CN114316031B - 一种生产血红素结合蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产血红素结合蛋白的方法，其特征在于所述方法是将含血红素结合蛋白基因表达框的表达载体转入大豆基因组中并表达，获得富含血红素结合蛋白的大豆种子，分离提取，获得血红素结合蛋白。本发明提供了一种利用转基因大豆种子生产血红蛋白/肌红蛋白的方法，这种方法生产的血红蛋白/肌红蛋白可以作为食品的着色添加剂、风味调节剂；本发明披露了可以在大豆种子中高表达的启动子和调控序列，高表达株系大豆种子中血红蛋白/肌红蛋白含量达到种子重量的0.1％以上；本发明的转基因大豆生产的血红蛋白/肌红蛋白，降低了生产成本，比传统微生物发酵方法节省能源，是一种更加环境友好型的生产方式。

Description

一种生产血红素结合蛋白的方法

(一)技术领域

本发明涉及血红素结合蛋白的生产，特别涉及利用表达血红素结合蛋白的转基因大豆生产血红素结合蛋白的方法。

(二)背景技术

血红蛋白/肌红蛋白是常见的血红素结合蛋白，包括动物肌红蛋白以及植物血红蛋白。随着植物肉行业的兴起，作为植物肉中一种重要的着色、风味添加剂，血红蛋白/肌红蛋白的需求越来越大。大量生产血红蛋白/肌红蛋白的方法是现实生产中所急需的。

畜禽血可以作为血红蛋白的来源，但是提取过程繁琐，并且有病原菌污染的风险，不适合大规模工业化生产。

微生物发酵也是制备血红蛋白的重要途径，例如，中国专利申请2016800292580.4，中国专利申请202110607028.1分别公开了利用基因工程改造甲基营养型酵母生产大豆血红蛋白，以及利用毕赤酵母重组菌株表达肌红蛋白或血红蛋白的方法。但是微生物发酵比较繁琐，必须加入血红素或者通过基因改造的方法提高微生物中血红素的含量。

转基因植物已成为一种有吸引力的重组蛋白表达系统。由于蛋白含量高、蛋白酶活性低、水分含量低、方便运输和储存等，种子成为表达重组蛋白的理想器官之一。利用种子作为生物反应器表达重组蛋白时，相比较组成型启动子，种子特异性启动子被认为是一个更好的选择(Lau OS,Sun S.Plant seeds as bioreactors for recombinant proteinproduction.Biotechnology Advances,2009,27(6):1015-1022)。

(三)发明内容

本发明目的是针对目前血红蛋白/肌红蛋白的生产方法中存在的缺陷，提供一种利用转基因大豆生产血红素结合蛋白(血红蛋白/肌红蛋白)的方法，所述方法利用植物栽培的可规模化和可持续性生产血红素结合蛋白，且无需考虑血红素供应问题。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种生产血红素结合蛋白的方法，所述方法是将含血红素结合蛋白基因表达框的表达载体转入大豆基因组中并表达，获得富含血红素结合蛋白的大豆种子，分离提取，获得血红素结合蛋白；所述血红素结合蛋白包括血红蛋白或肌红蛋白。

本发明采用转基因方法将含血红素结合蛋白基因表达框的表达载体转入大豆基因组中，获得含有至少一个拷贝血红素结合蛋白基因的转基因大豆，其种子中高表达红素结合蛋白，质量含量至少为0.1％。所述血红素结合蛋白基因表达框包括启动子、血红素结合蛋白编码基因、终止子。

本发明所述血红素结合蛋白包括但不限于大豆血红蛋白LGH(氨基酸序列SEQ IDNO:1)，牛肌红蛋白BMG(氨基酸序列SEQ ID NO:2)。根据大豆密码子偏好性合成相应的核苷酸序列，其中大豆血红蛋白编码基因LGH核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，牛肌红蛋白编码基因BMG的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明血红素结合蛋白基因表达框的启动子能够启动血红素结合蛋白在大豆种子中高水平表达，包括组成型启动子和种子特异性启动子，例如拟南芥泛素10启动子pAtUbi10(SEQ ID NO:5中478-1741bp)，pGmUbi3启动子(SEQ ID NO:8)，pCaMV35S启动子(SEQ ID NO:5中4491-5289bp)，pGm2S启动子(SEQ ID NO:7中478-1465bp)等。拟南芥泛素10启动子pAtUbi10调控的血红蛋白/肌红蛋白在大豆种子中的表达量较高，显著高于种子特异性启动子pGm2S。

进一步，本发明的终止子包括但不限于NOS终止子TNOS(SEQ ID NO:9)、拟南芥heat shock protein 18.2基因终止子TAtHSP18.2(SEQ ID NO:5中2180-3075bp)。

进一步，本发明的血红素结合蛋白基因表达框还可在5’端或3’端加入增强基因表达的元件，如烟草RB7核基质结合区调控序列MAR(SEQ ID NO:5中3082-4248bp)，增强子，以进一步提高血红蛋白/肌红蛋白在大豆种子中的表达量。所述血红素结合蛋白表达框组成为：启动子-血红素结合蛋白基因-终止子-MAR。

进一步，所述表达载体包含血红素结合蛋白基因表达框和筛选标记基因表达框；筛选标记基因表达框优选由启动子、抗除草剂基因、终止子组成。本发明的筛选标记基因表达框优选耐草甘膦基因表达框(Clemente TE.Progeny analysis of glyphosateselected transgenic soybeans derived from Agrobacterium-mediatedtransformation.Crop Science,2000,40(3):797-803)和耐草铵膦基因表达框(Zhang Z,Xing A,Staswick P,et al.The use of glufosinate as a selective agent inAgrobacterium-mediated transformation of soybean.Plant Cell,Tissue and OrganCulture,1999,56(1):37-46)以及耐啶嘧磺隆基因表达框(专利申请200810164131.8)，其中耐草甘膦基因表达框中草甘膦抗性基因g10evo epsps的核苷酸序列如SEQ ID NO:5中5664-6983bp所示，启动子为花椰菜花叶病毒35s启动子pCaMV35S(SEQ ID NO:5中4491-5289bp)，终止子为花椰菜花叶病毒35s终止子TCaMV35S(SEQ ID NO:10)。

进一步，本发明所述表达载体的基础载体优选是pCambia1300(NCBI序列编号AF234296)。

进一步，优选本发明所述表达载体的T-DNA元件组成为下列之一：(1)由pAtUbi10启动子、血红蛋白编码基因、终止子、增强α-淀粉酶编码基因表达的元件、花椰菜花叶病毒35s启动子pCaMV35S、抗草甘膦基因g10evo epsps、花椰菜花叶病毒35s终止子TCaMV35S组成，核苷酸序列如SEQ ID NO:5中205-7266bp；(2)由pAtUbi10启动子、肌红蛋白编码基因、终止子、增强α-淀粉酶编码基因表达的元件、花椰菜花叶病毒35s启动子pCaMV35S、抗草甘膦基因g10evo epsps、花椰菜花叶病毒35s终止子TCaMV35S组成，核苷酸序列如SEQ ID NO:6中205-7293bp所示。

本发明所述将含血红素结合蛋白基因的表达载体导入到大豆基因组中的方法如农杆菌介导方法(Hinchee MW,Connor-Ward DV,Newell CA,et al.Production oftransgenic soybean plants using Agrobacterium-mediated DNA transfer.NatureBiotechnology,1988,6(8):915-921)，基因枪方法等(Mccabe DE,Swain WF,MartinellBJ,et al.Stable transformation of Soybean(Glycine Max)by particleacceleration.Nature Biotechnology,1988,6(8):923-926)。这些方法都是成熟的方法，本领域的一般技术人员就能够利用这些方法获得转基因大豆。这些不同的方法都可以实现本发明获得表达血红蛋白/肌红蛋白的转基因大豆的目的。比较常用的转化方法是农杆菌介导方法。这种方法的特点是构建一种T-DNA转化体载体，然后通过农杆菌介导将载体中的T-DNA导入到大豆基因组。

本发明还提供了获得具有商业价值的转化体的选择方法：从获得的表达血红蛋白/肌红蛋白的转基因大豆转化体中选择血红蛋白/肌红蛋白表达量至少占种子总重量0.1％的转化体，并进一步筛选在不同代次大豆中表达稳定并且遗传稳定的转化体。

本发明还涉及一种表达载体构建的转基因植物细胞及转基因大豆。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：(1)本发明提供了一种利用转基因大豆种子生产血红蛋白/肌红蛋白的方法，这种方法生产的血红蛋白/肌红蛋白可以作为食品的着色添加剂、风味调节剂；(2)本发明披露了可以在大豆种子中高表达的启动子和调控序列，高表达株系大豆种子中血红蛋白/肌红蛋白含量达到种子重量的0.1％以上；(3)本发明的转基因大豆生产的血红蛋白/肌红蛋白，降低了生产成本，比传统微生物发酵方法节省能源，是一种更加环境友好型的生产方式。

(四)附图说明

图1、用于大豆遗传转化的载体GLLGH示意图。

图2、用于大豆遗传转化的载体SLGH示意图。

图3、高表达大豆血红蛋白的转基因大豆种子；CK为非转基因对照皖豆28，1、2、3、4为4个不同的GLLGH转基因株系。

图4、western blot方法检测转基因大豆株系中的大豆血红蛋白；M为蛋白Marker，+为阳性对照，-为阴性对照皖豆28，2、10、15为GLLGH的3个株系，2、5、7为SLGH的3个株系。

图5、吡啶血色原光吸收测定法测定转基因株系中的大豆血红蛋白含量，横坐标代表不同株系。

图6、高表达肌红蛋白的转基因大豆种子；CK为非转基因对照皖豆28，1、2、3、4为4个不同的GLBMG转基因株系。

图7、吡啶血色原光吸收测定法测定转基因株系中的肌红蛋白含量，横坐标代表GLBMG不同株系。

图8、转大豆血红蛋白基因的水稻种子；CK为非转基因对照秀水134，2、3、4、5、6分别为转基因株系OSLGH-2、OSLGH-3、OSLGH-4、OSLGH-5、OSLGH-6。

图9、western blot方法检测转基因水稻中的大豆血红蛋白；M为蛋白Marker，-为阴性对照秀水134，+为阳性对照，1、2、3、4、5、6分别为转基因株系OSLGH-1、OSLGH-2、OSLGH-3、OSLGH-4、OSLGH-5、OSLGH-6。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、血红蛋白/肌红蛋白基因的合成

通过NCBI基因数据库，直接搜索不同来源的血红蛋白/肌红蛋白基因序列。例如输入Soybean leghemoglobin可以搜寻到若干个大豆血红蛋白基因，随机选取基因LBC2(GeneID:100527379)；根据植物密码子偏好性人工合成大豆(Glycine max)血红蛋白基因LGH，氨基酸为SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示。

