CN116003531B - 噬菌体受体结合蛋白po86在大肠杆菌o抗原血清型分型鉴定中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了噬菌体受体结合蛋白PO86在大肠杆菌O抗原血清型分型鉴定中的应用，所述噬菌体受体结合蛋白具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或与其相比具有至少80％同源性的氨基酸序列。本发明的噬菌体受体结合蛋白可以特异性地结合大肠杆菌O86抗原血清型，从而可以实现快速且准确鉴定大肠杆菌O86抗原血清型，同时也可以用于富集大肠杆菌O86抗原血清型，有助于致病性大肠杆菌研究、疾病诊断和治疗及疫苗研发，对防御并控制致病性大肠杆菌传播有重要意义。

Description

噬菌体受体结合蛋白PO86在大肠杆菌O抗原血清型分型鉴定 中的应用

技术领域

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及噬菌体受体结合蛋白PO86在大肠杆菌O抗原血清型分型鉴定中的应用。

背景技术

大肠杆菌(Escherichia coli)，又叫大肠埃希氏菌，是动物肠道中的正常寄居菌，其中部分具有致病性。菌体O抗原，表面K抗原和鞭毛H抗原是大肠杆菌分型的主要表面抗原。O抗原是大肠杆菌脂多糖的最外层结构，与细菌对环境的适应性有关，是细菌的毒力因子，也是细菌噬菌体和宿主免疫系统的主要目标，能在宿主体内诱发强烈的免疫反应。

大肠杆菌血清型众多，其中致病性大肠杆菌O86抗原血清型主要引起禽类和水禽类的腹泻、气囊炎和肝周炎，在临床症状中主要表现在对胃黏膜、支气管和肝脏的损害，导致炎性细胞的浸润，给家禽行业造成了巨大的经济损失。

准确、快速的鉴定大肠杆菌O抗原血清型有利于大肠杆菌的有效预防、监测与治疗。当前常规O抗原血清学分型方法包括：血清凝聚法、基于特异性DNA序列的PCR分型方法、rbf-限制性片段长度多态性分析法和磁性微球免疫分析法等。这些血清型鉴定方法存在耗时长、成本高、鉴定效率和准确性较低等缺点。

因此，目前鉴定大肠杆菌O抗原血清型的方法仍有待研究。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题。

需要说明的是，本发明是基于发明人的如下发明构思而完成的：

噬菌体是专门感染细菌、放线菌、螺旋体和支原体等微生物的病毒，吸附是噬菌体侵染的第一步，该过程依赖于噬菌体表面的受体结合蛋白以及细菌细胞表面受体。

有鉴于此，发明人尝试选择以噬菌体表面的受体蛋白作为研究对象，期望寻求一种可以特异性结合大肠杆菌O86抗原血清型的噬菌体受体结合蛋白。经过大量理论分析和实验筛选优化，最终获得了一种噬菌体受体结合蛋白，将其命名为“噬菌体受体结合蛋白PO86”，其可以特异性地结合大肠杆菌O86抗原血清型，从而可以实现快速且准确鉴定大肠杆菌O86抗原血清型，同时也可以用于富集大肠杆菌O86抗原血清型，有助于致病性大肠杆菌研究、疾病诊断和治疗及疫苗研发，对防御并控制致病性大肠杆菌传播有重要意义。

为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种噬菌体受体结合蛋白。根据本发明的实施例，所述噬菌体受体结合蛋白具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或与其相比具有至少80％同源性的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种复合物。根据本发明的实施例，所述复合物包括：前面所述噬菌体受体结合蛋白；以及标记物，所述标记物用于标记所述噬菌体受体结合蛋白。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种分离的核酸分子。根据本发明的实施例，所述分离的核酸分子编码前面所述噬菌体受体结合蛋白或者所述复合物。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体含有前面所述分离的核酸分子。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，重组细胞中含有前面所述噬菌体受体结合蛋白、所述复合物、所述分离的核酸分子或者所述表达载体。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：前面所述噬菌体受体结合蛋白、所述复合物、所述分离的核酸分子、所述表达载体或者所述重组细胞。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：前面所述噬菌体受体结合蛋白、所述复合物、所述分离的核酸分子或者所述重组细胞；用于预防或治疗因大肠杆菌O86抗原血清型所引发的疾病的药物。

