CN106834329B - 一种运载质粒及其构建及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种关于鱼腥藻7120三亲转化系统中运载质粒的构建及其使用方法，通过序列与连接不依赖的克隆(SLIC)方法一步将核酸元件重组形成质粒pPT27。连接目的核酸序列后生成运载质粒，同帮助和结合质粒一起将外源DNA序列转移至宿主细胞内，通过标记基因筛选到目的突变株。本发明还公开了pPT27质粒的使用方法，转入绿色荧光蛋白(GFP)和一种融合蛋白(FdnifK)。本发明构建所得的运载载体(pPT27)可以用于目的DNA片段的功能分析和蛋白表达，应用所构建的质粒可以快速、高效、省时的构建运载质粒并且可以避免DNA序列的限制，在基因功能研究方面有着重要的意义。

Description

一种运载质粒及其构建及其使用方法

技术领域

本本发明公开了一种关于鱼腥藻7120三亲转化系统中运载质粒的构建及其使用方法，属于基因工程中的克隆技术领域。

背景技术

在鱼腥藻7120中，重要的基因无法获得其突变株，所以基因的过表达株的生理表型可以反映未知基因的功能。得到过表达株可以使用Wolk的三亲转化方法(Wolk et al.,Construction of shuttle vectors capable of conjugative transfer fromEscherichia coli to nitrogen-fixing filamentous cyanobacteria，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1984；Javier et al.Role of a Microcin-C-likebiosynthetic gene cluster in allelopathic interactions in marineSynechococcus，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2013；Jeff et al.Reduction of conjugaltransfer efficiency by three restriction activities of Anabaena sp.strain PCC7120，J.Bacteriol.，1997)。三亲转化方法是在结合质粒的作用下由帮助质粒将运载质粒线性化后转入宿主中，这一方法具有易操作、转化成功率高等优点。对于外源基因转移至其基因组上，关键是在运载质粒的体外重组构建，是一个必不可少的操作步骤，是限速步骤之一。在传统的构建运载质粒实际操作过程中，需要使用另外的质粒例如pUC19先构建好重组序列后，再将序列转至运载质粒上(例如Wolk方法中使用的pRL271质粒)。而且，常用的Geteway和Cre-loxP重组策略是需要特殊的重组位点。因此，一种更直接、更有效率的转化系统及运载质粒是更理想和迫切需要的。

发明内容

构建本发明的通用的运载质粒(本文称为pPT27)有助于简单快速构建重组质粒，为进一步对未知基因的功能进行研究提供便捷有力的遗传工具(即过量表达内源或者异源DNA序列)。相比较于现有技术已知的运载质粒例如Wolk方法中使用的pRL271质粒，本发明构建的pPT27质粒可以直接将目的片段通过PCR扩增纯化后连接，继而通过SLIC的方法获得目的运载质粒，省去了中间所需的大量实验和时间，而且这一方法不需要特异重组位点，不会导入基因组额外的序列和不存在序列上的限制。

本发明的目的在于提供通用的过表达质粒pPT27及其使用方法。

为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的：

本发明提供一种鱼腥藻7120三亲转化系统的运载质粒，其核苷酸序列如SEQ IDNo:2所示。

本发明还提供一种如权利要求1所述的运载质粒的构建方法，包括下述步骤：

A.使用限制性内切酶XhoI酶切含有蔗糖致死基因的载体质粒pRL271(SEQ ID No:1)，使其线性化并回收片段；

B.从鱼腥藻7120基因组DNA扩增同源重组双交换上游片段(SEQ ID No:3)、下游片段(SEQ ID No:4)和诱导型启动子P(SEQ ID No:5)，从质粒kan-pUC19中扩增筛选抗性基因kan(SEQ ID No:6)；

C.将步骤B获得的同源重组双交换片段上游片段、下游片段、诱导型启动子P和筛选抗性基因kan及线性pRL271连接获得pPT27质粒(SEQ ID No:2)。

在一个实施方案中，所述构建方法还包括步骤D.将步骤C获得的pPT27质粒转化到大肠杆菌中，从阳性克隆中提取pPT27质粒DNA。

在一个实施方案中，在步骤B中，所述诱导型启动子是铜离子诱导型的并且在铜离子存在环境下转录其后的开放性读码框。

在一个实施方案中，所述步骤B中用于扩增同源重组双交换上游片段的引物序列为

上游引物：CAGAAATTCGATATCTAGATCTCGAGTCTTCCTGTAAACGGTATGG(SEQ ID No:9)；和

下游引物：TGAGTGCTTGCGGCAGCGTGAGGTACTCTAATACTGTAAGATATAG(SEQ ID No:10)；

用于扩增同源重组双交换下游片段的引物序列为：

上游引物：CAGGTTAGGAGAACGCCGTCGACTCTAGACTTGAAATCATTAAAATATTGG(SEQ IDNo:11)；和

下游引物：GGCGGACGGGAAGTATCCAGCTCGAGGTATGAGACTTATGACAAACCC(SEQ ID No:12)。

在一个实施方案中，所述步骤B中用于扩增诱导型启动子P的引物序列为：

上游引物：CATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCGGGGATCCCAGTACTCAGAATTTTTTGCT(SEQ IDNo:13)；和

下游引物：GTCGACGGCGTTCTCCTAACCTG(SEQ ID No:14)。

在一个实施方案中，所述步骤B中用于扩增筛选抗性基因kan的引物序列为：

上游引物：CCTCACGCTGCCGCAAGCACTCA(SEQ ID No:15)；和

下游引物：CCGGTGGGCGAAGAACTCCAGCATG(SEQ ID No:16)。

本发明还提供权利要求1所述的运载质粒的使用方法，包括以下步骤：

A.使用PCR扩增将pPT27质粒线性化。

B.将目的片段连接至线性化的pPT27质粒中而获得目的质粒。

C.将步骤B获得的质粒转化至大肠杆菌中，筛选正确的克隆子。

在一个实施方案中，所述步骤A中用于将pPT27质粒线性化的引物序列为：

上游引物：TCTAGACTTGAAATCATTAAAATATTGG(SEQ ID No:17)；和

下游引物：GTCGACGGCGTTCTCCTAACCTGTAG(SEQ ID No:18)。

在一个实施方案中，所述步骤B中所述目的片段为GFP基因片段(SEQ ID No:7)或融合基因片段FdnifK(SEQ ID No:8)。

通过上述方法，本发明得以得到一种关于鱼腥藻7120三亲转化系统中通用运载质粒的构建和其使用方法，该载体可以作为SLIC克隆的初始载体，并且通用载体质粒具有简单、快速、省时、省力等遗传操作的显著优点，可用于一个或多个基因功能研究和蛋白表达分析。

