CN111286514A - 一种利用基因编辑精准创制小麦waxy基因突变体材料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用基因编辑精准创制小麦waxy基因突变体材料的方法。本发明的方法通过构建具有敲除waxy基因功能的表达载体pBUE411‑waxy，通过基因转化过程降低胚乳中waxy基因的表达的水平。本发明通过特异性引导单链sgRNA的设计，构建了可以实现waxy基因体内编辑的表达载体，可以敲除小麦waxy基因。在实际应用中，通过一个基因转化过程，就可实现基因组水平胚乳特异表达waxy基因的沉默。为利用基因工程技术改良小麦淀粉特性，提高小麦加工品质提供有力的工具。

Description

一种利用基因编辑精准创制小麦waxy基因突变体材料的方法

技术领域

本发明涉及一种利用基因编辑精准创制小麦waxy基因突变体材料的方法，属于基因工程领域。

背景技术

淀粉是小麦籽粒的重要组成部分，分为直链淀粉和支链淀粉两类。胚乳淀粉一般由20％～30％直链淀粉和70％～80％支链淀粉组成。在胚乳中合成直链淀粉的关键酶是颗粒结合型淀粉合成酶(Granule-bound starch synthase，GBSS)，也叫糯蛋白(Waxyprotein)。控制3个waxy位点的wx-A1，wx-B1和wx-D1基因分别位于染色体的7As、4AL和7Ds上。3个基因的核苷酸序列长度分别是2781、2794、2862bp，基因的完全编码区含有11个外显子和10个内含子，在核苷酸序列上三个糯基因彼此之间的同源性达到95％以上。这些基因的缺失、突变或遗传表达障碍会使胚乳中直链淀粉的含量减少，支链淀粉含量上升，小麦胚乳表现为糯性。直链淀粉含量接近于或不含直链淀粉的小麦称为全糯质小麦。糯小麦因有高于普通小麦的支链淀粉含量，在食品和工业方面有很大的应用价值和潜力，自发现后就成为各国小麦研究的重点之一。通过多年的努力，人们在糯小麦的遗传机理、育种理论和方法、品质性状及利用等方面的研究都取得了很大的进展。人们对小麦种质资源进行了大规模的鉴定，但除发现有部分糯质小麦突变体(例如，sturdy缺失wx-A1蛋白亚基，Eradu缺失Wx-B1蛋白亚基，关东107缺失Wx-A1和WX-B1蛋白亚基，内乡白火麦缺失wx-D1蛋白亚基等)外，四倍体和六倍体小麦中至今还未发现全糯质天然突变体，而在二倍体玉米、大麦、水稻等谷类作物已发现有全糯质天然突变体的存在。本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，人工创造小麦waxy基因缺失的突变体材料，为小麦淀粉特性研究和新品种改良提供宝贵的基础材料。

发明内容

本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种利用基因编辑精准创制小麦waxy基因突变体材料的方法。本发明的方法通过构建具有敲除waxy基因功能的表达载体pBUE411-waxy，通过基因转化过程降低胚乳中waxy基因的表达的水平。

一种具有敲除waxy基因功能的pBUE411-waxy双元载体，包括表达盒A和表达盒B；

所述表达盒A具体自上游至下游依次包括如下元件：所述来自小麦的TaU3启动子A，所述waxy基因的sgRNA、终止子A；

所述表达盒B具体自上游至下游依次包括如下元件：所述启动子B、所述玉米Cas9编码序列、所述终止子B。

进一步的，所述waxy基因的sgRNA的序列如SEQ10所示；

所述玉米Cas9编码序列如SEQ13所示；

所述启动子A的序列如SEQ3所示；

所述启动子B序列如SEQ4所示；

所述终止子A序列如SEQ5所示；

所述终止子B序列如SEQ6所示。

进一步的，所述表达盒A具体可如序列SEQ7所示；

所述表达盒B具体可如序列SEQ8所示；

所述表达盒A位于所述表达盒B的上游，表达盒A和表达盒B相互串联。

进一步的，所述载体还含有抗性标记基因，如bar基因；所述载体的核苷酸序列如SEQ9所示。

进一步的，上述pBUE411-waxy双元载体的构建方法包括如下步骤：

S11根据靶向Waxy基因设计其sgRNA，sgRNA的寡核苷酸对应的是waxy-gR1-TaU3-F和waxy-gR1-TaU3-R，即waxy-gR1-TaU3-F序列如SEQ1所示，waxy-gR1-TaU3-R序列如SEQ2所示；