输入bovine myoglobin可以搜寻到一个牛肌红蛋白基因MB(Gene ID:280695)。根据植物密码子偏好性人工合成牛(Bostaurus)肌红蛋白基因BMG，氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示，核苷酸序列为SEQ ID NO:4所示。

实施例2、构建大豆遗传转化载体

理论上，本发明实施例1的2种血红蛋白/肌红蛋白的基因，在5’端添加可在大豆种子中启动基因高表达的启动子，在3’端添加终止子，可以得到在大豆种子中表达血红蛋白/肌红蛋白的表达框，进一步的，血红蛋白/肌红蛋白的表达框可以添加其他增强表达的元件。然后构建入含有选择性标记的植物遗传转化载体。在大豆种子中表达不同血红蛋白/肌红蛋白的植物遗传转化载体的主要区别仅在于血红蛋白/肌红蛋白编码基因的不同。

1、双元T-DNA转化载体GLLGH

下面以实施例1合成的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的大豆血红蛋白LGH基因为例，分别选择拟南芥pAtUbi10启动子(SEQ ID NO:5中478-1741bp)，以及种子特异性的大豆2S球蛋白基因启动子pGM2S(SEQ ID NO:7中478-1465bp)作为5’端控制元件；以拟南芥TAtHsp18.2终止子(SEQ ID NO:5中2180-3075bp)串联烟草RB7核基质结合区调控序列MAR(SEQ ID NO:5中3082-4248bp)作为3’端控制元件。按如下步骤构建：

血红蛋白基因表达框：SEQ ID NO:3所示的大豆血红蛋白LGH编码区5’端接启动子pAtUbi10(SEQ ID NO:5中478-1741bp)，3’端接TAtHSP18.2终止子(SEQ ID NO:5中2180-3075bp)和烟草RB7核基质结合区调控序列MAR(SEQ ID NO:5中3082-4248bp)，得大豆血红蛋白基因表达框pAtUbi10-LGH-TAtHsp18.2-MAR(SEQ ID NO:5中478-4248bp)。人工合成含有血红蛋白表达框pAtUbi10-LGH-TAtHsp18.2-MAR的片段ALS(SEQ ID NO:5中457-4248bp)。

抗草甘膦基因表达框：草甘膦抗性基因g10evo epsps(SEQ ID NO:5中5664-6983bp)编码区5’端接花椰菜花叶病毒35s启动子pCaMV35S(SEQ ID NO:5中4491-5289bp)，TEV5’UTR-AtEPSPS SP序列(SEQ ID NO:5中5296-5657bp)，3’端接花椰菜花叶病毒35s终止子TCaMV35S。人工合成含抗草甘膦基因的片段pCaMV35S-TEV5'UTR-AtEPSPS SP-g10evoepsps，记为片段G10evo(核苷酸序列如SEQ ID NO:5中4229-7004bp所示)。

将载体pCAMBIA1300用Hind III/Xho I双酶切，回收6783bp大小的片段FV。以人工合成的片段ALS为模板，使用引物组合(F1，R1)扩增，获得LGH片段。以人工合成的片段G10evo为模板，使用引物组合(F2，R2)扩增得到片段G10evo。将酶切片段FV，与片段LGH和片段G10evo通过无缝克隆的方法重组，转化至大肠杆菌TG1菌株，测序确认，得到双元T-DNA转化载体GLLGH(图1)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，组成原件和位置如表3所示。

表1扩增血红蛋白表达框和片段G10evo所使用的引物及目标条带大小

表2扩增血红蛋白表达框和G10evo表达框所使用的引物序列

*黑体部分为同源臂部分，下同。

表3转化载体GLLGH和SLGH的组成元件和位置

2、双元T-DNA转化载体SLGH

血红蛋白基因表达框：SEQ ID NO:3所示的大豆血红蛋白LGH基因编码区5’端接启动子pGM2S(SEQ ID NO:7中478-1465bp)，TEV 5’UTR-At2S2SP序列(SEQ ID NO:7中1466-1659bp)，3’端接TAtHSP18.2终止子(SEQ ID NO:5中2180-3075bp)和烟草RB7核基质结合区调控序列MAR(SEQ ID NO:5中3082-4248bp)，得血红蛋白基因表达框pGM2S-TEV 5’UTR-At2S2 SP-LGH-TAtHsp18.2-MAR(SEQ ID NO:7中478-4163bp)。人工合成含有血红蛋白基因表达框pGM2S-TEV 5’UTR-At2S2SP-LGH-TAtHsp18.2-MAR的片段GLS(457-4163bp)。

抗草甘膦基因表达框：草甘膦抗性基因g10evo epsps(SEQ ID NO:5中5664-6983bp)编码区5’端接花椰菜花叶病毒35s启动子pCaMV35S，TEV 5’UTR-AtEPSPS SP序列(SEQ ID NO:5中5296-5657bp)，3’端接花椰菜花叶病毒35s终止子TCaMV35S，人工合成抗草甘膦基因的片段pCaMV35S-TEV5'UTR-AtEPSPS SP-g10evo epsps，记为片段G10evo(SEQ IDNO:5中4229-7004bp)。

将载体pCAMBIA1300用Hind III/Xho I双酶切，回收6783bp大小的片段FV。分别以人工合成的片段GLS为模板，使用表2引物组合(F3，R1)扩增，获得SLGH片段。以人工合成的片段G10evo为模板，使用引物组合(F2，R2)扩增得到片段G10evo。将酶切片段FV，与片段SLGH和片段G10evo通过无缝克隆的方法重组，转化至大肠杆菌TG1菌株，测序确认，得到双元T-DNA转化载体SLGH(图2)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，组成原件和位置如表3所示。

3、转化

分别将质粒GLLGH和SLGH电击转入农杆菌EHA105感受态细胞，酶切鉴定正确后以甘油菌保存，获得重组农杆菌，用于大豆转化。

实施例3、转基因大豆的获得

大豆转化流程主要参照Paz的农杆菌介导的half-seed转化法(Paz MM,MartinezJC,Kalvig AB,et al.(2006),Improved cotyledonary node method using analternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation.Plant Cell Reports,25(3):206-213)。具体如下：

①大豆种子灭菌：挑选品质优良的大豆种子(品种：皖豆28)，放入干燥器里，用氯气处理16小时进行灭菌。氯气是通过向干燥器中装有100mL 30％(v/v)次氯酸钠水溶液的烧杯中缓慢加入8mL浓盐酸产生。

②种子萌发：将步骤①灭过菌的大豆种子在无菌蒸馏水中室温浸泡16小时，获得萌发的大豆种子。

③农杆菌菌液的制备：将实施例2制备的重组农杆菌在含50mg/L Kan(卡那霉素)和25mg/L利福平的YEP固体培养基上划线，28℃培养2天。刮取YEP培养板上的菌落，均匀悬浮在侵染培养基中，将其浓度调整为OD₆₅₀＝0.5-0.6，即为农杆菌菌液。YEP固体培养基组成：蛋白胨(Typtone)10g，酵母提取物(Yeast extract)10g，NaCl 5g，加水定容至1L。

④外植体的准备和侵染：将步骤②萌发的大豆种子沿着种脐纵向切割均匀切成两瓣，将带有胚轴和胚芽的那一瓣去掉种皮后迅速放入步骤③制备好的农杆菌菌液中，室温下侵染30min，取出放到衬有滤纸无菌培养皿中，封口后于22℃黑暗条件下共培养3天。

⑤芽诱导培养：步骤④共培养后的外植体转入含有30mg/L草甘膦的芽诱导培养基中，于26℃、16h光照/8h黑暗条件下培养3周。芽诱导培养基组成：B5盐3.21g，B5维生素(vitamins)1mL，蔗糖30g，4-吗啉乙磺酸(MES)3mM，琼脂(Agar)8g，加水定容至1L并将pH调至5.6，灭菌后添加200mg特美汀(Timentin)、1.67mg 6-苄基腺嘌呤(6-BA)。

⑥芽伸长和筛选：将步骤⑤诱导后的外植体切掉子叶，带丛生芽的部分转到加入10mg/L草甘膦的芽伸长培养基中，于26℃、16h光照/8h黑暗条件下培养21天。芽伸长培养基组成：MS盐4.33g，B5维生素1mL，蔗糖30g，MES 3mM，天冬酰胺50mg，谷氨酰胺50mg，Agar 8g，加水定容至1L并将pH调至5.6，灭菌后添加0.5mg赤霉素(GA3)、0.1mg吲哚-3-乙酸(IAA)、lmg玉米素核苷(zeatin riboside)、200mg Timentin。

⑦生根和移苗：将步骤⑥伸长后的丛生芽转移到生根培养基生根。当根长出后，洗去根上附着的培养基，将T₀代幼苗移栽到土壤中培养，直至收获种子。分别获得GLLGH转基因株系和SLGH转基因株系。生根培养基成：MS盐4.33g，B5vitamins 1mL，蔗糖20g，MES 3mM，Agar 8g，加水定容至1L并将pH调至5.6，灭菌后添加200mg Timentin。

实施例4、转基因大豆种子中大豆血红蛋白的测定

1、颜色观察

转基因大豆种子中大豆血红蛋白是否高表达可通过观察的方法进行初筛，表达量较高的转基因株系种子呈现红色(图3)。CK为非转基因对照皖豆28，1、2、3、4为4个不同的GLLGH转基因株系。4个GLLGH转基因株系均呈红色，而非转基因对照没有观察到红色。

2、Western blot检测

Western blot检测转基因大豆种子中的血红蛋白。检测方法如下：每个GLLGH转基因株系各取一粒呈现红色的种子，每个SLGH转基因株系各取一粒阳性种子(经G10EPSPS试纸条检测，购自上海佑隆生物科技有限公司)，另取一粒非转基因种子。将种子充分研磨，各称取30mg，加入300μL PBS缓冲液，振荡混匀3min，于4℃12000rpm离心10min，取上清，适当稀释后取40μL蛋白样品，加入10μL 5×蛋白上样缓冲液混匀，沸水中煮10min，12000rpm离心5min，取上清进行电泳。采用金斯瑞SurePAGE预制胶(4-20％)，上样后以200V电泳30min。电泳结束后，采用金斯瑞eBlot^TM L1快速湿转仪进行转膜。转膜结束后，将膜浸入含5％脱脂奶粉的TBST溶液中，置于水平摇床上，室温下封闭1h。封闭结束后，去掉封闭液，加入含1％脱脂奶粉的TBST溶液，同时按照1：1000(v/v)比例加入一抗Anti-LegHb，置于水平摇床上，室温下孵育1h；倒掉溶液，用TBST溶液洗膜3次，每次5min；加入含1％脱脂奶粉的TBST溶液，并按照1：5000(v/v)的比例加入辣根过氧化物酶交联的羊抗兔二抗，置于水平摇床上，室温下孵育1h；倒掉溶液，用TBST溶液洗膜3次，每次5min；加入ECL化学发光显色液，室温下孵育2min后进行化学曝光，得到曝光图，结果见图4所示，M为蛋白Marker，+为阳性对照，-为阴性对照皖豆28，2、10、15为GLLGH的3个株系，2、5、7为SLGH的3个株系。3个GLLGH转基因株系均可检测到约为15kDa的目标条带，且信号较强，而3个SLGH转基因株系则检测不到目标条带或是信号比较弱，非转基因对照未检测到目标条带。

