CN102012384B - 一种基于压电传感器检测致病菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于压电传感器检测致病菌的方法，通过抗原抗体反应(信标免疫磁颗粒)、生物素-亲和素系统(金标亲和素)和金的自生长技术(金生长液)，对压电免疫传感器的检测信号进行了多级放大，使得本发明的检测灵敏度得到了最大限度提高，其检测大肠杆菌0157:H7的灵敏度达到了23CFU/ml，该方法具有灵敏度高，特异性强、操作简便快速等特点，而且只要更换检测过程中涉及的抗体就可以检测不同的微生物，在微生物的检测领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测致病菌的方法，尤其是一种基于压电传感器检测致病菌的方法。
背景技术
1982年大肠杆菌O157:H7(Enterohemorrhagic Escherichiacoli，EHEC)首次在美国分离并确认为一种新型的肠道致病菌。它是肠出血性大肠杆菌的一个主要菌型，可引起人类腹泻、出血性肠炎、溶血性尿毒综合征(uremic syndrome hemolytic，HUS)和血栓形成性血小板减少性紫癜(thrombocytopenic purpura，TTP)，个别患者可因急性或慢性肾功能衰竭而死亡，病死率高达30％以上，是全球关注的世界性公共卫生问题。由该菌引起的食物中毒已在世界范围内多次出现，1996年日本发生了世界上规模最大、涉及上万人的由出血性大肠杆菌O157:H7引起的食物中毒。我国自1986年在徐州发现感染病人，已在全国其它城市分离到了大肠杆菌O157:H7，而且据报道食入不足10个大肠杆菌O157:H7即可引起致病。
传统的大肠杆菌O157:H7等致病菌的检测方法主要包括山梨醇麦康凯琼脂分离培养法，生化方法等，这些方法大多操作步骤繁琐，且耗时较长。随着科学技术的发展，出现了一些新兴检测方法，如PCR法，ELISA法，免疫磁珠分离法，流式细胞仪法及基因芯片法等，这些方法同样也存在着仪器昂贵，操作复杂，费时等缺点。
随着科技的发展，生物传感器以其灵敏度高、分析速度快、成本低等优点开始广泛用于大肠杆菌O157:H7等致病菌的检测研究。压电传感器作为生物传感器的一个重要分支，在大肠杆菌O157:H7等致病菌的检测方法中也开展了广泛的研究。压电传感器(Piezoelectric biosensor)是20世纪60年代建立起来的一种新型测量技术，其检测的理论基础是固载在晶体表面的沉积物质量与晶体频率变化存在着一定的比例关系，即Sauerbrey方程：
ΔF＝-2.26×10-6F2Δm/A，式中，F为石英晶体天然谐振频率(Hz)；Δm为沉积在晶体表面的质量变化(g)：ΔF为晶体频率的变化(Hz)；A为参与晶振的面积(cm2)；负号表示质量的增加导致频率的下降。但是目前单纯利用压电传感器进行大肠杆菌0157:H7的检测，其灵敏度一般为105cfu/ml。学者为了提高压电传感器的检测灵敏度，分别借助纳米等技术对压电传感器的检测信号进行放大，使得灵敏度提高到了102cfu/ml。然而这还是不能达到对大肠杆菌O157:H7的检测要求。
其他致病菌亦是如此，通过有效的检测方法，提高灵敏度，达到并优化致病菌的检测要求，具有非常重要的实践意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于压电传感器检测致病菌的方法。。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
本发明通过借助信标免疫纳米磁颗粒和金生长技术对压电传感器的检测信号进行多级放大，从而达到对致病菌的超灵敏检测。所述信标免疫纳米磁颗粒是指纳米磁颗粒上同时连接能够捕获目标菌的抗体(目标抗体)和用于对检测信号进行放大的抗体(信标抗体)。
具体实现方法如下：
一种基于压电传感器检测致病菌的方法，具体步骤为：
(1)制备信标免疫纳米磁颗粒；
(2)制备亲和素标记胶体金；
(3)制备金生长液，确定亲和素标记胶体金在金生长液中的生长时间；
(4)压电传感器的检测
