CN109580943B - 镥铕共发光时间分辨荧光免疫检测嗜水气单胞菌b11的方法 - Google Patents

镥铕共发光时间分辨荧光免疫检测嗜水气单胞菌b11的方法 Download PDF

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Abstract

镥铕共发光时间分辨荧光免疫检测嗜水气单胞菌B11的方法，涉及共发光时间分辨荧光免疫分析。制备嗜水气单胞菌B11抗血清；纯化B11抗体；建立共发光体系；检测B11的镥铕共发光TRFIA。在过量Lu3+下，Eu3+‑TTA‑phen‑Triton X‑100体系的荧光强度增强。对共发光体系条件优化，结果表明当Lu3+、TTA、phen、Triton X‑100浓度为7.5×10‑6mol/L、5×10‑5mol/L、4×10‑4mol/L和0.075％时，共发光体系荧光强度最大。应用直接共发光TRFIA法检测B11，检测到1×103cfu/mL的菌，比用直接TRFIA检测结果降低两个数量级。

Description

镥铕共发光时间分辨荧光免疫检测嗜水气单胞菌B11的方法
技术领域
本发明涉及共发光时间分辨荧光免疫分析，尤其是涉及镥铕共发光时间分辨荧光免疫检测嗜水气单胞菌B11的方法。
背景技术
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)可引发人类败血症、脑膜炎、腹泻等疾病(辛志明，等.嗜水气单胞菌胶体金快速检测试纸条的研制.中国兽医科学.2012,42:708-712)。高灵敏检测嗜水气单胞菌，可有效降低病害造成的损失，起到疾病预防和控制的作用。
免疫检测法操作简单、特异性强，常用于病原菌检测，但酶联免疫吸附法(ELISA)和荧光抗体法灵敏度不高，时间分辨荧光免疫检测(TRFIA)是用稀土离子螯合物作为标记，具有灵敏度高、操作简便、示踪物稳定的优点，但由于病原菌为颗粒性抗原，会干扰时间分辨荧光的测定，因此TRFIA法检测病原菌报道不多(林鹏,等.产酸克雷伯氏菌的时间分辨荧光免疫检测法,专利号ZL2011103430972,2011)。有研究表明，向Eu3+等稀土离子的螯合物体系中加入一定量的其它稀土离子，可以大大增强原体系的荧光强度，这种特殊的荧光增强现象是称之为“共发光效应”(杨景和,等.稀土元素的共发光效应.山东大学学报,自然科学版,1986:133-138)。基于以上理论，我们首先将Eu3+螯合物标记到嗜水气单胞菌抗体上，完成免疫反应后，加入共发光Lu3+，由于共发光效应，时间分辨荧光大大增强，从而细菌检测的灵敏度得到极大提高。共发光TRFIA法检测病原菌从未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高灵敏的镥铕共发光时间分辨荧光免疫检测嗜水气单胞菌B11的方法。
所述嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)B11已于2018年09月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072，保藏中心保藏编号为CCTCCNO：M2018642。
本发明包括以下步骤：
1)制备嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)B11抗血清；
在步骤1)中，所述制备嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)B11抗血清的具体方法可为：
将嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)B11接种于0.5％NaCl的牛肉膏蛋白胨培养液中，27℃培养24h，用甲醛及加热两种方法灭活，离心(4500r/min，5min)，再加入无菌生理盐水洗涤，调整细菌浓度至6×108cfu/mL备用；选择2只健康的2～3kg的新西兰大白兔，背部两侧皮下多点注射免疫，分4次免疫，免疫间隔期为2周，第1次免疫时与弗氏完全佐剂1∶1混合、乳化，第2次免疫时与弗氏不完全佐剂1∶1混合乳化，第3、4次免疫采用菌液注射，每次每只注射剂量为1mL；最后一次免疫10天后，耳静脉采血，分离血清，用试管凝集法测定抗血清效价，效价达到1∶1280以上方可使用。
2)纯化嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)B11抗体(IgG)
在步骤2)中，所述纯化嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)B11抗体(IgG)可采用以下步骤：