阳性对照样品制备：将大豆血红蛋白基因LGH(SEQ ID NO:3)连入载体pET28a(Novagen公司)中，转化大肠杆菌TG1感受态，测序确认，将序列无误的质粒(记为pET28a-LGH)转化表达菌株Transetta，加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在37℃条件下进行诱导表达。采用Ni-NTA His·Bind树脂(Millipore)对原核表达蛋白进行纯化，具体步骤参照MERCK操作手册：标签蛋白质-亲和层析法03Purification ofhistidine-tagged recombinant proteins。

3、吡啶血色原光吸收测定法

选取转基因株系GLLGH-1、GLLGH-5、GLLGH-6、GLLGH-9、GLLGH-11、GLLGH-14、GLLGH-15种子，通过吡啶血色原光吸收测定法(Senthilkumar M,Amaresan N,Sankaranarayanan A.(2021)Quantitative Estimation of Leghemoglobin Content inLegume Root Nodules.In:Plant-Microbe Interactions.Springer ProtocolsHandbooks.Humana,New York,NY.)进行血红蛋白含量测定。测定方法具体如下：0.3g种子用3mL磷酸盐缓冲液(0.1M Na₂HPO₄·2H₂O/NaH₂PO₄·H₂O，pH 7.4)充分研磨，以10000g(4℃)离心20min，取2mL上清液，与等体积碱性吡啶溶液(0.2M NaOH，4.2M吡啶，溶剂为水)混合，将混合后的溶液分为等体积的两份，一份加入10μL 0.5M连二硫酸钠水溶液，混匀后于2-5min内测定556nm处的吸光值(A₅₅₆)，另一份则加入5μL 0.1M铁氰化钾水溶液，混匀后测定539nm处的吸光值(A₅₃₉)，代入以下公式以计算豆血红蛋白的含量。

D为稀释倍数(计算是基于摩尔消光系数ε＝23.4mM^-1cm^-1)

从图5可以看出，4个转基因株系GLLGH-1、GLLGH-9、GLLGH-11、GLLGH-15种子中的血红蛋白含量超过了0.1％。

实施例5、转基因大豆种子中肌红蛋白的测定

肌红蛋白大豆遗传转化载体的构建过程可以参照实施例2进行，区别仅在于将大豆血红蛋白编码基因(SEQ ID NO:3)替换为肌红蛋白基因(SEQ ID NO:4)。与表达载体GLLGH仅有血红蛋白编码基因差异的表达载体，我们将其命名为GLBMG(SEQ ID NO:6)。由表达载体GLBMG遗传转化所得的转基因株系称之为GLBMG转基因株系。

1、颜色观察

转基因大豆种子中肌红蛋白是否高表达可通过观察的方法进行初筛，表达量较高的转基因株系种子呈现红色(图6)。CK为非转基因对照皖豆28，1、2、3、4为4个不同的GLBMG转基因株系。4个GLBMG转基因株系均呈红色，而非转基因对照没有观察到红色。

2、吡啶血色原光吸收测定法

选取转基因株系GLBMG-1、GLBMG-4、GLBMG-5、GLBMG-8、GLBMG-13、GLBMG-15种子，通过吡啶血色原光吸收测定法进行肌红蛋白含量测定，具体步骤参照实施例4。从图7可以看出，3个转基因株系GLBMG-1、GLBMG-4、GLBMG-5种子中的肌红蛋白含量超过了0.1％。

实施例6、构建水稻遗传转化载体

理论上，本发明实施例1的2种血红蛋白/肌红蛋白的基因，在5’端添加可在水稻种子中启动基因高表达的启动子，在3’端添加终止子，可以得到在水稻种子中表达血红蛋白/肌红蛋白的表达框，进一步的，血红蛋白/肌红蛋白的表达框可以添加其他增强表达的元件。然后构建入含有选择性标记的植物遗传转化载体。下面以转化载体OSLGH的构建过程为例，具体步骤如下：

血红蛋白基因表达框：将大豆血红蛋白LGH基因进行水稻偏爱密码子优化，序列如SEQ ID NO:11中1461-1895所示，血红蛋白编码区5’端接种子特异性启动子pGT1(SEQ IDNO:11中478-1388bp)，信号肽GT1SP(SEQ ID NO:11中1389-1460)，3’端接TPC终止子(SEQID NO:11中1896-2094bp)和烟草RB7核基质结合区调控序列MAR(SEQ ID NO:5中3082-4248bp)，得大豆血红蛋白基因表达框pGT1-GT1SP-LGH-TPC-MAR(SEQ ID NO:11中478-3267bp)。人工合成含有血红蛋白表达框pGT1-GT1SP-LGH-TPC-MAR的片段OLS(SEQ ID NO:11中457-3267bp)。

抗草甘膦基因表达框：将草甘膦抗性基因g10evo epsps进行水稻偏爱密码子优化，序列如SEQ ID NO:11中6533-7849bp所示，编码区5’端接花椰菜花叶病毒35s启动子pCaMV35S(SEQ ID NO:5中4491-5289bp)，pZmUbi启动子(SEQ ID NO:11中4304-6328)，信号肽AHAS SP(SEQ ID NO:11中6329-6526bp)，3’端接花椰菜花叶病毒35s终止子TCaMV35S。人工合成含抗草甘膦基因的片段pCaMV35S-pZmUbi-AHAS SP-g10evo epsps，记为片段OG10evo，核苷酸序列如SEQ ID NO:11中3248-7870bp所示。

将载体pCAMBIA1300用Hind III/Xho I双酶切，回收6783bp大小的片段FV。以人工合成的片段OLS为模板，使用引物组合(F4，R1)扩增，获得OLGH片段。以人工合成的片段OG10evo为模板，使用引物组合(F5，R3)扩增得到片段OG10evo。将酶切片段FV，与片段OLGH和片段OG10evo通过无缝克隆的方法重组，转化至大肠杆菌TG1菌株，测序确认，得到双元T-DNA转化载体OSLGH，其核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，组成原件和位置如表4所示。

将质粒OSLGH电击转入农杆菌LBA4404感受态细胞，酶切鉴定正确后以甘油菌保存，用于水稻转化。

表4转化载体OSLGH的组成元件和位置

实施例7、转基因水稻的获得

采用农杆菌介导的方法(Hiei Y,Komari T.Agrobacterium-mediatedtransformation of rice using immature embryos or calli induced from matureseed.Nat Protoc,2008,3(5):824-34.)进行水稻遗传转化。以水稻品种秀水134作为受体材料。具体步骤如下：

选择生长良好的水稻愈伤组织，用含有转化载体OSLGH的农杆菌菌液侵染水稻愈伤组织，25℃暗培养3天，进一步在含草甘膦400mg L^-1的筛选培养基(2NBK培养基+特美汀200mg L^-1)上进行筛选培养(28℃暗培养)。每次筛选20d，共筛选2-3次。挑选抗性愈伤组织，将抗性愈伤组织转入分化培养基(NBKRH40培养基，不添加潮霉素)进行分化培养，将分化形成的再生小苗转入生根培养基(NBKFH40培养基，将潮霉素替换为20mg草甘膦)中培养，幼苗生根后炼苗、移栽，得到转基因水稻转化体。

实施例8、转基因水稻种子中大豆血红蛋白的检测

1、颜色观察

将成熟的水稻种子去壳后进行观察，结果显示，在所有转基因株系和非转基因对照的种子中均未观察到红色。图8为部分转基因株系和非转基因水稻的去壳种子对比图，CK为非转基因对照秀水134，2、3、4、5、6分别为转基因株系OSLGH-2、OSLGH-3、OSLGH-4、OSLGH-5、OSLGH-6。

2、Western blot检测

Western blot检测转基因水稻种子中的血红蛋白。每个OSLGH转基因株系各取一粒阳性种子(经G10EPSPS试纸条检测，购自上海佑隆生物科技有限公司)，另取一粒非转基因种子作为阴性对照，将种子充分研磨，称量，按10μL/mg样品加入PBS缓冲液，其余操作步骤同实施例4，得到化学曝光图(图9)。M为蛋白Marker，-为阴性对照秀水134，+为阳性对照(同实施例4)，1、2、3、4、5、6分别为转基因株系OSLGH-1、OSLGH-2、OSLGH-3、OSLGH-4、OSLGH-5、OSLGH-6。阳性对照可检测到约为15kDa的目标条带，而6个OSLGH转基因株系和非转基因对照均未检测到目标条带。

序列表

<110> 杭州瑞丰生物科技有限公司

<120> 一种生产血红素结合蛋白的方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 145

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

Met Gly Ala Phe Thr Glu Lys Gln Glu Ala Leu Val Ser Ser Ser Phe

1 5 10 15

Glu Ala Phe Lys Ala Asn Ile Pro Gln Tyr Ser Val Val Phe Tyr Thr

20 25 30

Ser Ile Leu Glu Lys Ala Pro Ala Ala Lys Asp Leu Phe Ser Phe Leu

35 40 45

Ser Asn Gly Val Asp Pro Ser Asn Pro Lys Leu Thr Gly His Ala Glu

50 55 60

Lys Leu Phe Gly Leu Val Arg Asp Ser Ala Gly Gln Leu Lys Ala Asn

65 70 75 80

Gly Thr Val Val Ala Asp Ala Ala Leu Gly Ser Ile His Ala Gln Lys

85 90 95

Ala Ile Thr Asp Pro Gln Phe Val Val Val Lys Glu Ala Leu Leu Lys

100 105 110

Thr Ile Lys Glu Ala Val Gly Asp Lys Trp Ser Asp Glu Leu Ser Ser

115 120 125

Ala Trp Glu Val Ala Tyr Asp Glu Leu Ala Ala Ala Ile Lys Lys Ala

130 135 140

Phe

145

<210> 2

<211> 154

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

Met Gly Leu Ser Asp Gly Glu Trp Gln Leu Val Leu Asn Ala Trp Gly

1 5 10 15

Lys Val Glu Ala Asp Val Ala Gly His Gly Gln Glu Val Leu Ile Arg

20 25 30

Leu Phe Thr Gly His Pro Glu Thr Leu Glu Lys Phe Asp Lys Phe Lys

35 40 45

His Leu Lys Thr Glu Ala Glu Met Lys Ala Ser Glu Asp Leu Lys Lys

50 55 60

His Gly Asn Thr Val Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys Lys Lys