在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述噬菌体受体结合蛋白、所述复合物、所述分离的核酸分子、所述表达载体、所述重组细胞或者所述试剂盒在鉴定和/或富集大肠杆菌O抗原血清型中的应用。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种鉴定大肠杆菌O抗原血清型的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：使前面所述噬菌体受体结合蛋白与待测微生物接触；基于所述噬菌体受体结合蛋白与所述待测微生物是否结合，确定所述待测微生物是否为大肠杆菌O抗原血清型。

在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述噬菌体受体结合蛋白、所述复合物、所述分离的核酸分子、所述表达载体或者所述重组细胞在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于诊断因感染大肠杆菌O86抗原血清型所引发的疾病。

在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述噬菌体受体结合蛋白、所述复合物、所述分离的核酸分子、所述表达载体或者所述重组细胞在制备药物组合物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物组合物用于预防或治疗因感染大肠杆菌O86抗原血清型所引发的疾病。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种富集大肠杆菌O86抗原血清型的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将待处理样品与前面所述复合物接触，所述待测样品中的大肠杆菌O86抗原血清型可与所述复合物中的噬菌体受体结合蛋白相结合，所述复合物中的标记物选自磁珠探针；通过磁力吸附所述磁珠探针，以便从所述待处理样品中富集出大肠杆菌O86抗原血清型。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的电泳图；

图2显示了根据本发明一个实施例的不同pH条件下蛋白的荧光强度分析图；

图3显示了根据本发明一个实施例的不同温度条件下蛋白的荧光强度分析图；

图4显示了根据本发明一个实施例的不同蛋白浓度下荧光强度分析图；

图5显示了根据本发明一个实施例的电镜图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。

在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。

本发明提出了噬菌体受体结合蛋白、复合物、分离的核酸分子、表达载体、重组细胞、试剂盒、药物组合物、鉴定大肠杆菌O抗原血清型的方法和富集大肠杆菌O86抗原血清型的方法，下面将分别对其进行详细描述。

噬菌体受体结合蛋白

在本发明的一个方面，本发明提出了噬菌体受体结合蛋白。根据本发明的实施例，噬菌体受体结合蛋白具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或与其相比具有至少80％同源性的氨基酸序列。

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在本发明中，术语“噬菌体受体结合蛋白”为噬菌体结合到细菌表面所需的结构，简称为RBP。同一噬菌体可以具有多个RBP，其主要功能是识别细菌特异性受体并与之结合。本发明的发明人发现，噬菌体受体结合蛋白PO86可以特异性地结合大肠杆菌O86抗原血清型，而不结合其他抗原血清型的大肠杆菌或者其他非大肠杆菌，因此可以实现快速且准确鉴定大肠杆菌O86抗原血清型，同时也可以用于富集大肠杆菌O86抗原血清型，有助于致病性大肠杆菌研究、疾病诊断和治疗及疫苗研发，对防御并控制致病性大肠杆菌传播有重要意义。

本发明对于噬菌体受体结合蛋白的来源不做严格限定，对于任何类型的噬菌体的受体结合蛋白均适用于本发明，例如大肠杆菌噬菌体、沙门杆菌噬菌体等等，只要是具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或与其相比具有至少80％同源性的氨基酸序列即可。

本文提及的“同源性”是指核苷酸序列或者氨基酸序列之间的相似程度，同时本文所说的具有(一定程度)同源性的核苷酸序列或者氨基酸序列对应的蛋白至少在用于本发明的功能方面具有相同或更好的活性。

在本发明中，术语“至少80％同源性”指与各参考序列至少为80％，可为81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％的相似程度。

尽管本发明采用的是由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列为SEQIDNO:1的PO86蛋白，但是可以理解，PO86蛋白的任何功能等效变体均适用于本发明中，所述功能等效变体相较于SEQ ID NO:1所示的PO86蛋白可以具有一个或者多个氨基酸的插入、替换和/或缺失，但是依然具有SEQ ID NO:1所示的PO86蛋白的相同或功能/作用。

复合物

在本发明的另一方面，本发明提出了一种复合物。根据本发明的实施例，该复合物包括：前面所述噬菌体受体结合蛋白；以及标记物，所述标记物与所述噬菌体受体结合蛋白结合，用于标记所述噬菌体受体结合蛋白。通过采用标记物以标记噬菌体受体结合蛋白，从而判断噬菌体受体结合蛋白是否结合到大肠杆菌O86抗原血清型。

根据本发明的实施例，所述标记物包括：荧光指示物或者磁珠探针。将复合物与待测菌接触，收集菌并检测荧光信号，当待测菌为大肠杆菌O86抗原血清型时，其会与复合物中的噬菌体受体结合蛋白结合，间接携带着标记物，产生可检测的荧光信号。或者，将复合物与含有待测菌的样品接触，当待测菌为大肠杆菌O86抗原血清型时，其会与复合物中的噬菌体受体结合蛋白结合，间接携带着磁珠探针，通过磁力吸附可以富集出大肠杆菌O86抗原血清型。

在本发明中，术语“荧光物”是指可产生可检测的荧光信号的物质，本发明不做严格限定，可以GFP蛋白、mCherry蛋白或者与氨基反应的异硫氰酸酯衍生物或者琥珀酰亚胺酯，如FITC、TRITC、NHS-荧光素或NHS-罗丹明等。

需要说明的是，前面针对噬菌体受体结合蛋白所描述的特征和优点，同样适用于该复合物，在此不再赘述。

分离的核酸分子、表达载体、重组细胞

在本发明的又一方面，本发明提出了一种分离的核酸分子。根据本发明的实施例，所述分离的核酸分子编码前面所述噬菌体受体结合蛋白或者所述复合物。由此，根据本发明实施例的分离的核酸分子编码的蛋白可以特异性地结合大肠杆菌O86抗原血清型，可以实现快速且准确鉴定大肠杆菌O86抗原血清型，同时也可以用于富集大肠杆菌O86抗原血清型，有助于致病性大肠杆菌研究、疾病诊断和治疗及疫苗研发，对防御并控制致病性大肠杆菌传播有重要意义。

根据本发明的实施例，所述分离的核酸分子具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或与其相比具有至少80％同源性的核苷酸序列。

atggctaacaaaatttccactgtacgtacttacccgctgaatggtgtcgtgaacttcacgattacctttgagtatttagcacgtaagttcgtcaaag

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根据本发明的实施例，当标记物为蛋白时，例如GFP蛋白、mCherry蛋白，则分离的核酸分子既可以编码噬菌体受体结合蛋白，也可以编码含有噬菌体受体结合蛋白和标记物的复合物。当标记物为非蛋白时，例如FITC、TRITC、NHS-荧光素或NHS-罗丹明，则分离的核酸分子仅能编码噬菌体受体结合蛋白，而复合物则不能通过编码表达的方式获得，可以通过化学反应将噬菌体受体结合蛋白和标记物结合。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体含有前面所述分离的核酸分子。由此，根据本发明实施例的表达载体可以将分离的核酸分子表达为噬菌体受体结合蛋白或复合物，从而可以特异性地结合大肠杆菌O86抗原血清型，可以实现快速且准确鉴定大肠杆菌O86抗原血清型，同时也可以用于富集大肠杆菌O86抗原血清型，有助于致病性大肠杆菌研究、疾病诊断和治疗及疫苗研发，对防御并控制致病性大肠杆菌传播有重要意义。

在本发明中，术语“表达载体”通常是指能够插入在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述表达载体可包括主要用于将DNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA的载体，以及主要用于DNA的转录和/或翻译的表达的载体。示例性地，表达载体可以为质粒、噬菌体、粘粒或病毒等。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，重组细胞中含有前面所述噬菌体受体结合蛋白、所述复合物、所述分离的核酸分子或者所述表达载体。通过培养该重组细胞可以获得噬菌体受体结合蛋白，可以实现快速且准确鉴定大肠杆菌O86抗原血清型，同时也可以用于富集大肠杆菌O86抗原血清型，有助于致病性大肠杆菌研究、疾病诊断和治疗及疫苗研发，对防御并控制致病性大肠杆菌传播有重要意义。

在本文中，术语“重组细胞”通常是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞。其中，术语“宿主细胞”是指可导入表达载体的原核细胞或真核细胞。

需要说明的是，前面针对噬菌体受体结合蛋白和复合物所描述的特征和优点，同样适用于该分离的核酸分子、表达载体和重组细胞，在此不再赘述。

试剂盒和用途

在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：前面所述噬菌体受体结合蛋白、所述复合物、所述分离的核酸分子、所述表达载体或者所述重组细胞。由此，利用根据本发明实施例的试剂盒可以实现快速且准确鉴定大肠杆菌O86抗原血清型，同时也可以用于富集大肠杆菌O86抗原血清型。

在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述噬菌体受体结合蛋白、所述复合物、所述分离的核酸分子、所述表达载体、所述重组细胞或者所述试剂盒在鉴定和/或富集大肠杆菌O抗原血清型中的应用。由此，利用根据本发明实施例的试剂盒可以实现快速且准确鉴定大肠杆菌O86抗原血清型，同时也可以用于富集大肠杆菌O86抗原血清型。

在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述噬菌体受体结合蛋白、所述复合物、所述分离的核酸分子、所述表达载体或所述重组细胞在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于诊断因感染大肠杆菌O86抗原血清型所引发的疾病。

根据本发明的实施例，所述疾病选自腹泻、气囊炎或者肝周炎。

需要说明的是，前面针对噬菌体受体结合蛋白、复合物、分离的核酸分子、表达载体或者重组细胞所描述的特征和优点，同样适用于该试剂盒和用途，在此不再赘述。

药物组合物和用途

在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：前面所述噬菌体受体结合蛋白、所述复合物、所述分离的核酸分子、所述表达载体或者所述重组细胞；用于预防或治疗因大肠杆菌O86抗原血清型所引发的疾病的药物。由此，利用噬菌体受体结合蛋白可以特异性结合大肠杆菌O86抗原血清型，可以将治疗药物靶向至机体内的大肠杆菌O86抗原血清型，从而高效地杀伤大肠杆菌O86抗原血清型，达到较好地预防和治疗效果。

根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括药学上可接受的辅料。

在本发明中，术语“药学上可接受的”是指物质或组合物必须与包含制剂的其它成分和/或用其治疗的哺乳动物化学上和/或毒理学上相容。优选地，本发明所述的“药学上可接受的”是指联邦监管机构或国家政府批准的或美国药典或其他一般认可药典上列举的在动物中、特别是人体中使用的。

在本发明中，术语“药学上可接受的辅料”均可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本发明的化合物不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本发明所考虑的范围。

在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述噬菌体受体结合蛋白、所述复合物、所述分离的核酸分子、所述表达载体或者所述重组细胞在制备药物组合物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物组合物用于预防或治疗因感染大肠杆菌O86抗原血清型所引发的疾病。

在本发明中，术语“治疗”是指用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本发明使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本发明使用的“治疗”涵盖将药物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本发明所述噬菌体受体结合蛋白的药物给予有需要的个体。

在本发明中，术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明的噬菌体受体结合蛋白可以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜、静脉、肌肉、皮下、皮层、口服、局部、鼻腔、肺部和直肠，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。然而，由于口服给药时，肽被消化，肽键断裂，因此口服给药的药物的活性成分应该被包被或被配制以防止其在胃部被降解或破坏。优选地，本发明的药物可以注射制剂被给药。此外，本发明的药物可以使用将活性成分传送到靶细胞的特定器械来给药。

本发明的药物的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定，该因素包括要被治疗的疾病类型、给药途径、病人年龄、性别、体重和疾病的严重程度以及作为活性成分的药物类型。根据本发明的一些实施例，日剂量可分为适宜形式的1剂、2剂或多剂，以在整个时间段内以1次、2次或多次给药，只要达到治疗有效量即可。

需要说明的是，前面针对噬菌体受体结合蛋白、复合物、分离的核酸分子、表达载体或者重组细胞所描述的特征和优点，同样适用于该药物组合物和用途，在此不再赘述。

鉴定大肠杆菌O抗原血清型的方法

在本发明的又一方面，本发明提出了一种鉴定大肠杆菌O抗原血清型的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：使前面所述噬菌体受体结合蛋白与待测微生物接触；基于所述噬菌体受体结合蛋白与所述待测微生物是否结合，确定所述待测微生物是否为大肠杆菌O抗原血清型。

根据本发明的实施例，所述噬菌体受体结合蛋白与待测微生物结合，则确定所述待测微生物为大肠杆菌O86抗原血清型；所述噬菌体受体结合蛋白不与待测微生物结合，则确定所述待测微生物不为大肠杆菌O86抗原血清型。

根据本发明的实施例，所述噬菌体受体结合蛋白是以前面所述复合物的形式与待测微生物接触的，通过检测标记物以便确定所述噬菌体受体结合蛋白与所述待测微生物是否结合。通过采用标记物以标记噬菌体受体结合蛋白，从而判断噬菌体受体结合蛋白是否结合到大肠杆菌O86抗原血清型。具体地，将复合物与待测菌接触，收集菌并检测荧光信号，当待测菌为大肠杆菌O86抗原血清型时，其会与复合物中的噬菌体受体结合蛋白结合，间接携带着标记物，产生可检测的荧光信号。或者，将复合物与含有待测菌的样品接触，当待测菌为大肠杆菌O86抗原血清型时，其会与复合物中的噬菌体受体结合蛋白结合，间接携带着磁珠探针，通过磁力吸附可以富集出大肠杆菌O86抗原血清型。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种富集大肠杆菌O86抗原血清型的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将待处理样品与前面所述复合物接触，所述待测样品中的大肠杆菌O86抗原血清型可与所述复合物中的噬菌体受体结合蛋白相结合，所述复合物中的标记物选自磁珠探针；通过磁力吸附所述磁珠探针，以便从所述待处理样品中富集出大肠杆菌O86抗原血清型。由此，有助于大肠杆菌O86抗原血清型的科学研究。

需要说明的是，前面针对噬菌体受体结合蛋白或者复合物所描述的特征和优点，同样适用于该方法，在此不再赘述。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

下述实施例中，采用的主要材料如下：

pET-28a-sumo载体：购买于Invitrogen公司。

BL21(DE3)感受态细胞：购买于Invitrogen公司。

洗涤液洗脱液配方：Tris 20mmol/L、NaCl 500mmol/L、咪唑50-500mmol、甘油5％、Tween0.05％。

菌来源如表1所示。

表1菌来源

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实施例1重组蛋白的构建

1.基因的扩增

以本实验室噬菌体PJN05为模板扩增目的片段基因PO86。

正向引物：5’-CG GGATCC ATGGCTAACAAAATTTCCACTGTAC-3’BamH I(SEQ ID NO：3)

反向引物：5’-CCC AAGCTT TTAATATTGAAAATTAATTTTAG-3’Hind III(SEQ ID NO：4)

扩增体系和扩增条件如下：

成分	加样量(μL)
		dH2O	7.5
上游引物(10μmol/l)	0.5
		下游引物(10μmol/l)	0.5
2×PrimeSTAR	10
		模板DNA	0.5
总体积	20

PCR反应程序：98℃预变性2min；98℃预变性20s，57℃退火30s，72℃延伸1.5min，28个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。

2.构建重组质粒

(1)胶回收目的片段与胶回收后的pET-28a-sumo载体分别与限制性内切酶BamH I和Hind III在37℃酶切2h；

(2)将酶切后的产物在T4连接酶的作用下4℃过夜连接，连接体系条件如下：

成分	加样量(μL)
		目的片段	2(100ng)
pET-28a-sumo载体	2(100ng)
		T4连接酶	0.5
T4 buffer	1
		dH2O	4.5
总体积	10

(3)取-70℃冻存的感受态细胞于冰上融化后，取100μL于无菌的1.5mL EP管中，加入10μL连接产物，混匀，于冰上放置30min；

(4)42℃水浴热击90s，再放回冰上2min；

(5)加入400μL LB液体培养基，37℃200rpm摇床培养35min；

(6)取100μL菌液涂卡那Kan(37mg/mL)抗性平板，37℃培养至单菌落出现。

将连接成功的目的重组质粒pET-28a-sumo-PO86送至测序公司测序，随后将鉴定碱基序列无误的重组质粒pET-28a-sumo-PO86按照常规方法导入BL21(DE3)感受态细胞中。

3.蛋白的表达

(1)按照1:100的比例向800mL的LB液里(含37mg/mL Kan)加入过夜菌BL21(DE3)-pET-28a-sumo-PO86，37℃摇床振荡培养(180rmp)两个小时，至菌液OD600nm在0.3-0.5之间，加入终浓度为0.6mmol IPTG；

(2)16℃摇床中140rpm诱导培养15小时；

(3)4℃离心机(10,000rmp)离心3min收集菌体；

(4)加入200mL PBS(pH＝8.0)对收集的菌体洗涤两次，加入200mL PBS(pH＝8.0)重悬，超声细胞破碎机破碎菌体(超声开4s关8s，工作时间20min)；

(5)破碎结束后，将破碎液于4℃离心机(10,000rmp)离心10min，取上清过0.22μm滤膜；

(6)将蛋白液至-80℃保存以备用。

4.蛋白的纯化与鉴定

(1)将上清与镍层析胶4℃摇床充分结合两个小时，过柱子，使用洗涤液(咪唑浓度20mmol)洗涤三次(每次1mL)后不同咪唑浓度的洗脱液洗脱(50mmol、100mmol、150mmol、200mmol、250mmol、300mmol、350mmol、400mmol、450mmol、500mmol)，取上清、穿流液、洗脱液、分别跑SDS-PAGE。

(2)通过配置胶确定蛋白的表达量及大小。

(3)使用His标签镍柱将蛋白纯化。

(4)使用PBS(pH＝8.0)透析咪唑，使用30-kD蛋白浓缩柱浓缩目的蛋白PO86；

(5)将1.2mL蛋白标准配制液加入到30mg蛋白标准品中，充分溶解后配置成25mg/mL的蛋白标准溶液；取20μL 25mg/mL蛋白标准加入980μL PBS(pH＝8.0)中配置成0.5mg/mL蛋白标准备用。

(6)将0.5mg/mL蛋白标准按0、1、2、4、8、12、16、20μL加入96孔板中，分别加PBS(pH＝8.0)缓冲液补足到20μL，即标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL。蛋白样品均用PBS缓冲液稀释10倍、50倍，分别取蛋白原液、10倍稀释液和50倍稀释液各20μL加入96孔板中。各孔加入200μL BCA工作液，60℃放置30min。用酶标仪测定OD562nm波长的吸光度，以标准品测定结果绘制标准曲线，根据标准曲线和使用样品体积计算样品蛋白浓度。

PO86蛋白纯化后的胶图见图1，其蛋白大小为70kDa。蛋白纯度检测结果为42μg/mL。

实施例2蛋白的活性与稳定性

1.蛋白的pH稳定性

取10mM的FITC溶解于1mL DMSO中。100μg的蛋白PO86加入适量的不同pH的PBS缓冲液溶解，达到所需的使用浓度。各取100μL PO86与FITC-DMSO按照2：1的比例混合，在4℃下避光结合2小时后，通过PBS(pH＝8.0)进行透析12h，期间更换3-5次PBS(pH＝8.0)，直到透析液中无染料析出。100μL FITC-PO86与100μL 1×105CFU细菌培养物混合，在37℃温箱避光孵育60分钟。8000rpm离心5min，PBS(pH＝8.0)重复洗涤三次，最后添加200μL PBS(pH＝8.0)重悬。多功能酶标仪测定荧光强度(fluorescence intensity；FL)，prism 8.0软件比较各组间FL差异(***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05)。

结果如图2所示，重组蛋白在pH4-10保持较高的活性。而在pH为8时，蛋白活性最高。

2.蛋白的温度稳定性

PO86对不同温度的敏感性试验与上述pH试验方法一致。不同的是选择最佳PBS缓冲溶液(pH＝8.0)来实施温度稳定性实验pH＝8.0。混合物先分别在20℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃环境下孵育1h，再与FITC-DMSO按照2：1的比例混合。多功能酶标仪测定荧光强度(fluorescence intensity；FL)，prism 8.0软件比较各组间FL差异(***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05)。

结果如图3所示，蛋白在4-50℃之间活性相对稳定。在60℃时，蛋白活性下降超过50％，而在70-80℃时，蛋白几乎没有活性。

3.蛋白的最低活性

将浓度为100μg/mL的PO86蛋白通过二倍倍比稀释，每个稀释液中取100μL PO86与FITC-DMSO按照2：1的比例混合，后续操作方法与上述pH方法一致，不同的是选择最佳PBS缓冲溶液(pH＝8.0)来实施蛋白的最低活性pH＝8.0。多功能酶标仪测定荧光强度(fluorescence intensity；FL)，prism 8.0软件比较各组间FL差异(***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05)。

结果如图4所示，PO86蛋白浓度在0.11μg/mL时与对照组存在显著差异，说明该蛋白的最低活性为0.11μg/mL。

实施例3大肠杆菌的O-抗原血清型分型

取10mM的FITC溶解于1mL DMSO中。100μg的蛋白PO86加入1mL PBS(pH＝8.0)缓冲液溶解，达到所需的使用浓度。各取100μL PO86与FITC-DMSO按照2：1的比例混合，在4℃下避光结合2小时后，通过PBS(ph7.2)进行透析12h，期间更换3-5次PBS(pH＝8.0)，直到透析液中无染料析出。100μL FITC-PO862与100μL 1×10⁵CFU不同细菌(167种不同标准O抗原大肠杆菌、3种不同宿主来源的O86大肠杆菌、沙门氏菌ATCC14028、阴沟肠杆菌AS 1.181、福氏志贺氏菌ATCC12022、链球菌CVCC3307和金黄色葡萄球菌ATCC49775)培养物混合(表1所示)，在37℃温箱避光孵育60分钟。8000rpm离心5min，PBS(pH＝8.0)重复洗涤三次，最后添加200μL PBS(pH＝8.0)重悬。

取10μL上述PBS混合菌液均匀涂布在载玻片上，室温下避光自然晾干，在FL荧光显微镜下(激发波长为460-550nm和发射波长为590nm，目镜10×，物镜100×)观察菌体发光情况，若菌体发绿光证实蛋白PO86吸附菌体，反之不吸附菌体。

结果如图5所示，PO86蛋白仅对4种O86抗原大肠杆菌结合，包括1株标准型O86大肠杆菌和三株不同宿主来源的O86大肠杆菌结合，不与剩余的167种不同的标准型O抗原的大肠杆菌和5种其它细菌(沙门氏菌ATCC14028、阴沟肠杆菌AS 1.181、福氏志贺氏菌ATCC12022、链球菌CVCC3307和金黄色葡萄球菌ATCC49775)结合，PO86蛋白与菌体结合如图5A所示，不能与菌体结合如图5B所示。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (15)

1.一种噬菌体受体结合蛋白，其特征在于，所述噬菌体受体结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种复合物，其特征在于，包括：

权利要求1所述噬菌体受体结合蛋白；以及

标记物，所述标记物与所述噬菌体受体结合蛋白结合，用于标记所述噬菌体受体结合蛋白。

3.根据权利要求2所述的复合物，其特征在于，所述标记物包括：荧光指示物或者磁珠探针。

4.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述分离的核酸分子编码权利要求1所述噬菌体受体结合蛋白。

5.根据权利要求4所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述分离的核酸分子具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或与其相比具有至少80%同源性的核苷酸序列。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求4或5所述分离的核酸分子。

7.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞中含有权利要求1所述噬菌体受体结合蛋白、权利要求4或5所述分离的核酸分子或者权利要求6所述表达载体。

8.一种试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1所述噬菌体受体结合蛋白、权利要求2或3所述复合物、权利要求4或5所述分离的核酸分子、权利要求6所述表达载体或者权利要求7所述重组细胞。

9.权利要求1所述噬菌体受体结合蛋白、权利要求2或3所述复合物或者权利要求8所述试剂盒在非诊断目的鉴定和/或富集大肠杆菌O86抗原血清型中的应用。

10.一种非诊断目的鉴定大肠杆菌O86抗原血清型的方法，其特征在于，包括：

使权利要求1所述噬菌体受体结合蛋白或权利要求2或3所述复合物与待测微生物接触；

基于所述噬菌体受体结合蛋白与所述待测微生物是否结合，确定所述待测微生物是否为大肠杆菌O86抗原血清型。

11.根据权利要求10所述方法，其特征在于，所述噬菌体受体结合蛋白与待测微生物结合，则确定所述待测微生物为大肠杆菌O86抗原血清型；

所述噬菌体受体结合蛋白不与待测微生物结合，则确定所述待测微生物不为大肠杆菌O86抗原血清型。

12.根据权利要求10所述方法，其特征在于，所述噬菌体受体结合蛋白是以权利要求2或3所述复合物的形式与待测微生物接触的，通过检测标记物以便确定所述噬菌体受体结合蛋白与所述待测微生物是否结合。

13.权利要求1所述噬菌体受体结合蛋白或权利要求2或3所述复合物在制备试剂盒中的用途，其特征在于，所述试剂盒用于诊断因感染大肠杆菌O86抗原血清型所引发的疾病。

14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，所述疾病选自腹泻、气囊炎或者肝周炎。

15.一种富集大肠杆菌O86抗原血清型的方法，其特征在于，包括：

将待处理样品与权利要求2或3所述复合物接触，所述待处理样品中的大肠杆菌O86抗原血清型可与所述复合物中的噬菌体受体结合蛋白相结合，所述复合物中的标记物选自磁珠探针；

通过磁力吸附所述磁珠探针，以便从所述待处理样品中富集出大肠杆菌O86抗原血清型。