S12将步骤S11合成的sgRNA的2条oligo进行磷酸化和退火形成双链，获得带有粘性末端的双链sgRNA；

S13利用限制性内切酶BsaI酶切pBUE411载体，回收含有所述启动子A、所述终止子A、所述启动子B、所述终止子B的载体片段；

S14将步骤S13回收的pBUE411载体片段和步骤S12获得的双链sgRNA进行通过T4连接酶进行连接反应，获得最终的pBUE411-waxy双元载体。

进一步的，所述Waxy基因可为GENBANK ACCESSION NUMBER：KF007194.1(VERSIONAHA61545.1)所示的DNA。

含有所述pBUE411-waxy双元载体的转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述pBUE411-waxy双元载体可应用于降低小麦胚乳中waxy基因表达水平。

所述pBUE411-waxy双元载体在小麦面粉色泽改良中的应用。

所述pBUE411-waxy双元载体在培育转基因小麦中的应用；与转基因前小麦相比，所述转基因小麦种子的直链淀粉含量下降，糯性增加。

本发明还保护DNA片段Ⅰ，所述DNA片段Ⅰ由waxy基因的引导sgRNA组成，其序列具体可如序列SEQ10所示

一种利用基因编辑精准创制小麦waxy基因突变体材料的方法，包括如下步骤：

S1构建一种pBUE411-waxy双元载体；

S2将步骤S1获得的pBUE411-waxy双元载体通过农杆菌转化到普通小麦中，获得转基因小麦。

有益效果：

本发明通过特异性引导单链sgRNA的设计，构建了可以实现waxy基因体内编辑的表达载体，可以敲除小麦waxy基因。在实际应用中，通过一个基因转化过程，就可实现基因组水平胚乳特异表达waxy基因的沉默。为利用基因工程技术改良小麦淀粉特性，提高小麦加工品质提供有力的工具。

附图说明

图1Waxy基因的编码区。

图2pBUE411载体BsaI酶切电泳图。

图3靶向waxy基因CRISPR/Cas9重组载体pBUE411-waxy测序结果。

图4Bar试纸条检测转基因小麦植株。

图5野生型小麦waxy基因的推导氨基酸序列。

图6突变型小麦waxy基因的推导氨基酸序列。

图7野生型和突变型的waxy基因核苷酸序列比对图。

图8野生型和突变型的waxy基因的推导氨基酸序列比对图。

图9Hi-tom检测转基因株系waxy基因编辑位点图。

图10基因编辑株系中waxy基因的表达量分析。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。PCR扩增所需的高保真酶、DNA片段连接所需的T4连接酶、酶切片段回收所需的凝胶回收试剂盒以及质粒提取试剂盒均购自大连宝生物公司。质粒提取试剂盒购自天根生物，培养基配制所需的无机盐购自国药集团，维生素和抗生素以及激素购自Sigma公司。植物CRISPR/Cas9基因编辑载体为pBUE411,含有小麦U3启动子TaU3，用以启动sgRNA，Cas9p模拟了禾本科植物基因具有5’端GC含量较高的特征，是设计合成的植物优化密码子基因。本实验室所用的大肠杆菌菌株是E.coli DH5α。

T4连接酶、DNA Marker DL2000等试剂购自Takara公司；FastPfu、2*Taq Mix、DH5α等购自北京全式金公司；限制性内切酶BsaI-HF购自NEB公司；所使用的引物由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成，序列如下：

