CN105137092A - 一种检测待测样品中的茉莉酸-异亮氨酸含量的方法 - Google Patents

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CN105137092A CN201510557842.1A CN201510557842A CN105137092A CN 105137092 A CN105137092 A CN 105137092A CN 201510557842 A CN201510557842 A CN 201510557842A CN 105137092 A CN105137092 A CN 105137092A
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杨脉
闫建斌
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Abstract

本发明公开了一种检测待测样品中的茉莉酸-异亮氨酸含量的方法。本发明所提供的一种检测待测样品中的茉莉酸-异亮氨酸含量的方法包括如下步骤：通过酶联免疫吸附法检测待测样品中的茉莉酸-异亮氨酸含量；所述酶联免疫吸附法中，以JAZ1蛋白为包被原，以含有COI1蛋白和待测样品的溶液为待测溶液，以抗COI1蛋白的抗体为一抗。利用本发明所提供的方法可检测待测样品中茉莉酸-异亮氨酸的含量，在评价植物防御反应能力和/或生长发育能力中具有重要的应用。

Description

一种检测待测样品中的茉莉酸-异亮氨酸含量的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测待测样品中的茉莉酸-异亮氨酸含量的方法，以及该方法在评价植物防御反应能力和生长发育能力中的应用。
背景技术
检测植物激素的方法有很多，如高效液相色谱(HPLC)、气象色谱-质谱联用(GC-MS)、毛细管电泳法(CE)、酶联免疫法(ELISA)等，其中高效液相色谱法和气象色谱-质谱联用法虽然可以比较准确的测量植物激素的含量，但对于仪器以及被测量材料的要求较高，毛细管电泳法也需要对样品进行荧光衍生化处理，不便于一般实验中的测量。相比而言，酶联免疫(ELISA)法无需昂贵的仪器，操作简便，也可以同时进行多个样品的检测，所以被用于检测各种植物激素含量的实验中。
酶联免疫吸附法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体——聚苯乙烯微孔板表面进行的一种技术。现在已有的酶联免疫法主要用于检测茉莉酸(Jasmonic，JA)的含量。而检测植物体内具有活性的茉莉素分子—茉莉酸-异亮氨酸(jasmonoyl-isoleucine,JA-Ile)的方法还没有。
发明内容
本发明的目的是提供检测待测样品中的茉莉酸-异亮氨酸含量的方法，以及该方法在评价植物防御反应能力和/或生长发育能力中的应用。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种检测待测样品中的茉莉酸-异亮氨酸含量的方法。
本发明所提供的一种检测茉莉酸-异亮氨酸的浓度的方法，可包括如下步骤：通过酶联免疫吸附法检测待测样品中茉莉酸-异亮氨酸含量；所述酶联免疫吸附法中，以JAZ1蛋白为包被原，以含有COI1蛋白和待测样品的溶液为待测溶液，以抗COI1蛋白的抗体为一抗。
本发明所提供的一种检测茉莉酸-异亮氨酸的浓度的方法，具体可包括下述步骤：
(1)取酶标板，以JAZ1蛋白为包被原进行包被；
(2)加入含有COI1蛋白和待测样品(待测样品疑似含有JA-Ile)的溶液；
(3)加入一抗；所述一抗为抗COI1蛋白的抗体；
(4)加入酶标二抗；所述二抗为抗一抗的抗体；
(5)加入显色剂或发光液；
(6)检测颜色变化或发光强度，得到待测样品中的茉莉酸-异亮氨酸含量。
上述方法中，所述JAZ1蛋白的包被浓度可为15μg/ml。