取信标免疫纳米磁颗粒加入到进行梯度稀释的致病菌的菌悬液中，通过超强磁的吸引去除非目标菌；将制备好的亲和素标记胶体金加入，通过生物素-亲和素系统将胶体金结合到信标免疫纳米磁颗粒上；将连接有信标免疫纳米磁颗粒和亲和素标记胶体金的致病菌加入金生长液中，按照步骤(3)确定的生长时间使胶体金得到生长放大，收集该液体滴加至固定有SPA和致病菌鼠单克隆抗体并用牛血清白蛋白(BSA)封闭非特异性位点的压电传感器的石英晶振上，观察压电传感器频率的变化确定待检测样本中致病菌的浓度。
优选的，上述基于压电传感器检测致病菌的方法，具体步骤为：
(1)制备信标免疫纳米磁颗粒
采用化学共沉淀法制备粒径为10nm～200nm的纳米磁颗粒，将采用SPA亲和纯化的致病菌兔多克隆抗体(目标抗体)和相同浓度的生物素标记的兔IgG(信标抗体)按体积比为1∶60混匀后，取混合抗体连接到纳米磁颗粒上制成信标免疫纳米磁颗粒；
(2)制备亲和素标记胶体金
胶体金采用柠檬酸钠还原法制备粒径为10nm-20nm的胶体金，将浓度为0.2mg/mL-1.0mg/mL的亲和素连接至胶体金上，即为亲和素标记胶体金；
(3)制备金生长液，确定亲和素标记胶体金在金生长液中的生长时间
取氯金酸溶液加入十六烷基三甲基浴溴化胺(CTAB)溶液中混匀，然后置于100℃水浴锅中加热10min，颜色变为清亮的黄色，室温下冷却备用；在加入亲和素标记胶体金溶液之前加入抗坏血酸(AA)溶液轻轻混匀，金生长液颜色即消失；取不同浓度的亲和素标记胶体金溶液于金生长液中进行自生长，利用紫外分光度度计进行波长扫描确定胶体金在金生长液中的生长时间；
(4)压电传感器的检测
①石英晶振用piranha液进行洗涤，取SPA溶液固定于压电传感器的石英晶振，取致病菌鼠单克隆抗体溶液固定于压电传感器的石英晶振，检测频率变化，确定致病菌鼠单克隆抗体的固定浓度和时间；
②取信标免疫纳米磁颗粒加入到进行梯度稀释的致病菌的菌悬液中，通过超强磁的吸引去除非目标菌；再借助膜将多余的信标免疫纳米磁颗粒离心去除；将步骤(2)中制备好的亲和素标记胶体金加入，通过生物素-亲和素系统将胶体金结合到信标免疫纳米磁颗粒上，然后借助超强磁将未结合的亲和素标记胶体金去除；最后将连接有信标免疫纳米磁颗粒和亲和素标记胶体金的致病菌加入金生长液中，按照步骤(3)确定的生长时间使胶体金得到生长放大，继续用超强磁将多余的金生长液去除；
③按上述步骤(4)①确定的固定浓度和固定时间分别将SPA和致病菌鼠单克隆抗体固定于压电传感器的石英晶振上，并用牛血清白蛋白(BSA)封闭石英晶振上非特异性位点，将步骤(4)②中最后收集到的液体滴加至石英晶振上，观察压电传感器频率的变化确定待检测样本中致病菌的浓度。
在检测致病菌的过程中，只需更换目标抗体和固定在压电传感器电极上的抗体即可。
优选的，上述基于压电传感器检测致病菌的方法，所述致病菌所述致病菌为大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌或嗜肺军团菌等。
优选的，上述基于压电传感器检测致病菌的方法，所述致病菌为大肠杆菌O157:H7。
优选的，上述基于压电传感器检测致病菌的方法，当致病菌为大肠杆菌O157:H7时，具体检测方法为：
(1)制备信标免疫纳米磁颗粒
采用化学共沉淀法制备粒径为10nm～200nm的纳米磁颗粒，将采用SPA亲和纯化的浓度为0.5mg/mL大肠杆菌O157:H7兔多克隆抗体(目标抗体)和相同浓度的生物素标记的兔IgG(信标抗体)按体积比为1∶60混匀后，取每0.3mL混合抗体连接到1mL纳米磁颗粒上制成信标免疫纳米磁颗粒；
(2)制备亲和素标记胶体金
胶体金采用柠檬酸钠还原法制备，制备粒径为18nm的胶体金，将浓度为0.5mg/mL的亲和素连接至胶体金上，即为亲和素标记胶体金；
(3)制备金生长液，确定亲和素标记胶体金在金生长液中的生长时间
取52μl 0.024M氯金酸溶液加入5ml 0.1M十六烷基三甲基浴溴化胺(CTAB)溶液中混匀，然后置于100℃的水浴锅中加热10min，颜色变为清亮的黄色，室温下冷却备用；在加入亲和素标记胶体金溶液之前加入50μl1M抗坏血酸(AA)溶液轻轻混匀，金生长液颜色即消失；取100μl的亲和素标记胶体金溶液于900μl金生长液中进行自生长，即待生长的亲和素标记胶体金溶液与金生长液的体积比为1∶9，其中亲和素标记胶体金溶液的浓度为对步骤(2)中亲和素标记胶体金进行对倍稀释，即1/2、1/4和1/8的浓度，利用紫外分光度度计进行波长扫描观察胶体金在金生长液中的生长时间为15min；