表1本研究中使用的引物

小麦品种Jw1是山东省农科院作物所自行选育的具有良好组织培养能力的新种质，公众可从山东省农业科学院作物研究所获得

质粒pBUE411(17430bp)，由中国农业大学孙其信课题组提供；公众可从中国农业大学获得。

实验例1表达载体的构建

1.靶向Waxy的sgRNA的设计

在小麦品种Fielder里扩增Waxy基因的序列，扩增序列见图1所示，下划线部分标记序列为靶向Waxy基因的sgRNA序列，下划线部分最后三个序列为PAM序列，与NCBI数据库中的小麦的该基因序列100％相似。该基因全长1815个碱基，通过网站CRISPRdirect(http://crispr.dbcls.jp/)在Waxy基因的编码区寻找1个适合的打靶位点，在PAM结构前找到19bp序列片段设定为靶序列，sgRNA序列选定为GACCAGTACAAGGACGCCT。

2.sgRNA的退火及双链的形成

Waxy基因的sgRNA的2条oligo是由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成，其中sgRNA的寡核苷酸对应的是waxy-gR1-TaU3-F和waxy-gR1-TaU3-R(表1)，引物中的下划线碱基部分是与pBUE411载体中的序列匹配。分别将sgRNA的2条oligo进行磷酸化，直接退火形成双链，体系为：waxy-gR1-TaU3-F(10μM)：4μL,waxy-gR1-TaU3-R(10uM)：4μL,10×T4PNKbuffer:1.5μL,PNK:1μL,ATP:1μL,ddH₂O补足15μL。程序在PCR仪中按下列条件运行：37℃,30min；95℃,5min；ramp to25℃at 5℃/min(0.08℃/s)。或者是沸水中煮5min，之后自然冷却至室温。

3.pBUE411载体的线性化

用BsaI的内切酶酶切pBUE411载体3h，BsaI酶切电泳图如图2所示，1为pBUE411用BsaI酶切；2为DL2000 Marker；3为1kb Marker，电泳后回收线性载体片段，回收含有所述启动子A、所述终止子A、所述启动子B、所述终止子B的载体片段

4.pBUE411载体与sgRNA的连接反应

连接反应体系为：5×ligation Buffer 2μL，annealed oligo duplex 4μL，pBUE411/BsaI 2ul(100ng)，T4 ligase 1μL，ddH₂O补足10μL，25℃30min进行连接反应。

5.转化

将连接产物转化大肠杆菌，重组质粒经转化到DH5α感受态细胞，之后于LB(kan)平板上培养至克隆长出后，挑单克隆进行菌液PCR鉴定及测序，引物用的是pBUE411-F和pBUE411-R。测序结果(如图3)检测到了sgRNA的靶序列，同时在靶序列上游都检测到了TaU3启动子序列，测序结果说明sgRNA表达盒构建成功，并成功的组装进入pBUE411双元表达载体，证明了Waxy的CRISPR/Cas9基因编辑载体构建成功。

实验例2基因编辑载体的转化普通小麦

1.培养基配制：见文献Kan Wang(ed.),Agrobacterium Protocals:Volume 1,Methods in Molecular Biology,vol.1223DOI10.007/978-1-4939-1695-5_15,SpringScience+Businedd Media New York 2015

2.农杆菌转化：取授粉15天左右的小麦穗子，取粒剥胚。在试验前一天农杆菌悬浮液摇菌，160r，28度培养24小时，穗子准备好后，开始准备农杆菌悬浮液取1ml菌液于1.5ml离心管中，加入1.4ul乙酰丁香酮(0.1M)混匀。加入准备好的菌液侵染5分钟后放到共培培养基上，23度暗培养3天。共培后放到休息培养基上暗培养5天，25度。将愈伤转移至筛选培养基1上。用封口膜封好培养皿，在25.5度培养箱中暗培养2周。将愈伤切割后转移到筛选培养基2上。

