CN115181165A - 沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白rbp 41及其在富集与检测沙门氏菌中的应用 - Google Patents

沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白rbp 41及其在富集与检测沙门氏菌中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115181165A
CN115181165A CN202210715092.6A CN202210715092A CN115181165A CN 115181165 A CN115181165 A CN 115181165A CN 202210715092 A CN202210715092 A CN 202210715092A CN 115181165 A CN115181165 A CN 115181165A
Authority
CN
China
Prior art keywords
salmonella
rbp41
receptor binding
binding protein
mbs
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210715092.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115181165B (zh
Inventor
王小红
丁一峰
王佳
邵彦春
黄晨曦
王源上
付琪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong Agricultural University filed Critical Huazhong Agricultural University
Priority to CN202210715092.6A priority Critical patent/CN115181165B/zh
Publication of CN115181165A publication Critical patent/CN115181165A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115181165B publication Critical patent/CN115181165B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56916—Enterobacteria, e.g. shigella, salmonella, klebsiella, serratia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10311—Siphoviridae
    • C12N2795/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10311—Siphoviridae
    • C12N2795/10331—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/42—Salmonella
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • G01N2333/255—Salmonella (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2446/00—Magnetic particle immunoreagent carriers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白RBP 41及其在富集与检测沙门氏菌中的应用；其氨基酸序列为SED ID No.1；本发明的RBP 41能够识别并结合沙门氏菌表面的受体，将其与活化的羧基磁珠偶联，形成RBP 41‑MBs。本发明利用探针RBP 41‑MBs构建快速富集沙门氏菌的磁分离试剂盒，并建立基于尾部受体结合蛋白的磁分离酶联免疫法检测沙门氏菌方法，将基于96孔板的传统ELISA改进为基于磁珠的MAEIA，实现待测样品的定性与定量检测。本发明富集与检测沙门氏菌时间短，约为1.5h，检测限为10CFU/mL，拓展了噬菌体受体结合蛋白在食品安全检测中的应用范围。

Description

沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白RBP 41及其在富集与检测 沙门氏菌中的应用
技术领域
本发明涉及食品安全领域，具体涉及一种沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白RBP41及其在富集与检测沙门氏菌中的应用。
背景技术
沙门氏菌(Salmonella spp.)是重要的食源性病原体之一，是引起食源性疾病的一个主要原因，对公众健康会构成严重威胁。它可以在生产、加工、分销和营销的各个阶段进入食品供应链。目前的沙门氏菌检测方法包括传统培养鉴定、分子生物学，免疫学检测和生物传感器检测等。然而为了实现对沙门氏菌的准确、快速检测，对待测样品中的沙门氏菌进行快速准确的分离富集是必不可少。
免疫磁分离法(Immunomagnetic separation，IMS)是将免疫学反应中抗原-抗体的高特异性与磁珠特有的磁响应性相结合的一种新的免疫学技术。近年来，免疫磁分离法已被应用于食源性致病菌的分离，在一定程度上可取代传统的增菌培养和常规的离心富集细菌。但是免疫磁珠存在一定局限性，例如：作为识别元件的高亲和力抗体昂贵且难以获得，使得免疫标记磁珠的使用规模难以扩大。
噬菌体是一类特异性感染宿主的病毒，广泛存在于自然界。噬菌体特异性感染宿主细胞的第一步为吸附，此过程依靠噬菌体的尾部受体结合蛋白(receptor bindingproteins,RBPs)完成。RBPs是噬菌体颗粒的高度可变结构，存在于噬菌体尾纤维或者尾刺的末端，负责识别细胞表面的特定受体，因此，RBPs介导的宿主识别是高度特异性的。依据RBPs的这一特性，将其用作检测元件有以下优点：
1)利用蛋白外源表达技术，易于大量获得RBPs；
2)RBPs具有模块化的性质，可将具有不同宿主范围的RBPs融合表达，扩大识别宿主范围；
3)与易发生重组和突变的完整噬菌体粒子相反，RBPs在生产过程中序列不易发生重组与突变，性质稳定，更适于商业化；
因此，将RBPs作为分子识别元件，在快速、准确检测食源性病原菌领域具有较好的应用潜力。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白RBP 41及其在富集与检测沙门氏菌中的应用，并构建了基于尾部受体结合蛋白的磁分离酶联免疫法(Magnetic affinity enzyme-linked immunosorbent,MAEIA)，用于沙门氏菌的检测。
为实现上述目的，本发明所设计一种沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白RBP 41，其氨基酸序列为SED ID No.1。
编码上述沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白RBP 41的基因orf 41，其核苷酸序列如SED ID No.2。
上述尾部受体结合蛋白RBP 41的组装伴侣蛋白TAC 34的氨基酸序列为SED IDNo.3；编码基因orf 34的核苷酸序列如SED ID No.4。
上述噬菌体受体结合蛋白RBP 41来自鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(SalmonellaTyphimurium bacteriophage)T102，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2022085。
其中，鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(Salmonella Typhimurium bacteriophage)T102保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2021170，保藏日期为2021年1月29日，地址：中国武汉武汉大学；其中，该鼠伤寒沙门氏菌噬菌体在申请号为202110982438.4，发明名称为鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T102及其在富集分离沙门氏菌中的应用。
本发明还提供了一种重组表达载体pETDuet-1-orf 34-orf 41，所述重组表达载体pETDuet-1-orf 34-orf 41为含有基因orf 41序列和基因orf 34序列的表达载体，其中，所述表达载体为原核细胞表达载体pETDuet-1；
所述基因orf 41的核苷酸序列如SED ID No.2；所述基因orf 34的核苷酸序列如SED ID No.4。
本发明还提供了一种含有上述重组表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。
本发明还提供了一种上述噬菌体受体结合蛋白RBP 41在特异性分离富集沙门氏菌中的应用。
本发明还提供了一种上述噬菌体受体结合蛋白RBP 41在制备快速富集沙门氏菌的磁分离试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种利用上述重组表达载体的宿主细胞制备噬菌体受体结合蛋白RBP 41的方法，包括以下步骤：
(1)将含有重组表达载体pETDuet-1-orf 34-orf 41的大肠杆菌感受态细胞BL21培养，用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后继续培养，离心，沉淀用磷酸盐缓冲液PBS重悬，即为悬浮菌液；
(2)对悬浮菌液进行菌体破碎，离心收集上清，经镍柱亲和层析纯化分离，得到重组的噬菌体受体结合蛋白RBP 41。
本发明还提供了一种沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白-磁珠探针RBP 41-MBs的制备方法，包括以下步骤：
1)采用NHS/EDC法将羧基化磁珠(200nm)上的羧基进行活化，得到活化的羧基化磁珠MBs；
2)将上述制备的噬菌体受体结合蛋白RBP 41与活化的羧基化磁珠MBs进行偶联，得到含有噬菌体受体结合蛋白-磁珠探针RBP41-MBs的PBS缓冲液，且PBS的摩尔浓度为0.05mol/L，噬菌体受体结合蛋白-磁珠探针RBP 41-QDs的浓度为2mg/mL。
作为优选方案，所述步骤1)中，羧基化磁珠的活化方法如下：
1)将羧酸修饰的磁珠经超声分散充分混匀后，得到分散磁珠；
2)取100μL 1mg/mL羧基化磁珠，置于磁性分离架上，待固液分离后去除上清液，保留磁珠，用50mmol/L 2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液洗涤3次；
3)磁分离后，加入到400μL混合物中，该混合物包括80μL1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(50mg/mL)和80μL N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)(50mg/mL)，随后进行30min的轻微摇动以活化磁珠；
4)用100μL预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗磁珠3次，以除去多余的NHS和EDC，得到活化的羧基磁珠MBs。
作为优选方案，所述步骤2)中，噬菌体受体结合蛋白RBP 41与活化的羧基化磁珠MBs偶联方法如下：
1)加入400μL PBS重悬磁珠；并加入115μg/mL沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白RBP 41，37℃振荡孵育2h；孵育结束后，采用PBS缓冲液洗涤3次；
2)为了阻断MBs上未偶联的活化位点，将磁珠在200μL的5％BSA溶液中37℃振荡孵育30min；
3)最后，封阻后的磁珠用PBS洗涤，最后加入500μL PBS缓冲液重悬探针RBP 41-MBs，将探针RBP 41-MBs(2mg/mL)保存于4℃备用。
本发明还提供了一种基于尾部受体结合蛋白快速富集沙门氏菌的磁分离试剂盒，所述试剂盒包括含有上述沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白-磁珠探针RBP 41-MBs。
作为优选方案，所述试剂盒还包括阴性对照品、阳性对照品和PBS缓冲溶液。
其中，阴性对照品为PBS缓冲液，PBS缓冲液摩尔浓度为0.05mol/L；阳性对照品为沙门氏菌阳性对照，该沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028。
本发明还提供了一种利用上述的磁分离试剂盒结合酶联免疫进行快速检测沙门氏菌的磁分离酶联免疫(MAEIA)方法，包括以下步骤：
1)待检测样品与含有噬菌体受体结合蛋白-磁珠探针RBP41-MBs的PBS缓冲液混合，按照V(样品):V(探针RBP 41-MBs)＝12:1，于180rpm转速的摇床上，37℃条件捕获20min，其中，PBS缓冲液浓度为0.05mol/L。
2)将样品置于磁力架上2～3min使磁珠充分吸附后，富集沙门氏菌。使用无菌PBS溶液洗涤磁珠4-5次。
3)探针RBP 41-MBs捕获的样品中加入100μL含辣根过氧化物酶标记的沙门氏菌抗体(Anti-Salmonella-HRP)于37℃孵育反应40min；
辣根过氧化物酶标记的沙门氏菌抗体(Anti-Salmonella-HRP)来自美国的Abcam公司。
4)将样品离心管置于磁分离架上2～3min，固液分离移除液体，加入200μL PBS缓冲液，清洗磁珠，并将磁珠转移至新的离心管中，再用无菌PBS缓冲液清洗磁珠，重复2-3次；
5)使用100μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色液重悬磁珠复合物，静置1-5min，观察溶液颜色变化；
6)若为阳性结果(含有沙门氏菌)，溶液由无色变为蓝色，达到终点时，加入50μL2mol/L H2SO4终止反应，此时溶液会变为黄色；若为阴性结果(不含有沙门氏菌)，溶液为无色或是淡蓝，加入2mol/L H2SO4终止反应，溶液为无色或是淡黄。
7)使用酶标仪于波长450nm处测定吸光值(OD)，依据标准曲线，根据线性回归方程，计算得到样品中沙门氏菌的浓度。
本发明原理：
噬菌体吸附感染宿主细菌依赖于其尾部中的受体结合蛋白。RBPs是噬菌体颗粒的高度可变结构，存在于噬菌体尾纤维或者尾刺的末端，负责识别细胞表面的特定受体。因而，RBPs介导的宿主识别是高度特异性的。与抗体相比，噬菌体受体结合蛋白的获得和纯化相对容易且成本低廉，并且同样具有特异性，能够识别并吸附宿主菌表面的受体部位。本发明将噬菌体受体结合蛋白RBP 41与磁珠偶联，构建分离富集沙门氏菌的探针RBP 41-MBs，具有识别与结合食源性病原菌的潜力。建立基于探针RBP 41-MBs的快速富集沙门氏菌磁分离试剂盒，以及磁分离酶联免疫法，定性和定量检测待测样品中沙门氏菌。
本发明的有益效果：
1.本发明以噬菌体尾部受体结合蛋白作为特异性识别沙门氏菌的元件，与羧基化磁珠偶联形成具有特异性识别沙门氏菌磁分离探针，能够在20min左右分离富集沙门氏菌，捕获率为80％以上。
2.本发明构建的磁分离探针结合沙门氏菌抗体，将96孔板上进行的ELISA反应移到磁珠上进行，缩短了传统ELISA时间，建立了磁分离酶联免疫(Magnetic affinityenzyme-linked immunosorbent,MAEIA)检测方法，整体检测时间为1.5h，检测限为10CFU/mL。
3.本发明能够作为沙门氏菌检测的有效手段，并且进一步扩展噬菌体蛋白在食品安全检测中的应用范围。
附图说明
图1为噬菌体受体结合蛋白RBP 41与尾部组装伴侣蛋白TAC 34的表达与纯化图；
图中，A为不同诱导条件对RBP 41和TAC 34表达影响的SDS-PAGE图，3-6列感受态细胞为大肠杆菌BL21。1：Marker；2：非诱导细菌培养(阴性对照)；3：16℃诱导16h可溶性上清蛋白；4：37℃诱导4h可溶性上清蛋白；5：16℃诱导16h变性上清蛋白；6：37℃诱导4h变性上清蛋白。红色箭头为获得的噬菌体受体结合蛋白RBP 41与尾部组装伴侣蛋白TAC 34。
B为重组蛋白的纯化图；1：Marker；2：纯化后的蛋白。红色箭头为获得的噬菌体受体结合蛋白RBP 41。
图2为噬菌体受体结合蛋白-纳米磁珠RBP探针41-MBs捕获沙门氏菌的条件优化。
图中，A为重组RBP 41蛋白浓度与磁珠偶联时间的影响，
B为RBP 41-MBs的量对于沙门氏菌捕获率的影响，
C为RBP 41-MBs捕获沙门氏菌的时间对捕获效率的影响，
D为RBP 41-MBs捕获沙门氏菌的反应温度对于捕获效率的影响。
统计学意义如下：*，P＜0.05；**，P＜0.01；ns,无显著性。
图3为噬菌体受体结合蛋白-纳米磁珠探针RBP 41-MBs捕获能力。
图中，A为探针RBP 41-MBs对不同浓度的沙门氏菌的捕获能力，
B为探针RBP 41-MBs的特异性。
图4为噬菌体受体结合蛋白-纳米磁珠探针RBP 41-MBs及其捕获沙门氏菌的透射电镜。
图中，A为羧基化纳米磁珠(200nm)形貌，
B为噬菌体受体结合蛋白-纳米磁珠探针RBP 41-MBs形貌，
C和D为探针RBP 41-MBs捕获沙门氏菌形貌。
图5为磁分离酶联免疫法(MAEIA)检测沙门氏菌条件优化。
图中，A为沙门氏菌抗体浓度的优化，
B为MAEIA反应时间的优化，
C为MAEIA反应温度的优化。
统计学意义如下：*，P＜0.05；**，P＜0.01；ns,无显著性。
图6为磁分离酶联免疫法(MAEIA)检测沙门氏菌的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T102基因组测序与分析
从固体培养基上挑取鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 14028)单个菌落，37℃摇床振荡培养3h至OD600nm为0.8-1.0，加入5mL噬菌体T102悬液，37℃摇床振荡培养4h-6h至培养液由浑浊变至澄清，取1mL高效价的噬菌体悬液(1010PFU/mL)，依次加入脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶，37℃孵育40min；加入20μL 2mol/L ZnCl2，37℃温育7min；离心后沉淀用500μL TES缓冲液溶解，于65℃水浴15min；用蛋白酶K(20mg/mL)消化后冷却，加入60μL预冷的3mol/L醋酸钾,冰上放置15min，离心后上清用苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提DNA，用70％乙醇洗涤后用TE缓冲液溶解DNA，获得噬菌体基因组样品，利用第二代测序技术(Next-GenerationSequencing，NGS)测定噬菌体T102基因组，应用NCBI的在线软件基本局部比对搜索工具BLAST Protein及保守结构域预测工具对预测的尾部受体结合蛋白相关基因进行逐个检索分析，得到噬菌体T102中存在受体结合蛋白(尾刺蛋白)基因orf 41以及尾部组装伴侣蛋白orf 34，两者的核苷酸序列分别如SED ID No.2和SED ID No.4，两个核苷酸序列编码的蛋白为沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白RBP 41和噬菌体尾部组装伴侣蛋白TAC 34，它们的氨基酸序列分别为SED ID No.1和SED ID No.3。
上述噬菌体受体结合蛋白(receptor binding protein)RBP 41和尾部组装伴侣蛋白TAC 34来自鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(Salmonella Typhimurium bacteriophage)T102，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2021170，保藏日期为2021年1月29日，地址：中国武汉武汉大学；其中，该鼠伤寒沙门氏菌噬菌体在申请号为202110982438.4，发明名称为鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T102及其在富集分离沙门氏菌中的应用的中国发明专利公开。
实施例2重组质粒的构建
通过人工合成得到尾部组装伴侣蛋白基因orf 34和尾部受体结合蛋白基因orf41。根据无缝克隆原则，使用HindⅢ将尾部组装伴侣蛋白基因orf 34插入至大肠杆菌蛋白双表达空载体pETDuet-1上。将连接产物采用热激法转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，将混合物铺在LB琼脂上(氨苄西林，Ampicillin)并在37℃下孵育过夜。挑取单菌落于LB培养基中，过夜培养后送去测序，将序列正确的确定为阳性转化子。
随后，将预测得到的尾部受体结合蛋白基因orf 41在N端加上His标签，使用Nde I和Xho I限制性内切酶将orf 41与载体pETDuet1-orf 34于37℃双酶切过夜，将酶切产物在琼脂糖凝胶电泳上验证后回收，将orf 41与pETDuet 1-orf 34的双酶切产物混合，用T4DNA连接酶在16℃条件下过夜连接，连接产物使用BamHⅠ和XhoⅠ于37℃双酶切，验证基因orf 34和orf 41正确插入载体pETDuet-1中；即为得到重组表达载体pETDuet-1-orf 34-orf 41；同时，采用热激法转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，即得到重组表达载体的宿主细胞。挑取单菌落于LB培养基中，过夜培养后送去测序，将序列正确的确定为阳性转化子。
实施例3重组噬菌体受体结合蛋白诱导表达与纯化
将已经转化的感受态细胞加到含氨苄西林(50μg/mL)的LB琼脂培养基上均匀涂开，37℃过夜培养。挑取含重组质粒的单菌落接种于含氨苄西林的5mL LB培养基中，37℃过夜培养。取200μL转接于20mL含抗性的LB培养基中，37℃培养至OD600nm＝0.6-0.8，加入IPTG(终浓度1mmol/L)后于37℃4h培养。用PBS重悬菌体，超声破碎细胞，分别取样进行SDS-PAGE验证表达情况。将镍柱平衡至室温，用洗涤液平衡后，将收集的上清样品过柱，用含20mM咪唑的缓冲液冲洗镍柱，用250mM咪唑的洗脱液洗脱目的蛋白，透析去除多余的咪唑，取样进行SDS-PAGE检测，结果如图1所示：得到纯化的尾部受体结合蛋白RBP 41。
实施例4沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白-纳米磁珠探针RBP 41-MBs的制备方法与使用条件的优化
一、沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白-纳米磁珠探针RBP41-MBs的制备
1.NHS/EDC法活化羧基化磁珠
1)将直径为200nm的羧基修饰磁珠经超声分散充分混匀后，得到分散磁珠；
2)取100μL(200nm，10mg/mL)的羧基MBs，置于磁性分离架上，待固液分离后去除上清液，保留磁珠，用50mmol/L 2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)缓冲液洗涤3次；磁分离后，加入到400μL混合物中，该混合物包括80μL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(50mg/mL)和80μL N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)(50mg/mL)，随后进行30min的轻微摇动以活化磁珠；
3)用100μL预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗磁珠3次，以除去多余的NHS和EDC，得到活化的羧基磁珠MBs。
2.上述活化的羧基磁珠MBs与沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白RBP 41进行偶联方法如下：
1)加入400μL PBS重悬磁珠；并加入115μg/mL上述实施例纯化的沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白RBP 41，37℃振荡孵育2h；孵育结束后，采用PBS缓冲液洗涤3次；
2)为了阻断MBs上未偶联的活化位点，将磁珠在200μL的5％BSA溶液中37℃振荡孵育30min；
3)最后，封阻后的磁珠用PBS洗涤，最后加入500μL PBS缓冲液重悬探针RBP 41-MBs，将探针RBP 41-MBs(2mg/mL)保存于4℃备用。
二、沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白-纳米磁珠探针RBP41-MBs使用条件的优化
根据以下公式计算出RBP 41-MBs对沙门氏菌的捕获效率(Capture efficiency，CE)：
CE(％)＝(Na/N0)×100％
公式中，N0是初始样品中存在的沙门氏菌菌液浓度(CFU/mL)，Na是与探针RBP 41-MBs结合的沙门氏菌浓度(CFU/mL)。
1.沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白RBP 41浓度的优化
为探究RBP 41浓度对沙门氏菌捕获率的影响，将羧基化磁珠MBs(10mg/mL)中分别加入2.3、11.5、115、1150μg/mL沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白进行偶联。取制备好的探针RBP41-MBs 75μL，磁分离去上清后，加入1mL 105CFU/mL的鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028菌液，37℃180r/min反应30min。反应完成后磁分离收集上清进行平板计数，得到探针RBP 41-MBs对目标细菌的捕获效率。结果如图2A所示，探针RBP 41-MBs对鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028的捕获率随着沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白浓度的增加而增大，当RBP 41浓度为115μg/mL时，捕获率为83.43％。随着RBP 41浓度的增加，捕获率变化不大(115和1150μg/mL蛋白浓度的捕获率没有显著差异)，因此探针RBP 41-MBs的制备过程中沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白浓度选择115μg/mL用于后续的实验。
2.探针RBP 41-MBs使用量的优化
将不同量的探针RBP 41-MBs(10～300μg)，分别加入到含有1mL沙门氏菌的PBS中(105CFU/mL)，37℃作用20min后，将其放置在磁力架上2～3min，使得磁珠充分与液体分离，采用平板计数法测定探针RBP 41-MBs捕获的菌量。
结果见图2B所示，随着探针RBP 41-MBs使用量的增大，对沙门氏菌的捕获率上升，其中150μg和300μg探针RBP 41-MBs对沙门氏菌的捕获率保持在80％以上。
3.探针RBP 41-MBs捕获沙门氏菌的时间优化
采用150μg RBP 41-MBs，加入到含有1mL沙门氏菌的PBS中(105CFU/mL)，37℃下进行捕获，测定不同捕获时间对捕获率的影响，共测定30min，将不同作用时间的管子放置在磁力架上2～3min，移去上清液，采用平板计数法测定探针RBP 41-MBs捕获的菌量。结果见图2C所示，随着捕获时间的增加，探针RBP 41-MBs对沙门氏菌的捕获率逐渐上升，在捕获时间为20min时到达最大捕获率84.56％，随后的时间点，捕获率有小范围的下降，可能与捕获时间过长，菌体之间相互碰撞有关。
4.探针RBP 41-MBs捕获沙门氏菌的温度优化
取用150μg RBP 41-MBs，加入到含有1mL沙门氏菌的PBS中(105CFU/mL)，分别在4℃、25℃、37℃作用20min后，将其放置在磁力架上2～3min，移去上清液，采用平板计数法测定探针RBP 41-MBs中的菌量。结果见图2D所示，探针RBP 41-MBs在37℃下捕获沙门氏菌20min能够达到84.52％的捕获率。
综上所述，采用150μg RBP 41-MBs在37℃下捕获沙门氏菌20min能够达到84.52％的捕获率。
实施例5沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白-纳米磁珠探针RBP 41-MBs的捕菌能力
一、探针RBP 41-MBs对不同浓度菌的捕获能力的评估
取150μg探针RBP 41-MBs，分别加入到不同菌液浓度的沙门氏菌中(102、103、104、105、106CFU/mL)进行富集分离后，采用平板计数法测定探针RBP 41-MBs中的菌量。结果如图3A所示，随着添加的菌液浓度的升高，探针RBP 41-MBs对沙门氏菌的捕获效率逐步上升的趋势。探针RBP 41-MBs能够有效的分离富集不同浓度的沙门氏菌。
二、探针RBP 41-MBs捕获特异性评估
使用肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌，对探针RBP41-MBs的捕获特异性进行评估。结果见图3B所示，探针RBP41-MBs可以特异性捕获不同血清型的沙门氏菌，捕获率均在70％以上。但是对其他属的细菌不具有捕获能力，捕获率均在10％左右。
三、透射电镜分析
采用透射电镜观察未修饰的羧基磁珠，沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白RBP 41修饰后的探针RBP 41-MBs以及探针RBP41-MBs捕获沙门氏菌的形貌。
探针RBP 41-MBs的制备按照上述方法进行制备。
探针RBP 41-MBs捕获沙门氏菌：取150μg探针RBP 41-MBs，加入到105CFU/mL沙门氏菌中进行富集分离。
结果如图4A所示，羧基化磁珠周边较为粗糙。图4B中使用沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白RBP 41修饰羧基磁珠，可明显观察到蛋白修饰后的磁珠周围由“水层”包围，与未修饰的羧基磁珠出现明显差异。图4C和D中，观察到沙门氏菌周围存在许多磁珠，观察到探针RBP 41-MBs与沙门氏菌形成的复合物，证明探针RBP41-MBs具有捕获沙门氏菌的能力。
实施例6基于RBP 41磁分离酶联免疫法(MAEIA)检测沙门氏菌的条件优化
根据以下公式计算MAEIA检测沙门氏菌的P/N(Positive/Negative)：
P/N＝ODPositive/ODNegative
公式中，ODPositive是实际样品的OD450nm；ODNegative是阴性样品(无菌PBS溶液)的OD450nm。
1.沙门氏菌抗体浓度优化
取75μL探针RBP 41-MBs加入至1mL 105CFU/mL鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028菌液内，37℃孵育20min。磁分离去上清，PBS洗涤3次。加入100μL不同稀释度(1:1000、1:4000、1:6000、1:8000、1:10000)Anti-Salmonella-HRP与RBP 41-MBs捕获的沙门氏菌在37℃孵育反应40min。磁分离后取磁珠部分，PBS洗涤3次。加入100μL TMB显色液重悬磁珠，静置1-5min，观察溶液颜色变化，随后加入50μL 2mol/L H2SO4终止反应，使用酶标仪于波长450nm处测定吸光值(OD)。以PBS作为阴性对照。根据P/N值确定MAEIA反应中加入的最佳抗体稀释比。
结果如图5A所示，随着沙门氏菌抗体稀释比越大时，P/N值逐渐降低。稀释比为1:1000和1:4000对应的P/N分别为4.83±0.35和4.92±0.36，无显著差异。而1:6000等较大稀释度比对应的P/N值均低于稀释比1:4000的值，为4.5以下。因此选取MAEIA反应中加入的最佳抗体稀释比为1:4000。
2.优化探针RBP 41-MBs捕获物与沙门氏菌抗体孵育时间
取75μL探针RBP 41-MBs加入至1mL 105CFU/mL鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028菌液内，37℃孵育20min。磁分离去上清，PBS洗涤3次。将探针RBP 41-MBs捕获的沙门氏菌与100μL 1:4000(稀释比)Anti-Salmonella-HRP于37℃与孵育15、30、40、50、60min。磁分离后取磁珠部分，PBS洗涤3次。加入100μL TMB显色液重悬磁珠，静置1-5min，观察溶液颜色变化，随后加入50μL2mol/L H2SO4终止反应，使用酶标仪于波长450nm处测定吸光值(OD)。以PBS作为阴性对照。根据P/N值确定沙门氏菌与抗体最佳孵育时间。
结果如图5B所示，随着抗体的孵育时间增加，P/N值逐渐增加，当时间为40min时，P/N值为4.73±0.37。40min后，P/N值略微下降，这是因为孵育时间过长，少部分抗体从探针RBP 41-MBs捕获物上脱落。因此，探针RBP 41-MBs捕获物与抗体最佳孵育时间为40min。
3.优化探针RBP 41-MBs捕获物与沙门氏菌抗体孵育温度
取用75μL探针RBP 41-MBs加入至1mL 105CFU/mL鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028菌液内，37℃孵育20min。磁分离去上清，PBS洗涤3次。将100μL 1:4000(稀释比)Anti-Salmonella-HRP分别于4、25、37℃与探针RBP 41-MBs捕获的沙门氏菌孵育40min。磁分离后取磁珠部分，PBS洗涤3次。加入100μL TMB显色液重悬磁珠，静置1-5min，观察溶液颜色变化，随后加入50μL 2mol/L H2SO4终止反应，使用酶标仪于波长450nm处测定吸光值(OD)。以PBS作为阴性对照。根据P/N值确定抗体与探针RBP41-MBs捕获物孵育的最佳温度。
结果如图5C所示，当抗体与探针RBP 41-MBs捕获物的温度为4℃时，P/N值为3.72±0.19，而在25℃和37℃标记沙门氏菌，P/N值分别为4.01±0.31和4.72±0.11。因此，探针RBP 41-MBs捕获物与沙门氏菌抗体在37℃下孵育的效果明显。
综上所述，MAEIA检测中，噬菌体受体结合蛋白-磁珠探针RBP41-MBs分离富集沙门氏菌后，加入稀释比为1:4000的沙门氏菌抗体，然后在37℃孵育40min。
实施例7基于尾部受体结合蛋白的磁分离试剂盒及磁分离酶联免疫检测沙门氏菌方法
基于噬菌体尾部受体结合蛋白的快速富集沙门氏菌磁分离试剂盒包括含有上述噬菌体受体结合蛋白-磁珠探针RBP 41-MBs的PBS缓冲液、阴性对照品、阳性对照品和PBS缓冲溶液。
其中，含有沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物RBP 41-MBs的PBS缓冲液，且PBS的摩尔浓度为0.05mol/L，牛血清白蛋白(BSA)的质量体浓度为15g/L，
每毫升PBS缓冲液中，沙门氏菌探针RBP 41-MBs的含量为2mg。
阴性对照品为含有BSA的PBS缓冲液，其中，牛血清白蛋白(BSA)的质量体积浓度(m/v)为15g/L；
PBS缓冲液摩尔浓度为0.05mol/L；
阳性对照品为沙门氏菌阳性对照，该沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028。
利用上述试剂盒对样品材料富集分离沙门氏菌的方法，包括以下步骤：
1.待检测样品中含有沙门氏菌时，按样品:偶联物RBP41-MBs＝12:1(v/v)的比例在待检测样品加入探针RBP 41-MBs，于180rpm转速的摇床上，37℃条件捕获20min。
2.将样品置于磁力架上2～3min使磁珠充分吸附后，富集沙门氏菌。
利用上述试剂盒对样品材料富集分离的沙门氏菌进行酶联免疫检测，包括以下步骤：
1)使用100μL含辣根过氧化物酶标记的沙门氏菌抗体(Anti-Salmonella-HRP)于37℃与探针RBP 41-MBs捕获的沙门氏菌孵育40min；
辣根过氧化物酶标记的沙门氏菌抗体(Anti-Salmonella-HRP)来自美国的Abcam公司。
2)将样品离心管置于磁分离架上2～3min，固液分离移除液体，加入200μL PBS缓冲液，清洗磁珠，并将磁珠转移至新的离心管中，再用无菌PBS缓冲液清洗磁珠，重复2-3次；
3)使用100μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)显色液重悬磁珠复合物，静置1-5min，观察溶液颜色变化；
4)若为阳性结果(含有沙门氏菌)，溶液由无色变为蓝色，达到终点时，加入50μL2mol/L H2SO4终止反应，此时溶液会变为黄色；若为阴性结果(不含有沙门氏菌)，让溶液为无色或是淡蓝，加入2mol/L H2SO4，溶液为无色或是淡黄。
5)使用酶标仪于波长450nm处测定吸光值(OD)，依据标准曲线，根据线性回归方程，计算得到待检测样品中沙门氏菌的浓度。
用上述所建立的检测方法检测101-105CFU/mL的鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028菌液。结果如图6A所示，随着细菌悬浮液的浓度增加，OD450nm值也逐渐增加。以细菌浓度的对数为横坐标，以吸光值OD450nm为纵坐标，绘制出沙门氏菌定量标准曲线(图6B)。根据阳性样品与阴性样品的OD450nm比(P/N比)计算检测限(LOD)。阴性对照组的OD450nm为0.078±0.0036，P/N≥2.1时即可判定该方法的检测限，为101CFU/mL(P/N：2.13±0.07)。
实施例8磁分离酶联免疫法(MAEIA)检测不同食品基质中的沙门氏菌
(1)牛奶样品的准备：称取10g脱脂奶粉溶于100mL蒸馏水中，采用巴氏杀菌的方法(70℃处理30min)，备用。使用牛奶稀释鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028菌悬液，制备成浓度为105、102CFU/mL的牛奶加标样品，取1mL牛奶加标样品按照已建立的检测方法测定OD450nm，实验重复三次。
(2)生菜样品的准备：新鲜生菜用无菌水冲洗2min后，使用无菌钻孔器取生菜鲜嫩部位成特定尺寸(面积2cm2)并置于无菌培养皿中，紫外照射生菜样品正反面各30min，确保无菌，备用。在生菜片上接种不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028菌液，将样品置于安全柜中干燥15～20min，然后取5g处理后生菜样品加入到95mL无菌PBS中，用研磨棒磨碎制备成浓度为105、102CFU/mL的生菜加标样品，取1mL上清按照已建立的检测方法测定OD450nm，实验重复三次。
将添加了不同浓度鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028的牛奶样品和生菜样品用建立的检测方法检测，以测定的阳性(Positive)与阴性(Negative)的OD450nm值，计算得到P/N值。P/N值带入图6中标准曲线的线性回归方程，计算得到细菌浓度，并计算回收率。
结果如表1所示，根据标准曲线公式，以P/N值计算得到检测菌浓度，从而计算获得加标回收率，其在85.47-101.19％之间，且变异系数(CV)都低于15％。表明该方法受模拟样品复杂基质的影响较小，具有较强的抗干扰能力。因此，该检测方法可应用于实际样品的检测。
表1.不同样品基质的检测回收率
Figure BDA0003708528080000181
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白RBP 41及其在富集与检测沙门氏菌中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 684
<212> PRT
<213> 鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T102(Salmonella Typhimurium Bacteriophage T102)
<400> 1
Met Ser Ser Gly Cys Gly Asp Val Leu Ser Leu Asn Asp Leu Gln Val
1 5 10 15
Ala Lys Lys His Gln Ile Phe Glu Ala Glu Val Ile Thr Gly Lys Gln
20 25 30
Gly Gly Val Ala Gly Gly Ala Asp Ile Asp Tyr Ala Thr Asn Gln Val
35 40 45
Thr Gly Gln Thr Gln Lys Thr Leu Pro Ala Val Leu Arg Asp Ala Gly
50 55 60
Phe Ser Pro Ala Ser Phe Asn Phe Thr Thr Gly Gly Thr Leu Gly Ile
65 70 75 80
Asn Asp Ala Asn Lys Ala Val Leu Trp Pro Lys Glu Asp Gly Gly Asp
85 90 95
Gly Asn Tyr Tyr Ala Trp Arg Gly Ser Leu Pro Lys Val Ile Pro Ala
100 105 110
Ala Ser Thr Pro Leu Thr Thr Gly Gly Ile Ser Asp Ser Ala Trp Val
115 120 125
Ala Phe Gly Asp Ile Thr Phe Arg Ala Glu Ala Asp Lys Lys Phe Lys
130 135 140
Tyr Ser Val Lys Leu Ser Asp Phe Thr Thr Leu Gln Gln Leu Ala Asp
145 150 155 160
Ala Ala Val Asp Ser Val Leu Ile Asp Arg Asp Tyr Asn Phe Ser Asn
165 170 175
Asn Glu Thr Val Asn Phe Gly Gly Lys Thr Leu Thr Ile Asp Cys Lys
180 185 190
Ala Lys Phe Ile Gly Asp Gly Asn Leu Val Phe Thr Gln Leu Gly Lys
195 200 205
Gly Ser Ile Val Val Gly Ala Phe Met Glu Ser Val Thr Thr Pro Trp
210 215 220
Val Ile Lys Pro Trp Thr Asp Asn Asn Glu Trp Ile Thr Asp Pro Ala
225 230 235 240
Ala Ile Val Ala Thr Leu Lys Gln Ser Lys Thr Asp Gly Tyr Gln Pro
245 250 255
Thr Val Asn Asp Tyr Val Lys Phe Pro Gly Ile Glu Ser Leu Leu Pro
260 265 270
Pro Glu Ala Lys Asp Gln Asn Ile Ser Ser Val Leu Glu Ile Arg Glu
275 280 285
Cys Thr Gly Val Glu Ile His Arg Ala Ser Gly Leu Met Ala Cys Phe
290 295 300
Leu Phe Arg Gly Cys His Phe Cys Lys Met Val Asp Ala Asp Asn Pro
305 310 315 320
Ser Gly Gly Lys Asp Gly Val Ile Thr Phe Glu Asn Leu Ser Gly Asp
325 330 335
Trp Gly Lys Gly Asn Tyr Val Ile Gly Gly Arg Thr Ser Tyr Gly Ser
340 345 350
Val Ser Ser Ala Gln Phe Leu Arg Asn Asn Gly Gly Phe Glu Arg Asp
355 360 365
Gly Gly Val Ile Gly Phe Thr Ser Tyr Arg Ala Gly Glu Ser Gly Val
370 375 380
Lys Thr Trp Gln Gly Thr Val Gly Ser Thr Thr Ser Arg Asn Tyr Asn
385 390 395 400
Leu Gln Phe Arg Asp Ser Ala Val Leu Tyr Pro Val Trp Asp Gly Phe
405 410 415
Asp Leu Gly Ala Asp Thr Asp Met Asn Pro Gly Asp Asp Arg Pro Gly
420 425 430
Asp Phe Pro Tyr Ser Gln Tyr Pro Val His Met Leu Pro Leu Asn His
435 440 445
Leu Ile Asp Asn Leu Leu Val Arg Gly Ser Leu Gly Val Gly Phe Gly
450 455 460
Met Asp Gly Lys Gly Leu Tyr Val Ser Asn Ile Thr Val Glu Asp Cys
465 470 475 480
Ala Gly Ser Gly Ala Tyr Leu Leu Thr His Glu Thr Val Phe Thr Asn
485 490 495
Ile Ala Ile Ile Asp Thr Asn Thr Lys Asp Phe Pro Ala Asn Gln Ile
500 505 510
Tyr Ile Ser Gly Ala Cys Arg Val Asn Gly Leu Arg Leu Val Gly Leu
515 520 525
Arg Ser Thr Ser Gly Ser Gly Met Met Ile Asp Ala Pro Asn Ser Thr
530 535 540
Val Ser Gly Ile Thr Gly Phe Val Asp Pro Ser Arg Ile Asn Val Ala
545 550 555 560
Asp Leu Met Asp Val Gly Leu Gly Asn Thr Met Ile Asn Ser Phe Asn
565 570 575
Ser Asp Ser Ala Ala Leu Arg Phe Arg Ile His Lys Leu Thr Lys Thr
580 585 590
Leu Asp Ser Gly Ser Val Tyr Ser His Ile Asn Gly Gly Pro Gly Ser
595 600 605
Gly Ser Ala Trp Thr Glu Ile Thr Ala Ile Ala Gly Ser Leu Pro Asp
610 615 620
Ala Val Ser Leu Lys Ile Asn Arg Gly Asp Tyr Arg Ala Val Glu Ile
625 630 635 640
Pro Val Ala Val Thr Val Leu Pro Asp Ser Ala Val Arg Asp Asn Gly
645 650 655
Ala Ile Ser Leu Tyr Leu Glu Gly Asp Ser Leu Lys Ala Leu Val Lys
660 665 670
Arg Ala Asp Gly Ser Tyr Thr Arg Leu Thr Leu Ala
675 680
<210> 2
<211> 2052
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T102(Salmonella Typhimurium Bacteriophage T102)
<400> 2
atgagcagtg gctgcggcga tgtgctgagt ctgaatgatc tgcaggttgc aaaaaagcat 60
cagatttttg aagcagaagt gattaccggt aaacagggcg gtgttgcagg tggtgccgat 120
attgattatg ccaccaatca ggtgaccggc cagacccaga aaaccctgcc ggcagttctg 180
cgtgatgccg gctttagccc ggcaagtttt aattttacca ccggtggcac cctgggcatt 240
aatgatgcaa ataaggcagt gctgtggccg aaagaagatg gtggtgacgg taattattat 300
gcatggcgtg gcagtctgcc gaaagttatt ccggccgcca gtaccccgct gaccaccggt 360
ggtattagcg atagcgcatg ggtggcattt ggtgacatta cctttcgcgc agaagccgat 420
aaaaaattca aatatagtgt gaagctgagc gattttacca ccctgcagca gctggccgat 480
gccgccgttg atagtgtgct gattgatcgc gattataatt ttagtaacaa cgaaaccgtg 540
aactttggtg gtaaaaccct gaccattgat tgcaaagcaa aattcattgg cgatggtaat 600
ctggtgttta cccagctggg taaaggtagt attgttgtgg gtgcctttat ggaaagcgtg 660
accaccccgt gggttattaa gccgtggacc gataataatg aatggattac cgatccggca 720
gcaattgttg caaccctgaa acagagcaaa accgatggct atcagccgac cgttaatgat 780
tatgtgaaat ttccgggtat tgaaagtctg ctgccgccgg aagcaaaaga tcagaatatt 840
agcagtgttc tggaaattcg cgaatgcacc ggcgttgaaa ttcatcgtgc aagtggtctg 900
atggcatgct ttctgtttcg tggttgtcat ttttgcaaaa tggtggatgc agataatccg 960
agcggcggca aagatggcgt gattaccttt gaaaatctga gtggtgactg gggcaaaggt 1020
aattatgtta ttggcggtcg caccagctat ggtagcgtta gtagcgcaca gtttctgcgt 1080
aataatggcg gttttgaacg cgatggtggt gtgattggct ttaccagtta tcgcgccggt 1140
gaaagtggtg tgaaaacctg gcagggcacc gtgggcagta ccaccagtcg caattataat 1200
ctgcagtttc gtgatagtgc agtgctgtat ccggtttggg atggttttga tctgggcgcc 1260
gataccgata tgaatccggg tgacgatcgc ccgggcgatt ttccgtatag ccagtatccg 1320
gtgcacatgc tgccgctgaa tcatctgatt gataatctgc tggtgcgcgg cagtctgggt 1380
gtgggttttg gcatggatgg caaaggcctg tatgtgagta atattaccgt tgaagattgt 1440
gcaggtagtg gtgcatatct gctgacccat gaaaccgtgt ttaccaatat tgcaattatt 1500
gataccaaca ccaaggattt tccggcaaat cagatctata ttagtggcgc ctgccgtgtg 1560
aatggtctgc gcctggttgg tctgcgcagt accagcggca gtggcatgat gattgatgcc 1620
ccgaatagca ccgttagcgg tattaccggc tttgttgatc cgagccgtat taatgttgcc 1680
gatctgatgg atgtgggtct gggtaatacc atgattaata gttttaacag cgacagtgca 1740
gccctgcgtt ttcgcattca taaactgacc aaaaccctgg atagtggtag cgtgtatagt 1800
catattaatg gtggcccggg tagcggcagt gcctggacag aaattaccgc aattgcaggt 1860
agcctgccgg atgcagttag cctgaaaatt aatcgcggtg actatcgtgc agtggaaatt 1920
ccggtggccg ttaccgtgct gccggatagt gccgtgcgcg ataatggcgc aattagcctg 1980
tatctggaag gtgacagtct gaaagcactg gtgaaacgcg ccgatggtag ctatacccgc 2040
ctgaccctgg cc 2052
<210> 3
<211> 138
<212> PRT
<213> 鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T102(Salmonella Typhimurium Bacteriophage T102)
<400> 3
Met Lys Leu Ser Asp Phe Tyr Phe Ala Glu Lys His Gln Lys Gly Thr
1 5 10 15
Met Met Pro Ile Pro Leu Pro Asn Gly Lys Asp Ser Gly Glu Trp Leu
20 25 30
Gln Val Val Gly Pro Asp Cys Asp Ala Ala Val Arg Ala Gly Arg Ala
35 40 45
Tyr Thr Arg Ala Val Tyr Ala Leu Lys Asp Ser Leu Ser Glu Leu Asp
50 55 60
Asp Gln Cys Lys Glu Lys Gly Asp Trp Thr Leu Tyr Asn Asn Glu Tyr
65 70 75 80
Thr Trp Ala Val Glu Lys Leu Asn His Gln Met Ala Lys Glu Ile Val
85 90 95
Thr Gly Trp Ser Phe Asp Glu Pro Phe Thr Leu Glu Ser Leu Glu Asn
100 105 110
Leu Leu Leu Gln Tyr Arg Gly Leu Ser Glu Leu Ile Leu Ala His His
115 120 125
Thr Lys Ser Lys Glu Leu Leu Leu Glu Lys
130 135
<210> 4
<211> 414
<212> DNA
<213> 鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T102(Salmonella Typhimurium Bacteriophage T102)
<400> 4
atgaaactta gcgattttta ttttgcagaa aagcaccaga aagggaccat gatgcccatt 60
cccctaccca acggcaaaga ctccggggag tggcttcaag tagttggacc tgattgcgat 120
gccgcggtta gagcaggacg ggcttatacg cgagcggtat acgccctgaa agactcgctg 180
tccgaattgg atgaccaatg caaggaaaaa ggggactgga ccctgtataa caatgaatat 240
acgtgggccg tcgaaaaact aaaccatcag atggcgaaag agatagtaac cggttggtcc 300
ttcgacgaac cgttcacact agagtccctg gaaaatctcc tgctacagta ccgggggtta 360
agtgagttaa ttttggcgca ccacaccaag agcaaggaat tattgttgga aaag 414

Claims (10)

1.一种沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白RBP 41，其氨基酸序列为SED ID No.1。
2.一种编码权利要求1所述沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白RBP 41的基因orf 41，其核苷酸序列如SED ID No.2。
3.一种权利要求1所述尾部受体结合蛋白RBP 41的噬菌体尾部组装伴侣蛋白TAC 34，其氨基酸序列为SED ID No.3。
4.根据权利要求3所述的组装伴侣蛋白TAC 34，其特征在于：所述组装伴侣蛋白TAC 34的编码基因orf 34，其核苷酸序列如SED ID No.4。
5.一种重组表达载体pETDuet-1-orf 34-orf 41，其特征在于：所述重组表达载体pETDuet-1-orf 34-orf 41为含有基因orf 41序列和基因orf 34序列的表达载体，其中，所述表达载体为原核细胞表达载体pETDuet-1；
所述基因orf 41的核苷酸序列如SED ID No.2；所述基因orf 34的核苷酸序列如SEDID No.4。
6.含有权利要求5所述重组表达载体的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。
7.一种权利要求1所述噬菌体尾部受体结合蛋白RBP 41在快速富集沙门氏菌的磁分离试剂盒以及磁分离酶联免疫法检测沙门氏菌中的应用。
8.利用权利要求6所述含有重组表达载体的大肠杆菌BL21制备噬菌体受体结合蛋白RBP 41的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将含有重组表达载体pETDuet-1-orf 34-orf 41的大肠杆菌感受态细胞BL21培养，用异丙基硫代半乳糖苷诱导后继续培养，离心，沉淀用磷酸盐缓冲液PBS重悬，即为悬浮菌液；
2)对悬浮菌液进行菌体破碎，离心收集上清，经镍柱亲和层析纯化分离，得到重组的噬菌体受体结合蛋白RBP 41。
9.一种沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白-磁珠探针RBP 41-MBs的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将羧基化磁珠(200nm)进行活化，得到活化的羧基磁珠MBs；
2)将权利要求8制备的噬菌体受体结合蛋白RBP 41与活化的羧基磁珠进行偶联，得到含有噬菌体受体结合蛋白-磁珠探针RBP 41-MBs的PBS缓冲液，且PBS的摩尔浓度为0.05mol/L，噬菌体受体结合蛋白-磁珠探针RBP 41-MBs的摩尔浓度为2mg/mL。
10.一种基于噬菌体尾部受体结合蛋白的快速富集沙门氏菌磁分离试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括含有权利要求9所述沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白-磁珠探针RBP41-MBs。
CN202210715092.6A 2022-06-22 2022-06-22 沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白rbp 41及其在富集与检测沙门氏菌中的应用 Active CN115181165B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210715092.6A CN115181165B (zh) 2022-06-22 2022-06-22 沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白rbp 41及其在富集与检测沙门氏菌中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210715092.6A CN115181165B (zh) 2022-06-22 2022-06-22 沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白rbp 41及其在富集与检测沙门氏菌中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115181165A true CN115181165A (zh) 2022-10-14
CN115181165B CN115181165B (zh) 2024-04-12

Family

ID=83515055

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210715092.6A Active CN115181165B (zh) 2022-06-22 2022-06-22 沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白rbp 41及其在富集与检测沙门氏菌中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115181165B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116003531A (zh) * 2022-12-28 2023-04-25 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 噬菌体受体结合蛋白po86在大肠杆菌o抗原血清型分型鉴定中的应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140050713A1 (en) * 2011-04-12 2014-02-20 C.B. Appaiah Chimeric antibacterial polypeptides
CN105399801A (zh) * 2008-07-04 2016-03-16 拜奥默里克斯公司 新的噬菌体粘附蛋白
CN109929813A (zh) * 2019-03-04 2019-06-25 华中农业大学 沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物及其富集分离试剂盒
CN113430173A (zh) * 2021-05-18 2021-09-24 瑞科盟(青岛)生物工程有限公司 一株宽裂解谱、耐高温沙门氏菌噬菌体及其应用
CN113801855A (zh) * 2021-08-25 2021-12-17 华中农业大学 鼠伤寒沙门氏菌噬菌体t102及其在富集分离沙门氏菌中的应用
CN114605503A (zh) * 2022-03-07 2022-06-10 华中农业大学 沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白rbp-55及其在检测沙门氏菌中的应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105399801A (zh) * 2008-07-04 2016-03-16 拜奥默里克斯公司 新的噬菌体粘附蛋白
US20140050713A1 (en) * 2011-04-12 2014-02-20 C.B. Appaiah Chimeric antibacterial polypeptides
CN103635584A (zh) * 2011-04-12 2014-03-12 冈戈根股份有限公司 嵌合抗菌多肽
CN109929813A (zh) * 2019-03-04 2019-06-25 华中农业大学 沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物及其富集分离试剂盒
CN113430173A (zh) * 2021-05-18 2021-09-24 瑞科盟(青岛)生物工程有限公司 一株宽裂解谱、耐高温沙门氏菌噬菌体及其应用
CN113801855A (zh) * 2021-08-25 2021-12-17 华中农业大学 鼠伤寒沙门氏菌噬菌体t102及其在富集分离沙门氏菌中的应用
CN114605503A (zh) * 2022-03-07 2022-06-10 华中农业大学 沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白rbp-55及其在检测沙门氏菌中的应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LU, Z.: ""hypothetical protein fmbp1_00026 [Salmonella phage fmb-p1]"", 《GENBANK》, pages 71872 *
LU, Z.: ""tail spike protein [Salmonella phage fmb-p1]"", 《GENBANK》, pages 71865 *
NCBI: ""tail assembly chaperone [Salmonella phage T102]"", 《GENBANK》, pages 66257 *
NCBI: ""tail spike protein [Salmonella phage T102]"", 《GENBANK》, pages 010748302 *
YIFENG DING 等: ""Magnetic microbead enzyme-linked immunoassay based on phage encoded protein RBP 41-mediated for rapid and sensitive detection of Salmonella in food matrices"", 《FOOD RES INT》, vol. 163, pages 10 *
潘晖 等: ""磁分离结合q PCR快速检测酱卤肉中的沙门氏菌"", 《现代食品科技》, pages 1 - 7 *
魏麟 等: ""噬菌体在检测食源性病原菌中的应用研究进展"", 《食品科学》, vol. 39, no. 17, pages 314 - 322 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116003531A (zh) * 2022-12-28 2023-04-25 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 噬菌体受体结合蛋白po86在大肠杆菌o抗原血清型分型鉴定中的应用
CN116003531B (zh) * 2022-12-28 2023-09-05 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 噬菌体受体结合蛋白po86在大肠杆菌o抗原血清型分型鉴定中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN115181165B (zh) 2024-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Tolba et al. Oriented immobilization of bacteriophages for biosensor applications
CN107118262A (zh) 一种牛支原体MbovP579蛋白及其应用
CN115181165A (zh) 沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白rbp 41及其在富集与检测沙门氏菌中的应用
US20230193194A1 (en) Generic inert bio-vector salmonella sp. and potential uses thereof
CN105755118B (zh) 免疫磁珠环介导等温扩增法快速检测副溶血性弧菌的方法
CN112707963A (zh) 广谱识别沙门氏菌的纳米抗体、重组载体、宿主细胞及其应用
CN110746495A (zh) 一种重组蛋白e2及其应用
CN116333957A (zh) 一种展示猪链球菌前噬菌体裂解酶的重组芽孢杆菌及其构建方法和应用
CN107746876B (zh) 一种鼠李糖乳杆菌免疫磁珠电化学传感器检测方法
CN114605503B (zh) 沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白rbp-55及其在检测沙门氏菌中的应用
CN116925218B (zh) 小热休克蛋白hspb1的抗体、抗体组合物、杂交瘤细胞株及其应用
CN102584957B (zh) 布氏杆菌特异性多表位人工多肽的特异性抗体及其包被的免疫磁珠和应用
CN111560341B (zh) 一种泛性型惰性载体大肠杆菌及其潜在应用
RU2260047C2 (ru) Рекомбинантная плазмидная днк, обеспечивающая синтез иммунодоминантного белка borrelia garinii, используемого для диагностики лайм-боррелиоза (варианты)
CN111499697A (zh) 一种非洲猪瘟病毒p54重组蛋白的间接ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法
CN108982847B (zh) 一种导致鸭脾脏坏死的鸭呼肠孤病毒的间接elisa检测方法
CN107460173B (zh) 一种纯化猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒或禽流感病毒的方法
CN113512110B (zh) Bvdv纳米抗体及其制备方法及应用
CN113461814B (zh) 特异识别副溶血性弧菌的纳米抗体、重组载体、宿主细胞及其应用
CN115850481A (zh) 一种抗vegfr2纳米抗体及其应用
CN107664694A (zh) 一种基于e2蛋白检测猪非典型瘟病毒抗体的elisa试剂盒
WO2012159772A1 (en) Listeria bacteriophage tailspike protein and uses thereof
Ang et al. A colloidal gold immunochromatographic strip assay for the rapid detection of Shigella in milk and meat products
CN113185610B (zh) 一种金黄色葡萄球菌肠毒素a纳米抗体、应用及试剂盒
Shi et al. Development of IMBs–qPCR detection method for Yersinia enterocolitica based on the foxA gene

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant