtca acaatgctgg ttccgctggt gcacagcgtc gcctcgctga aattcctctg 540
accgaggctg agctgggccc cggtgctgaa gaaactttac atgcttctat cgctaattta 600
ctcggcatgg gctggcattt aatgcgcatc gcagcaccac acatgccagt gggttccgca 660
gtcatcaatg tgtccaccat cttctcccgc gctgaatact acggccgcat cccatacgtg 720
accccaaagg cagcactgaa cgcactctcc cagctggctg cacgcgaact gggtgctcgt 780
ggcatccgcg tgaacaccat ctttcccggt ccaatcgaat ccgatcgcat ccgcaccgtg 840
ttccagcgta tggaccagct gaagggccgc ccagagggtg acaccgctca ccatttttta 900
aacactatgc gtctctgccg tgcaaacgat caaggtgctc tcgaacgtcg ctttccatcc 960
gtgggcgatg tggcagatgc tgcagtgttt ttagcatctg cagagtctgc agctctgtcc 1020
ggcgaaacca ttgaggtcac ccacggcatg gagctgccag cttgctccga gacctcttta 1080
ctggctcgta ccgatttacg tactatcgat gcatccggcc gcaccacttt aatttgcgct 1140
ggcgaccaga ttgaagaggt gatggctctc accggtatgc tgcgcacttg cggctccgag 1200
gtgattatcg gcttccgctc cgcagctgct ctggcacagt tcgagcaagc tgtgaacgag 1260
tcccgccgtc tcgctggtgc agatttcacc ccaccaatcg ctctcccatt agatcctcgc 1320
gacccagcaa ccatcgatgc tgtgtttgat tgggctggtg aaaacactgg cggtatccac 1380
gctgctgtga tcctccccgc tacctcccac gagccagctc catgcgtcat cgaagtcgac 1440
gacgaacgcg tgctgaactt cttagcagat gaaatcaccg gcactatcgt catcgcatcc 1500
cgcctcgcac gttactggca gtcccaacgt ctcacccccg gtgctcgtgc acgcggtcca 1560
cgtgtgatct tcctctccaa cggcgctgac caaaacggca acgtctacgg tcgcattcag 1620
tccgctgcaa tcggtcaact gatccgcgtg tggcgccatg aggcagaact cgattaccag 1680
cgtgcatccg cagctggtga ccacgtgctg ccacccgttt gggctaatca aatcgtgcgc 1740
ttcgctaacc gttctctgga gggcctcgaa tttgcttgcg cttggactgc tcagttatta 1800
cactcccagc gccacatcaa cgagatcact ttaaacatcc ccgctaatat ttaagagctc 1860
aaaggaggac aaccatgagc gatattcgta tggcagccca gggtgggcct ggtttcggaa 1920
atgacgtctt tgatcgaaag gaggacaact aatgcctagg atgtctgcaa ccaccggcgc 1980
tcgttccgct tccgtcggtt gggctgaatc tctgatcggt ttacatttag gcaaagtggc 2040
actgatcact ggtggctccg ctggtattgg cggccagatc ggtcgtctgc tcgcactctc 2100
cggcgcacgt gtgatgctcg ctgcacgcga ccgccataag ctggagcaga tgcaagctat 2160
gattcagtcc gaactcgctg aagtgggcta cactgacgtc gaagatcgtg tgcacattgc 2220
tcccggttgc gacgtctcct ccgaggcaca actggcagat ctcgtcgagc gcaccctctc 2280
cgctttcggc actgtcgact atttaatcaa caacgctggt atcgctggtg tcgaggagat 2340
ggtgatcgat atgcccgttg agggttggcg tcacaccctc ttcgcaaatt taatctccaa 2400
ctactctctc atgcgcaagc tggcacctct gatgaagaag caaggctccg gttacatttt 2460
aaatgtgtcc tcctacttcg gcggcgagaa ggacgctgct atcccatacc caaaccgcgc 2520
tgactacgca gtctccaagg ctggtcagcg cgcaatggca gaagtgtttg cacgctttct 2580
gggtcccgaa atccagatca acgcaatcgc tcccggtcca gtcgagggtg atcgcctccg 2640
tggcaccggc gaacgtcccg gtctgttcgc tcgccgtgca cgcctcattt tagagaacaa 2700
gcgtttaaat gagctgcacg cagctctcat cgctgctgct cgcactgacg agcgttccat 2760
gcacgagctg gtggaactct tattaccaaa tgatgtggca gcactcgaac agaacccagc 2820
agcaccaacc gctctgcgtg aattagcacg ccgctttcgt tccgaaggtg atccagcagc 2880
ttcctcttcc tccgctctgc tcaaccgctc tatcgcagct aagttattag ctcgcctcca 2940
caacggcggc tacgttttac cagcagacat cttcgctaat ttaccaaacc cacccgatcc 3000
tttcttcacc cgtgcacaga tcgaccgcga ggctcgcaag gtccgtgacg gcatcatggg 3060
tatgctgtat ttacagcgta tgcctaccga gtttgacgtg gctatggcaa ccgtgtacta 3120
tttagctgac cgcgtcgtct ccggcgagac cttccaccca tccggcggtc tccgttacga 3180
gcgcacccct accggtggtg aattattcgg cctcccttcc cccgaacgtt tagcagaact 3240
ggtgggttcc actgtctatt taatcggcga acacctcacc gaacacctca atttactggc 3300
acgtgcatat ttagagcgtt atggcgcacg ccaagttgtg atgatcgtcg agaccgagac 3360
cggcgctgaa accatgcgcc gtttactcca tgatcacgtc gaagctggtc gtctgatgac 3420
catcgtggct ggtgaccaga tcgaggcagc aatcgatcaa gctatcaccc gttatggccg 3480
tcccggtccc gttgtctgca ccccattccg cccactgcct accgtgccac tggtgggccg 3540
caaggactcc gactggtcca ccgtgctgtc cgaggcagag tttgctgaac tgtgcgaaca 3600
ccagctgacc caccattttc gcgtcgcacg ctggatcgca ctgtctgacg gcgctcgttt 3660
agctctcgtg acccccgaaa ccactgcaac ctctaccacc gagcagtttg ctctggcaaa 3720
cttcatcaaa actactttac acgcattcac tgcaaccatc ggcgtggaat ccgaacgcac 3780
cgcacagcgc attctgatta accaagttga tttaacccgc cgcgctcgcg cagaagaacc 3840
acgcgatcct cacgaacgtc agcaagaact ggaacgcttc atcgaagcag tgctgctggt 3900
gaccgcacca ctcccacccg aagctgatac ccgctacgct ggtcgcatcc accgtggtcg 3960
tgctatcacc gtgtaaggta cccggggatc ctctagagtc gacctgcagg catgcaagct 4020
tggctgtttt ggcggatgag agaagatttt cagcctgata cagattaaat cagaacgcag 4080
aagcggtctg ataaaacaga atttgcctgg cggcagtagc gcggtggtcc cacctgaccc 4140
catgccgaac tcagaagtga aacgccgtag cgccgatggt agtgtggggt ctccccatgc 4200
gagagtaggg aactgccagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct 4260
ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat ccgccgggag 4320
cggatttgaa cgttgcgaag caacggcccg gagggtggcg ggcaggacgc ccgccataaa 4380
ctgccaggca tcaaattaag cagaaggcca tcctgacgga tggccttttt gcgtttctac 4440
aaactctttt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgaattaatt 4500
ccgctagatg acgtgcggct tcgacctcct gggcgtggcg cttgttggcg cgctcgcggc 4560
tggctgcggc acgacacgcg tctgagcagt attttgcgcg ccgtcctcgt gggtcaggcc 4620