(4)压电传感器的检测
①石英晶振用piranha液进行洗涤，取浓度为0.2mg/mL～2.0mg/mL的SPA溶液10μl固定于压电传感器的石英晶振10～90min，取浓度为0.1mg/mL～1.8mg/mL的大肠杆菌O157:H7鼠单克隆抗体溶液10μl固定于压电传感器的石英晶振10～90min；
②取信标免疫纳米磁颗粒加入到进行梯度稀释的大肠杆菌O157:H7的菌悬液中，通过超强磁的吸引去除非目标菌；再通过0.45μm的膜将多余的信标免疫纳米磁颗粒离心去除；将制备好的亲和素标记胶体金溶液加入，通过生物素-亲和素系统将胶体金结合到信标免疫纳米磁颗粒上，然后借助超强磁将未结合的亲和素标记胶体金去除；最后将连接有信标免疫纳米磁颗粒和亲和素标记胶体金的大肠杆菌O157:H7加入金生长液中，按照步骤(3)确定的生长时间使胶体金得到生长放大，继续用超强磁将多余的金生长液去除；
③按上述步骤(4)①的固定浓度和固定时间分别将SPA和大肠杆菌O157:H7鼠单克隆抗体固定于压电传感器的石英晶振上，并用1％牛血清白蛋白(BSA)封闭石英晶振上非特异性位点；将步骤(4)②中最后收集到的液体滴加至石英晶振上，观察压电传感器频率的变化确定待检测样本中大肠杆菌O157:H7的浓度。
优选的，上述基于压电传感器检测致病菌的方法，所述步骤(1)中的纳米磁颗粒粒径约为50nm，连接的大肠杆菌O157:H7兔多克隆抗体的浓度为0.5mg/mL；步骤(2)中亲和素的连接量为14μg/ml。
优选的，上述基于压电传感器检测致病菌的方法，所述步骤(4)中SPA的固定浓度和时间为1.2mg/ml、40min；大肠杆菌O157:H7鼠单克隆抗体的固定浓度和时间为1.0mg/ml、60min。
本发明的有益效果是：
上述基于压电传感器检测致病菌的方法，通过抗原抗体反应(信标免疫纳米磁颗粒)、生物素-亲和素系统(亲和素标记胶体金)和金的自生长技术(金生长液)，对压电免疫传感器的检测信号进行了多级放大，使得本发明的检测灵敏度得到了最大限度提高，其检测大肠杆菌O157:H7的灵敏度达到了23CFU/ml，该方法具有灵敏度高，特异性强、操作简便快速等特点，而且只要更换检测过程中涉及的抗体就可以检测不同的微生物，在微生物的检测领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为不同体积比的大肠杆菌O157:H7信标免疫纳米磁颗粒回收率的测定图谱；
图2为SPA对传感器频率变化的影响图谱，其中a浓度、b时间；
图3为大肠杆菌O157:H7鼠单克隆抗体对传感器频率变化的影响图谱，其中a浓度、b时间；
图4为大肠杆菌O157:H7菌悬液浓度与频率变化关系图谱，其中a高浓度、b低浓度；
图5为本发明所述检测方法检测大肠杆菌O157:H7的流程图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例1
大肠杆菌O157:H7纯菌悬液的检测
(1)信标免疫纳米磁颗粒
①纳米磁颗粒的制备：将0.7mol/L的FeCl3·6H2O水溶液16mL与1.6mol/L FeCl2·4H2O水溶液4mL混合，在氮气条件下，加入10g葡聚糖T-40，混匀，60℃，水浴20min，在2000rpm的搅拌下，20min内，向混合液中滴加5mol/L的氨水40mL，温度保持60℃，并始终通氮气，制成悬液；然后用去离子水透析24h，离心管离心，2100rpm，15min，保留上清(阻氧避光保存)，所制备的纳米磁颗粒粒径约为50nm；
②信标免疫纳米磁颗粒的制备：游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与葡聚糖纳米磁颗粒分离，洗脱平衡液为pH为7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液，收集的颗粒冷冻干燥，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为8mg/mL；取葡聚糖纳米磁颗粒悬液1.0mL，加入20mmol/L NaIO4水溶液0.25mL，150转/分钟避光阻氧震荡6h后，加入2mol/L乙二醇的水溶液0.21mL终止氧化，pH为7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液4℃透析24h，去除过量的NaIO4，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为5.5mg/mL；取SPA亲和纯化的大肠杆菌O157:H7兔多克隆抗体(中国公共卫生，2005；21(6)：705-6)和生物素化兔IgG(BBI生物公司购买)分别按体积比为1∶0、1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶60、1∶80和1∶100的比例混合，抗体混合溶液的总体积为0.3ml，两种抗体的浓度均为0.5mg/mL，将混合好的抗体溶液加入到步骤(1)②中的1mL纳米磁颗粒中，混匀后，放入4℃冰箱过夜(避光)，次日，在上述溶液中加入BSA(终浓度为1％)进行封闭，过夜，置4℃冰箱备用；
③信标免疫纳米磁颗粒回收率的测定：分别取20μl步骤(1)②中制备的不同体积比的大肠杆菌O157:H7信标免疫纳米磁颗粒加入浓度为8.1×102CFU/ml的大肠杆菌O157:H7菌悬液中，于室温下孵育15min，借助超强磁将溶液浓缩至100μl；将此100μl溶液转移至远藤平板(BD公司产品)均匀涂布后于37℃下培养24h后计数，并将此计数结果除以大肠杆菌O157:H7菌液的原始浓度即为信标免疫纳米磁颗粒的回收率，如图1所示，综合考虑信标免疫纳米磁颗粒的回收率及信标抗体的后期信号放大作用，确定信标免疫纳米磁颗粒的目标抗体与信标抗体的最佳比例为体积比1∶60，且此信标免疫纳米磁颗粒在保存1年后，其回收率基本不变。
(2)亲和素标记胶体金
取2.0mL的1％氯金酸加入198mL超纯水，于沸水浴中加热10min；然后迅速加入5mL的1％柠檬酸三钠溶液，继续加热15min；当胶体金颜色变为葡萄酒红色时，继续加热10min，冷却后用透射电镜观察其粒径大小约为18nm。用0.2％K2CO3调pH值为6.5。利用分光光度计法测得稳定胶体金最适亲和素量为14μg/mL。取调好pH值的胶体金25ml，加入浓度为0.5mg/mL的亲和素0.7ml，缓慢搅拌10min，加入牛血清白蛋白(BSA)，使其终浓度为1％，继续搅拌10min以上。将上述初步制得的胶体金探针以4000rpm离心20min，收集上清以10000rpm 4℃离心60min；丢弃上清，留下管底为暗红色疏松状沉淀，沉淀用0.005mo l/L pH为7.6的PB缓冲液(含1％BSA，0.02％NaN3)重新悬浮，再同前离心洗涤一次。最后将沉淀用同前的pH为7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液悬浮，置4℃冰箱保存备用；
(3)金生长液
取52μl 0.024M氯金酸溶液加入5ml 0.1M十六烷基三甲基浴溴化胺(CTAB)溶液中混匀，然后置于100℃下的水浴锅中加热10min，颜色变为清亮的黄色，室温下冷却备用；在加入胶体金溶液之前加入50μl 1M抗坏血酸(AA)溶液轻轻混匀，金生长液颜色即消失，此即为金生长液。
(4)压电传感器的检测
①先将石英晶振用piranha液(浓H2SO4/H2O23/1，现用现配)进行洗涤，再用无水乙醇和超纯水洗涤，每次5min，重复3次；石英晶振在固定物质之前在气相中进行基础频率检测，固定物质之后进行洗涤，氮气吹干10min后在气相中进行频率检测，频率变化稳定在±1Hz间时计数；取0.2-2.0mg/ml的SPA溶液10μl滴加于石英晶振上，常温下固定10-90min，按上述步骤进行洗涤后取0.2-2.0mg/ml的大肠杆菌O157:H7鼠单克隆抗体溶液(专利申请号200810053955.8)10μl滴加于石英晶振上，37℃下固定10-90min，洗涤后用1％BSA封闭，用压电传感器检测频率做为基频，根据图2和图3可确定SPA的最佳固定浓度与时间为1.2mg/ml和40min，大肠杆菌O157:H7鼠单克隆抗体的最佳固定浓度与时间为1.0mg/ml和60min；
②取20μl信标免疫纳米磁颗粒加入1ml梯度稀释后的的大肠杆菌O157:H7菌悬液(9.2×101-9.2×106CFU/ml)和沙门氏菌的菌悬液(7.8×101-7.8×106CFU/ml)中，轻轻混匀后，于室温下孵育15mim，借助超强磁将溶液浓缩至100μl；利用带0.45μm滤膜的离心管(ultrafree-MC microcentrifuge filters，Sigma公司)1500rpm离心10min将多余的信标免疫纳米磁颗粒去除；加入10μl亲和素标记胶体金，37℃下孵育20min，用超强磁去除未结合的亲和素标记胶体金，并将溶液定容到100μl；将上述100μl溶液加入到900μl的金生长液中反应15min；再借助超强磁将多余的金生长液去除，最后将溶液定容到10μl；
③将步骤(4)②中最后得到的10μl溶液滴加到步骤(4)①中已修饰好的石英晶振上，并将石英晶振于37℃下反应60min后，洗涤后进行频率的测定，其检测结果见图4，可知压电免疫传感器经过信标免疫纳米磁颗粒和亲和素标记胶体金对检测信号进行了多级放大，大肠杆菌O157:H7菌检测限达到了23CFU/ml，整个检测过程控制在4h之内。
实施例2
大肠杆菌O157:H7纯菌悬液的检测
(1)信标免疫纳米磁颗粒
①纳米磁颗粒的制备：将0.7mol/L的FeCl3·6H2O水溶液16mL与1.6mol/L FeCl2·4H2O水溶液4mL混合，在氮气条件下，加入4g葡聚糖T-40，混匀，60℃，水浴20min，在2000rpm的搅拌下，20min内，向混合液中滴加5mol/L的氨水40mL，温度保持60℃，并始终通氮气，制成悬液；然后用去离子水透析24h，离心管离心，2100rpm，15min，保留上清(阻氧避光保存)，所制备的纳米磁颗粒粒径约为200nm，按此方法制备的纳米磁颗粒较易产生聚集，保存时间约1个月左右。
②③同实施例1，制备的信标免疫纳米磁颗粒的回收率最高为52％。
(2)(3)(4)同实施例1，最后检测大肠杆菌O157:H7菌灵敏度为172CFU/ml。
实施例3
大肠杆菌O157:H7纯菌悬液的检测
(1)信标免疫纳米磁颗粒
①纳米磁颗粒的制备：将0.7mol/L的FeCl3·6H2O水溶液16mL与1.6mol/L FeCl2·4H2O水溶液4mL混合，在氮气条件下，加入4g葡聚糖T-40，混匀，60℃，水浴20min，在500rpm的搅拌下，20min内，向混合液中滴加5mol/L的氨水40mL，温度保持60℃，并始终通氮气，制成悬液；然后用去离子水透析24h，离心管离心，2100rpm，15min，保留上清(阻氧避光保存)，所制备的纳米磁颗粒粒径约为10nm。
②③同实施例1，制备的信标免疫纳米磁颗粒的回收率最高为63％。
(2)(3)(4)同实施例1，最后检测大肠杆菌O157:H7菌灵敏度为120CFU/ml。
实施例4
(1)沙门氏菌纯菌悬液的检测
①游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与葡聚糖纳米磁颗粒分离，洗脱平衡液为pH 7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液，收集的颗粒冷冻干燥，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为8mg/mL；取葡聚糖纳米磁颗粒悬液1.0mL，加入20mmol/L NaIO4水溶液0.25mL，150转/分钟避光阻氧震荡6h后，加入2mol/L乙二醇的水溶液0.21mL终止氧化，pH 7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液4℃透析24h，去除过量的NaIO4，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为5.5mg/mL；
②取SPA亲和纯化的沙门氏菌兔多克隆抗体(中国公共卫生，2005；21(6)：705-6)和生物素化兔IgG(BBI生物公司购买)按体积比为1∶60比例混合，抗体混合溶液的总体积为0.3ml，两种抗体的浓度均为0.5mg/mL，将混合好的抗体溶液加入到步骤(1)①中的1mL纳米磁颗粒中，混匀后，放入4℃冰箱过夜(避光)，次日，在上述溶液中加入BSA(终浓度为1％)进行封闭，过夜，置4℃冰箱备用。
其余步骤同实施例1。
(4)压电传感器的检测