本发明提出的一种关于鱼腥藻7120三亲转化系统中通用运载质粒的构建对现有的技术相比所具有的有益效应为：1)本发明所构建的质粒pPT27与SLIC克隆技术结合后，构建反应只需一步克隆，可快速高通量构建所需要的运载质粒，并且没有DNA序列限制；2)使用本发明所构建的质粒构建运载质粒，可以极大节约试验时间和操作环节，降低实验成本，使科研效率的到提高；3)对于多基因的转录要求，质粒pPT27和SLIC克隆方法也是能够实现一步克隆获得运载质粒。

附图说明

图1为SLIC克隆方法构建运载质粒的流程示意图。

图2为本发明的运载质粒pPT27、GFP-pPT27、FdnifK-pPT27示意图，箭头方向代表着基因的转录方向。

图3a、3b、3c分别为pRL271、kan-pUC19、GFP-pUC19质粒的示意图，箭头方向代表基因的转录方向。

图4为FdnifK株的产氢积累量。

具体实施方式

pPT27质粒的技术优势是，扩增目的片段后直接利用SLIC克隆方法连接并转化大肠杆菌中，而获得目的质粒。之后将外源DNA序列转移至鱼腥藻7120中并筛选克隆子。由于穿梭质粒含有蔗糖致死基因和抗卡那霉素基因，可快速的获得完全整合的藻株。因为未整合的质粒和平台出现单交换的情况下，细胞会携带致死基因而死亡，只有携带重组成功的目的片段的克隆子才能够生长，所以大大的降低了高背景的缺点，减少重组株的筛选时间。同时，结合抗生素的筛选压力，会大大提高转化产物重组率。

为了验证通用过平台的适用性，本发明将报告基因GFP序列和线性化的pPT27质粒连接，转化至大肠杆菌中获得运载质粒。可以发现，质粒pPT27与SLIC克隆方法结合后，可以将目的DNA序列导入至质粒pPT27继而导入多基因至鱼腥藻7120中，表达相应代谢通路或工程改造特异性的代谢通路而获得有价值的代谢产物。另外，本发明过量表达了一融合蛋白(FdnifK)，这一蛋白可以和宿主的蛋白形成复合体，提高了H₂的产生。这一结果说明，过量表达平台构建的策略是成功的，此载体构建的策略亦适用在其他宿主表达载体的构建，用于基因的过量表达。本发明构建了通用表达质粒pPT27，并与SLIC克隆技术相结合，用于克隆的目的基因或者外源的目的DNA片段的功能分析和蛋白表达。

实施例一

在下述实施例中，所用的酶购自NEB，鱼腥藻7120购自中科院水生所，GFP和kan序列信息来自NCBI数据库，引物由金唯智公司合成，三亲转化质粒(pRL271/pRL623/pIncP)源自Wolk教授赠送。

参考图2a-2b为本发明通过该过程获得通用质粒和运载质粒，示例性过程如下：

将300ng的载体质粒pRL271的DNA与0.5μl限制性内切酶Xho I混合，进行酶切，37℃水浴1h，回收后获得线性化载体片段L-pRL271。以鱼腥藻7120基因组DNA为模板，以pt-up-1(SEQ ID No:9)和pt-up-2(SEQ ID No:10)为引物扩增同源重组双交换上游片段(SEQID No:3)；以pt-down-1(SEQ ID No:11)和pt-down-2(SEQ ID No:12)为引物扩增同源重组双交换下游片段(SEQ ID No:4)；以P-1(SEQ ID No:13)和P-2(SEQ ID No:14)为引物扩增诱导型启动子P(SEQ ID No:5)。以本实验室合成的质粒kan-pUC19为模板，以kan-1(SEQ IDNo:15)和kan-2(SEQ ID No:16)为引物扩增Kan(SEQ ID No:6)。

使用SLIC克隆方法连接上述片段。将100ng的L-pRL271和插入片段(UP、DOWN、P、Kan)按照摩尔比1：2，利用0.5U的T4DNA聚合酶于室温下处理2.5分钟，随后冰浴并转化至大肠杆菌中，涂布在含有卡那霉素平板上筛选正确的克隆子，获得质粒pPT27(图2a)，并且进行测序验证。

使用引物PTF(SEQ ID No:17)和PTR(SEQ ID No:18)PCR扩增质粒pPT27，获得线性化载体(L-pPT27)并且回收此片段。

以本实验室合成的质粒GFP-pUC19为模板，使用上游引物:GGTTAGGAGAACGCCGTCGACATGGTGAGCAAGGGCGCCGAG(SEQ ID No:19)和下游引物:ATTTTAATGATTTCAAGTCTAGATCACTTGTACAGCTCATCCATG(SEQ ID No:20)扩增GFP序列(SEQ ID No:7)，回收该GFP片段。

使用SLIC克隆方法连接L-pPT27和所述GFP片段。将100ng的L-pPT27和插入片段(GFP)按照摩尔比1：2，利用0.5U的T4DNA聚合酶于室温处理2.5分钟。随后冰浴并转化至大肠杆菌中，使用含有卡那霉素的平板筛选正确的克隆子，获得穿梭质粒GFP-pPT27(图2b)，并且进行测序验证。

按照Wolk,1984等文献记载的方法，将穿梭质粒GFP-pPT27、帮助质粒pRL623、结合质粒pIncP和鱼腥藻7120在含有5μg/ml卡那霉素的平板上混合培养2周左右。转印上述所获的克隆子至含有5％蔗糖的平板上再次筛选，获得单克隆子鉴定是否是整合株(GFP过表达株)。

实施例二

以鱼腥草7120基因组总DNA为模板，分别使用片段一上下游引物和片段二上下游引物进行PCR反应。反应程序：98℃预变性5分钟；98℃变形10s，60℃退火15s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。引物序列如下：

片段一上游引物：

CAGGTTAGGAGAACGCCGTCGACATGGCTAGCTACCAAGTTAG(SEQ ID No:21)

片段一下游引物：

CTGGATTCTGAGGCATGGTACCAGCAAGGTACGGTTC(SEQ ID No:22)

片段二上游引物：

CTGGTACCATGCCTCAGAATCCAGAAAG(SEQ ID No:23)

片段二下游引物：

CCAATATTTTAATGATTTCAAGTCTAGACTAGCGGATCAAGTCAAAG(SEQ ID No:24)

将得到的两个片段利用融合PCR的方法连接为一个片段(将上述片段一和片段二在95度变性30秒，再迅速降低至55度15秒，72度延伸1分45秒，并做30个循环回收)，即FdnifK序列(SEQ ID No:8)，连接至T载体上测序验证。