上述方法中，所述JAZ1蛋白可为a1)或b1)或c1)：
a1)氨基酸序列是SEQIDNo.1所示的蛋白质；
b1)氨基酸序列是SEQIDNo.5所示的蛋白质；
c1)将SEQIDNo.1或SEQIDNo.5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与JAZ1蛋白相关的蛋白质。
上述方法中，所述COI1蛋白可为a2)或b2)或c2)：
a2)氨基酸序列是SEQIDNo.3所示的蛋白质；
b2)氨基酸序列是SEQIDNo.6所示的蛋白质；
c2)将SEQIDNo.3或SEQIDNo.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与COI1蛋白相关的蛋白质。
上述方法中，所述抗COI1蛋白的抗体可为以所述COI1蛋白为免疫原得到的抗体。上述方法中，所述抗COI1蛋白的抗体具体可为以所述COI1蛋白为免疫原免疫SPFBalb/c雌性小鼠得到的抗体，对应的酶标二抗可为Abmart公司的GoatAnti-MouseIgG-HRP。
上述方法中，所述抗COI1蛋白的抗体还可为Abiocode公司的COI1(C2)抗体，对应的酶标二抗可为Abiocode公司的anti-Rabbit。
本发明还提供了试剂盒。
所述试剂盒可包括JAZ1蛋白、COI1蛋白和抗COI1蛋白抗体。
所述试剂盒可包括包被JAZ1蛋白的酶标板、COI1蛋白和抗COI1蛋白的抗体。
上述任一所述试剂盒还可包括茉莉酸-异亮氨酸标准品。
上述任一所述试剂盒还可包括酶标二抗，如Abmart公司的GoatAnti-MouseIgG-HRP或Abiocode公司的anti-Rabbit。
上述任一所述试剂盒中，所述包被JAZ1蛋白的酶标板中所述JAZ1蛋白的包被浓度可为15μg/ml。
上述任一所述试剂盒中，所述JAZ1蛋白可为a1)或b1)或c1)：
a1)氨基酸序列是SEQIDNo.1所示的蛋白质；
b1)氨基酸序列是SEQIDNo.5所示的蛋白质；
c1)将SEQIDNo.1或SEQIDNo.5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与JAZ1蛋白相关的蛋白质。
上述任一所述试剂盒中，所述COI1蛋白可为a2)或b2)或c2)：
a2)氨基酸序列是SEQIDNo.3所示的蛋白质；
b2)氨基酸序列是SEQIDNo.6所示的蛋白质；
c2)将SEQIDNo.3或SEQIDNo.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与COI1蛋白相关的蛋白质。
上述任一所述试剂盒中，所述抗COI1蛋白的抗体可为以所述COI1蛋白为免疫原得到的抗体。上述任一所述试剂盒中，所述抗COI1蛋白的抗体具体可为以所述COI1蛋白为免疫原免疫SPFBalb/c雌性小鼠得到的抗体，对应的酶标二抗可为Abmart公司的GoatAnti-MouseIgG-HRP。
上述任一所述试剂盒中，所述抗COI1蛋白的抗体还可为Abiocode公司的COI1(C2)抗体，对应的酶标二抗可为Abiocode公司的anti-Rabbit。
上述任一所述检测茉莉酸-异亮氨酸的浓度的方法、上述任一所述试剂盒在评价植物防御反应能力和/或生长发育能力中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述植物可为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体可为十字花科植物；所述十字花科植物可为拟南芥。
实验证明，利用本发明所提供的一种检测茉莉酸-异亮氨酸的浓度的方法可检测待测样品中茉莉酸-异亮氨酸的含量，而且特异性强，灵敏度高，对茉莉酸-异亮氨酸的浓度的最小检测限为10nM。利用本发明所提供的一种检测茉莉酸-异亮氨酸的浓度的方法在评价植物防御反应能力和/或生长发育能力中具有重要的应用。