10mL超纯水洗脱蛋白A柱中的保护液，流速控制在1min/mL，10mL的0.02mol/L PBS平衡柱子；将0.5mL抗血清同0.5mL PBS混匀后，经0.22μm膜过滤，将混合液注入蛋白A柱中，4℃孵育2.5h；10mL PBS洗脱杂蛋白，收集于50mL离心管中；柠檬酸缓冲液洗脱固定在柱中的IgG，用10个2mL离心管收集流出液，每管1mL；将280nm处吸光度值(A280)较大的离心管流出液合并，4℃透析24h脱盐，冷冻干燥得干粉IgG。
3)标记IgG；
在步骤3)中，所述标记IgG的方法可为：称取1mg IgG溶于250μL Na2CO3-NaHCO3标记缓冲液中，与0.2mL的Eu3+标记试剂混匀，4℃磁力搅拌12h；将标记好的IgG经由SephadexG-50柱子(1×20cm)纯化以除去多余的Eu3+标记试剂以及蛋白聚集物，洗脱液为Tris-HCl缓冲液，收集流出液，每离心管0.5mL，监测A280值，合并收集A280较大的离心管流出液，得IgG标记复合物Eu3+-IgG，复合物中Eu3+和IgG浓度分别为6.2×10-6mol/L和3.3×10-6mol/L，标记比约为2。
4)建立共发光体系；
在步骤4)中，所述建立共发光体系的具体方法可为：为了找到最佳的共发光条件，在10mL离心管中，依次加入1mL 1.0×10-10mol/L Eu3+、1mL 5×10-4mol/L TTA、1mL 7.5×10-5mol/L Lu3+、1mL 4×10-3mol/L phen、1mL 0.75％Triton X-100、4mL H2O和1mL0.05mol/L Tris-HCl(pH7.0)，震荡摇匀，室温放置10min。测量时间分辨荧光(TRF)值；如欲考察其中一种物质(Eu3+除外)浓度对共发光TRF的影响，配制不同浓度系列的该物质，其它物质浓度保持不变，测量不同浓度下的TRF值。
5)检测嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)B11的镥铕共发光TRFIA
在步骤5)中，所述检测嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)B11的镥铕共发光TRFIA的方法可为：用碳酸盐包被液将嗜水气单胞菌B11稀释成不同浓度，加入到96孔微孔板中，每孔100μL，60℃包被12h；洗涤缓冲液洗涤3次，每孔加入200μL 1％BSA封闭液，37℃封闭2h；洗涤3次，每孔加入稀释后的Eu3+-IgG溶液100μL，37℃震荡孵育1h；洗涤6次，每孔加入200μLLu3+缓冲增强液，震荡3min，每孔加入20μL碱性缓冲增强液，调整pH值，震荡10min后，在多标记分析仪上测量TRF值；测量参数设置如下：激发波长340nm，发射波长615nm。设碳酸盐包被液作阴性对照，以样品孔的TRF值(P)与对照孔的TRF值(N)之比大于2(即P/N>2)时判断为阳性；所述缓冲增强液的组成可为：5×10-4mol/L 2-噻吩甲酰三氟丙酮TTA1mL，7.5×10-5mol/L Lu3+1mL，0.75％Triton X-100 1mL，H2O 6mL，0.05mol/L pH 3.1邻苯二甲酸氢钾-HCl 1mL混匀；所述碱性缓冲增强液的组成可为：H2O 1.8mL，0.53mol/L Tris-base0.9mL，4×10-2mol/L phen 0.3mL混匀。
本发明在过量Lu3+存在下，Eu3+-TTA-phen-Triton X-100体系的荧光强度可增强400倍左右。对共发光体系条件进行了优化，结果表明，当Lu3+、TTA、phen、Triton X-100浓度分别为7.5×10-6mol/L、5×10-5mol/L、4×10-4mol/L和0.075％时，共发光体系荧光强度最大。应用直接共发光TRFIA法检测嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)B11，可检测到1×103cfu/mL的菌，比用直接TRFIA检测结果1×105cfu/mL降低两个数量级。
附图说明
图1为Eu3+-IgG的Sephadex G-50凝胶过滤层析色谱图。
图2为不同体系检测嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)B11的工作曲线。在图2中，(a)为直接TRFIA工作曲线，(b)为直接共发光TRFIA工作曲线。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
一、实验部分
1、仪器
PerkinElmer VICTOR X4多标记分析仪，AKTA Purifier 100蛋白纯化系统，MerckMilliporeDirect-Q3超纯水一体化系统，GE Healthcare HiTrapTM rProtein AFF蛋白A柱，LGJ-10冷冻干燥机。
2、试剂和材料
Perkin-Elmer Eu3+标记试剂盒(1244-302)，Sigma-Aldrich Triton X-100、2-噻吩甲酰三氟丙酮(TTA)、1，10-菲啰啉(phen)、三氧化二铕(Eu2O3，99.99％)，Alfa-Aesar氧化镥(Lu2O3，99.9％)。