65 70 75 80

Gly His His Glu Ala Glu Val Lys His Leu Ala Glu Ser His Ala Asn

85 90 95

Lys His Lys Ile Pro Val Lys Tyr Leu Glu Phe Ile Ser Asp Ala Ile

100 105 110

Ile His Val Leu His Ala Lys His Pro Ser Asp Phe Gly Ala Asp Ala

115 120 125

Gln Ala Ala Met Ser Lys Ala Leu Glu Leu Phe Arg Asn Asp Met Ala

130 135 140

Ala Gln Tyr Lys Val Leu Gly Phe His Gly

145 150

<210> 3

<211> 438

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

atgggcgcct tcaccgagaa gcaggaggcc ctcgtgtcct cctccttcga ggccttcaag 60

gccaacatcc cgcagtactc cgtggtgttc tacacctcca tcctggagaa ggccccggcc 120

gccaaggacc tcttctcctt cctctccaac ggcgtggacc cgtccaaccc gaagctcacc 180

ggccacgccg agaagctctt cggcctcgtg cgcgactccg ccggccagct caaggccaac 240

ggcaccgtgg tggccgacgc cgccctcggc tccatccacg cccagaaggc catcaccgac 300

ccgcagttcg tggtggtgaa ggaggccctc ctcaagacca tcaaggaggc cgtgggcgac 360

aagtggtccg acgagctgtc ctccgcctgg gaggtggcct acgacgagct ggccgccgcc 420

atcaagaagg ccttctga 438

<210> 4

<211> 465

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

atgggcctct ccgacggcga gtggcagctc gtgctcaacg cctggggcaa ggtggaggcc 60

gacgtggccg gccacggcca ggaggtgctc atccgcctct tcaccggcca cccggagacc 120

ctggagaagt tcgacaagtt caagcacctc aagaccgagg ccgagatgaa ggcctccgag 180

gacctcaaga agcacggcaa caccgtgctc accgccctcg gcggcatcct caagaagaag 240

ggccaccacg aggccgaggt gaagcacctc gccgagtccc acgccaacaa gcacaagatc 300

ccggtgaagt acctggagtt catctccgac gccatcatcc acgtgctcca cgccaagcac 360

ccgtccgact tcggcgccga cgcccaggcc gccatgtcca aggccctgga gctgttccgc 420

aacgacatgg ccgcccagta caaggtgctc ggcttccacg gctga 465

<210> 5

<211> 13295

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

agcctgtcgc gtaacttagg acttgtgcga catgtcgttt tcagaagacg gctgcactga 60

acgtcagaag ccgactgcac tatagcagcg gaggggttgg atcaaagtac tttgatcccg 120

aggggaaccc tgtggttggc atgcacatac aaatggacga acggataaac cttttcacgc 180

ccttttaaat atccgttatt ctaataaacg ctcttttctc ttaggtttac ccgccaatat 240

atcctgtcaa acactgatag tttaaactga aggcgggaaa cgacaatctg atccaagctc 300

aagctgctct agcattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg 360

gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg 420

gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtgc caagctttgt 480

atgaactgat gatctaggac cggataagtt cccttcttca tagcgaactt attcaaagaa 540

tgttttgtgt atcattcttg ttacattgtt attaatgaaa aaatattatt ggtcattgga 600

ctgaacacga gtgttaaata tggaccaggc cccaaataag atccattgat atatgaatta 660

aataacaaga ataaatcgag tcaccaaacc acttgccttt tttaacgaga cttgttcacc 720

aacttgatac aaaagtcatt atcctatgca aatcaataat catacaaaaa tatccaataa 780

cactaaaaaa ttaaaagaaa tggataattt cacaatatgt tatacgataa agaagttact 840

tttccaagaa attcactgat tttataagcc cacttgcatt agataaatgg caaaaaaaaa 900

caaaaaggaa aagaaataaa gcacgaagaa ttctagaaaa tacgaaatac gcttcaatgc 960

agtgggaccc acggttcaat tattgccaat tttcagctcc accgtatatt taaaaaataa 1020

aacgataatg ctaaaaaaat ataaatcgta acgatcgtta aatctcaacg gctggatctt 1080

atgacgaccg ttagaaattg tggttgtcga cgagtcagta ataaacggcg tcaaagtggt 1140

tgcagccggc acacacgagt cgtgtttatc aactcaaagc acaaatactt ttcctcaacc 1200

taaaaataag gcaattagcc aaaaacaact ttgcgtgtaa acaacgctca atacacgtgt 1260

cattttatta ttagctattg cttcaccgcc ttagctttct cgtgacctag tcgtcctcgt 1320

cttttcttct tcttcttcta taaaacaata cccaaagagc tcttcttctt cacaattcag 1380

atttcaattt ctcaaaatct taaaaacttt ctctcaattc tctctaccgt gatcaaggta 1440

aatttctgtg ttccttattc tctcaaaatc ttcgattttg ttttcgttcg atcccaattt 1500

cgtatatgtt ctttggttta gattctgtta atcttagatc gaagacgatt ttctgggttt 1560

gatcgttaga tatcatctta attctcgatt agggtttcat agatatcatc cgatttgttc 1620

aaataatttg agttttgtcg aataattact cttcgatttg tgatttctat ctagatctgg 1680

tgttagtttc tagtttgtgc gatcgaattt gtcgattaat ctgagttttt ctgattaaca 1740

gatgggcgcc ttcaccgaga agcaggaggc cctcgtgtcc tcctccttcg aggccttcaa 1800

ggccaacatc ccgcagtact ccgtggtgtt ctacacctcc atcctggaga aggccccggc 1860

cgccaaggac ctcttctcct tcctctccaa cggcgtggac ccgtccaacc cgaagctcac 1920

cggccacgcc gagaagctct tcggcctcgt gcgcgactcc gccggccagc tcaaggccaa 1980

cggcaccgtg gtggccgacg ccgccctcgg ctccatccac gcccagaagg ccatcaccga 2040

cccgcagttc gtggtggtga aggaggccct cctcaagacc atcaaggagg ccgtgggcga 2100

caagtggtcc gacgagctgt cctccgcctg ggaggtggcc tacgacgagc tggccgccgc 2160

catcaagaag gccttctgac gacatatgaa gatgaagatg aaatatttgg tgtgtcaaat 2220

aaaaagctag tgtgcttaag tttgtgtttt tttcttggct tgttgtgtta tgaatttgtg 2280

gctttttcta atattaaatg aatgtaagat ctcattataa tgaataaaca aatgtttcta 2340

taatccattg tgaatgtttt gttggatctc ttctgcagca tataactact gtatgtgcta 2400

tggtatggac tatggaatat gattaaagat aagatgggct catagagtaa aacgaggcga 2460

gggacctata aacctccctt catcatgcta tttcatgatc tattttataa aataaagatg 2520

tagaaaaaag taagcgtaat aaccgcaaaa caaatgattt aaaacatggc acataatgag 2580

gagattaagt tcggtttacg tttattttag tactaattgt aacgtgagac tacgtatcgg 2640

gaatcgccta attaaagcat taatgcgaac ctgattagat tcaccgaccc tcctatcgtg 2700

tcgacctttc tgtttcttag aattttttgg tagtctatgt actaataatg tcagcttcgt 2760

atttatttca taagcaattt gcatttgcaa tttgtttttt acttttattt ttattgtatt 2820

gtggaatgtg gactcgtacc aacatgaagt tatataccac caaaaaaatt acagttagtc 2880

aaaagattca cgagtgagag ctacttatga ttgtctttta cgtatatgtc taattgtcta 2940

tttgctcaat aatctttgta ctttcttttg tcgttgataa aatcacaaag ttccaaaagt 3000

aatcgaatga tttgctttta agaaaagaac agctcaataa ttcaacatat atctgtacac 3060

acataattga ataagggtac ccgattaaaa atcccaatta tatttggtct aatttagttt 3120

ggtattgagt aaaacaaatt cgaaccaaac caaaatataa atatatagtt tttatatata 3180

tgcctttaag actttttata gaattttctt taaaaaatat ctagaaatat ttgcgactct 3240

tctggcatgt aatatttcgt taaatatgaa gtgctccatt tttattaact ttaaataatt 3300

ggttgtacga tcactttctt atcaagtgtt actaaaatgc gtcaatctct ttgttcttcc 3360

atattcatat gtcaaaatct atcaaaattc ttatatatct ttttcgaatt tgaagtgaaa 3420

tttcgataat ttaaaattaa atagaacata tcattattta ggtatcatat tgatttttat 3480

acttaattac taaatttggt taactttgaa agtgtacatc aacgaaaaat tagtcaaacg 3540

actaaaataa ataaatatca tgtgttatta agaaaattct cctataagaa tattttaata 3600

gatcatatgt ttgtaaaaaa aattaatttt tactaacaca tatatttact tatcaaaaat 3660

ttgacaaagt aagattaaaa taatattcat ctaacaaaaa aaaaaccaga aaatgctgaa 3720

aacccggcaa aaccgaacca atccaaaccg atatagttgg tttggtttga ttttgatata 3780

aaccgaacca actcggtcca tttgcacccc taatcataat agctttaata tttcaagata 3840

ttattaagtt aacgttgtca atatcctgga aattttgcaa aatgaatcaa gcctatatgg 3900

ctgtaatatg aatttaaaag cagctcgatg tggtggtaat atgtaattta cttgattcta 3960

aaaaaatatc ccaagtatta ataatttctg ctaggaagaa ggttagctac gatttacagc 4020

aaagccagaa tacaaagaac cataaagtga ttgaagctcg aaatatacga aggaacaaat 4080

atttttaaaa aaatacgcaa tgacttggaa caaaagaaag tgatatattt tttgttctta 4140

aacaagcatc ccctctaaag aatggcagtt ttcctttgca tgtaactatt atgctccctt 4200

cgttacaaaa attttggact actattggga acttcttctg aaaatagtgg taccgagctc 4260

gaattcgtaa tcatgtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca 4320

cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa 4380

ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag 4440

ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg ctagagcagc 4500

ttgccaacat ggtggagcac gacactctcg tctactccaa gaatatcaaa gatacagtct 4560

cagaagacca aagggctatt gagacttttc aacaaagggt aatatcggga aacctcctcg 4620

gattccattg cccagctatc tgtcacttca tcaaaaggac agtagaaaag gaaggtggca 4680

cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggctatcgt tcaagatgcc tctgccgaca 4740

gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa 4800

ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg ataacatggt ggagcacgac actctcgtct 4860

actccaagaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggctattgag acttttcaac 4920

aaagggtaat atcgggaaac ctcctcggat tccattgccc agctatctgt cacttcatca 4980

aaaggacagt agaaaaggaa ggtggcacct acaaatgcca tcattgcgat aaaggaaagg 5040

ctatcgttca agatgcctct gccgacagtg gtcccaaaga tggaccccca cccacgagga 5100

gcatcgtgga aaaagaagac gttccaacca cgtcttcaaa gcaagtggat tgatgtgata 5160

tctccactga cgtaagggat gacgcacaat cccactatcc ttcgcaagac cttcctctat 5220

ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac acgctgaaat caccagtctc tctctacaaa 5280

tctatctctc tcgagtcaac acaacatata caaaacaaac gaatctcaag caatcaagca 5340

ttctacttct attgcagcaa tttaaatcat ttcttttaaa gcaaaagcaa ttttctgaaa 5400

attttcacca tttacgaacg atagccatgg ctcaagttag cagaatctgc aatggtgtgc 5460

agaacccatc tcttatctcc aatctctcta aatccagtca aaggaaatct cccttatcgg 5520

tttctctgaa gactcagcag catccacgag cttatccaat ttcttcatct tggggattga 5580

agaagagtgg gatgacttta attggctctg agcttcgtcc tcttaaggtc atgtcttctg 5640

tttccacggc ggagaaggga tccgacgctc ttccagctac cttcgacgtt atcgtgcatc 5700

cagctagaga actcagaggt gaacttagag cacagccatc caagaactac accactagat 5760

acctcctcgc cgctgctctc gctgagggtg aaaccagagt tgttggtgtg gctacctctg 5820

aggatgccga agctatgctc agatgcctca gagattgggg tgctggtgtt gagcttgttg 5880

gtgatgacgc cgtgatcaga ggtttcggtg ctagaccaca ggctggtgtt acccttaacc 5940

caggtaacgc tgctgcggtg gccagactcc ttatgggtgt tgctgctctc acctctggta 6000

caactttcgt taccgattac cctgattccc ttggtaagag acctcagggt gaccttcttg 6060

aagccctcga aagacttggt gcttgggtgt cctccaacga tggtagactc cctatctccg 6120

tttccggtcc agttagaggt ggtacagtgg aggtttccgc cgaaagatcc tcccagtacg 6180

cttccgccct tatgttcctc ggtcctcttc ttcctgacgg actcgaactt agactcaccg 6240

gtgatatcaa gtcccacgct cctcttagac agacacttga caccctctct gatttcggtg 6300

ttagagctac tgcctccgat gaccttagaa gaatctccat ccctggtggt cagaagtaca 6360

gaccaggtag agtgctcgtt cctggtgatt accctggttc cgctgctatc cttaccgccg 6420

ctgctcttct cccaggtgag gttagacttt ctaaccttag agaacacgac ctccagggtg 6480

agaaggaagc tgtgaacgtt cttagagaga tgggtgctga tatcgttaga gaaggtgata 6540

cccttaccgt gagaggtggt agacctctcc acgctgttac tagagatggt gattccttca 6600

ccgacgccgt gcaagctctt accgctgctg ctgccttcgc tgagggtgat accacctggg 6660

aaaacgttgc tactcttaga ctcaaggaat gcgatagaat ctctgacacc agagctgagc 6720

ttgaaagact tggtcttaga gcaagagaga ccgccgattc tctctccgtt actggttctg 6780

ctcaccttgc tggtggtatc accgctgatg gtcacggtga ccacagaatg atcatgcttc 6840

tcacccttct tggtctcaga gcagatgctc cacttagaat caccggtgca caccacatca 6900

gaaagtccta ccctcagttc ttcgctcacc ttgaagctct tggtgctaga ttcgaatacg 6960

ctgaggctac cgcctaatag gagctcgagt ttctccataa taatgtgtga gtagttccca 7020

gataagggaa ttagggttcc tatagggttt cgctcatgtg ttgagcatat aagaaaccct 7080

tagtatgtat ttgtatttgt aaaatacttc tatcaataaa atttctaatt cctaaaacca 7140

aaatccagta ctaaaatcca gatcccccga attaattcgg cgttaattca gtacattaaa 7200

aacgtccgca atgtgttatt aagttgtcta agcgtcaatt tgtttacacc acaatatatc 7260

ctgccaccag ccagccaaca gctccccgac cggcagctcg gcacaaaatc accactcgat 7320

acaggcagcc catcagtccg ggacggcgtc agcgggagag ccgttgtaag gcggcagact 7380

ttgctcatgt taccgatgct attcggaaga acggcaacta agctgccggg tttgaaacac 7440

ggatgatctc gcggagggta gcatgttgat tgtaacgatg acagagcgtt gctgcctgtg 7500

atcaccgcgg tttcaaaatc ggctccgtcg atactatgtt atacgccaac tttgaaaaca 7560

actttgaaaa agctgttttc tggtatttaa ggttttagaa tgcaaggaac agtgaattgg 7620

agttcgtctt gttataatta gcttcttggg gtatctttaa atactgtaga aaagaggaag 7680

gaaataataa atggctaaaa tgagaatatc accggaattg aaaaaactga tcgaaaaata 7740

ccgctgcgta aaagatacgg aaggaatgtc tcctgctaag gtatataagc tggtgggaga 7800

aaatgaaaac ctatatttaa aaatgacgga cagccggtat aaagggacca cctatgatgt 7860

ggaacgggaa aaggacatga tgctatggct ggaaggaaag ctgcctgttc caaaggtcct 7920

gcactttgaa cggcatgatg gctggagcaa tctgctcatg agtgaggccg atggcgtcct 7980

ttgctcggaa gagtatgaag atgaacaaag ccctgaaaag attatcgagc tgtatgcgga 8040

gtgcatcagg ctctttcact ccatcgacat atcggattgt ccctatacga atagcttaga 8100

cagccgctta gccgaattgg attacttact gaataacgat ctggccgatg tggattgcga 8160

aaactgggaa gaagacactc catttaaaga tccgcgcgag ctgtatgatt ttttaaagac 8220

ggaaaagccc gaagaggaac ttgtcttttc ccacggcgac ctgggagaca gcaacatctt 8280

tgtgaaagat ggcaaagtaa gtggctttat tgatcttggg agaagcggca gggcggacaa 8340

gtggtatgac attgccttct gcgtccggtc gatcagggag gatatcgggg aagaacagta 8400

tgtcgagcta ttttttgact tactggggat caagcctgat tgggagaaaa taaaatatta 8460

tattttactg gatgaattgt tttagtacct agaatgcatg accaaaatcc cttaacgtga 8520

gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 8580

tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 8640

ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc 8700

gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc 8760

tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg 8820

cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 8880

gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 8940

actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 9000

ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 9060

gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 9120

atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 9180

tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc 9240

tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg 9300

aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcctga tgcggtattt 9360

tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg 9420

ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg 9480

gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg 9540

gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca 9600

ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagggt gccttgatgt gggcgccggc ggtcgagtgg 9660

cgacggcgcg gcttgtccgc gccctggtag attgcctggc cgtaggccag ccatttttga 9720

gcggccagcg gccgcgatag gccgacgcga agcggcgggg cgtagggagc gcagcgaccg 9780

aagggtaggc gctttttgca gctcttcggc tgtgcgctgg ccagacagtt atgcacaggc 9840

caggcgggtt ttaagagttt taataagttt taaagagttt taggcggaaa aatcgccttt 9900

tttctctttt atatcagtca cttacatgtg tgaccggttc ccaatgtacg gctttgggtt 9960

cccaatgtac gggttccggt tcccaatgta cggctttggg ttcccaatgt acgtgctatc 10020

cacaggaaag agaccttttc gacctttttc ccctgctagg gcaatttgcc ctagcatctg 10080

ctccgtacat taggaaccgg cggatgcttc gccctcgatc aggttgcggt agcgcatgac 10140

taggatcggg ccagcctgcc ccgcctcctc cttcaaatcg tactccggca ggtcatttga 10200

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gcggtagaga aaacggccga tgccgggatc gatcaaaaag taatcggggt gaaccgtcag 10380

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gtgcgtggtg tttaaccgaa tgcaggtttc taccaggtcg tctttctgct ttccgccatc 10620

ggctcgccgg cagaacttga gtacgtccgc aacgtgtgga cggaacacgc ggccgggctt 10680

gtctcccttc ccttcccggt atcggttcat ggattcggtt agatgggaaa ccgccatcag 10740

taccaggtcg taatcccaca cactggccat gccggccggc cctgcggaaa cctctacgtg 10800

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caccaggtca tcacccagcg ccgcgccgat ttgtaccggg ccggatggtt tgcgaccgtc 11160

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cgcttacgcc tggccaaccg cccgttcctc cacacatggg gcattccacg gcgtcggtgc 11280

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attcatttgc tcatttactc tggtagctgc gcgatgtatt cagatagcag ctcggtaatg 11400

gtcttgcctt ggcgtaccgc gtacatcttc agcttggtgt gatcctccgc cggcaactga 11460

aagttgaccc gcttcatggc tggcgtgtct gccaggctgg ccaacgttgc agccttgctg 11520

ctgcgtgcgc tcggacggcc ggcacttagc gtgtttgtgc ttttgctcat tttctcttta 11580

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cgccgcctgg cctcggtggg cgtcacttcc tcgctgcgct caagtgcgcg gtacagggtc 12660