用封口膜封好培养皿，在25.5度培养箱中暗培养2周。愈伤切割筛选2周后，表现有抗性的愈伤转移到再生培养基上。抗性愈伤一般有绿芽或者绿点，或者有美丽的米黄色球状结构。

糊状的和褐色的愈伤不要转移。有增生的愈伤可以再切成更小的愈伤。来自同一个愈伤的小块应该再摆到同一条线上。注意愈伤的方向，例如，绿芽和绿点朝上。

封好培养皿，放到25度培养箱中光照(16h)培养2周。再生2周后，将健康成长的小苗转移到新的抗性再生小盒里。待苗长到一定大小可以取样检测。

3.转基因苗的突变体检测

3.1T0代转基因株系阳性鉴定及突变体筛选

由于此次转化所用载体上T-DNA区域有cas9、bar和gRNA三个表达框，其中bar基因的表达检测已经非常成熟，已经有商业化的检测试剂条，样品经过粗磨后用试剂条在10分钟内就可以判断是否带有bar基因，比PCR扩增快速高效。因此，我们以未转基因植株作为阴性对照，利用bar基因检测试剂盒quickstix^TM对转基因小麦T0植株进行检测，具体操作如下：

取转基因苗3-5cm,放入1.5m离心管中，用研磨棒研磨后加入Buffer 500μL，插入Bar试纸条，静置5min，根据试条显示带数纪录数据，2条带表示阳性，1条带代表阴性。上述试剂盒购自麦蒂森科技有限公司。

筛选阳性转基因苗子结果如图4所示，样品1-9为T0代再生苗，10为阴性对照，11为阳性对照，其中样品1,2,3,4,6,7,8,9出现两条带，与阳性对照11结果一致，为阳性苗；5出现一条带，与阴性对照一致，数字1-9，分别代表eWaxy-01，-02，-03,-04，-05，06，-07，-08，-09。

3.2T0代转基因植株Waxy基因的特异性扩增和突变体鉴定

目标基因编辑是否成功需要测序进行鉴定，本实验采用天津诺禾致源公司生产的Hi-TOM基因编辑位点检测试剂盒。该试剂盒通过PCR法自动完成高通量建库过程，并用Hi-TOM在线软件直接解析出多样品多位点的变异信息。利用靶向序列两侧的特异性引物(表1中的Primer-F和Primer-R)对Waxy进行扩增，扩增产物建库后送到诺禾致源测序。目的基因小麦Waxy基因的野生型核苷酸序列如SEQ11所示，其推导的氨基酸序列如图5所示，突变体的目的基因核苷酸序列如SEQ12所示，其推导的氨基酸序列如图6所示，经比对，eWaxy-2发生在+376处的核苷酸增加了1个碱基T，在突变序列的+429处出现TAA，变成了终止密码子，造成蛋白质翻译的提前终止，核苷酸序列的比对结果如图7所示，标记为加粗下划线的部分为野生型和突变体有差异的部分，氨基酸序列比对结果如图8所示，标记为浅灰色的部分为野生型和突变体有差异的部分。

第一轮PCR反应体系：以转pBUE411-waxy基因的小麦植株叶片DNA为模板1μL，试剂盒中的2×Taq Master Mix 10μL,Primer-F和Primer-R(表1)(10μM)各0.5μL，Nuclease-free Water补足体积至20μL。PCR反应条件为：94℃变性2min；94℃变性30s，65℃复性30s，72℃延伸20s，共33个循环；最后72℃延伸5min。PCR结束后取5μL琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，确保目标产物存在且特异性良好。

之后进行第二轮PCR反应，试剂盒中的Hi-TOM Mix 12μL，以第一轮PCR产物为模板加入1μL，Nuclease-free Water补足体积至20μL。PCR反应程序：94℃变性2min；94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸25s，共33个循环；最后72℃延伸5min。