ggggtgggat caggccaccg cagtaggcgc agctgatgcg atcctccact actgcgcgtc 4680
ctcctggcgc tgccgagcac gcagctcgtc ggccagctct tcaaggtcgg ccacaagcgt 4740
ttctaggtcg ctcgcggcac ttgcccagtc gcgtgatgct ggcgcgtctg tcgtatcgag 4800
ggcgcggaaa aatccgatca ccgtttttaa atcgacggcg gcatcgagtg cgtcggactc 4860
cagcgcgaca tcggagagat ccaccgctga tgcttcaggc cagttttggt acttcgtcgt 4920
gaaggtcatg acaccattat aacgaacgtt cgttaaaaat tctagcccca attctgataa 4980
tttcttccgg cactcctgcg aaaacctgcg agacttcttg cccagaaaaa acgccaagcg 5040
cagcggttac cgcacttttt ttccaggtga tttcaccctg accagcgaag cggcacttta 5100
gtgcatgagg tgtgcccctg gtttcccctc tttggagggt tcaacccaaa aaagcacaca 5160
agcaaaaatg aaaatcatca tgagcaagtt ggtgcgaagc agcaacgcgc tagctccaaa 5220
aaggtctcca ggatctcgag gagatttttg agggggaggg agtcgaggaa gagccagagc 5280
agaaggcggg ggaaccgttc tctgccgaca gcgtgagccc cccttaaaaa tcaggccggg 5340
gaggaaccgg ggagggatca gagctaggag cgagacaccc taaagggggg gaaccgtttt 5400
ctgctgacgg tgtttcgttt attagttttc agcccgtgga tagcggaggg tgagggcaag 5460
tgagagccag agcaaggacg ggacccctaa aggggggaac cgttttctgc tgacggtgtt 5520
tcgtttatta gttttcagcc cgtggacggc cgcgtttagc ttccattcca agtgcctttc 5580
tgacttgttg gatgcgcctt tcactgacac ctagttcgcc tgcaagctca cgagtcgagg 5640
gatcagcaac cgattgagaa cgggcatcca ggatcgcagt tttgacgcga agttcgagca 5700
actcgcctgt catttctcgg cgtttgtttg cttccgctaa tcgctgtcgc gtctcctgcg 5760
catacttact ttctgggtca gcccatctgc gtgcattcga tgtagctgcg ccccgtcgcc 5820
ccatcgtcgc tagagctttc cgccctcggc tgctctgcgt ttccacccga cgagcaggga 5880
cgactggctg gcctttagcc acgtagccgc gcacacgacg cgccatcgtc aggcgatcac 5940
gcatggcggg aagatccggc tcccggccgt ctgcaccgac cgcctgggca acgttgtacg 6000
ccacttcata cgcgtcgatg atcttggcat cttttaggcg ctcaccagca gctttgagct 6060
ggtatcccac ggtcaacgcg tggcgaaacg cggtctcgtc gcgcgctgcg cgctctggat 6120
ttgtccagag cactcgcacg ccgtcgatca ggtcgccgga cgcgtccagg gcgctcggca 6180
ggctcgcgtc caaaatcgct agcgccttgg cttctgcggt ggcgcgttgt gccgcttcaa 6240
tgcgggcgcg tccgctggaa aagtcctgct caatgtactt tttcggcttc tgtgatccgg 6300
tcatcgttcg agcaatctcc attaggtcgg ccagccgatc cacacgatca tgctggcagt 6360
gccatttata ggctgtcgga tcgtctgaga cgtgcagcgg ccaccggctc agcctatgcg 6420
aaaaagcctg gtcagcgccg aaaacacgag tcatttcttc cgtcgttgca gccagcaggc 6480
gcatatttgg gctggtttta cctgctgcgg catacaccgg gtcaatgagc cagatgagct 6540
ggcatttccc gctcagcgga ttcacgccga tccaagccgg cgctttttct aggcgtgccc 6600
atttctctaa aatcgcgtag acctgcgggt ttacgtgctc aatcttcccg ccggcctggt 6660
ggctgggcac atcgatgtca agcacgatca ccgcggcatg ttgcgcgtgc gtcagcgcaa 6720
cgtactggca ccgcgtcagc gcttttgagc cagcccggta gagctttggt tgggtttcgc 6780
cggtatccgg gtttttaatc caggcgctcg cgaaatctct tgtcttgctg ccctggaagc 6840
tttcgcgtcc caggtgagcg agcagttcgc ggcgatcttc tgccgtccag ccgcgtgagc 6900
cgcagcgcat agcttcgggg tgggtgtcga acagatcggc ggacaatttc cacgcgctag 6960
ctgtgactgt gtcctgcgga tcggctagag tcatgtcttg agtgctttct cccagctgat 7020
gactgggggt tagccgacgc cctgtgagtt cccgctcacg gggcgttcaa ctttttcagg 7080
tatttgtgca gcttatcgtg ttttcttcgt aaatgaacgc ttaactacct tgttaaacgt 7140
ggcaaatagg caggattgat ggggatctag cttcacgctg ccgcaagcac tcagggcgca 7200
agggctgcta aaggaagcgg aacacgtaga aagccagtcc gcagaaacgg tgctgacccc 7260
ggatgaatgt cagctactgg gctatctgga caagggaaaa cgcaagcgca aagagaaagc 7320
aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat agctagactg ggcggtttta tggacagcaa 7380
gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct ctggtaaggt tgggaagccc tgcaaagtaa 7440
actggatggc tttcttgccg ccaaggatct gatggcgcag gggatcaaga tctgatcaag 7500
agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg 7560
ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca acagacaatc ggctgctctg 7620
atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc 7680
tgtccggtgc cctgaatgaa ctccaagacg aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga 7740
cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc 7800
tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag 7860
tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct acctgcccat 7920
tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg 7980
tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca 8040
ggctcaaggc gcggatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct 8100
tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt ggccggctgg 8160
gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg tgatattgct gaagagcttg 8220
gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc 8280
gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgagc gggactctgg ggttcgcgga 8340
atcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 8400
aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 8460
aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 8520
ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg 8580
tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc 8640
ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga 8700
cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc 8760
agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc 8820
gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca 8880
ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg 8940
tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 9000
tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 9060
cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag 9120
tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa 9180
gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 9240
atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gtatacactc 9300
cgctatcgct acgtgactgg gtcatggctg cgccccgaca cccgccaaca cccgctgacg 9360
cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg 9420
ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgagg cagcagatca 9480
attcgcgcgc gaaggcgaag cggcatgcat ttacgttgac accatcgaat ggtgcaaaac 9540
ctttcgcggt atggcatgat agcgcccgga agagagtcaa ttcagggtgg tgaat 9595
<210> 10
<211> 857
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agctaggatc cggtgcagcc aagcgtgatc gtggggatcg tgattgggga gccgaagcga 60
aacgtggacg gccctggttt tgctgtgggt ttgggtaggg cagaggtgct ctcaaagctg 120
gcggactcat ataaggatgc atcccttgta ttgaaggctg ccgataatct gaaacttaat 180
gaggtgcagc gggcacaaga tttgtcatgg aagttggcta tccatgcaag cccacgggtg 240
acggagattc ttgcgcagaa atatgtgaag ccactaaggg aatctggcga gtttgctcat 300
gagatcgtgg aatctttgcg ggcatatgtg gacaaccaga tgaatattcc tgctgctgcg 360
cgcagtattc ctgtgcatgt gaatacgctt cgctatcggt tgcgccggtt tgaggagtta 420
acgggctgct atttggagga tacatccacg gtcattgaag tgtcgtgggt gctggaagtc 480
tttggccggg agctgtagaa aattgcacct atatatatgg tgcaaaacga aagtgatcat 540
ctttgttgtc ctatatctca attaggaatc tcatttgagg ggcaactggc tacactttga 600
aggcatgagt atttcgcgcg atttcgatgc ctggatggaa gatcggggca ttgttgctga 660
agctgaggtt ataccggatc atgcgtgcca agtgttccta cctgtggagg gtgtgagaat 720
ttccctcaag caaatggaag gtgaacaagg ccacaacaat tccgacgagc tagaggctgc 780
gcgaaacttg ttaacagacc tcctgggtta gaaaattatt ttaaatttca cattgacacg 840
gacgtgacat tgtgata 857
<210> 11
<211> 860
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cacggacgtg acattgtgat acaatggtag agtgcaaagg aggacaaccg tgaccgaatt 60
gagcaggaac ttcggggcca gccgactgat taaccgcttt ggccaggagc cttttgcctt 120
cgctttcgcc ggccaaggat atgactggtt gaagaccctt cgtgccgcgg ttgccgcagg 180
tgcaggcacc aatgttagtg acatcgtcga gcgcgcaaat gcgctgcttg cactagttgc 240
agatgatctc attggcaccc ttccatttgg tttcgatcca gtggcttggg ctaacaactc 300
cgaagatcca gctttcgata ctgcacaatc tgcagtgagc gtgccgggta tctttgtctc 360
ccagatcgca accctggatt cccttgaggc gcagcgcctt gatgtggatc aggctgtgtc 420
cagcattggt cattcccagg gcgtattggg cgtgcacctg ctcaatgatg cgactcgtgc 480
tgatgaactc gttgccattg cgcagttgat cggtgcagcg atcacccgca ccgcacgcat 540
gacgggcctg atcgcgcagg gcgacaacat gccgatgctg tcgatcgccg gaatttcccg 600
cgaacagctt cagcaagcta tcgacgcggc ctgcgccgaa gtccctgcgg agatccgccc 660
ggttatcggt ctgcgcaact cacgcgattc ttatgttttg gttggccgcc cagacgacaa 720
cgctcgcgtt gttaaggtca ttgaggcaat ggctgccaag gataagaagg ccattgaaga 780
taagctgcgc ggcggttccg cgttcagccc ccgtattact ccgctgaagg tgcaggctgc 840
tttccatcat ctagatagct 860
<210> 12
<211> 1696
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agctaggatc cggtgcagcc aagcgtgatc gtggggatcg tgattgggga gccgaagcga 60
aacgtggacg gccctggttt tgctgtgggt ttgggtaggg cagaggtgct ctcaaagctg 120
gcggactcat ataaggatgc atcccttgta ttgaaggctg ccgataatct gaaacttaat 180
gaggtgcagc gggcacaaga tttgtcatgg aagttggcta tccatgcaag cccacgggtg 240
acggagattc ttgcgcagaa atatgtgaag ccactaaggg aatctggcga gtttgctcat 300
gagatcgtgg aatctttgcg ggcatatgtg gacaaccaga tgaatattcc tgctgctgcg 360
cgcagtattc ctgtgcatgt gaatacgctt cgctatcggt tgcgccggtt tgaggagtta 420
acgggctgct atttggagga tacatccacg gtcattgaag tgtcgtgggt gctggaagtc 480
tttggccggg agctgtagaa aattgcacct atatatatgg tgcaaaacga aagtgatcat 540
ctttgttgtc ctatatctca attaggaatc tcatttgagg ggcaactggc tacactttga 600
aggcatgagt atttcgcgcg atttcgatgc ctggatggaa gatcggggca ttgttgctga 660
agctgaggtt ataccggatc atgcgtgcca agtgttccta cctgtggagg gtgtgagaat 720
ttccctcaag caaatggaag gtgaacaagg ccacaacaat tccgacgagc tagaggctgc 780
gcgaaacttg ttaacagacc tcctgggtta gaaaattatt ttaaatttca cattgacacg 840
gacgtgacat tgtgatacaa tggtagagtg caaaggagga caaccgtgac cgaattgagc 900
aggaacttcg gggccagccg actgattaac cgctttggcc aggagccttt tgccttcgct 960
ttcgccggcc aaggatatga ctggttgaag acccttcgtg ccgcggttgc cgcaggtgca 1020
ggcaccaatg ttagtgacat cgtcgagcgc gcaaatgcgc tgcttgcact agttgcagat 1080
gatctcattg gcacccttcc atttggtttc gatccagtgg cttgggctaa caactccgaa 1140
gatccagctt tcgatactgc acaatctgca gtgagcgtgc cgggtatctt tgtctcccag 1200
atcgcaaccc tggattccct tgaggcgcag cgccttgatg tggatcaggc tgtgtccagc 1260
attggtcatt cccagggcgt attgggcgtg cacctgctca atgatgcgac tcgtgctgat 1320
gaactcgttg ccattgcgca gttgatcggt gcagcgatca cccgcaccgc acgcatgacg 1380
ggcctgatcg cgcagggcga caacatgccg atgctgtcga tcgccggaat ttcccgcgaa 1440
cagcttcagc aagctatcga cgcggcctgc gccgaagtcc ctgcggagat ccgcccggtt 1500
atcggtctgc gcaactcacg cgattcttat gttttggttg gccgcccaga cgacaacgct 1560