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aactcggcaa tgccggcgaa cacggtcaac accatgcggc cggccggcgt ggtggtgtcg 12900

gcccacggct ctgccaggct acgcaggccc gcgccggcct cctggatgcg ctcggcaatg 12960

tccagtaggt cgcgggtgct gcgggccagg cggtctagcc tggtcactgt cacaacgtcg 13020

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aagtcctggt cgtcggtgct gacgcgggca tagcccagca ggccagcggc ggcgctcttg 13200

ttcatggcgt aatgtctccg gttctagtcg caagtattct actttatgcg actaaaacac 13260

gcgacaagaa aacgccagga aaagggcagg gcggc 13295

<210> 6

<211> 13322

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

agcctgtcgc gtaacttagg acttgtgcga catgtcgttt tcagaagacg gctgcactga 60

acgtcagaag ccgactgcac tatagcagcg gaggggttgg atcaaagtac tttgatcccg 120

aggggaaccc tgtggttggc atgcacatac aaatggacga acggataaac cttttcacgc 180

ccttttaaat atccgttatt ctaataaacg ctcttttctc ttaggtttac ccgccaatat 240

atcctgtcaa acactgatag tttaaactga aggcgggaaa cgacaatctg atccaagctc 300

aagctgctct agcattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg 360

gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg 420

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atgaactgat gatctaggac cggataagtt cccttcttca tagcgaactt attcaaagaa 540

tgttttgtgt atcattcttg ttacattgtt attaatgaaa aaatattatt ggtcattgga 600

ctgaacacga gtgttaaata tggaccaggc cccaaataag atccattgat atatgaatta 660

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aacttgatac aaaagtcatt atcctatgca aatcaataat catacaaaaa tatccaataa 780

cactaaaaaa ttaaaagaaa tggataattt cacaatatgt tatacgataa agaagttact 840

tttccaagaa attcactgat tttataagcc cacttgcatt agataaatgg caaaaaaaaa 900

caaaaaggaa aagaaataaa gcacgaagaa ttctagaaaa tacgaaatac gcttcaatgc 960

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aacgataatg ctaaaaaaat ataaatcgta acgatcgtta aatctcaacg gctggatctt 1080

atgacgaccg ttagaaattg tggttgtcga cgagtcagta ataaacggcg tcaaagtggt 1140

tgcagccggc acacacgagt cgtgtttatc aactcaaagc acaaatactt ttcctcaacc 1200

taaaaataag gcaattagcc aaaaacaact ttgcgtgtaa acaacgctca atacacgtgt 1260

cattttatta ttagctattg cttcaccgcc ttagctttct cgtgacctag tcgtcctcgt 1320

cttttcttct tcttcttcta taaaacaata cccaaagagc tcttcttctt cacaattcag 1380

atttcaattt ctcaaaatct taaaaacttt ctctcaattc tctctaccgt gatcaaggta 1440

aatttctgtg ttccttattc tctcaaaatc ttcgattttg ttttcgttcg atcccaattt 1500

cgtatatgtt ctttggttta gattctgtta atcttagatc gaagacgatt ttctgggttt 1560

gatcgttaga tatcatctta attctcgatt agggtttcat agatatcatc cgatttgttc 1620

aaataatttg agttttgtcg aataattact cttcgatttg tgatttctat ctagatctgg 1680

tgttagtttc tagtttgtgc gatcgaattt gtcgattaat ctgagttttt ctgattaaca 1740

gatgggcctc tccgacggcg agtggcagct cgtgctcaac gcctggggca aggtggaggc 1800

cgacgtggcc ggccacggcc aggaggtgct catccgcctc ttcaccggcc acccggagac 1860

cctggagaag ttcgacaagt tcaagcacct caagaccgag gccgagatga aggcctccga 1920

ggacctcaag aagcacggca acaccgtgct caccgccctc ggcggcatcc tcaagaagaa 1980

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cttggcttgt tgtgttatga atttgtggct ttttctaata ttaaatgaat gtaagatctc 2340

attataatga ataaacaaat gtttctataa tccattgtga atgttttgtt ggatctcttc 2400

tgcagcatat aactactgta tgtgctatgg tatggactat ggaatatgat taaagataag 2460

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catgatctat tttataaaat aaagatgtag aaaaaagtaa gcgtaataac cgcaaaacaa 2580

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ttgataaaat cacaaagttc caaaagtaat cgaatgattt gcttttaaga aaagaacagc 3060

tcaataattc aacatatatc tgtacacaca taattgaata agggtacccg attaaaaatc 3120

ccaattatat ttggtctaat ttagtttggt attgagtaaa acaaattcga accaaaccaa 3180

aatataaata tatagttttt atatatatgc ctttaagact ttttatagaa ttttctttaa 3240

aaaatatcta gaaatatttg cgactcttct ggcatgtaat atttcgttaa atatgaagtg 3300

ctccattttt attaacttta aataattggt tgtacgatca ctttcttatc aagtgttact 3360

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tatatctttt tcgaatttga agtgaaattt cgataattta aaattaaata gaacatatca 3480

ttatttaggt atcatattga tttttatact taattactaa atttggttaa ctttgaaagt 3540

gtacatcaac gaaaaattag tcaaacgact aaaataaata aatatcatgt gttattaaga 3600

aaattctcct ataagaatat tttaatagat catatgtttg taaaaaaaat taatttttac 3660

taacacatat atttacttat caaaaatttg acaaagtaag attaaaataa tattcatcta 3720

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tagttggttt ggtttgattt tgatataaac cgaaccaact cggtccattt gcacccctaa 3840

tcataatagc tttaatattt caagatatta ttaagttaac gttgtcaata tcctggaaat 3900

tttgcaaaat gaatcaagcc tatatggctg taatatgaat ttaaaagcag ctcgatgtgg 3960

tggtaatatg taatttactt gattctaaaa aaatatccca agtattaata atttctgcta 4020

ggaagaaggt tagctacgat ttacagcaaa gccagaatac aaagaaccat aaagtgattg 4080

aagctcgaaa tatacgaagg aacaaatatt tttaaaaaaa tacgcaatga cttggaacaa 4140

aagaaagtga tatatttttt gttcttaaac aagcatcccc tctaaagaat ggcagttttc 4200

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acatggtgga gcacgacact ctcgtctact ccaagaatat caaagataca gtctcagaag 4920

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ccagtcaaag gaaatctccc ttatcggttt ctctgaagac tcagcagcat ccacgagctt 5580

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gaccacaggc tggtgttacc cttaacccag gtaacgctgc tgcggtggcc agactcctta 6000

tgggtgttgc tgctctcacc tctggtacaa ctttcgttac cgattaccct gattcccttg 6060

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ccaacgatgg tagactccct atctccgttt ccggtccagt tagaggtggt acagtggagg 6180

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ctgacggact cgaacttaga ctcaccggtg atatcaagtc ccacgctcct cttagacaga 6300

cacttgacac cctctctgat ttcggtgtta gagctactgc ctccgatgac cttagaagaa 6360

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ctggttccgc tgctatcctt accgccgctg ctcttctccc aggtgaggtt agactttcta 6480

accttagaga acacgacctc cagggtgaga aggaagctgt gaacgttctt agagagatgg 6540

gtgctgatat cgttagagaa ggtgataccc ttaccgtgag aggtggtaga cctctccacg 6600

ctgttactag agatggtgat tccttcaccg acgccgtgca agctcttacc gctgctgctg 6660

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tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga 9300

gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga 9360

agcggaagag cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg 9420

catatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact 9480

ccgctatcgc tacgtgactg ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac 9540

gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc 9600

gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagggtgcc 9660

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agagttttag gcggaaaaat cgcctttttt ctcttttata tcagtcactt acatgtgtga 9960

ccggttccca atgtacggct ttgggttccc aatgtacggg ttccggttcc caatgtacgg 10020

ctttgggttc ccaatgtacg tgctatccac aggaaagaga ccttttcgac ctttttcccc 10080

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caaatcgtac tccggcaggt catttgaccc gatcagcttg cgcacggtga aacagaactt 10260

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gatcttgtag cggctaatca aggcttcacc ctcggatacc gtcaccaggc ggccgttctt 10560

ggccttcttc gtacgctgca tggcaacgtg cgtggtgttt aaccgaatgc aggtttctac 10620

caggtcgtct ttctgctttc cgccatcggc tcgccggcag aacttgagta cgtccgcaac 10680

gtgtggacgg aacacgcggc cgggcttgtc tcccttccct tcccggtatc ggttcatgga 10740

ttcggttaga tgggaaaccg ccatcagtac caggtcgtaa tcccacacac tggccatgcc 10800

ggccggccct gcggaaacct ctacgtgccc gtctggaagc tcgtagcgga tcacctcgcc 10860

agctcgtcgg tcacgcttcg acagacggaa aacggccacg tccatgatgc tgcgactatc 10920

gcgggtgccc acgtcataga gcatcggaac gaaaaaatct ggttgctcgt cgcccttggg 10980

cggcttccta atcgacggcg caccggctgc cggcggttgc cgggattctt tgcggattcg 11040

atcagcggcc gcttgccacg attcaccggg gcgtgcttct gcctcgatgc gttgccgctg 11100

ggcggcctgc gcggccttca acttctccac caggtcatca cccagcgccg cgccgatttg 11160

taccgggccg gatggtttgc gaccgtcacg ccgattcctc gggcttgggg gttccagtgc 11220

cattgcaggg ccggcagaca acccagccgc ttacgcctgg ccaaccgccc gttcctccac 11280

acatggggca ttccacggcg tcggtgcctg gttgttcttg attttccatg ccgcctcctt 11340

tagccgctaa aattcatcta ctcatttatt catttgctca tttactctgg tagctgcgcg 11400

atgtattcag atagcagctc ggtaatggtc ttgccttggc gtaccgcgta catcttcagc 11460

ttggtgtgat cctccgccgg caactgaaag ttgacccgct tcatggctgg cgtgtctgcc 11520

aggctggcca acgttgcagc cttgctgctg cgtgcgctcg gacggccggc acttagcgtg 11580

tttgtgcttt tgctcatttt ctctttacct cattaactca aatgagtttt gatttaattt 11640

cagcggccag cgcctggacc tcgcgggcag cgtcgccctc gggttctgat tcaagaacgg 11700

ttgtgccggc ggcggcagtg cctgggtagc tcacgcgctg cgtgatacgg gactcaagaa 11760

tgggcagctc gtacccggcc agcgcctcgg caacctcacc gccgatgcgc gtgcctttga 11820

tcgcccgcga cacgacaaag gccgcttgta gccttccatc cgtgacctca atgcgctgct 11880

taaccagctc caccaggtcg gcggtggccc atatgtcgta agggcttggc tgcaccggaa 11940

tcagcacgaa gtcggctgcc ttgatcgcgg acacagccaa gtccgccgcc tggggcgctc 12000

cgtcgatcac tacgaagtcg cgccggccga tggccttcac gtcgcggtca atcgtcgggc 12060

ggtcgatgcc gacaacggtt agcggttgat cttcccgcac ggccgcccaa tcgcgggcac 12120

tgccctgggg atcggaatcg actaacagaa catcggcccc ggcgagttgc agggcgcggg 12180

ctagatgggt tgcgatggtc gtcttgcctg acccgccttt ctggttaagt acagcgataa 12240

ccttcatgcg ttccccttgc gtatttgttt atttactcat cgcatcatat acgcagcgac 12300

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ttcttcagcg gccaagctgg ccggccaggc cgccagcttg gcatcagaca aaccggccag 12420

gatttcatgc agccgcacgg ttgagacgtg cgcgggcggc tcgaacacgt acccggccgc 12480

gatcatctcc gcctcgatct cttcggtaat gaaaaacggt tcgtcctggc cgtcctggtg 12540

cggtttcatg cttgttcctc ttggcgttca ttctcggcgg ccgccagggc gtcggcctcg 12600

gtcaatgcgt cctcacggaa ggcaccgcgc cgcctggcct cggtgggcgt cacttcctcg 12660

ctgcgctcaa gtgcgcggta cagggtcgag cgatgcacgc caagcagtgc agccgcctct 12720

ttcacggtgc ggccttcctg gtcgatcagc tcgcgggcgt gcgcgatctg tgccggggtg 12780

agggtagggc gggggccaaa cttcacgcct cgggccttgg cggcctcgcg cccgctccgg 12840

gtgcggtcga tgattaggga acgctcgaac tcggcaatgc cggcgaacac ggtcaacacc 12900

atgcggccgg ccggcgtggt ggtgtcggcc cacggctctg ccaggctacg caggcccgcg 12960

ccggcctcct ggatgcgctc ggcaatgtcc agtaggtcgc gggtgctgcg ggccaggcgg 13020

tctagcctgg tcactgtcac aacgtcgcca gggcgtaggt ggtcaagcat cctggccagc 13080

tccgggcggt cgcgcctggt gccggtgatc ttctcggaaa acagcttggt gcagccggcc 13140

gcgtgcagtt cggcccgttg gttggtcaag tcctggtcgt cggtgctgac gcgggcatag 13200

cccagcaggc cagcggcggc gctcttgttc atggcgtaat gtctccggtt ctagtcgcaa 13260

gtattctact ttatgcgact aaaacacgcg acaagaaaac gccaggaaaa gggcagggcg 13320

gc 13322

<210> 7

<211> 13210

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

agcctgtcgc gtaacttagg acttgtgcga catgtcgttt tcagaagacg gctgcactga 60

acgtcagaag ccgactgcac tatagcagcg gaggggttgg atcaaagtac tttgatcccg 120

aggggaaccc tgtggttggc atgcacatac aaatggacga acggataaac cttttcacgc 180

ccttttaaat atccgttatt ctaataaacg ctcttttctc ttaggtttac ccgccaatat 240

atcctgtcaa acactgatag tttaaactga aggcgggaaa cgacaatctg atccaagctc 300

aagctgctct agcattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg 360

gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg 420

gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtgc caagcttcag 480

attaaacgac gccgtttcgt tcctttcgct tcacggctta acgatgtcgt ttctgtctgt 540

gcccaaaaaa taaaggcatt tgttatttgc accagatatt tactaagtgc accctagttt 600

gacaagtagg cgataattac aaatagatgc ggtgcaaata ataaattttg aaggaaataa 660

ttacaaaaga acagaactta tatttacttt attttaaaaa actaaaatga aagaacaaaa 720

aaaagtaaaa aatacaaaaa atgtgcttta accactttca ttatttgtta cagaaagtat 780

gattctactc aaattgatct gttgtatctg gtgctgcctt gtcacactgg cgatttcaat 840

cccctaaaga tatggtgcaa actgcgaagt gatcaatatc tgctcggtta atttagatta 900

attaataata ttcaacgtga tgtaccaaaa aaagacaatt ttttgctcca ttgacaaatt 960

aaacctcatc aaggtaattt ccaaacctat aagcaaaaaa atttcacatt aattggcccg 1020

caatcctatt agtcttatta tactagagta ggaaaaaaaa caattacaca acttgtctta 1080

ttattctcta tgctaatgaa tatttttccc ttttgttaga aatcagtgtt tcctaattta 1140

ttgagtatta attccactca ccgcatatat ttaccgttga ataagaaaat tttacacata 1200

attcttttta aaataaataa tttttttata ctagatctta tatgattacg tgaagccaag 1260

tgggttatac taatgatata taatgtttga tagtaatcag tttataaacc aaatgcatgg 1320

aaatgttacg tggaagcacg taaattaaca agcattgaag caaatgcagc caccgcacca 1380

aaaccacccc acttcacttc cacgtaccat attccatgca actacaacac cctaaaactt 1440

caataaatgc ccccaccttc acttctcaac acaacatata caaaacaaac gaatctcaag 1500

caatcaagca ttctacttct attgcagcaa tttaaatcat ttcttttaaa gcaaaagcaa 1560

ttttctgaaa attttcacca tttacgaacg atagccatgg ctaacaagct cttccttgtt 1620

tgcgctactt tcgctctttg cttccttctt actaacgctg gcgccttcac cgagaagcag 1680

gaggccctcg tgtcctcctc cttcgaggcc ttcaaggcca acatcccgca gtactccgtg 1740

gtgttctaca cctccatcct ggagaaggcc ccggccgcca aggacctctt ctccttcctc 1800

tccaacggcg tggacccgtc caacccgaag ctcaccggcc acgccgagaa gctcttcggc 1860

ctcgtgcgcg actccgccgg ccagctcaag gccaacggca ccgtggtggc cgacgccgcc 1920

ctcggctcca tccacgccca gaaggccatc accgacccgc agttcgtggt ggtgaaggag 1980

gccctcctca agaccatcaa ggaggccgtg ggcgacaagt ggtccgacga gctgtcctcc 2040

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atgaagatga agatgaaata tttggtgtgt caaataaaaa gctagtgtgc ttaagtttgt 2160

gtttttttct tggcttgttg tgttatgaat ttgtggcttt ttctaatatt aaatgaatgt 2220

aagatctcat tataatgaat aaacaaatgt ttctataatc cattgtgaat gttttgttgg 2280

atctcttctg cagcatataa ctactgtatg tgctatggta tggactatgg aatatgatta 2340

aagataagat gggctcatag agtaaaacga ggcgagggac ctataaacct cccttcatca 2400

tgctatttca tgatctattt tataaaataa agatgtagaa aaaagtaagc gtaataaccg 2460

caaaacaaat gatttaaaac atggcacata atgaggagat taagttcggt ttacgtttat 2520

tttagtacta attgtaacgt gagactacgt atcgggaatc gcctaattaa agcattaatg 2580

cgaacctgat tagattcacc gaccctccta tcgtgtcgac ctttctgttt cttagaattt 2640

tttggtagtc tatgtactaa taatgtcagc ttcgtattta tttcataagc aatttgcatt 2700

tgcaatttgt tttttacttt tatttttatt gtattgtgga atgtggactc gtaccaacat 2760

gaagttatat accaccaaaa aaattacagt tagtcaaaag attcacgagt gagagctact 2820

tatgattgtc ttttacgtat atgtctaatt gtctatttgc tcaataatct ttgtactttc 2880

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agaacagctc aataattcaa catatatctg tacacacata attgaataag ggtacccgat 3000

taaaaatccc aattatattt ggtctaattt agtttggtat tgagtaaaac aaattcgaac 3060

caaaccaaaa tataaatata tagtttttat atatatgcct ttaagacttt ttatagaatt 3120

ttctttaaaa aatatctaga aatatttgcg actcttctgg catgtaatat ttcgttaaat 3180

atgaagtgct ccatttttat taactttaaa taattggttg tacgatcact ttcttatcaa 3240

gtgttactaa aatgcgtcaa tctctttgtt cttccatatt catatgtcaa aatctatcaa 3300

aattcttata tatctttttc gaatttgaag tgaaatttcg ataatttaaa attaaataga 3360

acatatcatt atttaggtat catattgatt tttatactta attactaaat ttggttaact 3420

ttgaaagtgt acatcaacga aaaattagtc aaacgactaa aataaataaa tatcatgtgt 3480

tattaagaaa attctcctat aagaatattt taatagatca tatgtttgta aaaaaaatta 3540

atttttacta acacatatat ttacttatca aaaatttgac aaagtaagat taaaataata 3600

ttcatctaac aaaaaaaaaa ccagaaaatg ctgaaaaccc ggcaaaaccg aaccaatcca 3660

aaccgatata gttggtttgg tttgattttg atataaaccg aaccaactcg gtccatttgc 3720

acccctaatc ataatagctt taatatttca agatattatt aagttaacgt tgtcaatatc 3780

ctggaaattt tgcaaaatga atcaagccta tatggctgta atatgaattt aaaagcagct 3840

cgatgtggtg gtaatatgta atttacttga ttctaaaaaa atatcccaag tattaataat 3900

ttctgctagg aagaaggtta gctacgattt acagcaaagc cagaatacaa agaaccataa 3960

agtgattgaa gctcgaaata tacgaaggaa caaatatttt taaaaaaata cgcaatgact 4020

tggaacaaaa gaaagtgata tattttttgt tcttaaacaa gcatcccctc taaagaatgg 4080

cagttttcct ttgcatgtaa ctattatgct cccttcgtta caaaaatttt ggactactat 4140

tgggaacttc ttctgaaaat agtggtaccg agctcgaatt cgtaatcatg tcatagctgt 4200

ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa 4260

agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac 4320

tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg 4380

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cttcatcaaa aggacagtag aaaaggaagg tggcacctac aaatgccatc attgcgataa 4620

aggaaaggct atcgttcaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc 4680

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cacctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggctatc gttcaagatg cctctgccga 4980

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aggacacgct gaaatcacca gtctctctct acaaatctat ctctctcgag tcaacacaac 5220

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catggctcaa gttagcagaa tctgcaatgg tgtgcagaac ccatctctta tctccaatct 5400

ctctaaatcc agtcaaagga aatctccctt atcggtttct ctgaagactc agcagcatcc 5460

acgagcttat ccaatttctt catcttgggg attgaagaag agtgggatga ctttaattgg 5520

ctctgagctt cgtcctctta aggtcatgtc ttctgtttcc acggcggaga agggatccga 5580

cgctcttcca gctaccttcg acgttatcgt gcatccagct agagaactca gaggtgaact 5640

tagagcacag ccatccaaga actacaccac tagatacctc ctcgccgctg ctctcgctga 5700

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cggtgctaga ccacaggctg gtgttaccct taacccaggt aacgctgctg cggtggccag 5880

actccttatg ggtgttgctg ctctcacctc tggtacaact ttcgttaccg attaccctga 5940

ttcccttggt aagagacctc agggtgacct tcttgaagcc ctcgaaagac ttggtgcttg 6000

ggtgtcctcc aacgatggta gactccctat ctccgtttcc ggtccagtta gaggtggtac 6060

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tcttcttcct gacggactcg aacttagact caccggtgat atcaagtccc acgctcctct 6180

tagacagaca cttgacaccc tctctgattt cggtgttaga gctactgcct ccgatgacct 6240

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tgattaccct ggttccgctg ctatccttac cgccgctgct cttctcccag gtgaggttag 6360

actttctaac cttagagaac acgacctcca gggtgagaag gaagctgtga acgttcttag 6420

agagatgggt gctgatatcg ttagagaagg tgataccctt accgtgagag gtggtagacc 6480

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ttggggtatc tttaaatact gtagaaaaga ggaaggaaat aataaatggc taaaatgaga 7620