使用SLIC克隆方法连接L-pPT27和所述FdnifK片段。将100ng的L-pPT27和FdnifK片段按照摩尔比1：2，利用0.5U的T4DNA聚合酶于室温处理2.5分钟。随后冰浴并转化至大肠杆菌中，用含有卡那霉素的平板筛选正确的克隆子，获得穿梭质粒FdnifK-pPT27(图2c)，并且进行测序验证。将穿梭质粒FdnifK-pPT27、帮助质粒pRL623、结合质粒pIncP和鱼腥藻7120混合培养2周左右在含有5μg/ml卡那霉素的平板上。转印上述所获的克隆子至含有5％蔗糖的平板上再次筛选，获得单克隆子并鉴定是否是整合株(FdnifK过表达株)。

实施例三

培养野生型和FdnifK株，待生长至OD₇₃₀≈0.8，分装藻液至40ml至60ml的玻璃管中，充氩气将玻璃管中的空气排净并用橡胶塞密封住，置于光下培养。氢气的测定通过气相色谱测定。氢气的积累量如图4所示，FdnifK株可以显著提高H₂的产量。

SEQUENCE LISTING

<110> 清华大学

<120> 一种运载质粒及其构建及其使用方法

<130> 20161213-1

<160> 24

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 6347

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gctggctgtt ttacgcgtat gacaggctcc ggaagacggt tgttgcgcac gtattcggtg 60