如图9所示，样品1-12为不同的转基因株系，M为DL2000 marker，灰色突出显示的是突变位点碱基变化，在此处缺失一个碱基G。

3.3基因编辑株系中waxy基因的表达量分析

应用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒(天根，北京，中国)提取转基因植株和对照植株不同发育时期(7、14、21和28DPA)籽粒总RNA，检测各转基因株系在籽粒不同发育时期PSY基因的相对表达量。基于小麦籽粒waxy同源基因cDNA序列间的保守性和差异性，设计能同时扩增A、B、D基因组同源基因的保守性引物，用于qRT-PCR检测，普通小麦β-actin基因作为内参基因。qRT-PCR反应体系：2×SYBR Green Mix 5μL,Primer-F和Primer-R(表1)(10μM)各0.5μL，50ng cDNA,Nuclease-free Water补足体积至10μL。反应程序：95℃变性5min；95℃变性15s，60℃复性20s，72℃延伸20s，共40个循环。每个转基因株系选取3个生物学重复，每个样本3次技术重复。如图10所示(*表示P<0.05，WT表示野生型)，结果表明，基因编辑株系中waxy基因的表达量显著降低。

表2引物序列(二)

3.4直链淀粉含量测定

小麦直链淀粉含量测定参照《谷物籽粒粗淀粉测定法(GB7648-87)》的方法，步骤为：

样品分散：称取0.1g粗淀粉的样品，加入1mL无水乙醇，充分湿润样品，再加入9mL1M的NaOH溶液，于沸水浴中分散10min，迅速冷却，用蒸馏水定容至100mL。

脱脂:取20mL分散液于50mL试管中，加入7-10mL石油醚，间歇摇动10min，静止15min，分层后洗去上部石油醚层。

测定：吸取脱脂后的分散液5mL于100mL容量瓶中，再加入1M乙酸溶液1mL和碘试剂2mL，用蒸馏水定容至100mL。显色10min后，用分光光度计在620nm处读取吸光度。直链淀粉遇碘变蓝，而直链淀粉遇碘变红。根据相应的混合校准曲线求出直链淀粉含量或回归方程。

每个转基因株系测定3个生物学重复，每个样品每个样品重复检测两次，如果两次检测结果相差超过10％，则需进行重复测定。经过测定，与未转基因对照植株相比，基因编辑株系的直链淀粉含量显著下降，从16.3％下降到8.9％，成功获得了小麦waxy基因突变体。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农业科学院作物研究所

<120> 一种利用基因编辑精准创制小麦waxy基因突变体材料的方法

<130> 0

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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ggtaatgtgt gaatattata tctgtcgtgc aaaattgcct ggcctgcaca attgctgtta 120

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agaaaaagcc atacgagact gatgtctctc agatgggccg ggatctgtct atctagcagg 360

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 60

agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 120

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ttacttctgc ag 1992

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gtacggcaca gcatttggaa ttaaagggtg tgatcgatac tgcttgctgc t 291

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<211> 571

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

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atatgaggag taaaacactt gtagttgtac cattatgctt attcactagg caacaaatat 480

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<213> 人工序列

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ggtaatgtgt gaatattata tctgtcgtgc aaaattgcct ggcctgcaca attgctgtta 120

tagttggcgg cagggagagt tttaacattg actagcgtgc tgataatttg tgagaaataa 180

taattgacaa gtagatactg acatttgaga agagcttctg aactgttatt agtaacaaaa 240

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agaaaaagcc atacgagact gatgtctctc agatgggccg ggatctgtct atctagcagg 360

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tcatcggttt cgacaacgtt cgtcaagttc aatgcatcag tttcattgcg cacacaccag 7560

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gtgcttgtaa tttactgtgt tttttattcg gttttcgcta tcgaactgtg aaatggaaat 7680

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tgttttgagt aaaaatgtgt caaatcgtgg cctctaatga ccgaagttaa tatgaggagt 7860

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agctatctgt cacttcatca aaaggacagt agaaaaggaa ggtggcacct acaaatgcca 8880