cgcgttgtta aggtcattga ggcaatggct gccaaggata agaaggccat tgaagataag 1620
ctgcgcggcg gttccgcgtt cagcccccgt attactccgc tgaaggtgca ggctgctttc 1680
catcatctag atagct 1696
<210> 13
<211> 623
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agctaggatc ctgaaccgtg gtggcctgcg tggcgcttcc tttgaaatgg atgatcgcta 60
caccggctac aacgtgtcct ccatggttga tcgtggcgtg gatttcgcga aaaccctagt 120
gcgcatcaac ttgagcgacg ccggaaccgc cccgaccttg gaagccaccg cgcatgcagt 180
caatgaggct gcagcagcac agctgcccat catgctcgag ccgttcatga gtaactgggt 240
aaacggcaag gtggtcaatg atctttccac cgatgcagtt atccaatctg tcgccattgc 300
tgctggtctg ggcaatgatt cttcctatac ctggatgaag cttccagtgg tggaggagat 360
ggagcgcgtc atggaatcca ccaccatgcc aaccctgttg ttgggcggcg aaggcggcaa 420
cgatccagat gccaccttcg catcctggga gcatgcactc accctgccgg gtgtgcgtgg 480
cctgaccgtg ggacgcactc tgctgtatcc gcaagacggc gatgtcgccg ccgctgttga 540
taccgcagcg cgacttgttc acacagatat tcaacaattc acttcgcaga gcatttaagg 600
aatttacaca cttgaaggag agc 623
<210> 14
<211> 624
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggaatttaca cacttgaagg agagcacagg actatgcgtt ggttccataa gaagggcgaa 60
ctggcccgag atggttggca aagcgttgtc gatgccacca ccccaggttg ggaatatacc 120
ggcatccgca ttgccgaact gggcagtggt gaatcgcttg aactgaatga cactggtgtg 180
gaacgcatct tcattccact tcagggcagc ttcgatgttg cccaccatgg tcaggtgacc 240
catcttcacg gaagaaagtc agtctttgat ggaccaaccg atgtgctcta cctccccact 300
ggacaaacag caacgctcag tggtcaggga cgagtcgccg tggcggaagc tcccactcag 360
gaacccaagg agtggaagta catcgctcca gcagaaactc ctgtggagtt gcgtggagct 420
ggccgctcga gccgacaagt ccacaacttt ggcaccccgg aagctctcga tgctgctcga 480
ctaatcgtgt gtgaagtaat caccccaggt gaaaactgga gctcttaccc tccacacaag 540
catgatgagc acatcccagg acacgagtcc aagctggagg aaatctacta cttcgaaagc 600
gccccatcgc gagtctagat agct 624
<210> 15
<211> 1222
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agctaggatc ctgaaccgtg gtggcctgcg tggcgcttcc tttgaaatgg atgatcgcta 60
caccggctac aacgtgtcct ccatggttga tcgtggcgtg gatttcgcga aaaccctagt 120
gcgcatcaac ttgagcgacg ccggaaccgc cccgaccttg gaagccaccg cgcatgcagt 180
caatgaggct gcagcagcac agctgcccat catgctcgag ccgttcatga gtaactgggt 240
aaacggcaag gtggtcaatg atctttccac cgatgcagtt atccaatctg tcgccattgc 300
tgctggtctg ggcaatgatt cttcctatac ctggatgaag cttccagtgg tggaggagat 360
ggagcgcgtc atggaatcca ccaccatgcc aaccctgttg ttgggcggcg aaggcggcaa 420
cgatccagat gccaccttcg catcctggga gcatgcactc accctgccgg gtgtgcgtgg 480
cctgaccgtg ggacgcactc tgctgtatcc gcaagacggc gatgtcgccg ccgctgttga 540
taccgcagcg cgacttgttc acacagatat tcaacaattc acttcgcaga gcatttaagg 600
aatttacaca cttgaaggag agcacaggac tatgcgttgg ttccataaga agggcgaact 660
ggcccgagat ggttggcaaa gcgttgtcga tgccaccacc ccaggttggg aatataccgg 720
catccgcatt gccgaactgg gcagtggtga atcgcttgaa ctgaatgaca ctggtgtgga 780
acgcatcttc attccacttc agggcagctt cgatgttgcc caccatggtc aggtgaccca 840
tcttcacgga agaaagtcag tctttgatgg accaaccgat gtgctctacc tccccactgg 900
acaaacagca acgctcagtg gtcagggacg agtcgccgtg gcggaagctc ccactcagga 960
acccaaggag tggaagtaca tcgctccagc agaaactcct gtggagttgc gtggagctgg 1020
ccgctcgagc cgacaagtcc acaactttgg caccccggaa gctctcgatg ctgctcgact 1080
aatcgtgtgt gaagtaatca ccccaggtga aaactggagc tcttaccctc cacacaagca 1140
tgatgagcac atcccaggac acgagtccaa gctggaggaa atctactact tcgaaagcgc 1200
cccatcgcga gtctagatag ct 1222
<210> 16
<211> 823
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
actgaggatc catcaaaggc actgtgggca ccaagcccaa gcatcgcgaa aatcttcgtt 60
ccctcggtct gaagcgaatc cgccacaccg tgatccgccc cgatacccca gaggtacgtg 120
gcatgatcct ggcagttcgc cacctgatcg tcgtcgaaga agtggcgggg gagtaggtaa 180
caatgagcga accaattaag ctccacgatt tgcgcccagc agcgggctca aacaaagcta 240
agacccgcgt tggtcgaggc gaagcatcca agggtaagac tgcaggtcgc ggtaccaagg 300
gtaccaaggc acgcaagcag gtttctgcag cattcgaagg tggccagatg ccactgcaga 360
tgcgtcttcc taagctgaag ggcttcaaga accctaacaa ggttgactac caggtagtta 420
acattgcaga tctcgcagag aagttcccac agggcggcga cgtcagcatt gctgacatcg 480
ttgcagcagg acttgtccgc aagaacgaac tggttaaggt tcttggcaac ggcgacatca 540
gcgtcaagct gaacgtcacc gctaacaagt tctccggctc tgccaaggaa aagatcgaag 600
ccgctggcgg ctccgcaacc gtggcataag ttcaccagaa ctttaaaaat gacctccaag 660
ggaaaccttg ggggtcattt ttaggttttt tgggaggacc tggggttctc ggagggggat 720
tgcgcagggg gcctactgat tgggtttgat ttgagtgcat ggaaaatgcc actctgtggg 780
gtaacaagag tggcattgca aagagactta ccctggcctt ttg 823
<210> 17
<211> 824
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
caaagagact taccctggcc ttttgaaggg gctctattgg cgaatatctt gttcttggct 60
tgtagagatt ccggtgaggt ttgattttgg cgaaaagggt taactagtag cttgacggcg 120
cctgggccac attcggctaa taagtaggga agattcggcg atgactgctc ctgaagccac 180
aaggaggacg gcgacatcga gaattccctc gggaacggtg atccagagat agatgcaaat 240
tcccacaatg atcaggccaa caagtcctac ggtcagaaga acccattggg gagatttttg 300
agtgagtgct gcggtaatga tggccgaagc gaaggaaagt gcaaggataa agccaattac 360
cactatgtct ggaatagaac caatcttgaa ccacaaacaa agcgcgacaa gaactactgc 420