aacgcactat ggcgacgctg gggcgtctta tgagcctgct gtcacccttt gacgtggtga 120

tatggatgac ggatggctgg ccgctgtatg aatcccgcct gaagggaaag ctgcacgtaa 180

tcagcaagcg atatacgcag cgaattgagc ggcataacct gaatctgagg cagcacctgg 240

cacggctggg acggaagtcg ctgtcgttct caaaatcggt ggagctgcat gacaaagtca 300

tcgggcatta tctgaacata aaacactatc aataagttgg agtcattacc aaaaggttag 360

gaatacggtt agccatttgc ctgcttttat atagttcata tgggattcac ctttatgttg 420

ataagaaata aaagaaaatg ccaataggat atcggcattt tcttttgcgt ttttatttgt 480

taactgttaa ttgtccttgt tcaaggatgc tgtctttgac aacagatgtt ttcttgcctt 540

tgatgttcag caggaagctt ggcgcaaacg ttgattgttt gtctgcgtag aatcctctgt 600

ttgtcatata gcttgtaatc acgacattgt ttcctttcgc ttgaggtaca gcgaagtgtg 660

agtaagtaaa ggttacatcg ttaggatcaa gatccatttt taacacaagg ccagttttgt 720

tcagcggctt gtatgggcca gttaaagaat tagaaacata accaagcatg taaatatcgt 780

tagacgtaat gccgtcaatc gtcatttttg atccgcggga gtcagtgaac aggtaccatt 840

tgccgttcat tttaaagacg ttcgcgcgtt caatttcatc tgttactgtg ttagatgcaa 900

tcagcggttt catcactttt ttcagtgtgt aatcatcgtt tagctcaatc ataccgagag 960

cgccgtttgc taactcagcc gtgcgttttt tatcgctttg cagaagtttt tgactttctt 1020

gacggaagaa tgatgtgctt ttgccatagt atgctttgtt aaataaagat tcttcgcctt 1080

ggtagccatc ttcagttcca gtgtttgctt caaatactaa gtatttgtgg cctttatctt 1140

ctacgtagtg aggatctctc agcgtatggt tgtcgcctga gctgtagttg ccttcatcga 1200

tgaactgctg tacattttga tacgtttttc cgtcaccgtc aaagattgat ttataatcct 1260

ctacaccgtt gatgttcaaa gagctgtctg atgctgatac gttaacttgt gcagttgtca 1320

gtgtttgttt gccgtaatgt ttaccggaga aatcagtgta gaataaacgg atttttccgt 1380

cagatgtaaa tgtggctgaa cctgaccatt cttgtgtttg gtcttttagg atagaatcat 1440

ttgcatcgaa tttgtcgctg tctttaaaga cgcggccagc gtttttccag ctgtcaatag 1500

aagtttcgcc gactttttga tagaacatgt aaatcgatgt gtcatccgca tttttaggat 1560

ctccggctaa tgcaaagacg atgtggtagc cgtgatagtt tgcgacagtg ccgtcagcgt 1620

tttgtaatgg ccagctgtcc caaacctcca ggccttttgc agaagagata tttttaattg 1680

tggacgaatc gaattcagga acttgatatt tttcattttt ttgctgttca gggatttgca 1740

gcatatcatg gcgtgtaata tgggaaatgc cgtatgtttc cttatatggc ttttggttcg 1800

tttctttcgc aaacgcttga gttgcgcctc ctgccagcag tgcggtagta aaggttaata 1860

ctgttgcttg ttttgcaaac tttttgatgt tcatcgttca tgtctccttt tttatgtact 1920

gtgttagcgg tctgcttctt ccagccctcc tgtttgaaga tggcaagtta gttacgcaca 1980

ataaaaaaag acctaaaata tgtaaggggt gacgccaaag tatacacttt gccctttaca 2040

cattttaggt cttgcctgct ttatcagtaa caaacccgcg cgatttactt ttcgacctca 2100

ttctattaga ctctcgtttg gattgcaact ggtctatttt cctcttttgt ttgatagaaa 2160

atcataaaag gatttgcaga ctacgggcct aaagaactaa aaaatctatc tgtttctttt 2220

cattctctgt attttttata gtttctgttg catgggcata aagttgcctt tttaatcaca 2280

attcagaaaa tatcataata tctcatttca ctaaataata gtgaacggca ggtatatgtg 2340

atgggttaaa aaggatcgat cctctagcta gagtcgacct gcatccctta acttacttat 2400

taaataattt atagctattg aaaagagata agaattgttc aaagctaata ttgtttaaat 2460

cgtcaattcc tgcatgtttt aaggaattgt taaattgatt ttttgtaaat attttcttgt 2520

attctttgtt aacccatttc ataacgaaat aattatactt ttgtttatct ttgtgtgata 2580

ttcttgattt ttttctactt aatctgataa gtgagctatt cactttaggt ttaggatgaa 2640

aatattctct tggaaccata cttaatatag aaatatcaac ttctgccatt aaaagtaatg 2700

ccaatgagcg ttttgtattt aataatcttt tagcaaaccc gtattccacg attaaataaa 2760

tctcattagc tatactatca aaaacaattt tgcgtattat atccgtactt atgttataag 2820

gtatattacc atatatttta taggattggt ttttaggaaa tttaaactgc aatatatcct 2880

tgtttaaaac ttggaaatta tcgtgatcaa caagtttatt ttctgtagtt ttgcataatt 2940

tatggtctat ttcaatggca gttacgaaat tacacctctt tactaattca agggtaaaat 3000

ggccttttcc tgagccgatt tcaaagatat tatcatgttc atttaatctt atatttgtca 3060

ttattttatc tatattatgt tttgaagtaa taaagttttg actgtgtttt atatttttct 3120

cgttcattat aaccctcttt aatttggtta tatgaatttt gcttattaac gattcattat 3180

aaccacttat tttttgtttg gttgataatg aactgtgctg attacaaaaa tactaaaaat 3240

gcccatattt tttcctcctt ataaaattag tataattata gcacgcgaat tcatcgaata 3300

aatacctgtg acggaagatc acttcgcaga ataaataaat cctggtgtcc ctgttgatac 3360

cgggaagccc tgggccaact tttggcgaaa atgagacgtt gatcggcacg taagaggttc 3420

caactttcac cataatgaaa taagatcact accgggcgta ttttttgagt tatcgagatt 3480

ttcaggagct aaggaagcta aaatggagaa aaaaatcact ggatatacca ccgttgatat 3540

atcccaatgg catcgtaaag aacattttga ggcatttcag tcagttgctc aatgtaccta 3600

taaccagacc gttcagctgg atattacggc ctttttaaag accgtaaaga aaaataagca 3660

caagttttat ccggccttta ttcacattct tgcccgcctg atgaatgctc atccggaatt 3720

ccgtatggca atgaaagacg gtgagctggt gatatgggat agtgttcacc cttgttacac 3780

cgttttccat gagcaaactg aaacgttttc atcgctctgg agtgaatacc acgacgattt 3840

ccggcagttt ctacacatat attcgcaaga tgtggcgtgt tacggtgaaa acctggccta 3900

tttccctaaa gggtttattg agaatatgtt tttcgtctca gccaatccct gggtgagttt 3960

caccagtttt gatttaaacg tggccaatat ggacaacttc ttcgcccccg ttttcaccat 4020

gggcaaatat tatacgcaag gcgacaaggt gctgatgccg ctggcgattc aggttcatca 4080

tgccgtttgt gatggcttcc atgtcggcag aatgcttaat gaattacaac agtactgcga 4140

tgagtggcag ggcggggcgt aattttttta aggcagttat tggtgccctt aaacgcctgg 4200

tgctacgcct gaataagtga taataagcgg atgaatggca gaaattcgat atctagatct 4260

cgagctggat acttcccgtc cgccaggggg acatgccggc gatgctgaag gtcgcgcgca 4320

ttcccgatga agaggccggt taccgcctgt ttgaggatat agtaatcttt ctaaatagct 4380

ttggattgga ggagtatggc cactaatact aagttcagct aataaaaaaa tttgctaaag 4440

aactccagct ggatttcact gatgagaata tcgtcggaga taaatataat aattccacgg 4500

actatagact atactagtat actccgtcta ctgtacgata cacttccgct caggtccttg 4560

tcctttaacg aggattgtta cgtacgctaa tggcgtcaaa acaaagactc tagacctagg 4620

ccttaagatc gaaagagctg gtagttggcg cactgttcga agaactgccg atgtccagta 4680

agattcttac tatgctggtt gaaccggatg ctggtaaagc tacttgggtt gctgcttcta 4740

cttatggtac cgatacaact actggtgagg aagttaaagg agctcgcgaa agcttgcatg 4800

cctgcagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct 4860

tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc 4920

tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct 4980

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tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat 5160

ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg 5220

accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc 5280

aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa 5340

ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag 5400

gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta 5460

ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta 5520

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gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agcattgaga aagcgccacg 5700

cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag 5760

cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc 5820

cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa 5880

aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg 5940

ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct 6000

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gagcgcctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg 6120

tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 6180

cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 6240

gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 6300

gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcag 6347

<210> 2

<211> 9733

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctggctgtt ttacgcgtat gacaggctcc ggaagacggt tgttgcgcac gtattcggtg 60

