CN113801855A - 鼠伤寒沙门氏菌噬菌体t102及其在富集分离沙门氏菌中的应用 - Google Patents

鼠伤寒沙门氏菌噬菌体t102及其在富集分离沙门氏菌中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T102及其在富集分离沙门氏菌中的应用，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2021170。所述偶联物PhageT102‑MBs为鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T102与羧基磁珠偶联得到的复合物。本发明以噬菌体T102作为特异性识别沙门氏菌的元件，与羧基化磁珠偶联形成具有特异性捕获沙门氏菌与磁响应的双功能性分离探针，能够作为病原菌检测中前处理富集分离的有效手段，并且进一步扩展噬菌体在食品安全检测中的应用范围。

Description

鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T102及其在富集分离沙门氏菌中的 应用
技术领域
本发明涉及食品安全领域，具体涉及一种鼠伤寒沙门氏菌噬菌 体T102及其在富集分离沙门氏菌中的应用。
背景技术
沙门氏菌为一种重要的食源性病原体，严重危害公共卫生安全。 众多患者在感染沙门氏菌后12-17h内出现腹泻、发烧和腹部绞痛的 症状。可受到沙门氏菌感染的样品，包括鸡蛋、蛋制品、肉类、奶酪、 新鲜水果和蔬菜等。它在工业化国家和不发达国家每年造成9380万 例食源性疾病和15.5万人死亡。在欧盟，每年报告的沙门氏菌病病 例超过91,000例，欧洲食品安全局(EFSA)估计人类沙门氏菌病的 总体经济负担每年约为30亿欧元。根据美国疾病控制和预防中心 (CDC)的数据，美国每年约有100万例沙门氏菌病爆发，全世界有2亿至13亿例。因此，沙门氏菌的检测在预防和控制沙门氏菌方面 尤为重要。为了实现对沙门氏菌的快速检测，对预处理样品中的沙门 氏菌进行快速准确的富集更是必不可少。
免疫磁分离法(Immunomagnetic Separation，IMS)是将免疫学 反应的高特异性与磁珠特有的磁响应性相结合的一种新的免疫学技 术。磁性微球具有超强的顺磁性，在磁场中能够迅速聚集，离开磁场 后又能均匀分散，其次，均一的粒径，保证了足够的磁响应性又不会 沉降，微球外部的包覆层可以修饰多种活性基团(如氨基、羧基、羟 基、疏基等，可以和细胞、蛋白质、核酸、酶等生化试剂发生偶联， 进而在磁场的作用下实现目标物的分离。近年来，免疫磁分离法已被 应用于食源性致病菌的分离，在一定程度上可取代传统的增菌培养。 据报道，抗体标记的磁性纳米粒子能有效地从碎牛肉中分离出大肠杆 菌O157:H7，从营养肉汤和牛奶样品中分离出单核细胞增生李斯特菌。
但是免疫磁珠存在一定局限性，例如：作为识别元件的高亲和力 抗体昂贵且难以获得，使得免疫标记磁珠的使用规模难以扩大。
发明内容
本发明第一目的是提供了一种鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T102。
为实现上述目的，本发明所设计一种鼠伤寒沙门氏菌噬菌体 (SalmonellaTyphimurium bacteriophage)T102，其保藏编号为： CCTCC NO：M 2021170。
上述鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(Salmonella Typhimurium bacteriophage)T102，中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为： CCTCC M 2021170，保藏日期为2021年1月29日，地址：中国武 汉武汉大学。
上述鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(Salmonella Typhimurium bacteriophage)T102为实验室分离纯化得到，其特异性强，能够识别 不同血清型的沙门氏菌，并且不能识别其他种属的细菌；其具有快速 吸附沙门氏菌的特点(20min可达到最大吸附速率)；其具有高pH稳定性(3-12)和热稳定性(30℃-80℃)。
上述鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(Salmonella Typhimurium bacteriophage)T102通过第二代基因组测序法得到其基因组，采用生 物信息学方法分析其基因组。随后结合其透射电镜结果，所述噬菌体 T102属于长尾科(Siphoviridae family)噬菌体。
本发明第二目的是一种沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物 PhageT102-MBs及其制备方法，所述偶联物PhageT102-MBs为权利 要求1所述鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T102与羧基磁珠偶联得到的复合 物。
进一步地，所述羧基磁珠的直径为200nm。
制备含有上述沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs 的PBS缓冲液的方法，包括以下步骤：
1)将噬菌体T102活化；
2)将羧基磁珠进行活化，得到活化羧基磁珠；
3)将噬菌体T102与活化的羧基磁珠进行偶联，得到含有沙门氏 菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs的PBS缓冲液，且含有沙 门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs的PBS缓冲液中，PBS 的摩尔浓度为0.05mol/L，牛血清白蛋白(BSA)的质量体积浓度为 15g/L，
每毫升PBS缓冲液中，沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物 PhageT102-MBs的含量为2mg。
进一步地，所述步骤1)中，噬菌体T102活化方法如下：
将噬菌体T102贮存液与对数期的鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028 混合，液体培养，过滤，得到噬菌体液体，于4℃备用；且噬菌体液 体使用滴度为：1010PFU/mL。
上述噬菌体液体的滴度的测定方法如下：
首先进行噬菌体液体10倍梯度稀释，按从稀释倍数高到低的方 向倒入4mL含有200μL宿主菌的0.7％琼脂LB培养基，37℃培养6-8h， 观察噬菌斑和个数，即为噬菌体滴度。
上述羧基磁珠活化的制备方法如下：
1)将直径为200nm的羧酸修饰的磁珠经超声分散充分混匀后， 得到分散磁珠，
2)取100μL分散磁珠到1.5mL离心管中，置于磁性分离架上， 待固液分离后去除上清液，保留磁珠；加入200μL 2-(N-吗啉)乙磺酸 (MES)溶液到上述离心管中，混匀置于磁性分离架上，待固液分离 后去除上清液，重复该步骤1次，加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)(100μL，20mg/mL)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC)(200μL，20mg/mL)来活化磁珠上的羧基；
3)活化后的磁珠在37℃下以180r/min的速度垂直混合30min， 然后用100μL冰冷的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗磁珠3次，以除去 多余的NHS和EDC，得到活化的羧基磁珠MBs。
上述噬菌体T102与活化的羧基磁珠偶联方法如下：
1)将200μL 1.0×1010PFU/mL的噬菌体T102与1mg活化的 羧基化磁珠在37℃下振荡(180r/min)30min，
2)用200μL磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗涤磁珠两次，以除 去多余的噬菌体。然后将偶联物PhageT102-MBs重新悬浮在1mL含 3％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)中，在37℃下振 荡(180r/min)30min，以阻断残留位点。清洗PhageT102-MBs偶联 物两次，以除去残留的阻断缓冲液；
3)最后，将PhageT102-MBs偶联物重悬于含1.5％牛血清白蛋 白(BSA)的PBS(pH7.4)中，4℃保存直至使用，得到含有沙门 氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs的PBS缓冲液。
本发明还提供了一种富集分离沙门氏菌的试剂盒，它包括含有上 述沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs的PBS缓冲液。
进一步地，所述试剂盒还包括阴性对照品、阳性对照品和PBS 缓冲溶液。
其中，阴性对照品为含有BSA的PBS缓冲液，其中，牛血清白 蛋白(BSA)的质量体积浓度(m/v)为15g/L，
PBS缓冲液摩尔浓度为0.05mol/L；
阳性对照品为沙门氏菌阳性对照，该沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌 ATCC 14028。
本发明还提供了一种利用上述试剂盒进行富集分离沙门氏菌的 方法，包括以下步骤：
1)含有沙门氏菌的待分离样品与含有沙门氏菌噬菌体纳米磁珠 偶联物PhageT102-MBs的PBS缓冲液混合，摇床培养，得到培养样 品
2)样品管放置于磁分离器中使得磁珠与液体充分分离，保留上 清液；其中，所述上清液采用平板计数法，计算出上清液中的含菌量，
根据以下公式计算出PhageT102-MBs对沙门氏菌的捕获效率CE：
Figure BDA0003229653450000051
公式中，N0是初始样品中存在的沙门氏菌菌液浓度(CFU/mL)， Na是未与颗粒结合的沙门氏菌菌液浓度(CFU/mL)。
作为优选方案，所述步骤1)中，摇床培养条件为：温度为37℃， 转速为180rpm，培养时间为：20min。
本发明原理：
噬菌体(感染细菌的天然病毒)是一类专门吸附细菌的生物体， 其具有高特异性的识别宿主细菌的特性，这一特性使得噬菌体成为食 源性病原菌检测的探针；和抗体相比，噬菌体的获得和纯化相对容易 且成本低廉，宿主范围可以很广，也可以很窄，在温度、pH值和离 子强度方面也比抗体更稳定。正是噬菌体具有的上述优点，使得其具 有用于快速检测食源性病原体的潜力。
本发明的有益效果：
本发明能够在20min左右富集到沙门氏菌，并且对于103 CFU/mL的沙门氏菌捕获率能够达到93.98±0.61％。另外，噬菌体能 够作为特异性识别沙门氏菌的识别元件，替代目前免疫磁珠中所使用 的抗体，减低富集技术的成本。
综上所述，本发明以噬菌体作为特异性识别沙门氏菌的元件，与 羧基化磁珠偶联形成具有特异性捕获沙门氏菌与磁响应的双功能性 分离探针，能够作为病原菌检测前处理富集分离的有效手段，并且进 一步扩展噬菌体在食品安全检测中的应用范围。
附图说明
图1为噬菌体T102双层平板中的噬菌斑的图片，
图2为噬菌体T102透射电镜照片，
图3为噬菌体T102生物学特性图，
图中，A为噬菌体T102的最佳感染复数图，
B为噬菌体T102一步生长曲线图，
C为噬菌体T102吸附速率曲线图，
D为噬菌体T102的温度稳定性图，
E为噬菌体T102的pH稳定性图；
图4为偶联物PhageT102-MBs与偶联物PhageT102-MBs/细菌复 合物透射电镜照片。
图中，A为偶联物PhageT102-MBs透射电镜图，
B为偶联物PhageT102-MBs/细菌复合物透射电镜图。
图5为偶联物PhageT102-MBs条件优化图；
图中，A为噬菌体T102与磁珠偶联时间的影响图，
B为加入偶联物PhageT102-MBs的量对于捕获效率的影响图，
C为偶联物PhageT102-MBs捕获沙门氏菌的时间对捕获效率的 影响，
D反应温度对于捕获效率的影响图。
图6为偶联物PhageT102-MBs捕获不同菌液浓度沙门氏菌的捕 获效率图；
图7为偶联物PhageT102-MBs捕获效率的特异性图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域 技术人员理解。
实施例1噬菌体分离纯化及形态学分析
1.噬菌体分离纯化
将从自然界中取样的样品与培养至对数期的鼠伤寒沙门氏菌 ATCC 14028过夜液体培养12h，经0.22μm微孔滤膜过滤，滤液按 照上述方法重复一次，得到噬菌体原液。纯化噬菌体采用双层平板法， 连续纯化5-10次，直至双层平板出现的噬菌斑大小、透明度一致，即为纯化好的噬菌体(图1)。
2.噬菌体形态学分析
将噬菌体采用磷钨酸负染色后，置于投射电子显微镜下观察噬菌 体形态，具体操作步骤如下：铜网浸没于噬菌体液中10min之后用 滤纸吸去多余液体，再将铜网置于磷钨酸染料中染色自然晾干至完全 干燥，制备好的铜网在透射电子显微镜下观察噬菌体形态，并用软件 Digital Micrograph Demo 3.9.1测量其大小(图2)。
结果显示：噬菌体T102具有二十面体头部，尾部较长且弯曲， 不可收缩，头部直径为48.02±0.35nm，尾长为96.48±0.28nm，其为 长尾噬菌体科。
上述鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(Salmonella Typhimurium bacteriophage)T102，中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为： CCTCC M 2021170，保藏日期为2021年1月29日，地址：中国武 汉武汉大学。
实施例2：噬菌体T102生物学特性分析
1.噬菌体T102宿主谱分析
噬菌体宿主谱的测定采用点样法。取100μL培养至对数期的待 测定菌液加入到温热的半固体培养基中，混匀后倒入预先制备好的 LB琼脂平板上，待凝固后，取5μL效价109PFU/mL的噬菌体滴加 至上层平板表面，干燥后倒置于37℃培养箱培养4h～6h，观察裂解 情况，结果如表1。
表1噬菌体T102宿主谱
Figure BDA0003229653450000071
Figure BDA0003229653450000081
Figure BDA0003229653450000091
Figure BDA0003229653450000101
Figure BDA0003229653450000111
注：a R,Drug-resistant organism strain；S,Sensitive organism strain.
b++strong intensity(Clear plaque)；+weak intensity(Opaque plaque)；-nolytic activity (No plaque).
c ATCC,American Type Culture Collection.CMCC,Center for MedicalCulture Collections. CVCC,China Veterinary Culture Collection Center
2.噬菌体最佳感染复数(MOI)
感染复数(Multiplicity of Infection，MOI)是指初始感染时噬菌 体的数量与宿主菌数量的比值。按一定的MOI值(0.001、0.01、0.1、 1、10、100、1000)将噬菌体与宿主菌混合，37℃培养3.5h，11000 r/min离心10min，用双层平板法测定不同MOI值样品中上清液的 噬菌体效价。试验设3个平行。结果见图3A，噬菌体在MOI＝0.001 时，噬菌体效价达到最大，即噬菌体的最佳感染复数为0.001，表明 在噬菌体效价与宿主菌菌量以0.001比例混合感染时，可增殖出更多 的噬菌体。
3.一步生长曲线
噬菌体的一步生长曲线反应其生长规律。将噬菌体和宿主菌按最 适MOI值混合，37℃温育10min左右，使噬菌体吸附于细菌上，于 4℃、8000r/min离心2min，弃上清，用等体积LB重悬，重复2次， 以除去未吸附的噬菌体。将上述液体加入到9mL LB液体培养基中， 每隔10min取样300μL，8000r/min离心2min，采用双层平板法 测定上清液中噬菌体的效价。试验设3个平行。结果见图3B，从一 步生长曲线可以看出噬菌体的潜伏期、裂解期。噬菌体T102的潜伏 期为30min、裂解期140min。
4.吸附速率
按最适MOI值将新鲜噬菌体液与宿主菌悬液混合于离心管中， 置于37℃摇床培养。从0min开始，每隔3min采用双层平板法测定 上清液中噬菌体的效价。试验设3个平行。吸附速率＝1－(每个时间 点未吸附的噬菌体效价/0min时噬菌体效价)×100％，噬菌体对宿 主菌的吸附速率结果如图3C所示。由图3C可以看出，噬菌体T102 的最佳吸附速率为62.95％达到最佳吸附速率的时间为15min，此时 噬菌体以最大量吸附于宿主菌上。
5.噬菌体T102稳定性分析
将噬菌体原液稀释至106PFU/mL，并分装于1mL无菌离心管 中，将离心管分别放置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的 恒温水浴锅中，0min、30min和60min时测定各管中噬菌体的效 价。试验设3个平行。由图3D可知，其中噬菌体T102在30℃到60℃ 之间噬菌体活性一直维持在与初始时相当的水平，在70℃和80℃时 半小时后噬菌体活性有所降低，90℃保温30min后噬菌体活性降低至 0。噬菌体会随着温度的升高即暴露于高温时间的延长，噬菌体活性 会逐渐降低直至完全失活。
取已知效价的噬菌体悬液(107PFU/mL)100μL加入到900μL 不同pH值(2～13)的PBS缓冲液中，将其置于37℃水浴锅2h后 测定各离心管中噬菌体的效价。试验设3个平行。由图3E可知，噬 菌体在pH 3～12时均保持稳定的滴度即高活性，而在pH 2和pH 13 时，效价基本降为0，说明强酸强碱直接破坏噬菌体的活性。
实施例3沙门氏菌噬菌体T102纳米磁珠的制备
1.噬菌体活化
从-80℃取出保存的噬菌体T102储存液，100μL活化后的宿主菌 菌悬液(108CFU/mL)和100μL噬菌体保存液加入15mL LB培养 基，放置于37℃、180r/min的恒温培养箱中培养16h左右。在8000 r/min、4℃的离心20min。使用0.22μm微孔滤膜过滤，过滤液即为 噬菌体原液，采用双层平板法测定噬菌体滴度，得到1010PFU/mL的 噬菌体T102，存放于4℃备用。
2.NHS/EDC活化羧基化磁珠
1)将直径为200nm的羧酸修饰的磁珠经超声分散充分混匀后， 得到分散磁珠，
2)取100μL分散磁珠到1.5mL离心管中，置于磁性分离架上， 待固液分离后去除上清液，保留磁珠；加入200μL 2-(N-吗啉)乙磺酸 (MES)溶液到上述离心管中，混匀置于磁性分离架上，待固液分离 后去除上清液，重复该步骤1次，加入N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)(100μL，20mg/mL)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC)(200μL，20mg/mL)来活化磁珠上的羧基；
3)活化后的磁珠在37℃下以180r/min的速度垂直混合30min， 然后用100μL预冷的磷酸盐(PBS)缓冲液清洗磁珠3次，以除去 多余的NHS和EDC，得到活化的羧基磁珠MBs。
上述噬菌体T102与活化的羧基磁珠偶联方法如下：
1)将200μL 1.0×1010PFU/mL的噬菌体T102与1mg活化的 羧基化磁珠在37℃下振荡(180r/min)30min，
2)用200μL磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗涤磁珠两次，以除 去多余的噬菌体。然后将PhageT102-MBs偶联物重新悬浮在1mL含 3％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)中，在37℃下振 荡(180r/min)30min，以阻断残留位点。清洗PhageT102-MBs偶联 物两次，以除去残留的阻断缓冲液；
3)最后，将PhageT102-MBs偶联物重悬于含1.5％牛血清白蛋 白(BSA)的PBS(pH7.4)中，4℃保存直至使用，得到含有沙门 氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs的PBS缓冲液。
实施例4沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs使用 条件的优化
1.噬菌体T102与磁珠偶联时间的优化
1)将200μL 1.0×1010PFU/mL的噬菌体T102与1mg活化后 的MBs在37℃下分别振荡(180r/min)30min、2h、4h；
2)用200μL PBST洗涤PhageT102-MBs两次，以除去多余的噬 菌体。然后将偶联物PhageT102-MBs重新悬浮在1mL含5％牛血清 白蛋白(BSA)的PBS中，在37℃下振荡(180r/min)30min，以 阻断残留位点。偶联物PhageT102-MBs被清洗2次，以除去残留的 阻断缓冲液。随后对PhageT102-MBs进行10倍梯度稀释；
3)最后，采用双层平板法取用10μL上述三个偶联时间的 PhageT102-MBs稀释液在铺满沙门氏菌的平板上点样，观察噬菌斑的 形成。
2.沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs最佳使用量 的确定
取10μg、25μg、50μg、75μg、100μg、200μg的PhageT102-MBs， 分别加入到100μL细菌培养液中(106CFU/mL)，37℃作用20min 后，将其放置在磁力架上5min，使得磁珠充分与液体分离，采用平 板计数法测定上清液中的菌量。
3.沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs最佳捕获时 间的优化
取25μg PhageT102-MBs，加入到100μL细菌培养液中(106 CFU/mL)，37℃作用，设置不同时间组，每5min取一次样，共测定 30min，将不同作用时间的管子放置在磁力架上2～3min，使得磁珠 充分与液体分离，采用平板计数法测定上清液中的菌量。
4.沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs最佳反应温 度的确定
取25μg PhageT102-MBs，加入到100μL细菌培养液中(106 CFU/mL)，分别在4℃、25℃、37℃作用20min后，将其放置在磁 力架上2～3min，使得磁珠充分与液体分离，采用平板计数法测定上 清液中的菌量。
结果如图5所示，当加入25μg PhageT102-MBs时，在37℃下捕 获时间为20min时，捕获效率达到最高(90％以上)。
实施例5：沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs灵 敏度评估
取25μg PhageT102-MBs，按照上述操作步骤分别加入到不同菌 液浓度的沙门氏菌中(102、103、104、105、106、107、108、109CFU/mL) 进行富集分离后，取上清液，采用平板计数法测定上清液中的菌量。
结果见图6所示，随着添加的菌液浓度的升高，偶联物 PhageT102-MBs的捕获效率出现先上升后下降的趋势，但是对于109 CFU/mL的捕获效率可达59.76％。PhageT102-MBs偶联物能够有效 的分离富集不同浓度的沙门氏菌。
实施例6富集分离沙门氏菌的试剂盒及其方法
富集分离沙门氏菌的试剂盒包括含有沙门氏菌噬菌体纳米磁珠 偶联物PhageT102-MBs的PBS缓冲液，阴性对照品、阳性对照品和 PBS缓冲溶液。
其中，含有沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs的PBS缓冲液，且含有沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs 的PBS缓冲液中，PBS的摩尔浓度为0.05mol/L，牛血清白蛋白(BSA) 的质量体积浓度为15g/L，
每毫升PBS缓冲液中，沙门氏菌PhageT102-MBs偶联物的含量 为2mg。
阴性对照品为含有BSA的PBS缓冲液，其中，牛血清白蛋白 (BSA)的质量体积浓度(m/v)为15g/L，
PBS缓冲液摩尔浓度为0.05mol/L；
阳性对照品为沙门氏菌阳性对照，该沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌 ATCC 14028。
利用上述试剂盒对样品材料富集分离沙门氏菌的方法，包括以下 步骤：
1.当样品中含有沙门氏菌时，按样品:偶联物 PhageT102-MBs＝1:4(m/v)的比例在样品加入偶联物PhageT102-MBs， 于180rpm转速的摇床上，37℃条件作用20min；
2.将样品置于磁力架上2～3min使磁珠充分吸附后，采用平板计 数法测定上清液中的菌量，按照下述公式，计算捕获率：
Figure BDA0003229653450000161
其中，N0是初始样品中存在的沙门氏菌菌液浓度(CFU/mL)， Na是未与颗粒结合的沙门氏菌菌液浓度(CFU/mL)。
实施例7沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs特异 性评估
按照上述使用方法，使用肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、鸡白 痢沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌， 对沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs的捕获能力进行 评估。
结果见图7所示：沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs可以特异性捕获不同血清型的沙门氏菌，但是对其他 属的细菌不具有捕获能力。
实施例8沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs在不 同基质中富集分离沙门氏菌
将鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028接种到LB培养基中，并在37℃ 下以180r/min，过夜振荡。将培养完成的沙门氏菌在8000rpm，4℃ 下离心20min，弃去上清液，分别使用LB培养基、PBS、5％(15％) 脱脂牛奶或5％(15％)全脂牛奶重悬菌体，并调整菌液浓度。
将沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs(25μg)加 入到含有102或是105CFU沙门氏菌的LB培养基、PBS、5％(15％) 脱脂牛奶或5％(15％)全脂牛奶的样本中。噬菌体T102-MBs在37℃ 下以180rpm的速度孵育20min。磁分离后，用PBS(pH 7.4)洗涤 偶联物PhageT102-MBs 3次。在LA固体培养基上用平板计数法计算 上清液中的鼠伤寒沙门氏菌的浓度，按照上述计算公式CE计算捕获 率。
结果所示：在不同的样品基质内，PhageT102-MBs均能有效捕获 到沙门氏菌，捕获效率均在70％以上，最高捕获效率达到了92.46％。 沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs在PBS、LB培养基、 不同浓度的脱脂牛奶和全脂牛奶中能够高效的捕获到沙门氏菌，达到 分离富集沙门氏菌的目的，极大程度下缩短了沙门氏菌前处理分离富 集的时间。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明 做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实 施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例， 这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.一种鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(Salmonella Typhimurium bacteriophage)T102，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2021170。
2.一种沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs，其特征在于：所述偶联物PhageT102-MBs为权利要求1所述鼠伤寒沙门氏菌噬菌体T102与羧基磁珠偶联得到的复合物。
3.根据权利要求2所述沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs，其特征在于：所述羧基磁珠的直径为200nm。
4.一种制备含有权利要求2所述沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs的PBS缓冲液的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将噬菌体T102活化；
2)将羧基磁珠进行活化，得到活化羧基磁珠；
3)将噬菌体T102与活化的羧基磁珠进行偶联，得到含有沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs的PBS缓冲液，且含有沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs的PBS缓冲液中，PBS的摩尔浓度为0.05mol/L，牛血清白蛋白的质量体积浓度为15g/L，
每毫升PBS缓冲液中，沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs的含量为2mg。
5.根据权利要求4所述沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，噬菌体T102活化方法如下：
将噬菌体T102贮存液与对数期的鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028混合，液体培养，过滤，得到噬菌体液体，于4℃备用；且噬菌体液体使用滴度为：1010PFU/mL。
6.一种富集分离沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：它包括权利要求2所述含有沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs的PBS缓冲液。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阴性对照品、阳性对照品和PBS缓冲溶液。
其中，阴性对照品为含有BSA的PBS缓冲液，其中，牛血清白蛋白的质量体积浓度为15g/L，
PBS缓冲液摩尔浓度为0.05mol/L；
阳性对照品为沙门氏菌阳性对照，该沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028。
8.利用权利要求6所述试剂盒进行富集分离沙门氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)含有沙门氏菌的待分离样品与含有沙门氏菌噬菌体纳米磁珠偶联物PhageT102-MBs的PBS缓冲液混合，摇床培养，得到培养样品
2)样品管放置于磁分离器中使得磁珠与液体充分分离，保留上清液；其中，所述上清液采用平板计数法，计算出上清液中的含菌量，
根据以下公式计算出PhageT102-MBs对沙门氏菌的捕获效率CE：
Figure FDA0003229653440000021
公式中，N0是初始样品中存在的沙门氏菌菌液浓度，CFU/mL，Na是未与偶联物结合的沙门氏菌菌液浓度，CFU/mL。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，摇床培养条件为：
温度为37℃，转速为180rpm，培养时间为：20min。
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