gtaaaaagca agaatcgatt taccgggtac cgggggatgt tgcactgcgc ggactcctgt 480
tgggcatcaa atgttctaaa tgggaatagc ttttaataag caaaccatac tgagcatgga 540
tgatcattag tttgatgcga tacaaatggg cttccctaaa actaaacacc cgccacaatg 600
aaacgcggcg ggtgtttagc tgagaacttt cagtaactaa atggttcggt gaatactctt 660
gtatgtcagg taagcactga ggccttcgat gccgtattcc actcccatac cggattcgtg 720
gcgtcctcca aatggggcgg aatggttgga accgaagaag ttgatgccta cggaaccaga 780
atccacttga cgggcgactt ctagtgcttg ttctctagat agct 824
<210> 18
<211> 1622
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
actgaggatc catcaaaggc actgtgggca ccaagcccaa gcatcgcgaa aatcttcgtt 60
ccctcggtct gaagcgaatc cgccacaccg tgatccgccc cgatacccca gaggtacgtg 120
gcatgatcct ggcagttcgc cacctgatcg tcgtcgaaga agtggcgggg gagtaggtaa 180
caatgagcga accaattaag ctccacgatt tgcgcccagc agcgggctca aacaaagcta 240
agacccgcgt tggtcgaggc gaagcatcca agggtaagac tgcaggtcgc ggtaccaagg 300
gtaccaaggc acgcaagcag gtttctgcag cattcgaagg tggccagatg ccactgcaga 360
tgcgtcttcc taagctgaag ggcttcaaga accctaacaa ggttgactac caggtagtta 420
acattgcaga tctcgcagag aagttcccac agggcggcga cgtcagcatt gctgacatcg 480
ttgcagcagg acttgtccgc aagaacgaac tggttaaggt tcttggcaac ggcgacatca 540
gcgtcaagct gaacgtcacc gctaacaagt tctccggctc tgccaaggaa aagatcgaag 600
ccgctggcgg ctccgcaacc gtggcataag ttcaccagaa ctttaaaaat gacctccaag 660
ggaaaccttg ggggtcattt ttaggttttt tgggaggacc tggggttctc ggagggggat 720
tgcgcagggg gcctactgat tgggtttgat ttgagtgcat ggaaaatgcc actctgtggg 780
gtaacaagag tggcattgca aagagactta ccctggcctt ttgaaggggc tctattggcg 840
aatatcttgt tcttggcttg tagagattcc ggtgaggttt gattttggcg aaaagggtta 900
actagtagct tgacggcgcc tgggccacat tcggctaata agtagggaag attcggcgat 960
gactgctcct gaagccacaa ggaggacggc gacatcgaga attccctcgg gaacggtgat 1020
ccagagatag atgcaaattc ccacaatgat caggccaaca agtcctacgg tcagaagaac 1080
ccattgggga gatttttgag tgagtgctgc ggtaatgatg gccgaagcga aggaaagtgc 1140
aaggataaag ccaattacca ctatgtctgg aatagaacca atcttgaacc acaaacaaag 1200
cgcgacaaga actactgcgt aaaaagcaag aatcgattta ccgggtaccg ggggatgttg 1260
cactgcgcgg actcctgttg ggcatcaaat gttctaaatg ggaatagctt ttaataagca 1320
aaccatactg agcatggatg atcattagtt tgatgcgata caaatgggct tccctaaaac 1380
taaacacccg ccacaatgaa acgcggcggg tgtttagctg agaactttca gtaactaaat 1440
ggttcggtga atactcttgt atgtcaggta agcactgagg ccttcgatgc cgtattccac 1500
tcccataccg gattcgtggc gtcctccaaa tggggcggaa tggttggaac cgaagaagtt 1560
gatgcctacg gaaccagaat ccacttgacg ggcgacttct agtgcttgtt ctctagatag 1620
ct 1622
<210> 19
<211> 9511
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gctaacctag gatgtctgca accaccggcg ctcgttccgc ttccgtcggt tgggctgaat 60
ctctgatcgg tttacattta ggcaaagtgg cactgatcac tggtggctcc gctggtattg 120
gcggccagat cggtcgtctg ctcgcactct ccggcgcacg tgtgatgctc gctgcacgcg 180
accgccataa gctggagcag atgcaagcta tgattcagtc cgaactcgct gaagtgggct 240
acactgacgt cgaagatcgt gtgcacattg ctcccggttg cgacgtctcc tccgaggcac 300
aactggcaga tctcgtcgag cgcaccctct ccgctttcgg cactgtcgac tatttaatca 360
acaacgctgg tatcgctggt gtcgaggaga tggtgatcga tatgcccgtt gagggttggc 420
gtcacaccct cttcgcaaat ttaatctcca actactctct catgcgcaag ctggcacctc 480
tgatgaagaa gcaaggctcc ggttacattt taaatgtgtc ctcctacttc ggcggcgaga 540
aggacgctgc tatcccatac ccaaaccgcg ctgactacgc agtctccaag gctggtcagc 600
gcgcaatggc agaagtgttt gcacgctttc tgggtcccga aatccagatc aacgcaatcg 660
ctcccggtcc agtcgagggt gatcgcctcc gtggcaccgg cgaacgtccc ggtctgttcg 720
ctcgccgtgc acgcctcatt ttagagaaca agcgtttaaa tgagctgcac gcagctctca 780
tcgctgctgc tcgcactgac gagcgttcca tgcacgagct ggtggaactc ttattaccaa 840
atgatgtggc agcactcgaa cagaacccag cagcaccaac cgctctgcgt gaattagcac 900
gccgctttcg ttccgaaggt gatccagcag cttcctcttc ctccgctctg ctcaaccgct 960
ctatcgcagc taagttatta gctcgcctcc acaacggcgg ctacgtttta ccagcagaca 1020
tcttcgctaa tttaccaaac ccacccgatc ctttcttcac ccgtgcacag atcgaccgcg 1080
aggctcgcaa ggtccgtgac ggcatcatgg gtatgctgta tttacagcgt atgcctaccg 1140
agtttgacgt ggctatggca accgtgtact atttagctga ccgcgtcgtc tccggcgaga 1200
ccttccaccc atccggcggt ctccgttacg agcgcacccc taccggtggt gaattattcg 1260
gcctcccttc ccccgaacgt ttagcagaac tggtgggttc cactgtctat ttaatcggcg 1320
aacacctcac cgaacacctc aatttactgg cacgtgcata tttagagcgt tatggcgcac 1380
gccaagttgt gatgatcgtc gagaccgaga ccggcgctga aaccatgcgc cgtttactcc 1440
atgatcacgt cgaagctggt cgtctgatga ccatcgtggc tggtgaccag atcgaggcag 1500
caatcgatca agctatcacc cgttatggcc gtcccggtcc cgttgtctgc accccattcc 1560
gcccactgcc taccgtgcca ctggtgggcc gcaaggactc cgactggtcc accgtgctgt 1620
ccgaggcaga gtttgctgaa ctgtgcgaac accagctgac ccaccatttt cgcgtcgcac 1680
gctggatcgc actgtctgac ggcgctcgtt tagctctcgt gacccccgaa accactgcaa 1740
cctctaccac cgagcagttt gctctggcaa acttcatcaa aactacttta cacgcattca 1800
ctgcaaccat cggcgtggaa tccgaacgca ccgcacagcg cattctgatt aaccaagttg 1860
atttaacccg ccgcgctcgc gcagaagaac cacgcgatcc tcacgaacgt cagcaagaac 1920
tggaacgctt catcgaagca gtgctgctgg tgaccgcacc actcccaccc gaagctgata 1980
cccgctacgc tggtcgcatc caccgtggtc gtgctatcac cgtgtaaggt acccggggat 2040