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gcaagtggat tgatgtgata tctccactga cgtaagggat gacgcacaat cccactatcc 9060

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caccagtctc tctctacaaa tctatctctc tcgagtctac catgagccca gaacgacgcc 9180

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cgctcatgtg ttgagcatat aagaaaccct tagtatgtat ttgtatttgt aaaatacttc 9840

tatcaataaa atttctaatt cctaaaacca aaatccagta ctaaaatcca gatcccccga 9900

attaattcgg cgttaattca gtacattaaa aacgtccgca atgtgttatt aagttgtcta 9960

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<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<210> 11

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<212> DNA

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gaagtgccga ggatcctgaa cctcgacaat aacccctact tttctgggcc ctacggggag 660

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tcgtaccagg gccgcttctc cttcgacgac ttcgcgcagc tcaacctgcc cgacaggttc 840

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agcgttgact gcaacgtggt ggagccggcc gacgtgaaga aggtggtcac caccctgaag 1620

cgcgccgtca aggtcgtcgg cacgccggcg taccatgaga tggtcaagaa ctgcatgata 1680

caggatctct cctggaaggg gcctgccaag aactgggagg acgtgcttct ggaactgggg 1740

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<212> DNA

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cctgcggcct catccagctc cagggaatgc gctacggaac gccgtgcgcc tgcgcgtcga 1500

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gcgttgactg caacgtggtg gagccggccg acgtgaagaa ggtggtcacc accctgaagc 1620

gcgccgtcaa ggtcgtcggc acgccggcgt accatgagat ggtcaagaac tgcatgatac 1680

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tggaggggag cgagccgggc atcgtcggcg aggagatcgc gccgctcgcc ctggagaacg 1800

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cattccatca agaagaatct cattggcgct ctcctgttcg acagcggcga gacggctgag 180

gctacgcggc tcaagcgcac cgcccgcagg cggtacacgc gcaggaagaa tcgcatctgc 240

tacctgcagg agattttctc caacgagatg gcgaaggttg acgattcttt cttccacagg 300

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aacattgtcg acgaggttgc ctaccacgag aagtacccta cgatctacca tctgcggaag 420

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cgcctcgaga acctgatcgc ccagctgccg ggcgagaaga agaacggcct gttcgggaat 720