附图说明
图1为JAZ1蛋白包被浓度确定实验。
图2为检测待测样品中的茉莉酸-异亮氨酸含量的方法检测JA-Ile的特异性。
图3为检测待测样品中的茉莉酸-异亮氨酸含量的方法检测JA-Ile的灵敏度。
图4为检测植物提取物中JA-Ile的含量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
本实施例中的定量实验，如无特殊说明均设置三次重复，结果取平均值。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的微孔板为PerkinElmer公司产品，货号为6005290；IAA为Sigma公司产品，货号为I2886；茉莉酸甲酯(Methyljasmonate)和茉莉酸((±)-Jasmonicacid)为Sigma公司产品，货号分别为392707和J2500，在下文中分别简称MeJA和JA；酶标二抗(GoatAnti-MouseIgG-HRP)为Abmart公司产品，货号为M21001，在下文中简称Anti-Mouse；SuperECLPlus超敏发光液为北京普利莱基因技术有限公司产品，产品货号为p1010；成像仪为Proteinsimple公司产品；酶标仪为PerkinElme公司产品；质粒pET28a(+)为Novagen公司产品；Ni-NTA重力柱为Qiagen公司产品，货号为30210；大肠杆菌BL21(DE3)为全式金公司产品，货号为CD701-03。
下述实施例中的野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)(Columbia-0亚型)(KimH,HyunY,ParkJ,ParkM,KimM,KimH,LeeM,MoonJ,LeeI,KimJ.AgeneticlinkbetweencoldresponsesandfloweringtimethroughFVEinArabidopsisthaliana.NatureGenetics.2004,36:167-171)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。拟南芥(Arabidopsisthaliana)(Columbia-0亚型)在下文中简称野生型拟南芥。
下述实施例中的茉莉酸-异亮氨酸为实验室合成，茉莉酸-异亮氨酸的分子式见式1，茉莉酸-异亮氨酸在下文简称JA-Ile。
下述实施例中的拟南芥茉莉素合成突变体aos为通过Tair网站购买，网址为：https://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject？id＝133493&type＝locus。
下述实施例中涉及的缓冲液如下：
包被液：pH9.6、50mM碳酸盐缓冲液。
封闭液：向包被液中加牛血清蛋白(BSA)至其含量为1％(质量百分比)。
洗涤液(pH7.4)：向蒸馏水中加入KH2PO40.2g，Na2HPO412H2O2.9g，NaCl8g，KCl0.2g，Tween-200.05％(体积百分比)，定容至1L。
抗体稀释液(pH7.4)：向洗涤液中加牛血清蛋白(BSA)至其含量为1％(质量百分比)。
下述实施例中涉及的JAZ1蛋白、COI1蛋白和抗COI1蛋白的抗体的制备方法分别如下：
制备JAZ1蛋白：
(1)载体构建：人工合成SEQIDNo.2所示的DNA分子(JAZ1基因)，编码SEQIDNo.1所示的JAZ1蛋白。将质粒pET28a(+)的BamHⅠ识别序列和HindⅢ识别序列间的DNA替换为核苷酸序列是SEQIDNo.2的DNA分子，保持pET28a(+)的其它序列不变得到JAZ1基因表达载体，其名称为pET28a/JAZ1。pET28a/JAZ1中，JAZ1基因与载体骨架上的部分核苷酸融合，可表达SEQIDNo.5所示的带His标签的JAZ1蛋白。