cctctagagt cgacctgcag gcatgcaagc ttggctgttt tggcggatga gagaagattt 2100
tcagcctgat acagattaaa tcagaacgca gaagcggtct gataaaacag aatttgcctg 2160
gcggcagtag cgcggtggtc ccacctgacc ccatgccgaa ctcagaagtg aaacgccgta 2220
gcgccgatgg tagtgtgggg tctccccatg cgagagtagg gaactgccag gcatcaaata 2280
aaacgaaagg ctcagtcgaa agactgggcc tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac 2340
gctctcctga gtaggacaaa tccgccggga gcggatttga acgttgcgaa gcaacggccc 2400
ggagggtggc gggcaggacg cccgccataa actgccaggc atcaaattaa gcagaaggcc 2460
atcctgacgg atggcctttt tgcgtttcta caaactcttt ttgtttattt ttctaaatac 2520
attcaaatat gtatccgctc atgaattaat tccgctagat gacgtgcggc ttcgacctcc 2580
tgggcgtggc gcttgttggc gcgctcgcgg ctggctgcgg cacgacacgc gtctgagcag 2640
tattttgcgc gccgtcctcg tgggtcaggc cggggtggga tcaggccacc gcagtaggcg 2700
cagctgatgc gatcctccac tactgcgcgt cctcctggcg ctgccgagca cgcagctcgt 2760
cggccagctc ttcaaggtcg gccacaagcg tttctaggtc gctcgcggca cttgcccagt 2820
cgcgtgatgc tggcgcgtct gtcgtatcga gggcgcggaa aaatccgatc accgttttta 2880
aatcgacggc ggcatcgagt gcgtcggact ccagcgcgac atcggagaga tccaccgctg 2940
atgcttcagg ccagttttgg tacttcgtcg tgaaggtcat gacaccatta taacgaacgt 3000
tcgttaaaaa ttctagcccc aattctgata atttcttccg gcactcctgc gaaaacctgc 3060
gagacttctt gcccagaaaa aacgccaagc gcagcggtta ccgcactttt tttccaggtg 3120
atttcaccct gaccagcgaa gcggcacttt agtgcatgag gtgtgcccct ggtttcccct 3180
ctttggaggg ttcaacccaa aaaagcacac aagcaaaaat gaaaatcatc atgagcaagt 3240
tggtgcgaag cagcaacgcg ctagctccaa aaaggtctcc aggatctcga ggagattttt 3300
gagggggagg gagtcgagga agagccagag cagaaggcgg gggaaccgtt ctctgccgac 3360
agcgtgagcc ccccttaaaa atcaggccgg ggaggaaccg gggagggatc agagctagga 3420
gcgagacacc ctaaaggggg ggaaccgttt tctgctgacg gtgtttcgtt tattagtttt 3480
cagcccgtgg atagcggagg gtgagggcaa gtgagagcca gagcaaggac gggaccccta 3540
aaggggggaa ccgttttctg ctgacggtgt ttcgtttatt agttttcagc ccgtggacgg 3600
ccgcgtttag cttccattcc aagtgccttt ctgacttgtt ggatgcgcct ttcactgaca 3660
cctagttcgc ctgcaagctc acgagtcgag ggatcagcaa ccgattgaga acgggcatcc 3720
aggatcgcag ttttgacgcg aagttcgagc aactcgcctg tcatttctcg gcgtttgttt 3780
gcttccgcta atcgctgtcg cgtctcctgc gcatacttac tttctgggtc agcccatctg 3840
cgtgcattcg atgtagctgc gccccgtcgc cccatcgtcg ctagagcttt ccgccctcgg 3900
ctgctctgcg tttccacccg acgagcaggg acgactggct ggcctttagc cacgtagccg 3960
cgcacacgac gcgccatcgt caggcgatca cgcatggcgg gaagatccgg ctcccggccg 4020
tctgcaccga ccgcctgggc aacgttgtac gccacttcat acgcgtcgat gatcttggca 4080
tcttttaggc gctcaccagc agctttgagc tggtatccca cggtcaacgc gtggcgaaac 4140
gcggtctcgt cgcgcgctgc gcgctctgga tttgtccaga gcactcgcac gccgtcgatc 4200
aggtcgccgg acgcgtccag ggcgctcggc aggctcgcgt ccaaaatcgc tagcgccttg 4260
gcttctgcgg tggcgcgttg tgccgcttca atgcgggcgc gtccgctgga aaagtcctgc 4320
tcaatgtact ttttcggctt ctgtgatccg gtcatcgttc gagcaatctc cattaggtcg 4380
gccagccgat ccacacgatc atgctggcag tgccatttat aggctgtcgg atcgtctgag 4440
acgtgcagcg gccaccggct cagcctatgc gaaaaagcct ggtcagcgcc gaaaacacga 4500
gtcatttctt ccgtcgttgc agccagcagg cgcatatttg ggctggtttt acctgctgcg 4560
gcatacaccg ggtcaatgag ccagatgagc tggcatttcc cgctcagcgg attcacgccg 4620
atccaagccg gcgctttttc taggcgtgcc catttctcta aaatcgcgta gacctgcggg 4680
tttacgtgct caatcttccc gccggcctgg tggctgggca catcgatgtc aagcacgatc 4740
accgcggcat gttgcgcgtg cgtcagcgca acgtactggc accgcgtcag cgcttttgag 4800
ccagcccggt agagctttgg ttgggtttcg ccggtatccg ggtttttaat ccaggcgctc 4860
gcgaaatctc ttgtcttgct gccctggaag ctttcgcgtc ccaggtgagc gagcagttcg 4920
cggcgatctt ctgccgtcca gccgcgtgag ccgcagcgca tagcttcggg gtgggtgtcg 4980
aacagatcgg cggacaattt ccacgcgcta gctgtgactg tgtcctgcgg atcggctaga 5040
gtcatgtctt gagtgctttc tcccagctga tgactggggg ttagccgacg ccctgtgagt 5100
tcccgctcac ggggcgttca actttttcag gtatttgtgc agcttatcgt gttttcttcg 5160
taaatgaacg cttaactacc ttgttaaacg tggcaaatag gcaggattga tggggatcta 5220
gcttcacgct gccgcaagca ctcagggcgc aagggctgct aaaggaagcg gaacacgtag 5280
aaagccagtc cgcagaaacg gtgctgaccc cggatgaatg tcagctactg ggctatctgg 5340
acaagggaaa acgcaagcgc aaagagaaag caggtagctt gcagtgggct tacatggcga 5400
tagctagact gggcggtttt atggacagca agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccc 5460
tctggtaagg ttgggaagcc ctgcaaagta aactggatgg ctttcttgcc gccaaggatc 5520
tgatggcgca ggggatcaag atctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt 5580
gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat 5640
gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag 5700
gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actccaagac 5760
gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac 5820
gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc 5880
ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg 5940
ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag 6000
cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat 6060
caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgcggatgcc cgacggcgag 6120
gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc 6180
ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg 6240
ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg 6300
ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag 6360
ttcttctgag cgggactctg gggttcgcgg aatcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt 6420
ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt 6480
ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg 6540
tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca 6600
gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt 6660
agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga 6720
taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc 6780
gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact 6840
gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga 6900
caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg 6960
aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt 7020
tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt 7080
acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga 7140
ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac 7200
gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcctgatgc ggtattttct 7260
ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catatggtgc actctcagta caatctgctc 7320
tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg ggtcatggct 7380
gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca 7440
tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg 7500
tcatcaccga aacgcgcgag gcagcagatc aattcgcgcg cgaaggcgaa gcggcatgca 7560
tttacgttga caccatcgaa tggtgcaaaa cctttcgcgg tatggcatga tagcgcccgg 7620
aagagagtca attcagggtg gtgaatctta aggaattcta gctgccaatt attccgggct 7680
tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata tcaacaaaaa 7740
ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccattt gacggatttt 7800
caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga ttttttaccc atgtccggca 7860
ctggccgttt agctggcaag atcgctctga tcaccggcgg cgctggtaac attggctctg 7920
aactgacccg tcgtttttta gcagagggcg caaccgtgat catctccggt cgcaatcgtg 7980
caaagctcac cgcactggca gagcgcatgc aagctgaggc tggcgtccca gctaagcgca 8040
tcgatttaga ggtcatggac ggctccgacc ccgttgcagt gcgcgctggt attgaagcaa 8100
tcgtcgctcg ccacggccag atcgacatcc tcgtcaacaa tgctggttcc gctggtgcac 8160
agcgtcgcct cgctgaaatt cctctgaccg aggctgagct gggccccggt gctgaagaaa 8220
ctttacatgc ttctatcgct aatttactcg gcatgggctg gcatttaatg cgcatcgcag 8280
caccacacat gccagtgggt tccgcagtca tcaatgtgtc caccatcttc tcccgcgctg 8340
aatactacgg ccgcatccca tacgtgaccc caaaggcagc actgaacgca ctctcccagc 8400
tggctgcacg cgaactgggt gctcgtggca tccgcgtgaa caccatcttt cccggtccaa 8460
tcgaatccga tcgcatccgc accgtgttcc agcgtatgga ccagctgaag ggccgcccag 8520
agggtgacac cgctcaccat tttttaaaca ctatgcgtct ctgccgtgca aacgatcaag 8580
gtgctctcga acgtcgcttt ccatccgtgg gcgatgtggc agatgctgca gtgtttttag 8640
catctgcaga gtctgcagct ctgtccggcg aaaccattga ggtcacccac ggcatggagc 8700
tgccagcttg ctccgagacc tctttactgg ctcgtaccga tttacgtact atcgatgcat 8760
ccggccgcac cactttaatt tgcgctggcg accagattga agaggtgatg gctctcaccg 8820
gtatgctgcg cacttgcggc tccgaggtga ttatcggctt ccgctccgca gctgctctgg 8880
cacagttcga gcaagctgtg aacgagtccc gccgtctcgc tggtgcagat ttcaccccac 8940
caatcgctct cccattagat cctcgcgacc cagcaaccat cgatgctgtg tttgattggg 9000
ctggtgaaaa cactggcggt atccacgctg ctgtgatcct ccccgctacc tcccacgagc 9060
cagctccatg cgtcatcgaa gtcgacgacg aacgcgtgct gaacttctta gcagatgaaa 9120
tcaccggcac tatcgtcatc gcatcccgcc tcgcacgtta ctggcagtcc caacgtctca 9180
cccccggtgc tcgtgcacgc ggtccacgtg tgatcttcct ctccaacggc gctgaccaaa 9240
acggcaacgt ctacggtcgc attcagtccg ctgcaatcgg tcaactgatc cgcgtgtggc 9300
gccatgaggc agaactcgat taccagcgtg catccgcagc tggtgaccac gtgctgccac 9360
ccgtttgggc taatcaaatc gtgcgcttcg ctaaccgttc tctggagggc ctcgaatttg 9420
cttgcgcttg gactgctcag ttattacact cccagcgcca catcaacgag atcactttaa 9480
acatccccgc taatatttaa gagctctagc t 9511
<210> 20
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
agctaggatc cggtgcagcc aagcgtgatc gt 32
<210> 21
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tatcacaatg tcacgtccgt gtcaatgtga aatttaaaat aattttctaa cccaggaggt 60
ctgttaacaa g 71
<210> 22
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cacggacgtg acattgtgat acaatggtag agtgcaaagg aggacaaccg tgaccgaatt 60
gagcaggaac t 71
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
agctatctag atgatggaaa gcagcctgca ccttc 35
<210> 24
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agctaggatc ctgaaccgtg gtggcctgcg tggcgc 36
<210> 25
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gctctccttc aagtgtgtaa attccttaaa tgctctgcg 39
<210> 26
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ggaatttaca cacttgaagg agagcacagg actatgcg 38
<210> 27
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agctatctag actcgcgatg gggcgctttc gaagta 36
<210> 28
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
actgaggatc catcaaaggc actgtgggc 29
<210> 29
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