ctcattgcgc tcagcctggg gctcacgccc aacttcaagt cgaatttcga tctcgctgag 780

gacgccaagc tgcagctctc caaggacaca tacgacgatg acctggataa cctcctggcc 840

cagatcggcg atcagtacgc ggacctgttc ctcgctgcca agaatctgtc ggacgccatc 900

ctcctgtctg atattctcag ggtgaacacc gagattacga aggctccgct ctcagcctcc 960

atgatcaagc gctacgacga gcaccatcag gatctgaccc tcctgaaggc gctggtcagg 1020

cagcagctcc ccgagaagta caaggagatc ttcttcgatc agtcgaagaa cggctacgct 1080

gggtacattg acggcggggc ctctcaggag gagttctaca agttcatcaa gccgattctg 1140

gagaagatgg acggcacgga ggagctgctg gtgaagctca atcgcgagga cctcctgagg 1200

aagcagcgga cattcgataa cggcagcatc ccacaccaga ttcatctcgg ggagctgcac 1260

gctatcctga ggaggcagga ggacttctac cctttcctca aggataaccg cgagaagatc 1320

gagaagattc tgactttcag gatcccgtac tacgtcggcc cactcgctag gggcaactcc 1380

cgcttcgctt ggatgacccg caagtcagag gagacgatca cgccgtggaa cttcgaggag 1440

gtggtcgaca agggcgctag cgctcagtcg ttcatcgaga ggatgacgaa tttcgacaag 1500

aacctgccaa atgagaaggt gctccctaag cactcgctcc tgtacgagta cttcacagtc 1560

tacaacgagc tgactaaggt gaagtatgtg accgagggca tgaggaagcc ggctttcctg 1620

tctggggagc agaagaaggc catcgtggac ctcctgttca agaccaaccg gaaggtcacg 1680

gttaagcagc tcaaggagga ctacttcaag aagattgagt gcttcgattc ggtcgagatc 1740

tctggcgttg aggaccgctt caacgcctcc ctggggacct accacgatct cctgaagatc 1800

attaaggata aggacttcct ggacaacgag gagaatgagg atatcctcga ggacattgtg 1860

ctgacactca ctctgttcga ggaccgggag atgatcgagg agcgcctgaa gacttacgcc 1920

catctcttcg atgacaaggt catgaagcag ctcaagagga ggaggtacac cggctggggg 1980

aggctgagca ggaagctcat caacggcatt cgggacaagc agtccgggaa gacgatcctc 2040

gacttcctga agagcgatgg cttcgcgaac cgcaatttca tgcagctgat tcacgatgac 2100

agcctcacat tcaaggagga tatccagaag gctcaggtga gcggccaggg ggactcgctg 2160

cacgagcata tcgcgaacct cgctggctcg ccagctatca agaaggggat tctgcagacc 2220

gtgaaggttg tggacgagct ggtgaaggtc atgggcaggc acaagcctga gaacatcgtc 2280

attgagatgg cccgggagaa tcagaccacg cagaagggcc agaagaactc acgcgagagg 2340

atgaagagga tcgaggaggg cattaaggag ctggggtccc agatcctcaa ggagcacccg 2400

gtggagaaca cgcagctgca gaatgagaag ctctacctgt actacctcca gaatggccgc 2460

gatatgtatg tggaccagga gctggatatt aacaggctca gcgattacga cgtcgatcat 2520

atcgttccac agtcattcct gaaggatgac tccattgaca acaaggtcct caccaggtcg 2580

gacaagaacc ggggcaagtc tgataatgtt ccttcagagg aggtcgttaa gaagatgaag 2640

aactactggc gccagctcct gaatgccaag ctgatcacgc agcggaagtt cgataacctc 2700

acaaaggctg agaggggcgg gctctctgag ctggacaagg cgggcttcat caagaggcag 2760

ctggtcgaga cacggcagat cactaagcac gttgcgcaga ttctcgactc acggatgaac 2820

actaagtacg atgagaatga caagctgatc cgcgaggtga aggtcatcac cctgaagtca 2880

aagctcgtct ccgacttcag gaaggatttc cagttctaca aggttcggga gatcaacaat 2940

taccaccatg cccatgacgc gtacctgaac gcggtggtcg gcacagctct gatcaagaag 3000

tacccaaagc tcgagagcga gttcgtgtac ggggactaca aggtttacga tgtgaggaag 3060

atgatcgcca agtcggagca ggagattggc aaggctaccg ccaagtactt cttctactct 3120

aacattatga atttcttcaa gacagagatc actctggcca atggcgagat ccggaagcgc 3180

cccctcatcg agacgaacgg cgagacgggg gagatcgtgt gggacaaggg cagggatttc 3240

gcgaccgtca ggaaggttct ctccatgcca caagtgaata tcgtcaagaa gacagaggtc 3300

cagactggcg ggttctctaa ggagtcaatt ctgcctaagc ggaacagcga caagctcatc 3360

gcccgcaaga aggactggga tccgaagaag tacggcgggt tcgacagccc cactgtggcc 3420

tactcggtcc tggttgtggc gaaggttgag aagggcaagt ccaagaagct caagagcgtg 3480

aaggagctgc tggggatcac gattatggag cgctccagct tcgagaagaa cccgatcgat 3540

ttcctggagg cgaagggcta caaggaggtg aagaaggacc tgatcattaa gctccccaag 3600

tactcactct tcgagctgga gaacggcagg aagcggatgc tggcttccgc tggcgagctg 3660

cagaagggga acgagctggc tctgccgtcc aagtatgtga acttcctcta cctggcctcc 3720

cactacgaga agctcaaggg cagccccgag gacaacgagc agaagcagct gttcgtcgag 3780

cagcacaagc attacctcga cgagatcatt gagcagattt ccgagttctc caagcgcgtg 3840

atcctggccg acgcgaatct ggataaggtc ctctccgcgt acaacaagca ccgcgacaag 3900

ccaatcaggg agcaggctga gaatatcatt catctcttca ccctgacgaa cctcggcgcc 3960

cctgctgctt tcaagtactt cgacacaact atcgatcgca agaggtacac aagcactaag 4020

gaggtcctgg acgcgaccct catccaccag tcgattaccg gcctctacga gacgcgcatc 4080

gacctgtctc agctcggggg cgactga 4107

Claims (10)

1.一种具有敲除waxy基因功能的pBUE411-waxy双元载体，其特征在于，包括表达盒A和表达盒B；

所述表达盒A具体自上游至下游依次包括如下元件：所述来自小麦的TaU3启动子A，所述waxy基因的sgRNA、终止子A；

所述表达盒B具体自上游至下游依次包括如下元件：所述启动子B、所述玉米Cas9编码序列、所述终止子B；

所述waxy基因的sgRNA的序列如SEQ10所示；

所述启动子A的序列如SEQ3所示；

所述启动子B序列如SEQ4所示；

所述终止子A序列如SEQ5所示；

所述终止子B序列如SEQ6所示。

2.如权利要求1所述的pBUE411-waxy双元载体，其特征在于，所述表达盒A具体可如序列SEQ7所示；

所述表达盒B具体可如序列SEQ8所示；

所述表达盒A位于所述表达盒B的上游，表达盒A和表达盒B相互串联。

3.如权利要求1 2所述的pBUE411-waxy双元载体，其特征在于，所述pBUE411-waxy双元载体含有抗性标记基因，所述抗性标记基因是bar基因；

所述pBUE411-waxy双元载体的核苷酸序列如SEQ9所示。

4.如权利要求1或2所述的pBUE411-waxy双元载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S11：根据靶向Waxy基因设计其sgRNA，sgRNA的寡核苷酸对应的是waxy-gR1-TaU3-F和waxy-gR1-TaU3-R，即waxy-gR1-TaU3-F序列如SEQ1所示，waxy-gR1-TaU3-R序列如SEQ2所示；

S12：将步骤S11合成的sgRNA的2条oligo进行磷酸化和退火形成双链，获得带有粘性末端的双链sgRNA；

S13：利用限制性内切酶BsaI酶切pBUE411载体，利用限制性内切酶BsaI酶切pBUE411载体，回收含有所述启动子A、所述终止子A的载体片段；利用限制性内切酶BsaI酶切pBUE411载体，回收含有所述启动子B、所述终止子B的载体片段；

S14：将步骤S13回收的pBUE411载体片段和步骤S12获得的双链sgRNA进行通过T4连接酶进行连接反应，获得最终的pBUE411-waxy双元载体。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述Waxy基因可为GENBANK ACCESSIONNUMBER：KF007194.1所示的DNA。

6.含有如权利要求1-3任一项所述的pBUE411-waxy双元载体的转基因细胞系或重组菌。

7.如权利要求1-3任一项所述的pBUE411-waxy双元载体在降低小麦胚乳中waxy基因表达水平的应用。

8.如权利要求1-3任一项所述的pBUE411-waxy双元载体在小麦淀粉改良中的应用。

9.如权利要求1-3任一项所述的pBUE411-waxy双元载体在培育转基因小麦中的应用。

10.一种利用基因编辑精准创制小麦waxy基因突变体材料的方法，包括如下步骤：

S1构建一种如权利要求1-3任一项所述的pBUE411-waxy双元载体；

S2将步骤S1获得的pBUE411-waxy双元载体通过农杆菌转化到普通小麦中，获得转基因小麦。

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