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agcaatctgc tcatgagtga ggccgatggc gtcctttgct cggaagagta tgaagatgaa 7920

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tttattgatc ttgggagaag cggcagggcg gacaagtggt atgacattgc cttctgcgtc 8280

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gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct 8700

ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg 8760

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gcttcgccct cgatcaggtt gcggtagcgc atgactagga tcgggccagc ctgccccgcc 10080

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cagaacttct tgaactctcc ggcgctgcca ctgcgttcgt agatcgtctt gaacaaccat 10200

ctggcttctg ccttgcctgc ggcgcggcgt gccaggcggt agagaaaacg gccgatgccg 10260

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gtttctacca ggtcgtcttt ctgctttccg ccatcggctc gccggcagaa cttgagtacg 10560

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gcctccttta gccgctaaaa ttcatctact catttattca tttgctcatt tactctggta 11280

gctgcgcgat gtattcagat agcagctcgg taatggtctt gccttggcgt accgcgtaca 11340

tcttcagctt ggtgtgatcc tccgccggca actgaaagtt gacccgcttc atggctggcg 11400

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ttagcgtgtt tgtgcttttg ctcattttct ctttacctca ttaactcaaa tgagttttga 11520

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cctgattggg agaaaataaa atattatatt ttactggatg aattgtttta gtacctagaa 9360

tgcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 9420

aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 9480

aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 9540

ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg 9600

tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc 9660

ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga 9720

cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc 9780

agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc 9840

gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca 9900

ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg 9960

tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 10020

tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 10080

cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag 10140

tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa 10200

gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 10260

atatggtgca ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gtatacactc 10320

cgctatcgct acgtgactgg gtcatggctg cgccccgaca cccgccaaca cccgctgacg 10380

cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg 10440

ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgagg cagggtgcct 10500

tgatgtgggc gccggcggtc gagtggcgac ggcgcggctt gtccgcgccc tggtagattg 10560

cctggccgta ggccagccat ttttgagcgg ccagcggccg cgataggccg acgcgaagcg 10620

gcggggcgta gggagcgcag cgaccgaagg gtaggcgctt tttgcagctc ttcggctgtg 10680

cgctggccag acagttatgc acaggccagg cgggttttaa gagttttaat aagttttaaa 10740

gagttttagg cggaaaaatc gccttttttc tcttttatat cagtcactta catgtgtgac 10800

cggttcccaa tgtacggctt tgggttccca atgtacgggt tccggttccc aatgtacggc 10860

tttgggttcc caatgtacgt gctatccaca ggaaagagac cttttcgacc tttttcccct 10920

gctagggcaa tttgccctag catctgctcc gtacattagg aaccggcgga tgcttcgccc 10980

tcgatcaggt tgcggtagcg catgactagg atcgggccag cctgccccgc ctcctccttc 11040

aaatcgtact ccggcaggtc atttgacccg atcagcttgc gcacggtgaa acagaacttc 11100

ttgaactctc cggcgctgcc actgcgttcg tagatcgtct tgaacaacca tctggcttct 11160

gccttgcctg cggcgcggcg tgccaggcgg tagagaaaac ggccgatgcc gggatcgatc 11220

aaaaagtaat cggggtgaac cgtcagcacg tccgggttct tgccttctgt gatctcgcgg 11280

tacatccaat cagctagctc gatctcgatg tactccggcc gcccggtttc gctctttacg 11340

atcttgtagc ggctaatcaa ggcttcaccc tcggataccg tcaccaggcg gccgttcttg 11400

gccttcttcg tacgctgcat ggcaacgtgc gtggtgttta accgaatgca ggtttctacc 11460

aggtcgtctt tctgctttcc gccatcggct cgccggcaga acttgagtac gtccgcaacg 11520

tgtggacgga acacgcggcc gggcttgtct cccttccctt cccggtatcg gttcatggat 11580

tcggttagat gggaaaccgc catcagtacc aggtcgtaat cccacacact ggccatgccg 11640

gccggccctg cggaaacctc tacgtgcccg tctggaagct cgtagcggat cacctcgcca 11700

gctcgtcggt cacgcttcga cagacggaaa acggccacgt ccatgatgct gcgactatcg 11760

cgggtgccca cgtcatagag catcggaacg aaaaaatctg gttgctcgtc gcccttgggc 11820

ggcttcctaa tcgacggcgc accggctgcc ggcggttgcc gggattcttt gcggattcga 11880

tcagcggccg cttgccacga ttcaccgggg cgtgcttctg cctcgatgcg ttgccgctgg 11940

gcggcctgcg cggccttcaa cttctccacc aggtcatcac ccagcgccgc gccgatttgt 12000

accgggccgg atggtttgcg accgtcacgc cgattcctcg ggcttggggg ttccagtgcc 12060

attgcagggc cggcagacaa cccagccgct tacgcctggc caaccgcccg ttcctccaca 12120

catggggcat tccacggcgt cggtgcctgg ttgttcttga ttttccatgc cgcctccttt 12180

agccgctaaa attcatctac tcatttattc atttgctcat ttactctggt agctgcgcga 12240

tgtattcaga tagcagctcg gtaatggtct tgccttggcg taccgcgtac atcttcagct 12300

tggtgtgatc ctccgccggc aactgaaagt tgacccgctt catggctggc gtgtctgcca 12360

ggctggccaa cgttgcagcc ttgctgctgc gtgcgctcgg acggccggca cttagcgtgt 12420

ttgtgctttt gctcattttc tctttacctc attaactcaa atgagttttg atttaatttc 12480

agcggccagc gcctggacct cgcgggcagc gtcgccctcg ggttctgatt caagaacggt 12540

tgtgccggcg gcggcagtgc ctgggtagct cacgcgctgc gtgatacggg actcaagaat 12600

gggcagctcg tacccggcca gcgcctcggc aacctcaccg ccgatgcgcg tgcctttgat 12660

cgcccgcgac acgacaaagg ccgcttgtag ccttccatcc gtgacctcaa tgcgctgctt 12720

aaccagctcc accaggtcgg cggtggccca tatgtcgtaa gggcttggct gcaccggaat 12780

cagcacgaag tcggctgcct tgatcgcgga cacagccaag tccgccgcct ggggcgctcc 12840

gtcgatcact acgaagtcgc gccggccgat ggccttcacg tcgcggtcaa tcgtcgggcg 12900

gtcgatgccg acaacggtta gcggttgatc ttcccgcacg gccgcccaat cgcgggcact 12960

gccctgggga tcggaatcga ctaacagaac atcggccccg gcgagttgca gggcgcgggc 13020

tagatgggtt gcgatggtcg tcttgcctga cccgcctttc tggttaagta cagcgataac 13080

cttcatgcgt tccccttgcg tatttgttta tttactcatc gcatcatata cgcagcgacc 13140

gcatgacgca agctgtttta ctcaaataca catcaccttt ttagacggcg gcgctcggtt 13200

tcttcagcgg ccaagctggc cggccaggcc gccagcttgg catcagacaa accggccagg 13260

atttcatgca gccgcacggt tgagacgtgc gcgggcggct cgaacacgta cccggccgcg 13320

atcatctccg cctcgatctc ttcggtaatg aaaaacggtt cgtcctggcc gtcctggtgc 13380

ggtttcatgc ttgttcctct tggcgttcat tctcggcggc cgccagggcg tcggcctcgg 13440

tcaatgcgtc ctcacggaag gcaccgcgcc gcctggcctc ggtgggcgtc acttcctcgc 13500

tgcgctcaag tgcgcggtac agggtcgagc gatgcacgcc aagcagtgca gccgcctctt 13560

tcacggtgcg gccttcctgg tcgatcagct cgcgggcgtg cgcgatctgt gccggggtga 13620

gggtagggcg ggggccaaac ttcacgcctc gggccttggc ggcctcgcgc ccgctccggg 13680

tgcggtcgat gattagggaa cgctcgaact cggcaatgcc ggcgaacacg gtcaacacca 13740

tgcggccggc cggcgtggtg gtgtcggccc acggctctgc caggctacgc aggcccgcgc 13800

cggcctcctg gatgcgctcg gcaatgtcca gtaggtcgcg ggtgctgcgg gccaggcggt 13860

ctagcctggt cactgtcaca acgtcgccag ggcgtaggtg gtcaagcatc ctggccagct 13920

ccgggcggtc gcgcctggtg ccggtgatct tctcggaaaa cagcttggtg cagccggccg 13980

cgtgcagttc ggcccgttgg ttggtcaagt cctggtcgtc ggtgctgacg cgggcatagc 14040

ccagcaggcc agcggcggcg ctcttgttca tggcgtaatg tctccggttc tagtcgcaag 14100

tattctactt tatgcgacta aaacacgcga caagaaaacg ccaggaaaag ggcagggcgg 14160

c 14161

Claims (4)

1.一种生产血红素结合蛋白的方法，其特征在于所述方法是将含血红素结合蛋白基因表达框的表达载体转入大豆基因组中并表达，获得富含血红素结合蛋白的大豆种子，分离提取，获得血红素结合蛋白；所述血红素结合蛋白包括血红蛋白或肌红蛋白；

所述血红素结合蛋白基因表达框组成为下列之一：（1）由pAtUbi10启动子、血红蛋白编码基因、终止子、烟草RB7核基质结合区调控序列MAR组成，核苷酸序列如SEQ ID NO:5中478-4248 bp；（2）由pAtUbi10启动子、肌红蛋白编码基因、终止子、烟草RB7核基质结合区调控序列MAR组成，核苷酸序列如SEQ ID NO:6中478-4275 bp所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述表达载体包含血红素结合蛋白基因表达框和筛选标记基因表达框；筛选标记基因表达框包括耐草甘膦基因表达框、耐啶嘧磺隆基因表达框或耐草铵膦基因表达框。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述耐草甘膦基因表达框中草甘膦抗性基因g10evo epsps的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5中5661-6977 bp所示，启动子为花椰菜花叶病毒35s的启动子，终止子为花椰菜花叶病毒35s终止子。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述表达载体的T-DNA元件组成为下列之一：（1）由pAtUbi10启动子、血红蛋白编码基因、终止子、烟草RB7核基质结合区调控序列MAR、花椰菜花叶病毒35s启动子、抗草甘膦基因g10evo epsps、花椰菜花叶病毒35s终止子组成，核苷酸序列如SEQ ID NO:5中205-7266 bp；（2）由pAtUbi10启动子、肌红蛋白编码基因、终止子、烟草RB7核基质结合区调控序列MAR、花椰菜花叶病毒35s启动子、抗草甘膦基因g10evo epsps、花椰菜花叶病毒35s终止子组成，核苷酸序列如SEQ ID NO:6中205-7293 bp所示。