CN113862296B - 水稻茉莉素生物传感器j6v-hm的构建及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种重组表达载体J6V‑HM；所述重组表达载体J6V‑HM中含有DNA片段Ubi‑1:Jas6‑VENUS‑6HA:F2A:H2B‑mCherry；在所述DNA片段中，含有茉莉素感受元件Jas6‑VENUS‑6HA，核内参元件H2B‑mCherry，蛋白独立翻译短肽F2A，启动子Ubiquitin，本发明提供了一种水稻茉莉素生物传感器株系的构建方法，通过向水稻愈伤组织中导入载体J6V‑HM所得；含J6V‑HM的水稻可以同时观察感受元件VENUS荧光蛋白和核内参元件mCherry荧光蛋白的信号，两种荧光蛋白输出信号的比值可以示踪细胞和组织水平中茉莉素含量。

Description

水稻茉莉素生物传感器J6V-HM的构建及应用
技术领域
本发明属于水稻生物技术领域，具体涉及一种以荧光蛋白为输出信号的茉莉素生物传感器的构建及应用，特别涉及一种水稻茉莉素生物传感器J6V-HM的构建及应用。
背景技术
激素是植物生命活动调节的重要因子，在植物生长发育和对外界环境的响应中发挥着重要作用。不同时期、不同部位的激素分布和信号传递可以引起特定的基因表达，进而影响植物的生理、生长发育和抗性过程。茉莉素(jasmonate,JAs)是水稻形态建成和外界响应的关键信号之一，JAs合成代谢异常或信号转导异常的突变体将会在生物胁迫、非生物胁迫以及生殖等发育过程中出现异常。因此，在植物中开发能够实时和灵敏感知JAs含量和信号传递的生物传感器将对研究JAs在植物发育和抗逆中的功能具有重要意义，促进植物抗逆育种。
目前植物领域JAs的检测方法有液/气相色谱-质谱联用、实时定量基因扩增荧光检测系统、原位杂交以及蛋白质免疫印记法。这类检测方法不仅需要复杂的实验步骤，对操作人员的专业技术要求高，而且检测时效性差，检测尺度不精确。基因编码类生物传感器的问世为植物JAs的检测提供了更多选择，有望从细胞尺度快速检测激素的信号变化，提供时空数据。
JASMONATE ZIM DOMIAN(JAZ)蛋白是JA信号通路中的抑制因子，在JA-Ile的介导下，其Jas结构域(JAZ蛋白的一个功能域)和茉莉素受体COI1蛋白互作，随后JAZ被泛素化降解，从而解除了JAZ蛋白对茉莉素响应转录因子的抑制作用，引起茉莉素信号传递和信号响应。以“Jas结构域+荧光蛋白”作为茉莉素感受元件，有望达到基于荧光变化实现茉莉素信号的示踪，可以实现细胞和组织水平上分析茉莉素的时空分布和信号响应变化。
目前，尚未有以携带多顺反子的构建系统作为水稻茉莉素生物传感器的相关报道。本发明设计了一种基于与内参对比推测JA含量和信号响应的复合型JA生物传感器。该JA生物传感器包含JA响应元件和核内参元件，两组元件使用同一启动子，并由可以跳跃翻译形成独立蛋白的F2A短肽连接。因此，含有该构建的植株可以同时表达JA响应元件和核内参元件，通过比较两个元件所带荧光蛋白的比值来推算不同条件、不同细胞组织和发育过程中JA含量、或响应变化的相比值，在时空上快速获得JA的含量或反应的示踪图谱。
发明内容
本发明的目的在于开发一种水稻茉莉素生物传感器，具体涉及一种由多顺反子组成的复合型构建，包括同时表达茉莉素感受元件、核内参元件的构建系统及其在粳稻品种武运粳七号中应用的方法。通过两种元件的荧光值比值显示茉莉素含量和信号响应变化，在茉莉素研究和抗逆育种中具有十分重要的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供一种茉莉素生物传感器的构建系统，其特征在于：所述构建系统携带多顺反子，包括茉莉素感受元件，以及核内参元件；
所述茉莉素感受元件包括OsJAZ6基因中含有的OsJas6序列、荧光蛋白VENUS编码基因和标签HA编码基因；所述OsJas6序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，所述VENUS编码基因如序列表中SEQ ID NO.3所示，所述HA编码基因如序列表中SEQ ID NO.4所示。
所述核内参元件包括OsH2B.6编码基因、荧光蛋白mCherry编码基因和启动子Ubiquitin；所述OsH2B.6编码基因如序列表中SEQ ID NO.5所示；所述mCherry编码基因如序列表中SEQ ID NO.6所示；所述Ubiquitin如序列表中SEQ ID NO.8所示。
优选的，所述构建系统含有Ubi-1:Jas6-VENUS-6HA:F2A:H2B-mCherry片段，基因序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
其基本原理是茉莉素信号出现时，茉莉素感受元件会在26S蛋白酶体系统中降解，VENUS荧光信号减弱，进而实现对茉莉素含量和信号响应变化进行实时示踪。
所述茉莉酸感受元件和核内参元件之间用蛋白独立翻译短肽F2A编码基因序列连接，翻译后分别编码Jas6-VENUS-6HA-F2A蛋白和H2B-mCherry蛋白；所述F2A编码基因，如序列表中SEQ ID NO.7所示。
含有上述所述构建系统的编码基因的表达盒、重组表达载体、重组菌或重组细胞系也属于本发明保护范围。
本发明还提供一种重组表达载体J6V-HM；所述重组表达载体J6V-HM为Ubi-1:Jas6-VENUS-6HA:F2A:H2B-mCherry片段连接在载体pTCK303-6HA中。基因序列如序列表中SEQ ID NO.9所示。
所述Ubi-1:Jas6-VENUS-6HA:F2A:H2B-mCherry片段为位于SEQ ID NO.9所示序列的第777位至第5369位的核苷酸序列；所述OsJas6序列为位于SEQ ID NO.9所示序列的第2787位至第2870位的核苷酸序列；所述荧光蛋白VENUS编码基因为位于SEQ ID NO.9所示序列的第2922位至第3887位的核苷酸序列；所述标签HA编码基因为位于SEQ ID NO.9所示序列的第3888位至第4109位的核苷酸序列；所述蛋白独立翻译短肽F2A编码基因为位于SEQID NO.9所示序列的第4110位至第4175位的核苷酸序列；所述OsH2B.6编码基因为位于SEQID NO.9所示序列的第4182位至第4640位的核苷酸序列；所述荧光蛋白mCherry编码基因为位于SEQ ID NO.9所示序列的第4659位至第5369位的核苷酸序列；所述启动子Ubiquitin为位于SEQ ID NO.9所示序列的第777位至第2769位的核苷酸序列。
本发明还涉及上述重组表达载体在水稻抗逆育种中的应用。
本发明还提供一种水稻茉莉素生物传感器株系的构建方法，通过重组表达载体J6V-HM将编码所述J6V-HM序列导入所述水稻中实现的。
将所述重组表达载体J6V-HM导入水稻愈伤组织中，转化植株筛选，荧光信号检测，获得茉莉素生物传感器株系。
含J6V-HM的水稻可以同时观察感受元件VENUS荧光蛋白和核内参元件mCherry荧光蛋白的信号，两种荧光蛋白输出信号的比值可以示踪细胞和组织水平中茉莉素含量。此外，J6V-HM水稻还可用于生物胁迫和非生物胁迫条件下茉莉素信号感应变化的示踪，为茉莉素功能研究和抗性育种提供便利。所述水稻品种包括粳稻品种武运粳七号。
本发明还提供一种利用上述所述的生物传感器检测茉莉素的方法，通过比较茉莉素感受元件和核内参元件所带荧光蛋白信号的比值计算茉莉素的含量。
通过上述方法对水稻茉莉素含量和信号传递反应进行定性测量。
所述转化植株筛选是通过激光扫描共聚焦显微镜的双荧光检测实现的。
本发明的构建系统及所述方法在构建水稻茉莉素生物传感器株系中的应用也属于本发明的保护范围。
与现有检测茉莉素信号的方法相比，本发明具有如下有益效果：
1、本构建系统达到了多顺反子的真核表达载体转录表达的目的，实现了多个基因在同一载体上的“同时转录，独立翻译”，为基础研究应用重组表达载体进行双基因或多基因的试验提供了强有力的工具。
2、本发明构建的茉莉素生物传感器J6V-HM能够在细胞水平显示水稻茉莉素含量和信号响应变化。
3、本发明提供了一种水稻茉莉素生物传感器株系的构建方法，通过向水稻愈伤组织中导入载体J6V-HM所得；含J6V-HM的水稻可以同时观察感受元件VENUS荧光蛋白和核内参元件mCherry荧光蛋白的信号，两种荧光蛋白输出信号的比值可以示踪细胞和组织水平中茉莉素含量。含J6V-HM水稻还可用于生物胁迫和非生物胁迫条件下茉莉素信号感应变化的示踪，为茉莉素功能研究和抗性育种提供便利。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明中重组表达载体J6V-HM的构建流程图；
图2为转基因水稻J6V-HM根系VENUS通道和mCherry通道的荧光信号；其中，左图表示VENUS通道，中图表示mCherry通道，右图表示明场通道，图标等于100微米；
图3为转基因水稻J6V-HM的转录分析，其中M表示DNA分子标记，CK-表示以野生型水稻为模板，CK1表示以重组表达载体J6V-HM为模板，J6V-HM表示转基因材料J6V-HM的互补脱氧核糖核苷酸cDNA为模板；
图4为转基因水稻J6V-HM幼苗的免疫印迹实验，其中CK-表示野生型水稻总蛋白，J6V-HM表示转基因材料J6V-HM的总蛋白，Anti-HA表示用HA抗体与总蛋白进行杂交，Anti-RFP表示用RFP抗体与总蛋白进行杂交；
图5为转基因水稻J6V-HM与野生型水稻武运粳七号的表型分析，其中，图5A表示花器官表型分析，图标等于100微米；图5B表示花粉育性表型分析，图标等于100微米；图5C表示MeJA处理后抑制根系生长的表型分析；
图6为不同处理后J6V-HM根系VENUS的荧光信号，其中，图6A表示100μM MeJA处理后J6V-HM中VENUS的荧光信号，图标等于100微米；图6B表示100μM MeJA处理后mJ6V-HM中VENUS的荧光信号，图标等于100微米；图6C表示100μM MG132(蛋白酶抑制剂)处理1h后再施加100μM MeJA处理，观察并记录J6V-HM中VENUS的荧光信号，图标等于100微米；图6D为100μM MeJA处理J6V-HM根系4h后的免疫印迹实验，其中WT表示野生型水稻总蛋白，J6V-HM-(-)表示不施加MeJA处理的J6V-HM转基因材料总蛋白，J6V-HM-(+)表示施加MeJA处理4h后的J6V-HM转基因材料总蛋白；
图7为不同处理后J6V-HM根系的相对荧光强度随时间变化的情况，其中，图7A表示10μM MeJA和100μM MeJA处理后J6V-HM的荧光变化情况；图7B表示不同JA衍生物处理后J6V-HM的荧光变化情况；图7C表示不同植物激素处理后J6V-HM的荧光变化情况；
图8为损伤处理后J6V-HM的荧光变化情况及定量分析；其中图8A为损伤处理后J6V-HM的荧光变化情况；图8B为损伤处理后J6V-HM的荧光变化情况定量分析；
图9为高盐处理后J6V-HM的荧光变化情况及定量分析，以及高盐处理后质谱-液相色谱法测量的野生型水稻JA和JA-Ile的含量；其中，图9A为高盐处理后J6V-HM的荧光变化情况；图9B为高盐处理后J6V-HM的荧光变化情况定量分析；图9C为高盐处理后质谱-液相色谱法测量的野生型水稻JA和JA-Ile的含量；
图10为J6V-HM根尖的荧光信号分布；其中，rh表示根毛，st表示中柱，co表示皮层，ep表示表皮，qc表示静止中心，rc表示根冠；图标等于100微米；
图11为J6V-HM在水稻花药发育进程中的荧光信号分布；图标等于25微米；
图12为J6V-HM在水稻花丝发育进程中的荧光信号分布；图标等于25微米。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中如无特殊说明的实验方法，均为常规方法。
本发明涉及一种用于检测水稻体内茉莉素含量和信号传递反应的茉莉素生物传感器，所述茉莉素传感器是通过计算茉莉素感受元件和核内参元件的荧光蛋白信号比值的方法对水稻茉莉素含量和信号传递反应进行定性测量。本发明还提供一种重组表达载体J6V-HM；所述重组表达载体J6V-HM中含有DNA片段Ubi-1:Jas6-VENUS-6HA:F2A:H2B-mCherry；在所述DNA片段中，含有茉莉素感受元件Jas6-VENUS-6HA，核内参元件H2B-mCherry，蛋白独立翻译短肽F2A，启动子Ubiquitin，本发明提供了一种水稻茉莉素生物传感器株系的构建方法，通过向水稻愈伤组织中导入载体J6V-HM所得；含J6V-HM的水稻可以同时观察感受元件VENUS荧光蛋白和核内参元件mCherry荧光蛋白的信号，两种荧光蛋白输出信号的比值可以示踪细胞和组织水平中茉莉素含量。详见以下各实施例：
实施例1、以荧光蛋白为输出信号的茉莉素生物传感器的构建
一、载体质粒pTCK303-6HA的构建
1.1引物设计与合成
根据6HA的基因序列，设计两条扩增6HA(222bp)的引物，上游引物(6HA-F)为5’-CTAGAGGATCCCCGGGTACCATGGGAAGATCTACTAGTTC-3’(序列表中SEQ ID NO.26)，下游引物(6HA-R)为5-GCTCTCTAGAACTAGTGTCACCTTATCTAGTAGCGT-3’(序列表中SEQ ID NO.27)。
1.2 6HA的扩增与克隆
1、以HA-HA-BI-AR(addgene,Plasmid#171234)为模板，6HA-F和6HA-R为引物，扩增6HA片段；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离鉴定后，切下目标条带进行PCR产物的胶回收；
2、质粒pTCK303经BamHI和KpnI酶切后，琼脂糖凝胶电泳鉴定，并切胶回收质粒片段；
3、连接步骤1酶切后的载体与PCR扩增得到的6HA片段。阳性克隆的鉴定采用测序进行鉴定。得到载体质粒pTCK303-6HA。
二、核内参元件H2B-mCherry的构建
2.1引物设计与合成
参照图1的构建流程图，根据OsH2B.6蛋白预测的基因序列，设计两条扩增OsH2B.6(459bp)的引物，上游引物(OsH2B.6-F)为5’-CGACTCTAGAGGATCCATGGCGCCCAAGGCGG-3’(SEQID NO.10)，下游引物(OsH2B.6-R)为5’-CTTGCTCACCATGGTGGCGACCGGTGGATCAGAGGAAGTGAACTTGGTGACGG-3’(序列表中SEQ ID NO.11)。