(2)JAZ1蛋白的表达：将重组表达质粒pET28a/JAZ1导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有pET28a/JAZ1的重组大肠杆菌，将该重组大肠杆菌命名为BL21(DE3)/pET28a/JAZ1。将BL21(DE3)/pET28a/JAZ1接种于LB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)，37℃、220rpm振荡培养过夜得到BL21(DE3)/pET28a/JAZ1培养菌液1，然后将BL21(DE3)/pET28a/JAZ1培养菌液1以1:100(体积比)接种到含50μg/ml卡那霉素的LBG液体培养基(向蒸馏水中加入10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，5g氯化钠，2g葡萄糖，然后定容至1L)中，37℃、245rpm振荡培养至OD600值为0.6，得到BL21(DE3)/pET28a/JAZ1培养菌液2。向BL21(DE3)/pET28a/JAZ1培养菌液2中加入IPTG(使其在培养体系中的浓度为1mM)，37℃诱导3h，离心收集菌体。
(3)JAZ1蛋白的纯化：向步骤(2)收集到的菌体加入LysisBuffer(pH7.4、50mMTris-HCl，200mM氯化钠)悬浮并超声破碎，得到菌体破碎液。将菌体破碎液12000rpm离心15min，得到上清液，将该上清上样至Ni-NTA重力柱中，先用WashBuffer(pH7.4、50mMTris-HCl，200mM氯化钠，20mM咪唑)洗去杂蛋白，再用ElutionBuffer(pH7.4、50mMTris-HCl，250mM咪唑)进行竞争洗脱，收集洗脱液，用超滤管(Millipore公司产品)浓缩至2ml。浓缩液上样至SUPERDEX20010/300GL凝胶过滤柱(美国GE公司产品)，收集蛋白峰，分装后-80℃保存。
制备COI1蛋白：
(1)载体构建：人工合成SEQIDNo.4所示的DNA分子(COI1基因)，编码SEQIDNo.3所示的COI1蛋白。将质粒pET28a(+)的BamHⅠ识别序列和HindⅢ识别序列间的DNA替换为核苷酸序列是SEQIDNo.4的DNA分子，保持pET28a(+)的其它序列不变得到COI1基因表达载体，其名称为pET28a/COI1。pET28a/COI1中，COI1基因与载体骨架上的部分核苷酸融合，可表达SEQIDNo.6所示的带His标签的COI1蛋白。
(2)COI1蛋白的表达：按照CellfectinⅡReagent试剂(lifetechnologies公司产品，货号为10362-100)和试剂说明书提供的方法将重组表达质粒pET28a/COI1转染到sf-9昆虫细胞(Life公司产品,货号为12659-017)，经过3代培养，得到足够量的重组细胞。
(3)COI1蛋白的纯化：按照制备JAZ1蛋白中的步骤(3)的方法，将制备JAZ1蛋白步骤(3)中菌体替换为制备COI1蛋白步骤(2)的重组细胞，其它方法均不变，纯化得到COI1蛋白。
制备抗COI1蛋白的抗体：
抗COI1蛋白的抗体由北京华大蛋白质研发中心有限公司制备，制备方式具体为用上述制备的COI1蛋白免疫SPFBalb/c雌性小鼠收集血清得到抗COI1蛋白的抗体。
实施例1、检测待测样品中的JA-Ile含量的方法的建立
茉莉素(Jasmonates，JAs)是一类具有环戊烷酮结构的新型植物激素。茉莉素广泛参与调控植物的生长发育过程，如雄蕊发育和根的生长，同时还参与植物的防御反应，比如抵抗病原菌的侵害以及昆虫的噬咬。茉莉素的含量影响着植物体对于病虫害的抵御能力，监测植物体内茉莉素的含量对于研究茉莉素的分布和功能也具有重要的意义。而植物体内具有活性的茉莉素分子—茉莉酸-异亮氨酸可以介导受体COI1蛋白和JAZ1蛋白的互作，并促使JAZ1蛋白被26S蛋白酶体降解，释放下游转录因子，开启下游基因的表达，从而调控植物的防御反应。利用JA-Ile可以介导COI1蛋白与JAZ1蛋白相互作用的原理，建立了一种通过检测与JAZ1蛋白相互作用的COI1的蛋白量，标示JA-Ile含量的方法。
检测待测样品中的JA-Ile含量的方法如下：
1、取微孔板，用JAZ1蛋白进行包被；
2、加入含有COI1蛋白和待测样品(待测样品疑似含有JA-Ile)的待测溶液，孵育；
3、加入抗COI1蛋白的抗体(一抗)，孵育；
4、加入酶标二抗，孵育；
5、加入发光液或显色液，孵育；
6、在酶标仪下进行检测。
实施例2、检测待测样品中的JA-Ile含量的方法中JAZ1蛋白包被浓度的确定
确定JAZ1蛋白包被浓度的步骤如下：
1、取微孔板，用JAZ1蛋白作为包被原进行包被(分别设置以下包被浓度：(10μg/ml，5μg/ml，2.5μg/ml，1μg/ml，0.5μg/ml，0.25μg/ml，0.1μg/ml，50ng/ml，25ng/ml，10ng/ml，5ng/ml，0ng/ml)，用封口膜封好，4℃、50rpm(实际应用中40-50rpm均可)包被18h(实际应用中18-20h均可)，然后弃上清，用洗涤液洗涤，拍干；
2、完成步骤1后，加入封闭液，用封口膜封好微孔板，37℃、60rpm(实际应用中40-60rpm均可)封闭2h，然后弃上清，用洗涤液洗涤，拍干；
3、完成步骤2后，向微孔板每孔加入含有1μgCOI1蛋白和10μl浓度为1mM的JA-Ile的抗体稀释液，用封口膜封好，4℃、60rpm(实际应用中40-60rpm均可)孵育1h；然后弃上清，用洗涤液洗涤，拍干；
4、完成步骤3后，每孔加入100μl抗COI1蛋白的抗体(工作浓度为1:1000，用抗体稀释液稀释)，用封口膜封好，室温、60rpm(实际应用中40-60rpm均可)孵育1h；然后弃上清，用洗涤液洗涤，拍干；
5、完成步骤4后，每孔加入100μl酶标二抗(工作浓度为1:500，抗体稀释液稀释)，用封口膜封好，室温、60rpm(实际应用中40-60rpm均可)孵育1h；然后弃上清，用洗涤液洗涤，拍干；
6、完成步骤5后，每孔加入SuperECLPlus超敏发光液100μl，计时1min。然后用成像仪拍摄。
加入SuperECLPlus超敏发光液后用成像仪拍摄的照片见图2(图2中，孔1为JAZ1蛋白包被浓度10μg/ml，孔2为JAZ1蛋白包被浓度5μg/ml，孔3为JAZ1蛋白包被浓度2.5μg/ml250ng，孔4为JAZ1蛋白包被浓度1μg/ml100ng，孔5为JAZ1蛋白包被浓度0.5μg/ml50ng，孔6为JAZ1蛋白包被浓度0.25μg/ml25ng，孔7为JAZ1蛋白包被浓度0.1μg/ml10ng，孔8为JAZ1蛋白包被浓度50ng/ml5ng，孔9为JAZ1蛋白包被浓度25ng/ml2.5ng，孔10为JAZ1蛋白包被浓度10ng/ml1ng，孔11为JAZ1蛋白包被浓度5ng/ml500pg，孔12为JAZ1蛋白包被浓度0ng/ml)。结果表明，JAZ1蛋白包被量越高，信号越强，越有利于检测，为了保证JAZ1包被量足够，最终确定的JAZ1蛋白包被浓度为15μg/ml，即如果微孔板每孔包被液体积为100μl,则每孔包被1.5μgJAZ1蛋白。
实施例3、检测待测样品中的JA-Ile含量的方法检测JA-Ile的特异性
检测待测样品中的JA-Ile含量的方法检测JA-Ile的特异性的方法如下：
1、用抗体稀释液将激素小分子(JA-Ile、MeJA或IAA)分别稀释至100μM。用无水乙醇作为阴性对照。
2、按照实施例2中的方法将微孔板每孔包被1.5μgJAZ1蛋白。
3、完成步骤1和2后，向微孔板每孔加入90μl包含1μgCOI1蛋白的抗体稀释液，然后再向微孔板每孔加入10μl浓度为1mM的激素小分子(JA-Ile、MeJA或IAA)，使激素小分子在体系中浓度为100μM，每孔体积为100μl；阴性对照孔中，将激素小分子替换为10μl无水乙醇，其他成分不变。3孔平行。用封口膜封好，4℃、60rpm(实际应用中40-60rpm均可)孵育1h；然后弃上清，用洗涤液洗涤，拍干；
4、完成步骤3后，按照实施例2中步骤4-6的方法，在酶标仪波长430nm处，测量各孔的发光值。
实验结果见图3(图3中，mock为阴性对照)。结果表明，本发明提供的检测待测样品中的JA-Ile含量的方法能特异性的检测激素小分子JA-Ile。
实施例4、检测待测样品中的JA-Ile含量的方法检测JA-Ile的灵敏度
检测待测样品中的JA-Ile含量的方法检测JA-Ile的灵敏度的方法如下：
1、用抗体稀释液将JA-Ile分别稀释至1mM、100μM、10μM、1μM和100nM。用无水乙醇作为阴性对照。
2、按照实施例2中的方法将微孔板每孔包被1.5μgJAZ1蛋白。
3、完成步骤1和2后，向微孔板每孔加入90μl包含1μgCOI1蛋白的抗体稀释液，然后再向微孔板每孔加入10μl步骤1中配置的不同浓度的JA-Ile，则JA-Ile在体系中的浓度分别为100μM、10μM、1μM、100nM和10nM；阴性对照孔中，将JA-Ile替换为10μl无水乙醇，其他成分不变，作为阴性对照。3孔平行。用封口膜封好，4℃、60rpm(实际应用中40-60rpm均可)孵育1h；然后弃上清，用洗涤液洗涤，拍干；
4、完成步骤3后，按照实施例2中步骤4-6的方法，在酶标仪波长430nm处，测量各孔的发光值。
实验结果见图4(图4中，mock为阴性对照)。以JA-Ile溶液浓度为横坐标，以各浓度JA-Ile的发光值的平均值为纵坐标，绘制散点图；采用一元线性回归的数据拟合方式，得到线性回归方程为y＝0.0201x+0.9724(R2＝0.93276)。结果表明，本发明提供ELISA检测JA-Ile的方法对JA-Ile的最小检测限为10nM。
实施例5、检测植物提取物中JA-Ile的含量
一、植株材料提取JA-Ile
1、在液氮中研磨野生型拟南芥叶片，然后称取200mg液氮研磨后的粉末于EP管中。
2、完成步骤1后，加入1.5ml提取液(85％甲醇水溶液)，充分混合，14000g离心10min后取上清备用。
3、准备WatersSep-PakC18固相萃取柱(Waters公司产品，产品目录号为wat020805)：将WatersSep-PakC18固相萃取柱固定在架子上，依次加入1ml无水甲醇和1ml85％甲醇水溶液，不收集液体。
4、完成步骤3后，将步骤2获得的上清加入步骤3准备好的WatersSep-PakC18固相萃取柱中，收集液体。
5、完成步骤4后，加入1ml85％甲醇溶液到固相萃取柱中，收集液体。
6、将步骤4和5收集的液体混合，放在旋蒸仪中蒸干溶剂得到油状溶质。
7、向步骤6得到的油状溶质中加入200μl无水乙醇，震荡溶解后离心，上清即为茉莉素小分子提取物，命名为拟南芥茉莉素提取物。
按照上述步骤，将野生型拟南芥分别替换为伤处理野生型拟南芥和拟南芥茉莉素合成突变体aos，其它步骤均不变，得到的上清分别命名为伤处理茉莉素提取物和突变体茉莉素提取物。
其中，伤处理野生型拟南芥的获得方法如下：用止血钳处理未抽薹的拟南芥叶片，每个叶片夹1-2s，静置30min后取经止血钳夹过的拟南芥叶片作为材料。
二、检测植物提取物中的JA-Ile的含量
1、按照实施例2中的方法将微孔板每孔包被1.5μgJAZ1蛋白。
2、向微孔板每孔加入90μl包含1μgCOI1蛋白的抗体稀释液，然后再向微孔板每孔加入10μl提取物(拟南芥茉莉素提取物、伤处理茉莉素提取物或突变体茉莉素提取物)或无水乙醇，每个浓度做3孔平行，用封口膜封好，水平摇床40-60rpm，4℃孵育1h；去除孵育完的蛋白小分子溶液，用洗涤液洗板5次，拍干。
3、完成步骤2后，按照实施例2中步骤4-6的方法，在酶标仪波长430nm处，测量各孔的发光值。
4、完成步骤3后，根据步骤3测量各孔的发光值和实施例4得到线性回归方程为y＝0.0201x+0.9724(R2＝0.93276)，计算提取物JA-Ile的含量。进一步根据公式计算得到拟南芥中JA-Ile的含量，公式为：
实验结果见图5(图5中，mock为阴性对照，Col-0为野生型拟南芥，Col-0wounding为伤处理野生型拟南芥，aos为拟南芥茉莉素合成突变体aos)和表2。结果表明，野生型拟南芥茉莉素提取物、野生型拟南芥伤处理茉莉素提取物和拟南芥突变体茉莉素提取物中JA-Ile的浓度分别为3.0100nM、427.3807nM和19.8096nM，进一步计算得到相应的野生型拟南芥、伤处理野生型拟南芥和拟南芥茉莉素合成突变体aos中JA-Ile的含量为0.0030nmol/g、0.4274nmol/g和0.0198nmol/g。
表2拟南芥提取物含量的测定

Claims (10)

1.一种检测待测样品中茉莉酸-异亮氨酸含量的方法，包括如下步骤：
通过酶联免疫吸附法检测待测样品中茉莉酸-异亮氨酸含量；
所述酶联免疫吸附法中，以JAZ1蛋白为包被原，以含有COI1蛋白和待测样品的溶液为待测溶液，以抗COI1蛋白的抗体为一抗。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述JAZ1蛋白的包被浓度为15μg/ml。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述JAZ1蛋白为a1)或b1)或c1)：
a1)氨基酸序列是SEQIDNo.1所示的蛋白质；
b1)氨基酸序列是SEQIDNo.5所示的蛋白质；
c1)将SEQIDNo.1或SEQIDNo.5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与JAZ1蛋白相关的蛋白质；
所述COI1蛋白为a2)或b2)或c2)：
a2)氨基酸序列是SEQIDNo.3所示的蛋白质；
b2)氨基酸序列是SEQIDNo.6所示的蛋白质；
c2)将SEQIDNo.3或SEQIDNo.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与COI1蛋白相关的蛋白质。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述抗COI1蛋白的抗体为以氨基酸序列为SEQIDNo.3所示的蛋白质为免疫原得到的抗体。
5.一种试剂盒，包括JAZ1蛋白、COI1蛋白和抗COI1蛋白的抗体。
6.一种试剂盒，包括包被JAZ1蛋白的酶标板、COI1蛋白和抗COI1蛋白的抗体。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包被JAZ1蛋白的酶标板中所述JAZ1蛋白的包被浓度为15μg/ml。
8.如权利要求5-7任一所述试剂盒，其特征在于：所述JAZ1蛋白为a1)或b1)或c1)：
a1)氨基酸序列是SEQIDNo.1所示的蛋白质；
b1)氨基酸序列是SEQIDNo.5所示的蛋白质；
c1)将SEQIDNo.1或SEQIDNo.5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与JAZ1蛋白相关的蛋白质；
所述COI1蛋白为a2)或b2)或c2)：
a2)氨基酸序列是SEQIDNo.3所示的蛋白质；
b2)氨基酸序列是SEQIDNo.6所示的蛋白质；
c2)将SEQIDNo.3或SEQIDNo.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与COI1蛋白相关的蛋白质。
9.如权利要求5-8所述的试剂盒，其特征在于：所述抗COI1蛋白的抗体为以氨基酸序列为SEQIDNo.3所示的蛋白质为免疫原得到的抗体。
10.权利要求1-5任一所述方法和权利要求6-9任一所述试剂盒在评价植物防御反应能力和/或生长发育能力中的应用。
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