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)B11接种于固体培养基培养后，采用平板菌落计数法确定浓度，并调整浓度至1×108cfu/mL备用。
3、主要试剂配制
PBS溶液(0.02M pH 7.3)：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.58g，KH2PO40.27g，H20 800mL，浓盐酸调pH至7.3，加H2O定容至1L；柠檬酸缓冲液(0.1M pH 3.0)：柠檬酸·H2O 0.9772g，柠檬酸三钠·2H2O 0.1029g，H2O 40mL，1mol/L NaOH调pH至3.0，加H2O定容至50mL；碳酸盐Na2CO3-NaHCO3标记缓冲溶液(0.1mol/L pH 9.1)：NaCO3 0.106g，NaHCO30.756g，超纯水定容至100L；Tris-HCl标记洗脱液：Tris-base 6.057g，NaCl 9g，H2O800mL，浓HCl调pH至7.8，加H2O定容至1L；碳酸盐包被缓冲液(0.05mol/L pH 9.6)：NaCO31.49g，NaHCO3 2.93g，超纯水定容至1L；洗涤缓冲液：Tris-base 6.057g，NaCl 9g，Tween-20 2mL，H2O 800mL，浓HCl调pH至7.8，加H2O定容至1L；分析缓冲液：Tris-base6.057g，NaCl9g，超纯水800mL，浓HCl调pH至7.0，加H2O定容至1L
所述镥铕共发光TRFIA法检测嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)B11的方法如下：
1、嗜水气单胞菌B11的微生物学鉴定
材料及器具：Biolog自动生化鉴定系统(GeneⅢ)，菌株(由本实验室分离于日本鳗鲡)。
方法：采用自动生化鉴定系统进行鉴定。
结果：表1为全自动细菌生化鉴定特性表，其中+为阳性，-为阴性，鉴定结果为嗜水气单胞菌，id％为94.4％。
表1
Figure BDA0001894777770000041
Figure BDA0001894777770000051
Figure BDA0001894777770000061
2、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)B11抗血清的制备
将嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)B11菌株接种于0.5％NaCl的牛肉膏蛋白胨培养液中，27℃培养24h，用甲醛及加热两种方法灭活，离心(4500r/min，5min)，再加入无菌生理盐水洗涤，调整细菌浓度至6×108cfu/mL备用。选择2只健康的2～3kg的新西兰大白兔，背部两侧皮下多点注射免疫，分4次免疫，免疫间隔期为2周，第1次免疫时与弗氏完全佐剂1∶1混合、乳化，第2次免疫时与弗氏不完全佐剂1∶1混合乳化，第3、4次免疫采用菌液注射，每次每只注射剂量为1mL。最后一次免疫10天后，耳静脉采血，分离血清，用试管凝集法测定抗血清效价，效价达到1∶1280以上方可使用。
3、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)B11抗体(IgG)的纯化
10mL超纯水洗脱蛋白A柱中的保护液，流速控制在1min/mL，10mL的0.02mol/L PBS平衡柱子；将0.5mL抗血清同0.5mL PBS混匀后，经0.22μm膜过滤，将混合液注入蛋白A柱中，4℃孵育2.5h；10mL PBS洗脱杂蛋白，收集于50mL离心管中；柠檬酸缓冲液洗脱固定在柱中的IgG，用10个2mL离心管收集流出液，每管1mL；将A280值较大的离心管流出液合并，4℃透析24h脱盐，冷冻干燥得干粉IgG。
4、IgG的标记；
准确称取1mg IgG溶于250μL Na2CO3-NaHCO3标记缓冲液中，与0.2mL的Eu3+标记试剂混匀，4℃磁力搅拌12h；将标记好的IgG经由Sephadex G-50柱子(1×20cm)纯化以除去多余的Eu3+标记试剂以及蛋白聚集物，洗脱液为Tris-HCl缓冲液，收集流出液，每离心管0.5mL，监测A280值，合并收集A280值较大的离心管流出液，得IgG标记复合物Eu3+-IgG，复合物中Eu3+和IgG浓度分别为6.2×10-6mol/L和3.3×10-6mol/L，标记比约为2。
5、共发光体系的建立