根据mCherry的基因序列，设计两条扩增mCherry(711bp)的引物，上游引物(mCherry-F)为5’-AAGTTCACTTCCTCTGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG-3’(序列表中SEQ ID NO.12)，下游引物(mCherry-R)为5’-GATCGGGGAAATTCGAGCTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’(序列表中SEQ ID NO.13)。
2.2核内参元件H2B-mCherry的扩增与克隆
1、以粳稻武运粳七号的互补脱氧核糖核苷酸cDNA为模板，OsH2B.6-F和OsH2B.6-R为引物，扩增OsH2B.6片段；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离鉴定后，切下目标条带进行PCR产物的胶回收；
2、以pmCherry-C1 mCherry-NLS(addgene,Plasmid#58476)为模板，mCherry-F和mCherry-R为引物，扩增mCherry片段；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离鉴定后，切下目标条带进行PCR产物的胶回收；
3、利用重叠PCR，以PCR扩增得到的OsH2B.6和mCherry片段为模板，OsH2B.6-F和mCherry-R为引物，扩增H2B-mCherry片段(1188bp)；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离鉴定后，切下目标条带进行PCR产物的胶回收；
4、质粒pTCK303-6HA经BamHI和SacI酶切后，琼脂糖凝胶电泳鉴定，并切胶回收质粒片段；
5、连接步骤4酶切后的载体与PCR扩增得到的H2B-mCherry片段。阳性克隆的鉴定采用测序进行鉴定。得到中间载体H2B-mCherry。
三、茉莉素感应元件Jas6-VENUS-6HA的构建
3.1引物设计与合成
参照图1的构建流程图，根据OsJAZ6蛋白预测的基因序列，设计两条扩增OsJas6(81bp)的引物，上游引物(OsJas6-F)为5’-CGACTCTAGAGGATCCATGGATCTGCCTCAGGCTAGG-3’(序列表中SEQ ID NO.14)，下游引物(OsJas6-R)为5’-GCTGGGTCGCAGCTGCCGCAGTAGGGTGCTTTAGCCTGAAGG-3’(序列表中SEQ ID NO.15)。
根据VENUS的基因序列，设计两条扩增VENUS(966bp)的引物，上游引物(VENUS-F)为5’-TTCAGGCTAAAGCACCCTACTGCGGCAGCTGCGACC-3’(序列表中SEQ ID NO.16)，下游引物(VENUS-R)为5’-GTAGATCTTCCCATGGTACCCTCTTCTTCTTGATCAGCTTCTGTG-3(序列表中SEQ IDNO.17)’。
3.2茉莉素感应元件Jas6-VENUS-6HA的扩增与克隆
1、以粳稻武运粳七号的互补脱氧核糖核苷酸cDNA为模板，OsJas6-F和OsJas6-R为引物，扩增OsJas6片段；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离鉴定后，切下目标条带进行PCR产物的胶回收；
2、根据实验室已报道的文章Dynamic regulation of auxin distributionduring rice development revealed by newly established hormone biosensormarkers.Frontiers in Plant Science.8:256.doi:10.3389/fpls.2017.00256，以质粒DII-VENUS为模板，VENUS-F和VENUS-R为引物，扩增VENUS片段；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离鉴定后，切下目标条带进行PCR产物的胶回收；
3、利用重叠PCR，以PCR扩增得到的OsJas6和VENUS片段为模板，OsJas6-F和VENUS-R为引物，扩增Jas6-VENUS片段(1101bp)；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离鉴定后，切下目标条带进行PCR产物的胶回收；
4、pTCK303-6HA经KpnI和BamHI酶切后，琼脂糖凝胶电泳鉴定，并切胶回收质粒片段；
5、连接步骤4酶切后的载体与PCR扩增得到的Jas6-VENUS片段。阳性克隆的鉴定采用测序进行鉴定。得到中间载体Jas6-VENUS-6HA。
四、重组表达载体J6V-HM的构建
4.1引物设计与合成
1、以pGH-Amp为载体，全基因合成F2A编码区，由上海捷瑞生物工程有限公司提供，得到pGH-Amp-F2A质粒。
2、参照图1的构建流程图，根据F2A的基因序列，设计两条扩增F2A(66bp)的引物，上游引物(F2A-F)为5’-GATTACGCTACTAGAGTGAAGCAGACCCTCAACTTCG-3’(序列表中SEQ IDNO.18)，下游引物(F2A-R)为5’-TGGGCGCCATGGATCCCGGGCCAGGATTGGACTC-3’(序列表中SEQID NO.19)；根据Jas6-VENUS-6HA的基因序列，设计两条扩增Jas6-VENUS-6HA(1323bp)的引物，上游引物(J6V-6HA-F)为5’-CGACTCTAGAGGATCATGGATCTGCCTCAGGCTAGG-3’(序列表中SEQ ID NO.20)，下游引物(J6V-6HA-R)为5’-GAGGGTCTGCTTCACTCTAGTAGCGTAATCTGGAACGTCATATGG-3’(序列表中SEQ ID NO.21)。
4.2重组表达载体J6V-HM的扩增与克隆
1、以pGH-Amp-F2A质粒为模板，F2A-F和F2A-R为引物，扩增F2A片段；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离鉴定后，切下目标条带进行PCR产物的胶回收；
2、以中间载体Jas6-VENUS-6HA为模板，J6V-6HA-F和J6V-6HA-R为引物，扩增Jas6-VENUS-6HA片段；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离鉴定后，切下目标条带进行PCR产物的胶回收；
3、利用重叠PCR，以PCR扩增得到的Jas6-VENUS-6HA和F2A片段为模板，J6V-6HA-F和F2A-R为引物，扩增Jas6-VENUS-6HA-F2A片段(1389bp)；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离鉴定后，切下目标条带进行PCR产物的胶回收；
4、中间载体Ubi-1:H2B-mCherry经BamHI酶切后，琼脂糖凝胶电泳鉴定，并切胶回收质粒片段；
5、连接酶切后的载体与PCR扩增得到的Jas6-VENUS-6HA-F2A片段。阳性克隆的鉴定采用测序进行鉴定。得到重组表达载体J6V-HM。
其中，所述pmCherry-C1 mCherry-NLS载体和HA-HA-BI-AR载体在addgene官网购买获得；
DII-VENUS在本实验室已报道的文章Dynamic regulation of auxindistribution during rice development revealed by newly established hormonebiosensor markers.Frontiers in Plant Science.8:256.doi:10.3389/fpls.2017.00256已有记载，本实施例中其来源于上海交通大学生命科学技术学院。
五、功能缺失型茉莉素生物传感器mJ6V-HM的重组表达载体的构建
5.1引物设计与合成
1、根据mJas6-VENUS-6HA的基因序列，设计两条扩增mJas6-VENUS-6HA(1323bp)的引物，上游引物(mJ6V-6HA-F)为5’-CGACTCTAGAGGATCCATGGATCTGCCTCAGGCTGCCGCCGCGTCGCTTCACCGG TTC-3’(序列表中SEQ ID NO.22)，下游引物(mJ6V-6HA-R)为5’-GAGGGTCTGCTTCACTCTAGTAGCGTAATCTGGAACGTCATATGG-3’(序列表中SEQ ID NO.23)。
5.2 mJ6V-HM的扩增与克隆
1、以pGH-Amp-F2A质粒为模板，F2A-F和F2A-R为引物，扩增F2A片段；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离鉴定后，切下目标条带进行PCR产物的胶回收；
2、以中间载体Jas6-VENUS-6HA为模板，mJ6V-6HA-F和mJ6V-6HA-R为引物，扩增Jas6-VENUS-6HA片段；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离鉴定后，切下目标条带进行PCR产物的胶回收；
3、利用重叠PCR，以PCR扩增得到的mJas6-VENUS-6HA和F2A片段为模板，mJ6V-6HA-F和F2A-R为引物，扩增mJas6-VENUS-6HA-F2A片段(1389bp)；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离鉴定后，切下目标条带进行PCR产物的胶回收；
4、中间载体Ubi-1:H2B-mCherry经BamHI酶切后，琼脂糖凝胶电泳鉴定，并切胶回收质粒片段；
5、连接酶切后的载体与PCR扩增得到的mJas6-VENUS-6HA-F2A片段。阳性克隆的鉴定采用测序进行鉴定。得到功能缺失的茉莉素生物传感器mJ6V-HM的重组表达载体。
实施例2、重组根癌农杆菌的获得
将实施例1中重组表达载体J6V-HM和mJ6V-HM分别热击转化农杆菌EHA105，获得含有重组表达载体J6V-HM和mJ6V-HM的重组农杆菌，命名为EHA105-J6V-HM和EHA105-mJ6V-HM。
实施例3、在水稻武运粳七号中获得茉莉素生物传感器J6V-HM
将实施例2中的重组农杆菌EHA105-J6V-HM和EHA105-mJ6V-HM侵染水稻粳稻品种武运粳七号的成熟胚诱导的愈伤组织，将获得的转化植株命名为J6V-HM和mJ6V-HM。转化实验具体方法如下：
1、将水稻粳稻品种武运粳七号去壳种子或者幼穗，用75％酒精消毒1min，33％次氯酸钠消毒20min，随后再次消毒。最后用无菌水清洗种子10次，置于无菌滤纸中将水分吸干。将消毒后的种子转移到NBD2的固体培养基中，暗培养一到两周，观察到胚轴处出现黄色愈伤组织时，切除根部和胚乳，将愈伤组织转移到新的NBD2培养基上，至少培养10天后可进行转化。
2、将重组农杆菌接种于含50μg/ml卡那霉素和20μg/ml利福平的YEB培养基中，28℃、200rpm条件下振荡培养至OD600为0.6-0.8；以3000rpm、4℃离心3min，弃上清，用AAM-AS培养基(乙酰丁香酮AS浓度为200μM/L，pH 5.2)重悬至OD600为0.6-0.8。
3、将愈伤组织与重悬液共同放入无菌的锥形瓶中，在28℃摇床摇菌半小时以上。倒掉重悬液，将愈伤组织转移到无菌滤纸上，让无菌滤纸吸走多余菌液。将第一二层的含有菌液的滤纸除去以后，将愈伤组织连同新的无菌滤纸转移到共培养培养基上(乙酰丁香酮浓度为100μM/L，pH 5.2)，暗培养浸染3天。
4、将愈伤组织放入灭菌水中清洗5次，再次放到新的无菌滤纸上吸干水分。将吹干的愈伤组织转移到筛选培养基上(潮霉素浓度为50mg/L，pH 5.8)，暗培养两周。转移抗性愈伤组织至新的筛选培养基上暗培养两周。
5、将愈伤组织转移到分化培养基上，光下培养两周以上。将出现的绿芽转移到含生根培养基的无菌罐子中，当转基因苗足够大时，移入温室种植。
实施例4、茉莉素生物传感器J6V-HM在水稻品种武运粳七号的功能检测
一、含茉莉素生物传感器的转基因材料的信号筛选
1、夹取1cm左右的转基因材料的根系，放于载玻片上，盖上载玻片后轻微按压。
2、荧光信号是通过共聚焦激光显微镜confocal(TCS SP5 II,LEICA)拍照记录。VENUS和mCherry的发射光光谱分别设置为514nm和594nm，接受光光谱范围分别是520-560nm和590-620nm。图像像素为1024×1024，扫描速度为200Hz。
3、同时含有VENUS和mCherry荧光信号的样品即筛选出含茉莉素生物传感器J6V-HM的水稻品种武运粳七号的转基因株系(图2为转基因水稻J6V-HM根系VENUS通道和mCherry通道的荧光信号；其中，左图表示VENUS通道，中图表示mCherry通道，右图表示明场通道，图标等于100微米)。
二、含茉莉素生物传感器的转基因材料(J6V-HM)的转录及翻译水平检测
1、在获得J6V-HM转基因材料后，需要验证构建系统中的茉莉素感受元件和核内参元件在转录水平是否位于一个转录本上。以J6V-HM的互补脱氧核糖核苷酸cDNA为模板，正向和反向引物分别设在VENUS序列和H2B序列上，上游引物(qrt-J6V-HM-F)为5’-GGACATTGACGACACAGAAGC-3’(序列表中SEQ ID NO.24)，下游引物(qrt-J6V-HM-R)为5’-GCCTTCTCGGCCTTCTCC-3’(序列表中SEQ ID NO.25)，通过PCR和琼脂糖凝胶电泳结果显示，转录本具有完整性(图3为转基因水稻J6V-HM的转录分析，其中M表示DNA分子标记，CK-表示以野生型水稻为模板，CK1表示以重组表达载体J6V-HM为模板，J6V-HM表示转基因材料J6V-HM的互补脱氧核糖核苷酸cDNA为模板)。