aacgcactat ggcgacgctg gggcgtctta tgagcctgct gtcacccttt gacgtggtga 120

tatggatgac ggatggctgg ccgctgtatg aatcccgcct gaagggaaag ctgcacgtaa 180

tcagcaagcg atatacgcag cgaattgagc ggcataacct gaatctgagg cagcacctgg 240

cacggctggg acggaagtcg ctgtcgttct caaaatcggt ggagctgcat gacaaagtca 300

tcgggcatta tctgaacata aaacactatc aataagttgg agtcattacc aaaaggttag 360

gaatacggtt agccatttgc ctgcttttat atagttcata tgggattcac ctttatgttg 420

ataagaaata aaagaaaatg ccaataggat atcggcattt tcttttgcgt ttttatttgt 480

taactgttaa ttgtccttgt tcaaggatgc tgtctttgac aacagatgtt ttcttgcctt 540

tgatgttcag caggaagctt ggcgcaaacg ttgattgttt gtctgcgtag aatcctctgt 600

ttgtcatata gcttgtaatc acgacattgt ttcctttcgc ttgaggtaca gcgaagtgtg 660

agtaagtaaa ggttacatcg ttaggatcaa gatccatttt taacacaagg ccagttttgt 720

tcagcggctt gtatgggcca gttaaagaat tagaaacata accaagcatg taaatatcgt 780

tagacgtaat gccgtcaatc gtcatttttg atccgcggga gtcagtgaac aggtaccatt 840

tgccgttcat tttaaagacg ttcgcgcgtt caatttcatc tgttactgtg ttagatgcaa 900

tcagcggttt catcactttt ttcagtgtgt aatcatcgtt tagctcaatc ataccgagag 960

cgccgtttgc taactcagcc gtgcgttttt tatcgctttg cagaagtttt tgactttctt 1020

gacggaagaa tgatgtgctt ttgccatagt atgctttgtt aaataaagat tcttcgcctt 1080

ggtagccatc ttcagttcca gtgtttgctt caaatactaa gtatttgtgg cctttatctt 1140

ctacgtagtg aggatctctc agcgtatggt tgtcgcctga gctgtagttg ccttcatcga 1200

tgaactgctg tacattttga tacgtttttc cgtcaccgtc aaagattgat ttataatcct 1260

ctacaccgtt gatgttcaaa gagctgtctg atgctgatac gttaacttgt gcagttgtca 1320

gtgtttgttt gccgtaatgt ttaccggaga aatcagtgta gaataaacgg atttttccgt 1380

cagatgtaaa tgtggctgaa cctgaccatt cttgtgtttg gtcttttagg atagaatcat 1440

ttgcatcgaa tttgtcgctg tctttaaaga cgcggccagc gtttttccag ctgtcaatag 1500

aagtttcgcc gactttttga tagaacatgt aaatcgatgt gtcatccgca tttttaggat 1560

ctccggctaa tgcaaagacg atgtggtagc cgtgatagtt tgcgacagtg ccgtcagcgt 1620

tttgtaatgg ccagctgtcc caaacctcca ggccttttgc agaagagata tttttaattg 1680

tggacgaatc gaattcagga acttgatatt tttcattttt ttgctgttca gggatttgca 1740

gcatatcatg gcgtgtaata tgggaaatgc cgtatgtttc cttatatggc ttttggttcg 1800

tttctttcgc aaacgcttga gttgcgcctc ctgccagcag tgcggtagta aaggttaata 1860

ctgttgcttg ttttgcaaac tttttgatgt tcatcgttca tgtctccttt tttatgtact 1920

gtgttagcgg tctgcttctt ccagccctcc tgtttgaaga tggcaagtta gttacgcaca 1980

ataaaaaaag acctaaaata tgtaaggggt gacgccaaag tatacacttt gccctttaca 2040

cattttaggt cttgcctgct ttatcagtaa caaacccgcg cgatttactt ttcgacctca 2100

ttctattaga ctctcgtttg gattgcaact ggtctatttt cctcttttgt ttgatagaaa 2160

atcataaaag gatttgcaga ctacgggcct aaagaactaa aaaatctatc tgtttctttt 2220

cattctctgt attttttata gtttctgttg catgggcata aagttgcctt tttaatcaca 2280

attcagaaaa tatcataata tctcatttca ctaaataata gtgaacggca ggtatatgtg 2340

atgggttaaa aaggatcgat cctctagcta gagtcgacct gcatccctta acttacttat 2400

taaataattt atagctattg aaaagagata agaattgttc aaagctaata ttgtttaaat 2460

cgtcaattcc tgcatgtttt aaggaattgt taaattgatt ttttgtaaat attttcttgt 2520

attctttgtt aacccatttc ataacgaaat aattatactt ttgtttatct ttgtgtgata 2580

ttcttgattt ttttctactt aatctgataa gtgagctatt cactttaggt ttaggatgaa 2640

aatattctct tggaaccata cttaatatag aaatatcaac ttctgccatt aaaagtaatg 2700

ccaatgagcg ttttgtattt aataatcttt tagcaaaccc gtattccacg attaaataaa 2760

tctcattagc tatactatca aaaacaattt tgcgtattat atccgtactt atgttataag 2820

gtatattacc atatatttta taggattggt ttttaggaaa tttaaactgc aatatatcct 2880

tgtttaaaac ttggaaatta tcgtgatcaa caagtttatt ttctgtagtt ttgcataatt 2940

tatggtctat ttcaatggca gttacgaaat tacacctctt tactaattca agggtaaaat 3000

ggccttttcc tgagccgatt tcaaagatat tatcatgttc atttaatctt atatttgtca 3060

ttattttatc tatattatgt tttgaagtaa taaagttttg actgtgtttt atatttttct 3120

cgttcattat aaccctcttt aatttggtta tatgaatttt gcttattaac gattcattat 3180

aaccacttat tttttgtttg gttgataatg aactgtgctg attacaaaaa tactaaaaat 3240

gcccatattt tttcctcctt ataaaattag tataattata gcacgcgaat tcatcgaata 3300

aatacctgtg acggaagatc acttcgcaga ataaataaat cctggtgtcc ctgttgatac 3360

cgggaagccc tgggccaact tttggcgaaa atgagacgtt gatcggcacg taagaggttc 3420

caactttcac cataatgaaa taagatcact accgggcgta ttttttgagt tatcgagatt 3480

ttcaggagct aaggaagcta aaatggagaa aaaaatcact ggatatacca ccgttgatat 3540

atcccaatgg catcgtaaag aacattttga ggcatttcag tcagttgctc aatgtaccta 3600

taaccagacc gttcagctgg atattacggc ctttttaaag accgtaaaga aaaataagca 3660

caagttttat ccggccttta ttcacattct tgcccgcctg atgaatgctc atccggaatt 3720

ccgtatggca atgaaagacg gtgagctggt gatatgggat agtgttcacc cttgttacac 3780

cgttttccat gagcaaactg aaacgttttc atcgctctgg agtgaatacc acgacgattt 3840

ccggcagttt ctacacatat attcgcaaga tgtggcgtgt tacggtgaaa acctggccta 3900

tttccctaaa gggtttattg agaatatgtt tttcgtctca gccaatccct gggtgagttt 3960

caccagtttt gatttaaacg tggccaatat ggacaacttc ttcgcccccg ttttcaccat 4020

gggcaaatat tatacgcaag gcgacaaggt gctgatgccg ctggcgattc aggttcatca 4080

tgccgtttgt gatggcttcc atgtcggcag aatgcttaat gaattacaac agtactgcga 4140

tgagtggcag ggcggggcgt aattttttta aggcagttat tggtgccctt aaacgcctgg 4200

tgctacgcct gaataagtga taataagcgg atgaatggca gaaattcgat atctagatct 4260

cgagtcttcc tgtaaacggt atggatcatt gcttcccatc aaatgcagtg tccaactctg 4320

gcttaattct cgaagaattc agggagattt aacttcgaga actatatcga tcctataaat 4380

ttgaggagaa tcggcaaatg gctagctacc aagttagatt gatcaacaag aaacaagaca 4440

tcgatactac catcgagatt gatgaagaaa ccacaatttt agatggcgca gaagaaaatg 4500

gtattgaatt acctttctct tgccattctg gttcttgttc tagctgtgta ggcaaagttg 4560

ttgaaggtga agttgaccaa tctgatcaaa tcttcttaga tgatgaacag atgggtaaag 4620

gcttcgctct actttgtgtt acttaccctc gttccaactg cacaattaag acccaccaag 4680

aaccgtacct tgcttaattc attgctgtag tcgctactat ttacagcttg tgcaagtgta 4740

gcttaaatca ggatgaagga tatttttcat cctgatttct tatataaatc tattctgaat 4800

ttattaacac caatgtttac tccatttact gtaaatggca gttctttgca attgctaaaa 4860

gttggcgatc gcggaatagt caagttctgc aatattcaag ataaaaatat tctcaaaaaa 4920

ctcaagtctc tgggcttaaa taccggagtc actatcacca tagagcaaga attcccttct 4980

ttaattattc aagtaggaag cattctctta gaaatagata aagaacttgc tcgtaacatc 5040

tacgttcgtg taattaataa ttgattgaat tgagaaaaat cttcattaat aagtactata 5100

tcttacagta ttagagtacc tcacgctgcc gcaagcactc agggcgcaag ggctgctaaa 5160

ggaagcggaa cacgtagaaa gccagtccgc agaaacggtg ctgaccccgg atgaatgtca 5220

gctactgggc tatctggaca agggaaaacg caagcgcaaa gagaaagcag gtagcttgca 5280

gtgggcttac atggcgatak ctagactgkk yggtttwatg gaaccagcca aggcgaaccg 5340

ggaattcgcc cagykggggc cgcccttctg gataagggtt ggggaagccc ctgacaaagt 5400

aaactggatg gctttcytgc cgccaaggat ctgatggcgc aggggatcaa gatctgatca 5460

aggagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaagg tggattgcac gcaggttctc 5520

cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca atcggctgct 5580

ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc cggttctttt tgtcaagacc 5640

gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc 5700

acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg 5760

ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag 5820

aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc 5880

ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt 5940

cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcasgggc tcgcgccagc cgaactgttc 6000

gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc gatgatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc 6060

tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg 6120

ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaarag 6180

cttggcggcg aatgggctga ccgccttcct cstgcttwac ggtatcgccg ccttccsgat 6240

tcgcagcgca wcggcctyct atcggccttc ttggacgagt tcttctgagc gggactctgg 6300

ggttcgaaat gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc acgagatttc gattccaccg 6360

ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg ggacgccggc tggatgatcc 6420

tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct tcgcccaccg gggatcccag tactcagaat 6480

tttttgctga ggtactgagt acacagctaa taaaattggg caatctccgc gcctctatga 6540

cttgaaggag agtgtagggg tataggggaa agatatcttt tatctacatc acataaataa 6600

aaaatttaat ttgtcgctct ggctgcatat attgatgtat ttttagccat aagtttttta 6660

gtgccatgta attatagtga tttttagcga tcgcagagca tttttccctg gatttatcgc 6720

gatctcaaaa aaaatttgcc cgaagtatga cagattgtca tatttggtgt cgattttatt 6780

taaaatgaaa taagaaaaat aaaactacag gttaggagaa cgccgtcgac tctagacttg 6840

aaatcattaa aatattggga aaataaaata aatagagact ttaatatata acgtctctat 6900

ttagggaata aaggtaagcc atttaattag ttttggttta atcaacagca actatcacat 6960

ctgaggattt aattaaagcg tatgcttgct taccctcagc cagttggagt ttatctgctg 7020

atgatttggt gatgatcgaa actatctcta ctccaggagc tagttctaat gttacttcgg 7080

tgttaactgt accaggcaca acttttttaa cagttgtttt cagaaaatta cgtgcgctaa 7140

cttccatatc ttataatctt acctgtttac aggaaacaga ataccaacat ttacggtaaa 7200

taaaatcacc cctttagact tttttaatta tttcgataga tataaattta aaccaaaacc 7260

aaaaaccaga tacccgactt ctttaagaag tcgggtatct atggggattt tggtagctga 7320

catcatacaa gataactgtc aaaatagctg ccgttgtagt attttttaag cggatttaat 7380

caatgtacac ggcgatcgtt ataaacattc ataatctaag cttatcagag tgataatata 7440

taagtaagct aaattgttgc tagtgaacct agacctcagc aaaaagcgat tacagggtta 7500

tctcagacat tcctacctta atactggtca atcttagaaa ttgggtagat ggtcatatat 7560

cttcaagatg atactctcgg aacgctgcgg aaatcttcaa acaaaaacaa ccagatttat 7620

tagggtttgt cataagtctc atacctcgag ctggatactt cccgtccgcc agggggacat 7680

gccggcgatg ctgaaggtcg cgcgcattcc cgatgaagag gccggttacc gcctgtttga 7740

ggatatagta atctttctaa atagctttgg attggaggag tatggccact aatactaagt 7800

tcagctaata aaaaaatttg ctaaagaact ccagctggat ttcactgatg agaatatcgt 7860

cggagataaa tataataatt ccacggacta tagactatac tagtatactc cgtctactgt 7920

acgatacact tccgctcagg tccttgtcct ttaacgagga ttgttacgta cgctaatggc 7980

gtcaaaacaa agactctaga cctaggcctt aagatcgaaa gagctggtag ttggcgcact 8040

gttcgaagaa ctgccgatgt ccagtaagat tcttactatg ctggttgaac cggatgctgg 8100

taaagctact tgggttgctg cttctactta tggtaccgat acaactactg gtgaggaagt 8160

taaaggagct cgcgaaagct tgcatgcctg cagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat 8220

taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg 8280

ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata 8340

aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta 8400

agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa 8460

atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag 8520

tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg 8580

tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact 8640

gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg 8700

taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc 8760

aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata 8820

ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta 8880

catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc 8940

ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg 9000

ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac 9060

agcgtgagca ttgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg 9120

taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt 9180

atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct 9240

cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg 9300

ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata 9360

accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca 9420

gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc 9480

tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat 9540

agttaagcca gtatacactc cgctatcgct acgtgactgg gtcatggctg cgccccgaca 9600

cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag 9660

acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa 9720

acgcgcgagg cag 9733

<210> 3

<211> 903

<212> DNA

<213> 鱼腥草

<400> 3

cagaaattcg atatctagat ctcgagtctt cctgtaaacg gtatggatca ttgcttccca 60

tcaaatgcag tgtccaactc tggcttaatt ctcgaagaat tcagggagat ttaacttcga 120

gaactatatc gatcctataa atttgaggag aatcggcaaa tggctagcta ccaagttaga 180

ttgatcaaca agaaacaaga catcgatact accatcgaga ttgatgaaga aaccacaatt 240

ttagatggcg cagaagaaaa tggtattgaa ttacctttct cttgccattc tggttcttgt 300

tctagctgtg taggcaaagt tgttgaaggt gaagttgacc aatctgatca aatcttctta 360

gatgatgaac agatgggtaa aggcttcgct ctactttgtg ttacttaccc tcgttccaac 420

tgcacaatta agacccacca agaaccgtac cttgcttaat tcattgctgt agtcgctact 480

atttacagct tgtgcaagtg tagcttaaat caggatgaag gatatttttc atcctgattt 540

cttatataaa tctattctga atttattaac accaatgttt actccattta ctgtaaatgg 600

cagttctttg caattgctaa aagttggcga tcgcggaata gtcaagttct gcaatattca 660

agataaaaat attctcaaaa aactcaagtc tctgggctta aataccggag tcactatcac 720

catagagcaa gaattccctt ctttaattat tcaagtagga agcattctct tagaaataga 780

taaagaactt gctcgtaaca tctacgttcg tgtaattaat aattgattga attgagaaaa 840

atcttcatta ataagtacta tatcttacag tattagagta cctcacgctg ccgcaagcac 900

tca 903

<210> 4

<211> 866

<212> DNA

<213> 鱼腥草

<400> 4

caggttagga gaacgccgtc gactctagac ttgaaatcat taaaatattg ggaaaataaa 60

ataaatagag actttaatat ataacgtctc tatttaggga ataaaggtaa gccatttaat 120

tagttttggt ttaatcaaca gcaactatca catctgagga tttaattaaa gcgtatgctt 180

gcttaccctc agccagttgg agtttatctg ctgatgattt ggtgatgatc gaaactatct 240

ctactccagg agctagttct aatgttactt cggtgttaac tgtaccaggc acaacttttt 300

taacagttgt tttcagaaaa ttacgtgcgc taacttccat atcttataat cttacctgtt 360

tacaggaaac agaataccaa catttacggt aaataaaatc acccctttag acttttttaa 420

ttatttcgat agatataaat ttaaaccaaa accaaaaacc agatacccga cttctttaag 480

aagtcgggta tctatgggga ttttggtagc tgacatcata caagataact gtcaaaatag 540

ctgccgttgt agtatttttt aagcggattt aatcaatgta cacggcgatc gttataaaca 600

ttcataatct aagcttatca gagtgataat atataagtaa gctaaattgt tgctagtgaa 660

cctagacctc agcaaaaagc gattacaggg ttatctcaga cattcctacc ttaatactgg 720

tcaatcttag aaattgggta gatggtcata tatcttcaag atgatactct cggaacgctg 780

cggaaatctt caaacaaaaa caaccagatt tattagggtt tgtcataagt ctcatacctc 840

gagctggata cttcccgtcc gcctca 866

<210> 5

<211> 394

<212> DNA

<213> 鱼腥草

<400> 5

catgctggag ttcttcgccc accggggatc ccagtactca gaattttttg ctgaggtact 60

gagtacacag ctaataaaat tgggcaatct ccgcgcctct atgacttgaa ggagagtgta 120

ggggtatagg ggaaagatat cttttatcta catcacataa ataaaaaatt taatttgtcg 180

ctctggctgc atatattgat gtatttttag ccataagttt tttagtgcca tgtaattata 240

gtgattttta gcgatcgcag agcatttttc cctggattta tcgcgatctc aaaaaaaatt 300

tgcccgaagt atgacagatt gtcatatttg gtgtcgattt tatttaaaat gaaataagaa 360

aaataaaact acaggttagg agaacgccgt cgac 394

<210> 6

<211> 1343

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cctcacgctg ccgcaagcac tcagggcgca agggctgcta aaggaagcgg aacacgtaga 60

aagccagtcc gcagaaacgg tgctgacccc ggatgaatgt cagctactgg gctatctgga 120

caagggaaaa cgcaagcgca aagagaaagc aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat 180

akctagactg kkyggtttwa tggaaccagc caaggcgaac cgggaattcg cccagykggg 240

gccgcccttc tggataaggg ttggggaagc ccctgacaaa gtaaactgga tggctttcyt 300

gccgccaagg atctgatggc gcaggggatc aagatctgat caaggagaca ggatgaggat 360

cgtttcgcat gattgaacaa ggtggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga 420

ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc 480

ggctgtcagc gcaggggcgc cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg 540

aatgaactgc aggacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc 600

gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg 660

ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct 720

gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg 780

aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat 840

ctggacgaag agcatcasgg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc 900

atgcccgacg gcgatgatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg 960

gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc 1020

tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat attgctgaar agcttggcgg cgaatgggct 1080

gaccgccttc ctcstgcttw acggtatcgc cgccttccsg attcgcagcg cawcggccty 1140

ctatcggcct tcttggacga gttcttctga gcgggactct ggggttcgaa atgaccgacc 1200

aagcgacgcc caacctgcca tcacgagatt tcgattccac cgccgccttc tatgaaaggt 1260

tgggcttcgg aatcgttttc cgggacgccg gctggatgat cctccagcgc ggggatctca 1320

tgctggagtt cttcgcccac cgg 1343

<210> 7

<211> 764

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggttaggaga acgccgtcga catggtgagc aagggcgccg agctgttcac cggcatcgtg 60

cccatcctga tcgagctgaa tggcgatgtg aatggccaca agttcagcgt gagcggcgag 120

ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag 180

ctgcctgtgc cctggcccac cctggtgacc accctgagct acggcgtgca gtgcttctca 240

cgctaccccg atcacatgaa gcagcacgac ttcttcaaga gcgccatgcc tgagggctac 300

atccaggagc gcaccatctt cttcgaggat gacggcaact acaagtcgcg cgccgaggtg 360

aagttcgagg gcgataccct ggtgaatcgc atcgagctga ccggcaccga tttcaaggag 420

gatggcaaca tcctgggcaa taagatggag tacaactaca acgcccacaa tgtgtacatc 480

atgaccgaca aggccaagaa tggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag 540

gatggcagcg tgcagctggc cgaccactac cagcagaata cccccatcgg cgatggccct 600

gtgctgctgc ccgataacca ctacctgtcc acccagagcg ccctgtccaa ggaccccaac 660

gagaagcgcg atcacatgat ctacttcggc ttcgtgaccg ccgccgccat cacccacggc 720

atggatgagc tgtacaagtg atctagactt gaaatcatta aaat 764

<210> 8

<211> 1896

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctacaggtta ggagaacgcc gtcgacatgg ctagctacca agttagattg atcaacaaga 60