caaaaggcca gggtaagtct ctttgcaatg ccactct 37
<210> 30
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
caaagagact taccctggcc ttttgaaggg gctctattg 39
<210> 31
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
agctatctag agaacaagca ctagaagtcg cccgt 35
<210> 32
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
agctagagct caaaggagga caaccatgag cgatattcgt 40
<210> 33
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
agctacctag gcattagttg tcctcctttc gatcaaagac gtcattt 47
<210> 34
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gctaacctag gatgtctgca accaccggcg ctc 33
<210> 35
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
agctagagct cttaaatatt agcggggatg t 31

Claims (3)

1.产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株构建方法，其特征是包括如下步骤：
(1)在谷氨酸棒状杆菌重组菌株Cgz14中用弱启动子PP7替换编码脂肪酸合酶fasA基因的启动子；敲除消耗丙二酰半醛生成乙酰辅酶A途径的msmA基因和cg0635基因；
(2)在pEC-sod-N-C*质粒的mcr-N基因和mcr-C*基因之间插入来自谷氨酸棒杆菌ATCC13032clpP基因的前62bp，得到pEC-sod-N-HP-C*质粒；
(3)将所述pEC-sod-N-HP-C*质粒导入到步骤(1)获得的谷氨酸棒杆菌中，得到产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株；
所述弱启动子PP7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述fasA基因的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述msmA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述cg0635基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述质粒pEC-sod-N-C*的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述mcr-N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述mcr-C*基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述clpP基因的前62bp的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述质粒pEC-sod-N-HP-C*的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
2.权利要求1的方法构建的产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株。
3.权利要求2的菌株在生产3-羟基丙酸中的应用。
CN202210673552.3A 2022-06-13 2022-06-13 高产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建方法与应用 Active CN115074378B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210673552.3A CN115074378B (zh) 2022-06-13 2022-06-13 高产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210673552.3A CN115074378B (zh) 2022-06-13 2022-06-13 高产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115074378A CN115074378A (zh) 2022-09-20
CN115074378B true CN115074378B (zh) 2023-10-20

Family

ID=83250392

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210673552.3A Active CN115074378B (zh) 2022-06-13 2022-06-13 高产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115074378B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105950529A (zh) * 2016-06-24 2016-09-21 清华大学 产3-羟基丙酸的重组谷氨酸棒杆菌、其构建方法及应用
KR20160146588A (ko) * 2015-06-11 2016-12-21 부산대학교 산학협력단 3-하이드록시프로피온산에 의해 발현이 유도되는 프로모터 시스템 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산의 생물학적 생산방법
CN107881186A (zh) * 2017-10-18 2018-04-06 华东理工大学 利用乙酸生产羟基丙酸的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法与应用
CN113166772A (zh) * 2018-05-24 2021-07-23 韩国科学技术院 具有1,3-pdo生产力和降低的3-hp生产力的重组棒状杆菌以及使用其生产1,3-pdo的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160146588A (ko) * 2015-06-11 2016-12-21 부산대학교 산학협력단 3-하이드록시프로피온산에 의해 발현이 유도되는 프로모터 시스템 및 이를 이용한 3-하이드록시프로피온산의 생물학적 생산방법
CN105950529A (zh) * 2016-06-24 2016-09-21 清华大学 产3-羟基丙酸的重组谷氨酸棒杆菌、其构建方法及应用
CN107881186A (zh) * 2017-10-18 2018-04-06 华东理工大学 利用乙酸生产羟基丙酸的代谢工程大肠杆菌菌株的构建方法与应用
CN113166772A (zh) * 2018-05-24 2021-07-23 韩国科学技术院 具有1,3-pdo生产力和降低的3-hp生产力的重组棒状杆菌以及使用其生产1,3-pdo的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Enhanced 3-Hydroxypropionic Acid Production From Acetate via the Malonyl-CoA Pathway in Corynebacterium glutamicum;Zhishuai Chang等;Front Bioeng Biotechnol.;全文 *
生物法生产3-羟基丙酸研究进展;于新磊等;化工进展;第37卷(第11期);全文 *
谷氨酸棒状杆菌利用乙酸生产3-羟基丙酸的代谢工程研究;常志帅;中国优秀硕士学位论文数据库;全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115074378A (zh) 2022-09-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101835898A (zh) 用于生物活性肽表达和纯化的可溶性标记
KR20070004580A (ko) Ｐｓｏｄ 발현 유니트
CN108949721A (zh) 表达磷脂酶d的重组菌株及应用
CN111566217A (zh) 宿主细胞中风味化合物的产生
KR101914464B1 (ko) 코리네형 세균 형질 전환체 및 그것을 사용하는 페놀의 제조 방법
CN115074378B (zh) 高产3-羟基丙酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建方法与应用
KR20130139258A (ko) 코리네형 세균 형질 전환체 및 그것을 사용하는 페놀의 제조 방법
CN1323087C (zh) 编码与遗传稳定性、基因表达和折叠相关的蛋白质的基因
CN114316031B (zh) 一种生产血红素结合蛋白的方法
CN111471693A (zh) 一种产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用
CN114717237B (zh) 一种ep6启动子与其相关生物材料及应用
CN107043778B (zh) 真菌基因定点插入突变的近原位回补方法
CN113201538B (zh) 具有启动子活性的多核苷酸及其在生产目标化合物中的用途
CN109609425B (zh) 一种利用枯草芽孢杆菌整合位点的酶的活性恢复筛选整合重组子的方法
CN111926009B (zh) 阻断或减弱水稻OsMIR394基因表达以改良水稻籽粒性状的方法
CN112175894B (zh) 一种产l-氨基酸的重组菌株及其构建方法与应用
CN111233986B (zh) 一种表达链球菌溶血素成熟蛋白的工程菌及其应用
CN112625138A (zh) 新冠状病毒检测用多位点重组抗原及其制备方法
CN114181288A (zh) 制备l-缬氨酸的方法及其所用的基因与该基因编码的蛋白质
CN106834329B (zh) 一种运载质粒及其构建及其使用方法
CN113372440A (zh) 一种识别EB病毒gH糖蛋白的单克隆抗体及其应用
CN110484551A (zh) 金属硫蛋白表达载体及其应用
CN1274388A (zh) 突变芽胞杆菌rna酶基因及其转化植物
KR102302827B1 (ko) 크리스퍼 간섭을 이용한 유전자 발현 억제용 조성물
CN110564742A (zh) 一种yebN基因改造的重组菌株及其构建方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant