CN109929813A - 沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物及其富集分离试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物及其富集分离试剂盒，所述偶联物为沙门氏菌噬菌体与羧基磁珠偶联得到复合物，其中，所述沙门氏菌噬菌体为鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(Salmonella Typhimurium bacteriophage)LPST10，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2016473。本发明沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物中噬菌体能特异性识别并侵染细菌；具有特异性好，分子量小的特点。该试剂盒能快速、灵敏的分离富集沙门氏菌。

Description

沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物及其富集分离试剂盒

技术领域

本发明涉及食品安全领域，具体地指一种沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物及其富集分离试剂盒。

背景技术

沙门氏菌可在人和禽类的肠道内寄生引发沙门氏菌病，是全球引起的食源性疾病暴发率最高，患病人数最多的一种病原菌。沙门氏菌有2500多种血清型。其中，鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌是导致沙门氏菌食物中毒的最常见的血清型。

对于食品中沙门氏菌的检测，主要采用传统的选择培养基鉴别的方法。其方法耗时长(3-7天)，步骤繁琐。因此，近年来检测技术的开发方向主要包括基于免疫学、分子生物学等方法对沙门氏菌进行快速灵敏的检测。基于免疫学方法检测具有特异性好，灵敏度高的优点，但仍具有抗体成本较高，检测时间长的不足。而分子生物学方法快速灵敏，但有存在假阳性扩增的风险。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物及其富集分离试剂盒；其具有特异性好，分子量小，分离富集迅速的特点。

为实现上述目的，本发明提供了一种沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物，所述偶联物为沙门氏菌噬菌体与羧基磁珠偶联得到的复合物，其中，所述沙门氏菌噬菌体为鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(Salmonella typhimurium bacteriophage)LPST10，其保藏编号为：CCTCCNO：M 2016473。

进一步地，所述羧基磁珠的直径为300～500nm。

再进一步地，所述羧基磁珠的直径为400nm。

上述沙门氏菌噬菌体已送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(Salminella Typhimurium bacteriophage)LPST10，保藏编号为：CCTCC NO：M 2016473；保藏日期为2016年9月9日，地址：中国武汉武汉大学，其中，该鼠伤寒沙门氏菌噬菌体在申请号为2016109240160、发明名称为沙门氏菌噬菌体和噬菌体抗菌组合物及其应用的中国发明专利公开。

上述鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(Salminella Typhimurium bacteriophage)LPST10为实验室分离噬菌体，其可识别不同血清型沙门氏菌的宽谱噬菌体(包括鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌)；其具有高pH稳定性(3-13)和热稳定性(30℃-60℃)。

上述鼠伤寒沙门氏菌噬菌体LPST10尾部的受体结合蛋白可特异性识别并吸附沙门氏菌表面外膜蛋白(O抗原)。在宿主菌体内复制增殖，并在溶菌酶的作用下，最终裂解细菌释放更多的子代噬菌体。

上述磁性微球购于普瑞迈格(PuriMag Biotech)生产的蛋白偶联磁珠系列(PuriMag Si-Coupling)，表面修饰羧基基团(PuriMag Si-COOH)，尺寸为直径400nm。(普瑞迈格生物技术有限公司(PuriMag Biotechnology Ltd.,Xiamen,China))。

本发明提供了一种沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物的制备方法，包括以下步骤：

1)将噬菌体LPST10活化；

2)将磁珠进行羧基活化；得到活化羧基磁珠；

3)将活化的噬菌体LPST10与羧基磁珠进行偶联，得到沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物。

作为优选方案，所述步骤1)中，噬菌体LPST10活化具体方法如下：

从-80℃取噬菌体贮存液于TSA平板上划线，按从稀释倍数高到低的方向倒入4mL含有200μL宿主菌的0.7％琼脂TSB培养基。挑取单个噬菌斑于1mL TSB培养基37℃培养6-8小时，加入20μL氯仿，继续培养10min以释放子代噬菌体。经8000r/min离心10min,取上清液划线，按上述方法采用双层平板于37℃培养。倾注4mL PBS缓冲液至含有噬菌斑的平板上于4℃过夜，吸取出缓冲液到10mL离心管，8,000rpm离心15min，并用0.22μm微孔滤膜过滤备用。

作为优选方案，所述步骤2)中，磁珠羧基活化的制备方法如下：

取1mL保存磁珠(MBs)，经超声分散充分混匀后，取100μL PuriMag Si-COOH磁珠到1.5mL离心管中，置于磁性分离架上，待固液分离后去除上清液，保留MBs。加入200μL MES溶液(50mM，pH5.0)到上述离心管中，混匀置于磁性分离架上，待固液分离后去除上清液，重复该步骤1次。迅速加入新配置的100μL NHS溶液(20mg/mL)，200μL EDC溶液(20mg/ml)到装有磁珠的离心管中，漩涡混匀使磁珠充分悬浮，室温下垂直混合30min。用磁力架弃上清，并用冰PBS缓冲液洗三次(500μL)，于100μLPBS缓冲液中重悬。

作为优选方案，所述步骤3)中，偶联的具体方法：

取100μL PBS缓冲液重悬保存活化的磁珠，加入100μL噬菌体液(10⁹PFU/mL)轻柔地混匀，在4℃条件下垂直混合过夜。用1mL PBS缓冲液至少洗三次以去除未偶联的噬菌体。噬菌体-磁珠用1mL含0.1％BSA(w/v)的PBS缓冲液封闭剩余结合位点，(涡旋30s)，将离心管置于混合仪4℃反应2h，反应结束后，将离心管置于磁力架上，待固液分离后移除上清液，然后加入1mL PBS缓冲液(pH7.4)，磁吸分离，重复该步骤1次；噬菌体磁珠偶联物存于含0.1％BSA(w/v)的PBS缓冲液(pH7.4)中。

本发明提供了一种富集分离沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：它包括权利要求1所述沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物。

作为优选方案，所述试剂盒还包括阴性对照品、阳性对照品、TE缓冲液。

其中，所述沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物溶于含有质量体积浓度为0.1％BSA(w/v)的PBS缓冲液，PBS缓冲液摩尔浓度为0.05mol/L；其中，缓冲液中，沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物的浓度为1～2μg/μL。

阴性对照品为含有质量体积浓度为0.1％BSA(w/v)的PBS缓冲液(pH7.2-7.4)，其中，PBS缓冲液摩尔浓度为0.05mol/L；

阳性对照品为沙门氏菌阳性对照，该沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028；

TE缓冲液成分：10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1mmol/L EDTA(pH 8.0)

利用上述试剂盒富集分离沙门氏菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)当样品中含有沙门氏菌时，按噬菌体纳米磁珠偶联物与样品体积比1:5(v/v)将样品加入噬菌体纳米磁珠偶联物中，于旋转涡旋仪上，37℃条件作用15分钟；

2)将样品同时置于磁力架上2-3min使磁珠充分吸附后，弃上清；所剩余磁珠偶联物于200μL TE缓冲液中重悬，同时分别称取200μL阳性对照和阴性对照进行对比检测。

本发明的有益效果在于：

本发明沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物中噬菌体能特异性识别并侵染细菌；具有特异性好，分子量小的特点。该试剂盒能快速、灵敏的分离富集沙门氏菌；其具体优点如下：

1)克服了不同样品基质组分对沙门氏菌检测的影响；

2)本发明富集时间快(一般15分钟)，而传统富集前处理需18-24h。

3)噬菌体作为特异性识别噬菌体的元件代替抗体，降低成本；

4)噬菌体与纳米磁珠偶联形成的噬菌体-磁珠可特异性富集样品基质中沙门氏菌；

5)富集后样品采用实时荧光定量PCR进行检测，具有快速灵敏的优势。

综上所述，本发明以噬菌体作为特异性识别噬菌体的元件代替抗体制备偶联物，可识别不同血清型沙门氏菌，识别范围广且成本较低。

附图说明

图1为磁珠透射电镜照片。

图2为噬菌体纳米磁珠偶联物捕获沙门氏菌透射电镜图。

图3为噬菌体纳米磁珠偶联物制备条件优化。

其中：图3中A表示不同沙门氏菌浓度对捕获效率的影响，图3中B表示加入噬菌体纳米磁珠偶联物的量对捕获效率的影响，图3中C表示反应时间对捕获效率的影响，图3中D表示反应温度对捕获效率的影响。

图4为噬菌体纳米磁珠捕获效率的特异性。

图5为qPCR检测使用引物(invA)特异性的检测。

图6为不同基质中qPCR标准曲线Ct值的绘制。

其中：图6中A表示梯度稀释基因组qPCR测定绘制Ct值绘制标准曲线，图6中B表示不同基质中，菌液梯度稀释采用煮沸法提取基因组qPCR法测定Ct值绘制标准曲线。

图7为测定在不同基质包括TE缓冲液(A)、TSB培养基(B)和脱脂牛奶(C)、生菜(D)中，使用噬菌体纳米磁珠富集前后Ct值的变化。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

下述实施例使用材料来源：

噬菌体(10⁹PFU/mL)：采用宿主谱，裂菌能力强的噬菌体LPST10与羧基磁珠偶联。

磁性微球：采用普瑞迈格(PuriMag Biotech)生产的蛋白偶联磁珠系列(PuriMagSi-Coupling)，表面修饰羧基基团(PuriMag Si-COOH)，尺寸为直径400nm。(普瑞迈格生物技术有限公司(PuriMag Biotechnology Ltd.,Xiamen,China))

菌种及编号：鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium ATCC14028)、肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis ATCC13076)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella CholeraesulsATCC10708)、李斯特菌(Listeria monocytogenes ATCC19114)、副溶血弧菌(VibrioParahemolyticus ATCC17802，ATCC33846)来源于美国ATCC生物生物标准品资源中心(ATCC)。乙型副伤寒沙门氏菌(Salmonella Paratyphi B CMCC 50094)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CMCC(B)260031)来源于中国医学细菌菌种保藏管理中心(CMCC)。鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum CVCC534)购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)、大肠杆菌(Escherichia coli O157:H7 NCTC12900)来源于国家标准菌库(NCTC)。

实施例1沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物的制备

1、噬菌体的活化

从-80℃取噬菌体贮存液于TSA平板上划线，按从稀释倍数高到低的方向倒入4mL含有200μL宿主菌的0.7％琼脂TSB培养基。挑取单个噬菌斑于1mL TSB培养基37℃培养6-8小时，加入20μL氯仿，继续培养10min以释放子代噬菌体。经8000r/min离心10min,取上清液划线，按上述方法采用双层平板于37℃培养。倾注4mL PBS缓冲液至含有噬菌斑的平板上于4℃过夜，吸取出缓冲液到10mL离心管，8,000rpm离心15min，并用0.22μm微孔滤膜过滤备用。

2、NHS活化(磁珠羧基的活化)

取1mL保存磁珠(MBs)，经超声分散充分混匀后，取100μL PuriMag Si-COOH磁珠到1.5mL离心管中，置于磁性分离架上，待固液分离后去除上清液，保留MBs。加入200μL MES溶液(50mM，pH5.0)到上述离心管中，混匀置于磁性分离架上，待固液分离后去除上清液，重复该步骤1次。迅速加入新配置的100μL NHS溶液(20mg/mL)，200μL EDC溶液(20mg/ml)到装有磁珠的离心管中，漩涡混匀使磁珠充分悬浮，室温下垂直混合30min。用磁力架弃上清，并用冰PBS缓冲液洗三次(500μL)，于100μLPBS缓冲液中重悬。(活化状态不宜长时间保存，建议立即进行偶联)

3、噬菌体-磁珠(Phage-MBs)偶联

取100μLPBS缓冲液重悬保存活化的磁珠，加入100μL噬菌体液(10⁹PFU/mL)轻柔地混匀。在4℃条件下垂直混合过夜。用1mL PBS缓冲液至少洗三次以去除未偶联的噬菌体。噬菌体-磁珠用1mL含0.1％BSA(w/v)的PBS缓冲液封闭剩余结合位点，(涡旋30s)，将离心管置于混合仪4℃反应2h。反应结束后，将离心管置于磁力架上，待固液分离后移除上清液，然后加入1mL PBS缓冲液(pH7.4)，磁吸分离，重复该步骤1次。沙门氏菌噬菌体磁珠偶联物存于含0.1％BSA(w/v)的PBS缓冲液(pH7.4)中，沙门氏菌噬菌体磁珠偶联物简称为噬菌体-磁珠(Phage-MBs)。

实施例2沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物性能评估

1、磁珠观察

使用购买磁珠(磁珠参数10¹¹个/mL)，将干燥样品先在水中稀释，并用超声波分散30min，再将铜网插入到分散液中吸附5-10min，自然干燥后待测。

2、噬菌体纳米磁珠捕获菌电镜观察

取1mL培养至对数期的菌液，10,000rpm离心10min。弃上清，于1mL PBS缓冲液中重悬。重复上述操作三次。取噬菌体纳米磁珠(100μL，1mg/mL)稀释10倍，取500μL噬菌体纳米磁珠加入到500μL上述菌液中。120rpm下，37℃吸附15min。取出样品，加入等体积的固定液。采用负染法，铜网碳面扣在样品上，吸附样品5分钟。用滤纸垂直吸掉多余液体直至看不到残留液体。将铜网碳面扣在磷钨酸(Phosphotungstic acid，PTA)液滴上染色20-30s，用滤纸吸干；放在滤纸上，在阴凉处自然干燥，即可电镜观察。结果如图2所示，购买磁珠直径为400nm，所制备的沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物可特异性捕获沙门氏菌。

实施例3沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物使用条件优化

1、沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物最佳工作浓度的确定

噬菌体磁珠P-MBs(总1mL)，分别取600μL，400μL，200μL,100μL,50μL,10μL,加入到1mL细菌培养液(10⁵CFU/mL或10³CFU/mL)中，37℃作用15min后，将其置于磁力架上2-3min使磁珠充分吸附后，取上清液涂于XLD平皿，37℃培养12h观察。

2、沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物最佳温度的确定

噬菌体磁珠P-MBs分别取200μL加入到1mL细菌培养液(10³CFU/mL)中，55、42、37、25、4℃作用15min后，将其置于磁力架上2-3min使磁珠充分吸附后，取上清液涂于XLD平皿，37℃培养12h观察。

3、反应时间优化

取噬菌体-磁珠200μL，加入到沙门氏菌，37℃作用5min，15min，30min后，将其置于磁力架上2-3min使磁珠充分吸附后，取上清液涂于XLD平皿，37℃培养12h观察。

实施例4沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物灵敏度评估

取200μL沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物，按上述试剂盒使用方法加入到不同浓度的沙门氏菌(10⁵CFU/mL、10⁴CFU/mL、10³CFU/mL、10²CFU/mL、10CFU/mL)，取所得上清液涂于XLD平皿，37℃培养12h观察。

结果如图3所示，当加入在噬菌体-磁珠为200μg以内时，捕获效率随加入量增加而增加。当加入量高于200μg后，其捕获效率增加量不显著(P>0.5)。而当捕获时间为15分钟时，捕获效率较高(76.55％)。当反应温度为37℃时，捕获效率较高(81.9％)。而不同菌数浓度对噬菌体-磁珠捕获效率的影响不显著。因此，加入噬菌体-磁珠200μg，37℃作用15分钟的条件对沙门氏菌捕获效率较好。

实施例5富集分离沙门氏菌的试剂盒

富集分离沙门氏菌的试剂盒包括沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物、阴性对照品、阳性对照品、TE缓冲液；其中，

所述沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物溶于含有质量体积浓度为0.1％BSA(w/v)的PBS缓冲液，PBS缓冲液摩尔浓度为0.05mol/L；其体积为50mL，其中，缓冲液中，沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物的浓度为1mg/mL。阴性对照品为含有质量体积浓度为0.1％BSA(w/v)的PBS缓冲液(pH7.2-7.4)，其中，PBS缓冲液摩尔浓度为0.05mol/L；

阳性对照品为沙门氏菌阳性对照，该沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028；

TE缓冲液成分：10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1mmol/L EDTA(pH 8.0)

利用上述试剂盒富集分离沙门氏菌的方法，包括以下步骤：

1)当样品中含有沙门氏菌时，按体积比1:5样品加入噬菌体纳米磁珠偶联物中，于旋转涡旋仪上，37℃条件作用15分钟；

2)将样品置于磁力架上2-3min使磁珠充分吸附后，弃上清；所剩余磁珠偶联物于200μL TE缓冲液中重悬，同时分别称取200μL阳性对照和阴性对照进行对比检测。

实施例6试剂盒特异性评估

按上述试剂盒使用方法加入到1mL沙门氏菌(10⁵CFU/mL)，与副溶血弧菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，李斯特菌混合液，取上清液涂于XLD平皿，37℃培养12h观察。结果如图4所示，噬菌体-磁珠可特异性捕获不同血清型的沙门氏菌及其混合物，对其他种属的细菌不具有捕获能力。

实施例7利用试剂盒结合实时荧光定量PCR技术检测沙门氏菌方法的建立

1、实时荧光定量PCR条件的建立(特异性评估)

取不同血清型的沙门氏菌及其他种属菌株(见表1)一环，37℃，160rpm于TSB培养基中培养过夜得到相应增菌液。用煮沸法提取基因组为DNA模板。具体地，分别采用TSB培养基、TE缓冲液或无菌水中重悬10⁸CFU/mL菌液于1.5mL离心管中。12,000r/min离心10min。弃去上清，加入60μL TE将细胞悬浮起来，100℃水浴10min，冰浴10min，1,2000rpm离心10min，取上清液备用。采用引物invA(中华人民共和国出入境检验检疫行业标准食品中多种致病菌快速检测－PCR方法；引物序列：5’-gtg aaa tta tcg cca cgt tcg ggc aa-3’；5’-tcatcg cac cgt caa agg aac c-3,扩增片断长度：284bp。)依据qPCRGreenMaster Mix产品说明书进行实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分析。实验设置三个平行，实验的重复性依据在不同时间独立运行样品来评估。PCR产物用溴化乙锭染色1％琼脂糖凝胶进行验证，并同时测定其所含DNA浓度及含量。结果如图5所示，采用上述方法对不同种属细菌进行实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分析可特异性检出沙门氏菌。

2、不同基因组浓度实时荧光定量PCR标准曲线的绘制

分别于TE缓冲液、TSB培养基和脱脂牛奶中接种鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028(American Type Culture Collection,Manassas,VA)，用Real-time PCR方法测定鼠伤寒沙门氏菌。

采用实施例7.1中所述煮沸法提取基因组并取上清液梯度稀释。通过绘制CFU与靶基因产生的阈值周期(C_T)来构建标准曲线。为了比较不同实验中PCR扩增效率和检测灵敏度，通过进行线性回归分析计算标准曲线斜率。结果如图6A所示，其中以TE缓冲液或无菌水重悬后提取的基因组其浓度与C_T值正相关且呈线性关系(y＝-3.881x+46.64R²＝0.9815；y＝-3.139x+35.80,R²＝0.9939)。

3、不同菌液浓度条件下实时荧光定量PCR标准曲线的绘制

分别制备10⁰-10⁸CFU/mL菌液(菌数通过于XLD平板计数所得)，同时设置未接种沙门氏菌的TSB培养基(或脱脂牛奶或PBS缓冲液)为阴性对照。实验设置三个平行，分别采用煮沸法和传统提取基因组。其中煮沸法采用实施例7.1所述方法提取不同浓度沙门氏菌基因组。传统提取法采用蛋白酶K和SDS提取基因组提取沙门氏菌基因组。具体地，细菌接种于5mL液体培养基中，37℃摇床(300rpm)培养过夜。取1mL培养物于1.5mL EP管中，室温8,000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1mL TE(pH8.0)中。加入6μL 50mg/mL的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/L NaCl 50μL，10％SDS 110μL，20mg/mL的蛋白酶K 3μL，50℃作用3h。抽提：菌液取500μL，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，混匀，室温放置5-10min。12,000rpm离心10min。抽提2次。加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。12,000rpm离心10min。沉淀用75％的乙醇洗涤。溶于50μL双蒸水中，取5μL做模板。将提取的上清液梯度稀释。通过绘制CFU与靶基因产生的阈值周期(C_T)来构建标准曲线。

为了比较不同实验中PCR扩增效率和检测灵敏度，通过进行线性回归分析计算标准曲线斜率。为了比较不同实验中PCR扩增效率和检测灵敏度，通过进行线性回归分析计算标准曲线斜率。

结果如图6B所示，当采用传统提取法时，菌数与靶基因产生的阈值周期(C_T)呈线性关系(y＝2.18x+33.49R²＝0.9159)，当采用煮沸法且重悬于TE缓冲液时菌数与靶基因产生的阈值周期(C_T)呈线性关系(y＝2.992x+39.33R²＝0.9560)。

实施例8利用试剂盒结合实时荧光定量PCR技术检测沙门氏菌方法的评估

1、不同食品基质条件使用试剂盒性能评估

取样品1mL加入沙门氏菌(终浓度为0-5log CFU/mL)，实验设置阴性对照。按上述试剂盒使用方法富集样品。将富集后样品置于磁力架上2-3min使磁珠充分吸附后，弃上清。磁珠于100μL PBS中重悬。用实施例7方法提取基因组为DNA模板，进行实时荧光定量PCR(Real-time PCR)分析。实验设置三个平行，实验的重复性依据在不同时间独立运行样品来评估。在指数扩增阶段中荧光跨越特定阈值的周期数(指定为阈值周期[C_T])。结果如图7A-C所示，对于TSB培养基和牛奶样品，在未经噬菌体-磁珠富集时不可检出。而经噬菌体-磁珠富集后当沙门氏菌浓度高于10²CFU/mL时，可检出样品中的沙门氏菌。

2、生菜样品使用试剂盒性能评估

从菜市场买回生菜去除最外两层，剩下部分用无菌水冲洗，同时用75％酒精擦拭一遍，再置于紫外光照20min(正反各10min)。之后以无菌钻孔器(直径1.5cm)取中间鲜嫩的部分，置于无菌培养皿中，暂存于4℃。

吸取1mL所制备的沙门氏菌菌悬液，梯度稀释。取10μL菌悬液(0-9log CFU/cm²)滴加于生菜表面，均匀涂在生菜表面，得到样品上人工污染沙门氏菌菌液0-8CFU/cm²。将样品放置至安全柜中放置45min。用镊子轻取生菜样品于含有800μL无菌水的EP管中混匀。样品研磨匀浆，匀浆液在37℃下，8000r/min离心10min，取上清液。按上述试剂盒使用方法以煮沸法提取基因组。结果如图7D所示，对于生菜样品，经噬菌体-磁珠富集后当沙门氏菌浓度高于10²CFU/mL时，可检出样品中的沙门氏菌。

上述的实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本申请中的实施例及实施例中的特征在不冲突的情况下，可以相互任意组合。本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物，其特征在于：所述偶联物为沙门氏菌噬菌体与羧基磁珠偶联得到复合物，其中，所述沙门氏菌噬菌体为鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(Salmonella Typhimurium bacteriophage)LPST10，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2016473。

2.根据权利要求1所述沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物，其特征在于：所述羧基磁珠的直径为300～500nm。

3.根据权利要求1或2所述沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物，其特征在于：所述羧基磁珠的直径为400nm。

4.权利要求1所述沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将噬菌体LPST10活化；

2)将磁珠进行羧基活化；得到活化羧基磁珠；

3)将活化的噬菌体LPST10与羧基磁珠进行偶联，得到沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物。

5.根据权利要求4所述沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，噬菌体LPST10活化具体方法如下：

从-80℃取噬菌体贮存液于TSA平板上划线，按从稀释倍数高到低的方向倒入4mL含有200μL宿主菌的0.7％琼脂TSB培养基，挑取单个噬菌斑于1mL TSB培养基37℃培养6-8小时，加入20μL氯仿，继续培养10min以释放子代噬菌体；经8000r/min离心10min,取上清液划线，按上述方法采用双层平板于37℃培养，倾注4mL PBS缓冲液至含有噬菌斑的平板上于4℃过夜，吸取出缓冲液到10mL离心管，8,000rpm离心15min，并用0.22μm微孔滤膜过滤备用。

6.根据权利要求4所述沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，磁珠羧基活化的制备方法如下：

取1mL保存磁珠，经超声分散充分混匀后，取100μL PuriMag Si-COOH磁珠到1.5mL离心管中，置于磁性分离架上，待固液分离后去除上清液，保留MBs；加入200μL MES溶液到上述离心管中，混匀置于磁性分离架上，待固液分离后去除上清液，重复该步骤1次；迅速加入新配置的100μL NHS溶液，200μL EDC溶液到装有磁珠的离心管中，漩涡混匀使磁珠充分悬浮，室温下垂直混合30min，用磁力架弃上清，并用冰PBS缓冲液洗三次，于100μLPBS缓冲液中重悬。

7.根据权利要求4所述沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中，偶联的具体方法：

取100μL PBS缓冲液重悬保存活化的磁珠，加入100μL噬菌体液轻柔地混匀，在4℃条件下垂直混合过夜，用1mL PBS缓冲液至少洗三次以去除未偶联的噬菌体，噬菌体-磁珠用1mL含0.1％BSA的PBS缓冲液封闭剩余结合位点，涡旋30s，将离心管置于混合仪4℃反应2h，反应结束后，将离心管置于磁力架上，待固液分离后移除上清液，然后加入1mL PBS缓冲液，磁吸分离，重复该步骤1次；噬菌体磁珠偶联物保存于含有质量体积浓度为0.1％的BSA的PBS缓冲液中。

8.一种富集分离沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：它包括权利要求1所述沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阴性对照品、阳性对照品、TE缓冲液；

其中，所述沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物溶于含有质量体积浓度为0.1％BSA的PBS缓冲液，PBS缓冲液摩尔浓度为0.05mol/L；其中，缓冲液中，沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物的浓度为1～2μg/μL；

阴性对照品为含有质量体积浓度为0.1％BSA的PBS缓冲液，其中，PBS缓冲液摩尔浓度为0.05mol/L；

阳性对照品为沙门氏菌阳性对照，该沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028；

TE缓冲液成分：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA。

10.利用权利要求8所述试剂盒富集分离沙门氏菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)当样品中含有沙门氏菌时，按噬菌体纳米磁珠偶联物与样品体积比1:5将样品加入噬菌体纳米磁珠偶联物中，于旋转涡旋仪上，37℃条件作用15min；

2)将样品置于磁力架上2-3min使磁珠充分吸附后，弃上清；所剩余磁珠偶联物于200μLTE缓冲液中重悬。