CN104133065B - 纳米免疫磁球、其制备方法及用途 - Google Patents

纳米免疫磁球、其制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种纳米免疫磁球、其制备方法及用途，纳米免疫磁球的平均粒径为100‑1000nm。其制备方法包括：纳米磁球的活化；纳米磁球的偶联：将用于特异性捕获和分离抗原的抗体经稀释后加入离心管中，抗体和活化后的纳米磁球发生偶联反应，使抗体偶联到活化后的纳米磁球表面，得到纳米免疫磁球粗品；其中，偶联反应的反应条件为：偶联温度为4～37℃，偶联时间为2～12小时；抗体的浓度为10～200μg/mL；保存。纳米免疫磁球的粒径远小于常规的免疫磁球，是一种分散效果好、稳定性强的免疫磁球，从而能够方便、快捷、高效的分离出样品中的沙门氏菌。

Description

纳米免疫磁球、其制备方法及用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种纳米免疫磁球、其制备方法及用途。
背景技术
沙门氏菌是一种革兰氏阴性短杆菌，不形成芽胞，是引起人类食物中毒的主要病原菌之一，临床上可表现为胃肠炎、肠热病、菌血症综合症或局灶性疾病。据统计，在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。
目前，我国绝大多数检测机构对沙门氏菌检测的常规方法为分离培养方法，必须进行增菌培养以提高检出率，因而具有检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多、检出率较低等缺点，从而远远不能满足现代检测要求。
免疫磁球是一种新型的功能材料，免疫磁球表面偶联有抗体，在反应体系中，通过抗体与反应介质中特异性抗原结合形成抗原一抗体复合物，此复合物在磁场的作用下定向移动，从而达到分离或检测抗原的目的。通过免疫磁球分离抗原，具有样品分离速度快、特异性强、操作简单、不需要昂贵的仪器设备等特点，而且不影响被分离细胞的生物学性状和功能，目前已在医学和生物学的许多方面发挥了重要作用。
但是，现有的沙门氏菌免疫磁球分离技术中，所使用的免疫磁球产品粒径较大，一般都在1μm以上，因此，在分离微生物过程中，具有免疫磁球溶液稳定性差、容易沉淀聚集、不利于对分离目标物的有效捕获、有可能对被分离的微生物造成损伤、对微生物的检测灵敏度低等缺陷。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明提供一种纳米免疫磁球、其制备方法及用途，纳米免疫磁球的粒径远小于常规的免疫磁球，是一种分散效果好、稳定性强的免疫磁球，从而能够方便、快捷、高效的分离出样品中的沙门氏菌。
本发明采用的技术方案如下：
本发明第一目的为提供一种纳米免疫磁球，所述纳米免疫磁球的平均粒径为100-1000nm。
优选的，所述纳米免疫磁球的平均粒径为180-450nm。
本发明第二目的为提供一种纳米免疫磁球的制备方法，包括以下步骤：
S1，纳米磁球的活化：
取未活化的纳米磁球原料到离心管中，用磷酸盐吐温缓冲液PBST洗涤后，磁分离移除上清液；
以所述PBST为溶剂，分别配制1～10mg/mL的EDC溶液和1～10mg/mL的NHS溶液；向离心管中加入配制的EDC溶液和NHS溶液，在振荡器上振荡活化后，将离心管放置到磁分离架上，待磁球完全被吸附后，磁分离移除上清液；其中，EDC溶液和NHS溶液所使用的溶剂PBST为：10mM磷酸根浓度、pH为6.0～6.4、含有0.05％聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯Tween-20的缓冲液。10mM含义为10mmol/L。
向离心管中加入所述PBST，用所述PBST洗涤纳米磁球后，磁分离移除上清液；使用PBS重悬磁球，得到活化后的纳米磁球；
S2，纳米磁球的偶联：
将用于特异性捕获和分离抗原的抗体经稀释后加入离心管中，抗体和活化后的纳米磁球发生偶联反应，使抗体偶联到活化后的纳米磁球表面，得到纳米免疫磁球粗品；其中，偶联反应的反应条件为：偶联温度为4～37℃，偶联时间为2～12小时；抗体的浓度为10～200μg/mL；
S3，将经S2处理后的离心管放置到磁分离架上，待磁球完全被吸附后，磁分离移除上清液；使用所述PBST洗涤后，加入质量分数为1～5％BSA封闭磁球；其中，封闭磁球的温度为4～37℃；封闭磁球的时间为1～12小时；
S4，将经S3处理后的离心管放置到磁分离架上，磁分离移除上清液后PBS洗涤；
S5，保存：
将经S4处理后的纳米免疫磁球保存在含有1～10％的甘油、0.1～1％酪蛋白、10～20％血清和0.1％叠氮钠的溶液中。
优选的，S1中，磷酸盐吐温缓冲液PBST为10mM、pH为6.0～6.4、含有0.05％Tween-20的缓冲液。
优选的，S1中，所述EDC溶液浓度为1～10mg/ml；所述NHS溶液浓度为1～10mg/ml。
优选的，S1中，所述在振荡器上振荡活化的条件为：22～25℃条件下震荡活化30～60分钟。
优选的，S1中，所述PBS的pH＝7.0～7.4。
本发明第三目的为提供纳米免疫磁球的用途，所述的纳米免疫磁球用于富集沙门氏菌。
实验结果证明，本发明制备得到的纳米免疫磁球对沙门氏菌具有特异性和灵敏性。
本发明的有益效果如下：
本发明提供一种纳米免疫磁球、其制备方法及用途，纳米免疫磁球的粒径远小于常规的免疫磁球，是一种分散效果好、稳定性强的免疫磁球，从而能够方便、快捷、高效的分离出样品中的沙门氏菌。
具体实施方式
纳米免疫磁球制备实施例一
制备方法：
S1，纳米磁球的活化：
取未活化的纳米磁球原料到离心管中，用30μL、pH为6.0、浓度为10mM、含有0.05％Tween-20的磷酸盐吐温缓冲液PBST洗涤3次后，磁分离移除上清液；其中，本发明中，Tween-20含义为吐温20。
以PBST为溶剂，分别配制1mg/mL的EDC溶液15μL、以及，10mg/mL的NHS溶液15μL；向离心管中加入配制的EDC溶液和NHS溶液，22℃条件下在振荡器上震荡活化60分钟，将离心管放置到磁分离架上，待磁球完全被吸附后，磁分离移除上清液；
向离心管中加入PBST，用30μLPBST洗涤纳米磁球3次后，磁分离移除上清液；使用pH＝7.4的PBS重悬磁球，得到活化后的纳米磁球；
S2，纳米磁球的偶联：
将用于特异性捕获和分离抗原的抗体经稀释后加入离心管中，抗体和活化后的纳米磁球发生偶联反应，使抗体偶联到活化后的纳米磁球表面，得到纳米免疫磁球粗品；其中，偶联反应的反应条件为：偶联温度为37℃，偶联时间为12小时；抗体的浓度为200μg/mL；
S3，将经S2处理后的离心管放置到磁分离架上，待磁球完全被吸附后，磁分离移除上清液；使用PBST洗涤3次后，加入300μL5％的BSA封闭磁球；其中，封闭磁球的温度为37℃；封闭磁球的时间为12小时；其中，BSA为牛血清白蛋白。
S4，将经S3处理后的离心管放置到磁分离架上，PBS洗涤后磁分离移除上清液；
S5，保存：
将经S4处理后的纳米免疫磁球保存在含有10％的甘油、1％酪蛋白、10％血清和0.1％叠氮钠的溶液中。
纳米免疫磁球制备实施例二
制备方法：
S1，纳米磁球的活化：
取未活化的纳米磁球原料到离心管中，用100μL、pH为6.4、浓度为10mM、含有0.05％Tween-20的磷酸盐吐温缓冲液PBST洗涤3次后，磁分离移除上清液；
以PBST为溶剂，分别配制10mg/mL、pH＝6.0的EDC溶液15μL、以及，1mg/mL、pH为6.4的NHS溶液15μL；向离心管中加入配制的EDC溶液和NHS溶液，25℃条件下在振荡器上震荡活化30分钟，将离心管放置到磁分离架上，待磁球完全被吸附后，磁分离移除上清液；
向离心管中加入PBST，用30μLPBST洗涤纳米磁球3次后，磁分离移除上清液；使用pH＝7.0的PBS重悬磁球，得到活化后的纳米磁球；
S2，纳米磁球的偶联：
将用于特异性捕获和分离抗原的抗体经稀释后加入离心管中，抗体和活化后的纳米磁球发生偶联反应，使抗体偶联到活化后的纳米磁球表面，得到纳米免疫磁球粗品；其中，偶联反应的反应条件为：偶联温度为4℃，偶联时间为2小时；抗体的浓度为10μg/mL；
S3，将经S2处理后的离心管放置到磁分离架上，待磁球完全被吸附后，磁分离移除上清液；使用PBST洗涤3次后，加入300μL3％的BSA封闭磁球；其中，封闭磁球的温度为4℃；封闭磁球的时间为1小时；
S4，将经S3处理后的离心管放置到磁分离架上，PBS洗涤后磁分离移除上清液；
S5，保存：
将经S4处理后的纳米免疫磁球保存在含有1％的甘油、0.1％酪蛋白、20％血清和0.1％叠氮钠的溶液中。
纳米免疫磁球制备实施例三
制备方法：
S1，纳米磁球的活化：
取未活化的纳米磁球原料到离心管中，用60μL、pH为6.2、浓度为10mM、含有0.05％Tween-20的磷酸盐吐温缓冲液PBST洗涤3次后，磁分离移除上清液；
以PBST为溶剂，分别配制8mg/mL、pH＝6.2的EDC溶液15μL、以及，7mg/mL、pH为6.1的NHS溶液15μL；向离心管中加入配制的EDC溶液和NHS溶液，23℃条件下在振荡器上震荡活化45分钟，将离心管放置到磁分离架上，待磁球完全被吸附后，磁分离移除上清液；
向离心管中加入PBST，用30μLPBST洗涤纳米磁球3次后，磁分离移除上清液；使用pH＝7.3的PBS重悬磁球，得到活化后的纳米磁球；
S2，纳米磁球的偶联：
将用于特异性捕获和分离抗原的抗体经稀释后加入离心管中，抗体和活化后的纳米磁球发生偶联反应，使抗体偶联到活化后的纳米磁球表面，得到纳米免疫磁球粗品；其中，偶联反应的反应条件为：偶联温度为21℃，偶联时间为10小时；抗体的浓度为100μg/mL；
S3，将经S2处理后的离心管放置到磁分离架上，待磁球完全被吸附后，磁分离移除上清液；使用PBST洗涤3次后，加入300μL3％的BSA封闭磁球；其中，封闭磁球的温度为25℃；封闭磁球的时间为5小时；
S4，将经S3处理后的离心管放置到磁分离架上，PBS洗涤后磁分离移除上清液；
S5，保存：
将经S4处理后的纳米免疫磁球保存在含有8％的甘油、0.7％酪蛋白、15％血清和0.1％叠氮钠的溶液中。
纳米免疫磁球制备实施例四
制备方法：
S1，纳米磁球的活化：
取未活化的纳米磁球原料到离心管中，用80μL、pH为6.3、浓度为10mM、含有0.05％Tween-20的磷酸盐吐温缓冲液PBST洗涤3次后，磁分离移除上清液；
以PBST为溶剂，分别配制4mg/mL、pH＝6.3的EDC溶液15μL、以及，9mg/mL、pH为6.1的NHS溶液15μL；向离心管中加入配制的EDC溶液和NHS溶液，24℃条件下在振荡器上震荡活化40分钟，将离心管放置到磁分离架上，待磁球完全被吸附后，磁分离移除上清液；
向离心管中加入PBST，用30μLPBST洗涤纳米磁球3次后，磁分离移除上清液；使用pH＝7.2的PBS重悬磁球，得到活化后的纳米磁球；
S2，纳米磁球的偶联：
将用于特异性捕获和分离抗原的抗体经稀释后加入离心管中，抗体和活化后的纳米磁球发生偶联反应，使抗体偶联到活化后的纳米磁球表面，得到纳米免疫磁球粗品；其中，偶联反应的反应条件为：偶联温度为12℃，偶联时间为9小时；抗体的浓度为50μg/mL；
S3，将经S2处理后的离心管放置到磁分离架上，待磁球完全被吸附后，磁分离移除上清液；使用PBST洗涤3次后，加入300μL4％的BSA封闭磁球；其中，封闭磁球的温度为16℃；封闭磁球的时间为8小时；
S4，将经S3处理后的离心管放置到磁分离架上，PBS洗涤后磁分离移除上清液；
S5，保存：
将经S4处理后的纳米免疫磁球保存在含有6％的甘油、0.2％酪蛋白、17％血清和0.1％叠氮钠的溶液中。
纳米免疫磁球制备实施例五
制备方法：
S1，纳米磁球的活化：
取未活化的纳米磁球原料到离心管中，用60μL、pH为6.3、浓度为10mM、含有0.05％Tween-20的磷酸盐吐温缓冲液PBST洗涤3次后，磁分离移除上清液；
以PBST为溶剂，分别配制6mg/mL、pH＝6.2的EDC溶液15μL、以及，8mg/mL、pH为6.2的NHS溶液15μL；向离心管中加入配制的EDC溶液和NHS溶液，24℃条件下在振荡器上震荡活化50分钟，将离心管放置到磁分离架上，待磁球完全被吸附后，磁分离移除上清液；
向离心管中加入PBST，用30μLPBST洗涤纳米磁球3次后，磁分离移除上清液；使用pH＝7.3的PBS重悬磁球，得到活化后的纳米磁球；
S2，纳米磁球的偶联：
将用于特异性捕获和分离抗原的抗体经稀释后加入离心管中，抗体和活化后的纳米磁球发生偶联反应，使抗体偶联到活化后的纳米磁球表面，得到纳米免疫磁球粗品；其中，偶联反应的反应条件为：偶联温度为26℃，偶联时间为8小时；抗体的浓度为150μg/mL；
S3，将经S2处理后的离心管放置到磁分离架上，待磁球完全被吸附后，磁分离移除上清液；使用PBST洗涤3次后，加入300μL4％的BSA封闭磁球；其中，封闭磁球的温度为32℃；封闭磁球的时间为6小时；
S4，将经S3处理后的离心管放置到磁分离架上，PBS洗涤后磁分离移除上清液；
S5，保存：
将经S4处理后的纳米免疫磁球保存在含有9％的甘油、0.3％酪蛋白、16％血清和0.1％叠氮钠的溶液中。
纳米免疫磁球制备实施例六
制备方法：
S1，纳米磁球的活化：
取未活化的纳米磁球原料到离心管中，用80μL、pH为6.3、浓度为10mM、含有0.05％Tween-20的磷酸盐吐温缓冲液PBST洗涤3次后，磁分离移除上清液；
以PBST为溶剂，分别配制3mg/mL、pH＝6.2的EDC溶液15μL、以及，9mg/mL、pH为6.3的NHS溶液15μL；向离心管中加入配制的EDC溶液和NHS溶液，23℃条件下在振荡器上震荡活化50分钟，将离心管放置到磁分离架上，待磁球完全被吸附后，磁分离移除上清液；
向离心管中加入PBST，用30μLPBST洗涤纳米磁球3次后，磁分离移除上清液；使用pH＝7.3的PBS重悬磁球，得到活化后的纳米磁球；
S2，纳米磁球的偶联：
将用于特异性捕获和分离抗原的抗体经稀释后加入离心管中，抗体和活化后的纳米磁球发生偶联反应，使抗体偶联到活化后的纳米磁球表面，得到纳米免疫磁球粗品；其中，偶联反应的反应条件为：偶联温度为19℃，偶联时间为12小时；抗体的浓度为170μg/mL；
S3，将经S2处理后的离心管放置到磁分离架上，待磁球完全被吸附后，磁分离移除上清液；使用PBST洗涤3次后，加入300μL3％的BSA封闭磁球；其中，封闭磁球的温度为21℃；封闭磁球的时间为7小时；
S4，将经S3处理后的离心管放置到磁分离架上，PBS洗涤后磁分离移除上清液；
S5，保存：
将经S4处理后的纳米免疫磁球保存在含有5％的甘油、0.8％酪蛋白、13％血清和0.1％叠氮钠的溶液中。
试验例1
本试验例用于考察纳米免疫磁球制备实施例1-6制备得到的纳米免疫磁球是否偶联上抗体。
抗体均选用商品化羊抗沙门氏菌多克隆抗体、未活化的纳米磁球原料的粒径均选定为180nm，分别对纳米免疫磁球制备实施例1-6制备得到的样品1-6进行对目标菌的捕获试验，试验条件为：向编号为1、2、3、4、5、6的离心管中分别加入1mL的细菌培养液，然后分别向离心管1、离心管2、离心管3、离心管4、离心管5和离心管6中加入制备得到的纳米免疫磁球样品1、样品2、样品3、样品4、样品5和样品6，置25℃摇床中孵育0.5小时后，将离心管放置到磁分离架上，PBS洗涤后磁分离移除上清液；最后，每个离心管用1mLPBS重悬磁珠后，灌营养琼脂平皿，置于37℃培养箱中培养24小时后观察。敏感性试验结果见表1。
表1
样品编号 捕获率
样品1 90.3％
样品2 89.9％
样品3 92.2％
样品4 91.8％
样品5 90.5％
样品6 93.4％
通过对沙门氏菌的捕获试验结果可以看出，样品1-6均能够高效的捕获沙门氏菌，从而验证了通过本发明制备实施例1-6制备得到的纳米免疫磁球，均成功偶联上了商品化羊抗沙门氏菌多克隆抗体。
试验例2
本试验例用于考察偶联时间对偶联反应的影响。
按照纳米免疫磁球制备实施例一中的方法，向离心管中加入活化后的纳米磁球，然后加入抗体后，每隔1小时测定离心管中上清的OD280nm值，试验结果见表2。
表2
从上表可以看出，当偶联时间达到4小时左右时，磁球吸附抗体基本达到饱和，OD280nm值趋于稳定，因此，抗体包被磁珠的最佳时间为4小时。
试验例3
本试验例用于考察未活化的纳米磁球原料的粒径对所制得的纳米免疫磁球的影响。
按照纳米免疫磁球制备实施例一中的方法，分别选取粒径为180nm、300nm、450nm、800nm和1000nm的未活化的纳米磁球原料，抗体选用商品化羊抗沙门氏菌多克隆抗体，分别配制得到纳米免疫磁球的样品1、样品2、样品3、样品4和样品5。
对纳米免疫磁球的样品1、样品2、样品3、样品4和样品5进行对目标菌的捕获试验，试验条件为：向编号为1、2、3、4、5的离心管中分别加入1mL的细菌培养液，然后分别向离心管1、离心管2、离心管3、离心管4和离心管5中加入制备得到的纳米免疫磁球样品1、样品2、样品3、样品4和样品5，置25℃摇床中孵育0.5小时后，将离心管放置到磁分离架上，PBS洗涤后磁分离移除上清液；最后，每个离心管用1mLPBS重悬磁珠后，灌营养琼脂平皿，置于37℃培养箱中培养24小时后观察。敏感性试验结果为：样品1对沙门氏菌的捕获率为92.1％，样品2对沙门氏菌的捕获率为91.0％，样品3对沙门氏菌的捕获率为90.0％，样品4对沙门氏菌的捕获率为78.0％，样品5对沙门氏菌的捕获率为65.7％。
通过对沙门氏菌的捕获试验结果可以看出，样品1、样品2和样品3的敏感性接近，均明显优于样品4和样品5。因此，未活化的纳米磁球原料的最佳粒径范围为：180nm-450nm。
试验例4
本试验例用于考察纳米免疫磁球富集沙门氏菌的特异性
向编号为1、2、3、4的离心管中分别加入用无菌PBS稀释至102～103cfu/mL的细菌培养液，离心管1中加入大肠埃希氏菌，离心管2中加入沙门氏菌，离心管3中加入单核细胞增生李斯特菌，离心管4中加入志贺氏菌。然后分别向离心管1、离心管2、离心管3和离心管4中加入制备实施例一制备得到的纳米免疫磁球10μL，置25℃摇床中孵育0.5小时后，将离心管放置到磁分离架上，PBS洗涤后磁分离移除上清液；最后，每个离心管用1mLPBS重悬磁珠后，灌营养琼脂/TSA-YE平皿，置于37℃培养箱中培养24小时后观察。
试验结果为：所制备的纳米免疫磁球对沙门氏菌的捕获率为96.0％，对志贺氏菌的捕获率为2.0％，对单核细胞增生李斯特氏菌的捕获率是33.0％，对大肠埃希氏菌的捕获率为6.5％。
实验结果表明，制备实施例一制备得到的纳米免疫磁球对沙门氏菌的富集具有特异性。
对本发明其他制备实施例制备得到的纳米免疫磁球进行了相同实施，实验结果相似。
试验例5
本试验例用于考察纳米免疫磁球富集沙门氏菌的灵敏性。
将沙门氏菌培养液10倍倍比稀释，取制备实施例一制备得到的沙门氏菌抗体包被后的纳米免疫磁球10μL加入到1mL的细菌培养液中，室温结合0.5小时，将其置于磁场30min，使磁球充分吸附细菌后，PBS洗涤后磁分离移除上清液；最后，每个离心管用1mLPBS重悬磁珠后，灌营养琼脂平皿，置于37℃培养箱中培养24小时后观察。结果表明，当菌液稀释到10-10时，溶液中的沙门氏菌总菌落数为5cfu/mL时，纳米免疫磁球结合目标菌，经磁场富集分离，捕获率为100％。由此可见，本发明制备实施例一制备得到的纳米免疫磁球灵敏性非常高。
对本发明其他制备实施例制备得到的纳米免疫磁球进行了相同实施，实验结果相似。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种纳米免疫磁球的制备方法，其特征在于，通过制备方法，制备得到平均粒径为180-450nm的纳米免疫磁球，纳米免疫磁球的制备方法包括以下步骤：
S1，纳米磁球的活化：
取未活化的纳米磁球原料到离心管中，用磷酸盐吐温缓冲液PBST洗涤后，磁分离移除上清液；
以所述PBST为溶剂，分别配制1～10mg/mL的EDC溶液和1～10mg/mL的NHS溶液；向离心管中加入配制的EDC溶液和NHS溶液，在振荡器上振荡活化后，将离心管放置到磁分离架上，待磁球完全被吸附后，磁分离移除上清液；
向离心管中加入所述PBST，用所述PBST洗涤纳米磁球后，磁分离移除上清液；使用PBS重悬磁球，得到活化后的纳米磁球；
S1中，所述PBS的pH＝7.0～7.4；
S1中，所述在振荡器上振荡活化的条件为：22～25℃条件下震荡活化30～60分钟；
S1中，所述EDC溶液浓度为1～10mg/ml；所述NHS溶液浓度为1～10mg/ml；
S1中，磷酸盐吐温缓冲液PBST为10mM、pH为6.0～6.4、含有0.05％Tween-20的缓冲液；
S2，纳米磁球的偶联：
将用于特异性捕获和分离抗原的抗体经稀释后加入离心管中，抗体和活化后的纳米磁球发生偶联反应，使抗体偶联到活化后的纳米磁球表面，得到纳米免疫磁球粗品；其中，偶联反应的反应条件为：偶联温度为4～37℃，偶联时间为2～12小时；抗体的浓度为10～200μg/mL；
S3，将经S2处理后的离心管放置到磁分离架上，待磁球完全被吸附后，磁分离移除上清液；使用所述PBST洗涤后，加入质量分数为1～5％BSA封闭磁球；其中，封闭磁球的温度为4～37℃；封闭磁球的时间为1～12小时；
S4，将经S3处理后的离心管放置到磁分离架上，PBS洗涤后磁分离移除上清液；
S5，保存：
将经S4处理后的纳米免疫磁球保存在含有1～10％的甘油、0.1～1％酪蛋白、10～20％血清和0.1％叠氮钠的溶液中。
2.一种纳米免疫磁球的用途，其特征在于，权利要求1所述的纳米免疫磁球用于富集沙门氏菌。
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