aacaagacat cgatactacc atcgagattg atgaagaaac cacaatttta gatggcgcag 120

aagaaaatgg tattgaatta cctttctctt gccattctgg ttcttgttct agctgtgtag 180

gcaaagttgt tgaaggtgaa gttgaccaat ctgatcaaat cttcttagat gatgaacaga 240

tgggtaaagg cttcgctcta ctttgtgtta cttaccctcg ttccaactgc acaattaaga 300

cccaccaaga accgtacctt gctggtacca tgcctcagaa tccagaaaga actgtagacc 360

acgttgatct attcaaacag ccagaataca ccgagctatt tgaaaacaag agaaagaact 420

ttgaaggcgc tcatcctcct gaagaagttg aaagagtgtc tgaatggaca aaatcttggg 480

actaccggga aaagaacttc gctcgtgaag ctttaaccgt taaccctgct aaaggttgcc 540

aacctgtagg cgcgatgttc gctgctttgg gttttgaagg tactctacct ttcgtacaag 600

gttctcaagg ttgcgttgct tacttccgta cacacctcag ccgtcactac aaagagcctt 660

gctccgcagt atcttcttcc atgacagaag atgcagcagt attcggtggt ttgaacaaca 720

tgatcgaagg tatgcaggtt tcataccaac tgtacaagcc taagatgatt gctgtttgca 780

ccacctgtat ggcggaagtt atcggagatg acttgggcgc gttcatcacc aactccaaga 840

acgctggttc tattcctcaa gatttccccg taccctttgc tcacacacct agctttgttg 900

gttcccacat cactggctac gacaacatga tgaagggtat tctgtctaac ttgacagaag 960

gtaagaagaa agctaccagc aacggcaaaa ttaacttcat tcctggtttt gatacctatg 1020

taggtaacaa ccgcgaattg aagcggatga tgggtgtaat gggtgttgac tacaccatcc 1080

tgtctgacag cagcgactac tttgattcac ctaacatggg tgaatacgaa atgtacccag 1140

gtggtacaaa gctggaagat gcggctgatt ctatcaacgc taaagcaact gttgctctcc 1200

aagcttacac cacacctaag acccgcgaat acatcaaaac ccagtggaag caagaaacac 1260

aagtattgcg ccccttcggt gttaagggta ctgacgagtt cttgactgct gtttctgaat 1320

tgaccggtaa agctattcct gaagaattgg aaatcgaacg cggtcgttta gttgatgcta 1380

tcactgactc ctacgcttgg attcatggta agaagttcgc tatctacggc gatccagatt 1440

tgatcatctc catcaccagc ttcttgttag aaatgggtgc tgaaccagta cacatcctct 1500

gcaacaacgg tgatgacacc ttcaagaaag aaatggaagc tatcctcgct gctagcccat 1560

ttggtaaaga agctaaagtc tggattcaaa aagacttgtg gcacttccgt tccttgttgt 1620

tcaccgagcc tgtagacttc ttcatcggta actcctacgg taagtacctg tggcgcgata 1680

ccagcatccc aatggtgcgg attggttatc ctctcttcga tcgccaccac ttacaccgct 1740

attctaccct cggctaccaa ggtggtctaa atatcctcaa ctgggttgtt aacaccctgt 1800

tggatgaaat ggatcgcagc accaacatca ctggtaagac cgatatctcc tttgacttga 1860

tccgctagtc tagacttgaa atcattaaaa tattgg 1896

<210> 9

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cagaaattcg atatctagat ctcgagtctt cctgtaaacg gtatgg 46

<210> 10

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgagtgcttg cggcagcgtg aggtactcta atactgtaag atatag 46

<210> 11

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

caggttagga gaacgccgtc gactctagac ttgaaatcat taaaatattg g 51

<210> 12

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggcggacggg aagtatccag ctcgaggtat gagacttatg acaaaccc 48

<210> 13

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

catgctggag ttcttcgccc accggggatc ccagtactca gaattttttg ct 52

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gtcgacggcg ttctcctaac ctg 23

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cctcacgctg ccgcaagcac tca 23

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ccggtgggcg aagaactcca gcatg 25

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tctagacttg aaatcattaa aatattgg 28

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gtcgacggcg ttctcctaac ctgtag 26

<210> 19

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ggttaggaga acgccgtcga catggtgagc aagggcgccg ag 42

<210> 20

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

attttaatga tttcaagtct agatcacttg tacagctcat ccatg 45

<210> 21

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

caggttagga gaacgccgtc gacatggcta gctaccaagt tag 43

<210> 22

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ctggattctg aggcatggta ccagcaaggt acggttc 37

<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ctggtaccat gcctcagaat ccagaaag 28

<210> 24

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ccaatatttt aatgatttca agtctagact agcggatcaa gtcaaag 47

Claims (9)

1.一种用于鱼腥藻7120(Anabaena sp.PCC 7120)三亲转化系统的运载质粒pPT27，其核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。

2.如权利要求1所述的运载质粒的构建方法，包括下述步骤：

A.使用限制性内切酶XhoI酶切载体质粒pRL271，使其线性化并回收片段；

B.从鱼腥藻7120基因组DNA扩增同源重组双交换上游片段、下游片段和诱导型启动子P，从质粒kan-pUC19中扩增筛选抗性基因kan；

C.将步骤B获得的同源重组双交换片段上游片段、下游片段、诱导型启动子P和筛选抗性基因kan及线性pRL271连接获得pPT27质粒(SEQ ID No:2)；

步骤A中，所述载体质粒pRL271的序列如SEQ ID No:1所示；并且在步骤B中，所述同源重组双交换上游片段的序列如SEQ ID No:3所示，所述下游片段的序列如SEQ ID No:4所示，所述诱导型启动子P的序列如SEQ ID No:5所示，所述筛选抗性基因kan的序列如SEQ IDNo:6所示。

3.根据权利要求2所述的构建方法，还包括步骤D.将步骤C获得的pPT27质粒转化到大肠杆菌中，从阳性克隆中提取pPT27质粒。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于在步骤B中，所述诱导型启动子是铜离子诱导型的并且在铜离子存在环境下转录其后的开放性读码框。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤B中用于扩增同源重组双交换上游片段的引物序列为

上游引物：CAGAAATTCGATATCTAGATCTCGAGTCTTCCTGTAAACGGTATGG(SEQ ID No:9)；和

下游引物：TGAGTGCTTGCGGCAGCGTGAGGTACTCTAATACTGTAAGATATAG(SEQ ID No:10)；

用于扩增同源重组双交换下游片段的引物序列为：

上游引物：CAGGTTAGGAGAACGCCGTCGACTCTAGACTTGAAATCATTAAAATATTGG(SEQ ID No:11)；和

下游引物：GGCGGACGGGAAGTATCCAGCTCGAGGTATGAGACTTATGACAAACCC(SEQ ID No:12)。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤B中用于扩增诱导型启动子P的引物序列为：

上游引物：CATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCGGGGATCCCAGTACTCAGAATTTTTTGCT(SEQ ID No:13)；和

下游引物：GTCGACGGCGTTCTCCTAACCTG(SEQ ID No:14)。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤B中用于扩增筛选抗性基因kan的引物序列为：

上游引物：CCTCACGCTGCCGCAAGCACTCA(SEQ ID No:15)；和

下游引物：CCGGTGGGCGAAGAACTCCAGCATG(SEQ ID No:16)。

8.如权利要求1所述的运载质粒的使用方法，包括以下步骤：

A.使用PCR扩增将pPT27质粒线性化；

B.将目的片段连接至线性化的pPT27质粒中而获得目的运载质粒；

C.将步骤B获得的质粒转化至大肠杆菌中，筛选正确的克隆子；

步骤A中用于将pPT27质粒线性化的引物序列为：上游引物：

TCTAGACTTGAAATCATTAAAATATTGG(SEQ ID No:17)；和下游引物：

GTCGACGGCGTTCTCCTAACCTGTAG(SEQ ID No:18)。

9.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于所述步骤B中所述目的片段为GFP基因片段或融合基因片段FdnifK；所述GFP基因片段的序列如SEQ ID No:7所示，所述融合基因片段FdnifK如SEQ ID No:8所示。

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