2、为了验证构建系统中的茉莉素感受元件和内参元件在翻译水平是否是两个独立的蛋白。在提取J6V-HM幼苗叶片和根系总蛋白后，通过蛋白质免疫印迹实验，分别用HA抗体去确定Jas-VENUS蛋白分子量大小，用RFP抗体去确定H2B-mCherry蛋白分子量大小。根据预测，Jas6-VENUS-6HA-F2A分子量为51.679kD，H2B-mCherry分子量为43.998kD。结果显示，用HA抗体检测到的条带在50-70kD之间，RFP抗体检测到的条带在40-50kD之间，且实验中没有检测到全长融合蛋白J6V-HM-H2B-mCherry(图4为转基因水稻J6V-HM幼苗的免疫印迹实验，其中CK-表示野生型水稻总蛋白，J6V-HM表示转基因材料J6V-HM的总蛋白，Anti-HA表示用HA抗体与总蛋白进行杂交，Anti-RFP表示用RFP抗体与总蛋白进行杂交)，证明J6V-HM植株中正确翻译产生了Jas6-VENUS-6HA-F2A和H2B-mCherry蛋白。
三、含茉莉素生物传感器的转基因材料不影响水稻正常生长发育的表型观察
从水稻花器官上观察，转基因水稻J6V-HM与野生型水稻武运粳七号无明显差别。转基因水稻J6V-HM花粉碘染结果显示可育。外源MeJA处理水稻幼苗根系，结果表明均能抑制根系的生长，转基因水稻J6V-HM和野生型水稻武运粳七号的结果无明显差异(图5为转基因水稻J6V-HM与野生型水稻武运粳七号的表型分析，其中，图5A表示花器官表型分析，图标等于100微米；图5B表示花粉育性表型分析，图标等于100微米；图5C表示MeJA处理后抑制根系生长的表型分析；)。
以上结果表明，J6V-HM构建系统不影响水稻正常的生长发育。
四、含茉莉素生物传感器的转基因材料(J6V-HM)响应茉莉素信号的功能检测
4.1 J6V-HM响应茉莉素信号的实时性检测
为了验证构建系统是否响应外源JA信号，通过MeJA处理J6V-HM幼苗根尖，结果表明，与对照相比，20min后J6V-HM根系VENUS荧光信号明显降低。经过蛋白质免疫印迹实验证明，MeJA处理4小时后根系中Jas6-VENUS-6HA蛋白完全降解，HA抗体检测不到明显的信号。与之相比，同样处理茉莉素感受元件突变的转基因材料mJ6V-HM的根系，VENUS荧光信号并没有明显减弱。在100μM MG132(蛋白酶抑制剂)处理J6V-HM转基因材料1小时以后再施加MeJA处理，VENUS信号没有明显改变(图6为不同处理后J6V-HM根系VENUS的荧光信号，其中，图6A表示100μM MeJA处理后J6V-HM中VENUS的荧光信号，图标等于100微米；图6B表示100μMMeJA处理后mJ6V-HM中VENUS的荧光信号，图标等于100微米；图6C表示100μM MG132(蛋白酶抑制剂)处理1h后再施加100μM MeJA处理，观察并记录J6V-HM中VENUS的荧光信号，图标等于100微米；图6D为100μM MeJA处理J6V-HM根系4h后的免疫印迹实验，其中WT表示野生型水稻总蛋白，J6V-HM-(-)表示不施加MeJA处理的J6V-HM转基因材料总蛋白，J6V-HM-(+)表示施加MeJA处理4h后的J6V-HM转基因材料总蛋白)。
以上结果表明，J6V-HM响应茉莉素是依赖茉莉素感受元件和26s蛋白酶降解系统。
4.2 J6V-HM响应茉莉素信号的敏感性检测
为了验证构建系统响应外源JA信号的敏感性，利用10μM MeJA和100μM MeJA处理J6V-HM幼苗根尖，记录30min内VENUS和mCherry的荧光变化情况。通过分析软件FIJI对荧光进行定量分析，VENUS与mCherry荧光值之比代表相对荧光强度。结果表明，J6V-HM能够感受低浓度和高浓度的MeJA，并且不同浓度MeJA处理后相对荧光降解速率不同，具有剂量依赖性，浓度越高，降解速率越快(图7)。
为了验证构建系统响应不同类型JA信号的敏感性，利用JA衍生物处理J6V-HM幼苗根尖，记录30min内VENUS和mCherry的荧光变化情况。通过分析软件FIJI对荧光进行定量分析，VENUS与mCherry荧光值之比代表相对荧光强度。结果表明，J6V-HM对JA，JA-Ile，JA，MeJA和COR都具有敏感性，并且在JA活性形式JA和JA-Ile外源处理后降解速率最快(图7)。
4.3 J6V-HM响应茉莉素信号的特异性检测
为了验证构建系统对植物激素的特异性，利用不同植物激素处理J6V-HM幼苗根尖，记录30min内VENUS和mCherry的荧光变化情况。通过分析软件FIJI对荧光进行定量分析，VENUS与mCherry荧光值之比代表相对荧光强度。结果表明，J6V-HM在MeJA处理时相对荧光降解速率最快，生长素IAA，乙烯前体ACC和赤霉素GA3处理时荧光降解速率较慢(图7为不同处理后J6V-HM根系的相对荧光强度随时间变化的情况，其中，图7A表示10μM MeJA和100μM MeJA处理后J6V-HM的荧光变化情况；图7B表示不同JA衍生物处理后J6V-HM的荧光变化情况；图7C表示不同植物激素处理后J6V-HM的荧光变化情况)。
五、检测胁迫处理后含茉莉素生物传感器的转基因材料(J6V-HM)根尖对内源茉莉素信号的响应
为了检测损伤处理后J6V-HM根尖对内源茉莉素信号的响应，在距离根尖1cm左右的部位用镊子挤压3次，通过荧光定量PCR的方式证明该损伤处理有效。随后用同样的方法处理J6V-HM根尖，统计30min和1h后VENUS和mCherry的荧光信号。通过分析软件FIJI对荧光进行定量分析，VENUS与mCherry荧光值之比代表相对荧光强度。结果表明，损伤处理30min后，相对荧光强度显著降低(图8为损伤处理后J6V-HM的荧光变化情况及定量分析；其中图8A为损伤处理后J6V-HM的荧光变化情况；图8B为损伤处理后J6V-HM的荧光变化情况定量分析)。
为了检测高盐处理后J6V-HM根尖对内源茉莉素信号的响应，将培养10天的J6V-HM幼苗转移到含200mM NaCl的1/2MS培养基中，通过荧光定量PCR的方式证明该损伤处理有效。随后用同样的方法处理J6V-HM根尖，统计0min,4min,8min,15min,30min和1h时VENUS和mCherry的荧光信号。通过分析软件FIJI对荧光进行定量分析，VENUS与mCherry荧光值之比代表相对荧光强度。结果表明，在高盐处理8min后相对荧光强度开始减弱，一直持续到1h。同时，经过质谱-液相色谱法对JA和JA-Ile含量进行测定，发现高盐处理后JA和JA-Ile含量升高，与J6V-HM荧光下降的变化一致(图9为高盐处理后J6V-HM的荧光变化情况及定量分析，以及高盐处理后质谱-液相色谱法测量的野生型水稻JA和JA-Ile的含量；其中，图9A为高盐处理后J6V-HM的荧光变化情况；图9B为高盐处理后J6V-HM的荧光变化情况定量分析；图9C为高盐处理后质谱-液相色谱法测量的野生型水稻JA和JA-Ile的含量)。
六、检测含茉莉素生物传感器的转基因材料(J6V-HM)在不同组织和发育事件中对内源茉莉素信号的响应
1.1检测J6V-HM根尖的荧光信号分布
为了检测J6V-HM能否在细胞水平显示水稻根尖的JA分布，将夹取1cm左右的J6V-HM根尖，放于载玻片上，盖上载玻片后轻微按压。通过共聚焦激光显微镜confocal拍照，记录荧光信号。结果表明，J6V-HM荧光信号分布具有特异性，根系表皮、根冠和静止中心的VENUS荧光强度较弱，皮层和中柱的的VENUS荧光强度较强(图10)。
1.2检测J6V-HM在水稻花药发育进程中的荧光信号分布
为了检测J6V-HM能否在细胞水平显示水稻花药发育进程中的JA分布，观察和记录J6V-HM花药发育不同时期荧光信号。结果表明，不同时期的花药在不同组织中荧光信号分布具有特异性。在花药内部，8期四分体和9期小孢子中VENUS荧光信号一直保持较高水平，而表皮和内层中VENUS荧光信号在9期明显减弱。当花药发育进入11期，表皮、皮层和小孢子中VENUS荧光信号逐渐减弱，到12期花粉成熟以后，花药的各个组织中VENUS信号基本检测不到(图11)。
1.3检测J6V-HM在水稻花丝发育进程中的荧光信号分布
为了检测J6V-HM能否在细胞水平显示水稻花丝发育进程中的JA分布，观察和记录J6V-HM花药发育不同时期中花丝的荧光信号。结果表明，花丝各个部位荧光信号分布均一，没有明显差异。在水稻花药发育的8期到11期中，VENUS信号一直保持较高水平，而在12期信号开始减弱，直至13期完全消失(图12)。
综上所述，本发明涉及一种用于检测水稻体内茉莉素含量和信号传递反应的茉莉素生物传感器，所述茉莉素传感器是通过计算茉莉素感受元件和核内参元件的荧光蛋白信号比值的方法对水稻茉莉素含量和信号传递反应进行定性测量。本发明还提供一种重组表达载体J6V-HM；所述重组表达载体J6V-HM中含有DNA片段Ubi-1:Jas6-VENUS-6HA:F2A:H2B-mCherry；在所述DNA片段中，含有茉莉素感受元件Jas6-VENUS-6HA，核内参元件H2B-mCherry，蛋白独立翻译短肽F2A，启动子Ubiquitin，本发明提供了一种水稻茉莉素生物传感器株系的构建方法，通过向水稻愈伤组织中导入载体J6V-HM所得；含J6V-HM的水稻可以同时观察感受元件VENUS荧光蛋白和核内参元件mCherry荧光蛋白的信号，两种荧光蛋白输出信号的比值可以示踪细胞和组织水平中茉莉素含量。
本发明提供一种水稻茉莉素传感器的构建系统，并在水稻品种粳稻武运粳七号中实现对茉莉素的响应；本发明筛选的转基因株系在水稻生长发育时期与受体材料无明显差异。这将有利于茉莉素在植物的内部监测，在农业生产上具有十分重要的应用。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 水稻茉莉素生物传感器J6V-HM的构建及应用
<130> KAG47952
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4593
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 60
agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 120
tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa 180
tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga 240
gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt 300
ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg 360
gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt 420
agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata 480
taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa 540
aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga 600
cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga 660
cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg 720
acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac 780
ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc 840
gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct 900
ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca 960
cccgtcggca cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc cctctctacc 1020
ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt agttctactt ctgttcatgt 1080
ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag cgttcgtaca cggatgcgac 1140
ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt ttctctttgg ggaatcctgg 1200
gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga ttttttttgt ttcgttgcat 1260
agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc gtgcacttgt ttgtcgggtc 1320
atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg gtctggttgg gcggtcgttc 1380
tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat ttattaattt tggatctgta 1440
tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg atggatggaa atatcgatct 1500
aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat atacagagat gctttttgtt 1560
cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc attcgttcta gatcggagta 1620
gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg gaactgtatg tgtgtgtcat 1680
acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat 1740
gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata tgcagcatct attcatatgc 1800
tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg ttttataatt attttgatct 1860
tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg gattttttta gccctgcctt 1920
catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga tgctcaccct gttgtttggt 1980
gttacttctg caggtcgact ctagaggatc atggatctgc ctcaggctag gaaggcgtcg 2040
cttcaccggt tcctcgagaa aagaaaggat cgccttcagg ctaaagcacc ctactgcggc 2100
agctgcgacc cagctttctt gtacaaagtg gccgcagctg ccgcaatggt gagcaagggc 2160
gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 2220
cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 2280
aagctgatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 2340
ggctacggcc tgcagtgctt cgcccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 2400
aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 2460
aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 2520
ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 2580
tacaacagcc acaacgtcta tatcaccgcc gacaagcaga agaacggcat caaggccaac 2640
ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc ggcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 2700
aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagctaccag 2760
tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 2820
accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca ttgctgcagc ggccgaattc 2880
aagcgtgaag agcaagcaag gaaagctaag gtgaacaatg agaaaaagac ggaaatagtg 2940
aaaccagaga gttgtagcaa tgaaggagat gtcaaggatc tgaaaagaaa ggactctgag 3000
gatggaaacg agggtgagga agaagaagct tcttcgaaac cgaaaaagcc aaaagttgct 3060
ctttctcatc ttcaggacat tgacgacaca gaagctgatc aagaagaaga gggtaccatg 3120
ggaagatcta ctagttctag ttacccatac gatgttcctg actatgcagg ctatccctat 3180
gacgtcccgg actatgcagg ttcctatcca tatgacgttc cagattacgc ttcaagatac 3240
ccatacgatg ttcctgacta tgcgggctat ccctatgacg tcccggacta tgcaggttcc 3300
tatccatatg acgttccaga ttacgctact agagtgaagc agaccctcaa cttcgacctc 3360
ctcaagctcg ccggcgacgt ggagtccaat cctggcccgg gatccatggc gcccaaggcg 3420
gagaagaagc cggccgcgaa gaagcccgcg gaggaggagc ccgcggcgga gaaggccgag 3480
aaggccccgg cggggaagaa gcccaaggcg gagaagcgtc tccccgccgg caagggcgag 3540
aagggcagcg gcgaggggaa gaaggcgggg cggaagaagg ggaagaagag cgtcgagacc 3600
tacaagatct acatcttcaa ggtgctcaag caggtccacc ccgacatcgg catctcctcc 3660
aaggccatgt ccatcatgaa ctccttcatc aacgacatct tcgagaagct cgccgccgag 3720
gccgccaagc tcgcccgcta caacaagaag cccaccatca cctcccggga gatccagacc 3780
gccgtccgcc tcgtcctccc cggcgagctt gccaagcacg ccgtctccga gggcaccaag 3840
gccgtcacca agttcacttc ctctgatcca ccggtcgcca ccatggtgag caagggcgag 3900
gaggataaca tggccatcat caaggagttc atgcgcttca aggtgcacat ggagggctcc 3960
gtgaacggcc acgagttcga gatcgagggc gagggcgagg gccgccccta cgagggcacc 4020
cagaccgcca agctgaaggt gaccaagggt ggccccctgc ccttcgcctg ggacatcctg 4080
tcccctcagt tcatgtacgg ctccaaggcc tacgtgaagc accccgccga catccccgac 4140
tacttgaagc tgtccttccc cgagggcttc aagtgggagc gcgtgatgaa cttcgaggac 4200
ggcggcgtgg tgaccgtgac ccaggactcc tccctgcagg acggcgagtt catctacaag 4260
gtgaagctgc gcggcaccaa cttcccctcc gacggccccg taatgcagaa gaagaccatg 4320
ggctgggagg cctcctccga gcggatgtac cccgaggacg gcgccctgaa gggcgagatc 4380
aagcagaggc tgaagctgaa ggacggcggc cactacgacg ctgaggtcaa gaccacctac 4440
aaggccaaga agcccgtgca gctgcccggc gcctacaacg tcaacatcaa gttggacatc 4500
acctcccaca acgaggacta caccatcgtg gaacagtacg aacgcgccga gggccgccac 4560
tccaccggcg gcatggacga gctgtacaag taa 4593
<210> 2
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggatctgc ctcaggctag gaaggcgtcg cttcaccggt tcctcgagaa aagaaaggat 60
cgccttcagg ctaaagcacc ctac 84
<210> 3
<211> 966
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagct gatctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgggcta cggcctgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca ccgccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg ccaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcggcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagct accagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacattgct 720
gcagcggccg aattcaagcg tgaagagcaa gcaaggaaag ctaaggtgaa caatgagaaa 780
aagacggaaa tagtgaaacc agagagttgt agcaatgaag gagatgtcaa ggatctgaaa 840
agaaaggact ctgaggatgg aaacgagggt gaggaagaag aagcttcttc gaaaccgaaa 900
aagccaaaag ttgctctttc tcatcttcag gacattgacg acacagaagc tgatcaagaa 960
gaagag 966
<210> 4
<211> 222
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtaccatgg gaagatctac tagttctagt tacccatacg atgttcctga ctatgcaggc 60
tatccctatg acgtcccgga ctatgcaggt tcctatccat atgacgttcc agattacgct 120
tcaagatacc catacgatgt tcctgactat gcgggctatc cctatgacgt cccggactat 180
gcaggttcct atccatatga cgttccagat tacgctacta ga 222
<210> 5
<211> 459
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggcgccca aggcggagaa gaagccggcc gcgaagaagc ccgcggagga ggagcccgcg 60
gcggagaagg ccgagaaggc cccggcgggg aagaagccca aggcggagaa gcgtctcccc 120
gccggcaagg gcgagaaggg cagcggcgag gggaagaagg cggggcggaa gaaggggaag 180
aagagcgtcg agacctacaa gatctacatc ttcaaggtgc tcaagcaggt ccaccccgac 240
atcggcatct cctccaaggc catgtccatc atgaactcct tcatcaacga catcttcgag 300
aagctcgccg ccgaggccgc caagctcgcc cgctacaaca agaagcccac catcacctcc 360
cgggagatcc agaccgccgt ccgcctcgtc ctccccggcg agcttgccaa gcacgccgtc 420
tccgagggca ccaaggccgt caccaagttc acttcctct 459
<210> 6
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta a 711
<210> 7
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtgaagcaga ccctcaactt cgacctcctc aagctcgccg gcgacgtgga gtccaatcct 60
ggcccg 66
<210> 8
<211> 1993
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 60
agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 120
tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa 180
tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga 240
gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt 300
ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg 360
gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt 420
agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata 480
taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa 540
aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga 600
cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga 660
cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg 720
acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac 780
ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc 840
gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct 900
ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca 960
cccgtcggca cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc cctctctacc 1020
ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt agttctactt ctgttcatgt 1080
ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag cgttcgtaca cggatgcgac 1140
ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt ttctctttgg ggaatcctgg 1200
gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga ttttttttgt ttcgttgcat 1260
agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc gtgcacttgt ttgtcgggtc 1320
atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg gtctggttgg gcggtcgttc 1380
tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat ttattaattt tggatctgta 1440
tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg atggatggaa atatcgatct 1500
aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat atacagagat gctttttgtt 1560
cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc attcgttcta gatcggagta 1620
gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg gaactgtatg tgtgtgtcat 1680
acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat 1740
gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata tgcagcatct attcatatgc 1800
tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg ttttataatt attttgatct 1860
tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg gattttttta gccctgcctt 1920
catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga tgctcaccct gttgtttggt 1980
gttacttctg cag 1993
<210> 9
<211> 16673
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
taccatggtc aagagtcccc cgtgttctct ccaaatgaaa tgaacttcct tatatagagg 60
aagggtcttg cgaaggatag tgggattgtg cgtcatccct tacgtcagtg gagatatcac 120
atcaatccac ttgctttgaa gacgtggttg gaacgtcttc tttttccacg atgctcctcg 180
tgggtggggg tccatctttg ggaccactgt cggcagaggc atcttcaacg atggcctttc 240
ctttatcgca atgatggcat ttgtaggagc caccttcctt ttccactatc ttcacaataa 300
agtgacagat agctgggcaa tggaatccga ggaggtttcc ggatattacc ctttgttgaa 360
aagtctcaat tgccctttgg tcttctgaga ctgtatcttt gatatttttg gagtagacaa 420
gtgtgtcgtg ctccaccatg ttgacgaaga ttttcttctt gtcattgagt cgtaagagac 480
tctgtatgaa ctgttcgcca gtctttacgg cgagttctgt taggtcctct atttgaatct 540
ttgactccat gaagctaaac tgaaggcggg aaacgacaat ctgatccaag ctcaagctgc 600
tctagcattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt 660
cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc 720
cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgccaagctt gcatgcctgc 780
agtgcagcgt gacccggtcg tgcccctctc tagagataat gagcattgca tgtctaagtt 840
ataaaaaatt accacatatt ttttttgtca cacttgtttg aagtgcagtt tatctatctt 900
tatacatata tttaaacttt actctacgaa taatataatc tatagtacta caataatatc 960
agtgttttag agaatcatat aaatgaacag ttagacatgg tctaaaggac aattgagtat 1020
tttgacaaca ggactctaca gttttatctt tttagtgtgc atgtgttctc cttttttttt 1080
gcaaatagct tcacctatat aatacttcat ccattttatt agtacatcca tttagggttt 1140
agggttaatg gtttttatag actaattttt ttagtacatc tattttattc tattttagcc 1200
tctaaattaa gaaaactaaa actctatttt agttttttta tttaataatt tagatataaa 1260
atagaataaa ataaagtgac taaaaattaa acaaataccc tttaagaaat taaaaaaact 1320
aaggaaacat ttttcttgtt tcgagtagat aatgccagcc tgttaaacgc cgtcgacgag 1380
tctaacggac accaaccagc gaaccagcag cgtcgcgtcg ggccaagcga agcagacggc 1440
acggcatctc tgtcgctgcc tctggacccc tctcgagagt tccgctccac cgttggactt 1500
gctccgctgt cggcatccag aaattgcgtg gcggagcggc agacgtgagc cggcacggca 1560
ggcggcctcc tcctcctctc acggcaccgg cagctacggg ggattccttt cccaccgctc 1620
cttcgctttc ccttcctcgc ccgccgtaat aaatagacac cccctccaca ccctctttcc 1680
ccaacctcgt gttgttcgga gcgcacacac acacaaccag atctccccca aatccacccg 1740
tcggcacctc cgcttcaagg tacgccgctc gtcctccccc cccccccctc tctaccttct 1800
ctagatcggc gttccggtcc atggttaggg cccggtagtt ctacttctgt tcatgtttgt 1860
gttagatccg tgtttgtgtt agatccgtgc tgctagcgtt cgtacacgga tgcgacctgt 1920
acgtcagaca cgttctgatt gctaacttgc cagtgtttct ctttggggaa tcctgggatg 1980
gctctagccg ttccgcagac gggatcgatt tcatgatttt ttttgtttcg ttgcataggg 2040
tttggtttgc ccttttcctt tatttcaata tatgccgtgc acttgtttgt cgggtcatct 2100
tttcatgctt ttttttgtct tggttgtgat gatgtggtct ggttgggcgg tcgttctaga 2160
tcggagtaga attctgtttc aaactacctg gtggatttat taattttgga tctgtatgtg 2220
tgtgccatac atattcatag ttacgaattg aagatgatgg atggaaatat cgatctagga 2280
taggtataca tgttgatgcg ggttttactg atgcatatac agagatgctt tttgttcgct 2340
tggttgtgat gatgtggtgt ggttgggcgg tcgttcattc gttctagatc ggagtagaat 2400
actgtttcaa actacctggt gtatttatta attttggaac tgtatgtgtg tgtcatacat 2460
cttcatagtt acgagtttaa gatggatgga aatatcgatc taggataggt atacatgttg 2520
atgtgggttt tactgatgca tatacatgat ggcatatgca gcatctattc atatgctcta 2580
accttgagta cctatctatt ataataaaca agtatgtttt ataattattt tgatcttgat 2640
atacttggat gatggcatat gcagcagcta tatgtggatt tttttagccc tgccttcata 2700
cgctatttat ttgcttggta ctgtttcttt tgtcgatgct caccctgttg tttggtgtta 2760
cttctgcagg tcgactctag aggatcatgg atctgcctca ggctaggaag gcgtcgcttc 2820
accggttcct cgagaaaaga aaggatcgcc ttcaggctaa agcaccctac tgcggcagct 2880
gcgacccagc tttcttgtac aaagtggccg cagctgccgc aatggtgagc aagggcgagg 2940
agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca 3000
agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagc 3060
tgatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgggct 3120
acggcctgca gtgcttcgcc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt 3180
ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact 3240
acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga 3300
agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca 3360
acagccacaa cgtctatatc accgccgaca agcagaagaa cggcatcaag gccaacttca 3420
agatccgcca caacatcgag gacggcggcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca 3480
cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc taccagtccg 3540
ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg 3600
ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacattgc tgcagcggcc gaattcaagc 3660
gtgaagagca agcaaggaaa gctaaggtga acaatgagaa aaagacggaa atagtgaaac 3720
cagagagttg tagcaatgaa ggagatgtca aggatctgaa aagaaaggac tctgaggatg 3780
gaaacgaggg tgaggaagaa gaagcttctt cgaaaccgaa aaagccaaaa gttgctcttt 3840
ctcatcttca ggacattgac gacacagaag ctgatcaaga agaagagggt accatgggaa 3900
gatctactag ttctagttac ccatacgatg ttcctgacta tgcaggctat ccctatgacg 3960
tcccggacta tgcaggttcc tatccatatg acgttccaga ttacgcttca agatacccat 4020
acgatgttcc tgactatgcg ggctatccct atgacgtccc ggactatgca ggttcctatc 4080
catatgacgt tccagattac gctactagag tgaagcagac cctcaacttc gacctcctca 4140
agctcgccgg cgacgtggag tccaatcctg gcccgggatc catggcgccc aaggcggaga 4200
agaagccggc cgcgaagaag cccgcggagg aggagcccgc ggcggagaag gccgagaagg 4260
ccccggcggg gaagaagccc aaggcggaga agcgtctccc cgccggcaag ggcgagaagg 4320
gcagcggcga ggggaagaag gcggggcgga agaaggggaa gaagagcgtc gagacctaca 4380
agatctacat cttcaaggtg ctcaagcagg tccaccccga catcggcatc tcctccaagg 4440
ccatgtccat catgaactcc ttcatcaacg acatcttcga gaagctcgcc gccgaggccg 4500
ccaagctcgc ccgctacaac aagaagccca ccatcacctc ccgggagatc cagaccgccg 4560
tccgcctcgt cctccccggc gagcttgcca agcacgccgt ctccgagggc accaaggccg 4620
tcaccaagtt cacttcctct gatccaccgg tcgccaccat ggtgagcaag ggcgaggagg 4680
ataacatggc catcatcaag gagttcatgc gcttcaaggt gcacatggag ggctccgtga 4740
acggccacga gttcgagatc gagggcgagg gcgagggccg cccctacgag ggcacccaga 4800
ccgccaagct gaaggtgacc aagggtggcc ccctgccctt cgcctgggac atcctgtccc 4860
ctcagttcat gtacggctcc aaggcctacg tgaagcaccc cgccgacatc cccgactact 4920
tgaagctgtc cttccccgag ggcttcaagt gggagcgcgt gatgaacttc gaggacggcg 4980
gcgtggtgac cgtgacccag gactcctccc tgcaggacgg cgagttcatc tacaaggtga 5040
agctgcgcgg caccaacttc ccctccgacg gccccgtaat gcagaagaag accatgggct 5100
gggaggcctc ctccgagcgg atgtaccccg aggacggcgc cctgaagggc gagatcaagc 5160
agaggctgaa gctgaaggac ggcggccact acgacgctga ggtcaagacc acctacaagg 5220
ccaagaagcc cgtgcagctg cccggcgcct acaacgtcaa catcaagttg gacatcacct 5280
cccacaacga ggactacacc atcgtggaac agtacgaacg cgccgagggc cgccactcca 5340
ccggcggcat ggacgagctg tacaagtaag agctcgaatt tccccgatcg ttcaaacatt 5400
tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa 5460
tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg 5520
agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa 5580
atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg 5640
gaattcgtaa tcatgtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca 5700
cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa 5760
ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag 5820
ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg ctagagcagc 5880
ttgccaaaca tggtggagca cgacactctc gtctactcca agaatatcaa agatacagtc 5940
tcagaagacc aaagggctat tgagactttt caacaaaggg taatatcggg aaacctcctc 6000
ggattccatt gcccagctat ctgtcacttc atcaaaagga cagtagaaaa ggaaggtggc 6060
acctacaaat gccatcattg cgataaagga aaggctatcg ttcaagatgc ctctgccgac 6120
agtggtccca aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca 6180
accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt gataacatgg tggagcacga cactctcgtc 6240
tactccaaga atatcaaaga tacagtctca gaagaccaaa gggctattga gacttttcaa 6300
caaagggtaa tatcgggaaa cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg tcacttcatc 6360
aaaaggacag tagaaaagga aggtggcacc tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag 6420
gctatcgttc aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg 6480
agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat 6540
atctccactg acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc cttcgcaaga ccttcctcta 6600
tataaggaag ttcatttcat ttggagagga cacgctgaaa tcaccagtct ctctctacaa 6660
atctatctcc tcgagctttc gcagatcccg gggggcaatg agatatgaaa aagcctgaac 6720
tcaccgcgac gtctgtcgag aagtttctga tcgaaaagtt cgacagcgtc tccgacctga 6780
tgcagctctc ggagggcgaa gaatctcgtg ctttcagctt cgatgtagga gggcgtggat 6840
atgtcctgcg ggtaaatagc tgcgccgatg gtttctacaa agatcgttat gtttatcggc 6900
actttgcatc ggccgcgctc ccgattccgg aagtgcttga cattggggag tttagcgaga 6960
gcctgaccta ttgcatctcc cgccgtgcac agggtgtcac gttgcaagac ctgcctgaaa 7020
ccgaactgcc cgctgttcta caaccggtcg cggaggctat ggatgcgatc gctgcggccg 7080
atcttagcca gacgagcggg ttcggcccat tcggaccgca aggaatcggt caatacacta 7140
catggcgtga tttcatatgc gcgattgctg atccccatgt gtatcactgg caaactgtga 7200
tggacgacac cgtcagtgcg tccgtcgcgc aggctctcga tgagctgatg ctttgggccg 7260
aggactgccc cgaagtccgg cacctcgtgc acgcggattt cggctccaac aatgtcctga 7320
cggacaatgg ccgcataaca gcggtcattg actggagcga ggcgatgttc ggggattccc 7380
aatacgaggt cgccaacatc ttcttctgga ggccgtggtt ggcttgtatg gagcagcaga 7440
cgcgctactt cgagcggagg catccggagc ttgcaggatc gccacgactc cgggcgtata 7500
tgctccgcat tggtcttgac caactctatc agagcttggt tgacggcaat ttcgatgatg 7560
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gtacacaaat cgcccgcaga agcgcggccg tctggaccga tggctgtgta gaagtactcg 7680
ccgatagtgg aaaccgacgc cccagcactc gtccgagggc aaagaaatag agtagatgcc 7740
gaccggatct gtcgatcgac aagctcgagt ttctccataa taatgtgtga gtagttccca 7800
gataagggaa ttagggttcc tatagggttt cgctcatgtg ttgagcatat aagaaaccct 7860
tagtatgtat ttgtatttgt aaaatacttc tatcaataaa atttctaatt cctaaaacca 7920
aaatccagta ctaaaatcca gatcccccga attaattcgg cgttaattca gtacattaaa 7980
aacgtccgca atgtgttatt aagttgtcta agcgtcaatt tgtttacacc acaatatatc 8040
ctgccaccag ccagccaaca gctccccgac cggcagctcg gcacaaaatc accactcgat 8100
acaggcagcc catcagtccg ggacggcgtc agcgggagag ccgttgtaag gcggcagact 8160
ttgctcatgt taccgatgct attcggaaga acggcaacta agctgccggg tttgaaacac 8220
ggatgatctc gcggagggta gcatgttgat tgtaacgatg acagagcgtt gctgcctgtg 8280
atcaccgcgg tttcaaaatc ggctccgtcg atactatgtt atacgccaac tttgaaaaca 8340
actttgaaaa agctgttttc tggtatttaa ggttttagaa tgcaaggaac agtgaattgg 8400
agttcgtctt gttataatta gcttcttggg gtatctttaa atactgtaga aaagaggaag 8460
gaaataataa atggctaaaa tgagaatatc accggaattg aaaaaactga tcgaaaaata 8520
ccgctgcgta aaagatacgg aaggaatgtc tcctgctaag gtatataagc tggtgggaga 8580
aaatgaaaac ctatatttaa aaatgacgga cagccggtat aaagggacca cctatgatgt 8640
ggaacgggaa aaggacatga tgctatggct ggaaggaaag ctgcctgttc caaaggtcct 8700
gcactttgaa cggcatgatg gctggagcaa tctgctcatg agtgaggccg atggcgtcct 8760
ttgctcggaa gagtatgaag atgaacaaag ccctgaaaag attatcgagc tgtatgcgga 8820
gtgcatcagg ctctttcact ccatcgacat atcggattgt ccctatacga atagcttaga 8880
cagccgctta gccgaattgg attacttact gaataacgat ctggccgatg tggattgcga 8940
aaactgggaa gaagacactc catttaaaga tccgcgcgag ctgtatgatt ttttaaagac 9000
ggaaaagccc gaagaggaac ttgtcttttc ccacggcgac ctgggagaca gcaacatctt 9060
tgtgaaagat ggcaaagtaa gtggctttat tgatcttggg agaagcggca gggcggacaa 9120
gtggtatgac attgccttct gcgtccggtc gatcagggag gatatcgggg aagaacagta 9180
tgtcgagcta ttttttgact tactggggat caagcctgat tgggagaaaa taaaatatta 9240
tattttactg gatgaattgt tttagtacct agaatgcatg accaaaatcc cttaacgtga 9300
gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 9360
tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 9420
ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc 9480
gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc 9540
tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg 9600
cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 9660
gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 9720
actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 9780
ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 9840
gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 9900
atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 9960
tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc 10020
tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg 10080
aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcctga tgcggtattt 10140
tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg 10200
ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg 10260
gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg 10320
gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca 10380
ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagggt gccttgatgt gggcgccggc ggtcgagtgg 10440
cgacggcgcg gcttgtccgc gccctggtag attgcctggc cgtaggccag ccatttttga 10500
gcggccagcg gccgcgatag gccgacgcga agcggcgggg cgtagggagc gcagcgaccg 10560
aagggtaggc gctttttgca gctcttcggc tgtgcgctgg ccagacagtt atgcacaggc 10620
caggcgggtt ttaagagttt taatagtttt ccgtctgtcg aagcgtgacc gacgagctgg 10680
cgaggtgatc cgctacgagc ttccagacgg gcacgtagag gtttccgcag ggccggccgg 10740
catggccagt gtgtgggatt acgacctggt actgatggcg gtttcccatc taaccgaatc 10800
catgaaccga taccgggaag ggaagggaga caagcccggc cgcgtgttcc gtccacacgt 10860
tgcggacgta ctcaagttct gccggcgagc cgatggcgga aagcagaaag acgacctggt 10920
agaaacctgc attcggttaa acaccacgca cgttgccatg cagcgtacga agaaggccaa 10980
gaacggccgc ctggtgacgg tatccgaggg tgaagccttg attagccgct acaagatcgt 11040
aaagagcgaa accgggcggc cggagtacat cgagatcgag ctagctgatt ggatgtaccg 11100
cgagatcaca gaaggcaaga acccggacgt gctgacggtt caccccgatt actttttgat 11160
cgatcccggc atcggccgtt ttctctaccg cctggcacgc cgcgccgcag gcaaggcaga 11220
agccagatgg ttgttcaaga cgatctacga acgcagtggc agcgccggag agttcaagaa 11280
gttctgtttc accgtgcgca agctgatcgg gtcaaatgac ctgccggagt acgatttgaa 11340
ggaggaggcg gggcaggctg gcccgatcct agtcatgcgc taccgcaacc tgatcgaggg 11400
cgaagcatcc gccggttcct aatgtacgga gcagatgcta gggcaaattg ccctagcagg 11460
ggaaaaaggt cgaaaaggtc tctttcctgt ggatagcacg tacattggga acccaaagcc 11520
gtacattggg aaccggaacc cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggtc 11580
acacatgtaa gtgactgata taaaagagaa aaaaggcgat ttttccgcct aaaactcttt 11640
aaaactggcc acgtccatga tgctgcgact atcgcgggtg cccacgtcat agagcatcgg 11700
aacgaaaaaa tctggttgct cgtcgccctt gggcggcttc ctaatcgacg gcgcaccggc 11760
tgccggcggt tgccgggatt ctttgcggat tcgatcagcg gccgcttgcc acgattcacc 11820
ggggcgtgct tctgcctcga tgcgttgccg ctgggcggcc tgcgcggcct tcaacttctc 11880
caccaggtca tcacccagcg ccgcgccgat ttgtaccggg ccggatggtt tgcgaccgtc 11940
acgccgattc ctcgggcttg ggggttccag tgccattgca gggccggcag acaacccagc 12000
cgcttacgcc tggccaaccg cccgttcctc cacacatggg gcattccacg gcgtcggtgc 12060
ctggttgttc ttgattttcc atgccgcctc ctttagccgc taaaattcat ctactcattt 12120
attcatttgc tcatttactc tggtagctgc gcgatgtatt cagatagcag ctcggtaatg 12180
gtcttgcctt ggcgtaccgc gtacatcttc agcttggtgt gatcctccgc cggcaactga 12240
aagttgaccc gcttcatggc tggcgtgtct gccaggctgg ccaacgttgc agccttgctg 12300
ctgcgtgcgc tcggacggcc ggcacttagc gtgtttgtgc ttttgctcat tttctcttta 12360
cctcattaac tcaaatgagt tttgatttaa tttcagcggc cagcgcctgg acctcgcggg 12420
cagcgtcgcc ctcgggttct gattcaagaa cggttgtgcc ggcggcggca gtgcctgggt 12480
agctcacgcg ctgcgtgata cgggactcaa gaatgggcag ctcgtacccg gccagcgcct 12540
cggcaacctc accgccgatg cgcgtgcctt tgatcgcccg cgacacgaca aaggccgctt 12600
gtagccttcc atccgtgacc tcaatgcgct gcttaaccag ctccaccagg tcggcggtgg 12660
cccatatgtc gtaagggctt ggctgcaccg gaatcagcac gaagtcggct gccttgatcg 12720
cggacacagc caagtccgcc gcctggggcg ctccgtcgat cactacgaag tcgcgccggc 12780
cgatggcctt cacgtcgcgg tcaatcgtcg ggcggtcgat gccgacaacg gttagcggtt 12840
gatcttcccg cacggccgcc caatcgcggg cactgccctg gggatcggaa tcgactaaca 12900
gaacatcggc cccggcgagt tgcagggcgc gggctagatg ggttgcgatg gtcgtcttgc 12960
ctgacccgcc tttctggtta agtacagcga taaccttcat gcgttcccct tgcgtatttg 13020
tttatttact catcgcatca tatacgcagc gaccgcatga cgcaagctgt tttactcaaa 13080
tacacatcac ctttttagac ggcggcgctc ggtttcttca gcggccaagc tggccggcca 13140
ggccgccagc ttggcatcag acaaaccggc caggatttca tgcagccgca cggttgagac 13200
gtgcgcgggc ggctcgaaca cgtacccggc cgcgatcatc tccgcctcga tctcttcggt 13260
aatgaaaaac ggttcgtcct ggccgtcctg gtgcggtttc atgcttgttc ctcttggcgt 13320
tcattctcgg cggccgccag ggcgtcggcc tcggtcaatg cgtcctcacg gaaggcaccg 13380
cgccgcctgg cctcggtggg cgtcacttcc tcgctgcgct caagtgcgcg gtacagggtc 13440
gagcgatgca cgccaagcag tgcagccgcc tctttcacgg tgcggccttc ctggtcgatc 13500
agctcgcggg cgtgcgcgat ctgtgccggg gtgagggtag ggcgggggcc aaacttcacg 13560
cctcgggcct tggcggcctc gcgcccgctc cgggtgcggt cgatgattag ggaacgctcg 13620
aactcggcaa tgccggcgaa cacggtcaac accatgcggc cggccggcgt ggtggtgtcg 13680
gcccacggct ctgccaggct acgcaggccc gcgccggcct cctggatgcg ctcggcaatg 13740
tccagtaggt cgcgggtgct gcgggccagg cggtctagcc tggtcactgt cacaacgtcg 13800
ccagggcgta ggtggtcaag catcctggcc agctccgggc ggtcgcgcct ggtgccggtg 13860
atcttctcgg aaaacagctt ggtgcagccg gccgcgtgca gttcggcccg ttggttggtc 13920