①先将石英晶振用piranha液(浓H2SO4/H2O23/1，现用现配)进行洗涤，再用无水乙醇和超纯水洗涤，每次5min，重复3次；石英晶振在固定物质之前在气相中进行基础频率检测，固定物质之后进行洗涤，氮气吹干10min后在气相中进行频率检测，频率变化稳定在±1Hz间时计数；取1.2mg/ml的SPA溶液10μl滴加于石英晶振上，常温下固定40min；按上述步骤进行洗涤后取1.0mg/ml的沙门氏菌鼠单克隆抗体溶液(AB公司沙门氏菌鼠单克隆抗体，货号为ab13628)10μl滴加于石英晶振上，37℃下固定60min，洗涤后用1％BSA封闭，用压电传感器检测频率做为基频；
②取20μl信标免疫纳米磁颗粒加入1ml梯度稀释后的的沙门氏菌菌悬液(8.6×101-8.6×106CFU/ml)和肠球菌的菌悬液(4.2×101-4.2×106CFU/ml)中，轻轻混匀后，于室温下孵育15mim，借助超强磁将溶液浓缩至100μl；利用带0.45μm滤膜的离心管(ultrafree-MC microcentrifuge filters，Sigma公司)1500rpm离心10min将多余的信标免疫纳米磁颗粒去除；加入10μl亲和素标记胶体金37℃下孵育20min，用超强磁去除未结合的亲和素标记胶体金，并将溶液定容到100μl；将上述100μl溶液加入到900μl的金生长液中反应15min；再借助超强磁将多余的金生长液去除，最后将溶液定容到10μl；
③将步骤(4)②中最后得到的10μl溶液滴加到步骤(4)①中已修饰好的石英晶振上，并将石英晶振于37℃下反应60min后，洗涤后进行频率的测定，最后检测结果为35CFU/ml。
实施例5
嗜肺军团菌纯菌悬液的检测
(1)信标免疫纳米磁颗粒的制备
①游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与葡聚糖纳米磁颗粒分离，洗脱平衡液为pH 7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液，收集的颗粒冷冻干燥，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为8mg/mL；取葡聚糖纳米磁颗粒悬液1.0mL，加入20mmol/L NaIO4水溶液0.25mL，150转/分钟避光阻氧震荡6h后，加入2mol/L乙二醇的水溶液0.21mL终止氧化，pH 7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液4℃透析24h，去除过量的NaIO4，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为5.5mg/mL；
②取SPA亲和纯化的嗜肺军团菌兔多克隆抗体(中国公共卫生，2005；21(6)：705-6)和生物素化兔IgG(BBI生物公司购买)按体积比为1∶60比例混合，抗体混合溶液的总体积为0.3ml，两种抗体的浓度均为0.5mg/mL，将混合好的抗体溶液加入到步骤(1)①中的1mL纳米磁颗粒中，混匀后，放入4℃冰箱过夜(避光)，次日，在上述溶液中加入BSA(终浓度为1％)进行封闭，过夜，置4℃冰箱备用。
其余步骤同实施例1。
(4)压电传感器的检测
①先将石英晶振用piranha液(浓H2SO4/H2O23/1，现用现配)进行洗涤，再用无水乙醇和超纯水洗涤，每次5min，重复3次；石英晶振在固定物质之前在气相中进行基础频率检测，固定物质之后进行洗涤，氮气吹干10min后在气相中进行频率检测，频率变化稳定在±1Hz间时计数；取1.2mg/ml的SPA溶液10μl滴加于石英晶振上，常温下固定40min；按上述步骤进行洗涤后取1.0mg/ml的嗜肺军团鼠单克隆抗体溶液(AB公司嗜肺军团鼠单克隆抗体，货号为ab8263)10μl滴加于石英晶振上，37℃下固定60min，洗涤后用1％BSA封闭，用压电传感器检测频率做为基频；
②取20μl信标免疫纳米磁颗粒加入1ml梯度稀释后的的嗜肺军团菌菌悬液(5.7×101-5.7×106CFU/ml)和大肠杆菌的菌悬液(9.3×101-9.3×106CFU/ml)中，轻轻混匀后，于室温下孵育15mim，借助超强磁将溶液浓缩至100μl；利用带0.45μm滤膜的离心管(ultrafree-MC microcentrifuge filters，Sigma公司)1500rpm离心10min将多余的信标免疫纳米磁颗粒去除；加入10μl亲和素标记胶体金37℃下孵育20min，用超强磁去除未结合的亲和素标记胶体金，并将溶液定容到100μl；将上述100μl溶液加入到900μl的金生长液中反应15min；再借助超强磁将多余的金生长液去除，最后将溶液定容到10μl；
③将步骤(4)②中最后得到的10μl溶液滴加到步骤(4)①中已修饰好的石英晶振上，并将石英晶振于37℃下反应60min后，洗涤后进行频率的测定，最后检测结果为57CFU/ml。
实施例6
食品样本加标大肠杆菌O157:H7的检测
(1)从天津某菜场购买熟牛肉作为本次实验的样本，在无菌操作下分别称取25g样本分成2份进行检测，其中一份按照GB/T4789.36-2008进行大肠杆菌O157:H7的检测；另外一份样本中加入225ml灭菌生理盐水进行均质后，取2.5ml已知浓度(2.2×109CFU/ml)的大肠杆菌O157:H7的菌悬液加入，分别在加入大肠杆菌O157:H7之前与之后各取1ml样本液体利用压电免疫传感器进行大肠杆菌O157:H7的检测；
(2)样本利用压电免疫传感器进行大肠杆菌O157:H7检测的方法同实施例1中的步骤(1)-(4)，检测结果为：未加标的样本中未检测出大肠杆菌O157:H7，加标样本中大肠杆菌O157:H7最低检测限为55CFU/ml。
可见，上述基于压电传感器检测致病菌的方法在其他检测条件不变的情况下，仅需更换目标抗体和固定在压电传感器电极上的抗体即可对各类致病菌进行检测，是可以普遍应用于各类致病菌的检测方法。
上述参照具体实施方式对该一种基于压电传感器检测致病菌的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种基于压电传感器检测致病菌的方法，其特征在于：具体步骤为：
(1)制备信标免疫纳米磁颗粒
采用化学共沉淀法制备粒径为10nm～200nm的纳米磁颗粒，将采用SPA亲和纯化的致病菌兔多克隆抗体和相同浓度的生物素标记的兔IgG按体积比为1∶60混匀后，取混合抗体连接到纳米磁颗粒上制成信标免疫纳米磁颗粒；
(2)制备亲和素标记胶体金；
(3)制备金生长液，确定亲和素标记胶体金在金生长液中的生长时间；
(4)压电传感器的检测
取信标免疫纳米磁颗粒加入到进行梯度稀释的致病菌的菌悬液中，通过超强磁的吸引去除非目标菌；将制备好的亲和素标记胶体金加入，通过生物素-亲和素系统将胶体金结合到信标免疫纳米磁颗粒上；将连接有信标免疫纳米磁颗粒和亲和素标记胶体金的致病菌加入金生长液中，按照步骤(3)确定的生长时间使胶体金得到生长放大，收集该液体滴加至固定有SPA和致病菌鼠单克隆抗体并用牛血清白蛋白封闭非特异性位点的压电传感器的石英晶振上，观察压电传感器频率的变化确定待检测样本中致病菌的浓度。
2.根据权利要求1所述的基于压电传感器检测致病菌的方法，其特征在于：具体步骤为：
(1)制备信标免疫纳米磁颗粒
采用化学共沉淀法制备粒径为10nm～200nm的纳米磁颗粒，将采用SPA亲和纯化的致病菌兔多克隆抗体和相同浓度的生物素标记的兔IgG按体积比为1∶60混匀后，取混合抗体连接到纳米磁颗粒上制成信标免疫纳米磁颗粒；
(2)制备亲和素标记胶体金
胶体金采用柠檬酸钠还原法制备粒径为10nm-20nm的胶体金，将浓度为0.2mg/mL-1.0mg/mL的亲和素连接至胶体金上，即为亲和素标记胶体金；
(3)制备金生长液，确定亲和素标记胶体金在金生长液中的生长时间
取氯金酸溶液加入十六烷基三甲基浴溴化胺溶液中混匀，然后置于100℃水浴锅中加热10min，颜色变为清亮的黄色，室温下冷却备用；加入抗坏血酸溶液轻轻混匀至金生长液颜色消失；取不同浓度的亲和素标记胶体金溶液于金生长液中进行自生长，利用紫外分光光度计进行波长扫描确定胶体金在金生长液中的生长时间；
(4)压电传感器的检测
①石英晶振用piranha液进行洗涤，取SPA溶液固定于压电传感器的石英晶振，检测频率变化，确定SPA的固定浓度和时间后，取致病菌鼠单克隆抗体溶液固定于压电传感器的石英晶振，检测频率变化，确定致病菌鼠单克隆抗体的固定浓度和时间；
②取信标免疫纳米磁颗粒加入到进行梯度稀释的致病菌的菌悬液中，通过超强磁的吸引去除非目标菌；再借助膜将多余的信标免疫纳米磁颗粒离心去除；将步骤(2)中制备好的亲和素标记胶体金加入，通过生物素-亲和素系统将胶体金结合到信标免疫纳米磁颗粒上，然后借助超强磁将未结合的亲和素标记胶体金去除；最后将连接有信标免疫纳米磁颗粒和亲和素标记胶体金的致病菌加入金生长液中，按照步骤(3)确定的生长时间使胶体金得到生长放大，继续用超强磁将多余的金生长液去除；
③按上述步骤(4)①的固定浓度和固定时间分别将SPA和致病菌鼠单克隆抗体固定于压电传感器的石英晶振上，并用牛血清白蛋白封闭石英晶振上非特异性位点，将步骤(4)②中最后收集到的液体滴加至石英晶振上，观察压电传感器频率的变化确定待检测样本中致病菌的浓度。
3.根据权利要求2所述的基于压电传感器检测致病菌的方法，其特征在于：所述致病菌为大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌或嗜肺军团菌。
4.根据权利要求2或3所述的基于压电传感器检测致病菌的方法，其特征在于：所述致病菌为大肠杆菌O157:H7。
5.根据权利要求4所述的基于压电传感器检测致病菌的方法，其特征在于：具体检测方法为：
(1)制备信标免疫纳米磁颗粒
采用化学共沉淀法制备粒径为10nm～200nm的纳米磁颗粒，将采用SPA亲和纯化的浓度为0.5mg/mL大肠杆菌O157:H7兔多克隆抗体和相同浓度的生物素标记的兔IgG按体积比为1∶60混匀后，取每0.3mL混合抗体连接到1mL纳米磁颗粒上制成信标免疫纳米磁颗粒；
(2)制备亲和素标记胶体金
胶体金采用柠檬酸钠还原法制备，制备粒径为18nm的胶体金，将浓度为0.5mg/mL的亲和素连接至胶体金上，即为亲和素标记胶体金；
(3)制备金生长液，确定胶体金在金生长液中的生长时间
取52μl 0.024M氯金酸溶液加入5ml 0.1M十六烷基三甲基浴溴化胺(CTAB)溶液中混匀，然后置于100℃的水浴锅中加热10min，颜色变为清亮的黄色，室温下冷却备用；加入50μl 1M抗坏血酸溶液轻轻混匀至金生长液颜色消失；取每100μl的亲和素标记胶体金溶液于900μl金生长液中进行自生长，其中亲和素标记胶体金溶液的浓度为对步骤(2)中亲和素标记胶体金溶液进行对倍稀释，利用紫外分光光度计进行波长扫描观察胶体金在金生长液中的生长时间为15min；
(4)压电传感器的检测
①石英晶振用pi ranha液进行洗涤，取浓度为0.2mg/mL～2.0mg/mL的SPA溶液10μl固定于压电传感器的石英晶振10～90min，取浓度为0.1mg/mL～1.8mg/mL的大肠杆菌O157:H7鼠单克隆抗体溶液10μl固定于压电传感器的石英晶振10～90min；
②取信标免疫纳米磁颗粒加入到进行梯度稀释的大肠杆菌O157:H7的菌悬液中，通过超强磁的吸引去除非目标菌；再通过0.45μm的膜将多余的信标免疫纳米磁颗粒离心去除；将制备好的亲和素标记胶体金溶液加入，通过生物素-亲和素系统将胶体金结合到信标免疫纳米磁颗粒上，然后借助超强磁将未结合的亲和素标记胶体金去除；最后将连接有信标免疫纳米磁颗粒和亲和素标记胶体金的大肠杆菌O157:H7加入金生长液中，按照步骤(3)确定的生长时间使胶体金得到生长放大，继续用超强磁将多余的金生长液去除；
③按上述步骤(4)①的固定浓度和固定时间分别将SPA和大肠杆菌O157:H7鼠单克隆抗体固定于压电传感器的石英晶振上，并用1％牛血清白蛋白封闭石英晶振上非特异性位点；将步骤(4)②中最后收集到的液体滴加至石英晶振上，观察压电传感器频率的变化确定待检测样本中大肠杆菌O157:H7的浓度。
6.根据权利要求5所述的基于压电传感器检测致病菌的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的纳米磁颗粒粒径约为50nm，连接的大肠杆菌O157:H7兔多克隆抗体的浓度为0.5mg/mL；步骤(2)中亲和素的连接量为14μg/ml。
7.根据权利要求5所述的基于压电传感器检测致病菌的方法，其特征在于：所述步骤(4)中SPA的固定浓度和时间为1.2mg/ml、40min；大肠杆菌O157:H7鼠单克隆抗体的固定浓度和时间为1.0mg/ml、60min。
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