为了找到最佳的共发光条件，在10mL离心管中，依次加入1mL 1.0×10-10mol/LEu3+，1mL 5×10-4mol/L TTA，1mL 7.5×10-5mol/L Lu3+，1mL 4×10-3mol/L phen，1mL0.75％TritonX-100，4mL H2O，1mL 0.05mol/L Tris-HCl(pH 7.0)，震荡摇匀，室温放置10min。测量TRF值。如欲考察其中一种物质(Eu3+除外)浓度对共发光TRF的影响，配制不同浓度系列的该物质，其它物质浓度保持不变，测量不同浓度下的TRF值。
6、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)B11的镥铕共发光TRFIA检测
用碳酸盐包被液将嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)B11稀释成不同浓度，加入到96孔微孔板中，每孔100μL，60℃包被12h；缓冲液洗涤3次，每孔加入200μL 1％BSA封闭液，37℃封闭2h；洗涤3次，每孔加入稀释后的Eu3+-IgG溶液100μL，37℃震荡孵育1h；洗涤6次，每孔加入200μLLu3+缓冲增强液(含Lu3+、邻苯二甲酸-HCl、TritonX-100和2-噻吩甲酰三氟丙酮TAA)，震荡3min，每孔加入20μL碱性缓冲增强液(含Tris-base和1,10菲啰啉phen)，调整pH值，震荡10min后，在多标记分析仪上测量时间分辨荧光TRF值；测量参数设置如下：激发波长340nm，发射波长615nm。设碳酸盐包被液作阴性对照，以样品孔的TRF值(P)与对照孔的TRF值(N)之比大于2(即P/N>2)时判断为阳性。
以下给出Eu3+-IgG的纯化结果。
图1为Eu3+-IgG的Sephadex G-50凝胶过滤层析色谱图，产生两个洗脱峰，第一个洗脱峰为Eu3+-IgG吸收峰，是IgG和Eu3+标记试剂在280nm处的共同吸收，第二个洗脱峰为没有标记到IgG上的Eu3+-标记试剂的吸收峰。由图1可见Eu3+-IgG主要集中在5～8mL处，合并5～8mL处的溶液，混匀。计算标记比，得到合并液中Eu3+和IgG浓度分别为6.2×10-6mol/L和3.3×10-6mol/L，标记比约为2。
以下给出共发光体系条件优化。
1)共发光离子的选择
通过实验比较了4种不同的稀土离子Y3+、Gd3+、Lu3+、Lu3+对Eu3+-TTA-1,10-phen-TritonX-100体系荧光强度的增强效果，综合荧光增强值和背景荧光两个因素，Lu3+最为合适，选择Lu3+作为共发光离子进行后续实验。
2)缓冲溶液的选择
pH值的变化对共发光体系荧光强度有影响，Lu3+-Eu3+-TTA-1,10-phen-Triton X-100共发光体系的适用范围为pH5.5～7.0，本发明取pH＝7.0，比较了共发光体系在以下几种不同组成缓冲液中的TRF：Na2HPO4-柠檬酸、K2HPO4-NaOH、邻苯二甲酸氢钾-HCl、Na2HPO4-NaH2PO4和Tris-HCl，结果表明，只有在0.05mol/L pH 7.0的Tris-HCl缓冲溶液中体系的荧光强度存在增强作用。因此，本发明缓冲液选择0.05mol/L pH 7.0的Tris-HCl。
3)Lu3+浓度的影响
不同浓度Lu3+对体系Eu3+-TTA-1,10-phen-Triton X-100荧光强度的增强效果有很大差异，实验比较了Lu3+浓度在0-1×10-5mol/L范围内荧光强度的变化，结果表明，在其它实验条件一致的情况下，Lu3+浓度为7.5×10-6mol/L时体系荧光强度最大。
4)TTA浓度的影响
在Lu3+最佳浓度条件下，在0～1×10-4mol/L范围内对TTA浓度进行优化，TTA最佳浓度为5×10-5mol/L。
5)phen浓度的影响
在其它实验条件一致的情况下，实验比较了不同浓度phen对体系荧光强度的影响，phen最佳浓度应选择4×10-4mol/L。
6)Triton X-100浓度的影响
在最佳Lu3+、Eu3+、TTA、phen条件下，比较了Triton X-100浓度变化对体系荧光强度的影响，Triton X-100最佳浓度应选择0.075％(m/v)。
以下给出检测嗜水气单胞菌的工作曲线和检测限。
分别用直接TRFIA法和直接共发光TRFIA法检测嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)B11。由图2可知，直接TRFIA法的线性范围5×103～1×107cfu/mL，工作曲线y＝0.0543x+13595，r2＝0.9997，检测限(以P/N值大于2确定)为1×105cfu/mL；直接共发光TRFIA法的线性范围5×102～5×106cfu/mL，工作曲线方程y＝0.5138x+299334，r2＝0.9936，线性关系良好，检测限1×103cfu/mL，比试剂盒法降低两个数量级水平。说明该法线性范围宽，能定量检测，并且灵敏度远高于一般的直接TRFIA法检测病原菌。

Claims (1)

1.镥铕共发光时间分辨荧光免疫检测嗜水气单胞菌B11的方法，其特征在于所述嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）B11已于2018年09月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2018642；
包括以下步骤：
1）制备嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）B11抗血清，具体方法为：
将嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）B11接种于0.5% NaCl的牛肉膏蛋白胨培养液中，27 ℃培养24h，用甲醛及加热两种方法灭活，4500r/min离心5min，再加入无菌生理盐水洗涤，调整细菌浓度至6×108 cfu/mL备用；选择2只2～3kg的新西兰大白兔，背部两侧皮下多点注射免疫，分4次免疫，免疫间隔期为2周，第1次免疫时与弗氏完全佐剂1∶1混合、乳化，第2次免疫时与弗氏不完全佐剂1∶1混合乳化，第3、4次免疫采用菌液注射，每次每只注射剂量为1mL；最后一次免疫10天后，耳静脉采血，分离血清，用试管凝集法测定抗血清效价，效价达到1∶1280以上，即使用；
2）纯化嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）B11抗体IgG；
所述纯化嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）B11抗体IgG采用以下步骤：
10 mL超纯水洗脱蛋白A柱中的保护液，流速控制在1 min/mL，10 mL 的0.02mol/L PBS平衡柱子；将0.5 mL抗血清同0.5 mL PBS混匀后，经0.22 µm膜过滤，将混合液注入蛋白A柱中，4℃孵育2.5 h；10 mL PBS洗脱杂蛋白，收集于50 mL 离心管中；柠檬酸缓冲液洗脱固定在柱中的IgG，用10个2mL离心管收集流出液，每管1mL；将280nm处吸光度值较大的离心管流出液合并，4℃透析24 h脱盐，冷冻干燥得干粉IgG；
3）标记IgG，具体方法如下：
称取1 mg IgG溶于250µL Na2CO3-NaHCO3标记缓冲液中，与0.2mL的Eu3+标记试剂混匀，4℃磁力搅拌12 h；将标记好的IgG经由Sephadex G-50柱子纯化以除去多余的Eu3+标记试剂以及蛋白聚集物，洗脱液为Tris-HCl缓冲液，收集流出液，每离心管0.5 mL，监测A280值，合并收集A280较大的离心管流出液，得IgG标记复合物Eu3+-IgG，复合物中Eu3+和IgG浓度分别为6.2×10-6mol/L和3.3×10-6mol/L，标记比约为2；所述Sephadex G-50柱子采用1×20 cm柱子；
4）建立共发光体系，具体方法如下：
在10 mL 离心管中，依次加入1 mL 1.0×10-10 mol/L Eu3+、1 mL 5×10-4 mol/L TTA、1mL 7.5×10-5 mol/L Lu3+、1 mL 4×10-3 mol/L phen、1 mL 0.75% Triton X-100、4mL H2O和1 mL 0.05 mol/L Tris-HCl，pH7.0，震荡摇匀，室温放置10 min；测量时间分辨荧光值；当考察其中一种物质，Eu3+除外，浓度对共发光TRF的影响，配制不同浓度系列的该物质，其它物质浓度保持不变，测量不同浓度下的TRF值；
5）检测嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）B11的镥铕共发光TRFIA，具体方法为：用碳酸盐包被液将嗜水气单胞菌B11稀释成不同浓度，加入到96孔微孔板中，每孔100 µL，60℃包被12 h；洗涤缓冲液洗涤3次，每孔加入200 µL 1% BSA封闭液，37℃封闭2 h；洗涤3次，每孔加入稀释后的Eu3+-IgG溶液100 µL，37℃震荡孵育1 h；洗涤6次，每孔加入200 µLLu3+缓冲增强液，震荡3 min，每孔加入20 µL 碱性缓冲增强液，调整pH值，震荡10 min后，在多标记分析仪上测量TRF值；测量参数设置如下：激发波长340 nm，发射波长615 nm；设碳酸盐包被液作阴性对照，以样品孔的TRF值与对照孔的TRF值之比大于2时判断为阳性；
所述镥缓冲增强液的组成为：5×10-4 mol/L 2-噻吩甲酰三氟丙酮TTA 1 mL，7.5×10-5mol/L Lu3+ 1 mL，0.75% Triton X-100 1 mL，H2O 6 mL，0.05 mol/L pH 3.1 邻苯二甲酸氢钾-HCl 1 mL混匀；
所述碱性缓冲增强液的组成为：H2O 1.8 mL，0.53 mol/L Tris-base 0.9 mL，4×10-2mol/L phen 0.3 mL混匀。
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