aagtcctggt cgtcggtgct gacgcgggca tagcccagca ggccagcggc ggcgctcttg 13980
ttcatggcgt aatgtctccg gttctagtcg caagtattct actttatgcg actaaaacac 14040
gcgacaagaa aacgccagga aaagggcagg gcggcagcct gtcgcgtaac ttaggacttg 14100
tgcgacatgt cgttttcaga agacggctgc actgaacgtc agaagccgac tgcactatag 14160
cagcggaggg gttggatcaa agtactttga tcccgagggg aaccctgtgg ttggcatgca 14220
catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt taaatatccg ttattctaat 14280
aaacgctctt ttctcttagg tttacccgcc aatatatcct gtcaaacact gatagtttaa 14340
ttcccgatct agtaacatag atgacaccgc gcgcgataat ttatcctagt ttgcgcgcta 14400
tattttgttt tctatcgcgt attaaatgta taattgcggg actctaatca taaaaaccca 14460
tctcataaat aacgtcatgc attacatgtt aattattaca tgcttaacgt aattcaacag 14520
aaattatatg ataatcatcg caagaccggc aacaggattc aatcttaaga aactttattg 14580
ccaaatgttt gaacgatcgg ggaaattcga gctggtcacc tgtaattcac acgtggtggt 14640
ggtggtggtg gctagcttgt ttgcctccct gctgcggttt ttcaccgaag ttcatgccag 14700
tccagcgttt ttgcagcaga aaagccgccg acttcggttt gcggtcgcga gtgaagatcc 14760
ctttcttgtt accgccaacg cgcaatatgc cttgcgaggt cgcaaaatcg gcgaaattcc 14820
atacctgttc accgacgacg gcgctgacgc gatcaaagac gcggtgatac atatccagcc 14880
atgcacactg atactcttca ctccacatgt cggtgtacat tgagtgcagc ccggctaacg 14940
tatccacgcc gtattcggtg atgataatcg gctgatgcag tttctcctgc caggccagaa 15000
gttctttttc cagtaccttc tctgccgttt ccaaatcgcc gctttggaca taccatccgt 15060
aataacggtt caggcacagc acatcaaaga gatcgctgat ggtatcggtg tgagcgtcgc 15120
agaacattac attgacgcag gtgatcggac gcgtcgggtc gagtttacgc gttgcttccg 15180
ccagtggcgc gaaatattcc cgtgcacctt gcggacgggt atccggttcg ttggcaatac 15240
tccacatcac cacgcttggg tggtttttgt cacgcgctat cagctcttta atcgcctgta 15300
agtgcgcttg ctgagtttcc ccgttgactg cctcttcgct gtacagttct ttcggcttgt 15360
tgcccgcttc gaaaccaatg cctaaagaca gctgaaagcc gacagcagca gtttcatcaa 15420
tcaccacgat gccatgttca tctgcccagt cgagcatctc ttcagcgtaa gggtaatgcg 15480
aggtacggta ggagttggcc ccaatccagt ccattaatgc gtggtcgtgc accatcagca 15540
cgttatcgaa tcctttgcca cgtaagtccg catcttcatg acgaccaaag ccagtaaagt 15600
agaacggttt gtggttaatc aggaactgtt ggcccttcac tgccactgac cggatgccga 15660
cgcgaagcgg gtagatatca gactctgtct ggcttttggc tgtgacttcg agttcataga 15720
gataaccttc acccggttgc cagaggtgcg gattcaccac ttgcaaagtc ccgctagtgc 15780
cttgtccagt tgcaaccacc tgttgatccg catcacgcag ttcaacgctg acatcaccat 15840
tggccaccac ctgccagtca acagacgcgt ggttacagtc ttgcgcgaca tgcgtcacca 15900
cggtgatatc gtccacccag gtgttcggcg tggtgtagag cattacgctg cgatggattc 15960
cggcatagtt aaagaaatca tggaagtaag actgcttttt cttgccgttt tcgtcggtaa 16020
tcaccattcc cggcgggata gtctgccagt tcagttcgtt gttcacacaa acggtgatac 16080
gtacactttt cccggcaata acatacggcg tgacatcggc ttcaaatggc gtatagccgc 16140
cctgatgctc catcacttcc tgattattga cccacacttt gccgtaatga gtgaccgcat 16200
cgaaacgcag cacgatacgc tggcctgccc aacctttcgg tataaagact tcgcgctgat 16260
accagacgtt gcccgcataa ttacgaatat ctgcatcggc gaactgatcg ttaaaactgc 16320
ctggcacagc aattgcccgg ctttcttgta acgcgctttc ccaccaacgc tgatcaattc 16380
cacagttttc gcgatccaga ctgaatgccc acaggccgtc gagttttttg atttcacggg 16440
ttggggtttc tacaggacgg acgagtcgtc ggttctgtaa ctatcatcat catcatagac 16500
acacgaaata aagtaatcag attatcagtt aaagctatgt aatatttaca ccataaccaa 16560
tcaattaaaa aatagatcag tttaaagaaa gatcaaagct caaaaaaata aaaagagaaa 16620
agggtcctaa ccaagaaaat gaaggagaaa aactagaaat ttaccctcag atc 16673
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgactctaga ggatccatgg cgcccaaggc gg 32
<210> 11
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cttgctcacc atggtggcga ccggtggatc agaggaagtg aacttggtga cgg 53
<210> 12
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aagttcactt cctctgatcc accggtcgcc accatggtga gcaagggcga ggagg 55
<210> 13
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gatcggggaa attcgagctc ttacttgtac agctcgtcca tgcc 44
<210> 14
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgactctaga ggatccatgg atctgcctca ggctagg 37
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gctgggtcgc agctgccgca gtagggtgct ttagcctgaa gg 42
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttcaggctaa agcaccctac tgcggcagct gcgacc 36
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtagatcttc ccatggtacc ctcttcttct tgatcagctt ctgtg 45
<210> 18
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gattacgcta ctagagtgaa gcagaccctc aacttcg 37
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgggcgccat ggatcccggg ccaggattgg actc 34
<210> 20
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cgactctaga ggatcatgga tctgcctcag gctagg 36
<210> 21
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gagggtctgc ttcactctag tagcgtaatc tggaacgtca tatgg 45
<210> 22
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cgactctaga ggatccatgg atctgcctca ggctgccgcc gcgtcgcttc accggttc 58
<210> 23
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gagggtctgc ttcactctag tagcgtaatc tggaacgtca tatgg 45
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ggacattgac gacacagaag c 21
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gccttctcgg ccttctcc 18
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ctagaggatc cccgggtacc atgggaagat ctactagttc 40
<210> 27
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gctctctaga actagtgtca ccttatctag tagcgt 36

Claims (6)

1.一种茉莉素生物传感器的构建系统，其特征在于：所述构建系统携带多顺反子，包括茉莉素感受元件，以及核内参元件；
所述茉莉素感受元件包括OsJAZ6基因中含有的OsJas6序列、荧光蛋白VENUS编码基因和标签HA编码基因；所述OsJas6序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，所述VENUS编码基因如序列表中SEQ ID NO.3所示，所述HA编码基因如序列表中SEQ ID NO.4所示；
所述核内参元件包括OsH2B.6编码基因、荧光蛋白mCherry编码基因和启动子Ubiquitin；所述OsH2B.6编码基因如序列表中SEQ ID NO.5所示；所述mCherry编码基因如序列表中SEQ ID NO.6所示；所述Ubiquitin如序列表中SEQ ID NO.8所示。
2.根据权利要求1所述的构建系统，其特征在于：所述构建系统含有Ubi-1:Jas6-VENUS-6HA:F2A:H2B-mCherry片段，基因序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
3.一种含有如权利要求1～2中任一项所述构建系统的编码基因的表达盒、重组菌或重组细胞系，所述重组细胞系为非动物或者植物品种。
4.一种含有如权利要求1～2中任一项所述构建系统的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为重组表达载体J6V-HM；所述J6V-HM为Ubi-1:Jas6-VENUS-6HA:F2A:H2B-mCherry片段连接在载体pTCK303-6HA中，基因序列如序列表中SEQ ID NO.9所示。
5.一种水稻茉莉素生物传感器株系的构建方法，其特征在于：将权利要求4所述重组表达载体J6V-HM导入水稻愈伤组织中，获得茉莉素生物传感器株系。
6.一种利用权利要求1所述的生物传感器检测茉莉素的方法，其特征在于：通过比较茉莉素感受元件和核内参元件所带荧光蛋白信号的比值计算茉莉素的含量。
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